NO327397B1

NO327397B1 - Kimaert sIL-6R/IL-6-protein, DNA, vektor, celle, fremgangsmate for fremstilling samt ulike anvendelser av nevnte protein

Info

Publication number: NO327397B1
Application number: NO20000086A
Authority: NO
Inventors: Michel Revel; Judith E Chebath; Tsvee Lapidot; Orit Kollet
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 2000-01-07
Publication date: 2009-06-22
Also published as: NZ502139A; BG104070A; US7374912B2; EE200000012A; KR20010021522A; DK0991661T3; EP0991661B1; HUP0002426A3; AU758161B2; BG64680B1; HK1031895A1; SK287039B6; WO1999002552A3; US7198781B1; WO1999002552A2; CZ302488B6; HUP0002426A2; DE69836217D1; ATE342915T1; NO20000086D0

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører kimært glykosylert løselig interleukin-6 reseptor (sIL-6R)-interleukin-6 (IL-6) protein (sIL-6R/IL-6) og biologisk aktive analoger av dette. Videre vedrører foreliggende oppfinnelse DNA som koder for nevnte protein, vektor, celle samt fremgangsmåte for fremstilling. Foreliggende oppfinnelse vedrører også ulike anvendelser av nevnte protein.

O ppfinnelsens bakgrunn og teknikkens stand

Interleukin-6 (IL-6) er et velkjent cytokin hvis biologiske aktiviteter formidles ved et membranbundet reseptorsystem som omfatter to forskjellige proteine, et betegnet IL-6-reseptor (IL-6R eller gp80) og det andre gpl30 (se oversikt av Hirano et al., 1994). Lø-selige former av IL-6R (sEL-6R) som tilsvarer det ekstracellulære domenet i gp80, er naturlige produkter i menneskekroppen som finnes som glykoproteiner i blod og urin (Novick et al., 1990,1992). En enestående egenskap ved sIL-6R-molekyler er at de virker som kraftige agonister av IL-6 i mange celletyper, heriblant humane celler (Taga et al., 1989; Novick et al., 1992). Dette skyldes det faktum at selv uten det intracy-toplasmatiske domenet i gp80 er sIL-6R fortsatt i stand til å utløse dimerisering av gpl30 som respons på EL-6, noe som i sin tur formidler den påfølgende EL-6-spesifikke signaloverføring og biologiske virkninger (Murakami et al., 1993). Det aktive EL-6-reseptorkompleks er faktisk en heksamer struktur som dannes av to gpl30-kjeder, to EL-6R og to IL-6-ligander (Ward et al., 1994; Paonessa et al., 19959, hvor sIL-6R har to typer interaksjoner med gpl30 som begge er essensielle for de EL-6-spesifikke biologiske aktiviteter (Halimi et al., 1995).

Behandling med sIL-6R fører til forsterkning av de biologiske aktiviteter av IL-6 i mange celletyper. Et eksempel er tumorceller^hvis vekst inhiberes i større grad av IL-6 dersom sIL-6R er tilsatt, f.eks. myeloleukemicellene Ml fra mus (Taga et al., 1989), de humane brystcarcinomceller T47D (Novick et al. 1992) eller humane "non-small cell"-lungecarcinomceller (Ganapathi et al., 1996). IL-6 har antimetastatiske aktiviteter in vivo (Katz et al., 1995), og sIL-6R kan også forsterke slike in vivo-antitumorvirkninger av IL-6 (Mackiewicz et al., 1995). En annen aktivitet av IL-6 som forsterkes ved sIL-6R-tilsetning er stimulering av hematopoietiske stamceller for frembringelse av flerlin-jekolonier (Sui et al., 1995). De foreliggende oppfinnere har også observert at overlevelse av primærkulturer av oligodendrocytter fra hjerne understøttes av kombinasjonen av sIL-6R og IL-6 (Oh, 1997), mens EL-6 alene er lite aktivt i slike kulturer (Kahn og De Vellis, 1994). Dette funn tyder på at IL-6, ved kombinasjon med sIL-6R, kan etterligne aktiviteten av andre neurotropiske cytokiner som ciliær neurotropisk faktor (CNTF) eller leukemiinhiberende faktor (LIF), som også virker via gpl30, noe som også gjelder for IL-11 og Oncostatin M (Hirano et al., 1994).

I et forsøk på å tilveiebringe et molekyl som kan kombinere de ovenfor bemerkede funk-sjoner av EL-6 og sIL-6R, er det nylig blitt rapportert fremstilling i rekombinante gjærceller av et fusjonsprotein mellom et avkortet segment av den humane IL-6R-sekvens og IL-6, sammenbundet med en glycinrik linker (Fischer et al., 1997). Dette fusjonsprotein omfatter idet vesentlige kun cytokinreseptor-N-domenet og cytokinreseptor-C-domenet fra IL-6R og mangler således idet vesentlige hele det immunoglobulin (Ig)-lignende domenet fra IL-6R og reseptorens pre-membranområde (området mellom C-domenet og transmembrandomenet). Som sådant representerer proteinet en avkortet form av sIL-6R, og dette avkortede sIL-6R er i fusjonsproteinet koblet via den ovenfor bemerkede gly-cinrike linker til idet vesentlige hele den modne form av EL-6.1 tillegg til å mangle deler av den naturlige sIL-6R har dette fusjonsprotein, siden det er fremstilt i gjærceller, ikke det samme glykosyleringsmønster som et slikt fusjonsprotein ville hatt dersom det var fremstilt i pattedyrceller, nærmere bestemt i f.eks. humane celler. Dette gjærproduserte fusjonsprotein har faktisk en molekylvekt på kun tilnærmet 57 kDa, i motsetning til et fusjonsprodukt som omfatter idet vesentlige alle de naturlige aminosyrerester i sEL-6R og EL-6 og som er fullstendig glykosylert i pattedyrceller (f.eks. humane celler), som har den forventede molekylvekt på tilnærmet 85 kDa (se eksempel 2 heri nedenfor).

En vanlig erfaring ved fremstilling av rekombinante proteiner som kan benyttes for behandling av humane pasienter er at det er viktig å forbli så nær som mulig til proteinenes naturlige former som de finnes i den menneskelige kropp, for å unngå utløsning av antistoffer og andre bivirkninger som observeres med ikke-naturlige rekombinante produkter. Av denne grunn har det vært fordelaktig å benytte rekombinante pattedyrcellesyste-mer for fremstilling av glykosylerte proteiner, f.eks. interferon-B eller granulocyttkolo-nistimulerende faktor (Chernajovsky et al., 1984, Holloway, 1994) i en kjemisk form som er mest mulig lik det naturlige humane produkt. Bakterier eller mikroorganismer som f.eks. gjær, som ikke glykosylerer korrekt, gir også feilfolding av proteinkjedene, noe som fører til immunogene reaksjoner. Dette er spesielt viktig når det gjelder EL-6 som i omfattende grad modifiseres posttranslasjonelt ved N- og O-glykosylering så vel som ved fosforylering (se Revel, 1989 for en oversikt), og når det gjelder naturlig sEL-6R fra humant blod og human urin, som er et glykoprotein hvis aminoterminale og karboksyterminale aminosyrer er konstante og har blitt bestemt (Novick et al., 1990 og foreliggende oppfinneres U.S. patentskrift nr. 5,216,128 og det tilsvarende patentskrift EP 413908 Bl).

Følgelig, ser det ut til at det ovenfor beskrevne, tidligere fremstilte fusjonsprodukt mellom en del av sEL-6R og EL-6 har en rekke mulige ulemper, særlig når det gjelder anvendelse for behandling av mennesker, og dette grunnet det faktum at proteinet mangler deler av sIL-6R, såvel som fremstillingen i gjær, som kan gi ukorrekt glykosylering av proteinet.

Inntil nå har et fusjonsmolekyl som omfatter den naturlige sIL-6R som finnes i humane kroppsvæsker og naturlig IL-6 og som er fremstilt i humane celler eller andre pattedyrceller ikke blitt beskrevet.

Det er et annet mål med foreliggende oppfinnelse å benytte et slikt fusjonsprotein (en sIL-6R/IL-6-chimere) for inhibering av veksten av svært metastatiske melanomceller ved svært lave konsentrasjoner, siden disse celler er resistente ovenfor IL-6 eller sIL-6R alene.

Nok et mål er å benytte et slikt fusjonsprotein (sIL-6R/IL-6 chimeren) for in vivo-transplantering av humane hematopoietiske stamceller i fremgangsmåter for transplantasjon av benmarg.

Det er nok et mål med foreliggende oppfinnelse å benytte et slikt fusjonsprotein ved andre IL-6-relaterte forstyrrelser, f.eks. levertilstander eller neurologiske tilstander.

Et videre mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe farmasøytiske preparater som inneholder det ovenfor nevnte fusjonsprotein mellom naturlig sIL-6R og naturlig EL-6 (sIL-6R/EL-6-chimeren) for behandling av cancer, for anvendelse i fremgangsmåter for benmargstransplantasjon og for andre EL-6-relaterte forstyrrelser, f.eks. levertilstander og neurologiske tilstander.

Andre mål og sider ved foreliggende oppfinnelse vil beskrives i eller fremgå fra den påfølgende beskrivelse av foreliggende oppfinnelse.

Oppsummering av oppfinnelsen

I samsvar med foreliggende oppfinnelse er det fremstilt en rekke fusjonsproteiner (chimerer) som alle omfatter idet vesentlige hele den naturlig forekommende sEL-6R fra humane kroppsvæsker og idet vesentlige hele den modne form av naturlig forekommende human IL-6, hvor disse er sammenbundet med korte linkerpeptider som kan være så korte som 3 aminosyrer lange eller lengre, f.eks. 13 aminosyrerester lange (se nedenfor i eksemplene 1 og 2). Det bør imidlertid bemerkes at linkerpeptidene kan utelates i disse fusjonsproteiner, slik at sIL-6R-gruppen er direkte koblet til IL-6-gruppen. Siden linkere som representerer ikke-naturlige aminosyresekvenser kan være immunogene epitoper som utløser antistoffer hos pasienter er det fordelaktig å ha en direkte sammenkoblet sIL-6R/IL-6-chimere med den ønskede biologiske aktivitet, samtidig som faren for in-dusering av slik mulig skadelig antistoffdannelse er minimalisert ved tilførsel av en slik chimer.

Konservering av hele sIL-6R-sekvensen, innbefattet det Ig-lignende domenet som det foreligger i det naturlig forekommende molekyl, såvel som korrekt glykosylering og annen posttranslasjonell modifisering innført av humane celler eller pattedyrceller når chimeren ovenfor fremstilles i slike celler, er også viktig for å redusere det chimere pro-teinprodukts mulige immunogenisitet.

Det er imidlertid mulig å benytte en svært kort linker på tilnærmet 3 aminosyrer i kob-lingspunktet mellom sIL-6R- og IL-6-gruppene i det chimere protein. En så kort linker vil ikke være en immunogen epitop. Det er naturligvis også mulig å benytte lengre linkere på opp til tilnærmet 30 aminosyrer for å gi separasjon mellom de to grupper, men her må man være forsiktig, og eksperimenter vedrørende biologisk effektivitet og sik-kerhet må utføres, for å sikre at chimere molekyler med slike linkere ikke er immunogene.

Det har faktisk blitt overraskende vist i samsvar med foreliggende oppfinnelse at slike lengre linkere ikke er vesentlige for aktiviteten av det chimere protein, noe som tyder på at korrekt folding av chimeren ikke krever en lengre linker, særlig dersom idet vesentlige hele den naturlig forekommende sekvens av sIL-6R og EL-6 innføres i det chimere molekyl (se eksempel 3 og fig. 5, som også gjelder en sammenligning mellom en sEL-6R/IL-6-chimere med en svært kort (3 aminosyrer) linker og en tilsvarende chimer med en lengre linker på 30 aminosyrer).

