JPH05279383A

JPH05279383A - 新規な免疫調整生理活性ペプチド

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Publication number: JPH05279383A
Application number: JP3198425A
Authority: JP
Inventors: Naoyoshi Suzuki; 木直義鈴
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-07-12
Filing date: 1991-07-12
Publication date: 1993-10-26
Anticipated expiration: 2014-11-08
Also published as: JP2973621B2; US5464819A; DE69112727T2; EP0466498B1; ATE127475T1; JPH0474197A; DK0466498T3; EP0466498A1; DE69112727D1

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は、トキソプラズマ細胞内増殖抑制作
用、抗腫瘍作用、抗菌作用、抗ウイルス作用に代表され
る免疫調整作用を有する新規な実質的に純粋な生理活性
ペプチドを提供することを目的とする。【構成】 Gly-Glu, Pro-Val-Val, Glu-Pro-Val-Val, G
lu-Glu-Pro-Val-Val, Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val, Gly-A
la-Glu-Glu-Pro-Val-Valから選ばれるアミノ酸配列を有
する実質的に純粋な生理活性ペプチド、これらのペプチ
ドの二種以上を含有する組成物、及び上記ペプチドの一
種以上とGly-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu, Glu-Glu-Glu-Glu-G
lu, Asp-Asp-Asp-Asp-Asp, Ala-Glu-Glu-Glu-Glu-Gluか
ら選ばれるアミノ酸配列を有する実質的に純粋な生理活
性ペプチドの一種以上を含有する組成物が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な生理活性ペプチ
ドに関する。更に詳細には、本発明は、トキソプラズマ
細胞内増殖抑制作用、抗腫瘍作用、抗菌作用、抗ウイル
ス作用に代表される免疫調整作用を有する新規な実質的
に純粋な生理活性ペプチドに関する。本発明は又、この
実質的に純粋な生理活性ペプチドを有効成分として含有
する医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】トキソプラズマ(Toxoplasma)は哺乳動物
の内皮細胞に寄生する原虫の一種で、家畜の病原原虫体
として、またヒト脳脊髄炎の病原体として恐れられてい
る。このトキソプラズマは健康な宿主のマクロファージ
に摂取されても、一般微生物と異なり、マクロファージ
の殺機能から逃亡し、内部出芽による分裂増殖を繰り返
す。

【０００３】一方、トキソプラズマ過免疫動物では、そ
のマクロファージは虫体を殺し、消化する作用が観察さ
れている。その血清中には該動物の正常細胞内のトキソ
プラズマ増殖を抑制する液性因子（サイトカイン）が存
在することが知られている〔セチ、ケー．ケー．ら（Se
thi,K.K. et al.）、ジェイ．イミュノロ．（J.Immuno
l.）131,1151-1558(1975)〕。

【０００４】またトキソプラズマ過免疫動物の脾臓細胞
をトキソプラズマ原虫溶解抗原(Toxoplasma lysate ant
igen：以下“TLA"と称す)の存在下で培養した培養上清
中にも、同様に細胞内でのトキソプラズマ増殖を抑制す
るサイトカインが存在することが分かっている〔シラハ
タ、ティー．、シミズ、ケー．、スズキ、エヌ．（Shir
ahata,T., Shimizu，K. & Suzuki,N.），ゼット．パラ
サイトエンクド．（Z.Parasitenkd．）49,11-23(197
6)〕。

【０００５】このサイトカインは感作Ｔリンパ球の産生
物質と推察される分子量3〜4万の糖蛋白で、トキソプラ
ズマ増殖抑制因子(Toxoplasma Glowth Inhibitory fact
or:以下“Toxo-GIF"と称す)と呼ばれている〔シラハ
タ、ティー．、シミズ、ケー．スズキ、エヌ．（Shirah
ata,T., Shimizu、K. & Suzuki,N.)，ゼット．パラサイ
トエンクド．(Z.Parasitenkd.)49、11-23（1976）及び
ナガサワ、エッチ．ら（Nagasawa,H. et al.）イミュノ
バイオロ．（Immunobiol.） 156, 307-319(1980)〕。こ
のToxo-GIFはマクロファージ内での増殖のみならず他の
体細胞でのトキソプラズマ増殖をも抑制する。しかし宿
主と同じ動物種の細胞内における原虫の増殖を阻止する
のみで、異種の動物での増殖は阻止できない〔ナガサ
ワ、エッチ．ら（Nagasawa,H. et al.）イミュノバイオ
ロ．（Immunobiol.）156, 307-319（1980）及びマツモ
ト、ワイ．ら(Matsumoto,Y. et al.) ゼットビーエル．
バクト．ハイジ．（Zbl.Bakt.Hyg.）A 250,383-391(198
1)〕。このような種属特異性が強いため、Toxo-GIFはヒ
トや宿主以外の動物のトキソプラズマ感染症の予防、治
療に用いることができなかった。

【０００６】このような状況下で、本発明者は、先に、
トキソプラズマ免疫動物血清の加水分解によって得られ
る低分子量の物質が種属特異性のないトキソプラズマ増
殖抑制活性のみならず原虫や細菌、ウイルス等に対する
抗微生物活性、さらには抗腫瘍活性を示すことを知見し
た〔特開昭57-142922号、特開昭57-144983号及び米国特
許第4482543号〕。このトキソプラズマ免疫動物血清由
来加水分解物質はオビオアクチン（Obioactin)と命名さ
れた〔スズキ、エヌ．ら（Suzuki,N. et al.）ゼットビ
ーエル．バクト．ハイジ．アイ．アブト．オリジ．（Zb
l.Bakt.Hyg.I.Abt.Orig.）A256, 356-366(1984)〕。こ
のオビオアクチンは分子量5000以下のポリペプチド物質
であり同種細胞だけでなく、異種細胞内におけるトキソ
プラズマ増殖を抑制する〔スズキ，エヌ．ら（Suzuki,
N. et al.）ゼットビーエル．バクト．ハイジ．アイ．
アブト．オリジ．（Zbl.Bakt.Hyg.I.Abt.Orig.）A256,
367-380(1984)〕。

