JPH05500806A

JPH05500806A - Ｇｍ―ｃｓｆ及びｉｌ―３を含む融合タンパク質

Info

Publication number: JPH05500806A
Application number: JP2513381A
Authority: JP
Inventors: カーティス，ベンソン・エム; パーク，リンダ・エス; コスマン，デービッド・ジェイ
Original assignee: イミュネックス・コーポレーション
Priority date: 1989-08-22
Filing date: 1990-08-14
Publication date: 1993-02-18
Anticipated expiration: 2015-12-04
Also published as: DE69007975T2; DK0489116T3; JP3115318B2; EP0489116A1; WO1991002754A1; FI920764A0; AU632372B2; DE69007975D1; ATE103932T1; NO920703L; NO301888B1; DD297188A5; AU6424090A; NO920703D0; EP0489116B1; ES2055445T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＧＭ−Ｃ５Ｆ及びＩＬ−３を含む融合タンパク質発明の背景本発明は、一般的にはＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＴＬ−３タンパク質の類似体に関し、特にＧＭ−Ｃ８Ｆ及びＩＬ−３を含む融合タンパク質の構築に関する。

造血細胞の分化及び増殖は、コロニー刺激因子類（Ｃ３Ｆｓ）として、総体的に知られている分泌糖タンパク質によって制御されている。ヒトでは、これらのタンパク質は、正常骨髄からの顆粒球及びマクロファージの生産を増進し、かつ成熟、分化した顆粒球及びマクロファージの活性を制御すると思われる顆粒球−マクロファージＣ５Ｆ　（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）を含む。ＩＬ−３（多能−Ｃ３Ｆとしても知られている）もまた、顆粒球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、巨核球及び赤血球を含む広範な造血細胞の形成を刺激する。このようにＧＭ−ＣＳ　Ｆ及びＩＬ−３は、その広範な生物活性の点でかなり重複している。その他のＣ８Ｆ類はもっと限定された範囲の活性を有しており、マクロファージＣ３Ｆ（Ｍ −Ｃ３Ｆ）はほとんどマクロファージコロニー形成のみを刺激し、そして顆粒球Ｃ５Ｆ　（Ｇ−Ｃ３Ｆ）は主として顆粒球コロニーを刺激する。ＧＭ−Ｃ３ＦとＩＬ−３とは異なるアミノ酸配列を有しているが、前臨床的研究によれば、これらは各種の血球減少症の治療、感染性病原菌に対する免疫応答の増加、ウィルス感染、或いは放射線照射又は化学療法誘導性の造血細胞抑圧に続（、正常血液細胞数の再構築における補助として用い得ることを示唆している。ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３をコードする遺伝子はマウス及びヒトでは同じ染色体上に位置しており、これらの遺伝子の発現は活性化Ｔリンパ球のような、ある種の細胞と関連している［Ｋｅｌｓｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３６：１７１８．１９８６；　Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ　７１F９５８．１９８８；　Ｂａｒｌｏｗ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　６：６１７．１９８７］。

短期間の実験によれば、ラクトフェリン（ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）−処理したマウスにおけるｉｎ　ｖｉｔｒｏで、骨髄造血前駆細胞の循環率及び数を増加する点において、ＧＭＣ３Ｆ及びＩＬ−３の同時組み合わせは、ＧＭ−Ｃ３Ｆ又はＩＬ−３のいずれか単独よりも効果的であることが示された［Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ　ｅｔａｌ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：３８７１．１９８７］。ＧＭ−Ｃ５Ｆ及びＩＬ−３のｉｎ　ｖｉｖｏにおける同時投与でこのような相乗効果が観察されたことはないが、臨床研究では正常ンノモルカス（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）モンキーの白血球細胞数を増加する点において、組み換えヒトＩＬ−３と組み換えヒトＧＭ−Ｃ８Ｆとの連続的投与は、ＧＭ−Ｃ３Ｆ又はＩＬ−３のいずれか単独よりも効果的であることが示された［Ｋｒｕｍｗｉｅｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｉｎ５ｔ、　Ｍｉｔｔ、　８３：２５０．１９８８；　Ｄｏｎａｈｕｅ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４１：１８２０．１９８８］。

ＧＭ−Ｃ８Ｆ及びＴＬ−３の生物活性は、−次（ｐｒｉｍａｒｙ）細胞及びｉｎ　ｖｉｔｒ○細胞系て発現される特定の細胞表面レセプターに結合することによって仲介される。ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３の各々は、それぞれのレセプターと結合し、各種の免疫エフェクター細胞に生物シグナルの形質導入をもたらす。

ヒト骨髄性白血病細胞系ＫＧ−１及びヒト前−Ｂ細胞系ＪＭ−１上にある、ＩＬ −３のレセプターの特徴及び分布についての最近の研究では、ＧＭ−Ｃ３Ｆとも結合するレセプターのサブクラスが存在することを示している［Ｐａｒｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ。２６４：５４２０．１９８９］。これらの研究においては、”　Ｉ　−Ｉ　Ｌ−３（７）ＫＧ−１細胞への結合を、ヒｌ−ＧＭ−Ｃ３Ｆがほとんど完全に阻止することができ、また逆に１２５Ｉ−ＧＭ−Ｃ３Ｆの同細胞への結合を、ＩＬ−３が実質的に阻止することができることを示した。１個の細胞表面レセプターに対するＧＭ−Ｃ８ＦとＩ　Ｌ　−３との間の直接的競合は、１個のレセプターがＧＭ−Ｃ３ＦとＩＬ−３との両方に結合できることを示している。ＩＬ−３及びＧＭ−Ｃ３Ｆ結合における異種混交が、ＩＬ−３のみと、又はＧＭ−Ｃ８Ｆのみと結合するレセプター分子とは異なるレセプター分子が存在するために因るものなのか、或いはＩＬ−３及びＧＭ−Ｃ８Ｆレセプターが、異なる比率のＩＬ−３及びＧＭ−Ｃ３Ｆ結合タンパク質からなる多サブユニットとして存在するのかについてはまだ明らかではないが、ここではこのレセプターをＧＭ−Ｃ８Ｆ／ＩＬ−３レセプターと呼ぶ。

発明の要約本発明は、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３を含む融合タンパク質である。この融合タンパク質は、以下の式％式％（式中、Ｒ１はＧＭ−Ｃ８Ｆであり、Ｒ２はＩＬ−３てあり：そしてＬはリンカ −ペプチド配列である）からなる群から選択される式を有する。本発明の好ましい面においては、ＧＭ− Ｃ３Ｆ及びｌ−３は、ＧＭ−Ｃ３Ｆ又はＩＬ−３ドメインのいずれの折り畳みをも邪魔しないリンカ−配列を介して連結されている。

本発明の融合タンパク質は、ＧＭ−Ｃ８Ｆ又はＩＬ−３単独、或いはその組み合わせよりも生物活性が高く、かつＩＬ−３に関して、ＩＬ−３又はＧＭ−Ｃ３Ｆレセプターのみを有する細胞系と比較して、ＧＭ−Ｃ８Ｆ／ＪＬ−３レセプターを有する細胞系との有意に高い結合親和性を有している。

図面の簡単な説明図１は、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列である。ヒトＧＭ−Ｃ８ＦのＣ−末端（アミノ酸１−１２７）が、ヒトＩＬ−３のＮ−末端（アミノ酸１３９−２７１）とリンカ−配列（アミノ酸１２８−１３８）を介して連結されている。

図２は、ヒトＩＬ−３／ＧＭ−Ｃ３Ｆ融合タンパク質のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列である。ヒトＩＬ−３のＣ−末端（アミノ酸１−１３３）が、ヒトＧＭ−Ｃ３ＦのＮ−末端（アミノ酸１４９−２７５）とリンカ−配列（アミノ酸１３４〜１４８）を介して連結されている。

図３Ａ−３Ｄは、ＩＬ−３（・）又はＧＭ−ＣＳＦ　（０）単独、或いはＩＬ− ３とＧＭ−Ｃ３Ｆとの組み合わせ（△）と比較して、ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ｌ−３融合タンパク質（ロ）がＢＦＵ−Ｅ　（図３Ａ）　、ＣＦＵ−ＧＭ　（図３Ｂ及び図３Ｃ）及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ　（図３Ｄ）コロニー形成を増強することを示すグラフである。

発明の詳細な説明 “ＧＭ−Ｃ３Ｆ”の語は、天然ヒト顆粒球−マクロファーンコロニーー刺激因子アミノ酸配列（例えば、ＡＴＣＣ５３１５７）と実質的に同様なアミノ酸配列を有し、かつＧＭ−Ｃ５Ｆレセプターに結合することができ、ＧＭ　Ｃ３Ｆレセプターに結合することによって開始される生物シグナルを形質導入し、或いはＧＭ −Ｃ５Ｆに対し７て高められた抗−ＧＭ−Ｃ３Ｆ抗体と交差反応することができるという点において、生物活性であるタンパク質を言う。このような配列は、例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：６２５０．１９８５に開示■ れている。“ＧＭ−Ｃ３Ｆ”の語はまた、天然ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆと共通の生物活性を少なくとも幾つか示すＧＭ−Ｃ８Ｆ分子の類似体を含む。ＧＭ−Ｃ３Ｆ類似体の例は、ヨーロッパ特許公開第２１２９１４号に開示されており、これは酵母宿主中でＧＭ−Ｃ３Ｆの発現を増加するように、不活性化されたＫＥＸ２プロテアーゼ開裂部位を有するＧＭＣ３Ｆ類似体を記載しており、また国際公開８９１０３８８１は、各種グリコリル部位が削除されたＧＭ−Ｃ５Ｆ類似体を記載する。ここに記載する他のＧＭ−Ｃ３Ｆ類似体もＩＬ−３との融合タンパク質の構築に用いることができる。さらに、突然変異誘発に関する当業者には、まだ未公開の、又は未発見の他の類似体もここに記載するようなＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質を構築するのに用いうろことが理解されるであろう。主要グリコジル化部位が除去された特に好ましいＧＭ−Ｃ５Ｆタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、寄託番号ＡＴＣＣ６７２３１（ＧＭ−Ｃ３Ｆ　［Ｌｅｕ”Ａｓｐ”Ｇｌｕ３９（）の下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンヨンに寄託されている。ここでアミノ酸配列を特定するために用いる命名は、タンパク質名のすぐ後のカッコ内に天然型と異なるアミノ酸を表し、またタンパク質名のすぐ前に該タンパク質が関連する種を表す。従って、ｈｕＧＭ−ＣＳＦ　［Ｌｅｕ２３．Ａｓｐ”Ｇｌｕ”］は、アミノ酸２３がロイシン残基に、アミノ酸２７がアスパラギン残基に、そしてアミノ酸２９がグルタミン酸に変更されたヒトＧＭ−Ｃ８Ｆを表す。

“Ｉｎ、−３”の語は、天然ヒトインターロイキン−３アミノ酸配列と実質的に同様なアミノ酸配列を有し、かっＩＬ−３レセプターに結合することができ、又はＩＬ−３レセプターに結合することによって開始される生物シグナルを形質導入し、或いはＩＬ−３に対して高められた抗−Ｉ　Ｌ−３抗体と交差反応することがてきるという点において、生物活性であるタンパク質を言う。このような配列は、例えば、ヨーロッパ特許公開第２７５．５９８号及び第２８２．１８５号に開示されている。“ＩＬ−３”の語はまた、天然ＩＬ−３と共通の生物活性を少なくとも幾つか示すＩＬ−３分子の類似体を含む。ＩＬ−３類似体の例は、ヨーロッパ特許公開第２８２．１８５号に開示されている。本発明に関連してＧＭ −Ｃ５Ｆと融合させることができる特に好ましいＩＬ−３は、ｈｕＩＬ−３［Ｐｒｏ８ＡｓｐＩ５Ａｓｐ７０］　、ｈｕＩＬ−３［５ｅｒ８Ａｓｐ１５Ａｓｐ７０］　、及びｈｕＩ　Ｌ−３［Ｓ　ｅ　ｒ８］を含む。ここで記載する融合タンパク質への導入に適した他のＩＬ−３タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ＡＴＣＣ６７７４７の寄託番号の下にＡＴＣＣに寄託されている。

ここで使用する際、“融合タンパク質”の語は、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３のＣ −末端からＮ−末端への融合を言う。本発明の融合タンパク質は、ＧＭ−Ｃ３ＦのＣ−末端部分がＩＬ−３のＮ−末端部分と融合した構築物、及びＩＬ−３のＣ −末端がＧＭ−Ｃ３ＦのＮ−末端と融合した構築物を含む。特定すれば、本発明の融合タンパク質は、以下の式・ＲＩ　Ｒ２，Ｒ２Ｒ１，ＲＩ　Ｌ　Ｒ２及びＲ２−Ｌ−Ｒ。