Disse fusjonsproteinene eller sEL-6R/IL-6-chimerene har blitt effektivt fremstilt i samsvar med foreliggende oppfinnelse i pattedyrcelleekspresjonssystemer for erholdelse av glykosylerte produkter med kraftig aktivitet på tumorceller som vanligvis ikke responderer på EL-6 eller sEL-6R alene, og som var svært effektive for å sikre vellykket innpoding av celler fra humane benmargstransplantater (se nedenfor og eksemplene 1-4). I slike benmargstransplantater var faktis sIL-6R/IL-6-chimerene essensielle for overlevelse og proliferasjon av de transplanterte, uforpliktede, pluripotente hematopoietiske stamceller. Videre fremgår det fra de eksperimentelle resultater presentert heri nedenfor såvel som fra andre analyser at forskjellige analoger av det chimere sIL-6R/IL-6-protein ifølge oppfinnelsen kan fremstilles som har idet vesentlige den samme biologiske aktivitet som sEL-6R/IL-6-chimeren, hvor disse analoger er sIL-6R/IL-6-chimerer i hvilke en eller flere aminosyrerester er delert, innført eller erstattet med andre, hvor den eneste begrensning i slike analoger er at de bibeholder det meste av den naturlige forekommende SDL-6R- og IL-6-sekvens. For eksempel, er aminosyreaddisjoner til de naturlig forekommende sEL-6R- og EL-6-sekvenser fortrinnsvis begrenset til opp til tilnærmet 20 aminosyrer, og disse addisjoner er fortrinnsvis i koblingssetet mellom sIL-6R og EL-6, dvs. i linkermolekylet. Likeså er delesjoner fra sEL-6R- og IL-6-sekvensene fortrinnsvis begrenset til opp til tilnærmet 20-30 aminosyrer, og substitusjoner av aminosyrerester i SEL-6R- og EL-6-sekvensene med andre aminosyrerester er også fortrinnsvis begrenset til opp til tilnærmet 20-30 aminosyrer. Alle de ovenfor nevnte delesjoner, addisjoner og substitusjoner er aksepterbare i samsvar med foreliggende oppfinnelse, dersom de således modifiserte analoger som erholdes bibeholder idet vesentlige de biologiske aktivitet til sIL-6R/IL-6-chimeren som består av idet vesentlige de naturlig forekommende sekvenser, og bibeholder idet vesentlige det samme glykosyleringsmønster som chimeren som består av idet vesentlige de naturlig forekommende sekvenser ved ekspresjon i pattedyrceller.

Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et kimært glykosylert løselig interleukin-6 reseptor (sIL-6R)-interleukin-6 (IL-6) protein (sIL-6R/IL-6) og biologisk aktive analoger av dette, kjennetegnet ved at det er et fusjonsproteinprodukt mellom sEL-6R og IL-6, hvor SEL-6R/IL-6 og nevnte analoger av dette bibeholder samme glyko-syleringsmønster som de naturlig forekommende sekvenser når utrykt i pattedyr celler, hvori sEL-6R og IL-6 er de naturlig forekommende former eller er kjennetegnet ved de naturlig forekommende former med aminosyreaddisjoner opptil 20 aminosyrer, delesjoner opptil 30 aminosyrer og/eller substitusjoner opptil 30 aminosyrer, og hvori nevnte sIL-6R er fusjonert med EL-6 direkte eller via et peptid linker molekyl som er et tripeptid med sekvensen E-F-M (Glu-Phe-Met) eller et 13 aminosyre peptid med sekvensen E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M(Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met).

Utførelser av det ovenfor beskrevne chimere protein ifølge oppfinnelsen omfatter:

(i) sIL-6R8Val/IL-6 med en tripeptidlinker med sekvensen E-F-M mellom den C-terminale Val-356 i sIL-6R og den N-terminale Pro-29 i IL-6, hvor det kimære protein har sekvensen beskrevet i figur 3. (ii) sIL-6R8Val/IL-6 med en 13 aminosyrers peptidlinker med sekvensen E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M mellom den C-terminale Val-356 i sEL-6R og den N-terminale Pro-29 i IL-6, hvor det kimære protein har sekvensen beskrevet i figur 3 hvori tripeptidet med sekvensen E-F-M mellom posisjonene 357-359 i figur 3 er erstattet med denne peptidsekvens på 13 aminosyrer. (iii) Et chimert sEL-6R/IL-6-protein, hvori proteinet er fremstilt in vitro i pattedyrceller i fullt prosessert form.

(iv) Et chimert sIL-6R/IL-6-protein, hvori proteinet er fremstilt i humane celler.

(v) Et chimert sIL-6R/IL-6-protein og biologisk aktive analoger av dette som ovenfor, hvori det chimere protein og analogene særpreges ved at de kan inhibere veksten av svært maligne cancerceller. (vi) Et chimert sIL-6R/IL-6-protein og biologisk aktive analoger av dette som ovenfor, hvori det chimere protein og analogene særpreges ved at de kan inhibere veksten av svært maligne melanomceller. (vii) Et chimert sIL-6R/IL-6-protein og biologisk aktive analoger av dette som ovenfor, hvori det chimere protein og analogene særpreges ved at de kan fremme innpoding in vivo av humane hematopoietiske celler i benmargstransplantater. (viii) Et chimert sIL-6R/EL-6-protein og biologisk aktive analoger av dette som ovenfor, hvori det chimere protein og analogene særpreges ved at de kan beskytte leveren mot hepatotoksiske midler.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en DNA-sekvens som koder for et chimert slL-6R/IL-6-protein og biologisk aktive analoger av dette som bemerket ovenfor, ifølge oppfinnelsen.

I tillegg tilveiebringer foreliggende oppfinnelse også en DNA-vektor som omfatter en DNA-sekvens som koder for et chimert sIL-6R/IL-6-protein og biologisk aktive analoger av dette ifølge oppfinnelsen, som bemerket ovenfor, hvori vektoren er egnet for in vitro ekspresjon av det chimere protein i pattedyrceller.

Utførelser av DNA-vektoren ifølge oppfinnelsen omfatter:

(i) En DNA-vektor hvori vektoren er egnet for ekspresjon av det chimere protein i humane celler. (ii) En DNA-vektor hvori det uttrykte chimere protein når vektoren uttrykkes i pattedyrceller eller humane celler har en sekvens som tillater full prosessering av det chimere protein ved pattedyrcellen eller den humane celle, og sekresjon av det fullt prosesserte chimere protein fra cellene til dyrkningsmediet i hvilket cellene dyrkes. (iii) En DNA-vektor som ovenfor, hvori vektoren er det heri betegnede plasmid pcDNAsIL-6R/lL-6, som omfatter en pcDNA3-vektor som inneholder DNA-sekvensen som koder for det chimere sIL-6R/IL-6-protein under kontroll av en cytomegalovirus (CMV)-promoter. (iv) En DNA-vektor som ovenfor, hvori vektoren er det heri betegnede plasmid pcDNA-sIL-6R/L/IL-6, som omfatter en pcDNA3-vektor som inneholder DNA-sekvensen som koder for det chimere sIL-6R/IL-6-protein under kontroll av en cytomegalovirus (CMV)-promoter, og hvori det i DNA-sekvensen som koder for det chimere sIL-6R/IL-6-protein er innsatt en linkersekvens som koder for et linkerpeptid i EcoRI-setet som er plassert mellom sekvensen som koder for slL-6R-delen og sekvensen som koder for IL-6-delen av proteinet.

Likeså tilveiebringer foreliggende oppfinnelse også transformerte pattedyrceller som inneholder en DNA-vektor som ovenfor som kan uttrykke den chimere sIL-6R/IL-6-proteinsekvens som bæres av vektoren og som fullt ut kan prosessere det uttrykte protein og utskille det i dyrkningsmediet hvor cellene dyrkes.

En utførelse av disse transformerte celler er de heri beskrevne humane embryonale nyrecellene 293 (HEK293) transfektert med vektoren pcDNA sIL-6R/IL-6, hvor cellene kan uttrykke det chimere sIL-6R/DL-6-protein, fullt ut prosessere proteinet og utskille det i dyrkningsmediet i hvilket cellene dyrkes, i form av et glykoprotein på tilnærmet 85 kDa.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et chimert protein eller biologisk aktive analoger av dette som ovenfor, som omfatter dyrking av de ovenfor nevnte transformerte celler under betingelser som er egnet for ekspresjon, prosessering og utskillelse av proteinet eller analogene i dyrkningsmediet som cellene dyrkes i, og rensing av proteinet eller analogene fra dyrkningsmediet ved immunaffinitetskromatografi ved benyttelse av monoklonale antistoffer som er spesifikke for sIL-6R.

Et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av det kimære sIL-6R/IL-6-protein eller analoger av dette, som definert ovenfor, salter av en av disse og blandinger av disse, for fremstilling av et medikament for bruk som en inhibitor av cancerceller, slik som svært maligne melanomceller.

Nok et aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av det kimære sBL-6R/IL-6-protein eller analoger av dette som definert ovenfor, salter av en av disse og blandinger av disse, for fremstilling av et medikament for å fremme innpoding av humane hematopoietiske celler ved benmargstransplantasjon.

Videre vedrører foreliggende oppfinnelse også anvendelse av det kimære slL-6R/IL-6-protein eller analoger av dette som definert ovenfor, salter av en av disse og blandinger av disse, for fremstilling av et medikament for beskyttelse av leveren mot hepatotoksiske midler.

Anvendelse av det kimære slL-6R/IL-6-protein eller analoger av dette, som definert ovenfor, salter av en av disse og blandinger av disse, for fremstilling av et medikament for behandling av levertilstander eller neurologiske tilstander, eller for andre anvendelser i hvilke IL-6 eller sDL-6R benyttes, er også en del av foreliggende oppfinnelse.

Videre tilveiebringer foreliggende oppfinnelse også et farmasøytisk preparat som omfatter som aktiv bestanddel et chimert sIL-6R/IL-6-protein eller en analog av dette som ovenfor, og et farmasøytisk aksepterbart bærestoff, fortynningsmiddel eller en eksipient.

Utførelser av dette farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen omfatter:

(i) Et farmasøytisk preparat for behandling av cancere hos pattedyr.

(ii) Et farmasøytisk preparat for å fremme benmargstransplantasjon.

(iii) Et farmasøytisk preparat for behandling av leverforstyrrelser eller neurologiske forstyrrelser, eller for å forhøye hematopoiesen eller for andre anvendelser i hvilke IL-6 eller sIL-6R benyttes.

Videre vedrører foreliggende oppfinnelse også anvendelse av et kimært sIL-6R/IL-6-protein eller en analog av dette ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av cancere i pattedyr, for fremming av benmargstransplantasjoner, for behandling av leverforstyrrelser eller neurologiske forstyrrelser, for å øke hematopoiese eller for andre anvendelser i hvilke IL-6 eller sIL-6R benyttes.

