KR100505172B1

KR100505172B1 - 키메라 인터루킨-6 용해성 수용체/리간드 단백질, 이의유사체 및 용도

Info

Publication number: KR100505172B1
Application number: KR10-2000-7000080A
Authority: KR
Inventors: 마이클 레벨; 쥬디스 체바스; 츠베 라피도트; 오리트 콜렛
Original assignee: 예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2005-08-03
Also published as: NZ502139A; BG104070A; US7374912B2; EE200000012A; KR20010021522A; DK0991661T3; EP0991661B1; HUP0002426A3; AU758161B2; BG64680B1; HK1031895A1; SK287039B6; WO1999002552A3; US7198781B1; WO1999002552A2; CZ302488B6; HUP0002426A2; NO327397B1; DE69836217D1; ATE342915T1

Abstract

암 및 간 치료, 골수 이식 강화, 다른 IL-6 관련 질환의 치료에 유용한 자연발생형 가용성 IL-6R 수용체 및 IL-6의 융합으로 작제되는 키메라 단백질을 제공한다.

Description

키메라 인터루킨-6 용해성 수용체/리간드 단백질, 이의 유사체 및 용도{CHIMERIC INTERLEUKIN-6 SOLUBLE RECEPTOR/LIGAND PROTEIN, ANALOGS THEREOF AND USES THEREOF}

본 발명은 일반적으로 인터루킨-6(IL-6) 생물학적 활성과 관계하는데, 이것은 용해성 IL-6 수용체(sIL-6R)의 길항작용에 의존한다. 좀더 적절하게는, 본 발명은 신규한 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질과 관계하는데, 이는 sIL-6R 및 IL-6의 자연발생형 그리고 이의 생물학적 활성 유사체가 융합하여 만들어지고, 암세포 성장억제를 통한 암의 치료, 뼈 골수 이식 강화, 간 질환 및 다른 IL-6 관련 이상의 치료에 특히 유용하다.

인터루킨-6(IL-6)은 잘 알려진 사이토킨으로 이들의 생물학적 활성은 막 수용체 시스템에 의해 조절되고, IL-6 수용체(IL-6R or gp80)와 다른 gp130(Hirano et al, 1994)으로 지칭되는 두 개의 상이한 단백질로 구성된다. gp80의 세포외 도메인에 해당하는 IL-6R의 용해성 형태(sIL-6R)는 인체의 자연산물로 혈액과 소변에서 당단백질로 발견된다(Novick et al, 1990, 1992). sIL-6R의 예외적 특성은 이들이 사람세포를 포함해 다양한 세포형에서 IL-6의 강력한 길항자 역할을 한다는 것이다(Taga et al, 1989; Novick et al, 1992). 이것은 gp80의 세포질내 도메인이 없어도, sIL-6R이 IL-6에 대한 반응으로 gp130의 이합화를 촉발시켜, 이후 IL-6 특이적 시그널 변환과 생물학적 효과를 조절한다는 사실에 기인한다(Murakami et al, 1993). 활성 IL-6 수용복합체는 실제로는 육각형 구조로 두 개의 gp130사슬, 두 개의 IL-6R 그리고 두 개의 IL-6 리간드로 이루어지는데(Ward et al, 1994; Paonessa et al, 1995), 여기서 sIL-6R은 gp130과 두 가지 형태의 상호작용을 하고, 이들은 IL-6-특이적 생물학적 활성에 필수적이다(Halimi et al, 1995).

sIL-6R로 처리하면, 많은 세포형에서 IL-6의 생물학적 활성이 증가한다. 쥐 골수백혈병성 M1 세포(Taga et al, 1989), 사람 유방 암(종) T47D세포(Novick et al, 1992), 또는 사람 비-소형 세포 폐 암(종)세포(Ganapathi et al, 1996)와 같은 종양 세포가 전형적인데, sIL-6R이 첨가될 때, 이들의 생장은 IL-6에 의해 상당히 저해된다. Il-6은 in vivo에서 항-전이성 활성을 가지고(Katz et al, 1995), sIL-6R은 또한 이런 IL-6 in vivo 항종양-효과를 증가시킬 수 있다(Mackiewicz et al 1995). sIL-6R 첨가에 의해 강화되는 IL-6의 또 다른 활성은 조혈 간세포를 자극해 다중혈통 클로니를 생산하는 것이다(Sui et al, 1995). 본 발명자는 또한 뇌 신경교 아세포종의 일차 배양물의 생존은 sIL-6R과 IL-6이 병용되면 증가한(Oh, 1997)반면에 IL-6 단독으로는 이런 배양물에 거의 활성을 나타내지 못한다(Kahn and De Vellis, 1994)는 것을 발견했다. 이런 발견에서 IL-6이 sIL-6R과 병용되면 모양체 신경향성 인자(CNTF)나 백혈병 저해 인자(LIF)와 같은 다른 신경향성 사이토킨의 활성을 흉내낼 수 있다는 것을 알 수 있는데, 이런 신경향성 사이토킨들 역시 IL-11 및 온코스테인 M에서와 같이 gp130을 통하여 작용한다(Hirano et al, 1994).

IL-6과 sIL-6R의 전술한 기능을 통합하는 분자를 제공하기 위한 시도에서, 사람 IL-6R 서열의 절단된 단편과 IL-6사이의 융합 단백질이 글리신-풍부 링크에 의해 연결되어 재조합 효모 세포에서 생산된다는 것이 보고되었다(Fischer et al, 1997). 이 융합 단백질은 필수적으로 IL-6R 사이토킨 수용체 N-도메인과 사이토킨 수용체 C-도메인만 보유하고 IL-6R 면역글로불린(Ig)-유사 도메인과 수용체 프레-막 영역(C-도메인과 막통 도메인사이의 영역)이 결핍되어 있다. 이와 같이 이것은 sIL-6R의 절단된 형태를 나타내는데, 융합단백질내 이 절단된 sIL-6R은 전술한 글리신-풍부 링크에 의해 IL-6의 완전 성숙형태에 필연적으로 연결된다. 고유 sIL-6R 일부분의 결핍이외에도, 효모 세포에서 생산된 융합 단백질은 포유동물 세포, 특히 사람세포에서 생산되었다면 가졌을 글리코실레이션 패턴을 갖지 않는다. 실제로, 효모-생산된 융합 단백질은 단지 57kDa정도의 분자량을 가지는데 이것은 필수적으로 전체 고유 sIL-6R과 IL-6 아미노산 잔기를 보유하고 완전하게 글리코실화된 85kDa 분자량의 융합 단백질과 대조를 이룬다(후술한 실시예 2 참조).

사람 환자를 치료하는데 사용될 수 있는 재조합 단백질을 개발할 때, 비-자연 재조합 산물에서 관찰되는 항체와 부작용을 야기하지 않기 위하여 가능한한 인체에서 발견되는 단백질의 자연형에 가깝게 하는 것이 중요하다. 이런 이유로, 천연 사람 산물과 가급적 유사한 화학물질 형태로 인터페론 β또는 과립백혈구와 같은 글리코실화된 단백질을 생산하기 위해서는 재조합 포유동물 세포계를 사용하는 것이 유리하다(Chernajovsky et al, 1984, Holloway, 1994). 적절하게 글리코실화를 못하는 효모와 같은 박테리아나 미생물은 단백질의 잘못된 접힘을 야기해, 면역성 반응이 일어난다. 이것은 IL-6이 인산화를 비롯해 N- 및 O- 글리코실레이션에 의해 해독후 심하게 변형된다는 점에서(Revel, 1989), 그리고 사람 혈액과 소변에서 얻은 천연 sIL-6R이 N-말단과 C-말단 아미노산이 일정하고 결정되어 있는 당단백질이라는 점에서 특히 중요해진다(Novick et al, 1990, 그리고 본 발명자의 공동-소유 특허 US 5,216,128 및 이에 해당하는 EP 413908 B1).

따라서, sIL-6R의 일부분과 IL-6사이의 전술한 융합 산물은 인간을 치료하기 위한 용도에서 몇 가지 결점이 있는데, 이것은 단백질의 부정확한 글리코실레이션을 제공하는 효모내 생산을 비롯해 sIL-6R의 일부분이 결핍했기 때문이다.

따라서, 사람 체액에서 발견되는 천연 sIL-6R과 천연 IL-6으로 구성되고 사람이나 다른 포유동물 세포에서 생산된 융합 분자는 아직 알려지고 있지 않고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 천연 sIL-6R과 천연 IL-6(어떤 순서에 상관없이)으로 구성되고 포유동물 세포에서 생산되는 융합 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 IL-6이나 sIL-6R 단독에는 저항성을 띠는 고도 전이성 흑색종의 생장을 저해할 수 있는 융합 단백질(sIL-6R/IL-6 키메라)을 매우 적은 농도로 사용하는 것이다.

또 다른 목적은 뼈 골수 이식 프로토콜에서 사람 조혈 간세포의 in vivo 이식을 위해 융합 단백질(sIL-6R/IL-6 키메라)을 사용하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 다른 IL-6 관련 질환, 예, 간 이상이나 신경 이상에 융합 단백질을 사용하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 천연 sIL-6R-천연 IL-6 융합 단백질(sIL-6R/IL-6 키메라)을 보유하고 암의 치료, 뼈 골수 이식 과정, 그리고 다른 IL-6 관련 질환(예, 간 이상 및 신경 이상)에 사용되는 제약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 특징은 본 발명의 공개이후에 제시될 것이다.

발명의 요약

본 발명에 따라, 필수적으로 사람 체액에서 얻은 모든 자연 발생 sIL-6R과 모든 자연 발생 사람 IL-6의 성숙형태로 구성되고 3 아미노산 잔기 길이 이상(예, 13 아미노산 잔기 길이)의 링크 펩티드에 의해 서로 연결된 많은 융합 단백질이 만들어졌다(아래의 실시예 1과 2 참조). 하지만 이들 융합 단백질에서, 링크 펩티드는 제거하고 sIL-6R부분은 직접적으로 IL-6부분에 결합할 수 있다. 비-천연 아미노산 서열을 제공하는 링크는 환자에게 항체를 유도하는 면역성 에피토프이기 때문에, 원하는 생물학적 활성을 가지고 동시에 이런 키메라가 투여될 때, 강력한 결손성 항체형성 유도의 위험을 최소화하도록 sIL-6R/IL-6을 직접 융합하는 것이 바람직하다.

상기 키메라가 세포에서 생산될 때, 사람이나 포유류 세포에 의해 도입된 적절한 글리코실레이션 및 다른 해독후 변형을 비롯해 자연 발생분자에서 발견되는Ig-유사 도메인을 포함한 전체 sIL-6R 서열의 보존은 키메라 단백질 산물의 잠재적 면역원성을 감소시키는데 또한 중요하다.

하지만, 키메라 단백질의 sIL-6R과 IL-6 부분사이의 접합점에서 대략 3개 아미노산의 매우 짧은 링크를 사용하는 것을 가능하다. 이런 짧은 링크는 면역원성 에피토프가 되지 않는다. 물론 두 부분을 분리하기 위해 최대 30개 아미노산의 좀 더 긴 링크를 사용할 수 도 있지만, 이런 링크를 가진 키메라 분자가 면역성을 띠지 않도록 주의를 기울여 생물학적 효과 및 안정 실험을 해야 한다.

