JP4402288B2 - キメラのインターロイキン−６可溶性受容体／リガンドタンパク質、その類似体およびその使用 - Google Patents
キメラのインターロイキン−６可溶性受容体／リガンドタンパク質、その類似体およびその使用 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、一般的には、可溶性インターロイキン−6受容体（sIL-6R）のアゴニスト作用に依存するインターロイキン−6（IL-6）の生物学的活性の分野である。より詳細には、本発明は、本質的には天然に存在する形態のsIL-RおよびIL-6の融合から構築される新規キメラのsIL-6R/IL-6タンパク質、およびその生物学的に活性な類似体に関する。そのようなキメラタンパク質および類似体は、がん性細胞の増殖を阻害することによるがんの治療に、骨髄移植の強化に、肝臓障害の治療およびIL-6関連症状の治療に特に有用である。
【０００２】
［発明の背景および先行技術］
インターロイキン−6（IL-6）はよく知られているサイトカインであり、その生物学的活性は、一方はIL-6受容体（IL-6Rまたはgp80）と呼ばれ、もう一方はgp130と呼ばれる2つの異なるタンパク質からなる膜受容体システムによって媒介されている（ヒラノら（Hirano et al）による総説、1994年）。gp80の細胞外ドメインに対応する可溶形態のIL-6R（sIL-6R）は、血液および尿において糖タンパク質として見出されるヒト身体の天然産物である（ノビックら（Novick et al）、1990年、1992年）。sIL-6R分子の優れた性質は、sIL-6Rが、ヒト細胞を含む多くの細胞タイプでIL-6の強力なアゴニストとして作用することである（タガら（Taga et al）、1989年；ノビックら（Novick et al）、1992年）。これは、gp80の細胞質内ドメインがない場合でも、sIL-6Rは、依然として、IL-6に応答してgp130の二量化を誘発させることができ、次いで、その後のIL-6特異的なシグナル伝達および生物学的作用を媒介するという事実によるものである（ムラカミら（Murakami et al）、1993年）。活性なIL-6受容体複合体は、実際には、2個のgp130鎖、2個のIL-6Rおよび2個のIL-6リガンドによって形成される六量体構造であり（ワードら（Ward et al）、1994年；パオネッサら（Paonessa et al）、1995年）sIL-6Rはgp130と2通りの相互作用を有し、その相互作用はともに、IL-6に特異的な生物学的活性に必須である（ハリミら（Halimi et al）、1995年）。
【０００３】
sIL-6Rを用いた治療により、IL-6の生物学的活性が多くの細胞タイプにおいて増強される。その一例は、sIL-6Rを加えた場合に、その増殖がIL-6によって大きく阻害される腫瘍細胞である：例えば、マウス骨髄球性白血病性Ｍ1細胞（タガら（Taga et al）、1989年）、ヒト乳がんT47D細胞（ノビックら（Novick et al）、1992年）またはヒトの非小細胞肺がん細胞（ガナパシら（Ganapathi et al）、1996年）など。IL-6は、インビボで抗転移活性を有し（カッツら（Katz et al）、1995年）、sIL-6Rはまた、IL-6のそのようなインビボでの抗腫瘍作用を増強することができる（マッキーヴィクズら（Mackiewicz et al）、1995年）。sIL-6Rの添加により増強されるIL-6の別の活性は、造血幹細胞を刺激して多系統のコロニーを産生することである（スイら（Sui et al）、1995年）。本発明者らはまた、脳の稀突起膠細胞の初代培養物の生存がsIL-6RおよびIL-6の組合せによって維持されること（オー（Oh）、1997年）を見出したが、IL-6単独では、そのような培養物において乏しい活性である（カーン（Kahn）および（デ ベリス（De Vellis）、1994年）。この発見は、IL-6は、sIL-6Rと組み合わせたときに、gp130を介して同様に作用する毛様体神経栄養因子（CNTF）または白血病阻害因子（LIF）などの他の神経栄養性サイトカインの活性を模倣し得ることを示しており、これは、IL-11およびオンコスタチンＭの場合にも見られる（ヒラノら（Hirano et al）、1994年）。
【０００４】
IL-6およびsIL-6Rの上記の機能を組合せ得る分子を得ようとする試みにおいて、グリシン−リッチリンカーによって連結されたヒトIL-6R配列の短縮セグメントとIL-6との融合タンパク質の組換え酵母細胞における産生が最近報告された（フィッシャーら（Fischer et al）、1997年）。この融合タンパク質は、本質的には、IL-6Rのサイトカイン受容体Nドメインおよびサイトカイン受容体Cドメインのみを含み、従って、本質的には、IL-6Rの免疫グロブリン（Ig）様ドメイン、および受容体前膜領域（Cドメインと膜貫通ドメインとの間の領域）を欠いている。このように、この融合タンパク質は、sIL-6Rの短縮型形態であり、この融合タンパク質におけるこの短縮型のsIL-6Rは、上記のグリシン−リッチリンカーを介して、本質的に完全な成熟型形態のIL-6に連結されている。天然のsIL-6Rの欠失部に加えて、酵母細胞により産生されることによるこの融合タンパク質は、哺乳類細胞、特に、例えば、ヒト細胞において産生された場合にそのような融合タンパク質が有するグリコシル化パターンを有していない。実際、酵母によって産生されたこの融合タンパク質は、約57kDaのみの分子量を有し、これに対して、本質的にすべての天然のsIL-6RおよびIL-6のアミノ酸残基を含有し、哺乳類（例えば、ヒト）細胞において完全にグルコシル化された融合産物は、約85kDaの推定分子量を有する（本明細書中下記の実施例2を参照のこと）。
【０００５】
ヒト患者を治療するために使用され得る組換えタンパク質の開発における一般的な実験により、抗体および非天然の組換え産物で認められる他の副作用の誘発を避けるために、それらがヒト身体で見出されるような天然の形態のタンパク質にできる限り近づけることが重要であることが示されてきた。このために、組換え哺乳類物細胞システムを使用して、天然のヒト産物にできる限り類似したキメラ形態で、インターフェロン−βまたは顆粒球コロニー刺激因子（チェルナジョブスキーら（Chernajovsky et al）、1984年；ホロウェイ（Holloway）、1994年）などのグリコシル化タンパク質を産生することは有利である。例えば、適切にグリコシル化されない酵母などの細菌または微生物はまた、タンパク質鎖の誤った折り畳みをもたらし、免疫反応を導く。このことは、N−グリコシル化およびO−グリコシル化ならびにリン酸化による著しい翻訳後修飾を受けるIL-6（総説、リーベルら（Revel et al）、1989年）に関して、ならびにヒトの血液および尿から得られた糖タンパク質であり、そのN端およびC端のアミノ酸が一定しており、決定された天然のsIL-6R（ノビックら（Novick et al）、1990年および本発明者らによる共有特許の米国特許第5,216,128号明細書およびその対応ヨーロッパ特許出願公開第EP413908B1号公報）に関して特に重要である。
【０００６】
従って、sIL-6Rの一部とIL-6との間の上記の融合産物は、特にヒトを治療するためにそれを使用することに関して多数の欠点が生じ得ると考えられる。これは、sIL-6Rの一部を欠いているという事実、ならびにタンパク質を正しくグリコシル化し得ない酵母における産生のためである。
【０００７】
これまで、ヒト体液において見出される天然のsIL-6Rと天然のIL-6からなり、ヒトまたは他の哺乳類細胞で産生される融合分子は報告されていない。
【０００８】
従って、本発明の目的は、天然のsIL-6Rおよび天然のIL-6（任意の順序で）からなり、哺乳類細胞で産生されるような融合分子を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、そのような融合タンパク質（sIL-6R/IL-6キメラ）を使用して、非常に低い濃度でIL-6またはsIL-6R単独に対して抵抗性である転移性の大きなメラノーマ細胞の増殖を阻害することである。
【００１０】
さらに別の目的は、骨髄移植プロトコルにおけるヒト造血幹細胞のインビボでの移植のためにそのような融合タンパク質（sIL-6R/IL-6キメラ）を使用することである。
【００１１】
本発明のなおさらなる目的は、他のIL-6関連障害、例えば、肝症状または神経学的症状においてそのような融合タンパク質を使用することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、がんの治療、骨髄移植術における使用、および他のIL-6関連障害、例えば、肝症状および神経学的症状のための、上記の天然sIL-6R-天然IL-6融合タンパク質（sIL-6R/IL-6キメラ）を含有する医薬組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的および態様は、本発明の下記の開示に示され、あるいは本発明の下記の開示から明らかである。
【００１４】
［発明の要旨］
本発明により、それぞれがヒトの体液から得られた天然に存在するsIL-6Rの本質的にすべて、ならびに天然に存在するヒトIL-6の成熟形態の本質的にすべてからなり、それぞれが、長さが3アミノ酸残基もの短さであり得るか、またはそれよりも長い、例えば、長さが13アミノ酸残基の短いリンカーペプチドによって連結されてなる多数の融合タンパク質（キメラ）が産生される（下記ならびに実施例1および2を参照のこと）。しかし、このような融合タンパク質においては、リンカーペプチドを省略することができ、sIL-6R部分をIL-6部分に直接連結することができることに留意しなければならない。非天然性アミノ酸配列を示すリンカーは、患者において抗体を誘発する免疫原性エピトープであり得るので、所望の生物学的活性を有する直接融合したsIL-6R/IL-6キメラであることが好ましく、その一方で、同時に、そのようなキメラ体が投与されたときに、このような混在的に有害な抗体の形成を誘導する危険性が最小限度化される。
【００１５】
天然に存在する分子において見出されるようなIg様ドメインを含む完全なsIL-6R配列の保存、ならびに上記のキメラ体がヒト細胞または哺乳類細胞において産生されたときにそのような細胞によって導入される正しいグリコシル化および他の翻訳後修飾もまた、キメラタンパク質産物の免疫原性の可能性を低下させるために重要である。
【００１６】
しかし、約3個のアミノ酸の非常に短いリンカーを、キメラタンパク質のsIL-6R部分とIL-6部分の接続点で使用することができる。そのような短いリンカーは免疫原性エピトープではない。当然、2つの部分を分離するために約30個までのアミノ酸のより長いリンカーを使用することもまた可能であるが、この場合、注意しなければならず、生物学的効能および安全性の実験を行って、そのようなリンカーを有するキメラ分子が免疫原性でないことを保証しなければならない。
【００１７】
実際、驚くべきことに、本発明により、より長いそのようなリンカーは、キメラタンパク質の活性に必須でないことが明らかにされた。このことは、特に、sIL-6RおよびIL-6部分の天然に存在する本質的にすべての配列がキメラ分子に取り込まれたとき、該キメラの正しい折り畳みには、より長いリンカーは必要でないことを示している（きわめて短い（3アミノ酸）リンカーを有するsIL-6R/IL-6キメラと30アミノ酸の長いリンカーを有する類似のキメラとの比較にも関連する実施例3および図5を参照のこと）。
【００１８】
これらの融合タンパク質、すなわち、sIL-6R/IL-6キメラは、本発明により、哺乳類細胞発現システムにおいて効率よく産生され、IL-6またはsIL-6R単独に対して通常は非応答性の腫瘍細胞に対して強力な活性を有し、ヒトの骨髄が移植された細胞の移植の成功を確実にすることにおいて非常に効果的であったグルコシル化産物が得られる（下記および実施例1〜4を参照のこと）。実際、そのような骨髄移植において、sIL-6R/IL-6キメラは、移植された非拘束の多分化能性造血幹細胞の生存および増殖に必須であった。さらに、本明細書中下記に示す実験結果から、そして他の分析からも、理解されるように、本発明のsIL-6R/IL-6キメラタンパク質の様々な類似体を調製することができ、sIL-6R/IL-6キメラの本質的に同じ生物学的活性を有し、そのような類似体は、1個または複数のアミノ酸残基の欠失、付加、または他のアミノ酸による置換が行われたsIL-6R/IL-6キメラであり、そしてそのような類似体に対する唯一の限定は、それらが天然に存在するsIL-6RおよびIL-6配列の大部分を保持することである。例えば、天然に存在するsIL-6R配列およびIL-6配列に対するアミノ酸の付加は、約20アミノ酸までに限定されることが好ましく、好ましくは、このような付加は、sIL-6RとIL-6との接合部位にあり、すなわち、リンカー分子である。同様に、sIL-6RおよびIL-6配列からの欠失は、好ましくは、約20〜30アミノ酸までに限定され；sIL-6RおよびIL-6配列におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基による置換もまた、好ましくは、約20〜30アミノ酸までに限定される。上記の欠失、付加および置換のすべては、得られたそのような改変類似体が、天然に存在する配列から本質的に構成されるsIL-6R/IL-6キメラの生物学的活性を本質的に保持し、そして哺乳類細胞で発現されたとき、天然に存在する配列から本質的に構成されるキメラと同じグリコシル化パターンを本質的に保持する場合に本発明により許容される。
【００１９】
従って、本発明は、グリコシル化されたキメラの可溶性インターロイキン−6受容体（sIL-6R）−インターロイキン−6（IL-6）タンパク質（sIL-6R/IL-6）、およびその生物学的に活性な類似体を提供する。これらは、sIL-6Rの本質的にすべての天然に存在する形態とsIL-6の本質的にすべての天然に存在する形態との融合タンパク質産物からなる。該sIL-6R/IL-6およびその類似体は、天然に存在するsIL-6RおよびIL-6のグリコシル化と類似する様式でグリコシル化される。
【００２０】
本発明の上記キメラタンパク質の実施例には下記が含まれる：
（i）sIL-6Rがペプチドリンカー分子を介してIL-6に融合しているキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的な活性な類似体。
【００２１】
（ii）前記リンカーが約3〜4アミノ酸残基の非常に短い非免疫原性リンカーである上記（i）のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的な活性な類似体。
【００２２】
（iii）前記リンカーが配列E-F-M（Glu-Phe-Met）のトリペプチドである上記（ii）のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的な活性な類似体。
【００２３】
（iv）前記リンカーが配列E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M（Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met）（配列番号1）の13アミノ酸残基のペプチドである上記（i）のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的な活性な類似体。
【００２４】
（v）sIL-6RのＣ末端のVal-356とIL-6のN末端のPro-29との間に配列E-F-Mのトリペプチドリンカーを有し、本明細書中においてsIL-6RδVal/IL-6と呼ばれ、該キメラタンパク質は図3に示す配列を有するキメラsIL-6R/IL-6タンパク質。
【００２５】
（vi）sIL-6RのC末端のVal-356とIL-6のN末端のPro-29との間に配列E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-Mの13アミノ酸ペプチドリンカーを有し、本明細書中においてsIL-6RδVal/L/IL-6と呼ばれ、該キメラタンパク質は図3に示す配列を有し、図3の357〜359位の配列E-F-Mのトリペプチドは、前記の13アミノ酸ペプチドリンカーによって置換されるキメラsIL-6R/IL-6タンパク質。
【００２６】
（vii）哺乳類細胞において完全にプロセシングされた形態で産生されるキメラsIL-6R/IL-6タンパク質。
【００２７】
（viii）ヒト細胞において産生されるキメラsIL-6R/IL-6タンパク質。
【００２８】
（ix）CHO細胞において産生されるキメラsIL-6R/IL-6タンパク質。
【００２９】
（x）きわめて悪性のがん細胞の増殖を阻害し得ることを特徴とする上記のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的に活性な類似体。
【００３０】
（xi）きわめて悪性のメラノーマ細胞の増殖を阻害し得ることを特徴とする上記のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的に活性な類似体。
【００３１】
（xii）骨髄移植におけるヒト造血細胞のインビボでの移植を誘発し得ることを特徴とする上記のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的に活性な類似体。
【００３２】
（xiii）肝毒性因子から肝臓を保護し得ることを特徴とする前記のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的に活性な類似体。
【００３３】
本発明はまた、本発明による上記キメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的に活性な類似体をコードするDNA配列を提供する。
【００３４】
さらに、本発明はまた、上記本発明のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的に活性な類似体をコードするDNA配列からなるDNAベクターであって、哺乳類細胞における前記キメラタンパク質の発現に適するDNAベクターを提供する。
【００３５】
本発明のDNAベクターの態様には下記が含まれる：
（i）ヒト細胞における前記キメラタンパク質の発現に適するDNAベクター。
【００３６】
（ii）哺乳類またはヒト細胞において発現されるDNAベクター、発現されるキメラタンパク質は、哺乳類またはヒト細胞によるキメラタンパク質の完全なプロセシングを可能にし、細胞から前記細胞が増殖する培養培地への完全にプロセシングされたキメラタンパク質の分泌を可能にする配列を有する。
【００３７】
（iii）サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下にキメラsIL-6R/IL-6タンパク質がコードされるDNA配列を含有するpcDNA3ベクターからなり、本明細書中においてプラスミドpcDNAsIL-6R/IL-6と呼ばれる上記DNAベクター。
【００３８】
（iv）サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下にあるキメラsIL-6R/IL-6タンパク質をコードするDNA配列を含有するpcDNA3ベクターからなり、本明細書中においてプラスミドpcDNAsIL-6R/L/IL-6と呼ばれ、前記キメラsIL-6R/IL-6タンパク質をコードする前記DNA配列において、リンカーペプチドをコードするリンカー配列が、前記タンパク質のsIL-6R部をコードする配列とIL-6部をコードする配列との間に配置されたEcoRI部位に挿入されている上記DNAベクター。
【００３９】
同様に、本発明はまた、上記DNAベクターを含有する形質転換された哺乳類細胞、すなわち、上記ベクターによって担持されるsIL-6R/IL-6キメラタンパク質の配列を発現することができ、発現タンパク質の完全なプロセシングを行うことができ、そして前記細胞が増殖する培地に発現タンパク質を分泌し得る哺乳類細胞を提供する。
【００４０】
これらの形質転換細胞の態様は、pcDNAsIL-6R/IL-6ベクターでトランスフェクションされた本明細書中に記載されるヒト胚性腎臓細胞293（HEK293）である。この細胞は、sIL-6R/IL-6キメラタンパク質を発現することができ、このタンパク質を完全にプロセシングすることができ、この細胞が増殖する培地にこのタンパク質を約85kDaの糖タンパク質の形態で分泌することができる。
【００４１】
形質転換細胞の他の態様は、pcDNAsIL-6R/IL-6ベクターでトランスフェクションされた本明細書中に記載されるCHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞である。この細胞は、sIL-6R/IL-6キメラタンパク質を発現することができ、このタンパク質を完全にプロセシングすることができ、そしてこの細胞が増殖する培地にこのタンパク質を約85kDaの糖タンパク質の形態で分泌することができる。