Andre sider ved og utførelser av foreliggende oppfinnelse beskrives i eller fremgår direkte fra den påfølgende detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 (A, B) viser en skjematisk fremstilling av de forskjellige vektorer, reagenser og prosesstrinn som benyttes ved konstruksjon av det chimere DNA-molekyl som koder for et chimert protein i hvilket strukturen av den naturlige form av sIL-6R som ender ved aminosyreresten Val 356 er konservert, fulgt av sekvensen til den naturlige, modne, prosesserte form av IL-6, som beskrevet i detalj i eksempel 1, Figur 2 (A, B) viser resultatene erholdt fra analysen utført for å identifisere sIL-6R6 Val/IL-6 p86-chimeren ved polyakrylamidgelelektroforese (A) og ved bioaktivitetsprofil (B), hvori det i figur 2A vises en reproduksjon av en Coomassie-farget gel på hvilken det ble fraksjonert ved elektroforese immunrensede fraksjoner eluert fra affinitetskroma-tografikolonner påsatt en utskilt proteinprøve erholdt fra cellekulturer transfektert med en vektor som koder for det chimere protein, og i figur 2B vises en grafisk fremstilling av den biologiske aktivitet (vekstinhibering av F10.9-melanomceller) av hver av de ovenfor beskrevne fraksjoner eluert fra affinitetskromatografikolonnene, alt som beskrevet i detalj i eksemplene 2 og 3, Figur 3 viser aminosyresekvensen (i enbokstavkode) av sIL-6R8Val/IL-6-chimeren i hvilken de forskjellige domener i molekylet er vist, heriblant det N-terminale signalpeptid (linje over sekvensen), det immunoglobulinlignende (Ig-lignende) domenet, cytokinreseptor-N-domenet (understreket), cytokin-C-domenet (linje over sekvensen) og reseptor-pre-membranområdet (området mellom C-domenet og transmembrandomenet), alle fra sEL-6R-delen av chimeren, såvel som den modne IL-6-gruppe (understreket) i chimeren, som beskrevet i eksemplene 1 og 2, Figur 4 (A, B) viser fotografier av F10.9-melanomceller i kultur uten (A) og med (B) behandling med det chimere sEL-6R/lL-6-protein i 4 dager, hvori i figur 4B de morfolo-giske endringer indusert i slike metastatiske melanomceller (F10.9-celler) ved behandling med sIL-6R/IL-6-chimeren er åpenbare, som beskrevet i eksempel 3, Figur 5 er en grafisk fremstilling av resultatene som viser vekstinhibering av F10.9-melanomceller med det chimere slL-6R/IL-6-protein ved forskjellige chimerkon-sentrasjoner i området fra tilnærmet 0,12 ng/ml til tilnærmet 150 ng/ml, hvor chimeren med en linker på kun 3 aminosyrer, IL-6RIL-6 som beskrevet i eksempel 3, sammenlig-nes med en chimer med en lang linker på 13 aminosyrer (IL-6LIL-6), Figur 6 er en grafisk fremstilling av resultatene som viser fravær av vekstinhiberende virkning på F10.9-melanomceller av enten isolert IL-6 alene (den prikkede øvre kurve med åpne firkanter) i konsentrasjoner mellom 0-40 ng/ml IL-6 og sIL-6R alene (konver-genspunktet for alle kurver på den vertikale akse hvor IL-6-konsentrasjonen er null), såvel som de observerte vekstinhiberende virkninger dersom IL-6 og slL-6R tilsettes sammen ved forskjellige konsentrasjoner av hver av dem, hvori EL-6-konsentrasjonen ligger fra 10 ng/ml til 40 ng/ml, og sIL-6R er tilsatt i tre konsentrasjoner på 100 ng/ml, 200 ng/ml og 400 ng/ml for hver IL-6-konsentrasjon, som illustrert i de tre nedre kurver (to prikkede kurver med åpne triangler hhv. sirkler og en heltrukket kurve med fyllte firkanter), som beskrevet i eksempel 3, Figur 7 er en reproduksjon av et autoradiogram av et Southern-blot som viser behovet for det chimere sIL-6R/IL-6-protein for vellykket innpoding av humane hematopoietiske stamceller under benmargstransplantasjon i SCID-NOD-mus (de to sporene til høyre representerer musen som ble gitt det chimere sIL-6R/IL-6-protein i tillegg til de andre nødvendige faktorer, SCF, FLT-3, og dette i motsetning til de tre sporene til venstre som representerer mus som kun ble gitt SCF og FLT-3 og SCF, FLT-3 såvel som isolert, dvs. ikke sammenkoblet, IL-6 og sIL-6R), som beskrevet i eksempel 4, Figur 8 er et Scatchard-plot av affinitetsegenskapene til sIL-6R/IL-6-chimeren sammenlignet med en blanding av IL-6 og sIL-6R, hvor verdiene for chimeren er vist med fyllte firkanter og for blandingen med fyllte romber, hvor forholdet mellom vinkelkoeffisien-tene er 4 til 1, Figur 9 viser den høyere aktivitet av sIL-6R/IL-6-chimeren på F10.9-melanomceller, sammenlignet med aktiviteten av en blanding av slL-6R + IL-6, eller aktiviteten av sDL-6R (uten EL-6), Figur 10 viser den beskyttende virkning av sIL-6R/IL-6-chimeren mot levertoksisitet, hvor verdiene representerer middelverdien fra 4 eksperimenter, fyllte firkanter representerer DL-6-/-mus, fyllte romber representerer IL-6-/-mus tilført DL-6, og fyllte stjerner representerer EL-6-/-mus tilført chimeren, Figur 11 viser aminosyresekvensen (i enbokstavkode) til IL-6-sIL-6R8Val-chimere 3e, hvor linkeren er understreket, og Figur 12 viser den biologiske aktivitetet på F10.9-melanomceller av chimere 3e (fyllte stjerner), sammenlignet med sIL-6R/IL-6-chimeren (fyllte firkanter) og to mutanter (Mutt 39 (HD) - fyllte romber) og Mutt NHD - skraverte stjerner), som beskrevet i eksempel 9.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører et kimært glykosylert løselig interleukin-6 reseptor (sIL-6R)-interleukin-6 (DL-6) protein (sEL-6R/EL-6) og biologisk aktive analoger av dette, kjennetegnet ved at det er et fusjonsproteinprodukt mellom sIL-6R og IL-6, hvor sDL-6R/IL-6 og nevnte analoger av dette bibeholder samme glykosyleirngsmønster som de naturlig forekommende sekvenser når utrykt i pattedyr celler, hvori sEL-6R og IL-6 er de naturlig forekommende former eller er kjennetegnet ved de naturlig forekommende former med aminosyreaddisjoner opptil 20 aminosyrer, delesjoner opptil 30 aminosyrer og/eller substitusjoner opptil 30 aminosyrer, og hvori nevnte sIL-6R er fusjonert med IL-6 direkte eller via et peptid linker molekyl som er et tripeptid med sekvensen E-F-M (Glu-Phe-Met) eller et 13 aminosyre peptid med sekvensen E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met). Et slikt chimert sEL-6R/EL-6-protein, fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse i pattedyrceller, nærmere bestemt i humane celler (se eksemplene 1-4 nedenfor) eller CHO-celler (se eksempel 6 nedenfor), ble funnet å uttrykkes effektivt i slike celler, å være svært glykosylert og å ha kraftig virkning på tumorceller som ikke i det hele tatt responderer på IL-6 eller sIL-6R alene.

Nærmere bestemt har det ifølge foreliggende oppfinnelse blitt observert (se eksempelen 1-3 nedenfor) at det ovenfor beskrevne chimere sDL-6R/IL-6-protein ifølge oppfinnelsen forårsaker vekstarrest av svært maligne pattedyrceller, f.eks. F10.9-melanomceller, ved konsentrasjoner som er lavere enn det som er nødvendig dersom en blanding av ikke-sammenkoblet sIL-6R og IL-6 benyttes. Dette er et spesielt viktig resultat tatt i betraktning det faktum at slike F10.9-melanomceller fortsetter å vokse normalt dersom de behandles med kun IL-6 eller kun sIL-6R hver for seg og kun undergår vekstarrest dersom de eksponeres for relativt høye doser av en kombinasjon av ikke-sammenlignet IL-6 og sIL-6R. Følgelig er det sIL-6R/IL-6-protein ifølge den foreliggende oppfinnelse overraskende nok en kraftigere inhibitor av disse svært maligne melanomcellene enn en blanding av dets enkelte deler, dvs. en blanding av ikke-sammenlignet IL-6 og sIL-6R. Det chimere protein ifølge foreliggende oppfinnelse er således spesielt anvendbart som en aktiv bestanddel for behandling av forskjellige typer cancere.

Den høyere aktivitet av det chimere sIL-6R/IL-6-protein skyldes at det har høyere affinitet for bpl30 enn blandingen av ikke-sammenkoblet IL-6 og sIL-6R har (eksempel 7).

Videre er det også funnet i samsvar med foreliggende oppfinnelse (se eksempel 4 nedenfor) at et chimert sIL-6R/IL-6-molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt anvendbart for å fremme benmargstransplantasjon. Ved benyttelse av en kjent fremgangsmåte for innpoding av humane benmargsceller i mus med alvorlig kombinert immundefisiens (SCID)-mus, i hvilke stamcellefaktor (SCF) og Flt-3-ligand benyttes for å tillate overlevelse og proliferasjon av de mest primitive, pluripotente hematopoietiske stamceller som kan gi lang tids innpoding i mottakerens benmarg, ble det faktisk funnet at disse to faktorer, SCF og Flt3-ligand, ikke var tilstrekkelig til å fremme innpoding av humane celler i mottakermusens benmarg, og at innpodingen kun var vellykket dersom det chimere slL-6R/IL-6-protein også ble tilsatt. Dette funn tyder på at det chimere protein kan være essensielt for slike innpodingsfremgangsmåter. I de samme eksperimenter var ikke-sammenkoblet EL-6 og sIL-6R tilsatt hver for seg ikke tilstrekkelig til å fremme vellykket benmargstransplantasjon, og ved tilsetning sammen mye mindre aktive enn det chimere sEL-6R/IL-6-protein, dvs. at det chimere sIL-6R/EL-6-protein i en effektiv konsentrasjon på 100 ng/ml fremmet vellykket benmargstransplantasjon, mens de to adskilte, ikke-sammenkoblede proteinene sEL-6R og EL-6 tilsatt sammen i enda høyere konsentrasjoner (sEL-6R fra 125-1250 ng/ml, IL-6 fra 50-200 ng/ml), var mye mindre aktive i fremming av slik transplantasjon.

Det ovenfor beskrevne chimere sIL-6R/IL-6-protein ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis en rekombinant, glykosylert slL-6R/TL-6-chimere fremstilt i humane celler eller i et hvert annet egnet pattedyrcelleekspresjonssystem, f.eks. CHO-celler fra hamster, som er i stand til å glykosylere proteiner på samme måte som humane celler og som innfører de samme post-translansjonelle modifikasjoner som humane celler. En viktig egenskap er at det således fremstilt chimere glykoprotein prosesseres og modifiseres på samme måte som de naturlige utgangsmolekylene sIL-6R og IL-6 foreligger i menneskekroppen, uten forkorting og uten innføring av unaturlige tilleggspolypeptidsekvenser, bortsett fra det svært korte tripeptid eller dersom et lengre linkerpeptid innføres mellom sIL-6R-gruppen og IL-6-gruppen i det chimere protein.

For å fremstille det ovenfor beskrevne, foretrukne chimere protein ifølge oppfinnelsen ble følgende egenskaper ved naturlig forekommende sIL-6R og EL-6 tatt i betraktning: Det er kjent at EL-6R som foreligger i humane cellemembraner fremstilles fra et cDNA som koder for 468 aminosyrer innbefattet et signalpeptid, et immunoglobulin (Ig)-lignende domene, et cytokinbindingsdomene, et transmembranområde og et cytoplasma-tisk domene (Yamasaki et al., 1988). En løselig form av sIL-6R finnes i kroppsvæsker og har i likhet med moden EL-6R fra membraner, en aminoende som tilsvarer Leu-20 (Novick et al., 1990) og en C-ende som tilsvarer Val-356, som ligger like før transmembranområdet i 1L-6R (se de foreliggende oppfinneres U.S. patentskrift nr. 5,216,128 og EP 413,908 Bl). For å sammenkoble denne sIL-6R-sekvens til IL-6, ble et EcoRI-restriksjonssete innført etter Val-356. Sekvensen av modent IL-6 med start ved Pro-29 i IL-6-cDNA og slutt ved Met-212 (Zilberstein et al., 1986; Hirano et al., 1986) ble innført etter dette EcoRI-setet. I dette EcoRI-setet kunne også, men ikke nødvendig-vis, innføres et linkerpeptid med ønsket lengde for å skilløe slL-6R- og IL-6-gruppene fra hverandre i det chimere protein. Som beskrevet i eksemplene nedenfor, ble to forskjellige chimere proteiner fremstilt som eksempler på slike mulige chimere proteiner, et med et tripeptidlinker og det andre med en linker med 13 aminosyrerester i dette EcoRI-setet, hvor begge hadde idet vesentlige lik biologisk aktivitet.