사실, 본 발명에 따르면, 이런 긴 링크는 키메라 단백질의 활성에 필수적이지 않은데, 이는 특히 sIL-6R의 모든 자연-발생 서열이 키메라 분자에 통합될 때 키메라의 적절한 접힘은 긴 링크를 필요로 하지 않는다는 것을 의미한다(실시예 3과 도 5 참조: 매우 짧은 링크(3개의 아미노산)를 가진 sIL-6R/IL-6 키메라와 30개이상의 아미노산 링크를 가진 유사한 키메라사이의 비교).

이들 융합 단백질 또는 sIL-6R/IL-6 키메라는 본 발명에 따라 포유류 세포 발현계에서 효과적으로 생산되어 IL-6이나 sIL-6R 단독에는 일반적으로 아무런 반응을 보이지 않는 종양 세포에 대해 강력한 활성을 지니는 글리코실화된 산물을 생산하는데, 이들은 사람 뼈 골수 이식된 세포의 이식을 성취하는데 매우 효과적이었다(아래의 실시예 1-4 참조). 사실, 이런 뼈 골수 이식체에서, sIL-6R/IL-6 키메라는 이식된 비-정착된 다능성 조혈 간세포의 생존과 증식에 필수적이었다. 또한, 후술된 실험결과 및 다른 분석으로부터, 본 발명의 sIL-6R/IL-6 키메라 단백질의 다양한 유사체를 만들 수 있는데, 이들 유사체는 필수적으로 sIL-6R/IL-6 키메라의 동일한 생물학적 활성을 가지고 하나 이상의 아미노산이 결손, 첨가 또는 다른 것으로 치환된 sIL-6R/IL-6 키메라로 이들의 유일한 제한은 자연 발생 sIL-6R과 IL-6 서열의 대부분을 보유한다는 것이다. 가령, 자연 발생 sIL-6R과 IL-6 서열에 대한 아미노산의 첨가는 최대 20개 아미노산으로 한정되고 가급적 이들 첨가는 sIL-6R과 IL-6사이의 접합위치, 즉, 링크분자에 위치한다. 유사하게, sIL-6R과 IL-6 서열의 결손은 최대 20-30개 아미노산에 한정된다; 그리고 sIL-6R과 IL-6 서열내 아미노산잔기의 다른 아미노산 잔기로의 대체는 최대 20-30개 아미노산에 한정된다. 전술한 결손, 첨가 그리고 치환 모두 본 발명에 따라 수용될 때는 수득된 변형 유사체가 필수적으로 자연-발생 서열로 이루어진 sIL-6R/IL-6 키메라의 생물학적 활성을 보유하고 포유류 세포에서 발현시 필수적으로 자연-발생 서열로 이루어진 키메라와 동일한 글리코실레이션 패턴을 보유하는 경우이다.

따라서, 본 발명은 키메라 글리코실화된 용해성 인터루킨-6 수용체(sIL-6R)-인터루킨-6(IL-6)단백질(sIL-6R/IL-6) 그리고 이의 생물활성 유사체를 제공하는데, 이들은 sIL-6R의 모든 자연 발생 형태 및 IL-6의 모든 자연 발생 형태사이의 융합 단백질 산물로 구성되고, 상기 sIL-6R/IL-6과 이의 유사체는 자연 발생 sIL-6R 및 IL-6과 유사한 방식으로 글리코실화한다.

본 발명의 키메라 단백질의 구체예에는 다음과 같은 것이 있다:

(i) 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질과 이의 생물학적 활성 유사체, 여기서 상기 sIL-6R은 펩티드 링크 분자를 통해 IL-6에 융합한다.

(ii) 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질과 상기 (i)에서와 같은 이의 생물학적 활성 유사체, 여기서 상기 링크는 매우 짧은 3-4 아미노산 잔기의 비-면역원성 링크다.

(iii) 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질과 상기 (ii)에서와 같은 이의 생물학적 활성 유사체, 여기서 상기 링크는 3가 펩티드 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met)이다.

(iv) 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질과 상기 (i)에서와 같은 이의 생물학적 활성 유사체, 여기서 상기 링크는 13개의 아미노산 잔기 서열: E-F-G-A-G-L-V-L -G-G-Q -F-M의 펩티드다(Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met)(SEQ ID :NO 1).

(v) 여기서 sIL-6RδVal/IL-6으로 지칭되고 sIL-6R의 C-말단 Val-356과 IL-6의 N-말단 Pro-29사이 3가 펩티드 링크 서열 E-F-M을 가진 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질, 이때 상기 키메라 단백질은 도 3에서 설명한 서열을 가진다.

(vi) 여기서 sIL-6RδVal/L/IL-6으로 지칭되고 sIL-6R의 C-말단 Val-356과 IL-6의 N-말단 Pro-29사이 13개의 펩티드 링크 서열 E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M을 가진 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질, 이때 상기 키메라 단백질은 도 3의 357-359위치사이의 3가 펩티드 서열 E-F-M이 상기 13개 아미노산 펩티드 서열로 치환되었다.

(vii) 완전히 가공된 형태로 포유류 세포에서 생산되는 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질.

(viii) CHO 세포에서 생산되는 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질.

(xi) 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질과 이의 생물학적 활성 유사체, 여기서 상기 키메라 단백질과 유사체는 극히 악성 암세포의 생장을 억제할 수 있는 것으로 특징지어진다.

(xii) 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질과 이의 생물학적 활성 유사체, 여기서 상기 키메라 단백질과 유사체는 뼈 골수 이식에서 사람 조혈 세포의 in vivo 이식을 유도할 수 있는 것으로 특징지어진다.

(xiii) 키메라성 sIL-6R/IL-6 단백질과 이의 생물학적 활성 유사체, 여기서 상기 키메라 단백질과 유사체는 간 독성 물질에 대해서 간을 보호할 수 있는 것으로 특징지어진다.

본 발명은 또한 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질 및 본 발명에 따른 이의 생물학적 유사체를 인코드한 DNA를 제공한다.

또한, 본 발명은 DNA 벡터를 제공하는데, 이것은 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질 및 본 발명에 따른 이의 생물학적 활성 유사체를 인코드한 DNA를 포함하고, 포유류 세포에서 상기 키메라 단백질의 발현에 적당하다.

본 발명의 DNA 벡터의 구체예에는 다음과 같은 것이 있다:

(i) 사람 세포에서 상기 키메라 단백질의 발현에 적당한 DNA 벡터.

(ii) 상기 벡터가 포유류나 사람 세포에서 발현될 때, 발현된 단백질이 포유류나 사람 세포에 의한 키메라 단백질을 완전하게 가공하고 세포에서 완전하게 가공된 키메라 단백질을 상기 세포가 성장하는 배양배지로 분비하게 하는 서열을 보유하는 DNA 벡터.

(iii) 시토메갈로바이러스(CMV)프로모터의 조절하에서 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질을 인코드한 DNA 서열을 보유한 pcDNA3 벡터를 포함하고 pcDNAsIL-6R/IL-6 플라스미드로 지칭되는 DNA 벡터.

(iv) 시토메갈로바이러스(CMV)프로모터의 조절하에서 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질을 인코드한 DNA 서열을 보유한 pcDNA3 벡터를 포함하고 pcDNAsIL-6R/L/IL-6 플라스미드로 지칭되는 DNA 벡터, 여기서 상기 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질을 인코드한 DNA 서열에는 sIL-6R 부분을 인코드한 서열과 단백질의 IL-6 부분을 인코드한 서열사이에 놓인 EcoRI위치에서 링크 펩티드를 인코드한 링크 서열이 삽입되어 있다.

유사하게, 본 발명은 상기 DNA 벡터를 보유한 형질변환 포유류 세포를 제공하는데, 이것은 벡터에 의해 운반된 sIL-6R/IL-6 키메라 단백질 서열을 발현하고 발현된 단백질을 완전하게 가공하여 이를 세포가 성장하는 배양배지로 분비할 수 있다.

이들 형질변환된 세포의 구체예에는 pcDNA sIL-6R/L/IL-6 벡터에 의해 트랜스펙션된 사람 태아 신장 세포 293 (HEK293)이 있는데, 이 세포는 sIL-6R/IL-6 키메라 단백질을 발현하고 상기 단백질을 완전하게 가공하여 이를 세포가 성장하는 배양배지에 대략 85kDa 당단백질의 형태로 분비할 수 있다.

형질변환된 세포의 또 다른 구체예에는 pcDNA sIL-6R/IL-6 벡터에 의해 트랜스펙션된 CHO(Chinese Hamster Ovary)세포가 있는데, 이 세포는 sIL-6-R/IL-6 키메라 단백질을 발현하고 상기 단백질을 완전히 가공하여 이를 세포가 성장하는 배양배지에 대략 85kDa 당단백질의 형태로 분비할 수 있다.

본 발명은 또한 키메라 단백질 및 이의 생물학적 활성 유사체를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 단백질이나 유사체의 발현, 가공 그리고 세포가 성장하는 배양배지로의 분비에 적당한 조건하에서 전술한 형질변환 세포를 생육하고; 그리고 sIL-6R에 특이적인 단일클론 항체를 이용해 면역친화력 크로마토그래피에 의해 배양배지에서 얻은 단백질 또는 유사체를 정제하는 것으로 이루어진다.

본 발명의 키메라 단백질은 다음과 같은 많은 용도에 사용된다:

(i) 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질이나 유사체, 이의 임의 염 그리고 이의 혼합물의 암세포의 저해물질로서의 용도.

(ii) (i)에서 극히 악성 흑색종 세포의 저해물질로서의 용도.

(iii) 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질이나 유사체, 이의 임의 염, 그리고 이의 혼합물의 뼈 골수 이식에서 사람 조혈 세포의 이식을 유도하기 위한 활성 성분으로서의 용도.

(iv) 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질이나 유사체, 이의 임의 염, 그리고 이의 혼합물의 조혈을 증가시키거나, 간 이상 및 신경이상을 치료하거나, 또는 IL-6이나 sIL-6R이 사용되는 다른 목적을 위한 활성 성분으로서의 용도.

유사하게, 본 발명의 키메라 단백질은 많은 의학적 징후를 위한 약물을 제조하기 위하여 사용된다, 다시 말하면, 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질이나 유사체, 이의 임의 염 그리고 이의 혼합물은 암세포를 저해하는 방식으로 암을 치료하는 약물의 제조에 또는 뼈 골수 이식에서 사람 조혈 세포의 이식을 유도하는 방식으로 뼈 골수 이식을 강화하기 위한 약물의 제조에, 또는 신경 이상을 치료하기 위한 약물의 제조에, 또는 IL-6이나 sIL-6R이 사용되는 다른 목적을 위한 약물의 제조에 사용된다.

또한 본 발명은 또한 활성성분으로 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질이나 이의 유사체, 그리고 제약학적으로 수용가능한 담체, 희석제나 부형제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 제약학적 조성물의 구체예에는 다음과 같은 것이 있다:

(i) 포유류 암의 치료를 위한 제약학적 조성물.

(ii) 뼈 골수 이식의 강화를 위한 제약학적 조성물.

(iii) 간 및 신경 이상을 치료하거나 또는 조혈을 증가시키거나 또는 IL-6이나 sIL-6R이 사용되는 다른 목적을 위한 제약학적 조성물.

본 발명은 또한 포유동물에서 암을 치료하거나, 또는 뼈 골수 이식을 강화하거나 또는 조혈을 증가시키거나 또는 IL-6이나 sIL-6R이 사용되는 다른 목적을 위한 방법을 제공하는데, 이 방법은 환자에게 제약학적 조성물을 적당한 약제형 및 적절한 투여경로로 투여하는 것이다.