【０００７】天然オビオアクチンは多くの異なるペプチ
ドの集合体であると考えられ、それらの各ペプチドの活
性中心ペプチドの同定によりその合成が可能になれば、
その用途における効果は飛躍的に増大することが期待さ
れる。

【０００８】しかし、上記のように、天然オビオアクチ
ンは多くの異なるペプチドの集合体乃至混合物と考えら
れ、クロマトグラフィーの手法により得られる精製分画
されたオビオアクチンについてアミノ酸解析を行なって
も、集合体乃至混合物中の多くの異なるペプチドのアミ
ノ酸配列を求めることは至難の技である。

【０００９】本発明者は、先に、ODS-120T逆相クロマト
グラフィーによる精製オビオアクチンの或る画分のアミ
ノ酸解析を行なったが、Ｎ末端からの第１位、第２位、
第３位以下の各位置のアミノ酸としてそれぞれ複数のア
ミノ酸が検出され、画分に含有されるペプチドのアミノ
酸配列の一義的な決定は不可能であった。しかし、偶然
にも、或るアミノ酸配列が所望の活性を有することを知
見した（特開平1−175996号〕。即ち、特開平1-175996
号明細書は、次式（７）〜（１０）のアミノ酸配列の群
から選ばれるアミノ酸配列を有する実質的に純粋なペプ
チドを開示している。 Gly-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu （７）、 Glu-Glu-Glu-Glu-Glu （８）、 Asp-Asp-Asp-Asp-Asp （９）、及び Ala-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu （１０）上記の式(７)〜(１０）のうち、式（７）のアミノ酸配
列を有するペプチドが最も高いトキソプラズマ増殖抑制
活性を示す。そこで、本発明者は、式(７）のアミノ酸
配列を有するペプチドをオビオペプチド−１(以下“Obi
o-1"と称す)と命名した。

【００１０】

【発明が解決しようとする問題点】しかし、オビオアク
チンを構成する多数の異なったペプチドの１部のペプチ
ドの活性中心ペプチドと考えられる上記の式（７)〜(１
０）のペプチド以外にも、より多くの活性中心ペプチド
の存在が考えられる。本発明者はこれらの他の活性中心
ペプチドの存在の確認とその構造の解明のみならず所望
の活性及び作用機序の解析により、新規で且つ有用なペ
プチドを開発すべく鋭意研究の結果、他の活性中心ペプ
チドと考えられる新規な６種のペプチドを開発し、その
トキソプラズマ増殖抑制活性を確認した。又、それらの
６種のペプチドの少なくとも２種を含有するペプチド組
成物と少なくとも１種と先に開発した式（７)〜(１０)
のペプチドの少なくとも１種とを組合せて得られるペプ
チド組成物が驚くべきことに予期せぬ優れた相乗効果を
発揮することをも知見し、本発明に到達したものであ
る。

【００１１】

【問題を解決するための手段および作用】即ち、本発明
の１つの態様によれば、次式（１)〜(６）： Gly-Glu （１）， Pro-Val-Val （２）， Glu-Pro-Val-Val （３）， Glu-Glu-Pro-Val-Val （４）， Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val （５），及び Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val （６) のアミノ酸配列の群から選ばれる１種のアミノ酸配列を
含有する実質的に純粋な生理活性ペプチドが提供され
る。

【００１２】本発明の別の態様によれば、次式（１）〜
（６）： Gly-Glu （１）， Pro-Val-Val （２）， Glu-Pro-Val-Val （３）， Glu-Glu-Pro-Val-Val （４）， Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val （５），及び Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val （６) のアミノ酸配列をそれぞれ含有する６種の実質的に純粋
なペプチドよりなる群から選ばれる少なくとも２種のペ
プチドを含有してなる生理活性ペプチド組成物が提供さ
れる。

【００１３】本発明の他の態様によれば、次式（１）〜
（６）： Gly-Glu （１）， Pro-Val-Val （２）， Glu-Pro-Val-Val （３）， Glu-Glu-Pro-Val-Val （４）， Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val （５），及び Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val （６) のアミノ酸配列をそれぞれ含有する６種の実質的に純粋
なペプチドよりなる群から選ばれる少なくとも１種のペ
プチドと次式（７）〜（１０）： Gly-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu （７）， Glu-Glu-Glu-Glu-Glu （８）， Asp-Asp-Asp-Asp-Asp （９），及び Ala-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu （１０) のアミノ酸配列をそれぞれ含有する４種の実質的に純粋
なペプチドよりなる群から選ばれる少なくとも１種のペ
プチドを含有してなる生理活性ペプチド組成物が提供さ
れる。

【００１４】更に他の態様によれば、抗原虫、抗細菌、
抗ウイルス又は抗腫瘍作用に有効な量の上記生理活性ペ
プチド又は上記生理活性ペプチド組成物と少なくとも１
種の薬学的に投与可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含有
する医薬組成物が提供される。