Foreliggende oppfinnelse gjelder også analoger av det ovenfor beskrevne chimere sDL-6R/IL-6-protein ifølge oppfinnelsen, hvor analogene bibeholder idet vesentlige den samme biologiske aktivitet som det chimere protein med idet vesentlige kun de naturlig forekommende sekvenser av sIL-6R og IL-6. Slike analoger kan være analoger i hvilke opp til tilnærmet 30 aminosyrerester er deletert, innført eller substituert med andre i sIL-6R- og/eller IL-6-grupper i det chimere protein, slik at modifikasjoner av denne type ikke idet vesentlige endrer den biologiske aktivitet av den chimere proteinanalog sammenlignet med et chimere protein selv, og hvor sDL-6R-gruppen i slike analoger idet vesentlige bibeholder den naturlig forekommende struktur (før prosessering - se figur 3) med et signalpeptid, et Ig-lignende domene, et cytokinreseptor-N-domene, et cytokinreseptor-C-domene og et reseptor-pre-membrandomene. Likeså bør slike chimere protei-nanaloger bibeholder idet vesentlige den naturlig forekommende modne form av IL-6-gruppen. De forskjellige analoger kan være mest ulike hverandre og det grunnleggende chimere proteinmolekyl (molekylet med idet vesentlige kun naturlig forekommende sIL-6R- og IL-6-sekvenser) i setet for linkerpeptidet som sammenkobler sEL-6R- og EL-6-gruppen idet chimere protein. En slik linker kan være opp til tilnærmet 30 aminosyrer lang og bidrar til å adskille sIL-6R-gruppen og DL-6-gruppen fra hverandre i det chimere protein. Når det gjelder en slik linker, bør forsiktighet utøves ved valg av sekvens (og følgelig også ved biologisk analyse i egnede standardanalyser av slike analoger) slik at den f.eks. ikke vil føre til ukorrekt folding av det chimere protein og gjøre det inaktivt, eller at den ikke vil gjøre den chimere proteinanalog til et immunogent protein som vil utløse antistoffer mot proteinet i en pasient som skal behandles med dette, noe som vil føre til at en slik analog vil være ineffektiv, idet minste som et medikament for middels eller lang tids bruk.

Når det gjelder de ovenfor nevnte analoger av det chimere protein ifølge oppfinnelsen, er disse analoger analoger i hvilke en eller flere, og opp til 30, av aminosyrerestene i det grunnleggende chimere protein ifølge oppfinnelsen er erstattet med forskjellige aminosyrerester, eller er deletert, eller hvor en eller flere aminosyrerester er tilført den opprinnelige sekvens av det chimere protein ifølge oppfinnelsen (proteinet med idet vesentlige kun de naturlig forekommende sIL-6- og IL-6-sekvenser) uten i omfattende grad å endre aktiviteten av de resulterende produkter sammenlignet med det grunnleggende chimere protein ifølge oppfinnelsen. Disse analoger fremstilles ved kjente synteseteknikker og/eller teknikker for setestyrt mutagenese, eller ved en hver annen kjent teknikk som er egnet for dette.

En hver slik analog har fortrinnsvis en aminosyresekvens som er tilstrekkelig lik sekvensen til den grunnleggende slL-6R/lL-6-chimere til at den har idet vesentlige tilsvarende aktivitet som denne. Således kan det fastslås hvorvidt en gitt analog har idet vesentlige samme aktivitet som det grunnleggende protein ifølge oppfinnelsen ved hjelp av rutinemessig eksperimentering, heriblant å undersøke en slik analog med de analyser for biologisk aktivitet som beskrives i eksemplene 2-4 nedenfor.

Analoger av det chimere protein som kan benyttes i forbindelse med foreliggende oppfinnelse, eller nukleinsyrer som koder for disse, omfatter et begrenset sett av idet vesentlige tilsvarende sekvenser som substitusjonspeptider eller polynukleotider som kan erholdes rutinemessig av en gjennomsnittsfagmann uten omfattende eksperimentering, basert på den lære og de retningslinjer som presenteres heri. For en detaljert beskrivelse av proteinkjemi og proteinstruktur, se Schulz, G.E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978; og Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983. For en presentasjon av nukleotidsekvenssubstitusjoner, f.eks. kodonpreferanser, se Ausubel et al, supra, i §§ A. 1.1-A. 1.24, og Sambrook et al, Current Protocols in Molecular Biology. Interscience N. Y. §§6.3 og 6.4 (1987,1992), i etterord C og D.

Foretrukne endringer i analoger i samsvar med foreliggende oppfinnelse er hva som betegnes "konservative" substitusjoner. Konservative aminosyresubstitusjoner av aminosyrene i det chimere protein som har idet vesentlige de naturlig forekommende sIL-6R- og DL-6-sekvenser kan omfatte synonyme aminosyrer innen en gruppe som har tilstrekkelig like fysikalskkjemiske egenskaper til at substitusjon mellom medlemmer av gruppen vil bevare molekylets biologiske funksjon, Grantham, Science, bind 185, s. 862-864 (1974). Det er klart at insertsjoner og delesjoner av aminosyrer også kan utføres i de ovenfor definerte sekvenser uten å endre deres funksjon, særlig dersom insertsjone-ne eller delesjonene kun omfatter noen få aminosyrer, f.eks. under 30 og fortrinnsvis under 10, og ikke fjerner eller erstatter aminosyrer som er avgjørende for en funksjonell konformasjon, f.eks. cysteinrester (Anfinsen, "Principles That Govern The Folding of Protein Chains", Science, bind 181, s. 223-230 (1973). Analoger fremstilt ved slike delesjoner og/eller insertsjoner ligger innenfor foreliggende oppfinnelses område.

De synonyme aminosyregrupper er fortrinnsvis gruppene definert i tabell I. Mer foretrukket er de synonyme aminosyregrupper gruppene definert i tabell n, og mest foretrukket er de synonyme aminosyregrupper gruppene definert i tablel IQ. Eksempler på innføring av aminosyresubstitusjoner i proteiner som kan benyttes for erholdelse av analoger av det chimere protein for anvendelse i foreliggende oppfinnelse omfatter et hvert kjent metodetrinn, f.eks. som beskrevet i U.S. patentskrifter RE 33,653,4,959,314,4,588,585 og 4,737,462 tildelt Mark et al.; 5,116,943 tildelt Koths et al., 4,965,195 tildelt Nåmen et al., 4,879,111 tildelt Chong et al., og 5,017,691 tildelt Lee et al., og lysinsubstituerte proteiner presentert i U.S. patentskrift nr. 4,904,584 (Shaw et al.).

I en annen foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse har enhver analog av det chimere protein for anvendelse i foreliggende oppfinnelse en aminosyresekvens som idet vesentlige tilsvarer sekvensen til det ovenfor bemerkede, grunnleggende chimere protein ifølge oppfinnelsen. Begrepet "idet vesentlige tilsvarer" er ment å omfatte analoger med mindre endringer av sekvensen av det grunnleggende chimere protein som ikke påvirker proteinets grunnleggende egenskaper, særlig når det gjelder dets evne til f.eks. å inhibere cancercelleproliferasjon eller fremme benmargstransplantasjoner. De endringer som generelt anses å ligge innenfor begrepet "idet vesentlige tilsvarer" er slike som er en følge av konvensjonelle mutageneseteknikker på DNA som koder for det chimere protein ifølge oppfinnelsen og som fører til kun mindre modifikasjoner, og gjennomsøking etter den ønskede aktivitet på den måte som er diskutert ovenfor.

Analoger i samsvar med foreliggende oppfinnelse omfatter analoger som kodes av en nukleinsyre, f.eks. DNA eller RNA, som under stringente betingelser hybridiserer til DNA eller RNA som koder for et chimert protein ifølge foreliggende oppfinnelse, som omfatter idet vesentlige hele de naturlig forekommende sekvenser som koder for sIL-6R og IL-6. Et slikt hybridiserende DNA eller RNA kan f.eks. være et DNA eller RNA som koder for det samme protein ifølge oppfinnelsen med f.eks. sekvensen beskrevet i figur 3, men som avviker i nukleotidsekvens fra den naturlig avledede nukleotidsekvens gruppet den genetiske kodes degenererthet, dvs. at en noe forskjellig nukleinsyresekvens fortsatt kan kode for samme aminosyresekvens grunnet denne degenererthet. Videre, som også bemerket ovenfor, er omfanget av aminosyreendringer (delesjoner, addisjoner, substitusjoner) begrenset til opp til tilnærmet 30 aminosyrer, slik at analogene i samsvar med foreliggende oppfinnelse selv med den maksimale mengde endringer vil være analoger som idet vesentlige bibeholder ledersekvensen (før prosessering), det Ig-lignende domenet, cytokinreseptor-N- og C-domenene og reseptor-pre-membranområdet (området mellom C-domenet og transmembrandomenet) i slL-6R-gruppen og idet vesentlige hele IL-6-gruppen. En slik nukleinsyre vil være en åpenbar kandidat for å fastslå hvorvidt det koder for et polypeptid som bibeholder den funksjonelle aktivitet av det chimere protein ifølge foreliggende oppfinnelse. Begrepet "stringente betingelser" viser til betingelser under hybridisering og den påfølgende vask som gjennomsnittsfagfolk konven-sjonelt betegner "stringente". Se Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biologv. su<p>ra. Lnterscience. N. Y., avsnitt 6.3 og 6.4 (1987,1992) og Sambrook et al., supra. Uten begrensning omfatter eksempler på stringente betingelser vaskebetingelser 12-20°C under det beregnede Tm for hybridet som undersøkes i f.eks. 2 x SSC og 0,5% SDS i 5 minutter, 2 x SSC og 0,1% SDS i 15 minutter, 0,1 x SSC og 0,5% SDS ved 37°C i 30-60 minutter og deretter 0,1 x SSC og 0,5% SDS ved 68°C i 30-60 minutter. Gjennomsnittsfagfolk vil forstå at stringensbetingelser også avhenger av lengden av DNA-sekvensene, oligonukleotidprobene (f.eks. 10-40 baser) eller de blandede oligonukleotidprober. Dersom blandede prober benyttes foretrekkes det å benytte tetramety-lammoniumklorid (TMAC) istedet for SSC. Se Ausubel. supra.

Begrepet "salter" viser heri til både salter av karboksylgrupper og til syreaddisjonssalter av aminogrupper i det chimere protein ifølge oppfinnelsen eller dets analoger. Salter av en karboksylgruppe kan dannes ved fremgangsmåter kjent innen faget og omfatter uor-ganiske salter, f.eks. natriumsalter, kalsiumsalter, ammoniumsalter, treverdige jernsalter eller sinksalter og lignende, og salter med organiske baser, som dem dannet med f.eks. aminer, som trietanolamin, arginin eller lysin, piperidin, prokain og lignende. Syreaddisjonssalter omfatter f.eks. salter med mineralsyrer som saltsyre eller svovelsyre, og salter med organiske syrer, f.eks. eddiksyre eller oksalsyre. Naturligvis må et hvert slikt salt ha idet vesentlige tilsvarende aktivitet som det chimere protein ifølge oppfinnelsen eller dets analoger.

Foreliggende oppfinnelse gjelder også DNA-sekvenser som koder for det ovenfor beskrevne chimere protein ifølge oppfinnelsen og dets analoger, såvel som DNA-vektorer som bærer slike DNA-sekvenser for ekspresjon i egnede pattedyrceller, fortrinnsvis humane celler. En utførelse av en vektor ifølge oppfinnelsen er et plasmid pcDNA sIL-6R/IL-6 som omfatter pcDNA3-vektoren (Invitrogen) inneholdende de fusjonerte sIL-6R/IL-6-sekvenser under kontroll av en cytomegalovirus (CMV)-promoter.

Foreliggende oppfinnelse gjelder også transformerte pattedyrceller, fortrinnsvis humane celler, som kan uttrykke de ovenfor beskrevne proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse. En utførelse av slike transformerte celler er de humane embryonale nyrecellene 293 (HEK 293, ATCC CRL 1573) transfektert med pcDNA sIL-6R/IL-6, som utskiller den chimere sIL-6R/lL-6-fusjonen som et glykoprotein på 85 kDa.

Nok en utførelse er plasmid pcDNA srL-6R/L/IL-6, som avviker fra det ovenfor nevnte pcDNA slL-6R/IL-6 ved at korte linkere som koder for ytterligere 10 aminosyrer er innsatt i EcoRI-setet. En rekke forskjellige sekvenser av varierende lengde kan innføres for å optimalisere avstanden mellom sIL-6R og IL-6.