명확히 하기 위해, 본 발명은 임의 순서의 IL-6과 sIL-6R사이의 키메라와 관계한다, 다시 말하면, 전반적으로 여기에서는 키메라를 sIL-6R/IL-6으로 지칭하지만 N-말단 및 C-말단 부분은 완전히 바뀌어 이때 IL-6-sIL-6R 단백질이 될 수도 있다.

도 1(A, B)은 키메라 단백질을 인코드한 키메라 DNA 분자의 작제에 사용된 다양한 벡터, 시약 그리고 처리단계의 개요도를 나타내는데, 이때 키메라 단백질에는 Val 356 잔기를 인코드한 sIL-6R의 자연 형태가 보존되어있고 그 다음으로 실시예1에서 자세하게 밝힌 것과 같이 IL-6의 자연, 성숙, 가공된 형태의 서열이 있다;

도 2(A, B)는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(A) 및 생리활성 개요(B)에 의해 sIL-6RδVal/IL-6 p86 키메라를 확인하기 위해 시행된 분석에서 수득한 결과를 보여주는데, 이때 도 2A에서는 키메라 단백질을 인코드한 벡터로 트랜스펙션된 세포배양물에서 수득된 분비된 단백질 샘플이 실린 친화력 크로마토그래피 칼럼에서 추출된 면역정제 분취물이 전기영동된 쿠마시 착색된 겔의 재현이 나타나 있다; 그리고 도 2B에서는 실시예 2와 3에서 자세하게 밝힌 것과 같이 친화력 크로마토그래피 칼럼에서 추출된 전술한 각각의 분취물의 생리활성(F10.9 흑색종 세포의 생장억제)의 도표가 나타나 있다;

도 3은 sIL-6RδVal/IL-6 키메라의 아미노산 서열(한-문자 코드)을 나타내는데, 여기에는 실시예 1과 2에서 자세하게 밝힌 것과 같이 N-말단 시그널 펩티드(서열의 제일 윗줄), 면역글로불린-유사(Ig-유사)도메인, 사이토킨 수용체 N-도메인(밑줄), 사이토킨 C-도메인(서열의 제일 윗줄)및 수용체 프레-막 영역(C-도메인과 막통 도메인사이 영역), 키메라의 모든 sIL-6R 부분( 키메라의 성숙 IL-6 부분(아래에 밑줄))을 포함해 분자의 상이한 도메인이 나타나 있다;

도 4(A, B)는 4일동안 sIL-6R/IL-6 키메라 단백질 처리의 유(A)무(B)하에 배양중인 F10.9 흑색종 세포의 사진을 나타내는데, 이때 도 4B에는 실시예 3에서 밝힌 것과 같이 sIL-6R/IL-6 키메라 처리에 의한 전이성 흑색종 세포(F10.9)에서 유도된 형태학적 변화가 명확하게 나타나 있다;

도 5는 0.12ng/㎖ 내지 150ng/㎖사이 범위의 다양한 키메라 농도에서 sIL-6R/IL-6 키메라 단백질에 의한 F10.9 흑색종 세포의 생장 저해를 보여주는 결과의 도표인데, 여기에서는 실시예 3에서 밝힌 것과 같은 3개 아미노산 링크 IL-6RLIL-6을 가진 키메라와 13개 아미노산 링크(IL-6RLIL-6)를 가진 키메라를 비교한다;

도 6은 0-40ng/㎖범위사이의 농도의 분리된 IL-6 단독(열린 사각형으로 표시된 위쪽 점선 곡선) 또는 sIL-6R 단독(IL-6 농도가 0인 수직축위 모든 곡선의 교차지점)의 F10.9 흑색종 세포에 대한 성장-저해 효과의 부재를 나타내는 결과의 도표인데, 또한 이것은 세 개의 아래쪽 곡선(열린 삼각형과 원으로 표시된 두 개의 점선 곡선과 닫힌 사각형으로 표시된 실선)에서 보이는 것과 같이 IL-6과 sIL-6R이 다양한 농도(IL-6은 10ng/㎖ 내지 40ng/㎖ 농도범위, sIL-6R은 각각의 IL-6에 대해100ng/㎖, 200ng/㎖, 400ng/㎖)로 부가될 때 관찰된 생장 억제 효과를 나타낸다;

도 7은 SCID-NOD 쥐에서 뼈 골수 이식동안 사람 조혈 간세포의 성공적인 이식을 위한 sIL-6R/IL-6의 필요를 보여주는 서든 블라트의 자가 방사선 진단의 재현이다(두개의 우선은 다른 생존인자, SCF, FLT-3과 부가하여 sIL-6R/IL-6 키메라 단백질을 흡수한 쥐를 나타내고 이에 반하여 세 개의 좌선은 격리된, 즉, 비-융합된 IL-6 및 sIL-6R을 비롯해 단지 SCF 및 FLT-3 그리고 SCF, FLT-3을 흡수한 쥐를 나타낸다);

도 8은 IL-6 및 sIL-6R의 혼합물과 비교한 sIL-6R/IL-6 키메라의 친화력 특성의 스캇차드 곡선(Scatchard plot)으로 4 대 1의 기울기 비율로 닫힌 사각형으로 표시된 키메라와 닫힌 다이아몬드로 표시된 혼합물의 수치를 나타낸다.

도 9는 sIL-6R+IL-6의 혼합물 또는 sIL-6R(IL-6 없음)과 비교한 F10.9 흑색종 세포에 대한 sIL-6R/IL-6 키메라의 좀더 높은 활성을 나타낸다.

도 10은 간 독성에 대한 sIL-6R/IL-6 키메라 보호를 나타내는데, 수치는 네번 실험의 평균값을 표시하고, 닫힌 사각형은 IL-6-/-쥐를 표시하고, 닫힌 다이아몬드는 IL-6을 흡수한 IL-6-/-쥐를 표시하고, 그리고 닫힌 별은 키메라를 흡수한 IL-6-/-쥐를 표시한다.

도 11은 IL-6-sIL-6RδVal 키메라 3e의 아미노산 서열(한 문자 코드)을 나타내는데, 링크는 밑줄 그어져있다; 그리고

도 12는 실시예9에서 밝힌 것과 같이 sIL-6R/IL-6 키메라(닫힌 사각형) 그리고 두 개의 돌연변이(Mutt 39 (HD)-닫힌 다이아몬드) 그리고 뮤트(Mutt) NHD(밝게 채워진 별)와 비교한 키메라 3e(어둡게 채워진 별)의 F10.9 흑색종 세포에 대한 생리활성을 나타낸다.

본 발명은 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질과 이의 생물활성 유사체와 관계하는데, 이들은 필수적으로 sIL-6R의 모든 자연 발생형태와 IL-6의 모든 자연 발생형태를 함께 융합하고, 융합의 위치는 짧게는 3개 아미노산 링크 펩티드를 통해서 이루어지며 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질이나 유사체는 자연 발생 sIL-6R 및 IL-6과 유사한 양과 글리코실레이션 패턴을 갖는다. 포유류 세포, 특히, 사람 세포(아래의 실시예 1-4 참조) 또는 CHO 세포(아래의 실시예 6 참조)에서 본 발명에 따라 생산된 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질은 이런 세포에서 효과적으로 발현하고 고도로 글리코실화되어 IL-6이나 sIL-6R 단독에는 전혀 반응을 보이지 않는 종양 세포에 대한 강력한 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다.

특히, 본 발명에 따르면, 본 발명의 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질은 비-융합된 sIL-6R과 IL-6의 혼합물이 사용될 때 필요한 것 보다 적은 농도로 F10.9 흑색종 세포와 같은 고도 악성 포유류 세포의 생장을 중단시키는 것으로 관찰되었다(아래의 실시예 1-3 참조). 이런 F10.9 흑색종 세포가 IL-6이나 sIL-6R만을 각각 별개로 처리할 때에는 정상적으로 성장하고 단지 상당히 많은 약량의 비-융합된 IL-6과 sIL-6R 혼합물에 노출된 경우에만 생장이 중단되었다는 점에서 이 결과는 특히 중요하다.

따라서, 본 발명의 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질은 놀랍게도 격리된 부분의 혼합물, 즉, 비-융합된 IL-6과 sIL-6R의 혼합물보다 극히 악성 흑색종 세포의 강력한 저해물질이 된다. 본 발명의 키메라 단백질은 이런 이유로 다양한 암을 치료하기 위한 활성성분으로 특히 유용하다.

비-융합된 IL-6과 sIL-6R의 혼합물보다 더 높은 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질의 활성은 gp130에 대한 더 높은 친화력 때문이다(실시예 7).

또한, 본 발명에 따르면, 본 발명의 키메라 sIL-6R/IL-6 분자는 뼈 골수 이식을 강화하는데 특히 유용한 것으로 밝혀졌다. 사실, 사람 뼈 골수세포를 합병증이 심각한 면역결핍 쥐(SCID)로 이식하기 위한 공지된 프로토콜을 이용해, 두 개의인자, SCF와 Flt3-리간드는 사람 세포를 수용쥐 뼈 골수로의 이식을 충분히 촉진하지 못하고 단지 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질이 부가될 때만 성공적으로 이식된다는 것이 밝혀졌는데, 간세포(SCF)와 Flt3-리간드는 SCID 쥐에서 수용자 뼈 골수로 장기간-이식이 가능한 일차 다능성 조혈 간세포의 생존과 증식을 위해 사용된다. 이런 발견을 통해, 키메라 단백질은 이런 이식 프로토콜에 필수적이라는 것을 알 수 있다. 동일한 실험에서, 비-융합된 IL-6과 sIL-6R이 따로 부가될 때는 성공적인 뼈 골수 이식을 충분히 촉진하지 못하고 함께 부가될 때에도 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질에 비해 활성이 훨씬 적었다, 다시 말하면, 100ng/㎖의 효과농도에서 sIL-6R/IL-6 키메라 단백질은 뼈 골수 이식을 성공적으로 촉진한 반면에 두 개의 격리된 비-융합 sIL-6R과 IL-6은 높은 농도(sIL-6R은 125-1250ng/㎖, IL-6은 50-200ng/㎖)로 함께 부가되어도 이식을 촉진하는데 있어 활성이 훨씬 적었다.

본 발명의 상기 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질은 가급적 사람 세포나 햄스터 CHO 세포와 같은 임의의 다른 적당한 포유류 세포 발현계에서 생산된 재조합 글리코실화된 sIL-6R/IL-6 키메라인데, 이때 세포 발현계는 사람 세포가 하는 것과 같이 단백질을 글리코실화 시키고 해독후 동일한 변형을 도입할 수 있다. 중요한 특성은 이렇게 생산된 키메라 당단백질은 짧은 3개의 펩티드 또는 좀더 긴 링크 펩티드가 키메라 단백질의 sIL-6R과 IL-6 부분사이에 통합되는 경우를 제외하고는 외인성 비고유 폴리펩티드 서열의 첨가나 절단없이 인체에서 발견되는 자연 sIL-6R과 IL-6 부모 분자에서와 같이 가공되고 변형된다.