（式中、Ｒ１はＧＭ−Ｃ８Ｆであり；Ｒ２はＩＬ−３であり；そしてＬはリンカ −ペプチド配列である）からなる群から選択される式を有する。ＧＭ−Ｃ５Ｆは、ＧＭ−Ｃ５ＦとＩＬ− ３との生物活性を保持する１個のタンパク質を生産するような方法でＩＬ−３と連結される。特定の融合タンパク質構築物は、融合タンパク質中のＧＭ−Ｃ８Ｆ及びＩＬ−３ドメインを配列順に（Ｎ−末端ドメインを最初に特定し、次いでＣ −末端ドメインを特定）挙げることにより命名される。従って、ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３とは、ＧＭ−Ｃ３Ｆとそれに続＜ＩＬ−３（即ち、ＧＭ−Ｃ８ＦのＣ− 末端がＩＬ−３のＮ−末端と連結する）とを含む融合タンパク質を言う。特に記載しない場合には、ＧＭ−Ｃ８Ｆ／ＩＬ−３及びＩＬ−３／Ｇ〜１−Ｃ３Ｆの語は、リンカ−配列が付加された融合タンパク質を言う。同様に、ｈｕＧＭ−Ｃ３Ｆ［Ｌｅｕ２３Ａｓｐ”ＧＩｕ３９］　／ｈｕｌＬ−３［Ｐｒｏ８．Ａｓｐ１５Ａｓｐ７０］は、融合構築物のＮ−末端領域がｈｕＧＭ−Ｃ８Ｆ　［Ｌｅｕ”、Ａｓｐ２７Ｇｌｕ３９］　てあり、そしてＣ−末端領域かｈｕＬＬ−３ＪＰｒｏ８Ａｓｐ１５Ａｓｐ７０っである融合タンパク質を言う。

アミノ酸又は核酸を定義するときに用いる“実質的に同一”の語は、特定の主題の配列、例えば、突然変異体配列が実質的に全長で、かつ図工又は２の配列と１又はそれ以上の置換、削除、又は付加によって異なっており、その正味効果がＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３又はＩＬ−３／ＧＭ−Ｃ５Ｆ融合タンパク質として由来するときのタンパク質の生物活性を保持するものであることを意味する。若しくは、もしも（ａ）ＤＮＡ類似体配列が天然哺乳動物ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＩ、−３遺伝子の実質的に全コーディング領域から由来するか：又は（ｂ）ＤＮＡ類似体配列が（ａ）の配列と匹敵する長さで、緩和な緊縮条件下でこれとハイブリダイゼーションすることができ、かつ生物的に活性なＧＭ−Ｃ３Ｆ又はＩＬ−３分子をコードするものであるか：又は（Ｃ）遺伝子コードの結果、（ａ）又は（ｂ）で定義するＤＮＡ類似体配列に変化したＤＮＡ配列であって、かつ生物的に活性なＧＭ−Ｃ３Ｆ又はＩＬ−３分子をコードするものである場合には、ＤＮＡ類似体配列はここに開示する特定のＤＮＡ配列と“実質的に同一”である。実質的に同一な類似体タンパク質は、天然タンパク質の対応する配列と約８０％以上似ている。より少ない類似性を有するが、比較し得る生物活性を有する配列は、同等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）と考えられる。核酸配列を定義するときには、実質的に同様なアミノ酸配列をコードすることのできる主題の核酸配列は全て、対照の核酸配列と実質的に同様であると考えられる。

例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　ＧｅｎｅｔｉｃＣｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ　（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰＤンビュータープログラム、ｖｅｒｓｉｏｎ６．０を用いて配列情報を比較することにより、類似性パーセントを決定することができる。ＧＡＰプログラムは、Ｓｍ１ｔｈ　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒｍａｎ、　Ａｄｖ、　Ａｐｐｌ、　Ｍａｔｈ、　２：４８２．１９８１によって書き換えられた、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４８：４４３．１９７０のアラインメントメソッド（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ）を用いる。簡単に言うと、ＧＡＰプログラムでは、類似である鎖状の記号（即ち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を、２つの配列の短い方にある全記号数で割ったものを類似性として定義する。ＧＡＰプログラムのための好ましいデフォルトのパラメーターは、（１）ヌクレオチドのための−成分比較行列（ｕｎａｒｙ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｍａｔｒｉｘ）（等恒成分とし、て値１を、非等恒成分として値Ｏを含む）、及びＧｒｊｂｓｋｏｖ　ａｎｄ　Ｂｕｒｇｅｓｓ。

Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：６７４５．１９８６の重みをかけた比較行列［Ｓｃｈｗａｒｔｚ　ａｎｄ　Ｄａｙｈ。

ｆｆ、　ｅｄｓ、　、　Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉ盾高■р奄モ≠戟@ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　ｐｐ、３５３−３５８．１９７９に記載されている］　：　（２）各キャップに３０のペナルティ−と、各キャップ中の各記号には更に０．１０のペナルティー：及び（３）末端キャップにはペナルティ−なし、を含む。

“組み換え”の語はここでは、組み換え体（例えば、微生物又は哺乳動物）発現系に由来するタンパク質を意味する。“微生物的”とは、バクテリア又は菌類（例えば酵母菌）発現系で生産される組み換えタンパク質を言う。生産物として、 “組み換え微生物的”とは、天然の内在物質を本質的に含まない微生物発現系で生産されるタンパク質を言う。大腸菌などのほとんどのバクテリア培養物において発現されるタンパク質はグリカンを含まない。酵母菌において発現されるタンパク質は、哺乳動物で発現されるものとは異なるグリコジル化パターンを有している。

本明細書で用いる“生物的に活性”の語は、ＧＭ−Ｃ３Ｆレセプター、ＩＬ−３レセプター又はＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３レセプターと結合しく例えば、Ｐａｒｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４：５４２０．１９８９参照）　、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及び／又はＩＬ−３刺激を細胞に伝達し、或いはＧＭ −Ｃ８Ｆ又はＩＬ−３に対して高められた抗体と交差反応することができるように、特定の分子が、ここで開示する本発明の態様と十分なアミノ酸配列の類似性を共有していることを意味する。

“ＤＮＡ配列”とは、より大きなりＮＡ構築物の分離断片の形で、又はその成分としてのＤＮＡポリマーを言う。好ましくは、ＤＮＡ配列は、その配列又は成分ヌクレオチド配列の同定、操作、及び回収が、標準的生化学手法、例えばクローニングベクターを用いてなされ得るような量又は濃度におけるものである。このような配列は、好ましくは、真核生物遺伝子に典型的に存在する内部非翻訳化配列、又はイントロンによって邪魔されない読み取り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）の形で提供される。関連する配列を含むゲノムＤＮＡも用いることができる。非翻訳化ＤＮＡの配列け、コーディング領域の操作又は発現を邪魔しないような、読み取り枠からの５′又は３“に存在する。

“ヌクレオチド配列”とは、デオキシヌクレオチドのヘテロポリマーを言う。

本発明で提供されるタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片及び短いオリゴヌクレオチドリンカーから、或いは一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられて、組み換え転写ユニット内で発現され得る合成遺伝子を提供する。

”組み換え発現ベクター“とは、本発明の融合タンパク質をコードし、かつ（１）遺伝子発現で制御的役割を有する遺伝的要素又は要素群、例えばプロモーター又はエンハンサ−１（２）ｍＲＮＡに転写されてタンパク質へと翻訳される、構造又はコーディング配列、及び（３）適当な転写及び翻訳開始及び終止配列、の組み合わせからなる転写ユニットを含む、ＤＮＡを増幅、或いは発現するために用いる、複製可能なりＮＡ構築物を言う。酵母菌発現系で用いる構造要素は、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含むのが好ましい。或いは、組み換えタンパク質がリーダー配列又は輸送配列なしで発現される場合には、Ｎ−末端メチオニン残基を含むことができる。この残基は、後に発現された組み換えタンパク質から任意に切り出して、最終生成物を提供することができる。“組み換え微生物発現系”とは、染色体ＤＮＡ中に組み換え転写ユニットを安定に統合し、或いは常住性（ｒｅｓｉｄｅｎｔ）プラスミドの一成分として組み換え転写ユニットを保持する、適当な宿主微生物、例えば大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のようなバクテリア、又はＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母菌の実質的に同種の単一培養物（ｍｏｎｏｃｕ　Ｉ　ｔｕｒｅ）を意味する。一般的に、系を構成する細胞は、１個の先祖の形質転換細胞からの子孫である。ここで定義する組み換え発現系は、Ｄ　Ｎ　Ａ配列又は発現されるべき合成遺伝子に連結した制御要素の誘導によって、異種タンパク質を発現することができる。

ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３を含む融合タンパク質をコートするｃＤＮＡの構築ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３をコードする別々のＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中に組み合わせる、組み換えＤＮＡ手法を用いて、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を構築する。ＧＭ−Ｃ３ＦをコードするＤ　Ｎ　Ａ断片の３′末端を、単一の生物的に活性な融合タンパク質中へのｍＲＮ、Ａの翻訳を可能にするような読み取り枠と共に、ＩＬ−３をコードするＤＮＡ断片の５゛末端に連結する。

得られるタンパク質は、ｈｕＧＭ−Ｃ３Ｆ　［Ｌｅｕ２３Ａｓｐ”Ｇｌｕ”コ／ｈｕＩＬ−３［Ｐ　ｒ　ｏ８．Ａ　ｓ　ｐ”Ａ　ｓ　ｐ”］である。若しくは、Ｔ　Ｌ−３をコードするＤＮＡ断片の３°末端を、単一の生物的に活性な融合タンパク質中へｍＲＮＡの翻訳を可能にするような読み取り枠と共に、ＧＭ−Ｃ８ＦをコードするＤＮＡ断片の５°末端に連結して、タンパク質ｈｕＩＬ−３［Ｐｒｏ８ＡｓｐＩ５Ａｓｐ７０］／ｈ　ｕＧＭ−Ｃ３Ｆ　［Ｌ　ｅ　ｕ２３Ａ　ｓ　ｐ”Ｇ　１　ｕ”］を製造する。ｍＲＮＡへのＤＮＡの翻訳を担当する制御要素は、２個のＤＮＡ配列のうちの最初のものの上に保持されるが、第２のＤＮＡ配列への読み通しくｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を防ぐ結合シグナル又は停止コドンは削除される。逆に、第２のＤＮＡ配列からは制御要素が削除され、一方翻訳を停止するのに必要な停止コドンは保持される。

本発明の好ましい面においては、ＧＭ−Ｃ８Ｆ及びＩＬ−３ドメインを連結するための手段、好ましくはリンカ−配列を介する手段が提供される。リンカ−配列は、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３ドメインのそれぞれが正しい二次及び三次構造に折り畳まれるように、十分な距離をもって各ドメインを分離する。適当なリンカ −配列は、（１）自在な伸ばされたコンホメーションを採り、（２）機能的ＧＭ −Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３ドメインと相互作用することのできる順序正しい第２の構造を発展させる傾向を示し、そして（３）機能的タンパク質ドメインとの相互作用を推進することのできる最小の疎水性又は荷電性質を有しているであろう。

自在なタンパク質領域における典型的な表面アミノ酸は、ＧＩｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒを含む。Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒを含むアミノ酸配列のいかなる置換もリンカ−配列のための上記基準を満足することが期待される。Ｔｈｒ及び、へ１ａのような他のほとんど中性のアミノ酸もリンカ−配列に用い得る。

リンカ−配列の長さは、融合タンパク質の生物活性に有意な影響を与えずに変えることができる。例えば、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３タンパク質はリンカ−配列なして直接融合することがてきる。融合するタンパク質が、機能的ドメインを分離し、かつ立体障害を防ぐために用いる非本質的Ｎ−又はＣ−末端アミノ酸領域を有している場合には、リンカ−配列は不必要である。本発明の好ましい態様によると、ＧＭ−Ｃ３ＦのＣ−末端がＩＬ−３のＮ−末端に直接融合される。ＧＭ −Ｃ８Ｆは、ジスルフィド結合に関与し、かつタンパク質の正しい折り畳みのために不可欠であるＣ−末端ンスティン残基に続いて６個のアミノ酸を有している。ＩＬ−３はぞのＮ−末端システィン残基の前に１５個のアミノ酸を有している。この組み合わせの末端領域は、リンカ−配列の使用を不必要とする十分な分離を提供する。