Foreliggende oppfinnelse gjelder videre en fremgangsmåte for fremstilling og rensing av det chimere protein ifølge oppfinnelsen eller dets analoger, som omfatter dyrking av de ovenfor beskrevne transformerte celler under betingelser som er egnet for ekspresjon og utskillelse av det chimere proteinprodukt i dyrkningsmediet, og deretter rensing av det utskilte protein ved immunaffinitetskromatografi med det monoklonale anti-sEL-6R-antistoff 34.4, som bemerket i eksempel 2 og 5 nedenfor.

Oppfinnelsen gjelder også et farmasøytisk preparat som omfatter som aktiv bestanddel en sEL-6R/IL-6-chimer eller analoger av denne, eller blandinger av disse eller salter av disse, og et farmasøytisk aksepterbart bærestoff, fortynningsmiddel eller en eksipiens. En utførelse av det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen omfatter et farmasøytisk preparat for forsterket virkning av IL-6-type for behandling av cancere, for benmargstransplantasjon, for forhøyet hematopoiese, nærmere bestemt trombopoiese, for behandling av neurologiske tilstander, for behandling av leverforstyrrelser og andre anvendelser av EL-6 eller beslektede cytokiner.

De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen fremstilles for tilførsel ved å blande det chimere protein eller dets analoger med fysiologisk aksepterbare bærestoffer og/eller stabilisatorer og/eller eksipienser, og fremstilt i doseringsform ved f.eks. frysetørking i doseringsampuller. Tilførselsfremgangsmåten kan være via en hver av de aksepterte tilførselsveier for tilsvarende midler og vil avhenge av tilstanden som skal behandles, f.eks. intravenøst, intramuskulært, subkutant, ved lokal injeksjon eller topisk påføring, eller kontinuerlig ved infusjon osv. Mengden av aktiv forbindelse som skal tilføres vil avhenge av tilførselsveien, sykdommen som skal behandles og pasientens tilstand. Lokal injeksjon vil f.eks. kreve en mindre mengde av proteinet relativt til kroppsvekten enn intravenøs infusjon vil.

Foreliggende oppfinnelse gjelder også anvendelser av det chimere protein ifølge oppfinnelsen eller dets analoger, eller blandinger av disse, for fremstilling av et medikament for behandling av cancere, for benmargstransplantasjoner, for forhøyet hematopoiese, særlig trombopoiese, for behandling av neurologiske tilstander, for beskyttelse av levervev hos pasienter med nekrotiske sykdommer grunnet kjemikalier (f.eks. karbontetraklorid, alkohol, paracetamol) eller andre årsaker (f.eks. virale, kirurgiske), og for anvendelse i andre tilstander hvori IL-6 eller beslektede cytokiner anvendes. Likeså gjelder foreliggende oppfinnelse også det chimere protein eller analoger av dette, eller blandinger av disse, for anvendelse ved fremstilling av medikamenter for behandling av de ovenfor nevnte lidelser eller for anvendelse i de ovenfor angitte indikasjoner.

I tillegg til de ovenfor nevnte anvendelser, omfattes også eks-vivo-fremgangsmåter og genterapi med chimeren og/eller DNA som koder for den.

Foreliggende oppfinnelse vil nå beskrives i mer detalj i de påfølgende, ikke-begrensende eksempler og de vedlagte figurer.

Eksempel 1: Konstruksjon av sIL- 6RSVal/ IL- 6- chimereekspresionsvektoren

I figur 1, vises et skjematisk flytdiagram over trinnene som ble utført for konstruksjon av ekspresjonsvektoren som bærer sekvensen som koder for det chimere sIL-6R5Val/IL-6-protein, innbefattet alle de forskjellige utgangsvektorene og intermediære vektorer, forskjellige reagenser og reaksjonstrinn. Denne konstruksjonsfremgangsmåte benyttet i det vesentlige teknikker som er velkjente innen faget for konstruksjon av ønskede eks-presjonsvektorer (se f.eks. Sambrook et al., 1989). Fremgangsmåten var kort beskrevet som følger: Et cDNA-bibliotek fra de humane brystcarcinomcellene T47D ble klonet i bakteriofag lambda (A,) gtl 1 og gjennomsøkt med oligonukleotidprober avledet fra IL-6R-sekvensen til Yamasaki et al. (1988). En A,gtl 1 cDNA-klon som hadde hele den humane 1L-6R-kodende sekvens ble isolert. Innskuddet ble utkuttet fra Xgtl 1 med EcoRI og klonet i det multiple kloningssetet (MCS) i E. coli-fagmidet Blue Script pBS/SK (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, California). Dette plasmid pBS/SK-IL-6R (figur 1) ble kuttet med EcoRI gjort buttendet og kuttet med EcoRV for isolering av det 5'-fragment av IL-6R på 959 basepar (bp) som ender ved EcoRV-setet i IL-6R (koordinat 1203). Dette fragment, ekstrahert fra en agarosegel etter elektroforese, ble klonet i en ny pBS/SK-vektor åpnet i EcoRV-setet i MCS (pBS/SK-sIL-6R-RV i figur 1).

Det ovenfor beskrevne, tidligere erholdte pBS/SK-IL-6R-DNA ble behandlet med po-lymerasekjedereaksjonen (PCR) for amplifisering av et fragment på 368 bp mellom foroverprimeren 1137-1156 og den reverse primer 1505-1488. Den reverse primer ble syntetisert med et EcoRI-sete umiddelbart etter kodonet for valin-356 i IL-6R (se figur 1), siden denne valinrest tidligere var vist å være den karboksyterminale aminosyre i den naturlige form av løselig sIL-6R utskilt i human urin (Novick et al., 1990; Oh et al., 1996; de foreliggende oppfinneres U.S. patentskrift nr. 5,216,128 og EP patentskrift nr. EP 413908 Bl). PCR-produktet ble kuttet med EcoRV og EcoRI og ligert inn i pBS/SK-SIL-6R-RV) mellom EcoRV-setet i 1L-6R og EcoRI-setet i MCS (figur 1). Det resulterende plasmid pBS-sIL-6R-8Val-RI ble så forkortet for fjerning av 5'-ikke-translaterte sekvenser ved ligering av HindDI-setet i MCS til Ncol-setet ved basepar 410 i IL-6R (hvor begge seter først ble gjort buttendet), for erholdelse av pBS-sIL-6R-8Val-RI-NcoI (figur 1). IL-6-sekvensen ble avledet fra plasmid pKKB2-7, som som tidligere beskrevet (Chen et al., 1988), ble konstruert ved innsetting av BstNI-kuttet EFN-B2/IL-6-CDNA (Zilberstein et al., 1986) i EcoRI-setet i É. coli-ekspresjonsvektoren pKK223-3 (Pharmacia, Uppsa-la, Sverige) ved benyttelse av et syntetisk oligonukleotid med et EcoRI-sete fulgt av et metioninkodon og kodonet for prolin-29 i IL-6, og med avslutning ved et BstNI (Eco-RH)-sete. IL-6-cDNA-innskuddet i pKKB2-7 slutter 7 basepar etter terminasjonskodonet i et NlaTV-sete og følges 11 bp senere av HindlH-sete i pKK223-3-vektoren (figur 1). pKKB2-7-DNA ble kuttet med Hindm, gjort buttendet og kuttet med EcoRI, og IL-6-cDNA innsatt i pBS-sIL-6R-8Val-RI-NcoI slik at den modne EL-6-sekvens (med start ved prolin-29) ble innkoblet umiddelbart etter valin-356 i 1L-6R og adskilt fra dette med kun 3 kodoner (Glu-Phe-Met). Det resulterende plasmid pBS/SK-sIL-6R/IL-6 (figur 1) ble så kuttet i Sall-setet og Notl-setet i MCS og innskuddet klonet inn i EcoRV-setet i pcDNA3 (Invitrogen Corporation, San Diego, California). Det resulterende plasmid pCDNA3-sIL-6R/IL-6 (figur 1) inneholder innskuddet nedstrøms for den kraftige cytomegalovirus (CMV)-promoter og følges av et polyadenyleringssete, noe som sikrer effektiv transkripsjon av sIL-6R8Val/IL-6-chimeren. Den konserverte 5' ende av sEL-6R i chimeren sikrer at signalpeptidfunksjonen og prosessering av det chimere proteins aminoende etter ekspresjon i pattedyrceller vil være som for naturlig sIL-6R.

Som antydet ovenfor, er en fordelaktig egenskap ved sIL-6R8Val/IL-6-konstruksjonen at den idet vesentlige er en fusjon mellom den naturlige form av sIL-6R og den naturlige form av IL-6 som disse foreligger i menneskekroppen, og uten ytterligere polypeptid-sékvenser. Imidlertid, tillater konservering av EcoRI-setet i sIL-6R8Val/IL-6-konstruksjonen (figur 1) enkel innføring av linkerpolypeptidsegmenter mellom sIL-6R-delen og EL-6-delen. En slik konstruksjon med den 13 aminosyrer lange linkersekvens Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met innsatt mellom Val-356 i S1L-6R og Pro-29 i IL-6, ble også konstruert (sLL-6R8Val/L/lL-6).

Eksempel 2; Ekspresjon av sIL- 6R8Val/ IL- 6- chimeren i humane celler

Ved å benytte idet vesentlige standardteknikker for dyrking av pattedyrceller, trans-feksjon av celler og analyse av de transfekterte celler for ekspresjon av den nyinnsatte DNA-sekvens som skulle uttrykkes (for fremgangsmåter se f.eks. Sambrook et al., 1989), ble den ovenfor beskrevne plasmidkonstruksjon (eksempel 1) benyttet for trans-feksjdn av humane celler, og ekspresjon av sekvensen i disse ble bekreftet. Kort beskrevet ble følgende fremgangsmåter benyttet: Humane HEK 293-celler (ATCC CRL 1573, transformete primære humane embryonale nyreceller) ble transfektert med plasmidkonstruksjonen pCDNA3-sIL-6R/TL-6-DNA (beskrevet i eksempel 1 ovenfor). Kulturer i logfase av HEK 293 ble trypsinbehandlet og utsådd i 9 cm Nunc-plater (2,5 x IO<6> celler/plate). En dag senere ble transfeksjonen utført med 10 ug pCDNA3-sIL-6R/IL-6-DNA ved CaP04-utfellingsfremgangsmåten

(Sambrook et al., 1989) og 1 time senere ble mediet endret til DMEM-10% FCS og dyrkingen fortsatt i ytterligere 16 timer. Etter endring av mediet til DMEM-2% FCS, ble de utskilte proteiner oppsamlet for to på hverandre følgende tidsrom på 48 timer. Celleres-ter ble fjernet ved sentrifugering ved 1000 rpm i 10 minutter og supernatanten analysert ved en ELISA for sIL-6R ved benyttelse av polyklonalt anti-sIL-6R fra kanin og McAB 17,6 fra mus (Novick et al., 1991). En konsentrasjon på 1,2 ng/ml slL-6R-ekvivalenter ble funnet, noe som tyder på svært effektiv ekspresjon av det chimere sIL-6R/IL-6-protein i de transfekterte humane celler.

Immunrensing av det utskilte chimere protein (sDL-6R/IL-6) ble utført med det monoklonale antistoff 34.4, som er spesifikt for en epitop i det ekstracellulære domenet i sIL-6R (Novick et la., 1991; Halimi et al., 1995). 34.4-hybridomcellene ble dyrket i bukhulen hos mus og immunglobulin (Ig)-fraksjonen erholdt fra ascitisvæske ved am-moniumsulfatutfelling. Affigel-10 (Bio-Rad Labs, Richmond, California) ble benyttet for immobilisering av McAB 34.4 (15 mg lg koblet til 1 ml Affigel-10). Supernatantene som inneholdt de utskilte proteiner fra HEK 293-cellene transfektert med pCDNA3-sIL-6R/IL-6 ble adsorbert til kolonner av McAB 34.4 (0,3 ml kolonne for 15 ml superna-tant). Etter vask med PBS ble bundne proteiner eluert med 25 mM sitronsyre, pH 2,5, og deretter umiddelbart nøytralisert med 1 M Hepes-buffer pH 8,5 og dialysert over natten (tilnærmet 8-12 timer) mot PBS.