본 발명의 상기 선호되는 키메라 단백질을 만들기 위하여, 자연 발생 sIL-6R과 IL-6의 다음 특징을 고려하였다: 사람 세포에 존재하는 IL-6R은 468개 아미노산을 인코드한 cDNA에 의해 생산되는데, 이것은 단일 펩티드, 면역글로불린(Ig)유사 도메인, 사이토킨 결합 도메인, 막통 영역 그리고 세포질 도메인로 구성된다(Yamasaki et al, 1988). sIL-6R의 용해성 형태는 인체에서 발견되는데, 이것은 막에서 얻은 성숙 IL-6R과 같이 Leu-20 (Novick et al, 1990)에 대응하는 N-말단과 IL-6R의 막통 영역 바로 앞의 Val-356에 대응하는 C-말단을 갖는다( 공동-소유의 U.S. Pat. No. 5,216,128 and EP 413.908B1). 이 sIL-6R 서열을 IL-6에 융합하기 위하여, EcoRI 제한위치를 Val-356의 뒤에 도입하였다. IL-6 cDNA의 Pro-29에서 시작해 Met-212(Zilberstein et al, 1986; Hirano et al, 1986)에서 끝나는 성숙 IL-6의 서열은 이 EcoRI 위치에 이어서 도입하였다. sIL-6R과 IL-6 부분을 키메라 단백질내에서 각각 분리하기 위해 원하는 길이의 링크 펩티드를 EcoRI 위치에 도입할 수도 있지만 꼭 필요한 것은 아니다. 아래의 실시예에서 후술한 바와 같이, 두 개의 상이한 키메라 단백질이 가능 키메라 단백질의 예로서 만들어졌는데, 하나는 EcoRI 위치에 3개의 펩티드 링크를 가지고 다른 것은 EcoRI 위치에 13개의 아미노산 잔기를 가지는데 둘 모두 동등하게 생물활성을 띤다.

본 발명은 또한 본 발명의 상기 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질의 유사체와 관계하는데, 이 유사체는 sIL-6R과 IL-6의 자연 발생 서열만을 가진 키메라 단백질과 동일한 활성을 보유한다. 이런 유사체는 키메라 단백질의 sIL-6R및 IL-6 부분내 최대 30개 아미노산 잔기가 다른 것들에 의해 결손, 첨가 또는 치환된 것인데, 이런 종류의 변이는 실제적으로 키메라 단백질 그 자체에 비추어 키메라 단백질 유사체의 생물활성을 변화시키지 않고 이런 유사체의 sIL-6R 부분은 필수적으로 자연 발생 구조인 단일 펩티드, Ig-유사 도메인, 사이토킨 수용체 N-도메인, 사이토킨 수용체, 그리고 수용체 프레-막 도메인을 보유한다. 유사하게, 이런 키메라 단백질 유사체는 필수적으로 IL-6 부분의 자연-발생 성숙형태를 보유해야 한다. 다양한 유사체는 대개 각각이 구별되고 키메라 단백질내 sIL-6R 및 IL-6 부분을 연결하는 링크 펩티드의 위치에서 기초 키메라 단백질 분자(필수적으로 자연-발생 sIL-6R과 IL-6 서열을 보유)와 달라진다. 이런 링크는 최대 30개 아미노산 길이이고 sIL-6R 및 IL-6 부분을 키메라 단백질내에서 서로 분리하는 역할을 한다. 이런 링크에 있어서, 키메라 단백질이 부정확하게 접혀 불활성화되지 않도록 또는 키메라 단백질 유사체가 면역성 단백질이 되어 치료받고 있는 환자에게 항체를 유도하고 결과적으로 적어도 중장기 약물로서 비효율적으로 되지 않도록 서열을 조심스럽게 선택(그리고 적절한 표준 분석에서 이런 유사체를 생물학적으로 검사)해야 한다.

본 발명의 상기 키메라 단백질 유사체에 관하여, 이들 유사체는 본 발명의 기초 키메라 단백질의 하나이상, 최대 30개의 아미노산 잔기가 본 발명의 기초 키메라 단백질과 비교하여 생성산물의 활성을 별로 변화시키지 않고 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 또는 결손되거나 또는 하나이상의 아미노산 잔기가 본 발명의 키메라 단백질의 고유서열(필수적으로 자연 발생 sIL-6R 및 IL-6 서열을 포함)에 부가된 것이다. 이들의 유사체는 공지된 합성법 또는 위치-지정 돌연변이 기술, 또는 다른 공지된 적당한 기술에 의해 만들어진다.

임의의 이런 유사체는 기초 sIL-6R/IL-6 키메라의 서열을 상당히 복제한 서열을 갖는데 이것은 기초 키메라와 유사한 활성을 가지기 위해서다. 따라서, 일상적인 실험을 통해 임의의 주어진 유사체가 본 발명의 기초 키메라 단백질과 거의 동일한 활성을 갖는 지를 결정할 수 있는데, 이런 실험에서 유사체는 아래의 실시예 2-4에서 밝힌 생물활성 검사를 받는다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 키메라 단백질의 유사체 또는 이를 코딩한 핵산은 치환 펩티드나 폴리뉴클레오티드로서 한정된 일단의 실제적인 대응 서열을 포함하는데, 이들 서열은 과도한 실험없이 여기에 제시된 지시와 안내에 기초하여 당업자에 의해 일상적으로 만들어질 수 있다(단백질 화학과 구조의 자세한 설명을 위해 Schulz, G.E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978;Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983 참조, 코돈 선호와 같은 뉴클레오티드 서열 치환의 제공을 위해 Ausubel et al, supra, at §§ A.1.1-A.1.24, and Sambrook et al, Current Protocols in Molecular Biology, Interscience N.Y. §§6.3 and 6.4 (1987, 1992),at Appendice C and D 참조).

본 발명에 따른 유사체에 대한 선호되는 변화는 "보존성"치환으로 알려져 있다. 키메라 단백질내 보존성 아미노산 치환체는 필수적으로 자연-발생 sIL-6R 및 IL-6 서열을 갖고 실제적으로 유사한 물리화학적 성질을 가진 그룹내 유사성 아미노산을 포함하는데, 이 그룹 멤버사이에서 치환이 일어나도 분자의 생물활성은 계속 유지된다(Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974)). 아미노산의 삽입과 결손은 특히, 삽입과 결손이 단지 몇 개, 예, 30개의 이하 적절하게는 10개 이하와 관련되고 기능형성에 중요한 아미노산, 예 시스테인 잔기가 제거되거나 자리를 바꾸지 않는 경우에는 기능의 변화없이 상기-정의한 서열에서 이루어 질 수 있다(Anfinsen, "Principles That Govern The Folding of Protein Chains", Science, Vol. 181, pp. 223-230 (1973). 이런 결손이나 삽입에 의해 생성된 유사체는 본 발명의 범위내에 있다.

선호되는 유사 아미노산 그룹은 표1에 정의되어 있다. 좀더 선호되는 유사 아미노산 그룹은 표II에 정의되어 있다; 그리고 가장 선호되는 유사 아미노산 그룹은 표III에 정의되어 있다.

본 발명에 사용되는 키메라 단백질의 유사체를 수득하기 위해 사용될 수 있는 단백질에서 아미노산 치환체 생산의 예에는 임의의 공지된 방법단계를 포함한다(US 특허 RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585 그리고 4,737,462(Mark et al); 5,116,943(Koths et al); 4,965,195(Namen et al); 4,879,111(Chong et al); 그리고 5,017,691(Lee et al); 그리고 US Patent No. 4,904,584 (Shaw et al)에서 제시한 리신 치환된 단백질).

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명에 사용하기 위한 키메라 단백질의 임의 유사체는 필연적으로 전술한 본 발명의 기초 키메라 단백질의 서열과 대응하는 서열을 갖는다. "필수적으로 대응하는"은 기본적 특성, 특히 암 세포 증식을 저해하거나 뼈 골수 이식을 촉진하는 능력에 관한한 아무런 영향을 주지 않는 기초 키메라 단백질 서열에 약간의 변화가 일어난 유사체를 포괄하기 위한 것이다. "필수적으로 대응하는"의 일반적 범주내에 있는 변화의 유형은 본 발명의 키메라 단백질을 인코드한 DNA의 전통적 전이 기술에서 이루어진 것으로 경미한 변화를 야기하는데, 전술한 방식으로 원하는 활성을 선별한다.

본 발명에 따른 유사체는 DNA나 RNA와 같은 핵산에 의해 인코드된 것을 포함하는데, 여기서 핵산은 엄격한 조건하에서 DNA나 RNA에 하이브리드가 되어 본 발명에 따른 키메라 단백질을 인코드하고 필수적으로 sIL-6R과 IL-6을 인코드한 모든 자연-발생 서열로 구성된다. 가령, 하이브리드되는 DNA와 RNA는 본 발명의 동일 단백질을 인코드한 것으로 도 3에서 밝힌 서열을 가지며 유전자 코드의 퇴화로 인해 뉴클레오티드 서열에서 자연-유도 뉴클레오티드 서열과 차이가 난다, 다시 말하면, 다소 상이한 핵산 서열이 이런 퇴화로 인해 동일한 아미노산 서열을 코드하게 된다. 또한, 전술한 것과 같이, 아미노산 변화(결손, 첨가,치환)의 양은 최대 30개의 아미노산에 한정되는데, 이것은 최대 변화량에서도, 본 발명에 따른 유사체는 sIL-6R부분 및 모든 IL-6부분에서 필수적으로 판독 서열(가공 전에), Ig-유사 도메인, 사이토킨 수용체 N- 및 C-도메인 그리고 수용체 프레-막 영역(C-도메인과 막통 도메인사이의 영역)을 갖도록 하기 위한 것이다. 이런 핵산은 이것이 본 발명의 키메라 단백질의 기능활성을 보유한 폴리펩티드를 인코드하는지를 결정할 수 있는 유력한 후보다. "엄격한 조건"이란 하이브리드화와 연이은 세척 조건을 의미하는데, 이런 조건은 당업자가 통상적으로 "엄격한"으로 지칭하는 것이다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., para. 6.3 and 6.4 (1987, 1992) and Sambrook et al., supra). 제한없이, 엄격한 조건의 예에는 5분동안 2 x SSC와 0.5% SDS, 15분동안 2 x SSC와 0.1% SDS; 30-60분동안 37℃ 0.1 x SSC와 0.5% SDS 그리고 이후 30-60분동안 68℃ 0.1 x SSC와 0.5% SDS에서 연구중인 하이브리드의 계산 Tm보다 12-20℃ 낮은 세척 조건이 포함된다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 엄격한 조건은 DNA 서열, 올리고뉴클레오티드 프로브(10-40 염기)또는 혼성된 올리고뉴클레오티드 프로브에 또한 의존한다. 혼성된 프로브를 사용하면, SSC 대신에 테트라메틸 암모니움 클로라이드(TMAC)를 사용하는 것이 낫다(Ausubel, supra).

여기서 "염"이란 카르복실 그룹의 염과 본 발명의 키메라 단백질 및 이의 유사체의 아미노 그룹의 산 첨가 염 모두를 의미한다. 카르복실 그룹의 염은 당업자에게 공지된 방법으로 만들어지며, 예를 들어, 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철 또는 아연염등과 같은 무기염, 그리고 트리에탄올아민과 같은 아민, 아르기닌이나 리신, 피페리딘, 프로케인등으로 형성된 유기염기를 가진 염을 포함한다. 산 첨가 염에는 염산이나 황산과 같은 무기산을 가진 염, 그리고 아세트산이나 옥살산과 같은 유기산을 가진 염이 포함된다. 물론, 임의의 이런 염은 본 발명의 키메라 단백질이나 이의 유사체와 실제적으로 유사한 활성을 가져야 한다.

본 발명은 또한 본 발명의 상기 키메라 단백질 및 이의 유사체를 인코드한 DNA 서열과 관계하는데, 또한 적당한 포유류 세포, 가급적 사람세포에서 발현을 위한 이런 DNA 서열을 운반하는 DNA 벡터에도 관계한다. 본 발명의 벡터의 구체예는 pcDNA sIL-6R/IL-6 플라스미드인데, 이것은 시토메갈로바이러스(CMV)프로모터의 조절하에서 sIL-6R/IL-6 융합서열을 보유한 pcDNA3 벡터(Invitrogen)를 포함한다.