一般的に、２つのタンパク質ドメインは、ＧＭ−Ｃ３Ｆ又はＩＬ−３の小ユニツト寸法（即ち、同様な４本−螺旋ホルモンとの類似から決定して、約０．　３８ｎｍ）とほぼ等しい距離で分離される。本発明の好ましい態様では、約１１個のアミノ酸の長さのリンカ−配列が、機能的タンパク質ドメインの適当な分離を与えるのに用いられるが、それよりも長いリンカ−配列でもよい。ＧＭ−Ｃ５Ｆと工Ｌ−３とを分離するリンカ−配列の長さは、１から５００アミノ酸の長さ、より好ましくは１から１００アミノ酸の長さである。本発明の最も好ましい面においては、リンカ−配列は約１−２０アミノ酸の長さである。ここに開示する特定の態様では、リンカ−配列は約５から１５アミノ酸であり、有利には約１０から１５アミノ酸である。ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３のリンカ−として用いられるアミノ酸配列は、例えば、（Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３及びＧｌｙ４ＳｅｒＧ］ｙ、Ｓｅｒである。

リンカ−配列は、以下に記載する公知の標準的突然変異誘発手法で融合タンパク質構築物に導入される。

タンパク質及び類似体本発明はヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３を含む融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質の誘導体は、生物活性を保持する一次タンパク質の各種構造形態をも含む。例えば、イオン化しうるアミノ及びカルボキシル基が存在するために、融合タンパク質は酸性又は塩基性塩、若しくは中性の形でありうる。個々のアミノ酸残基は酸化又は還元によって修飾することもてきる。

グリコノル基、脂質、リン酸、アセチル基などの化学部分との共有結合又は会合複合体を形成することにより、或いはアミノ酸配列突然変異体を作ることにより、アミノ酸の一次構造を修飾することができる。共有結合誘導体は、特定の官能基をアミノ酸側鎖、又はＮ−又はＣ−末端に連結することによって製造できる。

本発明の範囲内における融合タンパク質のその他の誘導体は、Ｎ−又はＣ−末端融合としての組み換え培養における合成のように、融合タンパク質と他のタンパク質又はポリペプチドとの共有結合又は会合複合体を含む。例えば、複合ペプチドは、タンパク質の合成部位から細胞膜又は壁の内部或いは外部にある機能部位へのタンパク質の運搬を同時翻訳的に或いは翻訳後に指示するタンパク質のＮ− 末端領域にあるシグナル（又はリーダー）ポリペプチド配列でありうる（例えば酵母菌ａ−因子リーダー）。ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質の精製又は同定を容易にするためにペプチドを付加することもてきる（例えばポリ−Ｈ１ｓ）。融合タンパク質のアミノ酸配列は、ペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ　（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）と連結することもできる［Ｈｏｐｐ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｋｏｇｙ　６：１２０４．１９８８］　。後者の配列は高度に抗原性で、特定のモノクローナル抗体によって可逆的に結合するエピトープを提供し、発現する組み換えタンパク質の迅速なアッセイと容易な精製とを可能にする。こノ配列は、Ａｓｐ−Ｌｙｓペアの直後の残基において、ウシ粘膜エンテロキナーゼによって特異的に切断される。このペプチドでキャップされた融合タンパク質は大腸菌における細胞内分解に対して耐性でもある。

融合タンパク質はまた、免疫原、レセプターに基づくイムノアッセイの試薬、又は結合リガンドのアフィニティ精製法のための結合剤として用いることもてきる。ンステイン及びリンン残基において、Ｍ−マレイミドベンゾイルスクシンイミドエステル及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような架橋剤を用いて誘導体を得ることもてきる。融合タンパク質はまた、反応性側基を介して、臭化ンアンー活性化、ビスオキシランー活性化、カルボニルシイミダゾールー活性化又はトシル−活性化アガロース構造のような各種の不溶性基質に共有結合させるか、或いは（ゲルタールアルデヒド架橋を伴うか伴わずに）吸着によりポリオレフィンに共有結合させることもできる。

本発明は、関連する天然型のグリコジル化を伴うか伴わないタンパク質をも含む。大腸菌のようなバクテリアにおける融合タンパク質をコードするＤＮＡの発現は、非グリコノル化分子を与える。不活性化Ｎ−グリコノル化部位を有する機能性突然変異体は、オリゴヌクレオチド合成及び連結によって、或いは部位特異的突然変異誘発法によって生産することができる。これらの類似タンパク質は酵母菌発現系を用いて、均質な還元炭化水素の形て好収率で生産される。真核生物タンパク質におけるＮ−グリコノル化部位は、アミノ酸３個組Ａｓｎ−Ａ、−Ｚ（式中、Ａ１はＰｒｏを除くいかなるアミノ酸でもよく、ＺはＳｅｒ又はＴｈｒである）で特徴付けられる。この式において、アスパラキンは炭化水素の共有結合性付加のための側鎖アミノ基を提供する。Ａｓｎ又は残基Ｚを他のアミノ酸で置換するか、Ａ　ｓ　ｎ又はＺを削除するか、或いはＡ１とＺとの間にＺでないアミノ酸を挿入するか、又はＡｓｎとＡ１との間にＡｓｎ以外のアミノ酸を挿入することによって、このような部位を除去することができる。グリコノル化部位が除去されたヒトＧＭ−ＣＳＦ類似体の例は、ｈｕＧＭ−Ｃ３Ｆ　［Ｌｅｕ２３Ａｓｐ２７Ｇ　ｌ　ｕ　３９］　、　ｈｕＧＭ−Ｃ５Ｆ　［Ｌｅｕ”コ　、　ｈｕＧＭ−Ｃ８Ｆ　［Ｌｅｕ”Ａｓｐ”］　、ｈｕＧＭ−Ｃ８Ｆ　［Ｇｌ　ｕ３９］　、ｈｕＧＭ−Ｃ８Ｆ　［Ａｓｐ”Ｇｌ　ｕ３９］、ｈｕＧＭ−Ｃ３Ｆ　［Ｌｅｕ２３Ｇｌｕ３９コ及びｈｕＧＭ−Ｃ３Ｆ　［Ａｓｐ２７］を含む。グリコノル化部位が除去されたヒトＩＬ−３類似体の例は、ｈｕｌＬ−３［Ｐｒｏ８Ａｓｐ　１５Ａｓｐ７０］　、　ｈｕ　ＩＬ−３［Ａｓｐ７０コ　、　ｈｕＩＬ−３ＣＡｓｐ１５Ａｓｐ７０］　、ｈｕＩＬ−３［Ｐｒｏ８Ａｓｐ１５］　、ｈｕＩＬ −３ｒＰｒｏ８Ａ　Ｓ　ｐ　７０］及びｈｕＩＬ−３［Ａｓｐ＋５コを含む。

誘導体及び類似体は、融合タンパク質の突然変異によっても得られる。ここで言及する誘導体又は類似体は、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＴＬ−３ドメインが図１及び２に開示する配列の全長のＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３ドメインと実質的に相同であるが、削除、挿入又は置換によるアミノ酸配列の違いを有しているようなポリペプチドである。

融合タンパク質の生物等価的類似体は、例えば、残基又は配列の各種置換を行うことによって構築される。例えば、ンステイン残基を削除又は他のアミノ酸で置換して、タンパク質再生時の誤った分子内ジスルフィド架橋を防ぐことができる。突然変異誘発への他のアプローチは、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母菌系での発現を増加するために、隣接する二塩基性アミノ酸残基を修飾することを含む。一般に、置換は保存的になされるべきである：即ち、最も好ましい置換アミノ酸は、置換されるべき残基と似た物理化学的性質を有するものである。

同様に、削除又は挿入計画を作成する際には、削除又は挿入が生物活性に及ぼすかも知れない影響を考慮に入れるべきである。

もちろん、類似体の発現のために構築されるヌクレオチド配列中の突然変異は、コーディング配列の読み取り枠桁を保存しなければならず、また好ましくは、ハイブリダイゼーションの結果、ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３レセプタ−ｍＲＮＡの翻訳に逆の影響を及ぼすループやヘアピンのようなｍＲＮＡの二次構造をもたらす、相補的領域を作り出さないようにする。突然変異部位はあらかじめ定められているかも知れないが、突然変異の性質自体はあらかじめ定められている必要はない。例えば、一定部位における突然変異体の最適性質を選択するために、標的コドンでのランダム突然変異誘発を実施し、発現した突然変異体から所望の活性をスクリーニングする。

ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の全ての突然変異体が最終生成物中に発現される訳ではなく、例えば、ヌクレオチド置換は発現を増加するため、主として翻訳されたｍＲＮＡ中の二次構造ループを避けるため［ＥＰＡ７５，４４４Ａ　（参照によりここに包含される）参照コ、又は選択された宿主によってより容易に翻訳されるコドンを提供するために（例えば、大腸菌発現のための大腸菌が好むコドンがよく知られている）行われる。

天然配列の断片と連結させるための制限部位を脇にもつ、突然変異体配列を含む合成オリゴヌクレオチドによって、突然変異は特定の遺伝子座に導入される。

連結後に得られる再構築された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換又は削除を有する類似体をコートする。

若しくは、オリコヌクレオチドー指示部位特異的突然変異誘発法を用いて、所望の置換、削除、又は挿入によって改変された特定のコドンを有する改変された遺伝子を提供することもてきる。上記の改変法の例は、１Ｆａｌｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｇｅｎｅ　４２：１３３．１９８６＋　Ｂａｕｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　３７：７３．１９８５；　Ｃｒａｉｋ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、@Ｊａｎｕａｒｙ　１９８５．１２−１９：　Ｓｍ１ｔ：ｈ　ｅｔ　ａｌ、、、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎп@Ｍｅｔｈｏｄｓ。

Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８１：及び米国特許第４．５１８．５８４号及び４．　７３７゜４６２号（これらは参照によりここに包含される）に記載されている。

ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３を含む組み換え融合タンパク質の発現本発明は、哺乳動物、微生物、ウィルス又は昆虫遺伝子に由来する、適当な転写又は翻訳制御要素と作動的に連結した、ＧＭ−Ｃ８Ｆ及びＩＬ−３を含むヒト融合タンパク質、又は生物等価的類似体をコードする、合成又はｃＤＮＡ−由来の断片を含む組み換え発現ベクターを提供する。このような制御要素は、転写プロモーター、転写を制御する任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮ、Ａリポソーム結合部位をコードする配列、及び以下に詳述する転写及び翻訳の終末を制御する配列を含む。

複製起点、及び形質転換細胞の認識を容易にする選択遺伝子によって通常付与される、宿主中の複製能力を追加的に導入することもできる。ＤＮＡ領域はこれらが互いに機能的に関連しているときには作動的に連結される。例えば、もしもあるシグナルペプチド（分泌リーダー）用ＤＮＡがあるポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現されるならば、そのシグナルペプチドは該ポリペプチド用ＤＮＡと作動的に連結され：もしもあるプロモーターがある配列の転写を制御しているならば、そのプロモーターはコーディング配列と作動的に連結され、又はもしもリポソーム結合部位が翻訳を認めるように位置しているならば、そのリポソーム結合部位はコーディング配列と作動的に連結されている。一般に、作動的に連結される、とは隣接していることを意味し、分泌リーダーの場合には隣接しており、かつ読み取り枠内にあることを意味する。

縮重のために、同じアミノ酸配列をコートするヌクレオチド配列にもかなりの変化が有り得るが；ＤＮＡ態様の例としては、図１又は２に示すヌクレオチド配列に対応するものがある。他の態様は、図１又は２の配列と釣り合う長さで、かつ緩和な緊縮条件下に（５０℃、２　Ｘ　５ＳＣ）該配列とハイブリダイゼーションすることができ、かつ生物活性な融合タンパク質をコードする配列を含む。

形質転換された宿主細胞とは、組み換えＤＮＡ法を用いて構築した融合タンパク質ベクターで形質転換又はトランスフェクションされた細胞である。形質転換された宿主細胞は普通所望の融合タンパク質を発現するが、ＤＮＡのクローニング又は増幅のために形質転換された宿主細胞は必ずしも該タンパク質を発現しない。発現された融合タンパク質は一般に培養上澄みに分泌される。融合タンパク質の発現に適した宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は適当なプロモーターの制御下における高等真核細胞を含む。原核生物は、例えば大腸菌やバチルスなどのグラム陰性又は陽性菌を含む。高等真核細胞は以下に記載する哺乳動物由来の確立された細胞系を含む。本発明のＤＮＡ構築物に由来のＲＮＡを用いる融合タンパク質の生産には、無細胞翻訳系も用いることができる。バクテリア、菌類、酵母菌、及び哺乳動物細胞宿主に用いる適当なりローニング及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｖｔｏｒｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、@Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９８５に記載されており、その関連の記載は参照によりここに包含される。