【００４２】
本発明はまた、上記キメラタンパク質またはその生物学的に活性な類似体を産生するための方法を提供する。この方法は、上記形質転換された細胞を、前記タンパク質または類似体の発現、プロセシングおよび前記細胞が増殖する培地への分泌に適する条件下で増殖させ；前記タンパク質または類似体を、sIL-6Rに特異的なモノクローナル抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーによって前記培養培地から精製することからなる。
【００４３】
本発明のキメラタンパク質は、下記のように多くの用途がある：
（i）がん細胞の阻害剤としてのキメラsIL-6R/IL-6タンパク質または類似体、そのいずれか1つの塩、およびその混合物の使用。
【００４４】
（ii）きわめて悪性のメラノーマ細胞の阻害剤としての上記（i）の使用。
【００４５】
（iii）骨髄移植におけるヒト造血細胞の移植を誘発するための有効成分としてのキメラsIL-6R/IL-6タンパク質または類似体、そのいずれか1つの塩、およびその混合物の使用。
【００４６】
（iv）造血の増大、肝症状および神経学的症状の治療、またはIL-6もしくはIL-6Rが使用される他の適用のための有効成分としてのキメラsIL-6R/IL-6タンパク質または類似体、そのいずれか1つの塩、およびその混合物の使用。
【００４７】
同様に、本発明のキメラタンパク質は、多数の医学的適用症のための医薬、すなわちキメラsIL-6R/IL-6タンパク質または類似体、そのいずれか1つの塩、およびその混合物を調製するために使用でき、がん細胞を阻害することによってがんを治療処置するための医薬の調製において、または骨髄移植におけるヒト造血細胞の移植を誘発させることによって骨髄移植を強化するための医薬の調製において、または造血を増大させるための医薬の調製において、または神経学的障害を治療するための医薬の調製において、またはIL-6もしくはsIL-6Rが使用される他の適用のための医薬の調製において使用される。
【００４８】
さらに、本発明はまた、有効成分として上記キメラsIL-6R/IL-6タンパク質またはその類似体、および薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤からなる医薬組成物を提供する。
【００４９】
本発明のこの医薬組成物の態様には下記が含まれる：
（i）哺乳類のがんを治療するための医薬組成物。
【００５０】
（ii）骨髄移植を強化させるための医薬組成物。
【００５１】
（iii）肝臓および神経学的障害を治療するため、または造血を増大させるため、またはIL-6もしくはsIL-6Rが使用される他の適用のための医薬組成物。
【００５２】
本発明はまた、哺乳類のがんを治療するため、または骨髄移植を増強させるため、または肝臓および神経障害を治療するため、または造血を増大するため、またはIL-6もしくはsIL-6Rが使用される他の適用のための方法を提供する。この方法は、患者に、上記の医薬組成物を、適切な投薬形態で、適切な投与経路によって投与することからなる。
【００５３】
曖昧さを避けるために、本発明は、任意の順序のIL-6とsIL-6Rとのキメラに関する。すなわち、N端およびＣ端部分は逆にすることができ、従って、そのキメラは、IL-6-sIL-6Rタンパク質である。しかし、キメラ体は、本明細書中においては、一貫してsIL-6R/IL-6タンパク質として示される。
【００５４】
本発明の他の側面および態様は、本発明の下記の詳細な開示から説明されるか、またはあるいは本発明の下記の詳細な開示から直接的に現われる。
【００５５】
本発明は、キメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的に活性な類似体に関する。これらは、sIL-6Rの本質的にすべての天然に存在する形態およびIL-6の本質的にすべての天然に存在する形態が一緒に融合し、そしてその融合部位は、リンカーペプチド（3個もの短いアミノ酸）によるものであってもよく、そしてそのようなキメラsIL-6R/IL-6タンパク質または類似体は、天然に存在するsIL-6RおよびIL-6のグルコシル化量およびグリコシル化パターンと類似するグルコシル化量およびグリコシル化パターンを有する。哺乳類細胞、特にヒト細胞（下記の実施例1〜4を参照のこと）またはCHO細胞（下記の実施例6を参照のこと）において、本発明により産生されるそのようなキメラsIL-6R/IL-6タンパク質は、そのような細胞で効率的に発現され、高度にグルコシル化され、IL-6またはsIL-6R単独に対して全く応答性を示さない腫瘍細胞に対して強力な活性を有することが見出された。
【００５６】
より詳細には、本発明により、本発明の上記のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質は、非融合のsIL-6RおよびIL-6の混合物が使用されるときに必要とされるよりも低い濃度でF10.9メラノーマ細胞などのきわめて悪性の哺乳類細胞の増殖を停止させることが認められた（下記の実施例1〜3を参照のこと）。そのようなF10.9メラノーマ細胞が、IL-6単独またはsIL-6R単独で個々に処置されたときに正常に増殖し続け、非融合のIL-6およびsIL-6Rの組合せの比較的高い用量に曝したときにだけ増殖が停止されるという事実を考慮すれば、これは、特に有意義な結果である。従って、本発明のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質は、驚くべきことに、その別々の部分の混合物、すなわち、非融合のIL-6およびsIL-6Rの混合物よりも、これらのきわめて悪性のメラノーマ細胞の強力な阻害剤である。従って、本発明のキメラタンパク質は、様々な種類のがんを治療するための有効成分として特に有用である。
【００５７】
キメラsIL-6R/IL-6タンパク質のより高い活性は、gp130に対するその親和性が、非融合のIL-6およびsIL-6Rの混合物の親和性よりも高いことによって説明される（実施例7）。
【００５８】
さらに、本発明のキメラsIL-6R/IL-6分子は、骨髄移植を強化するために特に有用であることもまた本発明により見出された（下記の実施例4を参照のこと）。実際、ヒト骨髄細胞を重症複合免疫不全（SCID）マウスに移植するために知られているプロトコルにおいて、幹細胞因子（SCF）およびFlt-3リガンドが、レシピエントの骨髄への長期間の移植を可能にする最も原始的な多分化性造血幹細胞の生存および増殖を可能にするために使用されるが、そのようなプロトコルを使用して、これらの2つの因子、SCFおよびFlt3リガンドは、ヒト細胞をレシピエントマウス骨髄への移植を促進するには不十分であり、キメラsIL-6R/IL-6タンパク質をも加えられたときにだけ、移植が成功したことが見出された。この発見は、キメラタンパク質がそのような移植プロトコルにおいて必須であり得ることを示している。同じ実験において、非融合のIL-6およびsIL-6Rは、別々に加えられたとき、十分な骨髄移植を促進するには不十分であり、一緒に加えられたときには、キメラsIL-6R/IL-6タンパク質よりも活性がはるかに低かった、すなわち、100ng/mlの有効濃度で、sIL-6R/IL-6キメラタンパク質は十分な骨髄移植を促進したが、2つの別々の非融合のsIL-6RおよびIL-6は、より高い濃度（125〜1250ng/mlのsIL-6R、50〜200ng/mlのIL-6）でさえも一緒に加えられた場合、そのような移植を促進することにおいて活性ははるかに低かった。
【００５９】
本発明の上記のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質は、好ましくは、ヒト細胞において、あるいはヒト細胞がするようにタンパク質をグルコシル化することができ、そしてヒト細胞がするのと同じ翻訳後修飾を導入するハムスターCHO細胞などの任意の他の適切な哺乳類細胞発現システムにおいて産生された組換えグルコシル化sIL-6R/IL-6キメラである。重要な特徴は、そのように産生されたキメラ糖タンパク質が、短縮されることなく、非常に短いトリペプチドまたはより長いリンカーペプチドがキメラタンパク質のsIL-6RおよびIL-6部分との間に取り込まれている場合を除いて、余分な非天然のポリペプチド配列が付加されることなく、ヒト身体において見出される天然のsIL-6RおよびIL-6の親分子のようにプロセシングされ、修飾されることである。
【００６０】
本発明の上記の好ましいキメラタンパク質を調製するために、天然に存在するsIL-6RおよびIL-6の下記の特徴が考慮された。すなわち、ヒトの細胞膜に存在するIL-6Rは、シグナルペプチド、免疫グロブリン（Ig）様ドメイン、サイトカイン結合ドメイン、膜貫通領域、および細胞質ドメインからなる468アミノ酸をコードするcDNAによって産生されることが知られている（ヤマサキら（Yamasaki et al）、1988年）。可溶型形態のsIL-6Rは体液中に見出されており、これは、膜から得られた成熟のIL-6Rと同様に、Leu-20に対応するN末端（ノビックら（Novick et al）、1990年）およびIL-6Rの膜貫通領域の直前のVal-356に対応するＣ末端を有する（共有の米国特許第5,216,128号明細書およびヨーロッパ特許出願公開第413.908B1号公報を参照のこと）。このsIL-6R配列をIL-6に融合するために、EcoRI制限部位を、Val-356の後に導入した。IL-6cDNAのPro-29で始まり、Met-212で終わる成熟IL-6の配列（ジルバースラインら（Zilberstein et al）、1986年；ヒラノら（Hirano et al）、1986年）を、このEcoRI部位の後に導入した。このEcoRI部位において、キメラタンパク質で互いからのsIL-6RおよびIL-6部分の距離までの所望の長さのリンカーペプチドをも導入することができるが、必ずしもそのようなリンカーペプチドは導入されない。下記の実施例において示されているように、2つの異なるキメラタンパク質をそのような可能なキメラタンパク質の例として産生し、このEcoRI部位において、１つはトリペプチドリンカーを有し、他方は13アミノ酸残基のリンカーを有し、両方とも本質的に等しく生物学的に活性であった。
【００６１】
本発明はまた、本発明の上記のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質の類似体に関し、この類似体は、sIL-6RおよびIL-6の天然に存在する配列のみを本質的に有するキメラタンパク質と本質的に同じ生物学的活性を保持する。そのような類似体は、キメラタンパク質のsIL-6R部分およびIL-6部分において、約30個までのアミノ酸残基が欠失、付加、または他のアミノ酸により置換されているこの種の改変はキメラタンパク質類似体の生物学的活性を、キメラタンパク質自身に関して実質的に変化させず、そのような類似体のsIL-6R部分は、シグナルペプチド、Ig様ドメイン、サイトカイン受容体のNドメイン、サイトカイン受容体のCドメイン、および受容体の前膜ドメインの天然に存在する構造（プロセシング前−図3を参照のこと）を保持する。同様に、そのようなキメラタンパク質類似体は、IL-6部分の天然に存在する成熟型形態を本質的に保持しうる。様々な類似体は、互いに、そしてキメラタンパク質においてsIL-6RおよびIL-6部分を連結するリンカーペプチドの部位において（天然に存在するsIL-6RおよびIL-6配列のみを本質的に有する）基本的なキメラタンパク質分子と多くの場合異なり得る。そのようなリンカーは、長さが約30個までのアミノ酸残基であり得、そのようなリンカーは、キメラタンパク質において、sIL-6R部分およびIL-6部分を互いに隔てるのに役立つ。そのようなリンカーに関して、例えば、そのようなリンカーによって、キメラタンパク質を不活性にし得るキメラタンパク質の誤った折り畳みが生じないように、あるいはキメラタンパク質類似体が、それにより治療される患者においてその抗体を誘発する免疫原性タンパク質にし、その結果として、そのような類似体は少なくとも中長期の医薬として効果的でないことが生じないように、その配列を選択するように注意しなければならない（従って、適切な標準アッセイにおいて、そのような各類似体の生物学的試験もまた行うようにしなければならない）。
【００６２】
本発明のキメラタンパク質の上記類似体に関して、このような類似体は、本発明の基本的なキメラタンパク質の1つ以上のアミノ酸残基および約30個までのアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基によって置換され、あるいは欠失され、あるいは1つ以上のアミノ酸残基が、本発明の基本的なキメラタンパク質と比較して得られた産物の活性を著しく変化させることなく、本発明のキメラタンパク質の最初の配列（天然に存在するsIL-6R配列およびIL-6配列のみを本質的に有する配列）に付加される類似体である。そのような類似体は、既知の合成法および／または部位特異的変異誘発技術によって、あるいはそれに適する任意の他の既知の技術によって調製される。
【００６３】
任意のそのような類似体は、好ましくは、それに実質的に類似する活性を有するような基本的なsIL-6R/IL-6キメラを十分に複製し得るアミノ酸の配列を有する。従って、任意の所定の類似体が、本発明の基本的キメラタンパク質と実質的に同じ活性を有するかどうかを、下記の実施例2〜4に示す生物学的活性試験にそのような類似体を供することからなる常套な実験によって測定することができる。
【００６４】
本発明により使用され得るキメラタンパク質の類似体、またはそれをコードする核酸には、本明細書中に示される教示および指針に基づいて、過度な実験を行うことなく、当業者によって日常的に得ることができる置換ペプチドまたは置換ポリヌクレオチドとして実質的に対応する配列の有限の集合が含まれる。タンパク質化学および構造の詳しい説明に関しては、参照文献によって本明細書に組みこまれるシュルツ ジー イーら（Schulz,G.E. et al）、「タンパク質構造の原理」（Principles of Protein Structure）、スプリンガ−ベルラグ（Springer-Verlag）、ニューヨーク、1978年；およびクライトン ティー イー（Creighton,T.E.）、「タンパク質：構造と分子学的性質」（Proteins:Structure and Molecular Properties）、ダブリュ エイチ フリーマン＆株式会社（W.H.Freeman&Co.）、サンフランシスコ、1983年を参照。コドンの好みなどのヌクレオチド配列の置換の説明に関しては、オースベルら（Ausubel et al）、前出、A.1.1〜A.1.24頁；およびサムブロックら（Sambrook et al）、「分子生物学における最新プロトコル」（Current Protocols in Molecular Biology）、インターサイエンス（Interscience）、ニューヨーク、6.3および6.4頁（1987年、1992年）、補遺CおよびDを参照のこと。
【００６５】
本発明による類似体の好ましい変化は、「保存的」置換として知られているものである。天然に存在するsIL-6RおよびIL-6配列を本質的に有するキメラタンパク質における変化の保存的なアミノ酸の置換には、グループのメンバー間の置換は分子の生物学的機能を保っているという十分に類似する物理化学的特性を有するグループ内の同義のアミノ酸が含まれ得る：グランサム（Grantham）、サイエンス、185巻、862〜864頁（1974年）。アミノ酸の挿入および欠失もまた、特に、挿入または欠失に、少数のアミノ酸が、例えば、30個未満、好ましくは10個未満が含まれるだけである場合にその機能を変化させることなく上記の配列において行うことができ、そしてそのような挿入または欠失により機能的な配置に重要なアミノ酸、例えば、システイン残基が除去または脱離されないことは明らかである。アンフィンセン（Anfinsen）、「タンパク質鎖の折り畳みを支配する原理」、サイエンス、181巻、223頁〜230頁（1973年）。そのような欠失および／または挿入により産生される類似体は、本発明の範囲に含まれる。
【００６６】
好ましくは、同義のアミノ酸グループは、表Ｉに規定されるアミノ酸グループである。より好ましくは、同義のアミノ酸グループは、表IIに規定されるアミノ酸グループである。最も好ましくは、同義のアミノ酸グループは、表IIIに規定されるアミノ酸グループである。
【００６７】
【表１】
【００６８】
【表２】
【００６９】
【表３】
【００７０】
本発明において使用されるキメラタンパク質の類似体を得るために使用され得るタンパク質におけるアミノ酸置換体を製造する例には、任意の知られている方法工程が含まれる。それらは、マークら（Mark et al）の米国再発行特許第33,653号、米国特許第4,959,314号、同第4,588,585号、および同第4,737,462号；コスら（Koths et al）の米国特許第5,116,943号、ネーメンら（Namen et al）の同第4,965,195号；チョングら（Chong et al）の米国特許第4,879,111号；およびリーら（Lee et al）の米国特許第5,017,691号などに示されている。リシン置換タンパク質は、シャウら（Shaw et al）の米国特許第4,904,584号に記されている。
【００７１】
本発明の別の好ましい態様において、本発明において使用されるキメラタンパク質の任意の類似体は、本発明の上記の基本的なキメラタンパク質の配列に本質的に対応するアミノ酸配列を有する。用語「本質的に対応する」は、特に、がん細胞の増殖を阻害するか、または骨髄移植を促進させるその能力が、例えば、関係する限りにおいて、基本的なキメラタンパク質の配列に対して、その基本的な特性に影響を及ぼさない小さな変化を有する類似体を包含するものとする。「本質的に対応する」という言葉に含まれると一般に見なされる変化のタイプは、いくつかの小さな改変が生じる本発明のキメラタンパク質をコードするDNAの従来の変異誘発技術、および上記の方法において所望の活性についてスクリーニングすることから得られる。
【００７２】
本発明による類似体には、ストリンジェントな条件下でDNAまたはRNAにハイブリダイゼーションし、そしてsIL-6RおよびIL-6をコードする天然に存在する本質的にすべての配列からなる本発明によるキメラタンパク質をコードするDNAまたはRNAなどの核酸によってコードされる類似体が含まれる。例えば、そのようなハイブリダイゼーションするDNAまたはRNAは、例えば、図3に示す配列を有する本発明の同じタンパク質をコードするDNAまたはRNAであり得る。しかし、そのようなDNAまたはRNAは、そのヌクレオチド配列において、遺伝コードの縮重のために天然に由来するヌクレオチド配列と異なる：すなわち、いくらか異なるヌクレオチド配列は、この縮重のために、依然として同じアミノ酸をコードし得る。さらに、上記にも記されているように、アミノ酸変化（欠失、付加、置換）の量は、約30個までのアミノ酸に限定される。そうすることによって、変化が最大量である場合でも、本発明による類似体は、sIL-6R部分において（プロセシング前の）リーダー配列、Ig様ドメイン、サイトカイン受容体のN-およびC-ドメイン、ならびに受容体の前膜領域（C-ドメインと膜貫通ドメインとの間の領域）を本質的に保持し、そしてIL-6部分の本質的にすべてを保持する類似体である。そのような核酸は、それが本発明のキメラタンパク質の機能的活性を保持するポリペプチドをコードするかどうかを調べるための第1の候補である。用語「ストリンジェントな条件」は、当業者が従来的に「ストリンジェント」と呼ぶハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件を示す。オースベルら（Ausubel et al）、「分子生物学の最新プロトコル」（Current Protocols in Molecular Biology）、前出、インターサイエンス（Interscience）、ニューヨーク、6.3および6.4パラグラフ（1987年、1992年）；およびサムブロックら（Sambrook et al）、前出を参照のこと。限定ではないが、ストリンジェントな条件の例には、研究されたハイブリッドの計算されたTmよりも12℃〜20℃低く、例えば、2×SSCおよび0.5％SDSで5分間、2×SSCおよび0.1％SDSで15分間の洗浄条件；37℃で30分間〜60分間の0.1×SSCおよび0.5％SDS、次いで68℃で30分間〜60分間の0.1×SSCおよび0．5％SDSでの洗浄条件が含まれる。当業者は、ストリンジェントな条件はまた、DNA配列の長さ、オリゴヌクレオチドプローブの長さ（10塩基〜40塩基など）、または混合したオリゴヌクレオチドプローブに依存することを理解している。混合したプローブが使用される場合、SSCの代わりに、塩化テトラメチルアンモニウム（TMAC）を使用することが好ましい（前出のオースベル（Ausubel）を参照のこと）。
【００７３】