【００１５】なお、上記の式（１）〜（１０）の各々の
アミノ酸配列において左末端のアミノ酸はＮ末端アミノ
酸であり、右末端のアミノ酸はＣ末端のアミノ酸であ
る。本発明において、トキソプラズマ増殖抑制効果は、
「トキソプラズマ保有細胞出現率」と「トキソプラズマ
増殖抑制因子活性（以下、“Toxo-GIF活性"と称す)」の
２つの特性により評価する。それらの特性は、ナガサ
ワ、エッチ．ら（Nagasawa,H. et al.）ジャパン．ジェ
ー．ベト．サイ．（Jpn.J.Vet.Sci.） 43, 307-319(198
1)及びサクライ、エッチ．ら（Sakurai,H., et al.）ジ
ャパン．ジェー．トロプ．メド．ハイジ．（Jpn.J.Tro
p.Med.Hyg.）l0,183-195(1982)に記載の方法に準拠して
測定することができる。

【００１６】トキソプラズマ保有細胞出現率の測定 (a)マウスマクロファージおよびイヌ単球における効
果:成熟BALB/C系雌マウス腹腔内に減菌0.2%グリコーゲ
ン加生理食塩水1mlを注入し、5日後に冷ハンクス液(Han
k's balanced salt solution:以下“HBSS”と称す)にて
腹腔内を洗浄し腹腔内浸出細胞(peritoneal exudate ce
ll)を採取した。遠心操作(250G、5分)により2回洗浄し
た細胞を1×10⁶cells/mlの割合で10%-HICS-Tc199培養液
に浮遊させた。この細胞浮遊液を1mlずつ径15mmの円形
カバーグラスを落し込んだ培養シャーレ［マルチ・ディ
ッシュ・トレイ（Multi-dish-tray）,FB-16-24-TC、米
国、リンブロケミカル（Linblo Chemical）社製］内
に分注し、5%炭酸ガス培養器内で培養した。混入する赤
血球やリンパ球系細胞を除去するために、各培養シャー
レを2時間ごとに3回、HBSSで静かに洗浄後、一夜炭酸ガ
ス培養器内で培養してカバーグラス上にマウスマクロ
ファージのモノレーヤを形成させた。

【００１７】一方、イヌ単球の調製に際しては、0.05%
ヘパリン加末梢血液として頚静脈より血液5mlを採血し
た。この血液をコンレイ 400-フィコール（Conray 400-
Ficoll）法〔辻公美、免疫実験操作法、4版、免疫細胞
Ｉの４、443-446頁、前田印刷株式会社（1979)〕にて単
核細胞画分を採取した。得られた細胞画分をHBSSおよび
10%熱非動化仔牛血清（HICS)を添加した199培養液(Tc19
9）(医学の歩み）62、No.6、昭和42年8月5日発行参考）
(以下、“10%-HICS-Tc199培養液"と称す）にて１回ずつ
遠心(800G、5分間、4℃)後、約1×10⁶細胞（cells）／m
lの割合で10%-HICS-Tc199培養液に浮遊させた。この細
胞浮遊液を1mlずつ径15mmの円形カバーグラスの培養シ
ャーレ内に分注して、培養器内で培養した。培養後12時
間を経て、３回HBSSで静かに洗浄後、一夜炭酸ガス（CO
₂）培養器内で培養し、イヌ単球モノレーヤを作成し
た。

【００１８】上記のようにして得られたモノレーヤを10
%−HICS-Tc199培養液で再び洗浄した後、トキソプラズ
マRH株栄養型虫体をマウスマクロファージおよびイヌ
単球1×10⁶個あたり1×10⁵となるように添加・感染させ
た。細胞内に穿入しなかった遊離虫体は感染1時間後にH
BSSで洗浄除去した。

【００１９】このカバーグラスに各試料を含む10%−HIC
S−Tc199培養液（マウスマクロファージおよびイヌ単
球1×10⁶個当たり1ml)添加し、48時間培養した後、メイ
・グルンバルト・ギエムサ（May-Grunwald-Giemsa）で
染色して細胞内のトキソプラズマ数を算定した。カバー
グラス上の一定視野での細胞100個あたりについて、含
有虫体数が0個である細胞の数、含有虫体数が1個から5
個である細胞の数、含有虫体数が6個以上である細胞の
数をそれぞれ数え百分率を求める。同様な操作をカバー
グラスの他の4ヶ所の視野でも行ない、合計5ヶ所での値
からそれぞれの平均値と標準偏差を求めてトキソプラズ
マ含有細胞出現率とした。

【００２０】(b)ヒト心筋細胞[ギアルディハート(Giar
di Heart)]および脳細胞[フロー3000(Flow 3000)］にお
ける効果：細胞を1×10⁶細胞（cells）/mlの割合で10%
熱非働化ウシ胎仔血清(FCS)添加MEM-M培養液に浮遊させ
た。この浮遊液を1mlずつ直径15mmの円形カバーグラス
を落し込んだ培養シャーレ［マルチ・ディッシュ・トレ
イ（Multi-dish-tray）, FB-16-24-TC,リンブロケミ
カル社（Linblo Chemical Co.）製］内に分注し、5%炭
酸ガス培養器内で培養した。一夜炭酸ガス培養器内で培
養してカバーグラス上にモノレーヤ細胞層を形成させ
た。

