BR9812096B1

BR9812096B1 - proteìna interleucina-6 (il-6) receptor de interleucina-6 (sil-6r) solúvel glicosilada quimérica (sil-6r/il-6) e seus análogos biologicamente ativos, seu processo para preparação e uso, bem como seqüência de dna, vetor de dna e composição farmacêutica.

Info

Publication number: BR9812096B1
Application number: BRPI9812096-4A
Authority: BR
Inventors: Michel Revel; Judith Chebath; Tsvee Lapidot; Orit Kollet
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2011-09-06
Also published as: CA2295936C; BG104070A; PT991661E; DE69836217D1; EP0991661A2; NO327397B1; EA200000109A1; JP4402288B2; PL338002A1; HK1031895A1; AU8127198A; IL122818A0; BR9812096A; IL133972A; WO1999002552A2; NZ502139A; BG64680B1; AU758161B2; HU225855B1; HUP0002426A2

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNA INTERLEUCINA-6 (IL-6) RECEPTOR DE INTERLEUCINA-6 (SIL-6R) SO- LÚVEL GLICOSILADA QUIMÉRICA (SIL-6R/IL-6) E SEUS ANÁLOGOS BIOLOGICAMENTE ATIVOS, SEU PROCESSO PARA PREPARAÇÃO E USO, BEM COMO SEQÜÊNCIA DE DNA, VETOR DE DNA E COMPOSI- ÇÃO FARMACÊUTICA".

Campo da Invenção

A presente invenção está genericamente no campo de atividades bio- lógicas de interieucina-6 (IL-6) que são dependentes da ação agonística de receptor IL-6 solúvel (slL-6R). Mais especificamente, a presente invenção refere-se a novas proteínas SIL-6R/IL-6 quiméricas construídas a partir da fusão de essencialmente a forma de ocorrência natural de slL-6R e IL-6, e seus análogos biologicamente ativos, que são particularmente úteis para tratamento de câncer, via inibição de crescimento canceroso de célula, para aperfeiçoamento de transplante de medula óssea, para tratamento de distúrbios de fígado, e outras condições relacionadas com IL-6.

Antecedentes da Invenção e Técnica Anterior

Interleucina-6 (IL-6) é uma citocina bem conhecida cujas atividades biológicas são mediadas por um sistema receptor de membrana compreenden- do duas diferentes proteínas, uma chamada Receptor IL-6 (IL-6R ou gp80) e a outra gp130 (revisto por Hirano e outros, 1994). Formas solúveis de IL-6R(slL- 6R), correspondendo ao domínio extracelular de gp80, são produtos naturais do corpo humano encontrados como glicoproteínas em sangue e urina (Novick e outros, 1990, 1992). Uma propriedade excepcional de moléculas slL-6R é que elas atuam como potentes agonistas de IL-6 sobre muitos tipos de células inclu- indo células humanas (Taga e outros, 1989; Novick e outros, 1992). Isto é devi- do ao fato de que mesmo sem o domínio intracitoplásmico de gp80, slL-6R ain- da é capaz de disparar a dimerização de gp130 em resposta a IL-6, que por sua vez media a subseqüente transdução de sinal específica-IL-6 e efeitos bio- lógicos (Murakami e outros, 1993). O complexo receptor IL-6 ativo é de fato uma estrutura hexamérica formada por duas cadeias de gp130, dois Iigantes IL- 6R e dois IL-6 (Ward e outros, 1994; Paonessa e outros, 1995), onde slL-6R tem dois tipos de interação com gp130 ambos os quais são essenciais para as atividades biológicas específicas de IL-6 (Halimi e outros, 1995). Tratamento com slL-6R resulta em um aperfeiçoamento das ati- vidades biológicas de IL-6 em muitos tipos de células. Um exemplo são cé- lulas de tumor cujo crescimento é inibido em uma maior extensão por IL-6 quando slL-6R é adicionada, tais como células M1 mieloleucêmicas murina (Taga e outros, 1989), células T47D de carcinoma de mama humano (No- vick e outros, 1992) ou células de carcinoma de pulmão célula "Non-small" humana (Ganapathi e outros, 1996). IL-6 tem atividades antimetastáticas in vivo (Katz e outros, 1995), slL-6R è também pode aperfeiçoar tais efeitos anti-tumor in vivo de IL-6 (Mackiewicz e outros 1995). Uma outra atividade de IL-6 que é aperfeiçoada por adição de slL-6R, é a estimulação de células indiferenciadas hematopoiéticas para produção de colônias de multilinha- gem (Sui e outros, 1995). Os presentes inventores também observaram que a sobrevivência de culturas primárias de oligodendrópitos de cérebro é su- portada pela combinação de slL-6R e IL-6 (Oh, 1997), enquanto IL-6 sozi- nha é pobremente ativa em tais culturas (Kahn e De Vellis, 1994). Esta veri- ficação indica que IL-6, quando combinada com slL-6R, pode imitar a atividade de outras citocinas neurotrópicas tais como Fator Neurotrópico Ciliar (CNTF) ou Fator Inibidor de Leucemia ((LIF) que também atua através de gp130, como também é o caso para IL-11 e Oncostatin M (Hirano e outros, 1994).

Em uma tentativa para prover uma molécula que possa combi- nar as funções notadas acima de IL-6 e slL-6R, foi recentemente reportada a produção em células de levedura recombinantes de uma proteína de fusão entre um segmento truncado da seqüencia IL-6R humana e IL-6, ligada por um ligador rico em glicina (Fischer e outros, 1997). Esta proteína de fusão inclui essencialmente somente o domínio-N receptor de citocina IL-6R e o domínio-C receptor de citocina, e assim carece essencialmente de todo o domínio semelhante-imunoglobulina(lg) IL-6R, e a região pré-membrana re- ceptora (a região entre o domínio-C e o domínio transmembranal). Como tal ela representa uma forma truncada da slL-6R, esta slL-6R truncada na pro- teína de fusão estando ligada via o Iigador rico em glicina notado acima para essencialmente a forma madura inteira de IL-6. Além de falta de partes da slL-6R natural, esta proteína de fusão sendo produzida em células de levedura, não tem o padrão de glicosilação que uma tal proteína de fusão pode ter se fosse produzida em células de mamíferos, em particular, por exemplo, em células humanas. De fato, esta proteína de fusão produzida por levedura tem um peso molecular de somente cerca de 57 kDa em con- traste a um produto de fusão contendo essencialmente todos os resíduos de aminoácidos slL-6R e IL-6 naturais e sendo inteiramente glicosilado em cé- lulas de mamíferos (por exemplo, ser humano), que têm o esperado peso molecular de cerca de 85kDa (ver Exemplo 2 abaixo).

A experiência comum em desenvolvimento de proteínas recom- binantes que podem ser usadas para tratamento de pacientes humanos mostrou que é importante manter tanto quanto possível as formas naturais das proteínas, como elas são encontradas no corpo humano, de modo a evitar-se disparo de anticorpos e outros efeitos colaterais observados com produtos recombinantes não-naturais. Por esta razão, tem sido vantajoso usar-se sistemas de célula mamífera recombinante para produção de pro- teínas glicosiladas tais como lnterferon-β ou fator de estimulação de colônia de Granulócito (Chernajovsky e outros, 1984, Holloway, 1994) em uma for- ma química tão similar quanto possível ao produto humano natural. Bactéri- as ou microorganismos tais como, por exemplo, leveduras, que não glicosi- lam propriamente, também causam a má dobra das cadeias de proteína, conduzindo a reações imunogênicas. Isto é particularmente importante com relação a IL-6 que é pesadamente modificada pós-translacionalmente por N- e O-glicosilação assim como por fosforilação (Revel, 1989 para revisão), e em relação à slL-6R natural de sangue e urina humanos que é uma glico- proteína cujos N-terminais e aminoácidos C-terminais são constantes e fo- ram determinados (Novick e outros, 1990 e patentes co-possuídas pelos presentes inventores N°s US 5 216 128 e sua correspondente EP 413908 B1).

Da mesma maneira, pode parecer que o produto de fusão nota- do anteriormente acima entre parte de slL-6R e IL-6 tem um número de pos- síveis desvantagens especialmente com relação a seu uso para tratamento de seres humanos e isto, devido ao fato de carecer parte da slL-6R, assim como sua produção em leveduras que pode prover para incorreta glicosila- ção da proteína.

Anteriormente, uma molécula de fusão compreendendo slL-6R natural encontrada em fluidos de corpo humano e natural IL-6, e que é pro- duzida em células humanas ou de outros mamíferos, não foi descrita.

Por isso, é um objetivo da presente invenção prover uma tal molécula de fusão compreendendo a slL-6R natural e a IL-6 natural (em qualquer ordem) que é produzida em células de mamíferos.

É um outro objetivo da presente invenção usar uma tal proteína de fusão (quimera sll_-6R/IL-6) para inibir o crescimento de células de mela- noma altamente metastáticas em concentrações muito baixas, estas células sendo resistentes à IL-6 ou slL-6R sozinhas.

Ainda um outro objetivo é usar uma tal proteína de fusão (a qui- mera slL-6R/IL-6) para enxerto in vivo de células indiferenciadas hemato- poiéticas humanas em protocolos de transplante de medula óssea.

É ainda um outro objetivo da presente invenção usar uma tal proteína de fusão em outros distúrbios relacionados com IL-6, por exemplo, condições de fígado ou condições neurológicas.

Ainda um objetivo da invenção é prover composições farmacêu- ticas que contêm a proteína de fusão IL-6 natural slL-6R natural (quimera slL-6R/IL-6) para o tratamento de câncer, para uso em procedimentos de transplante de medula óssea, e para outros distúbios relacionados a IL-6, por exemplo, condições de fígado e condições neurológicas.

Outros objetivos e aspectos da presente invenção serão mos- trados ou surgirão da seguinte exposição da presente invenção.

Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção foi produzido um número de proteínas de fusão (quimeras) cada uma compreendendo essencialmente todas slL-6R ocorrendo naturalmente a partir de fluidos de corpo humano e essencialmente toda forma madura de IL-6 humana ocorrendo naturalmente, e cada uma ligada por peptídios Iigadores curtos que podem ser tão curtos como 3 resíduos de aminoácidos em comprimento ou maiores, por exemplo, 13 resíduos de aminoácidos em comprimento (ver abaixo e Exemplos 1 e 2). Deve ser notado, entretanto, que nestas proteínas de fusão os peptídios ligadores podem ser omitidos e a porção slL-6R pode estar diretamente li- gada à porção IL-6. Uma vez que ligadores representando seqüencias de aminoácidos não-naturais podem ser epítopos imunogênicos elicitando anti- corpos em pacientes, é preferível ter-se uma quimera SIL-6R/IL-6 fundida diretamente que tenha a desejada atividade biológica, enquanto ao mesmo tempo seja minimizado o risco de indução de tal potencialmente prejudicial formação de anticorpos quando uma tal quimera é administrada.

A conservação da inteira seqüencia de slL-6R incluindo o domí- nio semelhante-lg como encontrado na molécula ocorrendo naturalmente, assim como a própria glicosilação e outras modificações pós-translacionais introduzidas por células humanas ou mamíferas quando a quimera acima é produzida em tais células, também são importantes para redução da poten- cial imunogenicidade do produto proteína quimérica.

Entretanto, é possível usar-se um ligador muito curto de cerca de três aminoácidos no ponto de junção entre as porções slL-6R e IL-6 da proteína quimérica. Um tal curto ligante pode ser um epítopo imunogênico. Também é possível, claro, usar-se ligadores mais longos de até cerca de 30 aminoácidos para proporcionar a separação entre as duas porções mas aqui deve ser tomado cuidado, e eficácia biológica e experimentos de segu- rança têm de ser realizados para assegurar-se que moléculas quiméricas com tais ligadores não são imunogênicas.

De fato, foi surpreendentemente mostrado de acordo com a pre- sente invenção que tais ligadores mais longos não são essenciais para a atividade da proteína quimérica indicando que dobra adequada de quimera não requer um ligador mais longo, especialmente quando essencialmente todas as seqüencias ocorrendo naturalmente das porções slL-6R e IL-6 são incorporadas na molécula quimérica (ver Exemplo 3 e figura 5 que se refe- rem também a uma comparação entre uma quimera slL-6R/IL-6 tendo um ligador muito curto (3 aminoácidos) e uma quimera similar tendo um ligador maior de 30 aminoácidos).