本明細書中の用語「塩」は、本発明のキメラタンパク質またはその類似体のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を示す。カルボキシル基の塩は、この分野で知られている手段によって形成させることができ、無機塩、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、鉄塩または亜鉛塩など、および例えば、トリエタノールアミン、アルギニンまたはリシン、ピペリジン、プロカインなどのアミンを用いて形成されるような有機塩基との塩を包含する。酸付加塩には、例えば、塩酸または硫酸などの鉱酸との塩、および例えば、酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩が含まれる。当然、任意のそのような塩は、本発明のキメラタンパク質または類似体に実質的に類似する活性を有しなければならない。
【００７４】
本発明はまた、本発明の上記のキメラタンパク質およびその類似体をコードするDNA配列、ならびに適切な哺乳類、好ましくは、ヒトの細胞における発現を行うためにそのようなDNA配列を担持するDNAベクターに関する。本発明のベクターの態様は、プラスミドpcDNAsIL-6R/IL-6であり、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下にsIL-6R/IL-6融合配列を含有するpcDNA3ベクター（インビトロゲン社（Invitrogen））からなる。
【００７５】
本発明はまた、本発明の上記のタンパク質を発現し得る形質転換された哺乳類、好ましくはヒトの細胞に関する。そのような形質転換細胞の態様は、pcDNAsIL-6R/IL-6によってトランスフェクションされ、融合sIL-6R/IL-6キメラを85kDaの糖タンパク質として分泌するヒトの胚性腎臓細胞293（HEK293、ATCC CRL1573）である。
【００７６】
さらなる態様は、プラスミドpcDNAsIL-6R/L/IL-6であり、10個のアミノ酸をさらにコードする短いリンカーのEcoRI部位での挿入によって、上記のpcDNAsIL-6R/IL-6と異なる。多数の様々な長さの異なる配列を、sIL-6RとIL-6との間の距離を最適にするために導入することができる。
【００７７】
本発明また、（図11に示されているように）IL-6部分がsIL-6Rに先行するキメラタンパク質を含む。
【００７８】
本発明はまた、本発明のキメラタンパク質またはその類似体の産生および精製を行うための方法に関し、上記の形質転換細胞を、キメラタンパク質産物の発現および培養培地へのその分泌に適する条件下で増殖させること、次いで、下記の実施例2および実施例5において記載されているように抗sIL-6Rモノクローナル抗体34.4を使用するイムノアフィニィティークロマトグラフィーによって、分泌されたタンパク質を精製することからなる。
【００７９】
本発明はまた、活性成分としてsIL-6R/IL-6キメラまたはその類似体またはその混合物またはその塩と薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤からなる医薬組成物に関する。本発明の薬学的組成物の態様には、強化されたIL-6型の作用のため、がんの治療のため、骨髄移植のため、造血の強化、特に、血小板新生のため、神経学的症状の治療のため、肝臓障害の治療のため、およびIL-6または関連サイトカインの他の適用のための医薬組成物が含まれる。
【００８０】
本発明の医薬組成物は、キメラタンパク質またはその類似体を、生理学的に許容しうる担体および／または安定化剤および／または賦形剤と混合することによって投与するために調製され、そして例えば、投薬バイアルで凍結乾燥することによる投薬形態で調製される。投与方法は、類似する薬剤の受容可能な投与様式のいずれかによって行うことができ、処置され得る症状に依存し、例えば、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所的注射または局所的適用によって、あるいは注入により連続的に行われる。投与され得る活性化合物の量は、投与経路、治療され得る疾患、および患者の状態に依存する。例えば、局所注射には、体重基準で、静脈内注入よりも少ない量のタンパク質が必要である。
【００８１】
本発明はまた、がんの治療、骨髄移植、造血、特に、血小板新生の増大、神経学的症状の治療、化学薬品（例えば、四塩化炭素、アルコール、パラセタモール）または他の原因（例えば、ウイルス、手術）による壊死性疾患の患者における肝臓組織の保護、そしてIL-6または関連サイトカインの他の適用のための本発明のキメラタンパク質またはその類似体またはその混合物の使用に関する。同様に、本発明はまた、上記の疾患を治療するための医薬、あるいは上記の適用症において使用される医薬を調製する際に使用されるキメラタンパク質またはその類似体またはその混合物に関する。
【００８２】
上記の治療方法に加えて、該キメラおよび／またはキメラタンパク質をコードするDNAによるエクスビボ手順および遺伝子治療もまた意図される。
【００８３】
本発明を、次に、下記の非限定的な実施例および添付した図面において、より詳しく説明する。
【００８４】
実施例 1 ： sIL-6R δ Val/IL-6 キメラ発現ベクターの構築
図1に、sIL-6RδVal/IL-6キメラタンパク質をコードする配列を保持する発現ベクターを構築するために採用した工程の概略のフローダイヤグラムを、様々な出発ベクターと中間ベクター、様々な試薬および反応段階を含めて示す。この構築法では、基本的に、当技術分野でよく知られている、所望の発現ベクターを構築するための技術を使った（例えばサムブルックら（Sambrook et al）（1989年）を参照されたい）。その方法は、簡単に述べると次のとおりである。
【００８５】
ヒト乳がんT47D細胞から得られるcDNAのライブラリーをラムダ（λ）gt11バクテリオファージにクローニングし、ヤマサキら（Yamasaki et al）（1988年）のIL-6R配列に由来するオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングした。全ヒトIL-6Rコード配列を持つ一つのλgt11 cDNAクローンを単離した。そのインサートをEcoRIでλgt11から切り出し、大腸菌ファージミドBlue Script pBS/SK（ストラタジーン クローニング システム社（Stratagene Cloning Systems）・カリフォルニア州ラホーヤ）のマルチプルクローニングサイト（MCS）にクローニングした。このプラスミドpBS/SK-IL-6R（図1）をEcoRIで切断し、次にそれを平滑末端化し、EcoRVで再切断することにより、IL-6RのEcoRV部位（位置1203）で終わる959塩基対（bp）のIL-6Rの5'断片を単離した。アガロースゲル電気泳動から抽出したこの断片を、MCSのEcoRVで開環した新しいpBS/SKベクターにクローニングした（図1のｐBS/SK-sIL-6R-RV）。
【００８６】
上述の、先に得たpBS/SK-IL-6R DNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）にかけて、順方向プライマー1137-1156と逆方向プライマー1505-1488の間の368bp断片を増幅した。IL-6Rのバリン-356残基はヒト尿中に排泄される天然の可溶性sIL-6Rのカルボキシ末端アミノ酸であることが既に決定されているのでノビックら（Novick et al）、1990年；オーら（Oh et al）、1996年；同所有権者の米国特許第5,216,128号および欧州特許EP413908B1）、逆方向プライマーは、このバリン残基のコドンの直後にEcoRI部位を持つように合成した（図1参照）。そのPCR産物をEcoRVとEcoRIで切断し、pBS/SK-sIL-6R-RV中、IL-6RのEcoRV部位とMCSのEcoRI部位の間に連結した（図1）。次に、MCSのHindIII部位をIL-6Rの塩基対410にあるNcoI部位と連結（どちらの部位もまず平滑末端化する）することによって、5'非翻訳配列が取り除かれるようにプラスミドpBS-sIL-6R-δVal--RIを短縮して、pBS-sIL-6R-δVal-RI-NcoIを得た（図1）。
【００８７】
IL-6配列はプラスミドpKKβ2-7から得たが、このプラスミドは、既に記述されているように（チェンら（Chen et al）、1988年）、EcoRI部位を持ち、その後ろにメチオニンコドンとIL-6のプロリン-29のコドンが続き、BstNI（EcoRII）部位で終わっている合成オリゴヌクレオチドを用いて、大腸菌発現ベクターpKK223-3（ファルマシア社（Pharmacia）・スウェーデン国ウプサラ）にBstNI切断IFN-β2/IL-6 cDNA（ジルベルステインら（Zilberstein et al）、1986年）を挿入することによって構築された。pKKβ2-7のIL-6 cDNAインサートはNlaIV部位中の終止コドンの7塩基対後ろで終わり、その11bp後ろにpKK223-3ベクターのHindIII部位が続いている（図1）。そのpKKβ2-7 DNAをHindIIIで切断し、平滑末端化し、EcoRIで再切断し、そのIL-6 cDNAを、IL-6の成熟配列（プロリン-29から始まる）がIL-6Rのバリン-356の直後に3コドン（Glu-Phe-Met）分だけ離れて融合されるように、pBS-sIL-6R-δVal-RI-NcoIに挿入した。次に、得られたプラスミドpBS/SK-sIL-6R/IL-6（図1）をそのMCSのSalI部位とNotI部位で再切断し、そのインサートをpcDNA3（インビトロゲン社（Invitrogen）・カリフォルニア州サンディエゴ）にクローニングした。得られたプラスミドpCDNA3-sIL-6R/IL-6（図1）は、強力なサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの下流にあって、sIL-6RδVal/IL-6キメラの効率のよい転写を保証するポリアデニル化部位が続いているインサートを含有する。このキメラにおけるsIL-6Rの5'末端の変換により、哺乳類細胞での発現時に、そのキメラタンパク質のN末端のシグナルペプチド機能とプロセッシングが天然sIL-6Rの場合と同じになることが保証される。
【００８８】
上に示したように、sIL-6RδVal/IL-6構築物の有利な特徴は、それが基本的にヒトの体内に存在する通りの天然のsIL-6Rと天然のIL-6の融合物であって、余分なポリペプチド配列を持たないことである。しかし、sIL-6RδVal/IL-6構築物（図1）におけるEcoRI部位の変換によって、sIL-6R部分とIL-6部分の間にリンカーポリペプチドセグメントを挿入することが容易になる。sIL-6RのVal-356とIL-6のPro-29の間に導入された13アミノ酸リンカー配列Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Metを持つそのような構築物の一つも構築した（sIL-6RδVal/L/IL-6）。
【００８９】
実施例 2 ：ヒト細胞での sIL-6R δ Val/IL-6 キメラの発現
基本的に標準的な哺乳類細胞培養法、細胞トランスフェクション法、および発現させるべく新たに導入したDNA配列の発現に関するトランスフェクト細胞の分析法を用いて（方法については、例えばサムブルックら（Sambrook et al）（1989年）を参照されたい）、上記プラスミド構築物（実施例1）をヒト細胞にトランスフェクトし、そこでのその発現を評価した。簡単に述べると、次の方法を使用した。
【００９０】
ヒトHEK293細胞（ATCC CRL1573、形質転換初代ヒト胚性腎細胞）にプラスミド構築物pCDNA3-sIL-6R/IL-6 DNA（上記実施例1に記載）をトランスフェクトした。HEK293の対数期培養物をトリプシン処理し、9cmのナンク（Nunc）製プレートに播種した（2.5×106細胞/プレート）。一日後に、10μgのpCDNA3-sIL-6R/IL-6 DNAを使ってCaPO4沈殿法（サムブルックら（Sambrook et al）、1989年）によるトランスフェクションを行ない、その1時間後に培地をDMEM-10%FCSに換え、培養をさらに16時間続けた。培地をDMEM-2%FCSに換えた後、分泌タンパク質をそれぞれ48時間にわたって2回継続して集めた。細胞片を1,000rpmで1分間の遠心分離によって除去し、その上清をポリクローナルウサギ抗sIL-6RとマウスMcAB17.6（ノビックら（Novick et al）、1991年）を用いるsIL-6R用エライザ（ELISA）によって試験した。濃度1.2μg/mlのsIL-6R相当物質が見出され、トランスフェクトされたヒト細胞におけるキメラsIL-6R/IL-6タンパク質の極めて効率のよい発現が示唆された。
【００９１】
分泌キメラタンパク質（sIL-6R/IL-6）の免疫精製を、ヒトsIL-6Rの細胞外ドメイン中のエピトープに特異的なモノクローナル抗体34.4（ノビックら（Novick et al）、1991年；ハリミら（Halimi et al）、1995年）を使って行なった。34.4ハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔で増殖させ、その腹水から硫酸アンモニウム沈殿によって免疫グロブリン（Ig）画分を得た。Affigel-10（バイオ−ラド ラブズ社（Bio-Rad Labs）・カリフォルニア州リッチモンド）を使ってMcAB34.4を固定化した（1mlのAffigel-10に15mgのIgを結合）。pCDNA3-sIL-6R/IL-6をトランスフェクトしたHEK293細胞からの分泌タンパク質を含有する上清をMcAB34.4のカラムに吸着させた（上清15mlにつきカラム0.3ml）。PBSで洗浄した後、結合したタンパク質を25mMクエン酸（pH2.5）で溶出させ、1Mヘペス緩衝液（pH8.5）で直ちに中和し、PBSに対して一晩（約8〜12時間）透析した。
【００９２】
免疫精製したタンパク質のSDS中でのポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析は、クーマシーブルーによって染色される特有のバンドを示した（図2）。そのタンパク質の分子量は、グリコシル化型のsIL-6RδVal（オーら（Oh et al）（1996年）に示されているように60kDa）とグリコシル化IL-6（ジベルステインら（Ziberstein et al）（1986年）に示されているように23〜26kDa）の融合物から予想されるとおり、85キロダルトンだった。sIL-6R/IL-6のアミノ酸配列は543アミノ酸で、その配列からシグナルペプチドのプロセッシング後に524アミノ酸または約58kDaのタンパク質が予想される（図3）。ヒト細胞中で組換えDNAから産生されるsIL-6R/IL-6キメラのサイズがこれよりはるかに大きいことは、糖鎖付加がこの分子のかなりの部分を占めることを示している。
【００９３】
実施例 3 ： sIL-6R/IL-6 キメラは転移性メラノーマ細胞の増殖を停止し、その分化を誘導する
B16メラノーマ細胞由来のF10.9クローンはC57Black/6マウスに転移性の高い腫瘍を形成し、2〜3カ月以内に肺転移でその動物を死亡させる（カッツら（Katz et al）、1995年）。F10.9細胞へのsIL-6R/IL-6キメラタンパク質の添加は、それらの細胞の著しい形態変化と、それらの増殖の停止をもたらす（図4）。このキメラで処理したF10.9細胞は細長くなり、樹状の伸長部分を突き出し、胚性メラノサイトまたは膠細胞の紡錘型（spindloid）分化に似る。
【００９４】
96ウェル-マイクロプレートのウェル中、10%FCSを含む0.2mlのRPMI1640培地に、3×103個の細胞を播種した4日後に、それらの細胞の増殖を定量した。細胞を12.5%グルタルアルデヒド中で30分間固定し、水中で洗浄し、0.1%クリスタルバイオレットで30分間染色した。十分な洗浄と乾燥の後、染色剤を10%酢酸で抽出し、その光学密度を540nmで測定した。本キメラは増殖の用量依存的阻害を引き起こし、10ng/ml程度の低い本キメラ（p85）タンパク質濃度で完全な増殖阻害を起こした（図5）。キメラタンパク質sIL-6RδVal/IL-6とsIL-6RδVal/L/IL-6（sIL-6R部分とIL-6部分の間に、より長いリンカーを持つキメラ；実施例1参照）はどちらも同様に活性だった。上記sIL-6RδVal/IL-6キメラは極めて短い3アミノ酸リンカーしか持たず、一方、上記sIL-6RδVal/L/IL-6はより長い13アミノ酸リンカーペプチドを持つが、どちらも本質的に同じ活性で転移性細胞の増殖を阻害することから、この結果は、キメラ中のsIL-6R部分とIL-6部分の間にあるリンカーペプチドが、このキメラの活性にとって必須でないことを示すことにもなる。これに対しIL-6とsIL-6RδValはどちらも単独ではこれらメラノーマ細胞の増殖を阻害しない（図6）ことから、sIL-6R/IL-6（p85）キメラタンパク質のユニークな活性が証明される。同様の効果を得るには、200〜400ng/mlのIL-6と125ng/mlのsIL-6RδValが必要である（図6）。モル濃度で計算すると、F10.9細胞の最大阻害には、7.5nMのIL-6と2nMのsIL-6RδValが必要であるのに対し、sIL-6R/IL-6キメラは0.12nMしか必要でない。
【００９５】
p85 sIL-6R/IL-6キメラタンパク質の増殖阻害活性をMcAB34.4カラムでの免疫精製中に追跡した（実施例2参照）。活性のパターンは、図2に示すSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の異なる画分に見られるp85バンドの強度と一致した。
【００９６】
実施例 4 ： sIL-6R/IL-6 キメラはヒト骨髄移植細胞の生着に不可欠である
ヒト骨髄から得られる造血幹細胞の生着は重症複合免疫不全（SCID）マウスへの移植後に調べることができる（ボーモールら（Vormoor et al）、1994年）。SCID-NODマウスに亜致死照射を行ない、尾静脈に3×105個のヒトCD34+骨髄細胞を注射した。注射に先立って、精製したCD34+細胞を様々な組み合わせのサイトカインと共に3日間液体培養中に維持した。1カ月後に、それらのマウスを屠殺し、骨を摘出して、骨髄細胞を集めた。SCID-NOD受容マウスにおけるヒト細胞の生着を、ヒトの反復DNAへのサザンブロットハイブリダイゼーションによって評価した。
【００９７】
幹細胞因子（SCF、steel因子またはckitリガンド）とFlt3リガンド（flt3/flk2チロシンキナーゼ受容体リガンド）は、受容者骨髄中で長期生着できる最も原始的な多能性造血幹細胞の生存と増殖にとって重要であることがわかっている（マックケンナら（McKenna et al）、1995年）。図7に示すように、SCID-NOD受容マウスの骨髄におけるヒト細胞の生着を促進するには、これら2つの因子だけでは不十分だった。生着が有意なレベルで検出されるためには、sIL-6R/IL-6キメラタンパク質の添加が必要だった。100ng/mlの濃度で、sIL-6R/IL-6キメラは、単離されたIL-6（50〜200ng/ml）とsIL-6R（125〜1250ng/ml）よりも、はるかに活性だった（図7）。sIL-6R/IL-6キメラを必要とすることは、このタンパク質が、骨髄環境に定着しそこで再増殖できる非拘束（non-committed）多能性造血幹細胞の生存と増殖に不可欠であることを示し、このタンパク質が骨髄移植医療に役立ちうることを示している。
【００９８】
これは、sIL-6R/IL-6キメラが、
（i）因子SCFおよびFlt3リガンドの両方と一緒にヒト造血原始前駆細胞に添加すると、それらの生存と増殖を促進し、
（ii）免疫不全マウスにおけるヒト骨髄移植のインビボモデルで活性である（また、不可欠であるらしい）
という、少なくとも2つの新たに見出された活性を持つことを初めて立証するものである。
【００９９】
実施例 5 ： sIL-6R/IL-6 キメラは高純度の原始造血幹細胞に対して活性である