【００２１】このモノレーヤ細胞層MEM-M培養液で洗浄
した後、トキソプラズマRH株虫体を細胞1×10⁶個あたり
1×10⁵個となるように添加・感染した。細胞内に穿孔し
なかった遊離虫体は感染1時間後にHBSSで洗浄除去し
た。このカバーグラスに各試料を含む培養液に1mlを添
加し、４８時間培養した。培養後、メイ・グルンバルト
・ギエムサ（May−Grunwald-Giemsa）染色して細胞内の
トキソプラズマ数を算定し、マウスマクロファージの
場合と同様にして求めた。

【００２２】Toxo-GIF活性の測定トキソプラズマ増殖抑制活性の別の表現方法でるToxo-G
IF活性は、試料添加によるトキソプラズマ(Tp)含有細胞
(百分率)の減少の割合から求められるもので百分率で表
示され、次式により与えられる。試料は各粉末試料を、3mlの10%-HICS-TC199培養液に溶
解し、0.46μm孔の膜フィルタで濾過滅菌したものを用
いた。

【００２３】なお、上記及びの測定において、試料
濃度は、次に述べる粗オビオアクチン、オビオアクチン
の各画分では5.0mg/ml、本発明の合成ペプチドでは0.5m
g/mlとした。

【００２４】次に、オビオアクチンの活性中心ペプチド
と考えられる本発明の生理活性ペプチドの開発に導いた
粗オビオアクチンの高速液体クロマトグラフィー及び逆
クロマトグラフィーによる精製オビオアクチンの画分に
ついて説明する。

【００２５】（I）粗オビオアクチンの調製粗オビオアクチンは、特開昭57-142922号及び同57-1449
83号に記載の方法に従って得ることができるが、本発明
においては、鈴木らの方法〔スズキ、エヌ．ら（Suzuk
i,N. et al.）ゼットビーエル．バクト．ハイジ．ア
イ．アブト．オリジ．（Zbl.Bakt.Hyg.I.Abt.Orig.）A2
56, 356-366(1984)〕に準じて調製した。すなわち健康
ホルスタイン牛(6〜8ヶ月齢)にトキソプラズマRH株栄養
型虫体（帯広畜産大学、大阪大学微生物病研究所原虫学
部門、国立予防衛生研究所などより入手できる)(1×10⁸
個)を静脈内接種し、初感染後5週目に同じトキソプラズ
マRH株(1×10⁸個)を同様に静脈内接種して攻撃した。攻
撃後2週目にTLA〔1μg/kg体重（body weight）,五十嵐
らの方法（イガラシ、アイ．ら(Igarashi,I. et al.）
ゼットビーエル．バクト．ハイジ．アイ．アブト．オリ
ジ．（Zbl.Bakt.Hyg.I.Abt.Orig.） A244, 374-382，19
79)で調製〕を静脈内投与し、その２４時間後に採血し
た。得られた血清の抗体価はラテックス凝集反応試験で
1:3,200以上を示した。この血清を用いてオビオアクチ
ンを調製した。

【００２６】血清100mlあたり0.1gのプロテアーゼ(プロ
ナーゼを用いた)を添加し37℃で12時間インキュベート
後、10規定水酸化ナトリウムを血清100mlあたり10ml滴
下して100℃にて１時間アルカリ加水分解した。その
後、反応液を４℃に冷却し10規定塩酸滴下によりpH7.0
±0.1まで戻した。

【００２７】得られた加水分解血清は、10,000rpm(10,7
00G)にて20分間遠心して残渣を取り除いた後、セファク
リルS-200(スウェーデン、ファルマシア社製)、トーヨ
ーパールHW-40(東洋曹達社製)にて順次ゲル濾過し、ト
キソプラズマ増殖抑制効果を有する画分を得た。これを
凍結乾燥して粗オビオアクチンとした。

【００２８】（II）オビオアクチンの精製 (1)DEAE-5PW高速液体クロマトグラフィー前述の如く調製された粗オビオアクチンをDEAE-5PW(2
1、5mm×15cmカラム（東洋曹達社製）を用いて0.02モル
酢酸アンモニウムを基本とした0から1モルの塩化ナトリ
ウム濃度勾配イオン交換クロマトグラフ法にて分画し
た。得られたクロマトグラムを第１図に示す。それぞれ
の画分は凍結乾燥後、セファデックス（Sephadex）G-15
（ファルマシア社、スウェーデン)のゲル濾過にて脱塩
し再度凍結乾燥した。各画分の粉末試料を5mg／mlとな
るように10%-HICS-Tc199培養液に溶解して、マウス腹腔
マクロファージを用いてトキソプラズマ増殖抑制効果を
評価した。その結果を表１に示す。

【００２９】

【表１】

【００３０】表１に示すように、Toxo-GIF活性は、第１
画分(Fr.1)で−38.2%、第２画分(Fr.2)で10.8%、第３画
分(Fr.3)で23.1%、第４画分(Fr.4)で16.1%を示した。こ
の結果から、第３画分を活性分画として集め、次の精製
を行なった。

【００３１】(2)ODS-120T 逆相クロマトグラフィ上記第3分画をODS-120Tカラム（東洋曹達社製）を用い
て0.1%トリフオロ酢酸に対して10%から100%のアセトニ
トリル濃度勾配による逆相クロマトグラムを行なって得
られたクロマトグラムを図２に示す。各画分のトキソプ
ラズマ増殖抑制効果を調べた。結果を表２に示す。

【００３２】

【表２】

【００３３】表２に示すごとく、第１画分(Fr.3-1)は9
7.6%、第２画分(Fr.3-2)は96.8%、第３画分(Fr.3-3)は9
7.3%、第４画分(Fr.3-4)は99.2%のToxo-GIF活性を各々
示した。第４画分（Fr.3-4)については、前記したよう
に、本発明者は既にアミノ酸組成を調べ、それに基づい
て新規な生理活性ペプチドを開発した(特開平1-175996
号)。