Analyse av det immunrensede protein ved polyakrylamidgelelektroforese i SDS viste et eneste proteinbånd som ble farget med Coomassie blue (figur 2). Molekylvekten av proteinet var 85 kilodalton, som forventet fra fusjonen av de glykosylerte former av slL-6R 8Val (60 kDa som vist i Oh et al., 1996) og glykosylert IL-6 (23-26 kDa som vist i Zilberstein et al., 1986). Aminosyresekvensen til slL-6R/IL-6 er på 543 aminosyrer, som etter prosessering av signalpeptidene vil tilsi et protein på 524 aminosyrer eller tilnærmet 58 kDa (figur 3). Den mye større størrelse av sIL-6R/IL-6-chimeren fremstilt fra rekombinant DNA i humane celler tyder på at glykosylering utgjør en omfattende del av mdlékylet.

Eksempel 3; sIL- 6R/ IL- 6- chimeren stanser vekst og induserer differensiering av metastatiske melanomceller

F10.9-klonen avledet fra B16-melanomceller danner svært metastatiske tumorer i C57Black/6-mus som dreper dyrene grunnet lungemetastaser i løpet av 2-3 måneder (Katz et al., 1995). Tilsetning av det chimere sIL-6R/IL-6-protein til F10.9-cellekulturer ga en omfattende morfologisk endring av cellene og stanset deres vekst (figur 4). Fl0.9-cellene behandlet med chimeren ble avlange med utstikkende dendritiske forlengelser, tilsvarende spindeloid differensiering av embryonale melanocytter eller glialceller.

Cellenes vekst ble kvantitert 4 dager etter utsåing av 3xl0<6> celler i brønner i en 96-brønners mikroplate i 0,2 ml RPMI 1640-medium med 10% FCS. Cellene ble fiksert med 12,5% glutaraldehyd i 30 minutter, vasket med vann og farget med 0,1% krystallfi-olett i 30 minutter. Etter grundig vask og tørking ble fargestoffet ekstrahert med 10% eddiksyre og den optiske tetthet ved 540 nm målt. Chimeren ga en doseavhengig vekstinhibering med fullstendig vekstinhibering ved konsentrasjoner så lave som 10 ng/ml av det chimere (p85) protein (figur 5). De to chimere proteiner sIL-6R8Val/IL-6 og sIL-6R 8Val/L/IL-6 (chimere med lengre linker mellom sIL-6R-delen og IL-6-delen, se eksempel 1) hadde lik aktivitet. Dette resultat bidrar også til å vise at linkerpeptidet mellom sIL-6R-delen og IL-6-delen i chimeren ikke er essensielt for chimerens aktivitet, siden den ovenfor beskrevne sIL-6R8Val/L-IL-6-chimere kun har en svært kort linker på 3 aminosyrer mens den ovenfor beskrevne sDL-6R8Val/L-IL-6 har et lengre linkerpeptid på 13 aminosyrer, men begge har idet vesentlige samme aktivitet når det gjelder inhibering av vekst av de metastatiske celler. I motsetning til dette inhiberer hverken IL-6 alene eller sIL-6R 8Val alene vekst av disse melanomceller (figur 6), noe som viser den enestående aktivitet av det chimere sIL-6R/IL-6 (p85)-protein. For å oppnå en tilsvarende virkning, kreves en blanding av 200-400 ng/ml IL-6 og 125 ng/ml slL-6R8Val (figur 6). Beregnet i molare konsentrasjoner krevde maksimal inhibering av F10.9-celler 7,5 nM IL-6 og 2 nM sIL-6R8Val, sammenlignet med kun 0,12 nM av sIL-6R/TL-6-chimer. Den vekstinhiberende aktivitet av det chimere p85 sIL-6R/IL-6-protein ble fulgt gjen-nom immunrensingen på McAB 34.4-kolonner (se eksempel 2). Aktivitetsmønsteret tilsvarte intensiteten av p85-båndet som kan ses i forskjellig fraksjoner i SDS-polyakrylamidgelelektroforesen i figur 2.

Eksempel 4: sIL- 6R/ IL- 6- chimeren er essensiell for innpoding av transplanterte humane benmargsceller

Innpoding av hematopoietiske stamceller fra human benmarg kan undersøkes etter transplantasjon i mus med alvorlig kombinert immundefisiens (SCID)-mus (Vormoor et al., 1994). SCID-NOD-mus ble utsatt for subletal bestråling og injisert i halevenen med 3xl0<5> humane CD34<+->benmargceller. Før injeksjonen ble de rensede CD34<+->cellene inkubert i 3 dager i flytende kultur med forskjellige kombinasjoner av cytokiner. Etter en måned ble musene avlivet og ben ble fjernet for oppsamling av benmargcellene. Innpoding av humane celler i SCID-NOD-mottakermusene ble evaluert ved Southern-blothybridisering mot humant repetitivt DNA.

Stamcellefaktor (SCF, steelfaktor eller ckit-ligand) og Flt3-ligand (flt3/flk2-tyrosinkinasereseptorligand) har vist seg viktige for overlevelse og proliferasjon av de mest primitive pluripotente hematopoietiske stamceller som er i stand til lang tids innpoding i mottakerbenmarg (McKenna et al., 1995). Som vist i figur 7, var disse to faktorer alene ikke tilstrekkelig til å fremme innpoding av humane celler i benmargen hos SCID-NOD-mottakermusene. Tilsetning av det chimere sIL-6R/IL-6-protein var nød-vendig for at innpoding skulle observeres i signifikant nivå. I en konsentrasjon av 100 ng/ml var sIL-6R/IL-6-chimeren mye mer aktiv enn isolert IL-6 (50-200 ng/ml) og sIL-6R (125-1250 ng/ml) (figur 7). Nødvendigheten av nærvær av sIL-6R/rL-6-chimeren tyder på at dette protein er essensielt for overlevelse og proliferasjon av de uforpliktede, pluripotente hematopoietiske stamcellene som kan styre mot og repopulere benmargs-miljøet, noe som tyder på at dette protein kan være anvendbart i kliniske fremgangsmåter for benmargstransplantasjon.

Dette er den første demonstrasjon av at sEL-6R/IL-6-chimeren har minst de to påfølgen-de, nyfunnede aktiviteter: (i) Ved tilsetning sammen med både SCF- og Flt3-ligand til humane hematopoietiske, primitive forløperceller fremmer proteinet disses overlevelse og proliferasjon, og (ii) proteiner er aktivt (og tilsynelatende essensielt) i en in vivo-modell med human benmargstransplantasjon i immundefisiente mus.

Eksempel 5: sIL- 6R/ IL- 6- chimeren har aktivitet på svært rensede primitive hematopoietiske stamceller

Mononukleære celler fra blod fra human navlesnor ble behandlet for fraksjonering av mononukleære celler med lav tetthet (NMC) på Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, Upp-sala, Sverige), fulgt av et mini MACS-sett (Miltney Biotec, Bergisch Gladbach, Tysk-land) for fremstilling av en 80% ren populasjon av CD34<+->celler. Disse celler ble så passert over immobilisert monoklonalt anti-CD38-antistoff og sortert ved fluorescensak-tivert cellesortering, og CD34<+>CD38"-populasjonen som tilsvarer tilnærmet 0,1% av de opprinnelige celler ble gjenvunnet. Disse rensede stamceller (20000 celler) ble plassert i suspensjonskulturer i 0,5 ml RPMI-medium, 10% fetalt kalveserum (FCS), 1% bovint serumalbumin tilsatt 50 ng/ml stamcellefaktor (SCF) og 100 ng/ml flt3-ligand (FL) begge fra R&D Systems, Minneapolis, MN). Halvparten av kulturene ble tilsatt 100 ng/ml slL-6R/IL-6-chimeren, mens de andre ble dyrket uten. Inkubasjonen var ved 37°C i 5% CO2, i 6 dager. Antall benmargsrepopulerende celler ble evaluert ved injeksjon (intrave-nøst) av alle celler fra disse in vzYrø-kulturer i subletalt bestrålte NOD-SCID-mus. Musene ble holdt i bakteriefritt miljø. Etter 6 uker ble musene avlivet og margen fra de lange kroppsben gjenvunnet. Disse benmargsceller (BM)-celler ble utsådd i halvfaste 0,9% metylcelluloseskåler med 30% FCS, 50 uM 6-merkaptoetanol, 50 ng/ml SCF, 5 ng/ml IL-3, 5 ng/ml GM-CSF, 6 u/ml erytropoietin (alle fra R&D Systems). Kulturene inneholdt også humant serum, betingelser som forhindrer vekst av musecellekolonier. Resultatene (tabell IV) tydet på at tilsetning av sIL-6R/IL-6-chimeren til suspensjonskulturene gir en 30-50 gangers økning i antall humane kolonidannende celler (CFU) gjenvunnet fra de transplanterte mus, sammenlignet med SCF og FL alene. Dette representerer en stor økning i antall SCED-repopulerende stamceller i suspensjonskulturene på dag 6, sammenlignet med dag 0.1 fravær av siL-6R/lL-6-chimere, ga SCF og FL ingen økning av antall stamceller i løpet av de 6 dagene i suspensjonskultur. DNA fra BM-cellene som ble gjenvunnet fra de transplanterte NOD/SCID-mus ble analysert ved Southern-blotting som i eksempel 4. Mengden av humant DNA som ble gjenvunnet var 10 ganger høyere dersom musene mottok cellene som var dyrket med chimere, sammenlignet med celler dyrket uten chimere.

CFU-forløpercellene fra benmarg fra NOD/SCID-mus ga, som vist i tabell IV, opphav til hematopoietiske celler fra forskjellige myeloide linjer (makrofag og granulocytt) så vel som erytroide og lymfoide linjer (f.eks. CD19<+>, CD56<+>) bare dersom de humane blodcellene hadde blitt dyrket med sIL-6R/IL-6-chimere før transplantasjonen. Ytterligere eksperimenter sammenlignet virkningen av SIL-6R/IL-6 på CD34<+>CD38<+->populasjonen fra navlesnorblod med virkningen på de svært rensede CD34<+>CD38'-stamcellene. In vifro-ekspansjonen av de svært rensede cellene ble mye kraftigere forsterket av sIL-6R/IL-6 enn ekspansjonen av de mindre rensede cellene (tabell V). Dette tyder på at de mest primitive stamcellene er det foretrukne mål for virkningen av sIL-6R/TL-6 på celleekspansjon.

In vzYro-bibeholdelse av den benmargsrepopulerende aktivitet ble målt ved å øke tiden for dyrking i suspensjonskulturer av svært rensede CD34<+>CD38"-stamceller før injeksjon i NOD/SCID-musene. Innpodingen ble evaluert ut fra mengden humant DNA i benmargen hos mottakermusene 6 uker etter intravenøs injeksjon av de dyrkede celler. Dersom slL-6R/IL-6 ble tilsatt til SCF og FL under dyrkingen ble en høy innpoding (>1% humant DNA) fortsatt observert etter 2 ukers dyrking, og innpodingen var høyere enn for de ikke-dyrkede cellene. I motsetning til dette, har eksperimenter med kulturer inneholdende SCF, FL, GM-CSF, IL-3 vist at ingen SCID-repopulerende celler er tilba-ke etter en ukes dyrking (Bhata, M., et al., J. Exp. Med. 186, 619-624,1997).

Disse resultater viser at sIL-6R/IL-6 tillater ekspansjon og opprettholdelse av humane primitive stamceller som kan innpodes i mottakerbenmarg. Stamcellene forblir aktive i en ikke-differensiert tilstand mens de deler seg. sIL-6R/lL-6-chimeren tilveiebringer et nytt middel for dyrking av hematopoietiske celler med innpodingspotensiale. Dette kan også tillate anvendelse av retrovirale vektorer for innføring i stamceller som kan innpodes i fremgangsmåter for genterapi. Inntil nå har dette ikke vært mulig med humane stamceller siden disse primitive cellene ikke kunne opprettholdes in vitro i en aktiv cel-lesyklus, noe som er nødvendig for integrasjon av retroviralt DNA. sIL-6R/IL-6-chimeren løser dette problem.