ヒト臍帯血単核細胞を、フィコール-パーク（Ficoll-Paque）（ファルマシア バイオテク社（Pharmacia Biotech）・スウェーデン国ウプサラ）での低密度単核細胞（NMC）の分画にかけた後、ミニMACSキット（ミルトネイ バイオテク社（Miltney Biotec）・ドイツ連邦共和国ベルギッシュグラトバハ）を使用して、純度80％のCD34+細胞集団を調製した。次に、これらの細胞を固定化抗CD38モノクローナル抗体に通すか、蛍光標示式細胞分取法によって分取して、元の細胞の約0.1%に相当するCD34+CD38-集団を回収した。これらの精製幹細胞（20,000細胞）を、50ng/mlの幹細胞因子（SCF）と100ng/mlのflt3リガンド（FL）（共にアールアンドディー システムズ社（R&D Systems）（ミネソタ州ミネアポリス）製）を含む0.5mlのRPMI培地、10%ウシ胎仔血清（FCS）、1%ウシ血清アルブミンでの懸濁培養にした。それらの培養の半分に100ng/mlのsIL-6R/IL-6キメラを加え、その他はキメラなしで培養した。培養は5%CO2中37℃で6日間行なった。これらインビトロ培養物から得られる細胞全てを亜致死照射NOD-SCIDマウスに注射（静脈内）することによって、骨髄再増殖細胞の数を評価した。それらのマウスを無菌状態に維持した。6週間後にそれらのマウスを屠殺し、その長骨の骨髄を回収した。それらの骨髄（BM）細胞を、30%FCS、50μMβ-メルカプトエタノール、50ng/ml SCF、5ng/ml IL-3、5ng/ml GM-CSF、6単位/mlエリスロポエチン（全てアールアンドディー システムズ社（R&D Systems））を含む半流動性0.9%メチルセルロースプレートに播種した。これらの培養はヒト血清も含有した（マウスコロニーの増殖を防ぐ条件）。その結果（表IV）は、上記懸濁培養にsIL-6R/IL-6キメラを添加すると、SCFおよびFLだけの場合と比較して、被移植マウスから回収されるヒトコロニー形成細胞（CFU）の数が30〜50倍増加することを示した。これは、第6日に懸濁培養中に存在するSCID再増殖幹細胞の数が第0日と比較して著しく増加したことを表す。sIL-6R/IL-6キメラが存在しない場合、SCFとFLは、6日間の懸濁培養中に幹細胞数の増加をもたらさなかった。被移植NOD/SCIDマウスから回収されるBM細胞のDNAを実施例4と同様にサザンブロットによって分析した。キメラと共に培養した細胞をマウスに与えた場合、回収されるヒトDNAの量はキメラなしの場合と比較して10倍高かった。
【０１００】
表IVに示すようなNOD/SCIDマウスの骨髄から得られるCFU前駆細胞は、移植に先立ってヒト血球をsIL-6R/IL-6キメラと共に培養した場合にのみ、異なる骨髄系譜（マクロファージと顆粒球）ならびに赤血球系譜とリンパ系譜（例えばCD19+、CD56+）の造血細胞をもたらす。
【０１０１】
【表４】
【０１０２】
さらに、臍帯血CD34+CD38+集団に対するsIL-6R/IL-6の効果を、高純度CD34+CD38-幹細胞に対するその効果と比較する実験を行なった。高純度細胞のインビトロ増殖は、sIL-6R/IL-6によって、低純度細胞のインビトロ増殖よりも、はるかに強く増強された（表V）。これは、最も原始的な幹細胞が細胞増殖に対するsIL-6R/IL-6効果の優先的標的であることを示している。
【０１０３】
【表５】
【０１０４】
骨髄再増殖活性のインビトロでの持続性を、NOD/SCIDマウスに注射する前の高純度CD34+CD38-幹細胞の懸濁培養期間を延長することによって測定した。生着は、培養細胞を静脈内注射した6週間後の受容マウスの骨髄におけるヒトDNAの割合によって評価した。培養中にsIL-6R/IL-6をSCFとFLに加えた場合は、2週間の培養後でもなお高い生着性（＞1%ヒトDNA）が観察され、その生着性は非培養細胞の場合より高かった。これに対し、SCF、FL、GM-CSF、IL-3を含む培養物を使った実験では、1週間の培養後にはSCID再増殖細胞は残存しないことが示されている（バータ、エムら（Bhata,M. et al）、ジェイ エクス メド（J.Exp.Med.）186,619-624,1997）。
【０１０５】
これらの結果は、sIL-6R/IL-6が、受容者骨髄での生着が可能なヒト原始幹細胞の増殖と維持を可能にすることを示している。それら幹細胞は増殖しながら非分化状態で活性を保つ。sIL-6R/IL-6キメラは、生着性造血細胞を培養するための新しい手段になる。これにより、遺伝子治療のプロトコルでレトロウイルスベクターを使って生着性幹細胞に遺伝子を導入することが可能になる。今までこれはヒト幹細胞では可能でなかった。なぜなら、これらの原始細胞は、レトロウイルスDNAの組込みに必要とされるような細胞周期進行状態ではインビトロで維持することができなかったからである。sIL-6R/IL-6キメラはこの問題を解決する。
【０１０６】
実施例 6 ： CHO 細胞での IL-6R/IL-6 キメラの生産
図1に示すプラスミドsIL-6R/IL-6 pcDNA3のDNAを、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞に、モリーら（Mory et al）（DNA 5,181-193,1986）に記述されているようなプラスミドpDHFRのDNAと共に同時トランスフェクトした。50nMメトトレキセート中で増殖するトランスフェクタントのうち、クローンL12-[IL-6R/IL-6]を分離した。このクローンは継代培養を数多く繰返しても安定であることがわかり、半集密的培養物は通例、培養培地に2.5μg/ml量のIL-6R/IL-6キメラを分泌する。
【０１０７】
IL-6R/IL-6キメラを精製するために、2%ウシ血清でのクローンL12培養によって得た3.25リットルの培地を200mlに濃縮した。これを、既述のごとく（ノビックら（Novick et al）、ハイブリドーマ（Hybridoma）10,137-146,1991）、Affigel-10ビーズに結合した抗ヒトsIL-6Rモノクローナル抗体34.4の18mlカラムに吸着させ、溶出した。25mMクエン酸溶出液を1 ヘペス緩衝液（pH8.6）で直ちに中和した。それらのタンパク質を10kDaカットオフアミコン（Amicon）製メンブレンで1mg/mlの最終濃度まで濃縮した。SDS-PAGEを行なうと、IL-6R/IL-6キメラに相当する85kDaの単一バンドが観察された。糖鎖付加はグリコシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社（Boehringer-Mannheim））による処理後のサイズ減少によって証明された。CHO産生IL-6R/IL-6キメラの生物学的活性は、4℃で少なくとも5ヶ月間は安定であることがわかった。通例、保存は-70℃で行なう。
【０１０８】
実施例 7 ： gp130 に対する IL-6R/IL-6 キメラの親和力
CHO産生IL-6R/IL-6キメラと、ヒトIL-6およびヒトsIL-6Rの混合物とを、IL-6の受容体系の第二鎖である可溶型gp130（sgp130）へのそれらの結合について比較した（背景の項参照）。マイクロタイター96ウェルプレート（ナンク社（Nunc））を抗ヒトgp130モノクローナル抗体でコーティングし、50ng/mlのsgp130を加えた（どちらの試薬もアール アンド ディー システムズ社（R&D Systems）（ミネアポリス）製）。リン酸緩衝食塩水中で洗浄した後、IL-6R/IL-6キメラを異なるウェルに0.1〜50ng/mlの範囲の様々な濃度で添加した。別のウェルに、rhuIL-6（アレス-セロ社（Ares-Serono）・ジュネーブ）を500ng/mlの濃度で、濃度2〜500ng/mlのヒトsIL-6RδValと共に加えた。4℃で一晩インキュベートした後、ウサギポリクローナル抗IL-6R（オーら（Oh et al）、サイトカイン（Cytokine）,8,401-409,1996）を加え、さらにセイヨウワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ウサギIgを加えて、それを着色反応（シグマ社(Sigma)・セントルイス）で検出した。図8は、その結果のスキャッチャードプロット（Scatchard plot）を示す。gp130に対するIL-6R/IL-6キメラの親和力は、別々に加えたその分子の2つの部分よりも4倍以上高い（6.3×10-11M対2.6×10-10M）ことがわかった。この結果は、メラノーマと造血細胞に対するこのキメラの活性がIL-6＋sIL-6Rの組み合わせより高いことと一致しており、またその説明になっている（図9と実施例4）。
【０１０９】
実施例 8 ： IL-6R/IL-6 キメラは肝毒性から保護する
マウスへの四塩化炭素（CCl4）注射は、その動物の死につながる重篤な肝臓の壊死をもたらす（スラター ティー エフら（Slater T.F. et al）、フィロス トランス アール ソク バイオル（Philos.Trans.R.Soc.Biol.）311,633-645,1985）。IL-6が遺伝的に欠損したマウス（IL-6-/-）に比較的低用量のCCl4（2〜3ml/kg体重）を腹腔内注射によって与えた場合、24時間時点の致死率は70%前後である（図10）。CCl4の1時間前とCCl4の4時間後にCHO産生IL-6R/IL-6キメラを注射すると、それらの動物が保護され、24時間時点で死亡は認められない。これに対し、同様に注射した遊離のrhuIL-6には効果がない（図10）。IL-6R/IL-6キメラは注射1回あたり2〜3μgの用量で有効であり、これは、無効であったIL-6の用量よりモル比で10倍低い。より高用量のCCl4（例えば図10の3.5ml/kg）でもキメラは保護的であって、死亡率はIL-6の場合またはサイトカインなしの場合よりも低い。どちらも同じCCl4投与を受けたキメラ処置マウスと無処置マウスの間の死亡率の相違はp＜0.01のレベルで有意だった。ヘマトキシリン-エオシン染色した肝切片の組織学的所見から、CCl4が肝組織壊死をもたらし、IL-6R/IL-6キメラがその化学的毒性から肝細胞を保護することが確認された（非掲載）。
【０１１０】
IL-6R/IL-6キメラの応用として、化学物質（例えばアルコールやパラセタモール）または他の原因（例えばウイルス性肝炎）による壊死性疾患を持つ患者の肝組織の保護が考えられる。
【０１１１】
実施例 9 ： IL-6/sIL-6R δ Val キメラの構築と活性
IL-6部分をN末端に持ちsIL-6R部分をC末端に持つキメラ分子を構築した。プラスミドpBS-sIL-6RδValをSau3a（bp 1086）とVal-356の後ろにある停止コドンに続くHindIIIで切断した（実施例1参照）。3つの制限部位、SpeI、SmaIおよびBamHIを含むリンカーを次のように合成した。
【０１１２】
【配列表１】
【０１１３】
sIL-6RのこのSau3a部位を、リンカーのBamHIに連結し、Bluescript pBS SKプラスミドのマルチクローニングサイトにクローニングした。IL-6配列は、次のプライマー（開始コドンは下線部）を用いてpKKβ2-7 DNAからPCRによって増幅した。
【０１１４】
【配列表２】
【０１１５】
SpeIとHaeIIIで切断したそのPCR産物を上記リンカーのSpeI部位とSmaI部位の間に導入した。内部SmaIを持つもう一つのリンカーBamHI-NcoIを次のように合成した。
【０１１６】
【配列表３】
【０１１７】
これを、先のリンカーのBamHIとIL-6R配列のNcoI 1464の間にクローニングした。次に、SmaI 867からNcoI 1464までのIL-6R断片を、第二のリンカーのSmaIとIL-6RのNcoIの間に導入した。得られたキメラDNAを配列決定し、ヒトHEK293細胞で発現させるためにpCDNA3に再クローニングした。このIL-6-IL-6Rキメラ3eのアミノ酸配列を図11に示す（リンカーは下線部）。キメラ3eを抗IL-6モノクローナル抗体でのアフィニティークロマトグラフィーで精製した（ノビックら（Novick et al）、ハイブリドーマ（Hybridoma）8,561-567,1989と同様に実施）。SDS-PAGEでは75kDaバンドが観察された。
【０１１８】
F10.9メラノーマ細胞の増殖を阻害するIL-6-IL-6Rキメラ3eの生物学的活性を図12に示す。50%増殖阻害にはより多くの量が必要であるものの、これは同じ実験でのIL-6R/IL-6キメラ（調製1-3）と比較して明らかに活性である。
【０１１９】
IL-6R/IL-6の2つの突然変異体、すなわちIL-6R/IL-6のIL-6R部分のアミノ酸His-280とAsp-281（図3）をPCR突然変異誘発法でそれぞれSerとValに変えたもの（突然変異体39またはHD）と、さらにAsn-230をAspに変えたもの（突然変異体NHD）とを作製した。図12からわかるように、これら2つの突然変異体はIL-6R/IL-6およびIL-6-IL-6Rキメラと比較してほとんど活性を持たない。分子モデリングによって示されているように（ハリミら（Halimi et al）、1995年）、IL-6Rではこれらのアミノ酸がgp130と相互作用するので、これはsIL-6R/IL-6キメラがこの不可欠な相互作用部位を保存することを証明している。
【０１２０】
IL-6-IL-6Rキメラ3eはIL-6R/IL-6には存在するIL-6Rの免疫グロブリン様ドメインを欠く。しかし、IL-6R/IL-6からこのIgドメインを除去しただけではF10.9細胞に対するその生物学的活性は低下しなかった。gp130へのIL-6-IL-6Rキメラ3eの結合はもう一つのIL-6R/IL-6キメラの約30%だった（非掲載）。この低い結合性はメラノーマ細胞増殖に対する活性が低いことと一致している。
【０１２１】
これらの結果は、リンカーを介したsIL-6Rへの融合によるIL-6カルボキシ末端の遮断が、このような新規キメラで良好な生物学的活性を保存することを証明している。
【０１２２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】 図1（A、B）は、実施例1に詳しく記載されているように、天然の成熟型のプロセシングされた形態のIL-6の配列を伴うVal356残基で終わるsIL-6Rの天然の形態の構造が保存されているキメラタンパク質をコードするキメラDNA分子の構築において使用される様々なベクター、試薬および処理工程を図示する。
【図２】 図2（A、B）は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（A）および生物活性プロファイル（B）によってsIL-6RδVal/IL-6 p68キメラを同定するために行った分析から得られた結果を示す。図2Aには、クーマシー染色したゲルの複製を示す：キメラタンパク質をコードするベクターでトランスフェクションした細胞の培養物から得た分泌タンパク質サンプルを負荷したアフィニティクロマトグラフィーカラムから溶出される免疫精製画分を電気泳動した。図2Bには、アフィニティクロマトグラフィーカラムから溶出される上記の各画分の生物学的活性（F10.9メラノーマ細胞の増殖阻害）を図示する。これらは、実施例2および実施例3において詳しく記載されている。
【図３】 図3は、sIL-6RδVal/IL-6キメラのアミノ酸配列（1文字コード）を示す。図には分子の様々なドメインが示され、これには、実施例1および実施例2に記載されているように、N末端のシグナルペプチド（配列の上部に線を付す）、免疫グロブリン様（Ig様）ドメイン、サイトカイン受容体Ｎドメイン（下線部）、サイトカインCドメイン（配列の上部に線を付す）、および受容体の前膜領域（Cドメインと膜貫通ドメインとの間の領域）（これらはすべて、キメラのsIL-6R部分である）；ならびにキメラの成熟型IL-6部分（下線部）を含む。
【図４】 図4（A、B）は、sIL-6R/IL-6キメラタンパク質による4日間の処置を伴わない培養（A）、およびそのような処置を伴う培養（B）におけるF10.9メラノーマ細胞の写真である。図4Bにおいて、実施例3において記載されているように、sIL-6R/IL-6キメラを用いた処置によってそのような転移性メラノーマ細胞（F10.9細胞）において誘導された形態学的変化が明らかである。
【図５】 図5は、約0.12ng/ml〜約150ng/mlの範囲のキメラ体の様々な濃度でのsIL-6R/IL-6キメラタンパク質によるF10.9メラノーマ細胞の増殖阻害を示す結果を図示する。実施例3に記載されているように、わずかに3アミノ酸のリンカーを有するキメラ体IL-6RIL-6が、13アミノ酸の長いリンカーを有するキメラ体（IL-6RLIL-6）と比較される。
【図６】 図6は、実施例3において記載されているように、F10.9メラノーマ細胞に対する増殖阻害作用がないことを示す結果：IL-6が0ng/ml〜40ng/mlの範囲の濃度にある単離したIL-6単独（空き四角を付けた上部の点線）、およびsIL-6R単独（IL-6濃度が0である縦軸でのすべての曲線の集束点）、ならびにIL-6およびsIL-6Rが様々な濃度、IL-6の濃度は10ng/ml〜40ng/mlの範囲であり、sIL-6Rは、それぞれのIL-6濃度に対して、100ng/ml、200ng/mlおよび400ng/mlの3つの濃度で加えられるが、ともに加えられたときに認められる増殖阻害作用、3つの下部の曲線（空き三角および空き丸を付けた2つの点線ならびに黒四角を付けた実線）を図示する。
【図７】 図7は、実施例4に記載されているように、SCID-NODマウスにおける骨髄移植中のヒト造血幹細胞の十分な移植にsIL-6R/IL-6キメラタンパク質が必要であることを示すサザンブロットのオートラジオグラフの複製である（右側の2つのレーンは、他の必要な因子（SCF、FLT-3）に加えて、sIL-6R/IL-6キメラタンパク質が投与されたマウスを示し、これに対して、左側の3つのレーンは、SCFおよびFLT-3のみ、そしてSCF、FLT-3ならびに単離した、すなわち、非融合のIL-6およびIL-6Rが投与されたマウスを示す）。
【図８】 図8は、IL-6およびsIL-6Rの混合物と比較されるsIL-6R/IL-6キメラの親和性特性のスキャチャード プロット（Scatchard plot）である。キメラ体の値は黒四角で示され、混合物の値は黒菱形で示される。傾きの比は4：1である。
【図９】 図9は、sIL-6R+IL-6の混合物の活性、あるいはsIL-6R（IL-6の非存在）の活性と比較して、F10.9メラノーマ細胞に対するsIL-6R/IL-6キメラの大きな活性を示す。
【図１０】 図10は、肝臓毒性に対するsIL-6R/IL-6キメラの保護を示す。値は4実験の平均を示す。黒四角はIL-6-／−マウスを示し、黒菱形はIL-6が投与されたIL-6-／−マウスを示し、黒星はキメラ体が投与されたIL-6-／−マウスを示す。
【図１１】 図11は、IL-6-sIL-6RδValキメラ3eのアミノ酸配列（1文字コード）を示し、リンカーに下線を付す。
【図１２】 図12は、実施例9に記載されているように、sIL-6R/IL-6キメラ（黒四角）および2つの変異型（Mutt39（HD）−黒菱形、およびMutt（NHD）−明灰色星）と比較して、キメラ3e（暗灰色星）の図9のメラノーマ細胞に対する生物学的活性を示す。
［発明の分野］
本発明は、一般的には、可溶性インターロイキン−6受容体（sIL-6R）のアゴニスト作用に依存するインターロイキン−6（IL-6）の生物学的活性の分野である。より詳細には、本発明は、本質的には天然に存在する形態のsIL-RおよびIL-6の融合から構築される新規キメラのsIL-6R/IL-6タンパク質、およびその生物学的に活性な類似体に関する。そのようなキメラタンパク質および類似体は、がん性細胞の増殖を阻害することによるがんの治療に、骨髄移植の強化に、肝臓障害の治療およびIL-6関連症状の治療に特に有用である。
【０００２】
［発明の背景および先行技術］
インターロイキン−6（IL-6）はよく知られているサイトカインであり、その生物学的活性は、一方はIL-6受容体（IL-6Rまたはgp80）と呼ばれ、もう一方はgp130と呼ばれる2つの異なるタンパク質からなる膜受容体システムによって媒介されている（ヒラノら（Hirano et al）による総説、1994年）。gp80の細胞外ドメインに対応する可溶形態のIL-6R（sIL-6R）は、血液および尿において糖タンパク質として見出されるヒト身体の天然産物である（ノビックら（Novick et al）、1990年、1992年）。sIL-6R分子の優れた性質は、sIL-6Rが、ヒト細胞を含む多くの細胞タイプでIL-6の強力なアゴニストとして作用することである（タガら（Taga et al）、1989年；ノビックら（Novick et al）、1992年）。これは、gp80の細胞質内ドメインがない場合でも、sIL-6Rは、依然として、IL-6に応答してgp130の二量化を誘発させることができ、次いで、その後のIL-6特異的なシグナル伝達および生物学的作用を媒介するという事実によるものである（ムラカミら（Murakami et al）、1993年）。活性なIL-6受容体複合体は、実際には、2個のgp130鎖、2個のIL-6Rおよび2個のIL-6リガンドによって形成される六量体構造であり（ワードら（Ward et al）、1994年；パオネッサら（Paonessa et al）、1995年）sIL-6Rはgp130と2通りの相互作用を有し、その相互作用はともに、IL-6に特異的な生物学的活性に必須である（ハリミら（Halimi et al）、1995年）。
【０００３】