Estas proteínas de fusão ou quimeras SIL-6R-IL-6 têm sido efi- cientemente produzidas, de acordo com a presente invenção, em sistemas de expressão de célula de mamífero para render produtos glicosilados tendo potente atividade sobre células de tumores que usualmente são não- responsivas à IL-6 ou sIL-6R sozinhas, e que são altamente efetivos em as- segurar o sucesso de enxerto de células transplantadas de medula óssea humana (ver abaixo e Exemplos 1-4). De fato, em tais transplantes de me- dula óssea, as quimeras sIL-6R/IL-6 são essenciais para a sobrevivência e proliferação das células indiferenciadas hematopoiéticas pluripotenciais não-comprometidas transplantadas. Além disso, a partir de resultados expe- rimentais apresentados aqui abaixo, assim como a partir de outras análises surge que vários análogos da proteína quimérica sIL-6R/ll-6 da invenção podem ser preparados, que têm essencialmente a mesma atividade biológi- ca da quimera sIL-6R/IL-6, estes análogos sendo quimeras sIL-6R/IL-6 onde um ou mais dos resíduos de aminoácidos foram suprimidos, adicionados ou substituídos por outros, a única limitação sobre tais análogos sendo que eles retêm a maioria da seqüencia de slL-6R e IL-6 ocorrendo naturalmente. Por exemplo, adições de aminoácidos às seqüencias de sIL-6R e IL-6 ocor- rendo naturalmente são preferivelmente limitadas a até entre cerca de 20 aminoácidos, e preferivelmente estas adições estão no sítio de junção entre sIL-6R e IL-6, isto é, a molécula ligadora. Da mesma maneira, supressões de seqüencias slL-6R e IL-6 são preferivelmente limitadas a até entre cerca de 20-30 aminoácidos; e substituições de resíduos de aminoácidos nas se- qüencias de sIL-6R e IL-6 por outros resíduos de aminoácidos também são preferivelmente limitadas a até entre cerca de 20-30 aminoácidos. Todas as supressões, adições e substituições mencionadas anteriormente são aceitá- veis de acordo com a presente invenção quando os análogos assim modifi- cados, que são obtidos, retêm essencialmente a atividade biológica da qui- mera sIL-6R/IL-6 composta por essencialmente as seqüencias ocorrendo naturalmente, e retêm essencialmente o mesmo padrão de glicosilação da quimera composta por essencialmente as seqüencias ocorrendo natural- mente quando expressas em células mamíferas.

Da mesma maneira, a presente invenção provê uma proteína (IL-6) interleucina-6-receptor de interleucina-6 (slL-6R) (slL-6R/IL-6) e seus análogos biologicamente ativos, compreendendo um produto de proteína de fusão entre essencialmente toda forma ocorrendo naturalmente de slL-6R e essencialmente toda forma ocorrendo naturalmente de IL-6, dita SIL-6R/IL-6 e seus análogos estando glicosilados em uma maneira similar à glicosilação de slL-6R e IL-6 ocorrendo naturalmente.

Realizações da proteína quimérica acima da invenção incluem:

(i) Uma proteína slL-6R/IL-6 quimérica e seus análogos biologi- camente ativos, onde a dita sll_-6R está fundida a IL-6 via uma molécula ligadora de peptídio.

(ii) Uma proteína slL-6R/IL-6 quimérica e seus análogos biologi- camente ativos, como em (I) acima, onde o dito Iigador é um Iigador não- imunogênico, muito curto, de cerca de 3-4 resíduos de aminoácidos.

(iii) Uma proteína slL-6R/IL-6 quimérica e seus análogos biologi- camente ativos, como em (ii) acima, onde o dito Iigador é um tripeptídio da seqüencia E-F-M (Glu-Phe-Met).

(iv) Uma proteína slL-6R/IL-6 quimérica e seus análogos biolo- gicamente ativos, como em (I) acima, onde o dito Iigador é um peptídio de 13 resíduos de aminoácidos de seqüencia E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met)(SEQ ID: NO 1).

(v) Uma proteína slL-6R/IL-6 quimérica, sendo aqui designada slL-6R5Val/IL-6 tendo um Iigador tripeptídio de seqüencia E-F-M entre Val- 356 C-terminal de slL-6R e Pro-29 N-terminal de IL-6, a dita proteína quimé- rica tendo a seqüencia mostrada na figura 3.

(vi) Uma proteína slL-6R/IL-6 quimérica, sendo aqui designada slL-6R5Val/L/IL-6 tendo um Iigador peptídio de 13 aminoácidos de seqüen- cia E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M entre Val-356 terminal-C de slL-6R e o Pro-29 terminal-N de IL-6R, a dita proteína quimérica tendo a seqüencia mostrada na figura 3 onde o tripeptídio de seqüencia E-F-M entre posições 357-359 de figura 3 está substituído pela dita seqüencia de peptídio de 13 aminoácidos.

(vii) Uma proteína SIL-6R/IL-6, onde a dita proteína é produzida em células mamíferas em uma forma inteiramente processada.

(viii) Uma proteína slL-6R/IL-6 quimérica, onde a dita proteína é produzida em células humanas.

(ix) Uma proteína slL-6R/IL-6 quimérica, onde a dita proteína é produzida em células CHO.

(x) Uma proteína slL-6R/IL-6 quimérica e seus análogos biologi- camente ativos, como acima, onde a dita proteína quimérica e análogos são caracterizados por ser capazes de inibir o crescimento de células de câncer altamente malignas.

(xi) Uma proteína slL-6R/IL-6 quimérica e seus análogos biolo- gicamente ativos, como acima, onde a dita proteína quimérica e análogos são caracterizados por ser capazes de inibir o crescimento de células de melanoma altamente maligno.

(xii) Uma proteína sll_-6R/IL-6 e seus análogos biologicamente ativos, como acima, onde a dita proteína quimérica e análogos são caracte- rizados por ser capazes de elicitar o enxerto in vivo de células hematopoiéti- cas humanas em transplantes de medula óssea.

(xiii) Uma proteína slL-6R/ll-6 quimérica e seus análogos biolo- gicamente ativos, como acima, onde a dita proteína quimérica e análogos são caracterizados por ser capazes de proteger o fígado contra agentes he- patotóxicos.

A presente invenção também provê uma seqüencia de DNA co- dificando uma proteína slL-6R/IL-6 quimérica e seus análogos biologica- mente ativos como notado acima de acordo com a invenção.

Em adição, a presente invenção também provê um vetor de DNA compreendendo uma seqüencia de DNA codificando uma proteína sIL- 6R/IL-6 e seus análogos biologicamente ativos da invenção, como notado acima, o dito vetor sendo apropriado para expressão da dita proteína quimé- rica em células mamíferas.

Realizações do vetor DNA da invenção incluem:

(i) Um vetor DNA onde o dito vetor é apropriado para expressão da dita proteína quimérica em células humanas. (ii) Um vetor DNA onde o dito vetor é expresso em células de mamíferos ou seres humanos, a proteína quimérica expressa tem uma se- qüencia que permite inteiro processamento da proteína quimérica pela cé- lula mamífera ou humana e secreção da proteína quimérica inteiramente processada a partir das células no meio de cultura onde as ditas células são crescidas.

(iii) Um vetor DNA1 como acima, onde o dito vetor é o plasmídio aqui designado pcDNAslL-6R/IL-6 compreendendo um vetor pcDNA3 con- tendo a seqüencia de DNA codificando a proteína slL-6R/IL-6 quimérica sob o controle de um promotor citomegalovírus (CMV).

(iv) Um vetor DNA, como acima, onde o dito vetor é o plasmídio aqui designado pcDNA SIL-6R/L/IL-6 compreendendo um vetor pcDNA3 contendo a seqüencia de DNA codificando a proteína SIL-6R/IL-6 quimérica sob o controle de um promotor citomegalovírus (CMV), e onde na dita se- qüencia de DNA codificando a dita proteína quimérica slL-6R/IL-6 é inserida uma seqüência Iigadora codificando um peptídio Iigador no sítio EcoRI colo- cado entre a seqüencia codificando a parte slL-6R e a seqüencia codifican- do a parte IL-6 da proteína.

Da mesma maneira, a presente invenção também provê células mamíferas transformadas contendo um vetor DNA como acima, que é capaz de expressar a seqüencia de proteína quimérica SIL-6R/IL-6 carreada pelo dito vetor e de processar inteiramente a proteína expressa e secretar a mesma no meio de cultura no qual as ditas células são desenvolvidas.

Uma realização destas células transformadas são as aqui des- critas células de rins embrionárias humanas 293 (HEK293) transfectadas pelo vetor pcDNA SIL-6R/I1-6, as ditas células sendo capazes de expressar a proteína quimérica SIL-6R/IL-6, processando inteiramente a dita proteína e secretando a dita proteína no meio de cultura onde as ditas células são crescidas na forma de uma glicoproteína de cerca de 85kDa.

Uma outra realização de células transformadas são as aqui des- critas células CHO (Ovário de Hamster Chinês) transfectadas pelo vetor pcDNA SIL-6R/IL-6, as ditas células sendo capazes de expressar a proteína quimérica SIL-6R/IL-6, inteiramente processando a dita proteína no meio de cultura no qual as ditas células são crescidas na forma de uma glicoproteína de cerca de 85kDa.

A presente invenção também provê um processo para produção de uma proteína quimérica ou seus análogos biologicamente ativos, como acima, compreendendo crescimento das células transformadas menciona- das anteriormente sob condições apropriadas para expressão, processa- mento e secreção da dita proteína ou análogos no meio de cultura onde as ditas células são desenvolvidas; e purificação da dita proteína ou análogos do dito meio de cultura por cromatografia de imunoafinidade usando-se an- ticorpos monoclonais específicos para slL-6R.

A proteína quimérica da presente invenção tem uma variedade de usos incluindo:

(i) uso de uma proteína SIL-6R/IL-6 ou análogos quiméricos, sais de qualquer um dos mesmos, e suas misturas, como um inibidor de células de câncer.

(ii) uso, como em (i) acima, como um inibidor de células de me- lanoma altamente malignas.

(iii) uso de uma proteína slL-6R/IL-6 quimérica ou análogos, sais de qualquer um dos mesmos, e suas misturas, como um ingrediente ativo para elicitar enxerto de células hematopoiéticas humanas em transplante de medula óssea.

(iv) uso de uma proteína SIL-6R/IL-6 ou análogos, sais de qual- quer um dos mesmos, e suas misturas, como um ingrediente ativo para crescente hematopoiese, para tratamento de condições hepáticas e neuro- lógicas, ou para outras aplicações onde IL-6 ou slL-6R são usadas.

Similarmente, a proteína quimérica da presente invenção pode ser usada para preparar medicamentos para uma variedade de indicações médicas, por exemplo, uma proteína sll_-6R]IL-6 quimérica ou análogos, sais de qualquer uma das mesmas e suas misturas, para uso na preparação de um medicamento para tratamento de cânceres por meio de inibição de células de câncer, ou na preparação de um medicamento para aperfeiçoa- mento de transplante de medula óssea por meio de elicitação de enxerto de células hematopoiéticas humanas em transplante de medula óssea, ou na preparação de um medicamento para aumento de hematopoiese, ou na pre- paração de um medicamento para tratamento de distúrbios neurológicos, ou na preparação de um medicamento para outras aplicações nas quais IL-6 ou slL-6R são usadas.

Além disso, a presente invenção também provê uma composi- ção farmacêutica compreendendo como ingrediente ativo uma proteína sIL- 6R/IL-6 quimérica ou seu análogo como acima, e um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Realizações desta composição farmacêutica da invenção incluem:

(i) Uma composição farmacêutica para o tratamento de cânceres de mamíferos.

(ii) Uma composição farmacêutica para o aperfeiçoamento de transplante de medula óssea.

(iii) Uma composição farmacêutica para o tratamento de distúr- bios do fígado e neurológicas, ou para aumentar hematopoiese ou para ou- tras aplicações onde IL-6 ou slL-6R sejam usadas.

A presente invenção também provê um processo para trata- mento de cânceres em mamíferos, ou para aperfeiçoamento de transplantes de medula óssea, ou para tratamento de distúrbios hepáticos e neurológi- cos, ou para aumento de hematopoiese, ou para outras aplicações nas quais IL-6 ou slL-6R sejam usadas, compreendendo administração a um paciente de uma composição farmacêutica, como acima, em uma forma de dosagem apropriada e através de uma rota de administração apropriada.

De modo a evitar-se dúvidas, a presente invenção refere-se a uma quimera entre IL-6 e slL-6R em qualquer ordem, isto é, as porções ter- minal-N e terminal-C podem ser reversas e a quimera é então uma proteína IL-6-slL-6R, embora seja preferido aqui como proteína SIL-6R/IL-6 na totalidade.