原核生物発現宿主は、タンパク質分解及びジスルフィド処理をさらに必要としない融合タンパク質の発現に用いる。原核生物発現ベクターは一般に、１又はそれ以上の表現型選択可能マーカー、例えば、抗生物質耐性を付与したり、又は独立栄養要求を与えるタンパク質をコードする遺伝子と、宿主内での増幅を確実にするために宿主によって認識される複製起点とを含む。形質転換用に適した原核生物宿主は、ンユードモナス属（Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ）、　ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及びスタフイロコックス属（Ｓｔａｐｈｙｌ。

ｃｏｃｃｕｓ）の各種を含むが、他の物も選択により用い得る。

バクテリア用の有用な発現ベクターは、選択可能なマーカーと、公知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子要素を含む市販のプラスミドから由来するバクテリア複製起点とを含む。このような市販のベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）及びｐＧＥＭｌ　（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を含む。これらｐＢＲ３２２の ″主力（１）ａｃｋｂｏｎｅ）”部分を適当なプロモーター及び発現すべき構造配列と組み合わせる。大腸菌は典型的には、大腸菌由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　２：９５．１９７７）の誘導体を用いて形質転換される。

ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、これは形質転換細胞を同定する簡単な手段を提供する。

組み換え微生物発現ベクターに通常用いるプロモーターは、ブラクタマーゼ（ペニンリナーセ）及びラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２７５：６１５．１９７８：　Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２８１：５４４．１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　８：４０５７．１９８０　及びＥＰＡ３６．７７６）及びｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ］ｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｏｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ｐ、４１２．１９８２）■■■B 特に有用なハタテリア発現系はファージλＰＬプロモーター及びＣｌ８５７ｔｓ熱誘導性リプレツサーを用いる。λＰＬプロモーターの誘導体を導入したアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能なプラスミドベクターは、大腸菌ＪＭＢ９株に含まれるプラスミドｐＨＵＢ２　（ＡＴＣＣ３７０９２）　、及び大腸菌ＲＲＩ株に含まれるｐＰＬｃ２８　（ＡＴＣＣ５３０８２）を含む。

組み換え融合タンパク質は酵母菌宿主、好ましくはＳ、セレビノアエ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のようなサツカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の宿主中で発現させることもてきる。ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）又はクルーベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のような他の属の酵母菌も用いることができる。酵母菌ベクターは一般に、２ｍ酵母菌プラスミドからの複製起点又は自律的複製配列（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　：ＡＲ８）　、プロモーター、融合タンパク質をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化のための配列及び翻訳末端及び選択遺伝子を含む。好ましくは、酵母菌ベクターは、複製起点、及び大腸菌のアンピンリン耐性遺伝子及びＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｔｒｐｌ遺伝子（これはトリプトファン中で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異体のための選択マーカーを提供する）のような、大腸菌と酵母菌の両方での形質転換を可能とする選択可能マーカー、及び下流の構造配列の転写を誘導するための、高度に発現された酵母菌に由来するプロモーターを含む。か（して酵母菌宿主ケノム甲のｔｒｐｌ障害の存在は、トリプトファンの存在下での成長による形質転換を検出するための効果的な環境を与える。

酵母菌ベクター中の適当なプロモーター配列は、メタロチオネイン用プロモーター、３−フォスフォグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５５：２０７３．１９８０）又は他の解糖酵素（Ｈｅｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、　７：１４９．１９６８：　Ｈｏ１ｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７：４９００．１９７８）　、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデ力ルボキンラーセ、フォスフオフルクトキナーゼ、グルコース−６−フオスフエー１−イソメラーゼ、３−フォスフォグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースフォスフェートイソメラーゼ、フォスフオグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼを含む。酵母菌発現に用いる適当なベクター及びプロモーターはＲ，Ｈｉ　ｔｚｅｍａｎら、ＥＰＡ７３．６５７にさらに記載されティる。

好ましい酵母菌ベクターは、大腸菌中での選択及び複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐ’遺伝子及び複製起点）、及びグルコース−抑制性ＡＤＨ２プロモーターとα−因子選択リーダーとを含む酵母菌ＤＮＡ配列を用いて組み立てることができる。ＡＤＨ２プロモーターは、Ｒｕ５ｓｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５８：２６７４．１９８２及びＢｅ１ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３００ニア２４．１９８２に記載されている。異種タンパク質の分泌を指示する酵母菌σ−因子リーダーを、プロモーターと発現すべき構造遺伝子との間に挿入することができる。例えば、Ｋｕｒｊａｎ　ｅｔａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　３［１：９３３．１９８２：及びＢｉｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、@ＵＳＡ　８１：５３３０、１９８３を参照されたい。リーダー配列と外来遺伝子との融合を容易にするために、その３′末端近くに１個又はそれ以上の有用な制限部位を含むようにリーダー配列を修飾することができる。

酵母菌形質転換に適した方法は当業者に公知であり、例示的方法は１ｉｉｎｎｅｎ　ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５：１９２９．１９７８に記載されており、これは０６７％酵母窒素塩基、０．　５％カサミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニン及び２０＝ｇ／ｍｌウランルからなる選択培地中でＴｒｐ−形質転換体を選択する。

Ａ　Ｄ　Ｈ２プロモーターを含むベクターで形質転換された宿主株は、８０μｇ／ｍ１アデニン及び８０μｇ／ｍｌウラシルを補充した、１％酵母ニギス、２％ペプトン、及び１％グルコースからなる栄養培地中で、生育させて発現させることができる。ＡＤＨ２プロモーターの脱抑制は培地のグルコースを使い尽くしたときに起きる。粗酵母菌上澄みを濾過によって回収し、次の精製前に４°Ｃで保持する。

組み換えタンパク質を発現させるために、各種の哺乳動物又は昆虫細胞培養系を用いることができる。昆虫細胞中で異種タンパク質を生産するためのバキュロウィルス系が、Ｌｕｃｋｏｗ　ａｎｄ　Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：４７．１９８８に記載されている。適当な哺乳動物細胞系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｃｅ１ｌ　２３：１７５．１９８１に記載のサル腎臓細胞のＣＯ３−７系を含み、適当なベクターを発現させることのできる他の細胞系は１例えばＬ細胞、Ｃ１２７，３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）　、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞系を含む。哺乳動物発現ベクターは、複製起点のような非−転写要素、適当なプロモーター及び発現すべき遺伝子に連結したエンハンサ−１及び５゛又は３°フランキング非転写配列、及び５゛又は３゜非翻訳配列、例えば必要なリポソーム結合部位、ポリ−アデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプタ一部位、及び転写終結配列を含むことができる。

を椎動物細胞を形質転換するのに用いる発現ベクター中の転写及び翻訳制御配列は、ウィルス源のものを用いることができる。例えば、通常用いられるプロモーター及びエンハンサ−は、ポリオーマ、アデノウィルス２、シミアン′ウィルス４０　（ＳＶ４０）　、及びヒトサイトメガロウィルスに由来する。例えば、ＳＶ４０ウィルスケツム由来のＤＮＡ配列、Ｓ　Ｖ　４０オリジン、初期及び後期プロモーター、エンハンサ−、スプライス、及びポリ−アデニル化部位が、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝子要素を提供するために用いられる。初期及び後期プロモーターは特に有用である。何故ならば、これらはいずれもＳＶ４０ウィルス複製起点をも有する断片としてウィルスから容易に得られるからである（Ｆｉｅｒｓｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２７３：１１３．１９７８）。ウィルス複製起点に位置するＨｉｎｄｌＩ［部位からＢｇｌＩ部位に伸びる約２５０ｂｐの配列が含まれるという条件で、より小さな又はより大きなＳＶ４０断片を用いることもてきる。例示的ベクターはＯｋａｙａｍａ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　３：２８０．１９８３の記載に従って構築てきる。

Ｃ１２７マウス乳上皮細胞中の哺乳動物レセプター〇ＤＮＡの安定で高レベルな発現のための有用な系は、Ｃｏｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２３：９３５．１９８６の記載に実質的に従って構築できる。

ＧＭ−Ｃ８Ｆ／ＩＬ−３ＤＮＡの発現に特に好ましい真核生物ベクターは、ｐＩＸＹ３２１及びｐＩＸＹ３４４を含み、これらはいずれもｐＢｃ１０２．に２２　（ＡＴＣＣ６７，２５５）に由来する酵母発現ベクターであうで、以下の実施例１及び７に記載するように、大腸菌及び酵母菌における選択及び複製のためのｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｐｒ遺伝子及び複製起点）を含む。

精製哺乳動物融合タンパク質又はその類似体は、発明によるＤＮＡの組み換え翻訳生成物を発現するための適当な宿主／ベクター系を培養し、次いで培地又は細胞抽出物を精製することによって生産される。

例えば、組み換えタンパク質を培地に分泌する系からの上澄みを、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばアミコン又はミリポアベリコン限外濾過ユニットを用いてまず濃縮する。濃縮工程に次いで、濃縮物を適当な精製マトリックスに付す。例えば、適当なアフィニティーマトリックスは、ＧＭ−Ｃ５Ｆ又はＩＬ−３レセプター又はレクチン又は適当な支持体に結合した抗体分子を含むことができる。若しくは、陰イオン交換樹脂も用いることができ、例えば付属的（ｐｅｎｄａｎｔ）ジエチルアミノエチル（ＤＥ、ＡＥ）基を有するマトリックス又は基質を用いる。マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストリン、セルロース又はタンパク質精製に通常用いる他の型のものでもよい。若しくは、陽イオン交換法も用い得る。適当な陽イオン交換体は、スルフォプロピル又はカルホキ／メチル基を含む各種不溶性マトリックスを含む。スルフオンロピル基が好ましい。

最後に、付属的メチル又は他の脂肪族基を有するンリカケルのような、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒質を用いて、１又はそれ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー　（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いて融合タンパク質組成物を更に精製する。前記の全ての精製工程のいくつかを組み合わせて用いて、均質な組み換えタンパク質を生産する。

バクテリア培養で生産される組み換えタンパク質は、通常細胞小球からの最初の抽出物を単離し、次いで１回又はそれ以上の濃縮、塩析、水性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィ一工程を行う。最終精製工程には高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）を用いる。発現又は組み換え融合タンパク質に用いた微生物は、凍結融解、超音波、機械的破砕、又は細胞分解剤を含むいかなる便法によっても破砕しつる。

融合タンパク質を分泌タンパク質として発現する酵母の発酵は、精製工程をおおいに簡素化する。大規模発酵による分泌組み換えタンパク質は、Ｕｒｄａｌ　ｅｔ　ａｌ、　。

Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ、　２９６：１７１．１９８４に記載の方法と同様の方法によって精製できる。

この文献は、分離用ＨＰＬＣカラム上での組み換えマウスＧＭ−Ｃ３Ｆの精製のための２段階逆相ＨＰＬＣ工程を開示する。

組み換え培養で合成された融合タンパク質は、培養物から融合タンパク質を回収するための精製工程に依存する量と特質のタンパク質を含む、非−ヒト細胞成分の存在を特徴とする。これらの成分は通常、酵母、原核生物、又は非−ヒト真核生物由来のものであり、好ましくは無害な混在量、或いは走査型濃度計又はクロマトグラフィーで約５％以内の量で存在する。更に、組み換え細胞培養は、細胞、細胞滲出物、又は体液などのそれぞれの起源の種に天然に見られるような、ＧＭ−Ｃ５Ｆ又はＩＬ−３と関連するタンパク質を含まない融合タンパク質の生産を可能にする。

融合タンパク質組成物は、所望の精製度の融合タンパク質を生理学的に受容し得る担体と混合することによって、投与用に調製される。このような担体は使用する投与量及び濃度において慝者に非毒性である。普通、このような組成物の調製は、融合タンパク質と、緩衝液、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量（約１０残基以下）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロース、又はデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオン及びその他の安定化剤及び賦形剤との組み合わせを伴う。

融合タンパク質組成物は、骨髄細胞のような造血前駆体細胞の増殖、分化及び機能的活動を増強するのに用いることができる。特に、融合タンパク質を含む組成物は、末梢血白血球数を増加し、かつ骨髄抑制性患者の循環顆粒球数を増加するのに用いることができる。この目的を達成するためには、治療的に有効な量の融合タンパク質組成物を、哺乳動物、好ましくはヒトに医薬担体又は希釈剤と共に投与する。