sIL-6Rを用いた治療により、IL-6の生物学的活性が多くの細胞タイプにおいて増強される。その一例は、sIL-6Rを加えた場合に、その増殖がIL-6によって大きく阻害される腫瘍細胞である：例えば、マウス骨髄球性白血病性Ｍ1細胞（タガら（Taga et al）、1989年）、ヒト乳がんT47D細胞（ノビックら（Novick et al）、1992年）またはヒトの非小細胞肺がん細胞（ガナパシら（Ganapathi et al）、1996年）など。IL-6は、インビボで抗転移活性を有し（カッツら（Katz et al）、1995年）、sIL-6Rはまた、IL-6のそのようなインビボでの抗腫瘍作用を増強することができる（マッキーヴィクズら（Mackiewicz et al）、1995年）。sIL-6Rの添加により増強されるIL-6の別の活性は、造血幹細胞を刺激して多系統のコロニーを産生することである（スイら（Sui et al）、1995年）。本発明者らはまた、脳の稀突起膠細胞の初代培養物の生存がsIL-6RおよびIL-6の組合せによって維持されること（オー（Oh）、1997年）を見出したが、IL-6単独では、そのような培養物において乏しい活性である（カーン（Kahn）および（デ ベリス（De Vellis）、1994年）。この発見は、IL-6は、sIL-6Rと組み合わせたときに、gp130を介して同様に作用する毛様体神経栄養因子（CNTF）または白血病阻害因子（LIF）などの他の神経栄養性サイトカインの活性を模倣し得ることを示しており、これは、IL-11およびオンコスタチンＭの場合にも見られる（ヒラノら（Hirano et al）、1994年）。
【０００４】
IL-6およびsIL-6Rの上記の機能を組合せ得る分子を得ようとする試みにおいて、グリシン−リッチリンカーによって連結されたヒトIL-6R配列の短縮セグメントとIL-6との融合タンパク質の組換え酵母細胞における産生が最近報告された（フィッシャーら（Fischer et al）、1997年）。この融合タンパク質は、本質的には、IL-6Rのサイトカイン受容体Nドメインおよびサイトカイン受容体Cドメインのみを含み、従って、本質的には、IL-6Rの免疫グロブリン（Ig）様ドメイン、および受容体前膜領域（Cドメインと膜貫通ドメインとの間の領域）を欠いている。このように、この融合タンパク質は、sIL-6Rの短縮型形態であり、この融合タンパク質におけるこの短縮型のsIL-6Rは、上記のグリシン−リッチリンカーを介して、本質的に完全な成熟型形態のIL-6に連結されている。天然のsIL-6Rの欠失部に加えて、酵母細胞により産生されることによるこの融合タンパク質は、哺乳類細胞、特に、例えば、ヒト細胞において産生された場合にそのような融合タンパク質が有するグリコシル化パターンを有していない。実際、酵母によって産生されたこの融合タンパク質は、約57kDaのみの分子量を有し、これに対して、本質的にすべての天然のsIL-6RおよびIL-6のアミノ酸残基を含有し、哺乳類（例えば、ヒト）細胞において完全にグルコシル化された融合産物は、約85kDaの推定分子量を有する（本明細書中下記の実施例2を参照のこと）。
【０００５】
ヒト患者を治療するために使用され得る組換えタンパク質の開発における一般的な実験により、抗体および非天然の組換え産物で認められる他の副作用の誘発を避けるために、それらがヒト身体で見出されるような天然の形態のタンパク質にできる限り近づけることが重要であることが示されてきた。このために、組換え哺乳類物細胞システムを使用して、天然のヒト産物にできる限り類似したキメラ形態で、インターフェロン−βまたは顆粒球コロニー刺激因子（チェルナジョブスキーら（Chernajovsky et al）、1984年；ホロウェイ（Holloway）、1994年）などのグリコシル化タンパク質を産生することは有利である。例えば、適切にグリコシル化されない酵母などの細菌または微生物はまた、タンパク質鎖の誤った折り畳みをもたらし、免疫反応を導く。このことは、N−グリコシル化およびO−グリコシル化ならびにリン酸化による著しい翻訳後修飾を受けるIL-6（総説、リーベルら（Revel et al）、1989年）に関して、ならびにヒトの血液および尿から得られた糖タンパク質であり、そのN端およびC端のアミノ酸が一定しており、決定された天然のsIL-6R（ノビックら（Novick et al）、1990年および本発明者らによる共有特許の米国特許第5,216,128号明細書およびその対応ヨーロッパ特許出願公開第EP413908B1号公報）に関して特に重要である。
【０００６】
従って、sIL-6Rの一部とIL-6との間の上記の融合産物は、特にヒトを治療するためにそれを使用することに関して多数の欠点が生じ得ると考えられる。これは、sIL-6Rの一部を欠いているという事実、ならびにタンパク質を正しくグリコシル化し得ない酵母における産生のためである。
【０００７】
これまで、ヒト体液において見出される天然のsIL-6Rと天然のIL-6からなり、ヒトまたは他の哺乳類細胞で産生される融合分子は報告されていない。
【０００８】
従って、本発明の目的は、天然のsIL-6Rおよび天然のIL-6（任意の順序で）からなり、哺乳類細胞で産生されるような融合分子を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、そのような融合タンパク質（sIL-6R/IL-6キメラ）を使用して、非常に低い濃度でIL-6またはsIL-6R単独に対して抵抗性である転移性の大きなメラノーマ細胞の増殖を阻害することである。
【００１０】
さらに別の目的は、骨髄移植プロトコルにおけるヒト造血幹細胞のインビボでの移植のためにそのような融合タンパク質（sIL-6R/IL-6キメラ）を使用することである。
【００１１】
本発明のなおさらなる目的は、他のIL-6関連障害、例えば、肝症状または神経学的症状においてそのような融合タンパク質を使用することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、がんの治療、骨髄移植術における使用、および他のIL-6関連障害、例えば、肝症状および神経学的症状のための、上記の天然sIL-6R-天然IL-6融合タンパク質（sIL-6R/IL-6キメラ）を含有する医薬組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的および態様は、本発明の下記の開示に示され、あるいは本発明の下記の開示から明らかである。
【００１４】
［発明の要旨］
本発明により、それぞれがヒトの体液から得られた天然に存在するsIL-6Rの本質的にすべて、ならびに天然に存在するヒトIL-6の成熟形態の本質的にすべてからなり、それぞれが、長さが3アミノ酸残基もの短さであり得るか、またはそれよりも長い、例えば、長さが13アミノ酸残基の短いリンカーペプチドによって連結されてなる多数の融合タンパク質（キメラ）が産生される（下記ならびに実施例1および2を参照のこと）。しかし、このような融合タンパク質においては、リンカーペプチドを省略することができ、sIL-6R部分をIL-6部分に直接連結することができることに留意しなければならない。非天然性アミノ酸配列を示すリンカーは、患者において抗体を誘発する免疫原性エピトープであり得るので、所望の生物学的活性を有する直接融合したsIL-6R/IL-6キメラであることが好ましく、その一方で、同時に、そのようなキメラ体が投与されたときに、このような混在的に有害な抗体の形成を誘導する危険性が最小限度化される。
【００１５】
天然に存在する分子において見出されるようなIg様ドメインを含む完全なsIL-6R配列の保存、ならびに上記のキメラ体がヒト細胞または哺乳類細胞において産生されたときにそのような細胞によって導入される正しいグリコシル化および他の翻訳後修飾もまた、キメラタンパク質産物の免疫原性の可能性を低下させるために重要である。
【００１６】
しかし、約3個のアミノ酸の非常に短いリンカーを、キメラタンパク質のsIL-6R部分とIL-6部分の接続点で使用することができる。そのような短いリンカーは免疫原性エピトープではない。当然、2つの部分を分離するために約30個までのアミノ酸のより長いリンカーを使用することもまた可能であるが、この場合、注意しなければならず、生物学的効能および安全性の実験を行って、そのようなリンカーを有するキメラ分子が免疫原性でないことを保証しなければならない。
【００１７】
実際、驚くべきことに、本発明により、より長いそのようなリンカーは、キメラタンパク質の活性に必須でないことが明らかにされた。このことは、特に、sIL-6RおよびIL-6部分の天然に存在する本質的にすべての配列がキメラ分子に取り込まれたとき、該キメラの正しい折り畳みには、より長いリンカーは必要でないことを示している（きわめて短い（3アミノ酸）リンカーを有するsIL-6R/IL-6キメラと30アミノ酸の長いリンカーを有する類似のキメラとの比較にも関連する実施例3および図5を参照のこと）。
【００１８】
これらの融合タンパク質、すなわち、sIL-6R/IL-6キメラは、本発明により、哺乳類細胞発現システムにおいて効率よく産生され、IL-6またはsIL-6R単独に対して通常は非応答性の腫瘍細胞に対して強力な活性を有し、ヒトの骨髄が移植された細胞の移植の成功を確実にすることにおいて非常に効果的であったグルコシル化産物が得られる（下記および実施例1〜4を参照のこと）。実際、そのような骨髄移植において、sIL-6R/IL-6キメラは、移植された非拘束の多分化能性造血幹細胞の生存および増殖に必須であった。さらに、本明細書中下記に示す実験結果から、そして他の分析からも、理解されるように、本発明のsIL-6R/IL-6キメラタンパク質の様々な類似体を調製することができ、sIL-6R/IL-6キメラの本質的に同じ生物学的活性を有し、そのような類似体は、1個または複数のアミノ酸残基の欠失、付加、または他のアミノ酸による置換が行われたsIL-6R/IL-6キメラであり、そしてそのような類似体に対する唯一の限定は、それらが天然に存在するsIL-6RおよびIL-6配列の大部分を保持することである。例えば、天然に存在するsIL-6R配列およびIL-6配列に対するアミノ酸の付加は、約20アミノ酸までに限定されることが好ましく、好ましくは、このような付加は、sIL-6RとIL-6との接合部位にあり、すなわち、リンカー分子である。同様に、sIL-6RおよびIL-6配列からの欠失は、好ましくは、約20〜30アミノ酸までに限定され；sIL-6RおよびIL-6配列におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基による置換もまた、好ましくは、約20〜30アミノ酸までに限定される。上記の欠失、付加および置換のすべては、得られたそのような改変類似体が、天然に存在する配列から本質的に構成されるsIL-6R/IL-6キメラの生物学的活性を本質的に保持し、そして哺乳類細胞で発現されたとき、天然に存在する配列から本質的に構成されるキメラと同じグリコシル化パターンを本質的に保持する場合に本発明により許容される。
【００１９】
従って、本発明は、グリコシル化されたキメラの可溶性インターロイキン−6受容体（sIL-6R）−インターロイキン−6（IL-6）タンパク質（sIL-6R/IL-6）、およびその生物学的に活性な類似体を提供する。これらは、sIL-6Rの本質的にすべての天然に存在する形態とsIL-6の本質的にすべての天然に存在する形態との融合タンパク質産物からなる。該sIL-6R/IL-6およびその類似体は、天然に存在するsIL-6RおよびIL-6のグリコシル化と類似する様式でグリコシル化される。
【００２０】
本発明の上記キメラタンパク質の実施例には下記が含まれる：
（i）sIL-6Rがペプチドリンカー分子を介してIL-6に融合しているキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的な活性な類似体。
【００２１】
（ii）前記リンカーが約3〜4アミノ酸残基の非常に短い非免疫原性リンカーである上記（i）のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的な活性な類似体。
【００２２】
（iii）前記リンカーが配列E-F-M（Glu-Phe-Met）のトリペプチドである上記（ii）のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的な活性な類似体。
【００２３】
（iv）前記リンカーが配列E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M（Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met）（配列番号1）の13アミノ酸残基のペプチドである上記（i）のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的な活性な類似体。
【００２４】
（v）sIL-6RのＣ末端のVal-356とIL-6のN末端のPro-29との間に配列E-F-Mのトリペプチドリンカーを有し、本明細書中においてsIL-6RδVal/IL-6と呼ばれ、該キメラタンパク質は図3に示す配列を有するキメラsIL-6R/IL-6タンパク質。
【００２５】
（vi）sIL-6RのC末端のVal-356とIL-6のN末端のPro-29との間に配列E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-Mの13アミノ酸ペプチドリンカーを有し、本明細書中においてsIL-6RδVal/L/IL-6と呼ばれ、該キメラタンパク質は図3に示す配列を有し、図3の357〜359位の配列E-F-Mのトリペプチドは、前記の13アミノ酸ペプチドリンカーによって置換されるキメラsIL-6R/IL-6タンパク質。
【００２６】
（vii）哺乳類細胞において完全にプロセシングされた形態で産生されるキメラsIL-6R/IL-6タンパク質。
【００２７】
（viii）ヒト細胞において産生されるキメラsIL-6R/IL-6タンパク質。
【００２８】
（ix）CHO細胞において産生されるキメラsIL-6R/IL-6タンパク質。
【００２９】
（x）きわめて悪性のがん細胞の増殖を阻害し得ることを特徴とする上記のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的に活性な類似体。
【００３０】
（xi）きわめて悪性のメラノーマ細胞の増殖を阻害し得ることを特徴とする上記のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的に活性な類似体。
【００３１】
（xii）骨髄移植におけるヒト造血細胞のインビボでの移植を誘発し得ることを特徴とする上記のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的に活性な類似体。
【００３２】
（xiii）肝毒性因子から肝臓を保護し得ることを特徴とする前記のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的に活性な類似体。
【００３３】
本発明はまた、本発明による上記キメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的に活性な類似体をコードするDNA配列を提供する。
【００３４】
さらに、本発明はまた、上記本発明のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的に活性な類似体をコードするDNA配列からなるDNAベクターであって、哺乳類細胞における前記キメラタンパク質の発現に適するDNAベクターを提供する。
【００３５】
本発明のDNAベクターの態様には下記が含まれる：
（i）ヒト細胞における前記キメラタンパク質の発現に適するDNAベクター。
【００３６】
（ii）哺乳類またはヒト細胞において発現されるDNAベクター、発現されるキメラタンパク質は、哺乳類またはヒト細胞によるキメラタンパク質の完全なプロセシングを可能にし、細胞から前記細胞が増殖する培養培地への完全にプロセシングされたキメラタンパク質の分泌を可能にする配列を有する。
【００３７】
（iii）サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下にキメラsIL-6R/IL-6タンパク質がコードされるDNA配列を含有するpcDNA3ベクターからなり、本明細書中においてプラスミドpcDNAsIL-6R/IL-6と呼ばれる上記DNAベクター。
【００３８】
（iv）サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下にあるキメラsIL-6R/IL-6タンパク質をコードするDNA配列を含有するpcDNA3ベクターからなり、本明細書中においてプラスミドpcDNAsIL-6R/L/IL-6と呼ばれ、前記キメラsIL-6R/IL-6タンパク質をコードする前記DNA配列において、リンカーペプチドをコードするリンカー配列が、前記タンパク質のsIL-6R部をコードする配列とIL-6部をコードする配列との間に配置されたEcoRI部位に挿入されている上記DNAベクター。
【００３９】
同様に、本発明はまた、上記DNAベクターを含有する形質転換された哺乳類細胞、すなわち、上記ベクターによって担持されるsIL-6R/IL-6キメラタンパク質の配列を発現することができ、発現タンパク質の完全なプロセシングを行うことができ、そして前記細胞が増殖する培地に発現タンパク質を分泌し得る哺乳類細胞を提供する。
【００４０】
これらの形質転換細胞の態様は、pcDNAsIL-6R/IL-6ベクターでトランスフェクションされた本明細書中に記載されるヒト胚性腎臓細胞293（HEK293）である。この細胞は、sIL-6R/IL-6キメラタンパク質を発現することができ、このタンパク質を完全にプロセシングすることができ、この細胞が増殖する培地にこのタンパク質を約85kDaの糖タンパク質の形態で分泌することができる。
【００４１】
形質転換細胞の他の態様は、pcDNAsIL-6R/IL-6ベクターでトランスフェクションされた本明細書中に記載されるCHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞である。この細胞は、sIL-6R/IL-6キメラタンパク質を発現することができ、このタンパク質を完全にプロセシングすることができ、そしてこの細胞が増殖する培地にこのタンパク質を約85kDaの糖タンパク質の形態で分泌することができる。
【００４２】
本発明はまた、上記キメラタンパク質またはその生物学的に活性な類似体を産生するための方法を提供する。この方法は、上記形質転換された細胞を、前記タンパク質または類似体の発現、プロセシングおよび前記細胞が増殖する培地への分泌に適する条件下で増殖させ；前記タンパク質または類似体を、sIL-6Rに特異的なモノクローナル抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーによって前記培養培地から精製することからなる。
【００４３】
本発明のキメラタンパク質は、下記のように多くの用途がある：
（i）がん細胞の阻害剤としてのキメラsIL-6R/IL-6タンパク質または類似体、そのいずれか1つの塩、およびその混合物の使用。
【００４４】
（ii）きわめて悪性のメラノーマ細胞の阻害剤としての上記（i）の使用。
【００４５】
（iii）骨髄移植におけるヒト造血細胞の移植を誘発するための有効成分としてのキメラsIL-6R/IL-6タンパク質または類似体、そのいずれか1つの塩、およびその混合物の使用。
【００４６】
（iv）造血の増大、肝症状および神経学的症状の治療、またはIL-6もしくはIL-6Rが使用される他の適用のための有効成分としてのキメラsIL-6R/IL-6タンパク質または類似体、そのいずれか1つの塩、およびその混合物の使用。
【００４７】
同様に、本発明のキメラタンパク質は、多数の医学的適用症のための医薬、すなわちキメラsIL-6R/IL-6タンパク質または類似体、そのいずれか1つの塩、およびその混合物を調製するために使用でき、がん細胞を阻害することによってがんを治療処置するための医薬の調製において、または骨髄移植におけるヒト造血細胞の移植を誘発させることによって骨髄移植を強化するための医薬の調製において、または造血を増大させるための医薬の調製において、または神経学的障害を治療するための医薬の調製において、またはIL-6もしくはsIL-6Rが使用される他の適用のための医薬の調製において使用される。
【００４８】
さらに、本発明はまた、有効成分として上記キメラsIL-6R/IL-6タンパク質またはその類似体、および薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤からなる医薬組成物を提供する。
【００４９】
本発明のこの医薬組成物の態様には下記が含まれる：
（i）哺乳類のがんを治療するための医薬組成物。
【００５０】
（ii）骨髄移植を強化させるための医薬組成物。
【００５１】
（iii）肝臓および神経学的障害を治療するため、または造血を増大させるため、またはIL-6もしくはsIL-6Rが使用される他の適用のための医薬組成物。
【００５２】
本発明はまた、哺乳類のがんを治療するため、または骨髄移植を増強させるため、または肝臓および神経障害を治療するため、または造血を増大するため、またはIL-6もしくはsIL-6Rが使用される他の適用のための方法を提供する。この方法は、患者に、上記の医薬組成物を、適切な投薬形態で、適切な投与経路によって投与することからなる。