본 발명은 또한 형질변형된 포유류 세포, 가급적 사람세포와 관계하는데, 이 세포는 본 발명의 상기 단백질을 발현할 수 있다. 이런 형질변형된 세포의 구체예는 pcDNA sIL-6R/IL-6으로 트랜스펙션된 사람 태아 신장 세포 293(HEK 293, ATCC CRL 1573)인데, 이것은 융합된 sIL-6R/IL-6 키메라를 85kDa 당단백질로 분비한다.

또 다른 구체예는 pcDNA sIL-6R/L/IL-6 플라스미드인데, 이것은 EcoRI 위치에 10개의 추가 아미노산을 인코드한 짧은 링크가 삽입되어 있어 상기 pcDNA sIL-6R/IL-6과 차이가 난다. 다양한 길이의 많은 상이한 서열이 sIL-6R과 IL-6 사이의 거리를 최적화하기 위하여 도입될 수 있다.

본 발명은 또한 IL-6부분이 sIL-6R부분을 선행하는 키메라 단백질을 포함한다(도11).

본 발명은 또한 본 발명의 키메라 단백질이나 이의 유사체를 생산하고 정제하는 방법과 관계하는데, 이 방법은 키메라 단백질 산물을 배양배지로 발현하고 분비하기에 적당한 조건하에서 상기 형질변형된 세포를 생육하여 이후 분비된 단백질을 아래의 실시예 2와 5에서 밝힌 것과 같이 항-sIL-6R 단일클론성 항체 34.4를 이용한 면역친화력 크로마토그래피에 의해 정제한다.

본 발명은 또한 제약학적 조성물과 관계하는데, 이 조성물은 활성성분으로 sIL-6R/IL-6 키메라, 이의 유사체, 이의 혼합물 또는 이의 염 그리고 제약학적으로 수용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함한다. 본 발명의 제약학적 조성물의 구체예에는 강화된 IL-6 작용을 위한 제약학적 조성물, 암의 치료를 위한 제약학적 조성물, 뼈 골수 이식을 위한 제약학적 조성물, 신경이상을 치료하기 위한 제약학적 조성물, 간 질환을 치료하기 위한 제약학적 조성물 그리고 IL-6이나 관련된 사이토킨의 다른 목적을 위한 제약학적 조성물이 포함된다.

본 발명의 제약학적 조성물은 키메라 단백질이나 이의 유사체를 생리학적으로 수용가능한 담체, 또는 안정제 또는 부형제와 혼합하여 투여용으로 제조하고 약량 바이얼에서 동결건조 방식에 의해 약제형으로 제조한다.

투여의 방법은 유사한 약물을 위한 기존의 임의 투여 형태로 이루어질 수 있고 치료하는 조건에 따라 달라지는데, 예를 들면 정맥내, 근육내, 피하내 주사, 국소 주사나 표면부착, 또는 지속적 주입등이 있다.

투여되는 활성성분의 양은 투여 경로, 치료하는 질병 그리고 환자의 상태에 따라 달라진다. 예를 들면, 국소 주사는 정맥내 주입보다 체중당 더 소량을 필요로 한다.

본 발명은 또한 암의 치료, 뼈 골수 이식, 조혈, 특히 혈소판 신생의 증가, 신경 이상의 치료, 화학물질(탄소 테트라 클로라이드, 알코올. 파라세마톨)이나 다른 원인(바이러스, 수술)에 의한 괴사성 질병을 가진 환자의 간 조직 보호 그리고 IL-6이나 관련된 사이토킨의 다른 목적에 사용하기 위한 본 발명의 키메라 단백질 또는 이의 유사체 또는 이의 혼합물의 용도와 관계한다. 유사하게, 본 발명은 전술한 부조를 치료하거나 전술한 징후에 사용하기 위한 약물의 제조에 이용되는 키메라 단백질 또는 이의 유사체 또는 이의 혼합물과 관계한다.

전술한 치료방법에 더하여, 또한 탈체 처리와 키메라나 이를 인코드한 DNA를 이용한 유전자 치료법이 연구되고 있다.

본 발명은 다음의 실시예와 도면에서 자세히 설명할 것이다.

실시예 1. sIL-6RδVal/IL-6 키메라 발현벡터의 작제

도 1에서, sIL-6RδVal/IL-6 키메라 단백질에 대한 코딩 서열을 가지는 발현 벡터의 작제 단계를 도면으로 나타내었는데, 이때 벡터에는 다양한 시발 벡터 및 중간 벡터, 다양한 시약 및 반응 단계를 모두 포함시켰다. 이와 같은 작제 단계는 선택된 발현 벡터를 작제하는 당분야에 공지된 모든 기술을 이용하였다(Sambrook et al., 1989). 그 과정을 간략하게 설명하면, 다음과 같다:

사람 유방 암종 T47D에서 취한 cDNA 라이브러리를 람다(λ)gt11 박테리오파아지에 클론시키고, Yamasaki et al(1988)의 IL-6R 서열에서 유도된 올리고뉴클레오티드 프로브로 스크리닝한다. 한 개의 λgt11 cDNA 클론이 분리되었는데, 여기에는 사람의 전체 IL-6R 코딩 서열이 포함되어있다. λgt11에서 EcoRI을 이용하여 삽입체를 분리시키고, 대장균(E. coli) 파아지미드(phagemid) Blue Script pBS/SK (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, California)의 다중 클로닝 부위(Multiple Cloning Site(MCS))에 클론시킨다. 이와 같은 플라스미드 pBS/SK-IL-6R(도 1)는 EcoRI로 잘라내고, 평활단면을 가지게 한 후, EcoRV를 이용하여 다시 절단함으로써, IL-6R의 EcoRV 부위(coordinate 1203)로 종료되는 959염기의 IL-6R 5'말단을 분리한다. 아가로즈 겔 전기영동을 이용하여 추출된 이와 같은 단편을 EcoRV의 MCS에서 개방된 새로운 pBS/SK 벡터에 클론시킨다(도 1에서 pBS/SK-sIL-6R-RV).

상기에서 명시한 것과 같이, 기존에 수득된 pBS/SK-IL-6R DNA를 폴리메라제 사슬 연쇄반응(PCR)을 시켜, 전방 프라이머 1137-1156과 역 프라이머 1505-1488사이에 368bp를 증폭시켰다. 역 프라이머는 IL-6R의 발린-356(도 1 참고)에 대한 코드다음에 바로 있는 EcoRI 부위와 합성되는데, 그 이유는 발린 잔기는 사람의 뇨에서 분비되는 천연형 가용성 sIL-6R의 카르복시-말단 아미노산인 것으로 확인되었기 때문이다(Novick et al, 1990; Oh et al, 1996; co-owned U.S. Pat. No. 5,216,128 and EP Pat. No. EP 413908 B1). PCR 생성물은 EcoRV 및 EcoRI으로 절단하고, IL-6R의 EcoRV 부위와 MCS의 EcoRI 부위사이에서 pBS/SK-sIL-6R-RV에 결찰시킨다(도 1). 생성된 플라스미드인 pBS-sIL-6R-δVal-RI는 IL-6R의 염기쌍 410 위치에서 MCS의 HINDIII 부위를 NcoI 부위에 결찰시켜, 5' 비-해독 서열을 제거하여 짧게 만들어서, pBS-sIL-6R-δVal-RI-NcoI를 수득한다(도 1).

IL-6 서열은 플라스미드 pKKβ2-7에서 유도된 것으로 이 플라스미드는 Chen et al, 1988에서 설명된 바 있는 것으로써, BstNI-절단된 IFN-β2/IL-6 cDNA (Zilberstein et al, 1986)를 대장균 발현 벡터 pKK223-3의 EcoRI 부위에 삽입하여 작제한 것인데(Pharmacia, Uppsala, Sweden), 이때 합성 올리고뉴클레오티드와 EcoRI 부위에 이어서, 메티오닌 코돈, IL-6R의 프롤린-29에 대한 코돈, BstNI(EcoRI) 부위에서 종료되는 것을 이용한다. pKKβ2-7의 IL-6 cDNA 삽입체는 NlaIV 부위에 종료 코돈 바음에 7개 염기쌍으로 종료되는데, 이는 pKK223-3 벡터의 HindIII 부위다음에 11bp가 따라온다(도 1). pKKβ2-7 DNA는 HindIII로 절단시키고, 평활단편을 만들고, EcoRI을 이용하여 다시 절단시키고, IL-6 cDNA를 pBS-sIL-6R-δVal-RI-NcoI에 삽입하여, IL-6의 발린-356다음에 IL-6R 성숙 서열(프롤린-29에서 시작)을 융합하는데, 이때, 이들은 단지 3개 코돈(Glu-Phe-Met)에 의해 분리된다. 생성된 플라스미드 pBS/SK-sIL-6R/IL-6(도 1)은 이의 MCS에서 SalI 및 NotI 부위에서 다시 절단하여, 삽입체는 pcDNA3의 EcoRV 부위(Invitrogen Corporation, San Diego, California)에 클론시킨다. 생성된 플라스미드 pCDNA3-sIL-6R/IL-6(도 1)에는 강력한 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 삽입체 하류 및 이어서 sIL-6RδVal/IL-6 키메라의 효과적인 전사를 보장하는 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 키메라에서 sIL-6R의 5'말단이 보존되는 것은 포유류 세포에서 발현시에, 시그날 펩티드 기능 및 키메라 단백질의 N-말단의 프로세싱이 자연 sIL-6R의 것과 같도록 보장하는 것이다.

상기에서 지적한 것과 같이, sIL-6RδVal/IL-6 구조의 유익한 특징은 신체내에서 이들이 존재할 경우에, 기본적으로 자연형 sIL-6R의 융합 및 자연형 IL-6 융합이 된다는 것과 이질성 폴리펩티드 서열이 없다는 것이다. 그러나, sIL-6RδVal/IL-6 구조(도 1)에서 EcoRI 부위가 보존된다는 것은 sIL-6R 및 IL-6 부분 사이에 링커 폴리펩티드를 용이하게 도입시키기 위함이다. sIL-6R의 Val-356 및 IL-6의 Pro-29사이에 도입된 13개 아미노산 링커 서열인 Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met을 가지는 구조체를 또한 작제할 수 있다(sIL-6RδVal/L/IL-6).

실시예 2. 사람 세포에서 sIL-6RδVal/IL-6 키메라의 발현

포유류 세포 배양의 기본적인 표준 기술을 이용하여, 발현시킬 새로 도입된 DNA 서열의 발현을 위한 트랜스펙션된 세포의 세포 트랜스펙션 및 분석(가령, Sambrook et al., 1989 과정, 상기 플라스미드 구조(실시예 1))을 이용하여 사람 세포의 트랜스펙션 및 여기에서 발현을 평가한다. 간략하게 설명하면, 다음의 과정을 이용한다:

HEK 293 세포(ATCC CRL 1573, 형질변환된 주요 사람 배 신장 세포)에 플라스미드 구조체 pCDNA3-sIL-6R/IL-6 DNA를 트랜스펙션시킨다(상기 실시예 1). HEK 293 로그 상 배양물을 트립신으로 처리시키고, 9㎝ Nunc 플레이트(2.5 × 10⁶ cells/plate)에 접종시킨다. 하루가 지난 후에, CaPO₄ 침전 과정(Sambrook et al, 1989)을 이용하여, 10㎍ pCDNA3-sIL-6R/IL-6 DNA으로 트랜스펙션을 실시한다음, 1시간 뒤에, 배지를 DMEM-10% FCS로 교환시키고, 배양은 추가 16시간동안 계속한다. 배지를 DMEM-2% FCS로 교환한 후에, 48시간 2회 연속 기간동안에 분비된 단백질을 수집한다. 1,000 rpm에서 10분간 실시하여, 찌꺼기를 제거하고, 다클론 토끼 항-sIL-6R 및 생쥐 McAB 17.6(Novick et al, 1991)를 이용하여, sIL-6R에 대한 ELISA를 이용하여 상청액을 테스트한다. sIL-6R-등가물의 농도가 1.2㎍/㎖으로 나타나, 이는 트랜스펙션된 사람 세포에서 키메라 sIL-6R/IL-6 단백질이 매우 효과적으로 발현되었다는 것을 나타내는 것이다.