【００３４】そこで、本発明者は、第３画分(Fr.3-3)の
アミノ酸組成の解析を行なった。（III）Fr.3-3画分のアミノ酸組成の解析精製オビオアクチン画分〔ODS-120T 第３画分(Fr.3-3)8
00pm〕は0.1% チオグリコールを含む定沸点塩酸(６規
定)0.2mlで封管し、110℃で24時間加水分解した後、日
立83型アミノ酸分析装置でOPAI時亜法〔ベンソアー
ル．ジェー．ら（Benso R.J., et al.)プロク．ナト．
アカド．サイ．，米国（Proc.Nat.Acad.Sci.,USA.）72,
619-622(1975）及びボーレン、ピー．（Bohlen，P.）
メソッドインエンザイモロジー（Method in Enzymolo
gy), 91. 17-26(1984)〕よりアミノ酸組成を分析した。

【００３５】アミノ酸組成の解析はアプライドバイオシ
ステム社(米国)製プロテインシークエンサ(Protein seq
uencer)を用い、エドマン(Edman)分析に基づいて行なっ
た。収集したEdmanサイクルを3-フェニル-2-チオヒダン
トイン(PTH)誘導体に転換し、逆相高圧液体クロマトグ
ラフィーにより各PTH-アミノ酸を同定した。その結果を
表３に示す。

【００３６】表３精製オビオアクチン800pmol(ODS-120T Fr.3-3)でのアミ
ノ酸組成(単位はpmol) アミノ酸 No. Ala Val Glu Gly Pro Tyr 1 140 55 62 94 100 ― 2 70 112 100 ― ― ― 3 ― 103 100 ― ― ― 4 ― ― ― ― 101 ― 5 ― 100 ― ― ― ― 6 ― 112 ― ― ― ― 7 ― ― ― ― 10 51 (0.1pmol以下切捨)

【００３７】上記の表３に示すように、Fr.3-3画分のN
末端から分析されたアミノ酸は、第１位(第1残基)にア
ラニン(Ala、140pm)、バリン(Val、55pm)、グルタミン
酸(Glu、62pm),グリシン(Gly、90pm)、プロリン(Pro、1
00pm)などが検出された。第２位にはVal(112pm)、Glu(1
00pm)、Ala(70pm)などが検出された。第３位にはVal(10
3pm)、Glu(100pm)、第４位にはPro(101pm)、第５位Val
(100pm)、第６位Val(112pm)、第７位Tyr(51pm)、Proが
主たる成分であった。以上の結果から精製オビオアクチ
ンの１つは、Ｎ末端がAla、Pro、Gly、Glu、Valとする
少なくとも５成分の混合物であり、第２位以降はGlu、V
al、Ala、Proの連鎖による可能性が高いことが強く示唆
された。

【００３８】また、この精製オビオアクチンFr.3-3は、
その後同様のクロマトグラフィーに何回かけてもこれ以
上の精製ができない。その理由は、Fr.3-3が上記のよう
なＮ末端がヘテロの類似ペプチドの混合物であるためと
考えられる。

【００３９】以上の結果から推定されることは、精製オ
ビオアクチン第３画分(Fr.3-3)は、Ｎ末端にAla、Pro、
GlyあるいはGluを有し、次いでGlu、Ala、Pro、Valを2
〜6分子有するであろうという程度で、これからは一義
的には、オビオアクチン第３画分Fr.3-3の活性中心ペプ
チドのアミノ酸配列を決めることはできない。

【００４０】そこで、本発明者は、考えられる極めて多
くのアミノ酸配列について、それらに相当する多数のペ
プチドを合成し、それらペプチドのトキソプラズマ増殖
抑制活性について評価し、次式（２)〜(６）： Pro-Val-Val （２）、 Glu-Pro-Val-Val （３）、 Glu-Glu-Pro-Val-Val （４）、 Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val （５）、及び Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val （６) のアミノ酸配列の群から選ばれる１種のアミノ酸配列を
含有する実質的な純粋な新規な生理活性ペプチドの開発
に成功したものである。

【００４１】他方、本発明者は、トキソプラズマ増殖抑
制作用を有し、単純なアミノ酸構造を有する新規ペプチ
ドを開発すべく、図２の第４画分Fr．3-4に関し更に鋭
意分析研究を重ねた。その結果、意外にも、２つのアミ
ノ酸のみ、即ち、グリシンとグルタミン酸のみより構成
されるアミノ酸配列を有するペプチドが上記の式（２）
〜（６）に示すペプチドに匹敵する免疫調節作用を有す
ることを知見した。この新規ペプチドは、式Gly-Glu
（１）で示されるアミノ酸配列を有することが確認され
た。

【００４２】上記式（１）〜（６）で表わされるアミノ
酸配列を有するペプチドの中で、式（５）と式（６）と
式（１）のアミノ酸配列を有するペプチドが最も高いTo
xo-GIF活性を示すことを知見し、それらを夫々オビオ−
２(Obio-2)、オビオ−３(Obio-3)及びオビオ−４(Obio-
4)と命名した。