【００５３】
曖昧さを避けるために、本発明は、任意の順序のIL-6とsIL-6Rとのキメラに関する。すなわち、N端およびＣ端部分は逆にすることができ、従って、そのキメラは、IL-6-sIL-6Rタンパク質である。しかし、キメラ体は、本明細書中においては、一貫してsIL-6R/IL-6タンパク質として示される。
【００５４】
本発明の他の側面および態様は、本発明の下記の詳細な開示から説明されるか、またはあるいは本発明の下記の詳細な開示から直接的に現われる。
【００５５】
本発明は、キメラsIL-6R/IL-6タンパク質およびその生物学的に活性な類似体に関する。これらは、sIL-6Rの本質的にすべての天然に存在する形態およびIL-6の本質的にすべての天然に存在する形態が一緒に融合し、そしてその融合部位は、リンカーペプチド（3個もの短いアミノ酸）によるものであってもよく、そしてそのようなキメラsIL-6R/IL-6タンパク質または類似体は、天然に存在するsIL-6RおよびIL-6のグルコシル化量およびグリコシル化パターンと類似するグルコシル化量およびグリコシル化パターンを有する。哺乳類細胞、特にヒト細胞（下記の実施例1〜4を参照のこと）またはCHO細胞（下記の実施例6を参照のこと）において、本発明により産生されるそのようなキメラsIL-6R/IL-6タンパク質は、そのような細胞で効率的に発現され、高度にグルコシル化され、IL-6またはsIL-6R単独に対して全く応答性を示さない腫瘍細胞に対して強力な活性を有することが見出された。
【００５６】
より詳細には、本発明により、本発明の上記のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質は、非融合のsIL-6RおよびIL-6の混合物が使用されるときに必要とされるよりも低い濃度でF10.9メラノーマ細胞などのきわめて悪性の哺乳類細胞の増殖を停止させることが認められた（下記の実施例1〜3を参照のこと）。そのようなF10.9メラノーマ細胞が、IL-6単独またはsIL-6R単独で個々に処置されたときに正常に増殖し続け、非融合のIL-6およびsIL-6Rの組合せの比較的高い用量に曝したときにだけ増殖が停止されるという事実を考慮すれば、これは、特に有意義な結果である。従って、本発明のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質は、驚くべきことに、その別々の部分の混合物、すなわち、非融合のIL-6およびsIL-6Rの混合物よりも、これらのきわめて悪性のメラノーマ細胞の強力な阻害剤である。従って、本発明のキメラタンパク質は、様々な種類のがんを治療するための有効成分として特に有用である。
【００５７】
キメラsIL-6R/IL-6タンパク質のより高い活性は、gp130に対するその親和性が、非融合のIL-6およびsIL-6Rの混合物の親和性よりも高いことによって説明される（実施例7）。
【００５８】
さらに、本発明のキメラsIL-6R/IL-6分子は、骨髄移植を強化するために特に有用であることもまた本発明により見出された（下記の実施例4を参照のこと）。実際、ヒト骨髄細胞を重症複合免疫不全（SCID）マウスに移植するために知られているプロトコルにおいて、幹細胞因子（SCF）およびFlt-3リガンドが、レシピエントの骨髄への長期間の移植を可能にする最も原始的な多分化性造血幹細胞の生存および増殖を可能にするために使用されるが、そのようなプロトコルを使用して、これらの2つの因子、SCFおよびFlt3リガンドは、ヒト細胞をレシピエントマウス骨髄への移植を促進するには不十分であり、キメラsIL-6R/IL-6タンパク質をも加えられたときにだけ、移植が成功したことが見出された。この発見は、キメラタンパク質がそのような移植プロトコルにおいて必須であり得ることを示している。同じ実験において、非融合のIL-6およびsIL-6Rは、別々に加えられたとき、十分な骨髄移植を促進するには不十分であり、一緒に加えられたときには、キメラsIL-6R/IL-6タンパク質よりも活性がはるかに低かった、すなわち、100ng/mlの有効濃度で、sIL-6R/IL-6キメラタンパク質は十分な骨髄移植を促進したが、2つの別々の非融合のsIL-6RおよびIL-6は、より高い濃度（125〜1250ng/mlのsIL-6R、50〜200ng/mlのIL-6）でさえも一緒に加えられた場合、そのような移植を促進することにおいて活性ははるかに低かった。
【００５９】
本発明の上記のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質は、好ましくは、ヒト細胞において、あるいはヒト細胞がするようにタンパク質をグルコシル化することができ、そしてヒト細胞がするのと同じ翻訳後修飾を導入するハムスターCHO細胞などの任意の他の適切な哺乳類細胞発現システムにおいて産生された組換えグルコシル化sIL-6R/IL-6キメラである。重要な特徴は、そのように産生されたキメラ糖タンパク質が、短縮されることなく、非常に短いトリペプチドまたはより長いリンカーペプチドがキメラタンパク質のsIL-6RおよびIL-6部分との間に取り込まれている場合を除いて、余分な非天然のポリペプチド配列が付加されることなく、ヒト身体において見出される天然のsIL-6RおよびIL-6の親分子のようにプロセシングされ、修飾されることである。
【００６０】
本発明の上記の好ましいキメラタンパク質を調製するために、天然に存在するsIL-6RおよびIL-6の下記の特徴が考慮された。すなわち、ヒトの細胞膜に存在するIL-6Rは、シグナルペプチド、免疫グロブリン（Ig）様ドメイン、サイトカイン結合ドメイン、膜貫通領域、および細胞質ドメインからなる468アミノ酸をコードするcDNAによって産生されることが知られている（ヤマサキら（Yamasaki et al）、1988年）。可溶型形態のsIL-6Rは体液中に見出されており、これは、膜から得られた成熟のIL-6Rと同様に、Leu-20に対応するN末端（ノビックら（Novick et al）、1990年）およびIL-6Rの膜貫通領域の直前のVal-356に対応するＣ末端を有する（共有の米国特許第5,216,128号明細書およびヨーロッパ特許出願公開第413.908B1号公報を参照のこと）。このsIL-6R配列をIL-6に融合するために、EcoRI制限部位を、Val-356の後に導入した。IL-6cDNAのPro-29で始まり、Met-212で終わる成熟IL-6の配列（ジルバースラインら（Zilberstein et al）、1986年；ヒラノら（Hirano et al）、1986年）を、このEcoRI部位の後に導入した。このEcoRI部位において、キメラタンパク質で互いからのsIL-6RおよびIL-6部分の距離までの所望の長さのリンカーペプチドをも導入することができるが、必ずしもそのようなリンカーペプチドは導入されない。下記の実施例において示されているように、2つの異なるキメラタンパク質をそのような可能なキメラタンパク質の例として産生し、このEcoRI部位において、１つはトリペプチドリンカーを有し、他方は13アミノ酸残基のリンカーを有し、両方とも本質的に等しく生物学的に活性であった。
【００６１】
本発明はまた、本発明の上記のキメラsIL-6R/IL-6タンパク質の類似体に関し、この類似体は、sIL-6RおよびIL-6の天然に存在する配列のみを本質的に有するキメラタンパク質と本質的に同じ生物学的活性を保持する。そのような類似体は、キメラタンパク質のsIL-6R部分およびIL-6部分において、約30個までのアミノ酸残基が欠失、付加、または他のアミノ酸により置換されているこの種の改変はキメラタンパク質類似体の生物学的活性を、キメラタンパク質自身に関して実質的に変化させず、そのような類似体のsIL-6R部分は、シグナルペプチド、Ig様ドメイン、サイトカイン受容体のNドメイン、サイトカイン受容体のCドメイン、および受容体の前膜ドメインの天然に存在する構造（プロセシング前−図3を参照のこと）を保持する。同様に、そのようなキメラタンパク質類似体は、IL-6部分の天然に存在する成熟型形態を本質的に保持しうる。様々な類似体は、互いに、そしてキメラタンパク質においてsIL-6RおよびIL-6部分を連結するリンカーペプチドの部位において（天然に存在するsIL-6RおよびIL-6配列のみを本質的に有する）基本的なキメラタンパク質分子と多くの場合異なり得る。そのようなリンカーは、長さが約30個までのアミノ酸残基であり得、そのようなリンカーは、キメラタンパク質において、sIL-6R部分およびIL-6部分を互いに隔てるのに役立つ。そのようなリンカーに関して、例えば、そのようなリンカーによって、キメラタンパク質を不活性にし得るキメラタンパク質の誤った折り畳みが生じないように、あるいはキメラタンパク質類似体が、それにより治療される患者においてその抗体を誘発する免疫原性タンパク質にし、その結果として、そのような類似体は少なくとも中長期の医薬として効果的でないことが生じないように、その配列を選択するように注意しなければならない（従って、適切な標準アッセイにおいて、そのような各類似体の生物学的試験もまた行うようにしなければならない）。
【００６２】
本発明のキメラタンパク質の上記類似体に関して、このような類似体は、本発明の基本的なキメラタンパク質の1つ以上のアミノ酸残基および約30個までのアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基によって置換され、あるいは欠失され、あるいは1つ以上のアミノ酸残基が、本発明の基本的なキメラタンパク質と比較して得られた産物の活性を著しく変化させることなく、本発明のキメラタンパク質の最初の配列（天然に存在するsIL-6R配列およびIL-6配列のみを本質的に有する配列）に付加される類似体である。そのような類似体は、既知の合成法および／または部位特異的変異誘発技術によって、あるいはそれに適する任意の他の既知の技術によって調製される。
【００６３】
任意のそのような類似体は、好ましくは、それに実質的に類似する活性を有するような基本的なsIL-6R/IL-6キメラを十分に複製し得るアミノ酸の配列を有する。従って、任意の所定の類似体が、本発明の基本的キメラタンパク質と実質的に同じ活性を有するかどうかを、下記の実施例2〜4に示す生物学的活性試験にそのような類似体を供することからなる常套な実験によって測定することができる。
【００６４】
本発明により使用され得るキメラタンパク質の類似体、またはそれをコードする核酸には、本明細書中に示される教示および指針に基づいて、過度な実験を行うことなく、当業者によって日常的に得ることができる置換ペプチドまたは置換ポリヌクレオチドとして実質的に対応する配列の有限の集合が含まれる。タンパク質化学および構造の詳しい説明に関しては、参照文献によって本明細書に組みこまれるシュルツ ジー イーら（Schulz,G.E. et al）、「タンパク質構造の原理」（Principles of Protein Structure）、スプリンガ−ベルラグ（Springer-Verlag）、ニューヨーク、1978年；およびクライトン ティー イー（Creighton,T.E.）、「タンパク質：構造と分子学的性質」（Proteins:Structure and Molecular Properties）、ダブリュ エイチ フリーマン＆株式会社（W.H.Freeman&Co.）、サンフランシスコ、1983年を参照。コドンの好みなどのヌクレオチド配列の置換の説明に関しては、オースベルら（Ausubel et al）、前出、A.1.1〜A.1.24頁；およびサムブロックら（Sambrook et al）、「分子生物学における最新プロトコル」（Current Protocols in Molecular Biology）、インターサイエンス（Interscience）、ニューヨーク、6.3および6.4頁（1987年、1992年）、補遺CおよびDを参照のこと。
【００６５】
本発明による類似体の好ましい変化は、「保存的」置換として知られているものである。天然に存在するsIL-6RおよびIL-6配列を本質的に有するキメラタンパク質における変化の保存的なアミノ酸の置換には、グループのメンバー間の置換は分子の生物学的機能を保っているという十分に類似する物理化学的特性を有するグループ内の同義のアミノ酸が含まれ得る：グランサム（Grantham）、サイエンス、185巻、862〜864頁（1974年）。アミノ酸の挿入および欠失もまた、特に、挿入または欠失に、少数のアミノ酸が、例えば、30個未満、好ましくは10個未満が含まれるだけである場合にその機能を変化させることなく上記の配列において行うことができ、そしてそのような挿入または欠失により機能的な配置に重要なアミノ酸、例えば、システイン残基が除去または脱離されないことは明らかである。アンフィンセン（Anfinsen）、「タンパク質鎖の折り畳みを支配する原理」、サイエンス、181巻、223頁〜230頁（1973年）。そのような欠失および／または挿入により産生される類似体は、本発明の範囲に含まれる。
【００６６】
好ましくは、同義のアミノ酸グループは、表Ｉに規定されるアミノ酸グループである。より好ましくは、同義のアミノ酸グループは、表IIに規定されるアミノ酸グループである。最も好ましくは、同義のアミノ酸グループは、表IIIに規定されるアミノ酸グループである。
【００６７】
【表１】
【表２】
【表３】
本発明において使用されるキメラタンパク質の類似体を得るために使用され得るタンパク質におけるアミノ酸置換体を製造する例には、任意の知られている方法工程が含まれる。それらは、マークら（Mark et al）の米国再発行特許第33,653号、米国特許第4,959,314号、同第4,588,585号、および同第4,737,462号；コスら（Koths et al）の米国特許第5,116,943号、ネーメンら（Namen et al）の同第4,965,195号；チョングら（Chong et al）の米国特許第4,879,111号；およびリーら（Lee et al）の米国特許第5,017,691号などに示されている。リシン置換タンパク質は、シャウら（Shaw et al）の米国特許第4,904,584号に記されている。
【００７１】
本発明の別の好ましい態様において、本発明において使用されるキメラタンパク質の任意の類似体は、本発明の上記の基本的なキメラタンパク質の配列に本質的に対応するアミノ酸配列を有する。用語「本質的に対応する」は、特に、がん細胞の増殖を阻害するか、または骨髄移植を促進させるその能力が、例えば、関係する限りにおいて、基本的なキメラタンパク質の配列に対して、その基本的な特性に影響を及ぼさない小さな変化を有する類似体を包含するものとする。「本質的に対応する」という言葉に含まれると一般に見なされる変化のタイプは、いくつかの小さな改変が生じる本発明のキメラタンパク質をコードするDNAの従来の変異誘発技術、および上記の方法において所望の活性についてスクリーニングすることから得られる。
【００７２】
本発明による類似体には、ストリンジェントな条件下でDNAまたはRNAにハイブリダイゼーションし、そしてsIL-6RおよびIL-6をコードする天然に存在する本質的にすべての配列からなる本発明によるキメラタンパク質をコードするDNAまたはRNAなどの核酸によってコードされる類似体が含まれる。例えば、そのようなハイブリダイゼーションするDNAまたはRNAは、例えば、図3に示す配列を有する本発明の同じタンパク質をコードするDNAまたはRNAであり得る。しかし、そのようなDNAまたはRNAは、そのヌクレオチド配列において、遺伝コードの縮重のために天然に由来するヌクレオチド配列と異なる：すなわち、いくらか異なるヌクレオチド配列は、この縮重のために、依然として同じアミノ酸をコードし得る。さらに、上記にも記されているように、アミノ酸変化（欠失、付加、置換）の量は、約30個までのアミノ酸に限定される。そうすることによって、変化が最大量である場合でも、本発明による類似体は、sIL-6R部分において（プロセシング前の）リーダー配列、Ig様ドメイン、サイトカイン受容体のN-およびC-ドメイン、ならびに受容体の前膜領域（C-ドメインと膜貫通ドメインとの間の領域）を本質的に保持し、そしてIL-6部分の本質的にすべてを保持する類似体である。そのような核酸は、それが本発明のキメラタンパク質の機能的活性を保持するポリペプチドをコードするかどうかを調べるための第1の候補である。用語「ストリンジェントな条件」は、当業者が従来的に「ストリンジェント」と呼ぶハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件を示す。オースベルら（Ausubel et al）、「分子生物学の最新プロトコル」（Current Protocols in Molecular Biology）、前出、インターサイエンス（Interscience）、ニューヨーク、6.3および6.4パラグラフ（1987年、1992年）；およびサムブロックら（Sambrook et al）、前出を参照のこと。限定ではないが、ストリンジェントな条件の例には、研究されたハイブリッドの計算されたTmよりも12℃〜20℃低く、例えば、2×SSCおよび0.5％SDSで5分間、2×SSCおよび0.1％SDSで15分間の洗浄条件；37℃で30分間〜60分間の0.1×SSCおよび0.5％SDS、次いで68℃で30分間〜60分間の0.1×SSCおよび0．5％SDSでの洗浄条件が含まれる。当業者は、ストリンジェントな条件はまた、DNA配列の長さ、オリゴヌクレオチドプローブの長さ（10塩基〜40塩基など）、または混合したオリゴヌクレオチドプローブに依存することを理解している。混合したプローブが使用される場合、SSCの代わりに、塩化テトラメチルアンモニウム（TMAC）を使用することが好ましい（前出のオースベル（Ausubel）を参照のこと）。
【００７３】
本明細書中の用語「塩」は、本発明のキメラタンパク質またはその類似体のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を示す。カルボキシル基の塩は、この分野で知られている手段によって形成させることができ、無機塩、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、鉄塩または亜鉛塩など、および例えば、トリエタノールアミン、アルギニンまたはリシン、ピペリジン、プロカインなどのアミンを用いて形成されるような有機塩基との塩を包含する。酸付加塩には、例えば、塩酸または硫酸などの鉱酸との塩、および例えば、酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩が含まれる。当然、任意のそのような塩は、本発明のキメラタンパク質または類似体に実質的に類似する活性を有しなければならない。
【００７４】
本発明はまた、本発明の上記のキメラタンパク質およびその類似体をコードするDNA配列、ならびに適切な哺乳類、好ましくは、ヒトの細胞における発現を行うためにそのようなDNA配列を担持するDNAベクターに関する。本発明のベクターの態様は、プラスミドpcDNAsIL-6R/IL-6であり、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下にsIL-6R/IL-6融合配列を含有するpcDNA3ベクター（インビトロゲン社（Invitrogen））からなる。
【００７５】
本発明はまた、本発明の上記のタンパク質を発現し得る形質転換された哺乳類、好ましくはヒトの細胞に関する。そのような形質転換細胞の態様は、pcDNAsIL-6R/IL-6によってトランスフェクションされ、融合sIL-6R/IL-6キメラを85kDaの糖タンパク質として分泌するヒトの胚性腎臓細胞293（HEK293、ATCC CRL1573）である。
【００７６】
さらなる態様は、プラスミドpcDNAsIL-6R/L/IL-6であり、10個のアミノ酸をさらにコードする短いリンカーのEcoRI部位での挿入によって、上記のpcDNAsIL-6R/IL-6と異なる。多数の様々な長さの異なる配列を、sIL-6RとIL-6との間の距離を最適にするために導入することができる。
【００７７】
本発明また、（図11に示されているように）IL-6部分がsIL-6Rに先行するキメラタンパク質を含む。
【００７８】
本発明はまた、本発明のキメラタンパク質またはその類似体の産生および精製を行うための方法に関し、上記の形質転換細胞を、キメラタンパク質産物の発現および培養培地へのその分泌に適する条件下で増殖させること、次いで、下記の実施例2および実施例5において記載されているように抗sIL-6Rモノクローナル抗体34.4を使用するイムノアフィニィティークロマトグラフィーによって、分泌されたタンパク質を精製することからなる。
【００７９】
本発明はまた、活性成分としてsIL-6R/IL-6キメラまたはその類似体またはその混合物またはその塩と薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤からなる医薬組成物に関する。本発明の薬学的組成物の態様には、強化されたIL-6型の作用のため、がんの治療のため、骨髄移植のため、造血の強化、特に、血小板新生のため、神経学的症状の治療のため、肝臓障害の治療のため、およびIL-6または関連サイトカインの他の適用のための医薬組成物が含まれる。