분비된 키메라 단백질(sIL-6R/IL-6)의 면역정제는 사람의 sIL-6R의 세포외 도메인에 있는 에피토프에 특이적인 단클론 항체 34.4을 이용하여 실시하였다(Novick et al, 1991; Halimi et al, 1995). 34.4 하이브리도마 세포를 생쥐의 복강에서 생장시켜, 황산암모니움 침전으로 복수로부터 이뮤노글로블린(Ig) 분취물을 수득하였다. Affigel-10(Bio-Rad Labs, Richmond, California)을 이용하여, McAB 34.4(1㎖ Affigel-10에 15㎎ Ig을 고정)를 고정시켰다. pCDNA3-sIL-6R/IL-6에 의해 트랜스펙션된 HEK 293 세포에서 분비된 단백질을 포함하는 상청액은 McAB 34.4 (15㎖ 상청액의 경우 0.3㎖ 컬럼) 컬럼에 흡수되었다. PBS로 세척한 후에, 결합된 단백질은 25mM 구연산(pH 2.5)으로 용출시키고, 그 다음 바로 1M Hepes 완충액 pH8.5로 중화시킨 다음, PBS에 대해 하룻밤 동안(8-12시간) 투석시킨다.

SDS에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 면역정제된 단백질을 분석하면, 코마시 블루에 의해 착색된 유일한 단백질 밴드를 볼 수 있다(도 2). 단백질의 분자량은 글리코실화된 sIL-6RδVal(Oh et al, 1996에 따르면, 분자량이 60kDa임) 및 글리코실화된 IL-6(Zilberstein et al, 1986에 따르면, 분자량이 23-26kDa임) 융합형에서 예상된 것과 같은 85kDa이었다. sIL-6R/IL-6의 아미노산 서열은 543개 아미노산이고, 시그날 펩티드의 프로세싱후에는 524개 아미노산 또는 분자량이 58kDa인 단백질이 된다(도 3). 사람 세포에서 재조합 DNA에서 생산되는 좀더 큰 크기의 sIL-6R/IL-6 키메라의 경우로 글리코실화가 분자의 상당 부분에 해당된다는 것을 나타낸다.

실시예 3. sIL-6R/IL-6 키메라는 생장을 멈추게 하고, 전이성 흑색종 세포의 분화를 유도한다.

B16 흑색종에서 유도된 F10.9 클론은 C57Black/6 생쥐에서 매우 전이성이 강한 종양을 만들어, 2-3 개월이내에 폐 전이로 인하여 동물이 죽게 된다(Katz et al, 1995). F10.9 세포 배양물에 sIL-6R/IL-6 키메라 단백질을 추가하면, 세포에서 상당한 형태학적 변형이 일어나 이들의 생장이 멈추게된다(도 4). 키메라로 처리된 F10.9 세포가 신장되고, 돌출 수상돌기가 연장되고, 배 흑혈구 또는 신경교 세포의 스핀들 분화를 닮게 된다.

96웰 미량적정판에서 10% FCS이 보충된 0.2㎖ RPMI 1640에 3 × 10³ 세포를 접종시킨 후 4일에 세포 생장을 정량화시킨다. 세포는 30분간 12.5% 글루타알데히드에 고정시키고, 물에 세척하고, 30분간 0.1% 크리스탈 바이올렛에 착색시킨다. 세척 및 건조를 시킨 후에, 10% 아세트산에 의해 착색을 추출시키고, 광학 밀도를 540㎚에서 결정하였다. 키메라는 키메라 단백질(p85) 10ng/㎖ 정도의 낮은 농도에서 완전하게 생장이 저해되는 약량-의존성 생장 저해를 나타내었다(도 5). 키메라 단백질 sIL-6RδVal/IL-6 및 sIL-6RδVal/IL-6(실시예 1에서 볼 수 있는 것과 같이 sIL-6R 및 IL-6 부분사이에 더 긴 링커를 가지는 키메라)는 모두 유사한 활성을 가진다. 이 결과는 키메라에서 sIL-6R 및 IL-6 부분 사이에 링커 펩티드는 키메라 활성에 필수적인 것은 아니라고 보는데, 그 이유는 상기 sIL-6RδVal/IL-6 키메라는 매우 짧은 3개 아미노산을 가지지만, 상기 sIL-6RδVal/L/IL-6는 더 긴 13개 아미노산 링커 펩티드를 가지고, 이들 두 가지는 전이 세포의 생장을 저해하는데 있어서, 기본적으로는 동일한 활성을 가진다. 대조적으로, IL-6 단독 또는 sIL-6R δVal 단독으로는 이들 흑생종 세포의 생장을 저해시키지 않고, 이것은 sIL-6R/IL-6(p85) 키메라 단백질의 독특한 활성을 설명하는 것이다. 유사한 효과를 얻기 위해, 200-400ng/㎖ IL-6 및 125ng/㎖ sIL-6RδVal이 필요하다(도 6). 몰 농도로 계산하였을 경우에, F10.9 세포를 최대로 저해시키기 위해서는 7.5nM IL-6 및 2nM sIL-6RδVal을 요구하나, sIL-6R/IL-6 키메라의 경우에는 0.12nM만을 필요로한다.

McAB 34.4 컬럼에서 면역정제하는 동안에 p85 sIL-6R/IL-6 키메라 단백질의 생장 저해 활성이 이어진다(실시예 2 참고). 활성 패턴은 도 2에서 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 상이한 분취물에서 볼 수 있는 p85 밴드의 강도에 상응한다.

실시예 4. sIL-6R/IL-6 키메라는 사람의 골수 이식된 세포의 접합에 필수적이다.

심각한 복합 면역결손(SCID) 생쥐(Vormoor et al, 1994)에 사람 골수의 조혈성 간 세포를 이식한 후에 이 세포의 접합에 대해 연구하였다. SCID-NOD 생쥐에게 치사량에 못미치는 방사능 조사를 시키고, 꼬리 정맥에 3 × 10⁵ CD34⁺ 골수 세포를 주사하였다. 주사 전에, 정제된 CD34⁺ 세포는 상이한 양의 사이토킨을 복합시킨 액체 배양물에서 3일간 유지시킨다. 1달 후에, 생쥐를 죽이고, 뼈에서 골수 세포를 수집한다. SCID-NOD 수용 생쥐에서 사람 세포가 접합되는 것은 사람의 반복성 DNA에 서든 블랏 하이브리드 반응에 의해 평가하였다.

간(stem)-세포 인자(SCF, 강철 인자 또는 ckit-리간드) 및 Flt3-리간드(flt3/flk2 티로신 키나아제 수용체 리간드)가 수용 골수에서 상당 기간 접합할 수 있는 가장 원시적인 다기능성 조혈성 간 세포의 생존 및 증식에 중요한 것으로 발견되었다(McKenna et al, 1995). 도 7에서 볼 수 있는 것과 같이, 이들 두 인자 자체는 SCID-NOD 수용 생쥐의 골수에서 사람 세포의 접합을 촉진시킬 수는 없었다. 접합이 상당 수준이 되도록 하기 위해서는 sIL-6R/IL-6 키메라 단백질을 추가해야 한다. 100ng/㎖에서는 sIL-6R/IL-6 키메라는 분리된 IL-6(50-200ng/㎖) 및 sIL-6R(125-1250 ng/㎖) 보다는 휠씬 활성이 크다(도 7). sIL-6R/IL-6 키메라에 대한 필요조건에 따르면 이 단백질이 골수 환경으로 들어가서 다시-집단을 이루는 비-위탁성 다능성 조혈간 세포의 생존 및 증식에 필수적이라는 것을 알 수 있고, 이는 이들 단백질이 골수 이식 임상 프로토콜에 유용할 수 있다는 것을 암시한다.

이는 sIL-6R/IL-6 키메라가 적어도 다음의 두 가지 새로 발견된 활성을 가진다는 것을 처음으로 설명하는 것이다;

(i) 사람 조혈 원시 생식 세포에 인자 SCF 및 Flt3-리간드 모두를 함께 첨가하는 경우에, 이는 이들의 생존 및 증식을 촉진시킨다; 그리고

(ii) in vivo 면역-결손 생쥐에서 사람 골수 이식 모델에서 활성을 가지고 이는 필수적인 것으로 보인다.

실시예 5. sIL-6R/IL-6 키메라는 매우 정제된 원시 조혈 간 세포에서 활성이 있다.

사람 척수 혈액 단핵세포는 저밀도 단핵세포(NMC) 분취를 Ficoll-Paque(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 상에서 그리고 이어서 미니 MACS 키트(Miltney Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)에서 실시하여, 80% 순도의 CD34⁺ 집단을 준비한다. 그 다음 이들 세포는 고정된 항-CD38 단클론 항체를 통과시키거나 형광 활성화된 세포 분류에 의해 분류하고, 고유 세포 0.1%에 상응하는 CD34⁺CD38^- 집단을 회수하였다. 이와 같이 정제된 간 세포(20,000 세포)를 0.5㎖ RPMI 배지, 10% 태아 송아지 혈청(FCS), 1% 소 혈청 알부민, 50ng/㎖ 간 세포 인자(SCF), 100ng/㎖ flt3-리간드(FL)(이들 둘다 R&D Systems, Minneapolis, MN에서 구함)를 포함하는 현탁 배지에 둔다. 배양물의 절단에는 100ng/㎖ sIL-6R/IL-6 키메라를 보충시키고, 다른 것은 이런 것 없이 배양하였다. 배양은 6일간 5% CO₂에서 37℃에서 실시하였다. 골수 재집단 형성 세포의 수는 이와 같은 in vitro 배양물에 모든 세포를 준-치사량의 방사선을 조사한 NOD-SCID 생쥐에 주사(i.v.)하여 평가하였다. 생쥐는 무균 상태에서 유지시켰다. 6주 후에, 생쥐를 죽이고, 이들의 긴 뼈의 골수를 회수하였다. 이와 같은 골수(BM) 세포는 30% FCS, 50μM β-멀캅토에탄올, 50ng/㎖ SCF, 5ng/㎖ IL-3, 5ng/㎖ GM-CSF, 6μ/㎖ 에리트로포에틴(모두 R&D Systems)을 가지는 반-고형 0.9% 메틸셀룰로오즈 플레이트에 도말하였다. 배양물에는 또한 사람 혈청이 포함되어있고, 조건은 생쥐 콜로니의 생장을 저해시키는 것이다. 결과를 보면(표 4), 현탁 배양물에 sIL-6R/IL-6를 추가하는 경우에 SCF 및 FL 단독의 경우와 비교하였을 때, 이식된 세포에서 회수된 사람 콜로니 형성 세포(CFU)의 수가 30-50배 증가되었다는 것을 볼 수 있다. 이는 0일의 경우와 비교하였을 때 6일째에 현탁 배양물에 있는 SCID-재집단형성 간 세포의 수가 상당히 증가된 것을 나타낸다. sIL-6R/IL-6 키메라가 없는 경우에, SCF 및 FL은 60일의 현탁 배양동안에 간 세포의 수가 증가되지 않았다. 이식된 NOD/SCID 생쥐에서 회수한 BM 세포의 DNA는 실시예 4에서 볼 수 있는 것과 같이 서든 블랏으로 분석하였다. 키메라가 없는 것과 비교하였을 때, 키메라를 포함하는 배양된 세포를 수용한 쥐와 비교하였을 때, 회수된 사람 DNA의 양이 10배 이상이다.