以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、何らこれを限定するもＡ、ｈｕＩＬ−３をコードするｃＤＮＡの単離Ｆ１ＣＯ１１へパーク密度遠心法を用いて、全血（Ｐｏｒｔｌａｎｄ　ＲｅｄＣｒｏｓｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ）から調製した淡黄色被覆物（ｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔｓ）から末梢血リンパ球を単離した。２−アミノエチルチオウロニウムブロミドー処理したヒツジ赤血球でロゼツト形成してＴ細胞を単離した。１００ｍ１　ＲＰＭＩ、１０％ウシ胎児血清、５０ｕＭ　ｂ−メルカプトエタノール、１％フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及び１０　ｎ　ｇ／ｍ　１フォルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）中で、１７５ｃｍ２のフラスコ中、５ｘｌＯ６細胞／ｍｌで、１８時間、細胞を培養した。グアニジニウムＣｓＣ］法及びオリゴ− ｄＴセルロースクロマトグラフィーによって調製したポリ、八−ＲＮ、Ａ　（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ獅■ ａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　１９ｇ２）によってＲＮＡを抽出した。Ｇｕｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ、　Ｇｅｎｅ　２５：２６３−２６９．１９８３の記載に本質的に従ってポリＡ　”　ＲＮ　ＡからｃＤＮＡを調製した。ｃ　Ｄ　Ｎ　、ＡをＤＮＡポリメラーゼエを用いて二本鎖にし、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ｃＤＮ、Ａ内のＥｃｏＲ１切断部位を保護するためにＥｃｏＲ１メチラーセでメチル化し、モしてＥｃｏＲ１リンカ −に連結した。この構築物をＥｃｏＲｌて消化して、ｃＤＮＡの両端にあるリンカ−の］コピー以外の全てを除去し、ＥｃｏＲ１切片及びファーシスｇｔｌＯ（ｎｕきｎｈ　ｅｔ　ａｌ。

、　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｇｌｏｖｅｒ、　ｅｄ、、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐｐ、S９−７８）の脱フォスフォリル化アームと連結し、製造者の指示に従いλファージ抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）中にパッケー／した。

大腸菌Ｃ６００ｈ　ｆ　１−株上に５００．０００個の組み換え体をプレートし、以下のプローブを用いる標準的プラークハイブリダイゼーション法でスクリーニングを行った。

ｈｕＩＬ−３遺伝子の選択された５゛及び３゛配列に相補的な配列を用いて、２つのオリゴヌクレオチドを合成した。ｈｕｌＬ−３リーダーの一部をコードする配列に相補的な５゛　プローブは、５’　−ＧＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣ，ＡＧＧＡＣ−３’　の配列を有していた。成熟タンパク質のアミノ酸１２３− １３０をコードする領域に相補的な３′プローブは、５’　−ＧＡＴＣＧＣＧＡＧＧＣＴＣＡＡＡＧＴＣＧＴ−３’　の配列を有していた。合成法は、５ｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　４：２５５７．１９７７及びＨｉｒｏｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔ、　２８：２４４９．１９７８の記載に実質的に似た標準的自動化トリエステル法であった。合成に続いて、オリゴヌクレオチドを脱ブロックし、分離用ゲル電気泳動で精製した。スクリーニングプローブとし、で用いるために、オリゴヌクレオチドをＭａｎｉａｔｉｓらの記載に似た方法を用いて、３２Ｐ−ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドモナーゼで末端放射能標識した。

ライブラリーのスクリーニングに用いた大腸菌株はＣ６００ｈｆ１−（上記Ｈｕｙｎｈら）であった。

１３個の陽性プラークを精製し、別々に２個のハイブリダイゼーションプローブと再プローブした。１１個のクローンが両方のオリゴヌクレオチドと／％イブリダイセーションした。幾つかの陽性組み換えファージからのｃＤＮＡ挿入物を、特異的ＥｃｏＲ１部位、Ｂａｍ８１部位及びその他多数の特異的制限部位を有するポリリンカーを含む標準的クローニングベクターｐＢＲ３２２のＥｃｏＲｌ− 切片誘導体（ｐＧＥＭＢＬ１８）にサブクローンした。この型の例示的ベクターであるｐＧＥＭＢＬは、Ｄｅｎｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１：１６４５．１９８３に記載されており、これはＳＦ３及びＴ７ポリメラーゼのためのプロモーターが複数のクローニング部位に隣接する。選択されたクローンのヌクレオチド配列は鎖末端法によって決定した。特に、２ＧＴ１０　：　ＩＬ−３クローン２．　３．　４及び５の部分ＥｃｏＲ１消化は、８５０ｂｐから１．０００ｂｐの大きさの断片を生成し、これを別々にｐＧＥＭＢＬ１８のＥｃｏＲ１部位にサブクローンした。ｐＧＥＭＢＬ１８の複数クローニング部位に隣接して結合する普遍的プライマーと、ｈｕＩＬ−３配列に由来する合成オリゴヌクレオチドプライマーとを用いて、ｐＧＥＭＢＬ　：　ｒｈｕ　ＩＬ−３サブクローンの挿入物を配列した。

天然タンパク質（Ａｓｎ”及びＡｓｎ”）に存在する２つのアスパラギン一連結グリコジル化部位を、これらの位置のコドンをアスパラギン酸をコードするコドンに変えることによって改変した。これは酵母細胞によって分泌されるタンパク質のＮ一連結グリコリル化（しばしば超グリコジル化）を防ぎ、より均質な生成物が得られる。この変更は、以下に記載するようにｈｕＩＬ−３ｃＤＮＡを酵母発現ベクターｐＩＸＹ１２０中にサブクローンして行った。

酵母発現ベクターｐｌＸＹ１２０は、複数のクローニング部位を含む以下の合成オリゴヌクレオチドが、ａ−因子シグナルペプチドの３゛末端近くのＡｓｐ７１８部位（アミノ酸７９）から２ｉｌ配列中に含まれるＳ　ｐ　ｅ　’１部位までに挿入される点以外は、ＥＰＡ２４３．１５３に記載のｐＢｃ１０２−に２２と実質的に同一である。

更に、複製起点及び遺伝子開領域を含む一本鎮ハクテリオファーンｆ１から由来する５１４−ｂｐのＤＮＡをｐＢＲ３２２ＤＮＡ配列中のＮｒｕ１部位に挿入した。ｆ１複製起点の存在は、適当な大腸菌（雄性）株に形質転換してハクテこの可能性はベクターのＤＮＡ配列決定本容易にし、またｉｎ　ｖｉｔｒｏての突然変異誘発の可能性をもたらす。

酵母発現ベクターｐｌＸＹ１２０を制限酵素Ａｓｐ７１８　Ｅこれはａ−因子リーダーペプチド（ヌクレオチド２３７）の３°末端近くて切断する〕、及びＢａｍＨｌ（これはポリリンカー中て切断する）で消化した。大きい方のベクター断片を精製して以下のＤＮＡ断片：（１）Ｃｌａ１部位（成熟ｈｕＩＬ−３のヌクレオチド５８）からＢａｍＨ１部位（ポリリンカー中の３゛がらｈｕＩＬ−３ｃＤＮＡ）までの、プラスミドＧＥＭＢＬ１８　：ｈｕｌＬ−３由来のｈｕｌＬ− ３ｃＤＮＡ断片）、及び（２）以下の合成オリゴヌクレオチドリンカーＡごと連結した。オリゴヌクレオチドＡは、α−因子リすダーベブチドのＣ−末端をコードし、コレをオクタヘプチドＤＹＫＤＤＤＤＫＩ＝枠内”Ｃ（ｉｎ−ｆ　ｒａｍｅ）融合する配列を再生させ、このオクタペプチドを次いて成熟ｒｈｕｌＬ−３のＮ−末端と融合させる。このｒｈｕＴＬ−３タンパク質との融合はオクタペプチドに特異的な抗体を用いる検出を可能とし、ｒｈｕｌＬ−３の発現及び精製をモニターするのに始め用いた。このオリゴヌクレオチドはまた、位置１５におけるアミノ酸の変更（Ａｓｎ］５からＡｓｐ＋５）をコードして、このＮ−グリコノル化部位を変える。オリゴヌクレオチドＡ中の下線部ヌクレオチドは野生型ｃＤＮＡ配列からの変化を表す。（成熟ｈｕｌＬ−３分子のＮ−末端アラニンに対応するコドンから数えて）それぞれヌクレオチド４３及び４５にある、八からＧへの、及びＣからＴへの変更を行うだけでアミノ酸の変更（Ａｓ　ｐ　Ｉ　５　）をもたらす。その他の塩基の変更は、アミノ酸配列の変更を伴わずに、便宜的な制限部位（ＡｈａｌＩ及びｐｖｕＩＩ）を導入する。得られるプラスミドはｐｌＸＹ１３９と命名され、１個の残るＮ一連結グリコシル化共通（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列（Ａ　ｓ　ｎ”）を有するｒｈｕＩＬ−３ｃＤＮＡを含む。

プラスミドｐＩＸＹ１３９は、オリゴヌクレオチド−指示突然変異誘発を行うて、Ａｓｎ”をＡｓｐ７０に変更することにより第２のＮ一連結グリコノル化部位を除去するのに用いた。ｉｎ　ｖｉｔｒｏの突然変異誘発は、Ｗａｌｄｅｒ　ａｎｄ　Ｗａｌｄｅｒ、Ｇｅｎｅ　４２：１３３．１９８６の記載と同様の方法で実施した。酵母ベクターｐＩＸＹ１３９は、−重鎖ハタテリオファーシｆ１のための複製起点を含み、適当な（雄性）大腸菌株中に存在し、ヘルパーファージで重感染するとき、−重鎖ＤＮＡを作ることができる。

大腸菌Ｊ　Ｍ　Ｉ　３７株て形質転換してヘルパーファージＩＲＩで重感染することにより一本鎖ＤＮＡを作った。−重鎖ＤＮＡを単離して以下の突然変異誘発オリゴヌクレオチドＢ：ＧＴＣＡＡＧ　ＡＧＴ　ＴＴＡ　ＣＡＧ　ＧＡＣＧＣＡＴＣＡ　ＧＣＡ　ＡＡＴ　Ｇ（これは成熟ｈｕｌＬ−３の位置７０において、ＡｓｐをＡｓｎで置換するコドンスイッチを提供する）とアニーリングした。アニーリング及び形質転換条件は、上記Ｗａｌｄｅｒ　ａｎｄ　Ｗａｌｄｅｒの記載に従って実施した。トリプトファン欠乏培地で生育させて酵母形質転換体を選択し、プールしてＨｏ１ｍ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　４２：１６９．１９８６の記載に従ってＤＮＡを抽出した。野生型と突然変異プラスミドＤＮＡの混合物を含む、このＤＮＡを用いて大腸菌ＲＲＩを形質転換してアンピシリン耐性とした。得られるコロニーを標準法によって、放射能標識したオリゴヌクレオチドＢとハイブリダイゼーションすることによりスクリーニングした。ｈｕｌＬ−３Ａｓｐ７０をコードするＤＮＡを含むプラスミドを、緊縮条件下に放射能標識したオリゴヌクレオチドＢと／Ｎイブリダイセーションすることによって同定し、ヌクレオチド配列決定によって°確認した。

得られる酵母発現プラスミドはｐＩＸＹ１３８と命名され、Ａ　Ｓ　ｐ１５ＡＳ　ｐ７０アミノ酸の変更をコートするｈｕｌＬ−３遺伝子と、Ｎ−末端にオクタペプチドＤＹＫＤＤＤＤＫとを含んでいた。最終酵母発現プラスミドは、オクタペプチドをコードするヌクレオチド配列を欠（意思外ではｐＩＸＹ１３８と同じてあり、かくして成熟ｒｈｕｌＬ−３を生成物として生産する。

最終酵母発現プラスミドは以下のように構築した。酵母発現ベクターｐＩＸＹ１２０を制限酵素Ａｓｐ７１８及びＢａｍＨｌで上記ように切断した。大きなベクター断片を（１）Ａｈａ２部位（これは成熟ｈｕＩＬ−３のヌクレオチド１９で切断する）からＢａｍＨ１部位（ｃＤＮＡへの３′）まで伸びる、プラスミドｐＩＸＹ１３８から由来するｈｕＩＬ−３ｃＤＮＡ断片、及び（２）以下の合成オリゴヌクレオチドＣと連結した。オリゴヌクレオチドＣは、Ａｓｐ７１８部位からのａ−因子リーダーペプチドの３′末端（アミノ酸Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）及びｈｕＩＬ−３のＮ−末端の７アミノ酸をＡｈａｌＩ部位に再生する。得られるプラスミドをｐＩＸＹ１５１と命名した。このベクターは、酵母中に存在するとき、グルコース−制御性発現及びｒｈｕｌＬ−３（Ｐｒｏ８ＡｓｐＩ５Ａｓｐ）Ｏ）の分泌を可能にする。