Outros aspectos e realizações da presente invenção são mos- trados ou surgem diretamente da seguinte exposição detalhada da invenção. Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 (A1B) mostra uma representação esquemática dos vários vetores, reagentes e etapas de processo usados na construção da molécula de DNA quimérica codificando uma proteína quimérica na qual é conservada a estrutura da forma natural de slL-6R terminando no resíduo Val 356 seguido pela seqüencia da forma natural, madura, processada, de IL-6, como detalhado no Exemplo 1;

A Figura 2 (A1B) mostra os resultados obtidos a partir das análi- ses realizadas para identificar a quimera sll_-6RÔVal/IL-6 p86 por eletrofore- se de gel de poliacrilamida (A) e por perfil de bioatividade (B)1 onde na figu- ra 2A é mostrada uma reprodução de um gel manchado Coomassie sobre o qual sofreram eletroforese frações imunopurificadas de colunas de cromato- grafia eluídas com uma amostra de proteína secretada obtida de culturas de células transfectadas com um vetor codificando a proteína quimérica; e na figura 2B é mostrada uma representação gráfica da atividade biológica (inibição de crescimento de células de melanoma F10.9) de cada uma das frações notadas acima eluídas das colunas de cromatografia de afinidade, tudo como detalhado nos Exemplos 2 e 3;

A Figura 3 mostra a seqüencia de aminoácidos (código de uma letra) da quimera slL-6RÔVal/IL-6 na qual são mostrados os diferentes do- mínios da molécula, incluindo o peptídio sinal N-terminal (linha sobre a se- qüencia), o domínio semelhante à imunoglobulina (semelhante-lg), o domí- nio-N receptor de citocina (sublinhado), o domínio-C citocina (linha sobre a seqüencia) e a região pré-membrana receptora (a região entre o domínio-C e o domínio trans-membranal), tudo da parte slL-6R da quimera; assim como a porção IL-6 madura (sublinhada abaixo) da quimera, como descrito nos Exemplos 1 e 2;

A Figura 4 (A1B) mostra fotografias de células de melanoma F10.9 em cultura sem tratamento (A) e com tratamento (B) com a proteína quimérica SIL-6R/IL-6 por 4 dias, onde na figura 4B são visíveis as mudan- ças morfológicas induzidas em tais células de melanoma metastáticas (células F10.9) por tratamento com a quimera slL-6R/IL-6, como descrito no Exemplo 3; A Figura 5 é uma representação gráfica dos resultados mos- trando a inibição de crescimento de células de melanoma F10.9 pela proteí- na quimérica SIL-6R/IL-6 em várias concentrações da quimera variando de cerca de 0,12 ng/ml a cerca de 150 ng/ml, onde a quimera com somente IL- 6RIL-6 Iigadora 3 aminoácidos como descrito no Exemplo 3 é comparada a uma quimera com Iigador de 13 aminoácidos (IL-6RLIL-6);

A Figura 6 é uma representação gráfica dos resultados mos- trando a ausência de efeitos de inibição de crescimento sobre células de melanoma F10.9 de IL-6 isolada sozinha (curva superior pontilhada com quadrados abertos) em concentrações variando de 0-40ng/ml de IL-6 e sIL- 6R sozinha (ponto de convergência de todas as curvas sobre o eixo vertical onde concentração de IL-6 é zero); assim como os efeitos inibidores de crescimento observados quando IL-6 e slL-6R são adicionadas juntas em várias concentrações de cada, onde a concentração de IL-6 varia de 10ng/ml a 40ng/ml, e slL-6R adicionada em três concentrações de 100ng/ml, 200ng/ml e 400ng/ml para cada concentração de IL-6, como ilustrado nas três curvas inferiores (duas curvas pontilhadas com triângulos abertos e círculos e cur- va cheia com quadrados fechados), como descrito no Exemplo 3;

A Figura 7 é uma reprodução de um autorradiograma de uma Southern blot mostrando o requisito da proteína quimérica SIL-6R/IL-6 para enxerto bem sucedido de células indiferenciadas hematopoiéticas humanas durante transplante de medula óssea em camundongos SCID-NOD (duas faixas à direita representando o camundongo que recebeu a proteína quimé- rica sIL-6R/IL-6 em adição a outros fatores necessários, SCF, FLT-3, e isto em contraste às três faixas à esquerda que representam camundongos ten- do recebido somente SCF e FLT-3 e SCF1 FLT-3 assim como isoladas, isto é, não-fundidas, IL-6 e slL-6R), como descrito no Exemplo 4;

A Figura 8 é um gráfico Scatchard das características de afini- dade da quimera SÍL-6R/IL-6 como comparada a uma mistura de IL-6 e sIL- 6R, os valores da quimera mostrados por quadrados cheios e da mistura por diamantes cheios, a razão das inclinações sendo 4 para 1;

A Figura 9 mostra a superior atividade da quimera sIL-6R/IL-6 sobre células de melanoma F10.9 como comparada com a da mistura de SIL-6R + IL-6, ou à de slL-6R (sem IL-6);

A Figura 10 mostra a proteção de quimera SIL-6R/IL-6 contra toxidez de fígado, os valores representando uma média de 4 experimentos, quadrados cheios representando IL-6-/-camundongo, diamantes cheios re- presentando IL-6-/-camundongos recebendo IL-6, e estrelas cheias repre- sentando 1L-6/-camundongos recebendo a quimera;

A Figura 11 mostra a seqüencia (código de uma letra) da quime- ra IL-6-slL-6R5Val 3e, o ligador sendo sublinhado; e

A Figura 12 mostra a atividade biológica sobre células de mela- noma de F10.9 da quimera 3e (estrelas escuras cheias) comparada à qui- mera slL-6R/IL-6 (quadrados cheios) e dois mutantes (Mutt 39 (HD) - dia- mantes cheios) e Mutt NHD - estrelas levemente cheias), como descrito no Exemplo 9.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção refere-se a uma proteína quimérica sIL- 6R/IL-6 e seus análogos biologicamente ativos que têm essencialmente to- das as formas ocorrendo naturalmente de slL-6R e essencialmente todas as formas ocorrendo naturalmente de IL-6 fundida junto, o sítio de fusão da qual pode ser por meio de um peptídio ligador, tão curto como 3 aminoáci- dos, e cuja proteína slL-6R/IL-6 quimérica ou análogos tem uma quantidade e padrão similares de glicosilação como aqueles de slL-6R e IL-6 ocorrendo naturalmente. Uma tal proteína slL-6R/IL-6 quimérica produzida de acordo com a presente invenção em células mamíferas, em particular, em células humanas (ver exemplos 1-4 abaixo) ou células CHO (ver Exemplo 6 abaixo) foi verificada ser eficientemente expressa em tais células, serem altamente glicosiladas, e terem potente atividade sobre células de tumor que não mostram resposta a IL-6 ou slL-6R sozinhas.

Mais particularmente, de acordo com a presente invenção foi observado (ver exemplos 1-3 abaixo) que a proteína SIL-6R/IL-6 quimérica da invenção mencionada anteriormente causa impedimento de crescimento de células mamíferas altamente malignas tais como as células de melanoma F10.9 em concentrações menores que necessárias quando uma mistura de slL-6R e IL-6 não-fundida é usada. Este é um resultado particularmente si- gnificante em vista do fato de que tais células de melanoma F10.9 continu- am a crescer normalmente quando tratadas com somente IL-6 ou somente slL-6R separadamente, e sofrem impedimento de crescimento somente quando expostas a dosagens relativamente altas de uma combinação de IL- 6 e slL-6R não-fundidas. Da mesma maneira, a proteína SIL-6R/IL-6 quimé- rica da presente invenção é surpreendentemente um inibidor mais potente destas células de melanoma altamente malignas que uma mistura de suas partes separadas, isto é, uma mistura de IL-6 e slL-6R não-fundidas. A pro- teína quimérica da presente invenção é assim particularmente útil como um ingrediente ativo para tratamento de vários tipos de cânceres.

A superior atividade da proteína SIL-6R/IL-6 quimérica é por conta de sua maior afinidade por gp130 que a mistura de IL-6 e slL-6R não- fundida (Exemplo 7).

Além disso, foi verificado de acordo com a presente invenção (ver exemplo 4 abaixo) que uma molécula SIL-6R/IL-6 quimérica da presente invenção é particularmente útil para aperfeiçoamento de transplante de me- dula óssea. De fato, usando-se um protocolo conhecido para enxerto de células de medula óssea humana em camundongos imunodeficientes com- binados severos (SCID), onde fator de célula indiferenciada (SCF) e Iigante- Flt3 são usados para permitir sobrevivência e proliferação das células indi- ferenciadas hematopoiéticas pluripotenciais primitivas capazes de enxerto de longo-termo em medula óssea de receptor, foi verificado que estes dois fatores, SCF e Iigante-Flt3, foram insuficientes para promoção de enxerto de células humanas na medula óssea de camundongo receptor, e que somente quando a proteína SIL-6R/IL-6 quimérica também foi adicionada o enxerto foi bem sucedido. Esta verificação indica que a proteína quimérica pode ser essencial em tais protocolos de enxerto. Nos mesmos experimentos, IL-6 e slL-6R não-fundidas quando adicionadas separadamente, foram insuficien- tes para promoção de transplante de medula óssea bem sucedido e quando adicionadas juntas foram muito menos ativas que a proteína SIL-6R/IL-6 qui- mérica, isto é, em uma concentração efetiva de 100ng/ml a proteína quimé- rica SIL-6R/IL-6 promoveu transplante de medula óssea bem sucedido, en- quanto as duas slL-6R e IL-6 não-fundidas separadas quando adicionadas juntas mesmo em concentrações superiores (slL-6R de 125-1250ng/ml, IL-6 de 50-200ng/ml), foram muito menos ativas na promoção de tais transplantes.

A proteína slL-6R/IL-6 quimérica acima é preferivelmente uma quimera slL-6R/IL-6 glicosilada recombinante produzida em células huma- nas ou em qualquer outro sistema de expressão de células mamíferas apro- priado tais como células CHO que seja capaz de glicosilação de proteínas como fazem células humanas e que introduz as mesmas modificações pós- translacionais como fazem células humanas. Uma característica importante é que a glicoproteína quimérica assim produzida seja processada e modifi- cada como são as moléculas parentes slL-6R e IL-6 naturais encontradas no corpo humano, sem truncação e sem adição de seqüencias de polipeptí- dios não-naturais estranhas, com a exceção do tripeptídio muito curto ou quando um peptídio Iigador mais longo é incorporado entre as porções sIL- 6R e IL-6 da proteína quimérica.

Para preparar a proteína quimérica preferida da invenção, as seguintes características de slL-6R e IL-6 ocorrendo naturalmente foram consideradas: É conhecido que a IL-6R presente em membranas de células humanas é produzida por um cDNA codificando 468 aminoácidos compre- endendo um peptídio sinal, um domínio semelhante a imunoglobulina (Ig), um domínio de ligação de citocina, uma região de transmembrana e um do- mínio citoplásmico (Yamasaki e outros, 1988). Uma forma solúvel de slL-6R é encontrada em fluidos do corpo que têm, como a IL-6R madura de mem- branas, um N-terminal correspondendo a Leu-20 (Novick e outros, 1990) e um C-terminal correspondendo a Val-356 justo antes da região de trans- membrana de IL-6R (ver patente US 5 216 128 e EP 413.908 B1). De modo a fundir esta seqüencia slL-6R a IL-6, um sítio de restrição EcoRI foi intro- duzido seguindo Val-356. A seqüência da IL-6 madura partindo em Pro-29 do cDNA IL-6 e terminando em Met-212 (Zilberstein e outros, 1986; Hirano e outros, 1986) foi introduzida após este sítio EcoRI. Neste sítio EcoRI tam- bém pode, mas não necessariamente, ser introduzido um peptídio Iigador de desejado comprimento para distanciar as porções slL-6R e IL-6 uma da ou- tra na proteína quimérica. Como mostrado nos Exemplos abaixo, duas dife- rentes proteínas quiméricas foram produzidas como exemplos de tais possí- veis proteínas quiméricas, uma tendo um Iigador tripeptídio e a outra tendo um Iigador resíduo de 13 aminoácidos neste sítio EcoRI1 ambas sendo es- sencialmente igualmente biologicamente ativas.