표 4에서 볼 수 있는 것과 같이 NOD/SCID 생쥐의 골수의 CFU 선조는 사람 혈액 세포를 이식하기 전에 sIL-6R/IL-6 키메라와 배양하였을 경우에만, 상이한 골수 계통 조혈 세포(대식세포 및 과립세포) 뿐만 아니라 적혈구 및 임파구 계통(가령, CD19⁺, CD56⁺)의 조혈 세포를 만든다.

추가 실험에서는 척수 혈액 CD34⁺CD38^- 집단과 고도로 정제된 CD34⁺CD38 ^- 간 세포에서 sIL-6R/IL-6의 효과를 비교하였다. 고도로 정제된 세포의 in vitro 확장은 정제가 다소 덜 된 세포의 것과 비교하였을 때 sIL-6R/IL-6에 의해 상당히 강화된다(표 5). 이것은 대부분의 원시 간 세포가 세포 확장에서 sIL-6R/IL-6의 선호적인 표적이 된다는 것을 나타낸다.

NOD/SCID 생쥐에 주사하기 전에 고도로 정제된 CD34⁺CD38^- 간 세포 배양 현탁액의 길이를 증가시킴으로써 골수-재집단형성 활성의 in vitro 유지도를 측정하였다. 배양된 세포를 i.v. 주사한 후 6주째에 골수 수용 생쥐에서 사람 DNA의 비율로 접합을 평가하였다. 배양하는 동안에 SCF와 FL에 sIL-6R/IL-6을 첨가하였을 때, 배양 6주후에도 상당한 접합(>1% 사람 DNA)이 여전히 관찰되었고, 접합은 비-배양된 세포에서보다 접합이 더 컸다. 이와는 대조적으로, SCF, FL, GM-CSF, IL-3을 포함하는 배양물을 이용한 실험에서, 배양 1주일 후에도 SCID-재집단형성 세포가 유지되지는 않았다(Bhata, M. et al., J. Exp. Med. 186, 619-624, 1997).

이와 같은 결과에서 sIL-6R/IL-6는 수용체 골수에서 접합을 할 수 있는 사람 원시 간 세포를 확장시키고, 유지시킬 수 있도록 한다는 것을 알 수 있다. sIL-6R/IL-6 키메라는 접합 조혈 간 세포를 배양하는 새로운 수단을 제공한다. 이때 유전자 치료법 프로토콜에서 접합 간 세포로 유전자를 도입시키기 위한 레트로바이러스 벡터를 이용할 수 있다. 현재까지, 레트로바이러스성 DNA 결합에대해 필요한 것 과 같이 교환 과정에서 이들 원시 세포가 in vitro에서 유지되지 않기 때문에 사람 간 세포와는 불가능한 것으로 보인다. sIL-6R/IL-6 키메라가 이와 같은 문제를 해결하였다.

실시예 6. CHO 세포에서 IL-6R/IL-6 키메라의 생산

도 1에서 볼 수 있는 것과 같이 플라스미드 sIL-6R/IL-6 pcDNA3의 DNA를 플라스미드 pDHFR의 DNA와 함께 Chinese Hamster Ovary(CHO) 세포로 공동 트랜스펙션시키는데, 이에 대해서는 Mory et al (DNA 5, 181-193, 1986)에서 설명하고 있다. 50nM 메토트렉세이트에서 생장하는 형질변환체중에서, 클론 L12-[IL-6R/IL-6]을 분리하였다. 이 클론은 많은 계대동안에도 안정한 것으로 밝혀졌으며, 반-합류 배양물은 정기적으로 배양배지로 2.5㎍/㎖의 IL-6R/IL-6 키메라를 분비하였다.

IL-6R/IL-6 키메라를 정제하기 위해, 2% 소 혈청에 클론 L12 배양물로부터 3.25ℓ배지를 200㎖로 농축시켰다. 이를 Affigel 10 비드에 결합된 항-사람 sIL-6R 단클론 항체 34.4 18㎖ 컬럼에 흡착시키고, Novick et al., Hybridoma, 10, 137-146, 1991에서 설명하는 것과 같이 용출시켰다. 25mM 구연산 용출액은 1 Hepes 완충액 pH8.6으로 바로 중화시킨다. 단백질은 10kDa 차단 Amicon 막에서 농축시켜 최종 농도를 1㎎/㎖가 되도록 한다. SDS-PAGE시에, IL-6R/IL-6 키메라에 상응하는 85kDa 단일 밴드가 관찰되었다. 글리코시다제(Boehringer, Mannheim)로 처리한 후에 크기가 감소되는 것으로 글리코실화반응을 설명할 수 있다. IL-6R/IL-6 키메라를 생산하는 CHO 세포의 생물학적 활성은 4℃에서 적어도 5개월간은 안정적인 것으로 밝혀졌다. 일상적으로 저장은 -70℃에서 실시한다.

실시예 7. IL-6R/IL-6 키메라가 gp130에 대한 친화력

IL-6R/IL-6 키메라를 생산하는 CHO와 사람 IL-6 및 sIL-6R 혼합물을 gp130(sgp130) 가용성형태에 이들의 결합 능력에 대해 비교하였는데, 이때 gp130은 IL-6에 대한 수용체 시스템의 제 2 쇄이다(배경을 참고). 미량적정판 96-웰(Nunc)은 항-사람 gp130 단클론 항체 및 50ng/㎖ sgp130(둘다 R&D Systems, Minneapolis에서 구입)을 첨가하였다. 인산 완충 염에서 세척한 후에, IL-6R/IL-6 키메라는 0.1 내지 50ng/㎖의 상이한 농도 범위에서 상이한 웰에 첨가한다. 별도의 웰에, rhuIL-6(Ares-Serono, Geneva)을 500ng/㎖ 농도로 첨가하고, 동시에 사람 sIL-6RδVal을 2 내지 500ng/㎖로 함께 첨가한다. 4℃에서 하룻밤동안 배양한 후에, 토끼 다클론 항-IL-6R(Oh et al., Cytokine, 8, 401-409, 1996)을 첨가하고, 양고추냉이 과산화효소가 공액된 염소 항-토끼 Ig를 첨가하고, 이는 색을 만드는 반응으로 감지된다(Sigma, St. Louis). 도 8에서는 결과를 Scatchard 플롯으로 나타낸 것이다. gp130에 대한 IL-6R/IL-6 키메라의 친화력은 별도로 분자의 두 부분을 첨가하였을 때보다 약 4배 이상 높은 것으로 밝혀졌다(6.3 × 10^-11M 대비 2.6 × 10^-10M). 이 결과는 직렬적인 것으로 이는 흑색종 및 조혈 세포에서 IL-6 + sIL-6R 복합 경우와 비교하였을 때 키메라의 활성이 더 높다는 것을 설명하는 것이다(도 9와 실시예 4).

실시예 8. IL-6R/IL-6 키메라는 간독성으로부터 보호기능을 한다.

사염화탄소(CCl₄)를 생쥐에 주사하면 간에 심각한 괴사가 일어나서, 결국에는 동물을 죽게한다(Slater T.F. et al., Philos. Trans. R. Soc. Biol. Sci. 311, 633-645, 1985). 유전학적으로 IL-6(IL-6^-/-)에 결손이 있는 생쥐에 복막으로 상대적으로 낮은 약량의 CCl₄(2-3 ㎖/㎏ 체중)을 주사하였을 때, 24시간에서 치사율은 약 70%정도가 된다(도 10). IL-6R/IL-6 키메라를 생산하는 CHO를 CCl₄ 주사전 한시간과 CCl₄ 주사후 4시간에 다시 주사하면, 24시간에 치사율이 0이 된다. 대조적으로, 자유 rhuIL-6을 주사하면 유사한 효과가 없었다(도 10). IL-6R/IL-6 키메라는 주사당 2-3㎍ 정도가 효과적인데, 이때 몰비는 IL-6의 약량보다 10배 정도 낮았고, 이 농도에서 IL-6는 효과가 없었다. 더 높은 약량의 CCl₄(가령, 도 10에서 3.5㎖/㎏), 키메라는 보호성을 가지고, 치사율은 IL-6 또는 사이토킨이 없는 경우보다 낮았다. 키메라로 처리된 생쥐와 처리안된 생쥐사이(이들 두 쥐 집단은 모두 동일한 CCl₄로 처리된다)에 치사율의 차이는 p<0.01에서 유의성이 있다. 헤마톡실린-에오신으로 착색된 간 부분의 조직학적 관찰을 함으로써, CCl₄는 간 조직의 괴사를 만들고, IL-6R/IL-6는 이와 같은 화학물질의 독성 효과로부터 간 세포를 보호한다는 것을 확인할 수 있다(나타내지 않음).

IL-6R/IL-6 키메라를 이용하는 경우에 화학물질(가령, 알코올, 파라세타몰)로 인한 괴사 질병을 가지는 환자의 간 조직을 보호할 수 있을 것이다.

실시예 9. IL-6/sIL-6RδVal 키메라의 작제 및 활성

IL-6 부분이 N-말단에 있고, sIL-6R 부분은 C-말단에 있는 키메라 분자를 작제하였다. 플라스미드 pBS-sIL-6RδVal는 Sau3a(bp 1086)과 Val-356 다음에 정지 코돈이 있는 HinIII에서 절단하였다(실시예 1 참고). 세 개 제한효소 부위를 포함하는 링커; (SpeI, SmaI, BamH1)은 다음과 같이 합성하였다;

SpeI SamI BamH1

5' CT AGT GGG CCC GGG GTG GCG GG

A CCC GGG CCC CAC CGC CCC TAG 5' (SEQ ID NO:2)

sIL-6R의 Sau3a 위치는 링커의 BamH1에 결찰시키고, Bluescript pBS SK 플라스미드의 MCS에 클론시킨다. IL-6 서열은 프라이머(아래 밑줄 부분은 개시 코돈)를 이용하여 pKKβ2-7 DNA로부터 PCR을 이용하여 증폭시킨다.