プラスミドｐＨＧ２３上にある、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆをコードする野生型遺伝子が、寄託番号第３９９００の下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２．ＵＳＡに寄託されている。酵母発現ベクターｐＹａｆＨｕＧＭ中に挿入されている野生型遺伝子も寄託番号第５３１５７の下にＡＴＣＣに寄託されている。ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆの非−グリコシル化類似体を得るために、ＰＣＴ公開ＷＯ３９１０３８８１に記載のように、オリゴヌクレオチド−指示部位特異的突然変異誘発法を用いて、有力なＮ−グリコノル化部位を排除した。この類似体、ｈｕＧＭ−Ｃ３Ｆ　（Ｌｅｕ”Ａｓｐ”Ｇｌｕ”）をコードするプラスミドは、寄託番号第６７２３１の下に、大腸菌ＲＲＩ株中０ブラスミドＬ２０７−３としてＡ　Ｔ　ＣＣに寄託された。

Ｄ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質用発現ベクターの構築リンカ−配列で分けられたヒトＧＭ−Ｃ５Ｆ及びヒトＩＬ−３を有する融合構築物を発現するための分泌ベクターを作成するためには、読み取り枠や介在配列をかまわずに、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３をコードするＤＮＡを直接融合して前駆体プラスミドをまず構築した。非グリコジル化ヒトＧＭ　Ｃ３ＦをコードするｃＤＮＡ断片を、９７７ｂｐの制限断片（Ｓｐｈｌから５ｓｐｌ）としてプラスミドＬ２０７− ３から切り取った。ＩＬ−３ｃＤＮＡは、Ａｓｐ７１８で消化することによりｐｌＸＹ１５１から切り取り、これをＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　１９８２．　り、　１１８のＴ４反応を用いて平滑末端とし、次いでＸｈｏｌで消化することにより８０３ｂｐの断片を得た。この２つの断片を次いで、５ｐｈｌ及びＸｈｏｌで切断したｐＩＸＹ１５１ベクター断片に直接連結した。このプラスミドはＧＭ／ＩＬ−３直接融合と呼ばれた。

ＧＭ／ＩＬ−３直接融合プラスミドを、上記Ｗａｌｄｅｒ　ａｎｄ　Ｗａｌｄｅｒの記載と同様の方法で、オリゴヌクレオチド−指示突然変異誘発における鋳型として用いた。次いで以下のオリゴヌクレオチドを合成した。

ＧＣＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣbＡＴＧＡＣＣにのオリゴヌクレオチドはＧＭ−Ｃ３Ｆの３°末端と１３ｂｐでオーバーラツプするが、停止コドンは含んでおらず、Ｇ１ｙＳｅｒリンカ−を含み、かつＩＬ−３の５′末端と１３ｂｐでオーバーラツプする。このリンカ−配列は、Ｂｕｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｊｓ＾８５：５８７９−５８８３．１９８８に記載のリンカ−に変更を加えたものであるが、Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５７：３０２６．１９８２のように酵母中でコドンを使用するために最適化した。

Ｒ４０８ヘルパー７７−シ及びＲｕ５ｓｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　４５：３３３−３３８．１９８６の方法を用いて、ＧＭ／ＩＬ−３直接融合から一重鎖プラスミドＤＮＡを作製した。

次いて、上記オリゴヌクレオチドを一重鎖プラスミドＤＮＡにアニーリングして、上記Ｗａｌｄｅｒ　ａｎｄ　Ｗａｌｄｅｒの記載に従ってアニーリングしたＤＮＡて酵母菌ＸＹ２１８１株を形質転換することにより、オリゴヌクレオチド指示突然変異誘発を実施した。この酵母菌ベクターは一重鎖バクテリオファーシｆｌ用の複製起点を含み、適当な（雄性）大腸菌株中に存在し、ヘルパーファーンで重感染すると、−末鎖ＤＮＡ生産をすることができる。トリプトファン欠乏培地で生育させて酵母菌形質転換体を選択し、プールし、そしてＨｏ１．ｍ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｇｅｎｅ４２：］６９．１９８６の記載に従ってＤＮＡを抽出した。突然変異体及び野生型プラスミドＤＮＡの混合物を含むこのＤＮＡを用いて、大腸菌ＲＲＩを形質転換してアンピシリン耐性とした。得られるコロニーを標準法で放射能標識したオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしてスクリーニングした。ＧＭ−Ｃ３Ｆ／リンカ−／ＩＬ−３をコードするＤＮＡを含むプラスミドを、緊縮条件下でリンカ−を含む放射能標識したオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションすることによって同定し、ヌクレオチド配列決定によって確認した。

ヌクレオチド配列決定過程において、リンカ−領域に突然変異が起こったことが判明した。ヌクレオチド配列ＴＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧが削除され（配列参照）、その結果アミノ酸配列ＧＩｙＧ］ｙＳｅｒＧＩｙが削除された配列のタンパク質を発現した。この突然変異は、読み取り枠に変化を与えず、また生物活性タンパク質の発現を妨げなかった。得られるプラスミドはｐｌＸＹ３２１と命名され、融合タンパク質ｈｕＧＭ−Ｃ８Ｆ　［Ｌｅｕ２３Ａｓｐ２７Ｇｌｕ３９］　／Ｇｌｙ４ＳｅｒＧ］　ｙ、Ｓｅ　ｒ／ｈｕ　ＩＬ＝３　［Ｐｒｏ８ＡｓｐＩ５Ａｓｐ７０］を発現した。

Ｅ、ＧＭ−Ｃ８Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質の発現及び精製Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｙｅａｓｔ　５ｔｒａｉｎ　Ｂａｎｋ、５ｅａｔｔｌ　ｅ、ＷＡ、ＵＳＡから得たＸＶ６１７−１−３ｂ　［ａ、ｈｉｓ６．　Ｉｅｕ２−１、Ｔｒｐｌ　１．ｕｒａ３．５ｔｅ５ｊと、Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ。

Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ、ＵＳ、Ａから得たＸ２１８１−ＩＢ　［ａ、ｔｒｐｌ −１゜ｇａｌｌ、ａｄｅｌ、ｈｉｓ２］とを交配することによって、二倍体Ｓ、ｃｅｒｅｖｊｓｉａｅである宿王ＸＶ２１８１株を作製した。Ｓｈｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ｍｅｔｂｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｒ＋ｇ　jＩａｒｂｃｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８６の方法て、該宿主株を発現プラスミドで形質転換した。

発現プラスミドｐｒＸＹ３２１（上記ＩＤ参照）を含む酵母菌を４℃てＹＮＢ− ｔｒｐ寒天プレート上に維持した。１リツトルのＹＮＢ−ｔｒｐ培地（６，７ｇ／Ｌ　酵母窒素塩基、５ｇ／Ｌ　カザミノ酸、４０ｍｇ／Ｌ　アデニン、１６０ｍｇ／Ｌ　ウラシル、及び２００ｍｇ／Ｌ　チロシン）中に幾つかの単離した組み換え酵母コロニーを接種することによって前培養を開始し、２リツトルのフラスコ中、３０°Ｃて、１夜激しく撹拌しながら生育させた。朝までに培養物は２ −７のＯＤ６゜０て定常期て飽和した。あらかじめ洗滌し、滅菌した発酵機（１０リツトルの作動容量の機械３機）に、その作動容量の８０％の５Ｄ−２培地（４゜Ｏｇ／Ｌ　硫酸アンモニウム、３．　２ｇ／Ｌ　リン酸−カリウム、３．　０ｇ／Ｌ酵母エキス、１．　０ｇ／Ｌ　クエン酸、鉤　１　ｇ／Ｌ　塩化ナトリウム、５ｍ１／Ｌ　２％塩化カルシウム、２．５ｍｌ／Ｌ　ビタミン１０１溶液、０．５ｍｌ／Ｌ　微量要素溶液（ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）、０．５ｍｌ／Ｌ　２０％硫酸マグネシウム、２．０ｍｌ／Ｌ　グルコース）を満たし、３０℃、５００−６００ｒｐｍの撹拌、及び１１０−１６１ｐの通気で維持した。接種物を加えた。生育２時間後に、５０％グルコースの栄養供給を始め、１０−１２時間で５０　ｇ／Ｌを加えた。次いで栄養供給を５０％エタノールに変えて、回収時まで３０３０−４Ｏ／時加えた。

発酵の全経過時間は約２０時間であり、その後の吸光度（６００ｎｍ）は３０から４５の範囲であった。次いで発酵機を２０℃に冷却し、５Ｍ　ＮａＯＨを加えて酵母発酵物のｐＨを８０に調整し、得られたものを領　４５νｍのフィルターカセットを備えたミリポアペリコンフィルターンステムで濾過して、滅菌した１　０　Ｌのカラスびんに回収した。

ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ、−３融合タンパク質を含む酵母菌上澄み１リンドルをアミコンＹＮｉ−１０膜上て５０ｍ１に濃縮した。酵母菌液濃縮物を次いて、酵母菌濃縮物に適用する前に水中の領　１％トリフロロ酢酸（溶媒Ａ）で平衡化しておいた５ｐ　Ｃ１８ンリカ（Ｖｙｄａｃ、５ｅｐａｒａｔ　１ｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ。

Ｈｅ　ｓ　ｐ　ｅ　ｒ　ｉ　ａ、ＣＡ、ＵＳ、Ａ）を詰めた１　ｃｍｘ２５ｃｍのカラムに適用して、分離用ＨＰＬＣによってさらに精製した。若しくは、粗酵母菌液はＣ−１８カラムに直接適用することもてきる。材料を入れた後、溶出物の吸光度がベースラインになるまてカラムを溶媒、へで溶出した。この時点でアセトニトリル中の０コ％トリフロロ酢酸勾配を、０％Ｂから１００％Ｂまで、１分間に１−２％Ｂの増加率で、かつ２ｍｌ／分の流速で行った。１分毎の分画を回収した。分画がら少予を取って、ＩＬ−３に対するウサギポリクローナル抗血清を用いるドツトプロットによって、タンパク質含量を分析した。ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３は、約５０％アセトニトリルて分画５０に溶出した。ドツトプロットでＧＭ−Ｃ８Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質に陽性であったＨＰＬＣ分画をプールして２０ｍＭ　β−アラニン、ｐＨ４のＳＰ−セファロースに結合した。０．５Ｍ　ＮａＣ１，１，００ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８で融合タンパク質を溶出した。融合タンパク質を含む分画をＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　、Ａ　Ｇ　Ｅて同定した。

分子量３５，０００を有するタンパク質を含むイオン交換分画をプールして、１００μｌに濃縮し、５ｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム上でＦＰＬＣゲル濾過を用いてさらに精製した。カラムはＰＢＳで溶出した。精製された分子量３５．０００の融合タンパク質のみを含む分画を５ＤＳ−ＰＡＧＥで同定した。

上記のようにして実質的に調製したＧＭ−Ｃ８Ｆ／ＩＬ−３の生物活性（ユニット／ｍｇ）及び結合親和性を、実施例４及び５に記載するように決定した。

生物活性レベルを測定するために、実施例３て調製したＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質を、チミジン取り込みアッセイにおいて、ＡＭＬ−１９３細胞の増殖を刺激する能力てアッセイした。、ＡＭＬ−１９３細胞系は、元来５ａｎｔｏｌｉｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３９：３３４８．１９８７に記載されたＧＭ−Ｃ３Ｆ依存性ヒト単球性日血病細胞系である。２３ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２００ｎＭ　Ｌ−グルタミン、５μｇ／ｍｌ　インツユリン、５ｄｇ／ｍ１　トランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌソディウムセレナイト、２．５％熱不活性化ウつ胎児血清、抗生物質、及び５ｎｂ／ｍｌ　精製組み換えヒトＧＭ−Ｃ３Ｆを含むイスコツのダルヘッコ改変培地（ＩＭＤＭ）中で細胞を生育させた。細胞は１週間に２回分けて、３００．０００／ｍ１の密度て新鮮な培地に接種した。