A presente invenção também refere-se a análogos da proteína slL-6R/IL-6 quimérica acima, cujos análogos retêm essencialmente a mesma atividade biológica da proteína quimérica tendo essencialmente somente as seqüencias ocorrendo naturalmente de slL-6R e IL-6. Tais análogos podem ser uns nos quais até cerca de 30 resíduos de aminoácidos podem ser su- primidos, adicionados ou substituídos por outros nas porções slL-6R e/ou IL-6 da proteína quimérica, de modo que modificações deste tipo não alte- rem substancialmente a atividade biológica do análogo de proteína quiméri- ca com relação à própria proteína quimérica e onde a porção slL-6R de tais análogos retém essencialmente a estrutura ocorrendo naturalmente (antes de processamento - ver figura 3) de um peptídio sinal, domínio semelhante a Ig, domínio-N receptor de citocina, domínio-C receptor de citocina e domínio pré-membrana receptor. Da mesma maneira, tais análogos de proteína qui- mérica devem reter essencialmente a forma madura ocorrendo naturalmente da porção IL-6. Os vários análogos podem diferir uns dos outros e da molé- cula de proteína quimérica básica (aquela com essencialmente somente seqüencias de slL-6R e IL-6 ocorrendo naturalmente) no sítio do peptídio Iigador que liga as porções slL-6R e IL-6 na proteína quimérica. Um tal Iiga- dor pode ser de até 30 aminoácidos em comprimento, e serve para separar as porções slL-6R e IL-6 uma da outra na proteína quimérica. Com relação a tal ligador, deve ser tomado cuidado para escolher-se sua seqüencia (e portanto também para testar biologicamente em ensaios padrões apropria- dos cada tal análogo) de modo que não resulte, por exemplo, em incorreta dobra da proteína quimérica o que pode torná-la inativa, ou não resultará em tornar o análogo de proteína quimérica uma proteína imunogênica que elicitará anticorpos contra ela em um paciente a ser tratado com a mesma com o resultado de que um tal análogo será ineficaz pelo menos como um medicamento de médio- ou longo-termo.

Com relação aos análogos acima da proteína quimérica da in- venção, estes análogos são aqueles nos quais um ou mais e até cerca de 30 dos resíduos de aminoácidos da proteína quimérica básica da invenção são substituídos por diferentes resíduos de aminoácidos, ou são suprimidos, ou um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados à seqüencia origi- nal de proteína quimérica da invenção (aquela com essencialmente somente as seqüencias slL-6R e IL-6 ocorrendo naturalmente ) sem alterar conside- ravelmente a atividade dos produtos resultantes como comparado com a proteína quimérica básica da invenção. Estes análogos são preparados por síntese conhecida e/ou por técnicas de mutagênese de sítio direcionado, ou qualquer outra técnica apropriada.

Qualquer tal análogo preferivelmente tem uma seqüencia de aminoácidos suficientemente duplicativa daquela da quimera SIL-6R/IL-6 básica de modo a ter atividade substancialmente semelhante à mesma. As- sim, pode ser determinado se qualquer dado análogo tem substancialmente a mesma atividade como a proteína quimérica básica da invenção por meio de experimentação rotineira compreendendo sujeição de um tal análogo aos testes de atividade biológica mostrados nos exemplos 2-4 abaixo.

Análogos da proteína quimérica que podem ser usados de acor- do com a presente invenção, ou ácidos nucléicos codificando os mesmos, incluem um conjunto finito de seqüencias substancialmente correspondentes como peptídios ou polinucleotídios de substituição que podem ser rotineira- mente obtidos por alguém versado na técnica, sem indevida experimenta- ção, baseado nos ensinamentos e orientação aqui apresentados. Para uma descrição detalhada de química e estrutura de proteína, ver Schulz, G.E. e outros, Principies of Protein Structure. Springer-Verlag1 New York, 1978; e Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties. W.H. Free- man & Co., San Francisco, 1983, que são aqui incorporados por referência. Para uma apresentação de substituições de seqüencia de nucleotídio, tais como preferências de códon, ver Ausubel e outros, supra em A. 1.1-A. 1.24, e Sambrook e outros, Current Protocols in Molecular Biology, Interscience N.Y. 6.3 e 6.4 (1987, 992), em Apêndices CeD.

Mudanças preferidas para análogos de acordo com a presente invenção são as conhecidas como substituições "conservativas". Substitui- ções conservativas de aminoácidos daqueles na proteína quimérica tendo essencialmente as seqüencias de slL-6R e IL-6 ocorrendo naturalmente, podem incluir aminoácidos sinônimos dentro de um grupo que tenha pro- priedades fisicoquímicas suficientemente similares de modo que substitui- ção entre membros do grupo preservará a função biológica da molécula, Grantham, Science. Vol. 185, pp. 862-864 (1974). É claro que inserções e supressões de aminoácidos também podem ser feitas nas seqüencias men- cionadas acima sem alteração de sua função, particularmente se as inser- ções ou supressões somente envolvem uns poucos aminoácidos, por exem- plo, abaixo de trinta, e preferivelmente abaixo de dez, e não removem ou deslocam aminoácidos que são críticos para uma conformação funcional, por exemplo, resíduos cisteína, Anfinsen, "Principies That Govern The Fol- ding of Protein Chains", Scinece, Vol. 181, pp. 223-230 (1973). Análogos produzidos por tais supressões e/ou inserções estão dentro do escopo da presente invenção.

Preferivelmente, os grupos de aminoácidos sinônimos são aqueles definidos na Tabela I. Mais preferivelmente, os grupos de aminoá- cidos sinônimos são aqueles definidos na Tabela II; e mais preferivelmente os grupos de aminoácidos sinônimos são aqueles definidos na Tabela III. Tabela I - Grupos Preferidos de Aminoácidos Sinônimos

Aminoácido Grupo Sinônimo Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His Leu lie, Phe, Tyr, Met, Vai, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Val Met, Tyr, Phe, lie, Leu, Val Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Ile Met, Tyr, Phe, Vai, Leu, Ile Phe Trp, Met, Tyr, lie, Vai, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, lie, Vai, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Asn Gln, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Met Phe, lie, Vai, Leu, Met Trp Trp Tabela II - Grupos Mais Preferidos de Aminoácidos Sinônimos

<table>table see original document page 22</column></row><table> Tabela III - Grupos Mais Preferidos de Aminoácidos Sinônimos

<table>table see original document page 23</column></row><table>

Exemplos de produção de substituições de aminoácidos em proteí- nas que podem ser usadas para obtenção de análogos da proteína quimé- rica para uso na presente invenção incluem quaisquer etapas de processo conhecidas, tal como apresentado nas patentes US RE33 653, 4 959 314, 4 588 585 e 4 737 462, para Mark e outros; 5 116 943 para Koths e outros, 4 965 195 para Namen e outros; 4 879 111 para Chong e outros; e 5017691 para Lee e outros; e proteínas substituídas com Iisina apresentadas na patente US 4 904 584 (Shaw e outros).

Em uma outra realização preferida da presente invenção, qual- quer análogo da proteína quimérica para uso na presente invenção tem uma seqüencia de aminoácidos correspondendo essencialmente àquela da pro- teína quimérica básica notada acima da invenção. O termo "correspondendo essencialmente a" é pretendido para compreender análogos com mudanças menores para a seqüencia da proteína quimérica básica que não afetam suas características básicas, particularmente na medida em que sua habili- dade para inibir proliferação de célula de câncer ou promover transplantes de medula óssea, por exemplo, esteja relacionado. O tipo de mudanças que são genericamente consideradas caindo dentro da linguagem "correspon- dendo essencialmente a" são aquelas que podem resultar de técnicas de mutagênese convencionais do DNA codificando a proteína quimérica da in- venção, resultando em umas poucas menores modificações, e selecionando para a atividade desejada na maneira discutida acima.

Análogos de acordo com a presente invenção incluem aqueles codificados por um ácido nucléico, tal como DNA ou RNA, que hibridiza o DNA ou RNA sob condições rigorosas e que codificam uma proteína quimé- rica de acordo com a presente invenção, compreendendo essencialmente todas as seqüencias ocorrendo naturalmente codificando slL-6r e IL-6. Por exemplo, um tal DNA ou RNA hibridizante pode ser um codificando a mesma proteína da invenção tendo, por exemplo, a seqüencia mostrada na figura 3, mas que difere em sua seqüencia de nucleotídios da seqüencia de nucleotí- dios derivada naturalmente em virtude de degeneração do código genético, isto é, uma seqüencia de ácidos nucléicos um pouco diferente ainda pode codificar a mesma seqüencia de aminoácidos, devido a esta degeneração. Ainda, como também notado acima, a quantidade de mudanças de aminoá- cidos (supressões, adições, substituições) é limitada a até cerca de 30 ami- noácidos, de modo que mesmo com a quantidade máxima de alterações, análogos de acordo com a presente invenção serão aqueles que essencial- mente retém a seqüencia líder (antes de processamento), domínio seme- lhante a Ig, domínios N- e C receptor de citocina e região pré-membrana re- ceptor (a região entre o domínio-C e o domínio transmembranal) na porção slL-6R e essencialmente toda a porção IL-6. Tal ácido nucléico pode ser um candidato principal para determinar se ele codifica um polipeptídio que re- tém a atividade funcional da proteína quimérica da presente invenção. O termo "condições rigorosas" refere-se à hibridização e subseqüentes condi- ções de lavagem que aqueles versados na técnica convencionalmente refe- rem-se como "rigorosas". Ver Ausubel e outros, Current Protocols in Mole- cular Bioloav. supra. Interscience, N.Y. para. 6.3 e 6.4 (1987, 1992), e Sam- brook e outros, supra. Sem limitação, exemplos de condições rigorosas in- cluem condições de lavagem de 12-20°C abaixo de Tm calculada do híbrido sob estudo em, por exemplo, 2xSSC e 0,5% SDS por 5 minutos, 2xSSC e 0,1% SDS por 15 minutos; 0, IxSSC e 0,5% SDS a 37°C por 30-60 minutos e então 0,1 χ SSC e 0,5% SDS a 68°C por 30-60 minutos. Aqueles versados na técnica entendem que condições rigorosas também dependem do com- primento das seqüencias de DNA, sonas de oligonucleotídios (tais como 10- 40 bases) ou sondas de oligonucleotídios mistas. Se sondas mistas são usadas, é preferível usar-se cloreto de tetra metil amônio (TMAC) ao invés de SSC. Ver Ausubel. supra.

O termo "sais" aqui refere-se a ambos sais de grupos carboxila e a sais de adição ácida de grupos amino da proteína quimérica da inven- ção ou seus análogos. Sais de um grupo carboxila podem ser formados por meios conhecidos na técnica e incluem sais inorgânicos, por exemplo, sais de sódio, cálcio, amônio, férricos ou de zinco, e semelhantes, e sais com bases orgânicas como aqueles formados, por exemplo, com aminas, tais como trietanol amina, arginina, ou lisina, piperidina, procaína e semelhan- tes. Sais de adição ácida incluem, por exemplo, sais com ácidos minerais tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico, e sais com áci- dos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido acético, ou ácido oxálico. É claro, quaisquer tais sais têm de ter atividade substancialmente similar à proteína quimérica da invenção ou seus análogos.

A presente invenção também refere-se a seqüencias de DNA codificando a proteína quimérica acima da invenção e seus análogos, assim como vetores DNA carreando tais seqüencias de DNA para expressão em células mamíferas apropriadas, preferivelmente humanas. Uma realização de um vetor da invenção é um plasmídio pcDNA SIL-6R/IL-6 compreenden- do o vetor pcDNA3 (Invitrogen) contendo as seqüencias fundidas SIL-6R/IL- 6 sob o controle de um promotor citomegalovírus (CMV).

A presente invenção também refere-se a células de mamífero transformadas, preferivelmente humanas, capazes de expressarem as pro- teínas acima da presente invenção. Uma realização de tais células trans- formadas são células de rim embrional humano 293 (HEK 293, ATCC CRL 1573) transfectadas por pcDNA SIL-6R/IL-6 que secretam a slL-6R/IL-6 qui- mérica fundida como uma glicoproteína de 85kDa.

Ainda uma realização é plasmídio pcDNA SIL-6R/L/IL-6 que dife- re do pcDNA slL-6R/IL-6 acima por inserção no sítio EcoRI de Iigadores cur- tos codificando 10 aminoácidos adicionais. Um número de diferentes seqüen- cias, de vários comprimentos, podem ser introduzidas para otimização de distância entre slL-6R e IL-6.