Eksempel 6: Fremstilling av IL- 6R/ IL- 6- chimere i CHO- celler

DNA fra plasmid slL-6R/rL-6 pcDNA3 som i figur 1, ble kotransfektert inn i "Chineste Hamster Ovary" (CHO)-celler, sammen med DNA fra plasmid pDHFR som beskrevet i Mory et al. (DNA 5,181-193,1986). Blant transfektantene som vokste i 50 nM me-totreksat ble klon L 12-[IL-6R/IL-6] isolert. Denne klon ble funnet å være stabil over mange passasjer, og halvkonfluente kulturer utskiller rutinemessig til dyrkningsmediet en mengde av 2,5 ng/ml av IL-6R/IL-6-chimere.

For rensing av IL-6R/TL-6-chimeren ble 3,25 liter medium fra klon L12-kulturer i 2% bovint serum konsentrert til 200 ml. Dette ble adsorbert på en 18 ml kolonne av det monoklonale anti-human slL-6R-antistoff 34.4 koblet til Affigel 10-kuler og eluert som beskrevet (Novick et al., Hybridoma, 10,137-146,1991). Et eluat med 25 mM sitronsyre ble umiddelbart nøytralisert med 1 M Hepesbuffer, pH 8,6. Proteinene ble konsentrert med en Amicon-membran med 10 kDa grenseverdi til en sluttkonsentrasjon på 1 mg/ml. Ved SDS-PAGE ble et enkelt bånd på 85 kDa som tilsvarte IL-6R/IL-6-chimeren observert. Glykosylering ble vist ved størrelsesreduksjon etter behandling med glykosidase

(Boehringer, Mannheim). Den biologiske aktivitet av IL-6R/IL-6-chimere fremstilt i

CHO ble funnet å være stabil i minst 5 måneder ved 4°C. Rutinemessig skjer lagringen ved -70°C.

Eksempel 7; Affinitet av IL- 6R/ IL- 6- chimere tii gp! 30

IL-6R/IL-6-chimere fremstilt i CHO og en blanding av human IL-6 og sIL-6R ble sammenlignet for bindingsevne til den løselige form av gpl30 (sgp 130), som er den andre kjede i reseptorsystemet for IL-6 (se bakgrunn). En 96-brønners mikrotiterplate (Nunc) ble belagt med monoklonalt anti-human gpl30-antistoff, og 50 ng/ml sgp 130 (begge fra R&D Systems, Minneapolis) ble tilsatt. Etter vask med fosfatbufret saltvann ble IL-6R/IL-6-chimeren tilsatt til forskjellige brønner i forskjellige konsentrasjoner mellom 0,1 og 50 ng/ml. I separate brønner ble rhuTL-6 (Ares-Serono, Genev) tilsatt i en konsentrasjon på 500 ng/ml sammen med human slL-6R8Val i konsentrasjoner mellom 2 og 500 ng/ml. Etter inkubering over natten ved 4°C ble et polyklonalt anti-IL-6R fra kanin (Oh et al., Cytokine, 8,401-409,1996) tilsatt, fulgt av anti-kanin-Ig fra geit kon-jugert med pepperrotperoksidase, som ble påvist ved en fargereaksjon (Sigma, St. Lou-is). Figur 8 viser et Scatchard-plot av resultatene. Affiniteten av IL-6R/IL-6-chimeren til gpl30 ble funnet å være mer enn 4 ganger høyere enn affiniteten av de to deler av molekylet tilsatt separat (6,3 x 10"nM mot 2,6 x 10"10M). Dette resultat er i tråd med og for-klarer den høyere aktivitet av chimeren, sammenlignet med kombinasjonen av IL-6 + sDL-6R, på melanomceller og hematopoietiske celler (figur 9 og eksempel 4).

Eksempel 8: IL- 6R/ IL- 6- chimeren beskytter mot hepatotoksisitet

Injeksjon av karbontetraklorid (CCU) i mus gir alvorlig levernekrose som fører til at dyrene dør (Slater, T.F. et al., Philos. Trans. R. Soc. Biol. Sei. 311,633-645,1985). Dersom mus som har en genetisk mangel på IL-6 (IL-6"<7>") gis relativt lave doser av CCI4 (2-3 ml/kg kroppsvekt) ved intraperitoneal injeksjon er dødeligheten etter 24 timer rundt 70% (figur 10). Injeksjon av IL-6R/IL-6-chimere fremstilt i CHO en time før CCU og igjen 4 timer etter CCU beskytter dyrene og ingen dødsfall observeres etter 24 timer. I motsetning til dette har fritt rhulL-6 injisert på samme måte ingen virkning (figur 10). IL-6R/IL-6-chimeren var effektiv ved doser på 2-3 ug pr. injeksjon, som molart sett er 10 ganger lavere enn dosen av IL-6, som ikke var effektiv. Ved høyere doser av CCU (f.eks. 3,5 ml/kg i figur 10), beskyttet chimeren også, siden dødeligheten var lavere enn med IL-6 eller uten cytokin. Forskjellen i dødelighet mellom mus behandlet med chimere og ubehandlede mus som begge ble gitt den samme CCU-belastning var signifikant ved p<0,01. Histologisk undersøkelse av leversnitt farget med hematoksillin-eosin bekreftet av CCU ga levervevsnekrose og at IL-6R/IL-6-chimere beskyttet hepatocyttene mot denne kjemiske toksiske virkning (ikke vist).

En anvendelse av rL-6R/IL-6-chimeren kan være for beskyttelse av levervev hos pasienter med nekrotiske sykdommer grunnet kjemikalier (f.eks. alkohol, paracetamol) eller andre årsaker (f.eks. viral hepatitt).

Eksempel 9: Konstruksjon og aktivitet av IL- 6/ sIL- 6R8Val- chimere Et chimert molekyl i hvilket DL-6-delen ligger i aminoenden mens sEL-6R-delen ligger i karboksylenden ble konstruert. Plasmid pBS-sIL-6R8Val ble kuttet i Sau3a (bp 1086) og i Hindni-setet som følger etter stoppkodonet etter Val-356 (se eksempel 1). En linker som inneholdt tre restriksjonsseter: Spel, Smal og BamHI, ble syntetisert som følger:

Spel Smal BamHI

Dette Sau3a-setet i sEL-6R ble ligert til BamHI i linkeren og klonet inn i det multiple kloningssetet i et Bluescript pBS SK-plasmid. IL-6-sekvensen ble amplifisert ved PCR fra pKKB2-7-DNA med følgende primere (initieringskodonet er understreket):

Spel

Forover: 5' GA CTA GTA GCT ATG AAC TCC TTC TC (SEKV.ID. NR.: 3)

Haem

PCR-produktet kuttet med Spel og HaeDI ble innsatt mellom Spel-setet og Smal-setet i linkeren ovenfor. En annen linker, BamHI-NcoI med et internt Saml-sete ble syntetisert som følger:

Smal

Denne ble klonet mellom BamHI-setet i den tidligere benyttede linker og Ncol 1464 i IL-6R-sekvensen. Et fragment av IL-6R fra Smal 867 til Ncol 1464 ble så innført mellom Smal-setet i den andre linker og Ncol i IL-6R. Det resulterende chimere DNA ble sekvensert og reklonet i pCDNA3 for ekspresjon i humane HEK 293-celler. Aminosyresekvensen til denne IL-6-IL-6R-chimere 3e er vist i figur 11 (linkeren er understreket). Chimere 3e ble renset ved affinitetskromatografi på et monoklonalt anti-IL-6-antistoff (som i Novick et al., Hybridoma 8, 561-567,1989). Ved SDS-PAGE ble et bånd på 75 kDa observert.

Den biologiske aktivitet av IL-6-IL-6R-chimere 3e for inhibering av vekst av Fl0.9-melanomcellene er vist i figur 12. Den er åpenbart aktiv sammenlignet med IL-6R/IL-6-chimeren (preparat 1-3) i samme eksperiment, selv om mer er påkrevet for 50% vekstinhibering.

To mutanter av EL-6R/IL-6 ble fremstilt, i hvilke aminosyrene His-280 og Asp-281 i IL-6R-delen av IL-6R/IL-6 (figur 3) ble endret til Ser hhv. Val ved PCR-mutagenese (mutant 39 eller HD), eller hvor Asn-230 i tillegg ble endret til Asp (mutant NHD). Som figur 12 viser, hadde disse to mutanter nesten ingen aktivitet sammenlignet med EL-6R/IL-6- og IL-6R-IL-6R-chimerene. Siden disse aminosyrer i IL-6R interagerer med gpl30, vist ved molekylær modellering (Halimi et al., 1995), viser dette at sIL-6R/IL-6-chimeren har bevart dette essensielle interaksjonssetet. IL-6-rL-6R-chimere 3e mangler det immunoglobulinlignende domenet i 1L-6R som foreligger i IL-6R/IL-6. Imidlertid, reduserte fjerning av dette Ig-domenet fra IL-6R/IL-6 ikke proteinets biologiske aktivitet på F10.9-celler. Binding av IL-6-IL-6R-chimere 3e til gp 130 var tilnærmet 30% av bindingen av en annen IL-6R/IL-6-chimere (ikke vist). Denne lavere binding er i tråd med den lavere aktivitet på melanomcellevekst.

Disse resultater viser at blokkering av karboksyenden av IL-6 ved fusjon via en linker til sIL-6R bevarer god biologisk aktivitet i slike nye chimerer.

Referanser

Chen, L., Mory, Y., Zilberstein, A. og Revel M. Growth inhibition of human breast carcinoma and leukemia/lymphoma cell lines by recombinant interferon-beta 2/TL-6. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85:8037-8041,1988.

Chernajovsky, Y., Mory, Y., Chen, L., Marks, Z., Novick, D., Rubinstein, M. og Revel, M. Efficient constitutive production of human fibroblast interferon by hamster cells transformed with the IFN-B1 gene fused to an SV40 early promoter. DNA, 3:297-308, 1984.

Fischer, M., Godschmitt, J., Peschel, C, Brakenhoff, JPG., Kallen, K-J., Wollmer, A., Grotzinger, J. og Rose-John, S. A bioactive designer cytokine for human hematopoietic progenitor cell expansion. Nature Biotechnology 15:142-145,1997.

Ganapathi, MK., Weizer, AK., Borsellino, S., Bukowski, RM., Ganapathi, S., Rice, T., Casey, G. og Kawamura, K. Resistance to lnterleukin-6 in human Non-small cell lung carcinoma cell lines: Role of receptor components. Cell Growth and Defferentiation, 7: 923-929,1996.

Halimi, H., Eisenstein, M., Oh, J., Revel, M. og Chebath, J. Epitope peptides from interleukin-6 receptor which inhibit the growth of human myeloma cells. Eur. Cytokine Netw., 6:135-143,1995.

Hirano, T., Yasukawa, K., Harada, H., Taga, T., Watanabe, Y., Matsuda, T., Kashimura, S., Nakajima, K., Koyama, K., Iwamatsu, K., Tsunasawa, S., Sakiyama, F., Matsui, H., Takahara, Y., Taniguchi, T. og Kishimoto, T. Complementary DNA for a novel interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulins. Nature, 234: 73-76,1986.

Hirano, T., Matsuda, T. og Nakajima, K. Signal transduction through gpl30 that is sha-red among the receptors for the interleukin 6 related cytokine subfamily. Stem cells, 12:262-277,1994.

Holloway, CJ. Applications of recombinant DNA technology in the production of gly-cosylated recombinant human granulocyte colony stimulating factor. Eur. J. Cancer, 30:S2-6,1994.

Kahn, MA. og De Vellis, J. Regulation of an oligodendrocyte progenitor cell line by the interleukin-6 family of cytokines. Glia, 12:87-98,1994.

Katz., A., Shulman, LM., Porgador, A., Revel, M., Feldman, M. og Eisenbach. L. Abro-gation of B16 melanoma metastases by long-term low-dose Interleukin-6 therapy. J. Immunother. 13:98-109,1993.

Mackiewicz, A., Wiznerowicz, M. Roeb, E., Nowak, J., Pawlowski, T., Baumann, H., Heinrich, P. og Rose-John, S. lnterleukcin-6-type cytokines and their receptors for gene therapy of melanoma. Ann. New York Acad. Sei., 762:362-374,1995.

McKenna, HJ., de Vries, P., Brasel, K., Lyman, SD. og Williams, DE. Effect of flt3 ligand on the ex vivo expansion of human CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood 86:3413-3420,1995.