【００４３】更に驚くべきことに、本発明の６種のペプ
チドの少なくとも２種を混合して得られる生理活性ペプ
チド組成物及び本発明の６種のペプチドの少なくとも１
種と特開平1-175996号に開示された４種のペプチドの少
なくとも１種とを混合して得られる生理活性ペプチド組
成物が極めて改善されたToxo-GIF活性を発揮するという
相乗効果を見出した。この場合、各ペプチドの混合比は
特に限定的でなく、目的と効果に応じて適宜所望の混合
比で用いることができる。一般には、各成分ペプチドの
量は、各等量乃至その半分以上の量が好ましく用いられ
る。

【００４４】本発明の生理活性ペプチドは、従来から知
られているペプチド合成法〔例えば、ケント、エス．ビ
ー．ら(Kent,S.B., et al) ユー．ラグナルセン（U.Rag
narsen）編「ペプチド（Peptides）1984」アルムクビス
トとウイクセル（Almqvist and Wiksell）、ストックホ
ルム、スウェーデン、（1984) 第185頁参照〕により製
造することができる。又、もし望まれるならば、各ペプ
チドをコードするＤＮＡを用い、適当なホスト・ベクタ
−系により、組換ＤＮＡ技術によって産生することも可
能である。このように、本発明の生理活性ペプチドは実
質的に純粋な形で得ることができる。

【００４５】上記したように、本発明の生理活性ペプチ
ドは、免疫賦活作用即ち各種原虫等の原生動物、細菌
類、ウイルス類等の各種微生物の増殖抑制作用及び制ガ
ン作用を有し、また低毒性であり、ヒト及びその他の哺
乳動物用医薬組成物の活性成分として有効である。又、
特に注目すべきは、担癌マウスに従来の抗癌剤、例えば
フトラフール(FT207)(大鵬薬品社製)、と併用使用する
と生存日数が増加することも認められている。

【００４６】本発明のペプチドをヒト及び動物の医療用
に用いる場合、抗原虫、抗細菌、抗ウイルス又は抗腫瘍
作用に有効な量の本発明の生理活性ペプチドと少なくと
も１種の薬学的に投与可能な担体、希釈剤又は賦形剤を
含有する医薬組成物の形態で用いられる。また、上記医
薬組成物には、必要に応じて通常の各種の添加剤例えば
安定剤、溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色
剤等が添加配合でき、また他の医薬品を添加配合するこ
ともできる。

【００４７】本発明ペプチドの使用形態は、好ましくは
注射剤（液剤、懸濁剤、乳剤等）とされるが、特にこれ
に限定されるわけではない。上記注射剤は通常の投与方
法にて、例えば上記の医薬組成物単独で又はブドウ糖、
アミノ酸等の一般的補液と併用して静脈内投与され得
る。また必要に応じて筋肉内、皮下、皮内もしくは腹腔
内投与することもできる。更に本発明ペプチドは、注射
剤以外、例えば経口投与に適した形態をとることもでき
る。

【００４８】本発明の医薬組成物中に配合される合成ペ
プチドの量及び投与量は、投与方法、投与形態、使用目
的、あるいは患者の症状等に応じ適宜に選択される。通
常有効成分を約1〜80重量％含有する注射剤の形態を例
にとれば、有効成分が約0.001〜10mg/kg/日となる範囲
で投与されるのが望ましく、投与は１日１回である必要
はなく、１日３〜４回に分けることができる。他の形態
での投与の場合も、上記注射剤の場合を目安として投与
量を適当に選択することができる。

【００４９】

【実施例】次に実施例、参考例及び適用例により本発明
を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。実施例１式（５）のペプチド(Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val)の合成
及び精製（１）t-Boc(tert-ブトキシカルボニル基)法によるペプ
チドの固相合成装置：ミリゲン／バイオサーチ（Milligen/Biosearc
h）社製ペプチド合成装置 9600型試薬類：合成装置にシーケンスを入力した後、合成のシ
ュミレーションを行なうと、種類及び必要量等が指示さ
れる。レジン Boc-Val-固相(Resin) アミノ酸 Boc-Ala Boc-Glu(OBzl) Boc-Pro Boc-Val 反応補助試薬 DCM［ジクロロメタン(Dichloromethane)］ DMF［ジメチルホルムアミド(Dimethylformamide)］ DCM/DMF＝1/1 キャッピング試薬（Capping Reagent） I-アセチルイミダゾール（Acetylimidazole）DMF溶液ベースウォッシュ（Basewash） DIPEA［ジイソプロピルエチルアミン(Diisopropylethyl
amine)］DCM溶液脱保護剤（Deblocking Reagent） 45.0% TFA ［トリフルオロ酢酸(Trifluoroacetic Aci
d)］ 2.5% アニソール（Anisole） 52.5% DCM アクチベーター（Activator） DIPCDI［ジイソプロピルカーボジイミド(Diisopropylca
rbodiimide）］DCM溶液以上の試薬（すべて、渡辺化学（株）製、ペプチド合成
用）を、ボトルにセットし、合成をスタートする。

【００５０】合成方法合成はＣ末端よりＮ末端に向けて進む。まず反応容器に
あらかじめ入れてあるBoc-Val-固相(シーケンスＣ末端
アミノ酸）のＮ末端保護基（Boc基)を外す［脱保護(Deb
lock)］。次にアクチベーター（Activator）により十分
活性化されたアミノ酸(Boc-Val)とともにアルゴンガス
により撹拌され、カップリングが行なわれる。Ｃ末端の
はじめの２残基が十分結合した時点（この過程に必要な
時間は、先の合成シュミレーションで計算される）で、
２残基目のアミノ酸の保護基を外す。