【００８０】
本発明の医薬組成物は、キメラタンパク質またはその類似体を、生理学的に許容しうる担体および／または安定化剤および／または賦形剤と混合することによって投与するために調製され、そして例えば、投薬バイアルで凍結乾燥することによる投薬形態で調製される。投与方法は、類似する薬剤の受容可能な投与様式のいずれかによって行うことができ、処置され得る症状に依存し、例えば、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所的注射または局所的適用によって、あるいは注入により連続的に行われる。投与され得る活性化合物の量は、投与経路、治療され得る疾患、および患者の状態に依存する。例えば、局所注射には、体重基準で、静脈内注入よりも少ない量のタンパク質が必要である。
【００８１】
本発明はまた、がんの治療、骨髄移植、造血、特に、血小板新生の増大、神経学的症状の治療、化学薬品（例えば、四塩化炭素、アルコール、パラセタモール）または他の原因（例えば、ウイルス、手術）による壊死性疾患の患者における肝臓組織の保護、そしてIL-6または関連サイトカインの他の適用のための本発明のキメラタンパク質またはその類似体またはその混合物の使用に関する。同様に、本発明はまた、上記の疾患を治療するための医薬、あるいは上記の適用症において使用される医薬を調製する際に使用されるキメラタンパク質またはその類似体またはその混合物に関する。
【００８２】
上記の治療方法に加えて、該キメラおよび／またはキメラタンパク質をコードするDNAによるエクスビボ手順および遺伝子治療もまた意図される。
【００８３】
本発明を、次に、下記の非限定的な実施例および添付した図面において、より詳しく説明する。
【００８４】
実施例 1 ： sIL-6R δ Val/IL-6 キメラ発現ベクターの構築
図1に、sIL-6RδVal/IL-6キメラタンパク質をコードする配列を保持する発現ベクターを構築するために採用した工程の概略のフローダイヤグラムを、様々な出発ベクターと中間ベクター、様々な試薬および反応段階を含めて示す。この構築法では、基本的に、当技術分野でよく知られている、所望の発現ベクターを構築するための技術を使った（例えばサムブルックら（Sambrook et al）（1989年）を参照されたい）。その方法は、簡単に述べると次のとおりである。
【００８５】
ヒト乳がんT47D細胞から得られるcDNAのライブラリーをラムダ（λ）gt11バクテリオファージにクローニングし、ヤマサキら（Yamasaki et al）（1988年）のIL-6R配列に由来するオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングした。全ヒトIL-6Rコード配列を持つ一つのλgt11 cDNAクローンを単離した。そのインサートをEcoRIでλgt11から切り出し、大腸菌ファージミドBlue Script pBS/SK（ストラタジーン クローニング システム社（Stratagene Cloning Systems）・カリフォルニア州ラホーヤ）のマルチプルクローニングサイト（MCS）にクローニングした。このプラスミドpBS/SK-IL-6R（図1）をEcoRIで切断し、次にそれを平滑末端化し、EcoRVで再切断することにより、IL-6RのEcoRV部位（位置1203）で終わる959塩基対（bp）のIL-6Rの5'断片を単離した。アガロースゲル電気泳動から抽出したこの断片を、MCSのEcoRVで開環した新しいpBS/SKベクターにクローニングした（図1のｐBS/SK-sIL-6R-RV）。
【００８６】
上述の、先に得たpBS/SK-IL-6R DNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）にかけて、順方向プライマー1137-1156と逆方向プライマー1505-1488の間の368bp断片を増幅した。IL-6Rのバリン-356残基はヒト尿中に排泄される天然の可溶性sIL-6Rのカルボキシ末端アミノ酸であることが既に決定されているのでノビックら（Novick et al）、1990年；オーら（Oh et al）、1996年；同所有権者の米国特許第5,216,128号および欧州特許EP413908B1）、逆方向プライマーは、このバリン残基のコドンの直後にEcoRI部位を持つように合成した（図1参照）。そのPCR産物をEcoRVとEcoRIで切断し、pBS/SK-sIL-6R-RV中、IL-6RのEcoRV部位とMCSのEcoRI部位の間に連結した（図1）。次に、MCSのHindIII部位をIL-6Rの塩基対410にあるNcoI部位と連結（どちらの部位もまず平滑末端化する）することによって、5'非翻訳配列が取り除かれるようにプラスミドpBS-sIL-6R-δVal--RIを短縮して、pBS-sIL-6R-δVal-RI-NcoIを得た（図1）。
【００８７】
IL-6配列はプラスミドpKKβ2-7から得たが、このプラスミドは、既に記述されているように（チェンら（Chen et al）、1988年）、EcoRI部位を持ち、その後ろにメチオニンコドンとIL-6のプロリン-29のコドンが続き、BstNI（EcoRII）部位で終わっている合成オリゴヌクレオチドを用いて、大腸菌発現ベクターpKK223-3（ファルマシア社（Pharmacia）・スウェーデン国ウプサラ）にBstNI切断IFN-β2/IL-6 cDNA（ジルベルステインら（Zilberstein et al）、1986年）を挿入することによって構築された。pKKβ2-7のIL-6 cDNAインサートはNlaIV部位中の終止コドンの7塩基対後ろで終わり、その11bp後ろにpKK223-3ベクターのHindIII部位が続いている（図1）。そのpKKβ2-7 DNAをHindIIIで切断し、平滑末端化し、EcoRIで再切断し、そのIL-6 cDNAを、IL-6の成熟配列（プロリン-29から始まる）がIL-6Rのバリン-356の直後に3コドン（Glu-Phe-Met）分だけ離れて融合されるように、pBS-sIL-6R-δVal-RI-NcoIに挿入した。次に、得られたプラスミドpBS/SK-sIL-6R/IL-6（図1）をそのMCSのSalI部位とNotI部位で再切断し、そのインサートをpcDNA3（インビトロゲン社（Invitrogen）・カリフォルニア州サンディエゴ）にクローニングした。得られたプラスミドpCDNA3-sIL-6R/IL-6（図1）は、強力なサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの下流にあって、sIL-6RδVal/IL-6キメラの効率のよい転写を保証するポリアデニル化部位が続いているインサートを含有する。このキメラにおけるsIL-6Rの5'末端の変換により、哺乳類細胞での発現時に、そのキメラタンパク質のN末端のシグナルペプチド機能とプロセッシングが天然sIL-6Rの場合と同じになることが保証される。
【００８８】
上に示したように、sIL-6RδVal/IL-6構築物の有利な特徴は、それが基本的にヒトの体内に存在する通りの天然のsIL-6Rと天然のIL-6の融合物であって、余分なポリペプチド配列を持たないことである。しかし、sIL-6RδVal/IL-6構築物（図1）におけるEcoRI部位の変換によって、sIL-6R部分とIL-6部分の間にリンカーポリペプチドセグメントを挿入することが容易になる。sIL-6RのVal-356とIL-6のPro-29の間に導入された13アミノ酸リンカー配列Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Metを持つそのような構築物の一つも構築した（sIL-6RδVal/L/IL-6）。
【００８９】
実施例 2 ：ヒト細胞での sIL-6R δ Val/IL-6 キメラの発現
基本的に標準的な哺乳類細胞培養法、細胞トランスフェクション法、および発現させるべく新たに導入したDNA配列の発現に関するトランスフェクト細胞の分析法を用いて（方法については、例えばサムブルックら（Sambrook et al）（1989年）を参照されたい）、上記プラスミド構築物（実施例1）をヒト細胞にトランスフェクトし、そこでのその発現を評価した。簡単に述べると、次の方法を使用した。
【００９０】
ヒトHEK293細胞（ATCC CRL1573、形質転換初代ヒト胚性腎細胞）にプラスミド構築物pCDNA3-sIL-6R/IL-6 DNA（上記実施例1に記載）をトランスフェクトした。HEK293の対数期培養物をトリプシン処理し、9cmのナンク（Nunc）製プレートに播種した（2.5×106細胞/プレート）。一日後に、10μgのpCDNA3-sIL-6R/IL-6 DNAを使ってCaPO4沈殿法（サムブルックら（Sambrook et al）、1989年）によるトランスフェクションを行ない、その1時間後に培地をDMEM-10%FCSに換え、培養をさらに16時間続けた。培地をDMEM-2%FCSに換えた後、分泌タンパク質をそれぞれ48時間にわたって2回継続して集めた。細胞片を1,000rpmで1分間の遠心分離によって除去し、その上清をポリクローナルウサギ抗sIL-6RとマウスMcAB17.6（ノビックら（Novick et al）、1991年）を用いるsIL-6R用エライザ（ELISA）によって試験した。濃度1.2μg/mlのsIL-6R相当物質が見出され、トランスフェクトされたヒト細胞におけるキメラsIL-6R/IL-6タンパク質の極めて効率のよい発現が示唆された。
【００９１】
分泌キメラタンパク質（sIL-6R/IL-6）の免疫精製を、ヒトsIL-6Rの細胞外ドメイン中のエピトープに特異的なモノクローナル抗体34.4（ノビックら（Novick et al）、1991年；ハリミら（Halimi et al）、1995年）を使って行なった。34.4ハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔で増殖させ、その腹水から硫酸アンモニウム沈殿によって免疫グロブリン（Ig）画分を得た。Affigel-10（バイオ−ラド ラブズ社（Bio-Rad Labs）・カリフォルニア州リッチモンド）を使ってMcAB34.4を固定化した（1mlのAffigel-10に15mgのIgを結合）。pCDNA3-sIL-6R/IL-6をトランスフェクトしたHEK293細胞からの分泌タンパク質を含有する上清をMcAB34.4のカラムに吸着させた（上清15mlにつきカラム0.3ml）。PBSで洗浄した後、結合したタンパク質を25mMクエン酸（pH2.5）で溶出させ、1Mヘペス緩衝液（pH8.5）で直ちに中和し、PBSに対して一晩（約8〜12時間）透析した。
【００９２】
免疫精製したタンパク質のSDS中でのポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析は、クーマシーブルーによって染色される特有のバンドを示した（図2）。そのタンパク質の分子量は、グリコシル化型のsIL-6RδVal（オーら（Oh et al）（1996年）に示されているように60kDa）とグリコシル化IL-6（ジベルステインら（Ziberstein et al）（1986年）に示されているように23〜26kDa）の融合物から予想されるとおり、85キロダルトンだった。sIL-6R/IL-6のアミノ酸配列は543アミノ酸で、その配列からシグナルペプチドのプロセッシング後に524アミノ酸または約58kDaのタンパク質が予想される（図3）。ヒト細胞中で組換えDNAから産生されるsIL-6R/IL-6キメラのサイズがこれよりはるかに大きいことは、糖鎖付加がこの分子のかなりの部分を占めることを示している。
【００９３】
実施例 3 ： sIL-6R/IL-6 キメラは転移性メラノーマ細胞の増殖を停止し、その分化を誘導する
B16メラノーマ細胞由来のF10.9クローンはC57Black/6マウスに転移性の高い腫瘍を形成し、2〜3カ月以内に肺転移でその動物を死亡させる（カッツら（Katz et al）、1995年）。F10.9細胞へのsIL-6R/IL-6キメラタンパク質の添加は、それらの細胞の著しい形態変化と、それらの増殖の停止をもたらす（図4）。このキメラで処理したF10.9細胞は細長くなり、樹状の伸長部分を突き出し、胚性メラノサイトまたは膠細胞の紡錘型（spindloid）分化に似る。
【００９４】
96ウェル-マイクロプレートのウェル中、10%FCSを含む0.2mlのRPMI1640培地に、3×103個の細胞を播種した4日後に、それらの細胞の増殖を定量した。細胞を12.5%グルタルアルデヒド中で30分間固定し、水中で洗浄し、0.1%クリスタルバイオレットで30分間染色した。十分な洗浄と乾燥の後、染色剤を10%酢酸で抽出し、その光学密度を540nmで測定した。本キメラは増殖の用量依存的阻害を引き起こし、10ng/ml程度の低い本キメラ（p85）タンパク質濃度で完全な増殖阻害を起こした（図5）。キメラタンパク質sIL-6RδVal/IL-6とsIL-6RδVal/L/IL-6（sIL-6R部分とIL-6部分の間に、より長いリンカーを持つキメラ；実施例1参照）はどちらも同様に活性だった。上記sIL-6RδVal/IL-6キメラは極めて短い3アミノ酸リンカーしか持たず、一方、上記sIL-6RδVal/L/IL-6はより長い13アミノ酸リンカーペプチドを持つが、どちらも本質的に同じ活性で転移性細胞の増殖を阻害することから、この結果は、キメラ中のsIL-6R部分とIL-6部分の間にあるリンカーペプチドが、このキメラの活性にとって必須でないことを示すことにもなる。これに対しIL-6とsIL-6RδValはどちらも単独ではこれらメラノーマ細胞の増殖を阻害しない（図6）ことから、sIL-6R/IL-6（p85）キメラタンパク質のユニークな活性が証明される。同様の効果を得るには、200〜400ng/mlのIL-6と125ng/mlのsIL-6RδValが必要である（図6）。モル濃度で計算すると、F10.9細胞の最大阻害には、7.5nMのIL-6と2nMのsIL-6RδValが必要であるのに対し、sIL-6R/IL-6キメラは0.12nMしか必要でない。
【００９５】
p85 sIL-6R/IL-6キメラタンパク質の増殖阻害活性をMcAB34.4カラムでの免疫精製中に追跡した（実施例2参照）。活性のパターンは、図2に示すSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の異なる画分に見られるp85バンドの強度と一致した。
【００９６】
実施例 4 ： sIL-6R/IL-6 キメラはヒト骨髄移植細胞の生着に不可欠である
ヒト骨髄から得られる造血幹細胞の生着は重症複合免疫不全（SCID）マウスへの移植後に調べることができる（ボーモールら（Vormoor et al）、1994年）。SCID-NODマウスに亜致死照射を行ない、尾静脈に3×105個のヒトCD34+骨髄細胞を注射した。注射に先立って、精製したCD34+細胞を様々な組み合わせのサイトカインと共に3日間液体培養中に維持した。1カ月後に、それらのマウスを屠殺し、骨を摘出して、骨髄細胞を集めた。SCID-NOD受容マウスにおけるヒト細胞の生着を、ヒトの反復DNAへのサザンブロットハイブリダイゼーションによって評価した。
【００９７】
幹細胞因子（SCF、steel因子またはckitリガンド）とFlt3リガンド（flt3/flk2チロシンキナーゼ受容体リガンド）は、受容者骨髄中で長期生着できる最も原始的な多能性造血幹細胞の生存と増殖にとって重要であることがわかっている（マックケンナら（McKenna et al）、1995年）。図7に示すように、SCID-NOD受容マウスの骨髄におけるヒト細胞の生着を促進するには、これら2つの因子だけでは不十分だった。生着が有意なレベルで検出されるためには、sIL-6R/IL-6キメラタンパク質の添加が必要だった。100ng/mlの濃度で、sIL-6R/IL-6キメラは、単離されたIL-6（50〜200ng/ml）とsIL-6R（125〜1250ng/ml）よりも、はるかに活性だった（図7）。sIL-6R/IL-6キメラを必要とすることは、このタンパク質が、骨髄環境に定着しそこで再増殖できる非拘束（non-committed）多能性造血幹細胞の生存と増殖に不可欠であることを示し、このタンパク質が骨髄移植医療に役立ちうることを示している。
【００９８】
これは、sIL-6R/IL-6キメラが、
（i）因子SCFおよびFlt3リガンドの両方と一緒にヒト造血原始前駆細胞に添加すると、それらの生存と増殖を促進し、
（ii）免疫不全マウスにおけるヒト骨髄移植のインビボモデルで活性である（また、不可欠であるらしい）
という、少なくとも2つの新たに見出された活性を持つことを初めて立証するものである。
【００９９】
実施例 5 ： sIL-6R/IL-6 キメラは高純度の原始造血幹細胞に対して活性である
ヒト臍帯血単核細胞を、フィコール-パーク（Ficoll-Paque）（ファルマシア バイオテク社（Pharmacia Biotech）・スウェーデン国ウプサラ）での低密度単核細胞（NMC）の分画にかけた後、ミニMACSキット（ミルトネイ バイオテク社（Miltney Biotec）・ドイツ連邦共和国ベルギッシュグラトバハ）を使用して、純度80％のCD34+細胞集団を調製した。次に、これらの細胞を固定化抗CD38モノクローナル抗体に通すか、蛍光標示式細胞分取法によって分取して、元の細胞の約0.1%に相当するCD34+CD38-集団を回収した。これらの精製幹細胞（20,000細胞）を、50ng/mlの幹細胞因子（SCF）と100ng/mlのflt3リガンド（FL）（共にアールアンドディー システムズ社（R&D Systems）（ミネソタ州ミネアポリス）製）を含む0.5mlのRPMI培地、10%ウシ胎仔血清（FCS）、1%ウシ血清アルブミンでの懸濁培養にした。それらの培養の半分に100ng/mlのsIL-6R/IL-6キメラを加え、その他はキメラなしで培養した。培養は5%CO2中37℃で6日間行なった。これらインビトロ培養物から得られる細胞全てを亜致死照射NOD-SCIDマウスに注射（静脈内）することによって、骨髄再増殖細胞の数を評価した。それらのマウスを無菌状態に維持した。6週間後にそれらのマウスを屠殺し、その長骨の骨髄を回収した。それらの骨髄（BM）細胞を、30%FCS、50μMβ-メルカプトエタノール、50ng/ml SCF、5ng/ml IL-3、5ng/ml GM-CSF、6単位/mlエリスロポエチン（全てアールアンドディー システムズ社（R&D Systems））を含む半流動性0.9%メチルセルロースプレートに播種した。これらの培養はヒト血清も含有した（マウスコロニーの増殖を防ぐ条件）。その結果（表IV）は、上記懸濁培養にsIL-6R/IL-6キメラを添加すると、SCFおよびFLだけの場合と比較して、被移植マウスから回収されるヒトコロニー形成細胞（CFU）の数が30〜50倍増加することを示した。これは、第6日に懸濁培養中に存在するSCID再増殖幹細胞の数が第0日と比較して著しく増加したことを表す。sIL-6R/IL-6キメラが存在しない場合、SCFとFLは、6日間の懸濁培養中に幹細胞数の増加をもたらさなかった。被移植NOD/SCIDマウスから回収されるBM細胞のDNAを実施例4と同様にサザンブロットによって分析した。キメラと共に培養した細胞をマウスに与えた場合、回収されるヒトDNAの量はキメラなしの場合と比較して10倍高かった。
【０１００】
表IVに示すようなNOD/SCIDマウスの骨髄から得られるCFU前駆細胞は、移植に先立ってヒト血球をsIL-6R/IL-6キメラと共に培養した場合にのみ、異なる骨髄系譜（マクロファージと顆粒球）ならびに赤血球系譜とリンパ系譜（例えばCD19+、CD56+）の造血細胞をもたらす。
【０１０１】
【表４】
さらに、臍帯血CD34+CD38+集団に対するsIL-6R/IL-6の効果を、高純度CD34+CD38-幹細胞に対するその効果と比較する実験を行なった。高純度細胞のインビトロ増殖は、sIL-6R/IL-6によって、低純度細胞のインビトロ増殖よりも、はるかに強く増強された（表V）。これは、最も原始的な幹細胞が細胞増殖に対するsIL-6R/IL-6効果の優先的標的であることを示している。
【０１０３】
【表５】
骨髄再増殖活性のインビトロでの持続性を、NOD/SCIDマウスに注射する前の高純度CD34+CD38-幹細胞の懸濁培養期間を延長することによって測定した。生着は、培養細胞を静脈内注射した6週間後の受容マウスの骨髄におけるヒトDNAの割合によって評価した。培養中にsIL-6R/IL-6をSCFとFLに加えた場合は、2週間の培養後でもなお高い生着性（＞1%ヒトDNA）が観察され、その生着性は非培養細胞の場合より高かった。これに対し、SCF、FL、GM-CSF、IL-3を含む培養物を使った実験では、1週間の培養後にはSCID再増殖細胞は残存しないことが示されている（バータ、エムら（Bhata,M. et al）、ジェイ エクス メド（J.Exp.Med.）186,619-624,1997）。
【０１０５】