Murakami, M., Hibi, M., Nakagawa, N., Nagakawa, T., Yasukawa, K., Yamanishi, K., Taga, T. og Kishimoto, T. IL-6 induced homodimerization of gpl30 and associated ac-tivation of a tyrosine kinase. Science, 260:1808-1810,1993.

Novick, D., Englemann, H., Wallach, D., Leitner, O., Revel, M. og Rubinstein, M. Purification of soluble cytokine receptors from normal urine by ligand-affinity and immu-noaffinity chromatography. J. Chromatogr., 510:331-337,1990.

Novick, D., Engelmann, H., Revel, M., Leitner, O. og Rubinstein, M. Monoclonal antibodies to the soluble IL-6 receptor: affinity purification, ELISA and inhibition of ligand binding. Hybridoma, 10:137-146,1991.

Novick, D., Shulman, LM., Chen. L. og Revel, M. Enhancement of interleukin-6 cy-tostatic effect on human breast carcinoma cells by soluble IL-6 receptor from urine and reversion by monoclonal antibodies. Cytokine, 4:6-11,1992.

Oh, J-W., Revel, M. og Chebath, J. A soluble interleukin-6 receptor isolated from con-ditioned medium of human breast cancer cells in encoded by a differentially spliced mRNA. Cytokine, 8:401-409,1996.

Oh, J-W. Expression of recombinant soluble human interleukin-6 receptors and analysis of their functions. Ph.D.-avhandling Weizmann Institute of Science (Revel, M., veile-der), 1997.

Paonessa, G., Graziani, R., DeSerio, A., Savino, R., Ciapponi, L., Lahmm, A., Salvati, AL., Toniatti, C. og Ciliberto, G. Two distinct and independent sites on DL-6 trigger gpl30 dimer formation and signalling. EMBO J., 14:1942-1951,1995.

Revel, M. Host defense against infections and inflammations: Role of the multifunc-tional IL-6/IFN-82 cytokine. Experientia 45:549-557,1989.

Sambrook, J., Fritsch, EF. og Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Press, 1989.

Sui, X., Tsuji, K., Tanaka, R., Tajima, S., Muraoka, K., Ebihara, Y., Dcebuchi, K., Yasukawa, K., Taga, T., Kishimoto, T. og Nakahata, T. Gpl30 and c-kit signalings syner-gize for ex vivo expansion of human primitive hemopoietic progenitor cells. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92:2859-2863,1995.

Taga, T., Hibi, M., Hirata, Y., Yamasaki, K., Yasukawa, K., Matsuda, T., Hirano, T. og Kishimoto, T. Interleukin-6 triggers the association of its receptor with a possible signal transducer gpl30. Cell, 58:573-581,1989.

Vormoor, J., Lapidot, T., Pflumio, F., Risdon, G., Patterson, B., Broxmeyer, HE. og Dick, JE. SCID mice as an in vivo model of human cord blood hematopoiesis. Blood cells 20:316-320,1994.

Ward, LD., Howlett, GJ., Discolo, G., Yasukawa, K., Hammacher, A., Moritz, RL. og Simpson, PJ. High affhity interleukin-6 receptor is a hexameric complex consisting of two molecules each of interleukin-6, interleukin-6 receptor and gpl30. J. Biol. Chem., 269:23286-23289,1994.

Yamasaki, K., Taga, T., Hirata, Y., Yawata, H., Kawanishi, Y., Seed, B., Taniguchi, T., Hirano, T. og Kishimoto, T. Cloning and expression of the human Interleukin-6 (BSF-2/Interferonbeta-2) receptor. Science, 241:825-828,1988.

Zilberstein, A., Ruggieri, R., Korn, HJ. og Revel, M. Structure and expression of cDNA and genes for human interferin-beta-2, a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines. EMBO J., 5:2529-2537,1986.

Claims

1. Kimært glykosylert løselig interleukin-6 reseptor (sIL-6R)-interleukin-6 (IL-6) protein (sIL-6R/IL-6) og biologisk aktive analoger av dette, karakterisert ved at det er et fusjonsproteinprodukt mellom sIL-6R og DL-6, hvor sIL-6R/IL-6 og nevnte analoger av dette bibeholder samme glykosyleringsmønster som de naturlig forekommende sekvenser når utrykt i pattedyr celler, hvori sIL-6R og IL-6 er de naturlig forekommende former eller er kjennetegnet ved de naturlig forekommende former med aminosyreaddisjoner opptil 20 aminosyrer, delesjoner opptil 30 aminosyrer og/eller substitusjoner opptil 30 aminosyrer, og hvori nevnte sIL-6R er fusjonert med IL-6 direkte eller via et peptid linker molekyl som er et tripeptid med sekvensen E-F-M (Glu-Phe-Met) eller et 13 aminosyre peptid med sekvensen E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M(Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met).

2. Kimært sIL-6R/lL-6-protein ifølge krav 1, karakterisert ved at det er det heri betegnede sIL-6R8Val/IL-6 med en tripeptidlinker med sekvensen E-F-M mellom den C-terminale Val-356 i sEL-6R og den N-terminale Pro-29 i IL-6, hvor det kimære protein har sekvensen beskrevet i figur 3.

3. Kimært sIL-6R/lL-6-protein ifølge krav 1, karakterisert v e d at det er det heri betegnede sEL-6R8Val/IL-6 med en 13 aminosyrers peptidlinker med sekvensen E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M mellom den C-terminale Val-356 i sIL-6R og den N-terminale Pro-29 i IL-6, hvor det kimære protein har sekvensen beskrevet i figur 3 hvori tripeptidet med sekvensen E-F-M mellom posisjonene 357-359 i figur 3 er erstattet med denne peptidsekvens på 13 aminosyrer.

4. Kimært sIL-6R/IL-6-protein ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at proteinet er fremstilt in vitro i pattedyrceller i fullt prosessert form.

5. Kimært sIL-6R/IL-6-protein ifølge krav 4, karakterisert v e d at proteinet er fremstilt i humane celler.

6. Kimært sEL-6R/IL-6-protein og biologisk aktive analoger av dette ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at de kan inhibere veksten av svært maligne cancerceller.

7. Kimært srL-6R/IL-6-protein og biologisk aktive analoger av dette ifølge krav 6, karakterisert ved at de kan inhibere veksten av svært maligne melanomceller.

8. Kimært sJL-6R/IL-6-protein og biologisk aktive analoger av dette ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at de kan fremme in vivo-innpoding av humane hematopoietiske celler ved benmargstransplantasjoner.

9. Kimært slL-6R/IL-6-protein og biologisk aktive analoger av dette ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at de kan beskytte leveren mot hepatotoksiske midler.

10. DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for et kimært sIL-6R/IL-6-protein og biologisk aktive analoger av dette ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5.

11. DNA-vektor, karakterisert ved at den omfatter en DNA-sekvens som koder for et kimært slL-6R/IL-6-protein og biologisk aktive analoger av dette ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, hvor vektoren er egnet for in vitro ekspresjon av det kimære protein i pattedyrceller.

12. DNA-vektor ifølge krav 11, karakterisert ved at vektoren er egnet for ekspresjon av det kimære protein i humane celler.

13. DNA-vektor ifølge kravene 11-12, karakterisert ved at dersom vektoren uttrykkes i pattedyrceller eller humane celler har det uttrykte kimære protein en sekvens som tillater full prosessering av det kimære protein ved pattedyrcel-lene eller de humane celler, og sekresjon av det fullt prosesserte kimære protein fra cellene til dyrkningsmediet i hvilket cellene dyrkes.

14. DNA-vektor ifølge hvilket som helst av kravene 11-13, karakterisert ved at vektoren er det heri betegnede plasmid pcDNAslL-6R/IL-6 som omfatter en pcDNA3-vektor inneholdende DNA-sekvensen som koder for det kimære slL-6R/IL-6-protein under kontroll av en cytomegalovirus (CMV)-promoter.

15. DNA-vektor ifølge hvilket som helst av kravene 11-13, karakterisert ved at vektoren er det heri betegnede plasmid pcDNA slL-6R/L/IL-6 som omfatter en pcDNA3-vektor inneholdende DNA-sekvensen som koder for det kimære sIL-6R/IL-6-protein under kontroll av en cytomegalovirus (CMV)-promoter, og hvori det i DNA-sekvensen som koder for det kimære sIL-6R/rL-6-protein er innsatt en linkersekvens som koder for en peptidlinker i EcoRI-setet som ligger mellom sekvensen som koder for sIL-6R-delen og sekvensen som koder for IL-6-delen av proteinet.

16. Transformerte pattedyrceller, karakterisert ved at de inneholder en DNA-vektor ifølge hvilket som helst av kravene 11-15 som kan uttrykke den kimære sIL-6R/lL-6-sekvens som bæres av vektoren og fullt ut prosessere det uttrykte protein og utskille det i dyrkningsmediet i hvilket cellene dyrkes.

17. Transformerte celler ifølge krav 16, karakterisert ved at cellene er de heri beskrevne humane embryonale nyrecellene 293 (HEK293) transfektert med vektoren pcDNA slL-6R/lL-6, hvor cellene kan uttrykke det kimære SEL-6R/IL-6-protein, fullt ut prosessere proteinet og utskille proteinet i dyrkningsmediet i hvilke cellene dyrkes i form av et glykoprotein på tilnærmet 85 kDa.

18. Fremgangsmåte for fremstilling av et kimært protein eller biologisk aktive analoger av dette ifølge hvilket som helst av kravene 1-8, karakterisert v e d at den omfatter dyrking av transformerte celler ifølge krav 16 eller 17 under betingelser som er egnet for ekspresjon, prosessering og utskillelse av proteinet eller analogene i dyrkningsmediet i hvilket cellene dyrkes, og rensing av proteinet eller analogene fra dyrkningsmediet.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at rensingen utføres ved immunaffinitetskromatografi ved benyttelse av monoklonale antistoffer som er spesifikke for sIL-6R.

20. Anvendelse av et kimært sIL-6R/IL-6-protein eller analoger av dette som definert i hvilket som helst av kravene 1-5, salter av en av disse og blandinger av disse, for fremstilling av et medikament for bruk som en inhibitor av cancerceller.

21. Anvendelse ifølge krav 20, hvor nevnte cancerceller er svært maligne melanomceller.

22. Anvendelse av et kimært slL-6R/IL-6-protein eller analoger av dette som definert i hvilket som helst av kravene 1-5, salter av en av disse og blandinger av disse, for fremstilling av et medikament for å fremme innpoding av humane hematopoietiske celler ved benmargstransplantasj on.

23. Anvendelse av et kimært sIL-6R/IL-6-protein eller analoger av dette som definert i hvilket som helst av kravene 1-5, salter av en av disse og blandinger av disse, for fremstilling av et medikament for beskyttelse av leveren mot hepatotoksiske midler.

24. Anvendelse av et kimært sIL-6R/IL-6-protein eller analoger av dette som definert i hvilket som heslt av kravene 1-5, salter av en av disse og blandinger av disse, for fremstilling av et medikament for behandling av levertilstander eller neurologiske tilstander, eller for andre anvendelser i hvilke IL-6 eller sIL-6R benyttes.

25. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter som aktiv bestanddel et kimært slL-6R/IL-6-protein eller en analog av dette ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, og et farmasøytisk aksepterbart bærestoff, et fortynningsmiddel eller en eksipiens.

26. Farmasøytisk preparat ifølge krav 25, karakterisert v e d at det benyttes for behandling av cancere.

27. Farmasøytisk preparat ifølge krav 25, karakterisert v e d at det benyttes for fremming av benmargstransplantasjon.

28. Farmasøytisk preparat ifølge krav 25, karakterisert v e d at det benyttes for behandling av leverforstyrrelser eller neurologiske forstyrrelser, eller for forhøyet hematopoiese eller for andre anvendelser i hvilke IL-6 eller sH-6R benyttes.

29. Anvendelse av et kimært sIL-6R/IL-6-protein eller en analog av dette ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av cancere i pattedyr, for fremming av benmargstransplantasjoner, for behandling av leverforstyrrelser eller neurologiske forstyrrelser, for å øke hematopoiese eller for andre anvendelser i hvilke IL-6 eller slL-6R benyttes.