【００５１】この時点において、カップリングに失敗し
た（つまり、２残基目のアミノ酸が結合されていない）
部分のカップリングが行なわれる。この操作が入ること
により、この部分は以後合成の対象とならず、最終的に
合成されたペプチドに１残基、あるいは数残基のアミノ
酸が欠落した物が混じることが防止される。以後、同様
に脱保護、活性化、カップリング、キャッピングの操作
が自動的に繰り返され、目的のペプチドが合成される。

【００５２】（２）固相(Resin)からのペプチドの切り
出し。合成が終了した時点でのペプチド鎖は、Ｃ末端が固相
（Resin）と結合している。また、側鎖の保護基も付い
たままである。これを利用可能な状態にするには、合成
ペプチドの切り出し、側鎖の脱保護を行なう必要があ
る。t-Boc法の場合は、この操作においてHF(フッ化水
素)を用いるのが一般的である。合成ペプチド(固相に結
合した状態)に、等量のアニソールを加えた後、切り出
し装置内HF中0℃にて１時間反応させることにより、こ
の過程は終了する。

【００５３】（３）ペプチドの抽出切り出しが終了しHFを除去した物に、TFAを加え、冷エ
ーテルをいれたフラスコ内にガラスフィルター(3G3)に
て濾過する。このとき、フィルター上に固相（Resin）
が残る。エーテル内の白色沈殿物を遠心分離により沈殿
させ、上清は捨てる。沈殿にさらに冷エーテルを加え、
撹拌し、遠心分離する。これを２〜３回繰返し、粗ペプ
チドに混入する非極性不純物を除いた後、沈殿を回収し
乾固させる。

【００５４】（４）クロマトグラフィーによる精製カラム ODS系逆相カラム(TSKゲル ODS-BOTm、東洋曹
達社製）分析 4.8×15cm 分取 21.5×30cm 溶離液 A:0.1% TFAを含む純水 B:0.1% TFAを含むアセトニトリル A:B＝95.5〜30:70リニアグラジエント分析 30分分取 90〜120分検出紫外線（UV） 230nm

【００５５】上記の条件により、切り出し、脱保護した
粗ペプチドの分析・分取を行なう。目的のペプチドは明
らかなメインピークとして確認できる（構成するアミノ
酸の種類、つまりそれらの疎水性や0.1%TFA(pH2.0前後)
におけるイオン化の程度等によりおおよそのリテンショ
ンタイムの推測も可能)が、念のため他のピークもとっ
ておく方が好ましい。また、なんらかの理由でメインピ
ークが１本に絞れない場合などは精製物のアミノ酸分
析、プロテインシーケンサー分析、マニュアルのエドマ
ン分解などについて再分析を行なう。以上のようにし
て、式（５）の合成ペプチドを得、その組成を確認し
た。

【００５６】実施例２〜５実施例１におけるアミノ酸原料を式（１）、式（２）、
式（３）、式（４）及び式（６）の各ペプチドに相当す
るアミノ酸原料に変える以外は実施例１と同様の操作
で、各ペプチドを合成し、その組成を確認した。

【００５７】参考例１実施例１におけるアミノ酸原料を式（７）のペプチド(O
bio-1)に相当するアミノ酸原料に変えた以外は実施例１
と同様の操作でObio-1を合成し、その組成を確認した。

【００５８】適用例１次に、本発明者の各生理活性ペプチド（以下、屡々“合
成ペプチド”と称す）の活性について述べる。（Ａ）マウスマクロファージにおけるToxo-GIF活性各合成ペプチドを0.7mM濃度で培養液に溶解して、マウ
ス腹腔マクロファージを用いてToxo-GIF活性を測定し
た。結果を下記の表４に示す。

【００５９】

【表４】

【００６０】表４に示されるように各ペプチドのToxo-G
IF活性値は、合成ペプチドNo.1(Obio-4)は47.6%、No.2
は30.2%、No.3は27.4%、No.4は30.2%、No.5(Obio-2)は6
1.1%、No.6(Obio-3)では51.7%を示した。またいずれの
ペプチドもこの濃度(0.7mM)では細胞毒性を示さなかっ
た。

【００６１】合成ペプチドNo.1(Obio-4)、No.5(Obio-2)
およびNo.6(Obio-3)が強い活性を示す。合成ペプチドN
o.5とNo.6の分子量はそれぞれ約642および約699であ
る。また合成ペプチドNo.2、No.3及びNo.4についてもト
キソプラズマ増殖抑制や免疫賦活などの作用を有する薬
剤として使用できる。粗オビオアクチンのToxo-GIF活性
は通常5mg/mlで測定されるのに対し、本発明の合成ペプ
チド、例えばNo.5(Obio-2)のToxo-GIF活性は0.25mg/ml
で十分な活性が検出できることから、粗オビオアクチン
に比べ本発明の合成ペプチドは重量比からみて10〜20
倍、モル比からみて40〜140倍相当の活性を示す。

【００６２】（Ｂ）マウスマクロファージ、イヌ単
球、ヒト心筋細胞及び脳細胞におけるToxo-GIF活性 No.5(Obio-2)を用いて評価したところ、次の表５に示す
ようにいずれの細胞でもあきらかなToxo-GIF活性が認め
られ、粗オビオアクチンと同様、本発明の合成ペプチド
は種属特異性を示さないことが確認された。