A invenção também inclui uma proteína quimérica na qual a por- ção IL-6 precede a slL-6R (como na figura 11).

A presente invenção ainda refere-se a um processo para produ- ção e purificação de proteína quimérica da invenção ou seus análogos que compreende crescimento das células transformadas acima sob condições apropriadas para expressão e secreção do produto proteína quimérica no meio de cultura e então purificação da proteína secretada por cromatografia de imunoafinidade usando-se anticorpos monoclonais anti-slL-6R 34.4 como notado no Exemplo 2 e 5 abaixo.

A invenção também refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo como ingrediente ativo uma quimera SIL-6R/IL-6 ou seus análogos ou suas misturas ou seus sais e um carreador, diluente ou excipi- ente farmaceuticamente aceitável. Uma realização da composição farma- cêutica da invenção inclui uma composição farmacêutica para aperfeiçoada ação tipo IL-6, para o tratamento de cânceres, para tmasplante de medula óssea, para aumento de hematopoiese, em particular trombopoiese, para tratamento de condições neurológicas, para o tratamento de distúrbios do fígado, e outras aplicações de IL-6 ou citocinas relacionadas.

As composições farmacêuticas da invenção são preparadas para administração por mistura da proteína quimérica, ou seus análogos com carreadores, e/ou estabilizadores, e/ou excipientes fisiologicamente aceitáveis, e preparadas em forma de dosagem, por exemplo, por Iiofiliza- ção em frascos de dosagem. O processo de administração pode ser via qualquer dos modos de administração aceitos para agentes similares e de- penderá da condição a ser tratada, por exemplo, intravenosamente, intra- muscularmente, subcutaneamente, por injeção local ou aplicação tópica, ou continuamente por infusão, etc. A quantidade de composto ativo a ser admi- nistrada dependerá da rota de administração, a doença a ser tratada e a condição do paciente. Injeção local, por exemplo, irá requerer uma menor quantidade da proteína em uma base de peso de corpo do que infusão intra- venosa.

A presente invenção também refere-se a usos da proteína qui- mérica da invenção ou seus análogos ou suas misturas para o tratamento de cânceres, para transplantes de medula óssea, para aumento de hemato- poiese, especialmente trombopoiese, para tratamento de condições neuro- lógicas, para proteção de tecidos de fígado em pacientes com doenças ne- cróticas devido a compostos químicos (por exemplo, tetracloreto de carbono, álcool, paracetamol) ou outras causas (por exemplo, viral, cirúrgica) e para uso em outras aplicações de IL-6 ou citocinas relacionadas. Da mesma ma- neira, a presente invenção também refere-se a proteína quimérica ou seus análogos ou suas misturas para uso na preparação de medicamentos para tratamento das doenças mencionadas acima ou para uso nas indicações notadas acima.

Em adição aos processos de tratamento mencionados acima, também procedimentos ex-vivo e terapia de gene com a quimera e ou DNA codificando a mesma, são contemplados.

A presente invenção será agora descrita em mais detalhes nos seguintes Exemplos não-limitantes e os desenhos acompanhantes. Exemplo 1: Construção do vetor de expressão de quimera slL-6R5Val/IL-6

Na Figura 1, é mostrado um fluxograma esquemático das etapas para construção de vetor de expressão transportando a seqüencia codificando a proteína quimérica sIL76RôVal/lL-6, inclusive de todos os vários vetores de partida e intermediários, vários reagentes e etapas de reação. Este procedi- mento de construção foi essencialmente usando técnicas bem conhecidas para construção de vetores de expressão de escolha (ver, por exemplo, Sambrook e outros, 1989). O procedimento foi, resumidamente, como se segue:

Uma biblioteca de DNAc's de células T47D de carcinoma de ma- ma humano foi clonada no bacteriofago lambda(X)gt11 e selecionada com sondas oligonucleotídio derivadas da seqüencia IL-6R de Yamasaki e outros (1988). Um clone de Xgt11 DNAc foi isolado o qual teve a seqüencia codifi- cando IL-6R humana inteira. A inserção foi excisada de Xgtl 1 por EcoRI e clonada no sítio de clonagem múltipla (MCS) do fagemídio E.coli Blue script pBS/SK (Stratagene Cloning Systems, LaJoIIa, Califórnia). Este plasmídio pBS/SK-IL-6R (Figura 1) foi cortado por EcoRI que foi então terminado-em- botado e recortado com EcoRV para isolar o fragmento 5' de IL-6R de 959 pa- res de bases (bp) terminando no sítio EcoRV de IL-6R (coordenada 1203). Este fragmento extraído de uma eletroforese de gel agarose foi clonado em um novo vetor pBS/SK aberto no EcoRV do MCS (pBS/SK-slL-6R-RV na Figura 1).

O pBS/SK-IL-6R-DNA obtido anteriormente, notado acima, foi submetido a reação de cadeia polimerase (PCR) para amplificar um frag- mento de 368 bp entre o primer dianteiro 1137-1156 e o primer reverso 1505-1488. O primer reverso foi sintetizado com um sítio EcoRI seguindo imediatamente o códon para Valina-356 da IL-6R (ver figura 1), desde que este resíduo valina foi previamente determinado ser o aminoácido terminal- carbóxi da forma natural da slL-6R solúvel excretada na urina humana (Novick e outros, Oh e outros, 1996; patentes US 5 216 128 e EP 413908 B1). 0 produto de PCR foi cortado por EcoRV e por EcoRI e ligado em pBS/SK-slL-6R-RV entre o sítio EcoRV de IL-6R e o sítio EcoRI da MCS (Figura 1). O resultante plasmídio pBS-slL-6R-5Val-RI foi então encurtado para remoção de seqüencias não-traduzidas 5' por ligação do sítio Hindlll de MCS com o sítio Ncol no par de base 410 de IL-6R (ambos sítios sendo pri- meiro terminados-embotados), para render pBS-slL-6R-£Val-RI-Ncol (Figura 1).

A seqüencia IL-6 foi derivada de plasmídio ρΚΚβ2-7 que, como descrito anteriormente (Chen e outros, 1988), foi construída por inserção do BstNI-cut IFN-P2/IL-6 DNAc (Zilberstein e outros, 1986) no sítio EcoRI do vetor de expressão E.coli pKK223-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) usando- se um oligonucleotídio sintético com um sítio EcoRI seguido por um códon metionina e o códon para prolina-29 de IL-6 e terminando em um sítio BstNI(EcoRII). A inserção de IL-6 DNAc de ρΚΚβ2-7 termina 7 pares de ba- ses após o códon de terminação em um sítio NIaIV e é seguido 11bp de- pois pelo sítio Hindlll do vetor pKK223-3 (Figura 1). O DNA ρΚΚβ2-7 foi cortado com Hindlll, terminado-embotado e recortado com EcoRI e o DNAc IL-6 inserido em pBS-slL-6R-ôVal-RI-Ncol de modo a fundir a seqüencia madura de IL-6 (partindo em prolina-29) imediatamente após valina-356 da IL-6R e separado por somente 3 códons (Glu-Phe-Met). O resultante plasmídio pBS/SK-slL-6R/IL-6 (Figura 1) foi então recortado nos sítios Sa11 e Notl de sua MCS e a inserção foi clonada no sítio EcoRV de pcDNA3 (Invitrogen Corporati- on, San Diego, Califórnia). O plasmídio resultante pCDNA3-slL-6R/IL-6 (Figura 1) contém a inserção a jusante do forte promotor citomegalovírus (CMV) e se- guido por um sítio de poliadenilação assegurando eficiente transcrição da qui- mera slL-6R5Val/IL-6. A conservação da extremidade 5' da slL-6R na quimera assegura que com expressão em células mamíferas a função peptídio sinal e processamento do terminus-N da proteína quimérica serão como na slL-6R.

Como indicado acima, uma característica vantajosa da constru- ção slL-6R5Val/IL-6 é que ela é essencialmente a fusão da forma natural de slL-6R e da forma natural de IL-6 como elas existem no corpo humano, e sem seqüencias de polipeptídios estranhas. Entretanto, a conservação do sítio EcoRI na construção slL-6R5Val/IL-6 (Figura 1) permite facilmente in- troduzir-se segmentos polipeptídios Iigantes entre as porções slL-6R e IL-6. Uma tal construção com a seqüencia Iigante de 13 aminoácidos Glu-Phe- Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introduzida entre Val-356 de slL-6R e Pro-29 de IL-6, também foi conastruída (slL-6R5Val/L/IL-6). Exemplo 2: Expressão da quimera slL-6R5Val/IL-6 em células humanas

Usando-se essencialmente técnicas padrão de cultura de célula de mamífero, transfecção e análise de célula das células transfectadas para expressão da seqüencia de DNA recentemente introduzida para ser expres- sa (para procedimentos, ver, por exemplo, Sambrook e outros, 1989), a construção de plasmídio acima (Exemplo 1) foi usada para transfectar célu- las humanas e sua expressão ali foi avaliada. Em resumo, os seguintes pro- cedimentos foram empregados:

Células HEK 293 humanas (ATCC CRL 1573, células de rim em- brional humano primárias transformadas) foram transfectadas com a cons- trução plásmica pCDNA-3-slL-6R/IL-6 DNA (mostrada no exemplo 1 acima). Culturas de fase Iog de HEK 293 foram tripsinizadas e semeadas em placas Nunc de 9cm (2,5x106 células/placa). Um dia depois, transfecção foi realiza- da com 10ug de pCDNA3-slL-6R/IL-6 DNA através do procedimento de pre- cipitação com CaPO4 (Sambrook e outros, 1989) e 1 hora depois o meio mudado para DMEM-10% FCS e a cultura continuada por 16 horas adicio- nais. Após alteração do meio para DMEM-2% FCS, as proteínas secretadas foram coletadas por dois períodos consecutivos de 48 horas. Debris foram removidos por centrifugação em 1000rpm por 10 minutos e o sobrenadante testado por um ELISA para slL-6R usando anti-slL-6R coelho policlonal e ca- mundongo McAB 17.6 (Novick e outros, 1991). Uma concentração de 1^g/ml slL-6R-equivalentes foi verificada, indicativa de expressão muito eficiente da proteína SIL-6R/IL-6 quimérica nas células humanas transfectadas.

Imunopurificação da proteína quimérica secretada (slL-6R/IL-6) foi realizada com anticorpo monoclonal 34.4 específico para um epítopo no domínio extracelular de slL-6R humana (Novick e outros, 1991; Halimi e ou- tros, 1995). As células hibridoma 34.4 foram crescidas na cavidade perito- neal de camundongo e a fração imunoglobulina (Ig) foi obtida de fluido as- cite por precipitação com sulfato de amônio. Affigel-10 (Bio-Rad Labs, Ri- chmond, Califórnia) foi usado para imobilizar McAB 34.4 (15mg Ig acoplada a 1ml Affigel-10). Os sobrenadantes contendo as proteínas secretadas de células HEK 293 transfectadas por pCDNA3-slL-6R/IL-6 foram adsorvidos sobre colunas de McAB 34.4 (0,3ml coluna para 15ml de sobrenadante). Após lavagem com PBS1 as proteínas ligadas foram eluídas por ácido cítrico 25mM pH 2,5, então imediatamente neutralizadas por tampão Hepes 1M pH 8,5 e dializadas por toda a noite (cerca de 8-12 horas) contra PBS.

Análise da proteína imunopurificada por eletroforese de gel poli- acrilamida em SDS mostrou uma única banda de proteína manchada por azul Coomassie (figura 2). 0 peso molecular da proteína foi 85 kilodaltons como esperado da fusão das formas glicosiladas de sll_-6RôVal(60kDa como mostrado em Oh e outros, 1996) e IL-6 glicosilada (23-26 kDa como mostrado em Zilberstein e outros, 1986). A seqüencia de aminoácido da sIL- 6R/IL-6 é 543 aminoácidos, que após processamento dos peptídios sinais pode predizer uma proteína de 524 aminoácidos ou cerca de 58 kDa (Figura 3). O tamanho muito maior da quimera slL-6R/IL-6 produzida a partir de DNA recombinante em células humanas indica que glicosilação responde por uma porção talhável da molécula.

Exemplo 3: A quimera SIL-6R/IL-6 impede crescimento e induz diferenciação de células melanoma metastáticas

O clone F10.9 derivado de células melanoma B16 forma tumo- res altamente metastáticos em camundongo C57Black/6 que matam os ani- mais de metastases pulmonares dentro de 2-3 meses (Katz e outros, 1995). Adição da proteína quimérica SIL-6R/IL-6 a cultura de células F10.9 produz uma profunda mudança morfológica nas células e um impedimento de seu crescimento (Figura 4). As células F10.9 tratadas pela quimera tornam-se alongadas, com extensões dendríticas sobressaindo-se, parecendo a dife- renciação fusiforme de melanócitos embriônicos ou células gliais.