既知の成長因子及び未知の上澄みがＡＭＬ　１９３の増殖を刺激する能力を試験するために、チミジン取り込みアッセイを行った。ＡＭＬ−１９３細胞を遠心で洗浄し、ウシ胎児血清及び／又はＧＭ−Ｃ８Ｆを含まない点を除いて、上記のＩＭＤＭと同じ組成のアッセイ培地中に再懸濁した。精製ＧＭ−Ｃ３Ｆ、ＩＬ−３又はＧＭ−Ｃ３Ｆ／ｌ　Ｌ−３融合タンパク質を、９６ウエルの平底組織培養プレートの最初のウェルに、５　Ｑ　ｍ　Ｉ培地中、４００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。次いてこれらのサンプルをマイクロタイタープレートの更に１１ウエルに３倍で連続的に希釈した。各ウェルに３７５０個のＡＭＬ−１９３細胞を含む５０μｍの培地を加え、空気中６％ＣＯ２の十分湿潤な大気中、３７℃で１３８時間インキュベーションした。トリチウムを入れたチミジン（０，５ｍＣ１／ウェル）を各ウェルに加えて更に６時間インキュベーションし、自動サンプル回収器でサンプルを回収して液体シンチレーションでカウントした。最大チミジン取り込みの半量を刺激するのに要する成長因子の量を１ユニツト活性と定義する。

同一濃度におけるＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ又はＣＭ−Ｃ８Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質の同時滴定の結果、融合タンパク質は、いずれかの因子単独或いはＩＬ− ３とＧＭ−Ｃ３Ｆとの組み合わせよりも強力に増殖刺激性であることが判明した。ＩＬ−３、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＧＭ−Ｃ５Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質の特異的活性を以下の表Ａに示す。

表Ａ分子　特異的活性ＩＬ−３１，６５ｘ１０５ＧＭ−Ｃ３Ｆ　９．７４ｘｌＯ’ ＩＬ−３＋　ＧＭ−Ｃ３Ｆ　１．３９ｘ１０５ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３１，８１ｘｌＯ６ＧＭ−Ｃ３Ｆ、／ＩＬ−３融合タンパク質の特異的活性は、ＩＬ−３又はＧＭ−Ｃ８Ｆ単独、或いはＧ〜１−Ｃ３ＦとＩＬ−３との組み合わせよりも約１０倍高い。

ヒト細胞系のレセプターに対するヒトＩＬ−３、ＧＭ−Ｃ５Ｆ及び融合タンパク質の結合親和性を、１２５Ｉ−標識Ｉ　Ｌ−３又はＧＭＣ３Ｆ結合の阻害を用いて測定した。

Ａ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３の放射能標識組み換えヒトＧＭ−Ｃ５Ｆ／ＩＬ− ３融合タンパク質を酵母細胞中で発現させ、本質的には上記の方法で精製した。

オクタペプチドＤＹＫＤＤＤＤＫを含むように遺伝子操作された組み換えヒトＩＬ−３及びＧＭ−Ｃ３Ｆを酵母中で発現させ、本質的にはＨｏｐｐ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１２０４．１９８８に記載の方法で該オクタペプチドに特異的なモノクローナル抗体を用いて精製した。精製したＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３タンパク質を、本質的にはＰａｒｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６１：４１７７、１９８６に記載するように、市販のエンザイモヒーズ（ｅｎｚｙｍｏｂｅａｄ）放射性ヨウ素試薬（ＢｉｏＲａｄ）を用いて放射能標識した。簡単に言うと、５０μｍ　０２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，２中の組み換えタンパク質２−１０μｇを、エンザイモビーズ試薬　５０μ】、２０μｍの０．０５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７中のヨウ化ナトリウム　２ｍＣ１、及び２５％　５−Ｄ−グルコース　１０μｍと組み合わせた。

２５°Ｃで１０分後、ソシウムアンド（５０ｍＭをＬｏｌｌ）及びソンウムメタバイスルファイト（＋ｍｇ／ｍｌを１０μｍ）を連続的に加え、２５°Ｃで５分間インキュベーションを続けた。反応混合物を２．５％（Ｗ／　Ｖ　）ウソ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、０．２％（ｗ／ｖ）ソシウムアンド及び２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７，４を蔭むＲｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　（ＲＰＭＩ）１６４０培地（結合培地）で平衡化した２ｍｌベッド容量のセファデックスＧ−２５（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）上でケル濾過して分画した、＋２５Ｉ−ＩＬ−３及び１２５１−ＧＭ−Ｃ３Ｆの最終プールを結合培地中１ｘｌＯ７Ｍの作動貯蔵溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ　５ｔｏｃｋ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）に希釈して、レセプター結合活性の検出しうるロスなしで、４℃で１力月間貯蔵した。ＧＭ−Ｃ８Ｆの放射能標識の特異的活性は通常１１−５ｘｌＯ１５ｃｐ／ｍｍｏ　Ｉ　ｅの範囲である。ＩＬ−３の特異的活性は３３−６ｘｌＯＩ５ｃｐ／ｍｍｏｌｅの範囲である。

Ｂ、結合アッセイＪＭ−１、ＫＧ−１，ＨＬ−６０及びＡＭＬ−１９３細胞を用いて結合アッセイを実施した。ＪＭ−１，ＨＬ−６０及びＫＧ−１細胞はＰａｒｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６４：５４２０．１９８９の記載により得、調製した。ＡＭＬ− １９３細胞は上記実施例４の方法で得、調製した。上記Ｐａｒｋらが記載するように、＋２５■ＱＭ−Ｃ３ＦはＪＭ−１細胞と結合せず、またＧＭ−Ｃ８Ｆは１２５　Ｉ　−Ｉ　Ｌ−３がＪＭ−１細胞と結合するのを阻害しない。これはこの細胞がＩＬ−３のみと結合できるレセプターを有していることを示唆する。逆に、１２５１−ＩＬ−３はＨＬ−６０細胞と結合せず、またｌ−３は１２５Ｉ　− ＧＭ−ＣＳ　ＦがＨＬ−６０と結合するのを阻害しない。これはこの細胞がＧＭ −Ｃ３Ｆのみと結合できるレセプターを有していることを示唆する。これとは対照的に、ＫＧ−１及びＡＭＬ−１９３細胞はいずれも＋２５Ｉ−ＧＭ−Ｃ８Ｆ及び１２５Ｉ−ＩＬ−３と結合し、更にＩＬ−３及びＧＭ−Ｃ３Ｆはいずれもおよそ等しい容量で異種の放射能標識したりガントの特異的結合を競合することができる。これはこれらの細胞系がＩＬ−３のみと結合するレセプター、ＧＭ−Ｃ８Ｆのみと結合するレセプター、及びＧＭ−Ｃ３ＦとＩＬ−３との両方と結合するレセプターをいずれも高い親和性で有していることを示唆する。

ＩＬ−３、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質の結合親和性（ＫＩ）を測定するために、”５ｌ−ＴＬ−３のＪｋｉ−１細胞への結合、＋２５Ｉ−ＧＭ−Ｃ３ＦのＨＬ−６０細胞への結合、並びに１２５１−ＩＬ−３及び１２５Ｉ−ＧＭ−Ｃ３ＦのＫＧ−１及びＡＭＬ−１９３細胞への結合を、各種１度のこれら未標識タンパク質が阻害する能力を測定して、阻害アッセイを行った。アッセイは、細胞（３，３ｘｌＯ’／ｍｌ）を３ｘｌＯ−”Ｍ　”Ｉ−ＧＭ −Ｃ３Ｆ又は＋２５Ｉ−ＩＬ−３、及び各種濃度の未標識ＩＬ−３、ＧＭ−Ｃ３Ｆ又はＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質と共に３７℃で３０−６０分間インキュベーションして行った。不質的にはＰａｒｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ　７４：５６．１９８９に記載され、またＤｏｗｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３２ニア５］、　１９８４に開示のフタレートオイル分離法を用いて、結合をアッセイした。ＩＬ−３、ＧＭ−Ｃ８Ｆ及びＧＭＣ５Ｆ／ＩＬ−３の結合親和性を測定して、以下の表Ｂに示す。

表Ｂ標識　未標識　ＫＩ値（Ｍ−１）リカンド　競合体　Ｊ〜ｉ−Ｉ　ＨＬ−６０ＫＧ−Ｉ　ＡＭＬ−１９３”Ｉ−ＩＬ−３ＩＬ−３１，８ｘｌＯＩＯ−２，０ｘｌＯ”　４．１ｘｌＯ”ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３’６．１ｘｌＯ’　−−２，８ｘ１０１′　１．５ｘｌＯ”＋２５Ｉ−ＧＭ−Ｃ３Ｆ　ＧＭ−Ｃ３Ｆ　１．２ｘ１０】０３．２ｘ１０１０１．６ｘｌＯ”ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３−−６，８ｘｌＯ’　１．９ｘｌＯ”　１．５ｘｌＯＩ０表Ｂのデータを得るために用いた実験は、異なる細胞系を異なる実験で用いたためにいくらかバラツキを示しており、直接比較することは難しい。このデータで直接比較を行うために、対照群と融合タンパク質の双方のＫＩ値を１つの細胞系における対照群のＫＩ値に規格化した。ＩＬ−３データはＪＭＩ細胞におけるＫ　Ｉ　＝　１．　８　ｘ　１０”Ｍ−’に、ＧＭ−Ｃ３ＦデータはＨＬ −６０細胞におけるに１＝１．２ｘｌＯ’°Ｍ−１に規格化されて、以下の表Ｃに示す値を与えた。

表Ｃ１２５Ｉ−ＩＬ−３ＩＬ−３１，８ｘｌＯ”−１，８ｘｌＯ”　１．８ｘｌＯ” ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３６゜１ｘｌＯ’−２，５ｘｌＯ”　６．８ｘｌＯ”１２５Ｉ−ＧＭ−Ｃ３Ｆ　ＧＭ−Ｃ３Ｆ　１．２ｘ１０１０１．２ｘｌＯ’°　１．２ｘｌＯ”ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３−−６，８ｘ１０９７．１ｘｌＯ”　１．１ｘ１０１０規格化されたデータを比較すると、ＧＭ−Ｃ５Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質とＧＭ−Ｃ３Ｆとは、ＨＬ−６０、ＫＧ−１及びＡＭＬ−１９３のＧＭ− Ｃ８Ｆに対するレセプターとほぼ同じ親和性で結合する。これとは対照的に、ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質は、ＫＧ−１及びＡＭＬ−１９３細胞（これらはいずれもＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３レセプターを有する）のレセプターに対して、ＩＬ−３よりも有意に高い親和性で結合する。ＧＭ−Ｃ８Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質のレセプターに対する正常結合親和性のための（即ち、ただ１個のりガントと結合することができるレセプターへの結合のための）標準としてＪＭ −１細胞を用いると、ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ　３融合タンパク質はＫＧ−１細胞と４１．０倍高い結合親和性で結合し、またＡＭＬ−１９３細胞と１１．１倍高い結合親和性で結合する。

いかなる特定の理論にも拘束される積もりはないが、ＫＧ−１及びＡＭＬ　１９３細胞に対するＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質の高い結合親和性は、これらの細胞系のどちらにもＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３レセプターが存在することと関係があると信じられる。特に、ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質のＡＭＬ−１９３細胞系に対する高い結合親和性は、ＡＭＬ−１９３細胞系を用いる実施例４のチミジン取り込みアッセイにおける、ＧＭ−Ｃ５Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質の高い生物活性を説明するものかも知れない。

未分化ヒト骨髄の増殖に対するＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３の生物的影響を、ＧＭ− Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３単独のそれと比較した。ヒト骨髄の非−固着性、底密度のＴ細胞脱プレート化培養物を、Ｌｕ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ　６１：２５０．１９８３に記載するようにメチルセルロース（Ｂ　Ｆ　Ｕ　Ｅ、ＣＦ　Ｕ−Ｇ　ＥＭＭ、１プレート当たり４０゜０００細胞）又は寒天（ＣＦＵ−ＧＭ、１培養当たり４０．０００細胞）中にプレートした。メチルセルロース培養物は１プレート当たり１ユニツトのエリスロポエチンを含み、サイトカインの非存在下に４８主２ＢＦＵ−Ｅのバ、：７クグランド数を含む。培養物を５％０２，５％ＣＯ２，９０％Ｎ２大気中で１４日間インキュベーションし、暗視野顕微鏡でカウントした。この値は、２つの代表的実験のうちの１つにおける二重又は三重データポイントの平均±１標準偏差を表す。