【００６３】

【表５】

【００６４】（Ｃ）メチルコランスレン誘発腫瘍(MC腫
瘍)マウスへの新規の合成ペプチド投与効果メチルコランスレン(20-Methylcholanthrene,和光純薬)
を0.5mg投与したBALB/cマウス誘発腫瘍塊より摘出したM
C腫瘍細胞をRPMI-1640培養液に2×10⁷個/mlとなる細胞
懸濁液に調製した。6週齢の雄マウス背部皮下に細胞調
整液0.025ml(5×10⁵MC腫瘍/マウス)を筋肉内投与してMC
腫瘍細胞を移植して担癌マウスとした。

【００６５】Obi-2およびObi-3、各30μg/マウスの量を
上記MC腫瘍細胞調整液を投与後1週間毎に背部皮下に筋
肉内注射して腫瘍増殖抑制効果を検討した。担癌マウス
は各実験に５匹ずつ用い、その平均をとった。その結果
を無投与マウスについての比較データと共に図３に示
す。

【００６６】図３に示す如く、腫瘍細胞移植後28日目に
おける平均腫瘍部面積は、無処理生理食塩水投与の対照
群(第1群)では432±10.5mm²、第2群(Obio-2投与群)およ
び第3群（Obio-3投与群）では208±40.1mm²、219±40.1
mm²であった。Obio-2あるいはObio-3投与群は、非投与
群に比較して有意に腫瘍増殖を抑制することが明らかに
なった。

【００６７】（Ｄ）混合使用の相乗効果高いToxo-GIF活性を示した合成ペプチドObio-2およびOb
io-3とペプチドObio-1との相乗作用の有無についても検
討した。次の表６に示すように各ペプチドを混合して添
加してたところ、Toxo-GIF効果は相乗的に上昇した。

【００６８】

【表６】

【００６９】（Ｅ）MC腫瘍担癌マウスにおける脾臓内単
核細胞数の変動次の表７に示すごとく、無処置担癌マウスの脾臓内単核
細胞数は、健康マウス値の10%にまで減少した。一方、O
bio-1およびObio-2投与担癌マウスでは、脾臓内単核細
胞数の減少は極めて軽度で、正常マウスの数の65−70%
を保持していた。これらの脾臓の病理組織学的所見で
は、Obio-2及び3投与群、および非投与群担癌マウス脾
濾胞は、ともに殆ど変化は認められなかった。しかし、
Obio-2及び3投与群では脾赤色髄内の小型単核細胞(小リ
ンパ球)および大型単球が髄内、とくに血管周囲に集簇
するのが目立つのに対して、非投与群では小型リンパ球
が僅かに散在するのみであった。更に、非投与マウスに
おける腫瘍組織部位には広範な出血巣が顕著に認められ
るのに反して、Obio-2および3投与マウスでは殆ど観察
されなかった。

【００７０】このように、合成ペプチド(Obio-2、Obio-
3)を担癌マウスにきわめて少量(30μg/週1回)投与し
て、脾臓内単核細胞、とくに大型円形細胞(単球−マク
ロファージ)に生体内で強く作用する物質であることが
明らかになった。

【００７１】

【表７】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は粗オビオアクチンの高速液体クロマトグ
ラムを示す。

【図２】図２は図１の第３の画分の逆相クロマトグラム
を示す。

【図３】図３は本発明の合成ペプチドの筋肉内投与によ
る担癌マウス腫瘍細胞増殖抑制効果を示す。

【表１】

【表２】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＢＣ０７Ｋ 5/06 Ｚ 8930−4Ｈ 5/08 8018−4Ｈ 5/10 8018−4Ｈ // Ｃ０７Ｋ 99:00

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次式（１)〜(６）： Gly-Glu （１）， Pro-Val-Val （２）， Glu-Pro-Val-Val （３）， Glu-Glu-Pro-Val-Val （４）， Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val （５），及び Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val （６) のアミノ酸配列の群から選ばれる１種のアミノ酸配列を
含有する実質的に純粋な生理活性ペプチド。
【請求項２】次式（１）〜（６）： Gly-Glu （１）， Pro-Val-Val （２）， Glu-Pro-Val-Val （３）， Glu-Glu-Pro-Val-Val （４）， Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val （５），及び Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val （６) のアミノ酸配列をそれぞれ含有する６種の実質的に純粋
なペプチドよりなる群から選ばれる少なくとも２種のペ
プチドを含有してなる生理活性ペプチド組成物。
【請求項３】次式（１）〜（６）： Gly-Glu （１）， Pro-Val-Val （２）， Glu-Pro-Val-Val （３）， Glu-Glu-Pro-Val-Val （４）， Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val （５），及び Gly-Ala-Glu-Glu-Pro-Val-Val （６) のアミノ酸配列をそれぞれ含有する６種の実質的に純粋
なペプチドよりなる群から選ばれる少なくとも１種のペ
プチドと次式（７）〜（１０）： Gly-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu （７）， Glu-Glu-Glu-Glu-Glu （８）， Asp-Asp-Asp-Asp-Asp （９），及び Ala-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu （１０) のアミノ酸配列をそれぞれ含有する４種の実質的に純粋
なペプチドよりなる群から選ばれる少なくとも１種のペ
プチドを含有してなる生理活性ペプチド組成物。
【請求項４】抗原虫、抗細菌、抗ウイルス又は抗腫瘍
作用に有効な量の請求項（１）に記載の生理活性ペプチ
ドと少なくとも１種の薬学的に投与可能な担体、希釈剤
又は賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項５】抗原虫、抗細菌、抗ウイルス又は抗腫瘍
作用に有効な量の請求項（２）または（３）に記載の生
理活性ペプチド組成物と少なくとも１種の薬学的に投与
可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含有する医薬組成物。