O crescimento das células foi quantificado 4 dias após semea- dura de 3x103 células em cavidades de uma microplaca de 96 cavidades em 0,2 ml de meio RPMI 1640 com 10% de FCS. As células foram fixadas em 12,5% glutaraldeído por 30 minutos, lavadas em água e manchadas com violeta cristal 0,1 % por 30 minutos. Após lavagem total e secagem, a man- cha foi extraída com 10% de ácido acético e a densidade ótica determinada em 540nm. A quimera produziu uma inibição dependente de dose de cres- cimento com uma completa inibição de crescimento em concentrações tão baixas como 10ng/ml da proteína quimérica (p85) (Figura 5). Ambas proteí- nas quiméricas sll_-6RôVal/IL-6 e slL-6R5Val/L/IL-6 (quimera com o Iigante mais longo entre as porções slL-6R e IL-6, ver exemplo 1) foram similar- mente ativas. Este resultado também serve para mostrar que o peptídio Ii- gante entre as porções slL-6R e IL-6 na quimera não é essencial para a ati- vidade da quimera na medida em que a quimera slL-6R5Val/IL-6 acima tem somente um Iigante de 3 aminoácidos muito curto enquanto slL-6RôVal/L/M- 6 acima tem um peptídio Iigante de 13 aminoácidos mais longo, mas ambas têm essencialmente a mesma atividade na inibição de crescimento das cé- lulas metastáticas. Em contraste, nem IL-6 sozinha, nem a slL-6R5Val sozi- nha inibe o crescimento destas células de melanoma (Figura 6) demons- trando a atividade única da proteína quimérica SIL-6R/IL-6 (p85). Para obter um efeito similar, uma mistura de 200-400ng/ml IL-6 e 125ng/ml slL-6R5Val é requerida (Figura 6). Quando calculada em concentrações molares, a ini- bição máxima de células F10.9 necessitou de 7,5 nM IL-6 e 2nM slL-6R5Val versus somente 0,12 nM da quimera SIL-6R/IL-6.

A atividade inibidora de crescimento da proteína quimérica slL/IL-6 p85 foi seguida durante a imunopurificação sobre colunas McAB 34.4 (ver Exemplo 2). O padrão de atividade correspondeu à intensidade da banda p85 vista nas diferentes frações da eletroforese de gel poliacrilamida SDS na Figura 2.

Exemplo 4: A quimera SIL-6R/IL-6 é essencial para enxerto de células trans- plantadas de medula óssea humana

Enxerto de células indiferenciadas hematopoiéticas a partir de medula óssea humana pode ser estudado após transplante em camundon- gos imunodeficientes combinados sérios (SCID) (Vormoor e outros, 1994). Camundongos SCID-NOD foram submetidos à irradiação subletal e injeta- dos na veia de cauda com 3x105 células de medula óssea CD34+ humanas. Antes da injeção, as células CD34+ purificadas foram mantidas por 3 dias em culturas líquidas com diferentes combinações de citocinas. Após um mês, os camundongos foram sacrificados e ossos tomados para coleta de células de medula óssea. O enxerto de células humanas no camundongo receptor SCID- NOD foi avaliado por hibridização Southern blot para DNA repetitivo humano.

Fator célula indiferenciada (SCF, steel factor ou ligante-ckit) e ligante-F1t3 (ligante f1t3/f1k2 receptor de tirosina cinase) foram verificados importantes para sobrevivência e proliferação das células indiferenciadas hematopoiéticas pluripotenciais mais primitivas capazes de enxerto de Ion- go-termo em medula óssea de receptor (McKenna e outros, 1995). Como visto na Figura 7, estes dois fatores por si próprios foram insuficientes para promoção de enxerto de células humanas na medula óssea do camundongo receptor SCID-NOD. Adição da proteína quimérica slL-6R/IL-6 foi requerida para o enxerto ser detectado em níveis significantes. Em 100 ng/ml, a quimera slL-6R/IL-6 foi muito mais ativa que a IL-6 isolada (50-200 ng/ml) e slL-6R (125- 1250 ng/ml) (Figura 7). O requisito para quimera SIL-6R/IL-6 indica que esta proteína é essencial para a sobrevivência e proliferação das células indiferen- ciadas hematopoiéticas pluripotenciais não-comprometidas que podem residir no e repopular o ambiente de medula óssea, indicando que esta proteína pode ser útil em protocolos clínicos de transplante de medula óssea.

Esta é a primeira demonstração de que a quimera SIL-6R/IL-6 tem pelo menos as seguintes duas novas atividades verificadas:

(i) Quando adicionada junto com ambos os fatores SCF e F1t-3 ligante a células progenitais primitivas hematopoiéticas humanas, ela pro- move sua sobrevivência e proliferação; e

(ii) Ela é ativa (e aparentemente essencial) em um modelo in vivo de um transplante de medula óssea humana em camundongo imunodeficiente.

Exemplo 5: A quimera slL-6R/IL-6 é ativa sobre células indiferenciadas he- matopoiéticas primitivas altamente purificadas

Células mononucleares de sangue de cordão humanas foram submetidas a fracionamento de células mononucleares de baixa densidade (NMC) sobre Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suiça) seguido por um mini kit MACS (Miltney Biotec1 Bergisch Gladbach, Alemanha) para pre- parar uma população pura de 80% de células CD34+. Estas células foram então passadas sobre anticorpo monoclonal anti-CD38 imobilizado ou cias- sificadas por classificação de célula ativada por fluorescência e a população CD34+CD38-, correspondendo a cerca de 0,1% das células originais, foi re- cuperada. Estas células indiferenciadas purificadas (20.000 células) foram colocadas em culturas de suspensão em 0,5 ml de meio RPMI1 10% de soro fetal de bezerro (FCS), 1% de albumina de soro bovino contendo 50ng/ml de fator de célula indiferenciada (SCF) e 100ng/ml f1t3-ligante(FL)(ambos de R&D Systems, Minneápolis, MN). Porções das culturas foi suplementada com 100ng/ml de quimera slL-6R/IL-6, as outras foram cultivadas sem. In- cubação foi a 37°C em 5% de Co2, por 6 dias. O número de células repopu- lantes de medula óssea foi avaliado por injeção (i.v.) de todas as células destas culturas in vitro em camundongos NOD-SCID irradiados subletal- mente. Os camundongos foram mantidos em condições livre de germe. Após 6 semanas, os camundongos foram sacrificados e a medula de seus ossos longos foi recuperada. Estas células de medula óssea (BM) foram revestidas sobre placas de metil celulose 0,9% semi-sólidas com 30% de FCS, 50 μΜ de β-mercaptoetanol, 50ng/ml SCF, 5 ng/ml IL-3, 5ng/ml GM- CSF1 6 u/ml eritropoietina (todos R&D Systems). As culturas também conti- veram soro humano, condições que evitam crescimento de colônias de ca- mundongos. Os resultados (Tabela IV) indicaram que a adição de quimera sIL-6R/IL-6 às culturas de suspensão produz um aumento de 30-50 vezes no número de células formando colônia humana (CFU) recuperadas dos camundongos transplantados como comparado a SCF e FL sozinhos. Isto representa um grande aumento no número de células indiferenciadas repo- pulantes-SCID em culturas de suspensão no dia 6 comparado ao dia 0. Na ausência de quimera sIL-6R/IL-6, SCF e FL não produziram aumento no número de células indiferenciadas durante os 6 dias de cultura de suspen- são. O DNA das células BM recuperadas dos camundongos NOD/SCID transplantados foi analisado por "Southern blot" como no Exemplo 4. A quantidade de DNA humano recuperado foi 10 vezes maior quando o ca- mundongo recebeu as células cultivadas com quimera quando comparado à sem quimera.

Os progenitores CFU de medula óssea de camundongos NOD/SCID como na Tabela IV, originaram células hematopoiéticas de dife- rentes linhagens mielóides (macrófago e granulócito) assim como linhagens eritróide e linfóide (por exemplo, CD19+, CD56+) somente quando as células de sangue humano foram cultivadas com quimera SIL-6R/IL-6 antes do transplante.

Tabela IV Células indiferenciadas humanas capazes de repopulação de medula óssea decamundongos NOD/SCID

<table>table see original document page 35</column></row><table>

Experimentos adicionais compararam o efeito de slL-6R/IL-6 sobre população de CD34+CD38" de sangue de cordão àquele sobre as cé- lulas indiferenciadas CD34+CD38" altamente purificadas. A expansão in vitro das células altamente purificadas foi muito mais fortemente aperfeiçoada por slL-6R/IL-6 do que aquela das células menos purificadas (Tabela V). Isto indica que as células tronco mais primitivas são o alvo preferencial do efeito de slL-6R/IL-6 sobre expansão de célula.

Tabela V Expansão In vitro de Células indiferenciadas Hematopoiéticas População de células se- Número de células no Número de células no dia 6 meadas (20.000 células) dia 6 com SC + FL com SC + FL + SIL-6R/IL-6

<table>table see original document page 35</column></row><table> A manutenção in vitro da atividade de repopulação de Medula Óssea foi medida aumentando-se o comprimento da suspensão de culturas de células indiferenciadas CD34+CD38" altamente purificadas antes da inje- ção nos camundongos NOD/SCID. O enxerto foi avaliado pela proporção de DNA humano na Medula Óssea dos camundongos receptores 6 semanas após i.v. das células cultivadas. Quando sll_-6R/IL-6 foi adicionada a SCF e FL durante as culturas, um alto enxerto (>1% de DNA humano) ainda foi observado após duas semanas de cultura, e o enxerto foi maior que nas células não-cultivadas. Em contraste, experimentos com culturas contendo SCF1 FL1 GM-CSF1 IL-3 mostraram que nenhuma célula repopulando-SCID permanece após uma semana de cultura (Bhata, Μ. E outros, J. Exp. Med. 186, 619-624, 1997).

Estes resultados mostram que SIL-6R/IL-6 permite expandir e manter, células indiferenciadas primitivas humanas capazes de enxerto em medula óssea de receptor. As células indiferenciadas permanecem ativas em um estado não-diferenciado enquanto multiplicando-se. A quimera sIL- 6R/IL-6 provê um novo meio de cultura de células hematopoiéticas de en- xerto. Isto também pode permitir uso de vetores retrovirais para introduzir genes em células indiferenciadas de enxerto, em protocolos de terapia ge- nética. Até agora, isto não foi possível com células indiferenciadas humanas porque estas células primitivas não podem ser mantidas in vitro em um es- tado em ciclo, como requerido para integração de DNA retroviral. A quimera slL-6R/IL-6 resolve este problema.

Exemplo 6: Produção de quimera IL-6R/IL-6 em células CHO

DNA de plasmídio SIL-6R/IL-6 pcDNA3 como na Figura 1, foi co- transfectado em células de ovário de hamster chinês (CHO), junto com DNA de plasmídio pDHFR como descrito em Mory e outros (DNA 5, 181-193, 1986). Entre os transfectantes crescendo em 50nM de Methotrexate, clone L12-[IL-6R/IL-6] foi isolado. Este clone foi verificado ser estável sobre mui- tas passagens e culturas semiconfluentes rotineiramente secretadas no meio de cultura totaliza 2,µg/ml da quimera IL-6R/IL-6.

Para purificação da quimera IL-6R/IL-6, 3,25 litros de meio de culturas de clone L12 em 2% de soro bovino foram concentrados para 200ml. Isto foi adsorvido sobre uma coluna de 18ml de anticorpo monoclo- nal slL-6R anti-humano 34.4 acoplado a pérolas de Affigel 10 e eluído como descrito (Novick e outros, Hybridoma, 10, 137-146, 1991). 25mM de um eluato de ácido cítrico foi imediatamente neutralizado com tampão Hepes 1 pH 8,6. As proteínas foram concentradas sobre uma membrana Amicon de corte de IOkDa para uma concentração final de 1 mg/ml. Com SDS-PAGE, uma banda simples de 85 kDa correspondendo à quimera IL-6R/IL-6 foi ob- servada. Glicosilação foi demonstrada por redução de tamanho após trata- mento com glicosidase (Boehringer, Mannheim). A atividade biológica da quimera IL-6R/IL-6 produzida por CHO foi verificada estável por pelo menos 5 meses a 4°C. Rotineiramente, estocagem é a -70°C.