これらの結果は、sIL-6R/IL-6が、受容者骨髄での生着が可能なヒト原始幹細胞の増殖と維持を可能にすることを示している。それら幹細胞は増殖しながら非分化状態で活性を保つ。sIL-6R/IL-6キメラは、生着性造血細胞を培養するための新しい手段になる。これにより、遺伝子治療のプロトコルでレトロウイルスベクターを使って生着性幹細胞に遺伝子を導入することが可能になる。今までこれはヒト幹細胞では可能でなかった。なぜなら、これらの原始細胞は、レトロウイルスDNAの組込みに必要とされるような細胞周期進行状態ではインビトロで維持することができなかったからである。sIL-6R/IL-6キメラはこの問題を解決する。
【０１０６】
実施例 6 ： CHO 細胞での IL-6R/IL-6 キメラの生産
図1に示すプラスミドsIL-6R/IL-6 pcDNA3のDNAを、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞に、モリーら（Mory et al）（DNA 5,181-193,1986）に記述されているようなプラスミドpDHFRのDNAと共に同時トランスフェクトした。50nMメトトレキセート中で増殖するトランスフェクタントのうち、クローンL12-[IL-6R/IL-6]を分離した。このクローンは継代培養を数多く繰返しても安定であることがわかり、半集密的培養物は通例、培養培地に2.5μg/ml量のIL-6R/IL-6キメラを分泌する。
【０１０７】
IL-6R/IL-6キメラを精製するために、2%ウシ血清でのクローンL12培養によって得た3.25リットルの培地を200mlに濃縮した。これを、既述のごとく（ノビックら（Novick et al）、ハイブリドーマ（Hybridoma）10,137-146,1991）、Affigel-10ビーズに結合した抗ヒトsIL-6Rモノクローナル抗体34.4の18mlカラムに吸着させ、溶出した。25mMクエン酸溶出液を1 ヘペス緩衝液（pH8.6）で直ちに中和した。それらのタンパク質を10kDaカットオフアミコン（Amicon）製メンブレンで1mg/mlの最終濃度まで濃縮した。SDS-PAGEを行なうと、IL-6R/IL-6キメラに相当する85kDaの単一バンドが観察された。糖鎖付加はグリコシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社（Boehringer-Mannheim））による処理後のサイズ減少によって証明された。CHO産生IL-6R/IL-6キメラの生物学的活性は、4℃で少なくとも5ヶ月間は安定であることがわかった。通例、保存は-70℃で行なう。
【０１０８】
実施例 7 ： gp130 に対する IL-6R/IL-6 キメラの親和力
CHO産生IL-6R/IL-6キメラと、ヒトIL-6およびヒトsIL-6Rの混合物とを、IL-6の受容体系の第二鎖である可溶型gp130（sgp130）へのそれらの結合について比較した（背景の項参照）。マイクロタイター96ウェルプレート（ナンク社（Nunc））を抗ヒトgp130モノクローナル抗体でコーティングし、50ng/mlのsgp130を加えた（どちらの試薬もアール アンド ディー システムズ社（R&D Systems）（ミネアポリス）製）。リン酸緩衝食塩水中で洗浄した後、IL-6R/IL-6キメラを異なるウェルに0.1〜50ng/mlの範囲の様々な濃度で添加した。別のウェルに、rhuIL-6（アレス-セロ社（Ares-Serono）・ジュネーブ）を500ng/mlの濃度で、濃度2〜500ng/mlのヒトsIL-6RδValと共に加えた。4℃で一晩インキュベートした後、ウサギポリクローナル抗IL-6R（オーら（Oh et al）、サイトカイン（Cytokine）,8,401-409,1996）を加え、さらにセイヨウワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ウサギIgを加えて、それを着色反応（シグマ社(Sigma)・セントルイス）で検出した。図8は、その結果のスキャッチャードプロット（Scatchard plot）を示す。gp130に対するIL-6R/IL-6キメラの親和力は、別々に加えたその分子の2つの部分よりも4倍以上高い（6.3×10-11M対2.6×10-10M）ことがわかった。この結果は、メラノーマと造血細胞に対するこのキメラの活性がIL-6＋sIL-6Rの組み合わせより高いことと一致しており、またその説明になっている（図9と実施例4）。
【０１０９】
実施例 8 ： IL-6R/IL-6 キメラは肝毒性から保護する
マウスへの四塩化炭素（CCl4）注射は、その動物の死につながる重篤な肝臓の壊死をもたらす（スラター ティー エフら（Slater T.F. et al）、フィロス トランス アール ソク バイオル（Philos.Trans.R.Soc.Biol.）311,633-645,1985）。IL-6が遺伝的に欠損したマウス（IL-6-/-）に比較的低用量のCCl4（2〜3ml/kg体重）を腹腔内注射によって与えた場合、24時間時点の致死率は70%前後である（図10）。CCl4の1時間前とCCl4の4時間後にCHO産生IL-6R/IL-6キメラを注射すると、それらの動物が保護され、24時間時点で死亡は認められない。これに対し、同様に注射した遊離のrhuIL-6には効果がない（図10）。IL-6R/IL-6キメラは注射1回あたり2〜3μgの用量で有効であり、これは、無効であったIL-6の用量よりモル比で10倍低い。より高用量のCCl4（例えば図10の3.5ml/kg）でもキメラは保護的であって、死亡率はIL-6の場合またはサイトカインなしの場合よりも低い。どちらも同じCCl4投与を受けたキメラ処置マウスと無処置マウスの間の死亡率の相違はp＜0.01のレベルで有意だった。ヘマトキシリン-エオシン染色した肝切片の組織学的所見から、CCl4が肝組織壊死をもたらし、IL-6R/IL-6キメラがその化学的毒性から肝細胞を保護することが確認された（非掲載）。
【０１１０】
IL-6R/IL-6キメラの応用として、化学物質（例えばアルコールやパラセタモール）または他の原因（例えばウイルス性肝炎）による壊死性疾患を持つ患者の肝組織の保護が考えられる。
【０１１１】
実施例 9 ： IL-6/sIL-6R δ Val キメラの構築と活性
IL-6部分をN末端に持ちsIL-6R部分をC末端に持つキメラ分子を構築した。プラスミドpBS-sIL-6RδValをSau3a（bp 1086）とVal-356の後ろにある停止コドンに続くHindIIIで切断した（実施例1参照）。3つの制限部位、SpeI、SmaIおよびBamHIを含むリンカーを次のように合成した。
【０１１２】
【配列表１】
sIL-6RのこのSau3a部位を、リンカーのBamHIに連結し、Bluescript pBS SKプラスミドのマルチクローニングサイトにクローニングした。IL-6配列は、次のプライマー（開始コドンは下線部）を用いてpKKβ2-7 DNAからPCRによって増幅した。
【０１１４】
【配列表２】
SpeIとHaeIIIで切断したそのPCR産物を上記リンカーのSpeI部位とSmaI部位の間に導入した。内部SmaIを持つもう一つのリンカーBamHI-NcoIを次のように合成した。
【０１１６】
【配列表３】
これを、先のリンカーのBamHIとIL-6R配列のNcoI 1464の間にクローニングした。次に、SmaI 867からNcoI 1464までのIL-6R断片を、第二のリンカーのSmaIとIL-6RのNcoIの間に導入した。得られたキメラDNAを配列決定し、ヒトHEK293細胞で発現させるためにpCDNA3に再クローニングした。このIL-6-IL-6Rキメラ3eのアミノ酸配列を図11に示す（リンカーは下線部）。キメラ3eを抗IL-6モノクローナル抗体でのアフィニティークロマトグラフィーで精製した（ノビックら（Novick et al）、ハイブリドーマ（Hybridoma）8,561-567,1989と同様に実施）。SDS-PAGEでは75kDaバンドが観察された。
【０１１８】
F10.9メラノーマ細胞の増殖を阻害するIL-6-IL-6Rキメラ3eの生物学的活性を図12に示す。50%増殖阻害にはより多くの量が必要であるものの、これは同じ実験でのIL-6R/IL-6キメラ（調製1-3）と比較して明らかに活性である。
【０１１９】
IL-6R/IL-6の2つの突然変異体、すなわちIL-6R/IL-6のIL-6R部分のアミノ酸His-280とAsp-281（図3）をPCR突然変異誘発法でそれぞれSerとValに変えたもの（突然変異体39またはHD）と、さらにAsn-230をAspに変えたもの（突然変異体NHD）とを作製した。図12からわかるように、これら2つの突然変異体はIL-6R/IL-6およびIL-6-IL-6Rキメラと比較してほとんど活性を持たない。分子モデリングによって示されているように（ハリミら（Halimi et al）、1995年）、IL-6Rではこれらのアミノ酸がgp130と相互作用するので、これはsIL-6R/IL-6キメラがこの不可欠な相互作用部位を保存することを証明している。
【０１２０】
IL-6-IL-6Rキメラ3eはIL-6R/IL-6には存在するIL-6Rの免疫グロブリン様ドメインを欠く。しかし、IL-6R/IL-6からこのIgドメインを除去しただけではF10.9細胞に対するその生物学的活性は低下しなかった。gp130へのIL-6-IL-6Rキメラ3eの結合はもう一つのIL-6R/IL-6キメラの約30%だった（非掲載）。この低い結合性はメラノーマ細胞増殖に対する活性が低いことと一致している。
【０１２１】
これらの結果は、リンカーを介したsIL-6Rへの融合によるIL-6カルボキシ末端の遮断が、このような新規キメラで良好な生物学的活性を保存することを証明している。
【０１２２】
［参照文献］
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【図面の簡単な説明】
【図１】 図1（A、B）は、実施例1に詳しく記載されているように、天然の成熟型のプロセシングされた形態のIL-6の配列を伴うVal356残基で終わるsIL-6Rの天然の形態の構造が保存されているキメラタンパク質をコードするキメラDNA分子の構築において使用される様々なベクター、試薬および処理工程を図示する。
【図２】 図2（A、B）は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（A）および生物活性プロファイル（B）によってsIL-6RδVal/IL-6 p68キメラを同定するために行った分析から得られた結果を示す。図2Aには、クーマシー染色したゲルの複製を示す：キメラタンパク質をコードするベクターでトランスフェクションした細胞の培養物から得た分泌タンパク質サンプルを負荷したアフィニティクロマトグラフィーカラムから溶出される免疫精製画分を電気泳動した。図2Bには、アフィニティクロマトグラフィーカラムから溶出される上記の各画分の生物学的活性（F10.9メラノーマ細胞の増殖阻害）を図示する。これらは、実施例2および実施例3において詳しく記載されている。
【図３】 図3は、sIL-6RδVal/IL-6キメラのアミノ酸配列（1文字コード）を示す。図には分子の様々なドメインが示され、これには、実施例1および実施例2に記載されているように、N末端のシグナルペプチド（配列の上部に線を付す）、免疫グロブリン様（Ig様）ドメイン、サイトカイン受容体Ｎドメイン（下線部）、サイトカインCドメイン（配列の上部に線を付す）、および受容体の前膜領域（Cドメインと膜貫通ドメインとの間の領域）（これらはすべて、キメラのsIL-6R部分である）；ならびにキメラの成熟型IL-6部分（下線部）を含む。
【図４】 図4（A、B）は、sIL-6R/IL-6キメラタンパク質による4日間の処置を伴わない培養（A）、およびそのような処置を伴う培養（B）におけるF10.9メラノーマ細胞の写真である。図4Bにおいて、実施例3において記載されているように、sIL-6R/IL-6キメラを用いた処置によってそのような転移性メラノーマ細胞（F10.9細胞）において誘導された形態学的変化が明らかである。
【図５】 図5は、約0.12ng/ml〜約150ng/mlの範囲のキメラ体の様々な濃度でのsIL-6R/IL-6キメラタンパク質によるF10.9メラノーマ細胞の増殖阻害を示す結果を図示する。実施例3に記載されているように、わずかに3アミノ酸のリンカーを有するキメラ体IL-6RIL-6が、13アミノ酸の長いリンカーを有するキメラ体（IL-6RLIL-6）と比較される。
【図６】 図6は、実施例3において記載されているように、F10.9メラノーマ細胞に対する増殖阻害作用がないことを示す結果：IL-6が0ng/ml〜40ng/mlの範囲の濃度にある単離したIL-6単独（空き四角を付けた上部の点線）、およびsIL-6R単独（IL-6濃度が0である縦軸でのすべての曲線の集束点）、ならびにIL-6およびsIL-6Rが様々な濃度、IL-6の濃度は10ng/ml〜40ng/mlの範囲であり、sIL-6Rは、それぞれのIL-6濃度に対して、100ng/ml、200ng/mlおよび400ng/mlの3つの濃度で加えられるが、ともに加えられたときに認められる増殖阻害作用、3つの下部の曲線（空き三角および空き丸を付けた2つの点線ならびに黒四角を付けた実線）を図示する。
【図７】 図7は、実施例4に記載されているように、SCID-NODマウスにおける骨髄移植中のヒト造血幹細胞の十分な移植にsIL-6R/IL-6キメラタンパク質が必要であることを示すサザンブロットのオートラジオグラフの複製である（右側の2つのレーンは、他の必要な因子（SCF、FLT-3）に加えて、sIL-6R/IL-6キメラタンパク質が投与されたマウスを示し、これに対して、左側の3つのレーンは、SCFおよびFLT-3のみ、そしてSCF、FLT-3ならびに単離した、すなわち、非融合のIL-6およびIL-6Rが投与されたマウスを示す）。
【図８】 図8は、IL-6およびsIL-6Rの混合物と比較されるsIL-6R/IL-6キメラの親和性特性のスキャチャード プロット（Scatchard plot）である。キメラ体の値は黒四角で示され、混合物の値は黒菱形で示される。傾きの比は4：1である。
【図９】 図9は、sIL-6R+IL-6の混合物の活性、あるいはsIL-6R（IL-6の非存在）の活性と比較して、F10.9メラノーマ細胞に対するsIL-6R/IL-6キメラの大きな活性を示す。
【図１０】 図10は、肝臓毒性に対するsIL-6R/IL-6キメラの保護を示す。値は4実験の平均を示す。黒四角はIL-6-／−マウスを示し、黒菱形はIL-6が投与されたIL-6-／−マウスを示し、黒星はキメラ体が投与されたIL-6-／−マウスを示す。
【図１１】 図11は、IL-6-sIL-6RδValキメラ3eのアミノ酸配列（1文字コード）を示し、リンカーに下線を付す。
【図１２】 図12は、実施例9に記載されているように、sIL-6R/IL-6キメラ（黒四角）および2つの変異型（Mutt39（HD）−黒菱形、およびMutt（NHD）−明灰色星）と比較して、キメラ3e（暗灰色星）の図9のメラノーマ細胞に対する生物学的活性を示す。
Claims (19)
- グリコシル化可溶性インターロイキン−6受容体（sIL-6R）−インターロイキン−6（IL-6）のキメラタンパク質（sIL-6R/IL-6）であって、sIL-6RとIL-6との融合タンパク質産物を含み、該sIL-6R/IL-6が哺乳類細胞において発現された場合に、sIL-6RおよびIL-6が、天然に存在する配列と同じグリコシル化のパターンを保持し、天然に存在する形態であり、かつ該sIL-6RがIL-6に、直接的にまたはペプチドリンカー分子を介して融合されており、該リンカー分子が、配列E-F-M（Glu-Phe-Met）のトリペプチド、または配列E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M（Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met）の13アミノ酸残基のペプチドである、キメラタンパク質。
- sIL-6RのC末端Val-356とIL-6のN末端Pro-29との間に配列E-F-Mのトリペプチドリンカーを有する本明細書中で指定されるsIL-6RδVal/IL-6であり、かつ配列番号7で示される配列を有する請求の範囲第１項記載のsIL-6R/IL-6キメラタンパク質。
- sIL-6RのC末端Val-356とIL-6のN末端Pro-29との間に配列E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-Mの13アミノ酸ペプチドリンカーを有する本明細書中で指定されるsIL-6RδVal/L/IL-6であり、かつ配列番号7に示される配列を有し、配列番号7の357〜359位間の配列E-F-Mのトリペプチドが、該13アミノ酸ペプチド配列によって置換されている請求の範囲第１項記載のsIL-6R/IL-6キメラタンパク質。
- 前記タンパク質が、インビトロで完全にプロセシングされた形態で哺乳類細胞中で産生される請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のsIL-6R/IL-6キメラタンパク質。
- 前記タンパク質がヒト細胞中で産生される請求の範囲第４項記載のsIL-6R/IL-6キメラタンパク質。
- 前記キメラタンパク質がきわめて悪性ながん細胞の増殖の阻害、骨髄移植におけるヒト造血細胞のインビボでの生着の誘導または肝毒性因子からの肝臓の保護を可能にせしめることを特徴とする請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載のsIL-6R/IL-6キメラタンパク質。
- 前記悪性ながん細胞が、悪性のメラノーマ細胞である請求の範囲第６項記載のsIL-6R/IL-6キメラタンパク質。
- 請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載のsIL-6R/IL-6キメラタンパク質をコードするDNA。
- 請求の範囲第８項記載のDNAを含むDNAベクターであって、哺乳類細胞における前記キメラタンパク質の発現に適しているDNAベクター。
- 前記ベクターが、ヒト細胞における前記キメラタンパク質の発現に適している請求の範囲第９項記載のDNAベクター。
- 前記ベクターが前記細胞で発現された場合、発現されたキメラタンパク質が、該細胞によるキメラタンパク質の完全なプロセシングおよび完全にプロセシングされたキメラタンパク質の、該細胞から該細胞が培養されている培地への分泌を可能にする配列を有してなる請求の範囲第９項または第１０項記載のDNAベクター。
- 前記ベクターによって担持されるsIL-6R/IL-6キメラタンパク質を発現でき、発現された該タンパク質を完全にプロセシングでき、該細胞が培養されている培地へと分泌できる請求の範囲第９項〜第１１項のいずれかに記載のDNAベクターを含む、形質転換された哺乳類細胞。
- 発現に適切な条件下で請求の範囲第１２項記載の形質転換細胞を培養すること、前記タンパク質をプロセシングしかつ該細胞が培養されている培地へ分泌させること、ならびに該培地から該タンパク質を精製することからなる請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載のキメラタンパク質を産生するための方法。
- 前記精製がsIL-6Rに特異的なモノクローナル抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーにより行なわれる請求の範囲第１３項記載の方法。
- 請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載のsIL-6R/IL-6キメラタンパク質、その塩、またはそれらの混合物を含むエクスビボにおけるがん細胞の阻害剤。
- 前記がん細胞がきわめて悪性なメラノーマ細胞である請求の範囲第１５項記載の阻害剤。
- 有効成分として請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載のsIL-6R/IL-6キメラタンパク質、その塩もしくはそれらの混合物、または請求の範囲第８項記載のDNA、ならびに薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
- 哺乳類がん細胞の阻害により哺乳類のがんを治療するため、骨髄移植におけるヒト造血細胞の生着を誘導することにより骨髄移植を増進するため、造血を増加させるため、肝臓もしくは神経学的障害を治療するため、またはIL-6もしくはsIL-6Rが使用される他の適用のための医薬組成物を調製するための請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載のsIL-6R/IL-6キメラタンパク質、その塩もしくはそれらの混合物、または請求の範囲第８項記載のDNAの使用。
- 前記哺乳類がん細胞がきわめて悪性なメラノーマ細胞である請求の範囲第１８項記載の使用。
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