SpeI

5' GA CTA GTA GCT ATG AAC TCC TTC TC (SEQ ID NO:3)

HaeIII

5' AG GGC CAT TTG CCG AAQG AGC C (SEQ ID NO:4)

PCR 생성물은 SpeI 및 HaeIII으로 절단하요, 상기 링커의 SpeI 및 SmaI 부위에 도입시켰다. 또 다른 링커 BamH1-NcoI(내부에 SmaI 부분은 포함)하는 것은 다음과 같이 합성하였다:

SmaI

5' GAT CCG GGC GGC GGG GGA GGG GGG CCC GGG C[NcoI]

[BamH1] GC CCG CCG CCC CCT CCT CCC GGG CCC GGT AC 5'

(SEQ ID NO:5)

이는 이전 링커의 BamH1과 IL-6R 서열의 NcoI 1464 사이에 클론하였다. IL-6R의 SmaI 867부터 NcoI 1464까지의 단편은 제 2 링커의 SmaI 부위와 IL-6R의 NcoI 부위에 도입시켰다. 생성된 키메라 DNA를 서열화시키고, pCDNA3에 다시 클론시켜, 사람 HEK 293 세포에서 발현시켰다. 이와 같은 IL-6IL-6R 키메라 3e의 아미노산 서열을 도 11에 나타내었다(링커는 밑줄을 그었다). 키메라 3e는 항-IL-6 단클론 항체에서 친화력 크로마토그래피에 의해 정제하였다(Novick et al., Hybridoma 8, 561-567, 1989). SDS-PAGE 상에서, 75kDa 밴드가 관찰되었다.

IL-6-IL-6R 키메라 3e의 F10.9 흑색종 세포의 생장을 저해시키는 생물학적 활성은 도 12에 나타내었다. 동일한 실험에서 IL-6R/IL-6 키메라의 것과 비교하였을 때 분명히 활성이 있으나, 50% 생장 저해를 위해 더 많이 요구되었다.

IL-6R/IL-6의 두 개 돌연변이를 만드는데, 이는 IL-6R/IL-6(도 3)의 IL-6R 부분에 아미노산 His-280 및 Asp-281를 PCR 돌연변이 생성(돌연변이 39 또는 HD)에 의해 각각 Ser 및 Val으로 변화시키거나 또는 Asn-230을 Asp로 추가 변화시킨다(돌연변이체 NHD). 도 12에서 볼 수 있는 것과 같이, 이들 두 개 돌연변이체는 IL-6R/IL-6 및 IL-6-IL-6R 키메라와 비교하였을 때 거의 활성이 없었다. IL-6R에서 분자 모델링으로 본 결과 이들 아미노산은 gp130과 상호작용하기 때문에(Halimi et al., 1995), 이는 sIL-6R/IL-6 키메라가 이와 같은 필수적인 상호작용 부위를 보존하고 있다는 것을 설명하는 것이다.

IL-6R-IL-6 키메라 3e는 IL-6R/IL-6에 있는 IL-6R의 이뮤노글로블린을 닮은 도메인을 가지고 있지 않는 것 같다. 그러나, IL-6R/IL-6로부터 이와 같은 Ig-도메인을 바로 제거하여도 F10.9 세포에서 이들의 생물학적 활성이 감소되지 않았다. IL-6R/IL-6 키메라 3e가 gp130에 결합하는 것은 또다른 IL-6R/IL-6 키메라의 것에 약 30%정도가 된다(나타내지 않음). 이와 같은 낮은 결합은 흑색종 세포 생장에서 낮은 활성과 같은 선상에 있는 것이다.

이 결과들로부터 링커를 통하여 sIL-6R에 융합함으로써 IL-6의 카르복시 말달을 차단시키면 이와 같은 신규한 키메라에서 우수한 생물학적 활성을 보존한다는 것을 알 수 있다.

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180 185 190 Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe 195 200 205 Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val 210 215 220 Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp 225 230 235 240 Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg 245 250 255 Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp 260 265 270 Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His 275 280 285 Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser 290 295 300 Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser 305 310 315 320 Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr 325 330 335 Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr 340 345 350 Ser Leu Pro Val Glu Phe Met Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys 355 360 365 Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile 370 375 380 Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys 385 390 395 400 Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 405 410 415 Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys 420 425 430 Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr 435 440 445 Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe 450 455 460 Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val 465 470 475 480 Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr 485 490 495 Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala 500 505 510 Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser 515 520 525 Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met 530 535 540 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 471 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8: Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 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Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser 225 230 235 240 Pro Leu Ser Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser 245 250 255 Leu Thr Thr Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro 260 265 270 Ala Glu Asp Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys 275 280 285 Phe Ser Cys Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile 290 295 300 Val Ser Met Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr 305 310 315 320 Gln Thr Phe Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn 325 330 335 Ile Thr Val Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr 340 345 350 Trp Gln Asp Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe 355 360 365 Glu Leu Arg Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met 370 375 380 Val Lys Asp Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly 385 390 395 400 Leu Arg His Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly 405 410 415 Glu Trp Ser Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu 420 425 430 Ser Arg Ser Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala 435 440 445 Leu Thr Thr Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala 450 455 460 Asn Ala Thr Ser Leu Pro Val 465 470

Claims

글리코실화된 가용성 인터루킨-6 수용체(sIL-6R)과 인터루킨-6(IL-6)이 융합되어 생성된 키메라 단백질에 있어서,

키메라 단백질은 하기 4가지 키메라 단백질에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 (sIL-6R/IL-6R) 단백질:

sIL-6RδVal/IL-6, 이때 이 단백질은 sIL-6R의 C 단부 Val-356과 IL-6R의 N 단부 Pro-29사이에 E-F-M 3가 펩티드 링커가 포함되며, 도 3(또는 SEQ ID NO:7)의 아미노산 서열을 가진다;

sIL-6RδVal/L/IL-6, 이때 이 단백질은 sIL-6R의 C 단부 Val-356과 IL-6R의 N 단부 Pro-29사이에 E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M 펩티드 링커가 포함되며, 도 3(또는 SEQ ID NO:7)의 아미노산 서열을 가지며, 이 서열의 357 내지 359 위치 사이에 있는 링커 펩티드 E-F-M가 상기 13개 아미노산잔기로 구성된 링커 펩티드로 대체된 아미노산 서열을 가진다;

IL-6/sIL-6R, 이때 이 단백질은 IL-6의 전장 아미노산 서열과 sIL-6R 서열과 이들 서열간 IL-6의 Met-212 C 단부와 sIL-6R의 Val-112의 14개 아미노산 잔기로 구성된 펩티드 링커 G-G-G-G-D-P-G-G-G-G-G-G-P-G(SEQ ID NO:6)을 포함하고, 이 키메라 단백질은 도 11(SEQ ID NO:8)에 제시된 서열을 가진다.

-sIL-6R/IL-6 키메라 단백질, 이때 이 단백질에는 링커가 포함되어 있지 않든다.
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제 1 항에 있어서, 키메라 단백질은 sIL-6RδVal/IL-6인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
제 1 항에 있어서, 키메라 단백질은 sIL-6RδVal/L/IL-6인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
제 1 항에 있어서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열로 된 펩티드 링커에 의해 링크된 IL-6/sIL-6R 인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
제 1 항에 있어서, 키메라 단백질은 펩티드 링커 없이 융합된 sIL-6R/IL-6 인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
제 1 항에 있어서, HEK293세포 또는 CHO 세포에서 선택된 포유류 세포에서 만들어지는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
제 9 항에 있어서, 단백질은 HEK293 세포에서 만들어지는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
제 9 항에 있어서, 단백질은 CHO 세포에서 만들어지는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
제 1 항에 있어서, 키메라 단백질은 악성 종양 세포의 생장을 저해할 수 있는 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
제 12 항에 있어서, 악성 종양 세포는 흑색종 세포인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
제 1 항에 있어서, 키메라 단백질은 골수 이식에서 사람의 조혈 세포의 in vivo 접합을 유도할 수 있는 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
제 1 항에 있어서, 키메라 단백질은 간독성 물질로부터 간을 보호할 수 있는 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
제 1 항에 따른 키메라 단백질을 인코드하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
제 16 항에 따른 키메라 단백질을 인코드하는 DNA 서열로 구성된 DNA 벡터에 있어서, 이 벡터는 포유류 세포에서 키메라 단백질을 발현시키는데 적합한 것을 특징으로 하는 DNA 벡터.
제 17 항에 있어서, 벡터는 HEK293 세포에서 제 1 항에 따른 키메라 단백질을 발현시키는데 적합한 것을 특징으로 하는 DNA 벡터.
제 17 항에 있어서, 벡터는 CHO 세포에서 제 1 항에 따른 키메라 단백질을 발현시키는데 적합한 것을 특징으로 하는 DNA 벡터.
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제 17 항에 있어서, 벡터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 제어하에서 제 1 항에 따른 키메라 단백질을 인코드하는 DNA 서열을 포함하는 pcDNA3 벡터로 구성된 플라스미드 pcDNAsIL-6R/IL-6인 것을 특징으로 하는 DNA 벡터.
제 17 항에 있어서, 벡터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 제어하에 제 1 항에 따른 키메라 단백질을 인코드하는 DNA 서열을 포함하는 pcDNA3 벡터로 구성된 플라스미드 pcDNAsIL-6R/LAL-6이고, 이때 제 1 항에 따른 키메라 단백질을 인코드하는 DNA 서열에는 키메라 단백질의 sIL-6R을 인코드하는 서열과 IL-6 단백질 서열 사이에 있는 EcoRI 부위에서 펩티드 링커를 인코드하는 삽입된 링커 서열이 있는 것을 특징으로 하는 DNA 벡터.
제 17 항에 따른 DNA 벡터를 포함하는 형질변환된 포유류 세포에 있어서, 이때 세포는 벡터에 포함된 제 1 항에 따른 키메라 단백질 서열을 발현시켜 완전하게 프로세스시킬 수 있고, 세포가 생장한 배지로 프로세스된 단백질을 분비시킬 수 있는 능력을 가지며, 이때 포유류 세포는 HEK293세포 또는 CHO 세포에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형질변환된 포유류 세포.
제 23 항에 있어서, 세포는 pcDNAsIL-6R/IL-6 벡터에 의해 트랜스펙션된 사람의 배 신장 세포 293(HEK293)이고, 세포는 제 1 항에 따른 키메라 단백질 서열을 발현시켜 완전하게 프로세스시킬 수 있고, 세포가 생장한 배지로 85kDa의 당단백질형태의 키메라 단백질로 분비시킬 수 있는 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 형질변환된 포유류 세포.
제 1 항에 따른 키메라 단백질을 만드는 방법에 있어서, 제23항 또는 제24항에 따른 형질변환된 세포를 생장시키고, 배양 배지로부터 생성된 단백질을 분리시키는 단계로 구성되며, 이때 sIL-6R에 특이적인 단클론성 항체를 이용하여 면역친화성 크로마토그래피를 하여 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
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제 1 항에 따른 키메라 단백질을 활성 성분으로 하고, 암 세포 생산을 저해하여 암을 치료하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 27 항에 있어서, 암 세포는 악성 흑색종 세포인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항에 따른 키메라 단백질을 활성 성분으로 하고, 골수 이식에서 사람 조혈 세포의 접합 유도용 약학 조성물.
제 1 항에 따른 키메라 단백질을 활성 성분으로 하고 간 독성 물질로부터 간을 보호하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항에 따른 키메라 단백질을 활성 성분으로 하고, 조혈 형성을 증가시켜 간 또는 신경 질환을 치료하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 키메라 단백질은 포유류 암 세포의 생장을 저해하여 포유류 암을 치료하는 약물, 골수 이식에서 사람 조혈 세포의 접합을 유도하여 골수 이식을 강화시키는 약물, 조혈을 증가시키는 약물, 또는 간 또는 신경 질환을 치료하는 약물의 제조에 이용되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
제 1 항에 따른 키메라 단백질을 활성 성분으로 하고, 포유류 암 세포의 생장을 저해하여 포유류 암을 치료하는 약물, 골수 이식에서 사람 조혈 세포의 접합을 유도하여 골수 이식을 강화시키는 약물, 조혈을 증가시키는 약물, 또는 간 또는 신경 질환을 치료하는 약물의 제조에 이용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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