Exemplo 7: Afinidade de quimera IL-6R/IL-6 a gp130

Quimera IL-6R/IL-6 produzida-CHO e uma mistura de IL-6 hu- mana e slL-6R foram comparadas para sua ligação à forma solúvel de gp130 (sgp 130), que é a segunda cadeia do sistema receptor para IL-6 (ver antecedentes). Uma placa de 96 cavidades de microtitulação (Nunc) foi re- vestida com anticorpo monoclonal gp 130 anti-humano e 50ng/ml de sgp130 (ambas de R&D Systems, Mineápolis) foi adicionada. Após lavagem em so- lução salina tamponada com fosfato, a quimera IL-6R/IL-6 foi adicionada em diferentes cavidades em diferentes concentrações variando de 0,1 a 50ng/ml. Em cavidades separadas, rhulL-6 (Ares-Serono, Geneva) foi adicionada em 500ng/ml junto com slL-6R5Val em concentrações de 2 a 500ng/ml. Após incu- bação por toda a noite a 4°C, anti-IL-6R policlonal de coelho (Oh e outros, Cytokine, 8, 401-409, 1996) foi adicionada, seguida por anti Ig de coelho de cabra conjugada com peroxidase de raiz forte que foi detectada por reação colorida (Sigma, St. Louis). A Figura 8 mostra um gráfico Scatchard dos re- sultados. A afinidade da quimera IL-6R/IL-6 para gp 130 foi verificada ser acima de 4 vezes maior do que aquela das duas partes da molécula adicionadas se- paradamente (6,3x1011M versus 2,6x10"10M). Este resultado está em linha e explica a maior atividade da quimera quando comparada à combinação IL-6 + slL-6R sobre células de melanoma e hematopoiéticas (Figura 9 e Exemplo 4). Exemplo 8: A quimera IL-6R/IL-6 protege de hepatotoxicidade

A injeção de tetracioreto de carbono(CCI4) a camundongos pro- duz uma séria necrose do fígado conduzindo à morte dos animais (Slater T.F. e outros, Philos. Trans. R. Soe. Biol. Sei. 311, 633-645, 1985). Quando camundongos que são geneticamente deficientes em IL-6 (IL-6"'") recebem doses relativamente baixas de CCI4 (2-3 ml/kg em peso de corpo) por inje- ção intraperitoneal, taxas de Ietalidade em 24 horas estão em torno de 70% (figura 10). Injeção da quimera IL-6R/IL-6 produzida por CHO uma hora an- tes de CCI4 e novamente 4 horas após CCI4 protege os animais e nenhuma morte é vista em 24 horas. Em contraste, rhulL-6 livre injetada similarmente não tem efeito (figura 10). A quimera IL-6R/IL-6 foi efetiva em doses de 2- 3μg por injeção, que em razão molar é 10 vezes menor do que a dose de IL- 6, que não foi eficaz. Em maiores doses de CCI4 (por exemplo, 3,5ml/kg na figura 10), a quimera também foi protetora, a mortalidade sendo menor do que com IL-6 ou sem citocina. A diferença em mortalidade entre camundon- gos tratados com quimera e camundongos não-tratados, ambos recebendo o mesmo desafio CCI4, foi significante em p<0,01. Observação histológica de seções de fígado manchadas com hematoxilina-eosina confirmaram que CCI4 produziu necrose de tecido de fígado, e que quimera IL-6R/IL-6 prote- ge os hepatócitos deste efeito químico tóxico (não-mostrado).

Uma aplicação da quimera IL-6R/IL-6 pode ser para proteção de tecido de fígado em pacientes com doenças necróticas devido a compostos químicos (por exemplo, álcool, paracetamol) ou outras causas (por exemplo, hepatite viral).

Exemplo 9: Construção e atividade de quimera IL-6/slL-6R5Val

Uma molécula quimérica na qual a porção IL-6 está no terminal- N enquanto a porção slL-6R está no terminal-C foi construída. Plasmídio pBS-slL-6RôVal foi cortado em Sau3a (bp 1086) e em Hindlll seguindo o códon de interrupção após Val-356 (ver Exemplo 1). Um Iigante contendo três sítios de restrição: Spel, Smal, e BamHI foi sintetizado como se segue: SpeI SmaI BamHl

CT AGT GGG CCC GGG GTG GCG GG

A CCC GGG CCC CAC CGC CCC TAG 5' (SEQIDN0:2)

Este sítio Sau3a de sll_-6R foi ligado à BamHI do Iigante e clo- nado no sítio de clonagem múltipla de um plasmídio Bluescript pBS SK. A seqüencia IL-6 foi amplificada por PCR a partir de DNA de ρΚΚβ2-7 usando- se primers (códon de iniciação sublinhados):

SpeI

Dianteiro 5' GA CTA GTA GCT ATG AAC TCC TTC TC (SEQIDNO:3) HaeIII

Traseiro 5' AG GGC CAT TTG CCG AAG AGC C (SEQIDNO:4)

O corte de produto de PCR com Spel e Haelll foi introduzido en- tre o sítio Spel e Smal do Iigante acima. Um outro Iigante BamHI-NcoI com um Smal interno foi sintetizado como se segue:

SmaI

5' GAT CCG GGC GGC GGG GGA GGG GGG CCC GGG CfNcoI] [BamH 1] GC CCG CCG CCC CCT CCT CCC GGG CCC GGT AC 5'

(SEQID NO: 5)

Este foi clonado entre BamHI do Iigante anterior e Ncol 1464 da seqüencia IL-6R. Um fragmento de IL-6R de Smal 867 a Ncol 1464 foi então introduzido entre Smal do segundo Iigante e Ncol de IL-6R. O DNA quiméri- co resultante foi seqüenciado e reclonado em pCDNA3 para expressão em células HEK 293 humanas. A seqüencia de aminoácidos desta quimera IL-6- 6R 3e é mostrada na Figura 11 (ligante sublinhado). Quimera 3e foi purifi- cada por cromatografia de afinidade sobre um anticorpo monoclonal anti-IL- 6 (como em Novick e outros, Hybridoma 8, 561-567, 1989). Sobre SDS- PAGE, uma banda de 75 kDa foi observada.

A atividade biológica da quimera IL-6-IL-6R 3e para inibir o cresci- mento das células de melanoma F10.9 é mostrada na figura 12. Ela é claramen- te ativa como comparada à quimera IL-6R/IL-6 (preparação 1-3) no mesmo ex- perimento, embora mais seja requerido para 50% de einibição de crescimento. Dois mutantes de IL-6R/IL-6 foram fabricados nos quais amino- ácidos His-280 e Asp-281 da porção IL-6R de IL-6R/IL-6 (figura 3) foram trocados para Ser e Val respectivamente por mutagênese de PCR (Mutante 39 ou HD), ou onde Asn-230 estava em adição alterada para Asp (mutante NHD). Como pode ser visto da figura 12, estes dois mutantes quase não tiveram atividade como comparados às quimeras IL-6R/IL-6 e IL-6-IL-6R. Uma vez que em IL-6R, estes aminoácidos interagem com gp130, como mostrado por modelagem molecular (Halimi e outros, 1995), isto demonstra que a quiemra SIL-6R/IL-6 conserva este sítio de interação essencial.

A quimera IL-6-IL-6R 3e está perdendo o domínio semelhante- imunoglobulina de IL-6R que está presente em IL-6R/IL-6. Entretanto, justa remoção deste domínio-lg de IL-6R/IL-6 não reduz sua atividade biológica sobre células F10.9. A ligação de quimera IL-6-IL-6R 3e a gp130 foi cerca de 30% daquela de uma outra quimera IL-6R/IL-6 (não-mostrada). Esta me- nor ligação está em linha com a menor atividade sobre o crescimento de célula melanoma.

Estes resultados demonstram que o bloqueio de terminal carbóxi de IL-6 por fusão através de um Iigante a slL-6R, conserva uma boa ativida- de biológica em tais novas quimeras. Referências

Chen L, Mory Y, Zilberstein A and Revel Μ. Growth inhibition of human breast carcinoma and leukemia/lymphoma cell lines by recombinant interferon-beta 2/IL-6. Proc. Natl. Acad. Sei. USA1 85:8037-8041, 1988.

Chernajovsky Y, Mory Y, Chen L, Marks Z1 Novick D1 Rubinstein M and Revel M. Efficient constitutive produetion of human fibroblast interfe- ron by hamster cells transformed with the IFN-β1 gene fused to an SV40 early promoter. DNA1 3:297-308, 1984.

Fiseher M, Goldsehimitt J, Pesehel C, Brakenhoff JPG1 Kallen K- J, Wollmer A, Grotzinger J and Rose-John S. A bioactive designer cytokine for human hematopoietic progenitor cell expansion. Nature Biotechnology 15:142-145, 1997.

Ganapathi MK1 Weizer AK1 Borsellino S1 Bukowski RM1 Gana- pathi S1 Rice T1 Casey G and Kawamura K. Resistance to lnterleukin-6 in human Non-small cell lung carcinoma cell lines: Role of receptor compo- nents. Cell Growth and Differentiation1 7:923-929, 1996.

Halimi H, Eisenstein M, Oh J, Revel M and Chebath J. Epitope peptides from interleukin-6 receptor which inhibit the growth of human mye- loma cells. Eur. Cytokine Netw., 6:135-143,1995.

Hirano T, Yasukawa K, Harada H, Taga T, Watanabe Y, Matsu- da T, Kashimura S, Nakajima K, Koyama K, Iwamatsu K1 Tsunasawa S, Sakiyama F, Matsui H, Takahara Y, Taniguchi T and Kishimoto T. Comple- mentary DNA for a novel interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulins. Nature1 234:73-76, 1986.

Hirano T, Matsuda T and Nakajima K. Signal transduction through gp130 that is shared among the receptors for the interleukin 6 re- lated cytokine subfamily. Stem cells, 12:262-277, 1994.

Holloway CJ. Applications of recombinant DNA technology in the produetion of glycosylated recombinant human granulocyte colony stimula- ting factor. Eur. J. Câncer, 30: S2-6, 1994.

Kahn MA and De Vellis J. Regulation of an oligodendrocyte pro- genitor cell Iine by the interleukin-6 family of cytokines. Glia1 12:87-98, 1994. Katz Α, Shulman LM, Porgador Α, Revel Μ, Feldman M and Eisenbach L. Abrogation of Β16 melanoma metastases by long-term low- dose lnterleukin-6 therapy. J. Immunother. 13:98-109, 1993.

Mackiewicz A, Wiznerowiez M1 Roeb E1 Nowak J1 Pawlowski T1 Baumann H, Heinrieh P and Rose-John S. lnterleukin-6-type cytokines and their receptors for gene therapy of melanoma. Ann. New York Acad. Sei., 762:361-374, 1995.

MeKenna HJ, de Vries P1 Brasel K, Lyman SD and Williams DE. Effeet of flt3 ligand on the ex vivo expansion of human CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood 86: 3413-3420, 1995.

Murakami M, Hibi M, Nakagawa N1 Nagakawa T, Yasukawa K, Yamanishi K, Taga T and Kishimoto T. IL-6 induced homodimerization of gp130 and associated activation of a tyrosine Kinase. Seienee1 260: 1808- 1810, 1993.

Noviek D, Englemann H, Wallaeh D, Leitner O, Revel M and Rubinstein M. Purifieation of soluble cytokine receptors from normal urine by ligand-affinity and immunoaffinity chromatography. J. Chromatogr., 510:331- 337, 1990.

Noviek D, Engelmann H, Revel M, Leitner O and Rubinstein M. Monoclonal antibodies to the soluble IL-6 receptor: affinity purification, ELI- SA and inhibition of Iigand binding. Hybridoma, 10: 137-146, 1991.

Novick D, Shulman LM, Chen L and Revel M. Enhancement of interleukin-6 cytostatic effect on human breast carcinoma cells by soluble IL- 6 receptor from urine and reversion by monoclonal antibodies. Cytokine, 4: 6-11,1992.

Oh J-W, Revel M and Chebath J. A soluble interleukin-6 recep- tor isolated from conditioned médium of human breast câncer cells is enco- ded by a differentially spliced mRNA. Cytokine, 8: 401-409, 1996.

Oh J-W. Expression of recombinant soluble human interleukin-6 receptors and analysis of their functions. Ph.D. Thesis Weizmann Institute of Science (Revel M, supervisor), 1997.