表　Ｄ１２５０＋１２５０　５．０±０４　４７±４　５６±３↑６２５＋６２５　２．５±０．３　２７±２　４４土３ｆ↑ １５６＋１５６　０．３±０．３　１０±１　４４±３↑１２５０　１．５±０．３　３３±２　４７±４↑６２５　０．３±０，３↑　２１±２　４６土３ｔ３１２０↑　１６±１　↑ ｔ＝培地コントロールに等しい値＊ｐ＜０．０５　培地コントａ−ルと比較して表　ＥＧＭ−Ｃ５Ｆ／ＩＬ−３５０００−４３±５　−２５００　１０．０±１　４５ ±５１２５±１０＊１２５０　９．０±０２３土２１２７カが＊６２５　６．０±１１５±２　９７±２＊＊３１２　５、５±０５　８±１７１±１＊１５６　２．０±１５±１４７±３１ ↑ ７８　２０±０　２±０．３　４４±１′ＧＭ−Ｃ３Ｆ＋１Ｌ−３５０００＋５０００　６．５±１５３２二２９３±３＊２５００＋２５００　５．０±１　２１土２　７］±８＊＊１２５０＋１２５０　１．５±０．５”　１３±０３４４立２↑６２５＋６２５　２．０±０７±２４５±５↑↑ ３１２＋３１２　↑　３±１　↑ １５６１５６　↑　１±０９↑　ｆ ↑＝培地コン）・ロールに等シい値＊ｐ＜０．０５　培地コントロールと比較して表り及びＥは、未分化ヒト骨髄細胞の増殖を増強する点におシ％て、ＧＭ−Ｃ３ＦプラスＩＬ−３がＧＭ−Ｃ３Ｆ又はＩＬ−３単独よりも約２倍有効であることを示している。、ＧＭ−Ｃ３Ｆ／Ｉ　Ｌ　３融合タンノくり質は、ＧＭ−Ｃ８ＦとＩＬ−３との混合物に匹敵する強度であり、ＧＭ−Ｃ３ＦとＩＬ−３との混合物ｉｔ　Ｇ　Ｍ−Ｃ８Ｆ又はＩＬ −３即独に比較して約２倍の増強を示した。

実施例７　土１＝−３／ＧＭ−Ｃ５Ｆ融合タンｌくり質をコードするｃＤＮＡの合成Ｎ−末端ＩＬ−３とＣ−末端ＧＭ−Ｃ５Ｆとを含む融合タンノ々り質をコードするｃＤＮＡを以下のようにして構築した。酵母発現ベクターｐｌＸＹ１２０（実施例ＩＢに記載）を制限酵素Ａ、５ｐ７１８［これはａ−因子リーダーペプチド（ヌクレオチド２３７）の３″末端近くで切断する］、及びＮｃｏｌ（これはポリリンカーで切断する）で消化した。大きなベクター断片を精製して、Ｌ２０７−３（ＡＴＣＣ６７２３１）の部分消化から得た約５００ｂｐのＡＳｐ７１８−Ｎｃ０１断片［ＧＭ−Ｃ８Ｆ　（Ｌｅｕ”Ａｓｐ２７Ｇｌｕ３９）をコードする］と連結してｐｌＸＹ２７３を構築した。ｐＩＸＹ２７３の９ｋｂ　Ａｓｐ７１８−Ｂｇ１２断片［まだＧＭ−Ｃ５Ｆ　（Ｌｅｕ２３Ａｓｐ２７Ｇｌｕ３９）を含んテイル］を次イて、ｐＩＸＹ１５１（実施例ＩＢに記載）からのヒトＩ　Ｌ−３（Ｐ　ｒ　ｏ８Ａｓ　ｐ’５ＡＳｐ７０）をコードするＡｓｐ７１８− Ｎｒｕｌ断片、及び以下の二本鎖オリゴヌクレオチド：と連結した。このオリゴヌクレオチドはＩＬ−３の３′末端と８ｂｐでオーバーラツプするが、停止コドンを含んでおらず、Ｇｌｙ−３ｅｒリンカ−を含み、かつＧＭ−Ｃ３Ｆの５′末端と１０ｂｐでオーバーラツプする。得られるベクターをｐＩＸＹ３４４と命名し、本質的には上記実施例３で記載したＩＬ−３／ＧＭ −Ｃ３Ｆ融合タンパク質の発現に用いた。

ヒト細胞系のレセプターに対するヒトＩＬ−３、ＧＭ−Ｃ５Ｆ及びＩＬ−３／ＧＭ−Ｃ８Ｆ融合タンパク質（実施例８の記載により作製）の結合親和性を、上記実施例５に記載のように、１２５■−標識ＩＬ−３又はＧＭ−Ｃ３Ｆ結合の阻害によって測定した。

Ｐａｒｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４：５４２０．１９８９の記載に従って得て、調製したＪＭ−１、ＨＬ−６０及びＫＧ−１細胞を用いて、結合アッセイを実施した。ＪＭ−１細胞はＩＬ−３と結合できるレセプターを有しているが、ＧＭ−Ｃ３Ｆとは結合しない。逆に、ＨＬ−６０細胞はＧＭ−Ｃ５Ｆと結合できるレセプターを有しているが、ＩＬ−３とは結合しない。

ＫＧ−１細胞はＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３の双方に対するレセプターを有する。

結合親和性（ＫＩ）を、ＩＬ−３、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３について測定し、以下の表Ｆに示した。

表Ｆ＋２５Ｉ−ＩＬ−３ＩＬ−３６，０ｘｌＯ’−５，７ｘｌＯ’ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３２，５ｘｌＯ’　−−３，０ｘｌＯ”ＩＬ−３／ＧＭ−Ｃ３Ｆ　１．２ｘｌＯ’−２，２ｘ１．０””５Ｉ−ＧＭ−ＣＳＦ　ＧＭ−Ｃ３Ｆ　１．５ｘ１．Ｏ”　Ｎ、ＤＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３−−５，４ｘ１０９Ｎ、Ｄ。

上のデータは、ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３及びＩＬ−３／ＧＭ−Ｃ８Ｆ融合タンパク質が、ＩＬ−３単独よりも低い親和性でＪＭ−１細胞と結合することを示す。

逆に、ＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３及びＩＬ、−３／ＧＭ−Ｃ８Ｆ融合タンパク質は、ＩＬ−３よりも有意に高い親和性でＫＧ−１細胞と結合する。ＫＧ〜１細胞に対するＧＭ−Ｃ３Ｆ／ＩＬ−３及びＩＬ−３／ＧＭ−Ｃ３Ｆ融合タンパク質のいずれのＫＩ値は、ＪＭ−１細胞に対するよりも１０−２０倍高い。同様に、ＨＩ −−６０細胞に対するＧＭ−Ｃ３Ｆ／ｒＬ−３及びＩＬ−３／ＧＭ−Ｃ８ＦのＫＩ値も同様である。

実施例４−６（これらは結合親和性と生物活性増強との関係を示す）に示すデータの観点からすると、上記結合データはＩＬ−３／ＧＭ−Ｃ５Ｆ融合タンパク質が増強された生物活性を有することを示唆している。

ＦＩＧＵＲＥ　１ＦＩＧＵＲＥ　２ｎｇ／ｍ１国際調査報告Ｉｍｓ、、ｕｌｌ。＋ＮＩＡｅｅｌｌＮＮ＋１゜、。ＰＣ丁／１１５９０１０４５９９国際調査報告：：”：”’、：；ｌ：：：ｈｅ、：ｒ’、二ｚ：；ｌ；、雫：π：：；：に” 、”ｒ”７．、”’ｔｒ’？＝”：””ｆｌｌｌ＃ｄＩＮｔ■■h−−ｍＦ５１ｉ７ｍ１１ン１ｔｉａｌｌ１６ｎｌ１１２６１！ｌ＋ｎｍＴｈｅ＋ｕ「６ＤｅｌｌｌｌｌｌＦｎ１６ｕ：ｆｌ＠ＩＩＩｎｎａ育Ｑｌｌｈｂｌ書１ａ＋ＩＭＩ＠Ｄ ”１ｆｕｌｌｎ＊ｈぼバーｒｅｍ豐＋■撃凵欄■魔■魔■盾秩{ｈｅｇｗｐａ＋輸・イ番ｍａ’ｌ’＠＋：１−喝

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下の式：Ｒ１−Ｒ２，Ｒ２−Ｒ１，Ｒ１−Ｌ−Ｒ２及びＲ２−Ｌ−Ｒ１（式中、Ｒ１はＧＭ−ＣＳＦであり；Ｒ２はＩＬ−３であり；そしてＬはリンカーペプチド配列である）からなる群から選択される式を有する融合タンパク質。
２．リンカー配列がＧＩｙ，Ａｓｎ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸を含む、請求の範囲第１項記載の融合タンパク質。
３．リンカー配列の長さが５から１５アミノ酸である、請求の範囲第２項記載の融合タンパク質。
４．図１のアミノ酸残基１−２７１及び図２のアミノ酸残基１−２７５からなる群からから選択される、請求の範囲第３項記載の融合タンパク質。
５．融合タンパク質がｈｕＧＭ−ＣＳＦ［Ｌｅｕ２３ＡＳＰ２７Ｇｌｕ３９］／Ｇ］ｙ４ＳｅｒＧｌｙ５Ｓｅｒ／ｈｕＩＬ−３［Ｐｒｏ８Ａｓｐ１５Ａｓｐ７０］である請求の範囲第３項記載の融合タンパク質。
６．ヒトＧＭ−ＣＳＦがｈｕＧＭ−ＣＳＦ、ｈｕＧＭ−ＣＳＦ［Ｌｅｕ２３Ａｓｐ２７Ｇｌｕ３９］、ｈｕＧＭ−ＣＳＦ［Ｌｅｕ２３］、ｈｕＧＭ−ＣＳＦ［Ｌｅｕ２３Ａｓｐ２７］、ｈｕＧＭ−ＣＳＦ［Ｇｌｕ３９］、ｈｕＧＭ−ＣＳＦ［Ａｓｐ２７Ｇｌｕ３９］、ｈｕＧＭ−ＣＳＦ［Ｌｅｕ２３Ｇｌｕ３９］及びｈｕＧＭ−ＣＳＦ［Ａｓｐ２７］からなる群から選択され、そしてヒトＩＬ−３がｈｕＩＬ−３、ｈｕＩＬ−３［Ｐｒｏ８Ａｓｐ１５Ａｓｐ７０］、ｈｕＩＬ−３［Ａｓｐ７０］、ｈｕＩＬ−３［Ａｓｐ１５Ａｓｐ７０］、ｈｕＩＬ−３［Ｐｒｏ８Ａｓｐ１５］、ｈｕＩＬ−３［Ｐｒｏ８Ａｓｐ７０］及びｈｕＩＬ−３［Ａｓｐ１５］からなる群から選択される、請求の範囲第１項記載の融合タンパク質。
７．請求の範囲第１項記載のタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
８．請求の範囲第４項記載のタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
９．請求の範囲第５項記載のタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
１０．請求の範囲第６項記載のタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
１１．図１又は図２に定義するＤＮＡ配列への遺伝子コードの結果として縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）している、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。
１２．請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列を含む組み換え発現ベクター。
１３．請求の範囲第８項記載のＤＮＡ配列を含む組み換え発現ベクター。
１４．請求の範囲第９項記載のＤＮＡ配列を含む組み換え発現ベクター。
１５．請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ配列を含む組み換え発現ベクター。
１６．請求の範囲第１１項記載のＤＮＡ配列を含む組み換え発現ベクター。
１７．請求の範囲第１２項記載のベクターを含む適当な宿主細胞を、発現を促進する条件下に培養する工程を含む、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３を含む融合タンパク質の製造方法。
１８．請求の範囲第１３項記載のベクターを含む適当な宿主細胞を、発現を促進する条件下に培養する工程を含む、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３を含む融合タンパク質の製造方法。
１９．請求の範囲第１４項記載のベクターを含む適当な宿主細胞を、発現を促進する条件下に培養する工程を含む、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３を含む融合タンパク質の製造方法。
２０．請求の範囲第１５項記載のベクターを含む適当な宿主細胞を、発現を促進する条件下に培養する工程を含む、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３を含む融合タンパク質の製造方法。
２１．請求の範囲第１６項記載のベクターを含む適当な宿主細胞を、発現を促進する条件下に培養する工程を含む、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３を含む融合タンパク質の製造方法。
２２．有効量の請求の範囲第１項記載の融合タンパク質と、適当な希釈剤又は担体とを含む、哺乳動物における免疫又は炎症応答を制御するための組成物。
２３．ヒトの免疫応答を制御するための医薬品の調製における、請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
２４．免疫応答を制御するためにヒト患者に非経口投与するのに適した医薬組成物の調製における、請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
２５．有効量の請求の範囲第１項記載の融合タンパク質を、適当な希釈剤又は担体に混合して含む、免疫応答を制御するためにヒト患者に非経口投与するのに適した医薬組成物。