Paonessa G, Graziani R, DeSerio A,1 Savino R, Ciapponi L, Lahmm Α, Salvati AL1 Toniatti C and Ciliberto G. Two distinct and indepen- dent sites on IL-6 trigger gp130 dimer formation and signalling. EMBO J., 14: 1942-1951, 1995.

Revel M. Host defense against infections and inflammations: Role of the multifunctional IL-6/IFN-p2 cytokine. Experientia 45: 549-557, 1989.

Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Press, 1989.

Sui X, Tsuji K, Tanaka R, Tajima S1 Muraoka K, Ebihara Y, Ike- buchi K, Yasukawa K, Taga T, Kishimoto T and Nakahata T. Gp130 and c-kit signalings synergize for ex vivo expansion of human primitive hemopoietic progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 2859-2863, 1995.

Taga T, Hibi M, Hirata Y, Yamasaki K, Yasukawa K, Matsuda T, Hirano T and Kishimoto T. lnterleukin-6 triggers the association of its re- ceptor with a possible signal transducer gp130. Cell1 58: 573-581, 1989.

Vormoor J, Lapidot T, Pflumio F, Risdom G, Patterson B1 Bro- xmeyer HE and Dick JE. SCID mice as an in vivo model of human cord blo- od hematopoiesis. Blood cells 20: 316-320, 1994.

Ward LD, Howlett GJ, Discolo G, Yasukawa K, Hammaeher A, Moritz RL and Simpson RJ. High affinity interleukin-6 receptor is a hexame- ric complex consisting of two molecules each of interleukin-6, interleukin-6 receptor and gp130. J. Biol. Chem., 269: 23286-23289, 1994.

Yamasaki K, Taga T, Hirata Y1 Yawata H1 Kawanish Y1 Seed B1 Taniguchi T1 Hirano T and Kishimoto T. Cloning and expression of the hu- man lnterleukin-6 (BSF-2/lnterferon beta-2) receptor. Science, 241: 825-828, 1988.

Zilberstein A, Ruggieri R1 Korn HJ and Revel M. Structure and expression of of cDNA and genes for human interferon-beta-2, a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines. EMBO J., 5: 2529-2537, 1986. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

(1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTE:

(A) NOME: Yeda Research and Development Co. Ltd. (B) RUA: Weizmann Institute of Science, P.O.B. 95 (C) CIDADE: Rehovot (E) PAÍS: Israel (F) CÓDIGO POSTAL (CEP): 76100 (G) TELEFONE: 972-8-9344093 (H) TELEFAX: 972-8-9470739

(A) NOME: REVEL, Michel (B) RUA: Beit Brazil 5, Weizmann Institute of Science (C) CIDADE: Rehovot (E) PAÍS: Israel (F) CÓDIGO POSTAL (CEP): 76100

(A) NOME: CHEBATH, Judith (B) RUA: Rehov Miller 13 (C) CIDADE: Rehovot (E) PAÍS: Israel (F) CÓDIGO POSTAL (CEP): 76284

(A) NOME: LAPIDOT, Tsvee (B) RUA: Rehov Boxer 6 (C) CIDADE: Ness-Ziona (E) PAÍS: Israel (F) CÓDIGO POSTAL (CEP): 74046

(A) NOME: KOLLET, Orit (B) RUA: Rehov Ramat Chen 14 (C) CIDADE: Ramat Gan (E) CIDADE: Israel

(F) CÓDIGO POSTAL (CEP): 52232

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Proteína Receptora/Ligante Solúvel lnterleucina-6 Quimérica, Seus Análogos e Seus Usos

(iii) NÚMERO DE SEQÜÊNCIAS: 8

(iv) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR:

(A) TIPO DE MEIO: Disco flexível

(B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERACIONAL: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30

(EPO)

(vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: IL 121284

(B) DATA DE DEPÓSITO: 10-JUL-1997 (vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: IL 122818

(B) DATA DE DEPÓSITO: 30-DEZ-1997 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos

(B) TIPO: Aminoácido

(C) FILAMENTO: Simples

(D) TOPOLOGIA: Linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Peptídeo

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 1: Glu Phe Gly Ala Gly Leu Val Leu Gly Gly Gln Phe Met 1 5 10

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 44 pares de base

(B) TIPO: Ácido nucléico

(C) FILAMENTO: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 2: CTAGTGGGCC CGGGGTGGCG GGACCCGGGC CCCACCGCCC CTAG 44 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 25 pares de base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTO: Simples

(D) TOPOLOGIA: Linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 3: GACTAGTAGC TATGAACTCC TTCTC 25

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 21 pares de base

(B) TIPO: Ácido nucléico

(C) FILAMENTO: Simples

(D) TOPOLOGIA: Linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 4: AGGGCCATTT GCCGAAGAGC C 21

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 62 pares de base

(B) TIPO: Ácido nucléico

(C) FILAMENTO: Simples

(D) TOPOLOGIA: Linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

GATCCGGGCG GCGGGGGAGG GGGGCCCGGG CGCCCGCCGC CCCCTCCTCC CGGGCCCGGT 60 AC 62

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos

(B) TIPO: Aminoácido

(C) FILAMENTO: Simples

(D) TOPOLOGIA: Linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Peptídeo

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Gly Gly Gly Gly Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly 1 5 10

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 543 aminoácidos

(B) TIPO: Aminoácido

(C) FILAMENTO: Simples

(D) TOPOLOGIA: Linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Peptídeo

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 15

Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg 20 25 30

Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro 35 40 45

Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys 50 55 60

Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg 65 70 75 80

Leu Leu Leu Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys 85 90 95

Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val 100 105 110

Pro Pro Glu Giu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser 115 120 125 Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr 13C 135 140

Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp 145 150 155 160

Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys 165 170 175

Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met 180 185 190

Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe 195 200 205

Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val 210 215 220

Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp 225 230 235 240

Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg 245 250 255

Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp 260 265 270

Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His 275 280 285

Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser 290 295 300

Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser 305 310 315 320

Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr 325 330 335

Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr 340 345 350

Ser Leu Pro Vai Glu Phe Met Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys 355 360 365

Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile 370 375 380

Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys 385 390 395 400

Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 405 410 415

Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys 420 425 430

Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr 435 440 445

Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe 450 455 460 Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val 465 4 "70 475 480

Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr 485 490 495

Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala 500 505 510

Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser 515 520 525

Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met 530 535 540

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 471 aminoácidos

(B) TIPO: Aminoácido

(C) FILAMENTO: Simples

(D) TOPOLOGIA: Linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Peptídeo

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 15 10 15

Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro 20 25 30

Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr 35 40 45

Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile 50 55 60

Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser 65 70 75 80

Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala 85 90 95

Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu 100 105 110

Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr 115 120 125

Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln 130 135 140

Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn 145 150 155 160 Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu 165 170 175

Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His 180 185 190

Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala 195 200 205

Leu Arg Gln Met Gly Gly Gly Gly Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly 210 215 220

Pro Gly Val Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser 225 230 235 240

Pro Leu Ser Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser 245 250 255

Leu Thr Thr Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro 260 265 270

Ala Glu Asp Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys 275 280 285

Phe Ser Cys Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile 290 295 300

Val Ser Met Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr 305 310 315 320

Gln Thr Phe Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn 325 330 335

Ile Thr Val Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr 340 345 350

Trp Gln Asp Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe 355 360 365

Glu Leu Arg Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met

370 375 380

Val Lys Asp Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly 385 390 395 400

Leu Arg His Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly 405 410 415

Glu Trp Ser Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu 420 425 430

Ser Arg Ser Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala 435 440 445

Leu Thr Thr Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala 450 455 460

Asn Ala Thr Ser Leu Pro Val 465 470

Claims

1. Proteína interleucina-6 (IL-6) receptor de interleucina-6 (slL-6R) solúvel glicosilada quimérica (slL-6R/IL-6) e seus análogos biologicamente ativos, caracterizados pelo fato de que compreende um produto de proteína de fusão entre slL-6R e IL-6, a dita slL-6R/IL-6 e seus ditos análogos retêm o mesmo padrão de glicosilação como as seqüências ocorrendo naturalmen- te quando expressas em células mamíferas, em que slL-6R e IL-6 são for- mas ocorrendo naturalmente ou são caracterizadas por adições de até 20 aminoácidos, supressões de até 30 aminoácidos e/ou substituições de até 30 aminoácidos às seqüências ocorrendo naturalmente e em que a dita sIL- 6R é fundida a IL-6 diretamente ou através de um molécula Iigante de peptí- deo que é um tripeptídeo da seqüência E-F-M (Glu-Phe-Met), ou um peptí- deo de 13 resíduos de aminoácidos de seqüência E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q- F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-VaI-Leu-GIy-GIy-GIn-Phe-Met).

2. Proteína slL-6R/IL-6 quimérica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que possui um tripeptídio de seqüência E-F-M entre Val-356 terminal-C de slL-6R e a Pro-29 terminal-N de IL-6, a dita pro- teína quimérica tendo a seqüência SEQ ID NO: 7.

3. Proteína slL-6R/IL-6 quimérica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que possui um Iigante peptídeo de 13 aminoáci- dos da seqüência E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M entre Val-356 terminal-C de slL-6R e Pro-29 terminal-N de IL-6, a dita proteína quimérica tendo a se- qüência SEQ ID NO: 7 onde o tripeptídeo de seqüência E-F-M entre posi- ções 357-359 da SEQ ID NO: 7 está substituído pela dita seqüência de pep- tídeos de 13 aminoácidos.

4. Proteína quimérica slL-6R/IL-6 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a dita proteína é produ- zida em células mamíferas in vitro em uma forma inteiramente processada.

5. Proteína SIL-6R/IL-6 quimérica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a dita proteína é produzida em células hu- manas.

6. Proteína slL-6R/IL-6 quimérica e seus análogos biologicamente ativos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizados pelo fato de que a dita proteína quimérica e análogos são capazes de inibir o crescimento de células de câncer altamente malignas, elicitar o enxerto in vivo de células hematopoiéticas humanas em transplantes de medula óssea ou de proteger o fígado de agentes hepatotóxicos.

7. Proteína SIL-6R/IL-6 quimérica e seus análogos biologicamen- te ativos de acordo com a reivindicação 6, caracterizados pelo fato de que as ditas células de câncer malignas são células de melanoma altamente malig- nas.

8. Seqüência de DNA, caracterizada pelo fato de que codifica uma proteína slL-6R/IL-6 quimérica e seus análogos biologicamente ativos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

9. Vetor de DNA1 caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de DNA, como definida na reivindicação 8, o dito vetor sendo apropriado para expressão da dita proteína quimérica em células mamíferas.

10. Vetor de DNA de acordo com a reivindicação 9, caracteriza- do pelo fato de que o dito vetor é apropriado para a expressão da dita prote- ína quimérica em células humanas.

11. Vetor de DNA de acordo com a reivindicação 9 ou 10, carac- terizado pelo fato de que o dito vetor é expresso nas ditas células, a proteína quimérica expressa tem uma seqüência que permite inteiro processamento da proteína quimérica pelas ditas células e a secreção da proteína quimérica inteiramente processada a partir das células no meio de cultura no qual as ditas células são desenvolvidas.

12. Processo para produção de uma proteína quimérica ou seus análogos biologicamente ativos, como definidos em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende o crescimento de células transformadas contendo um vetor de DNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11, e capazes de expressar a seqüên- cia de proteína quimérica SIL-6R/IL-6 carreada pelo dito vetor e de processa- rem inteiramente a proteína expressa e secretarem a mesma no meio de cultura no qual as ditas células são crescidas, sob condições apropriadas para expressão, processamento e secreção da dita proteína ou análogos no meio de cultura no qual as ditas células estão crescendo; e purificando a dita proteína ou análogos a partir do meio de cultura.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a purificação é realizada por cromatografia de imunoafini- dade utilizando anticorpos monoclonais específicos para slL-6R.

14. Uso de uma proteína SIL-6R/IL-6 quimérica ou análogos, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, sais de qualquer um dos mesmos, e suas misturas, caracterizado pelo fato de ser como um inibidor de células de câncer ex vivo.

15. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as células de câncer são células de melanoma altamente malignas.

16. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende, como ingrediente ativo, a proteína SIL-6R/IL-6 quimérica ou seu análogo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, sais de qualquer um dos mesmos, ou a seqüência de DNA, como definida na rei- vindicação 8, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento de cânceres.

18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de ser para o aperfeiçoamento de transplante de me- dula óssea.

19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento de distúrbios de fígado ou neurológicos, ou para aumento de hematopoiese ou para outras aplicações nas quais IL-6 ou slL-6R são usadas.