TW201400812A - 用於選擇及淘汰癌症病人接受免疫反應產生療法之質譜方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種用於在治療之前預測癌症病人可能或不可能受益於基於酵母之免疫反應產生療法單獨投與或與另一抗癌療法組合投與之方法及系統,該免疫反應產生療法可係針對基於突變Ras之癌症之基於酵母之免疫療法。該方法使用血液源病人樣本之質譜分析及電腦,該電腦係組態為分類器且使用來自受益於或不受益於免疫反應產生療法單獨或與另一抗癌療法之組合之其他癌症病人之類別經標記光譜的訓練集合。本發明亦揭示治療癌症病人之方法,其包含將基於酵母之免疫反應產生療法(其可為針對基於突變Ras之癌症之基於酵母之免疫療法)投與藉由本文所揭示之預測性質譜方法中之測試所選擇之病人,其中該等光譜之該類別標記指示該病人可能受益於該基於酵母之免疫療法。
Description
此申請案根據35 U.S.C.§119(e)主張對2012年6月26日提出申請的美國臨時申請案第61/664,308號及對2012年6月26日提出申請的美國臨時專利申請案第61/664,329號之優先權益。美國臨時專利申請案第61/664,308號及美國臨時專利申請案第61/664,329號中每一者之整體內容以引用的方式併入本文中。
本發明係由於2012年2月22日執行之聯合研究協議之各方完成或代表其利益。聯合研究協議之各方係:Biodesix公司及GlobeImmune公司。
此申請案含有作為文字檔案由EFS-Web以電子方式提交之序列表。該稱為「12-621-PRO_ST25」之文字檔案之大小為19KB位元組,且係於2013年3月15日記錄。該文字檔案中所含有之資訊根據37 CFR § 1.52(e)(5)以整體引用之方式併入本文中。
本發明概言之係關於指導癌症病人之治療方法的領域。更具體而言,在一個態樣中,本發明係關於在初始治療之前預測病人是否係
可能受益於投與免疫反應產生療法(例如,作為細胞免疫療法藥劑)單獨投與或另外投與標準抗癌藥物及/或用於癌症治療之其他治療方案之一類病人之成員。亦揭示識別不可能受益於免疫反應產生療法之病人及/或將免疫反應產生療法添加至標準化學治療劑之方法。本發明之方法使用自該病人之血液源樣本獲得之質譜數據、組態為分類器對該質譜數據操作之電腦及包含來自其他癌症病人之類別經標記光譜之訓練集合。
癌症係各種疾病之廣泛群組,所有均涉及失調之細胞生長。在癌症中,細胞無控制地分裂並生長,形成惡性腫瘤,並侵襲身體之附近部分。癌症亦可藉助淋巴系統或血流擴散至身體之較遠部分。根據追蹤該等統計之國家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI),據估計2012年美國新癌症病例之數量為1,638,910(不包括非黑色素瘤皮膚癌),且估計在美國每年癌症死亡之數量為577,190(http://cancer.gov/cancertopics/cancerlibrary/what-is-cancer)。存在針對癌症之管理及治療選項。主要選項包括手術(例如,手術切除腫瘤)、化學療法、放射療法、靶向癌症療法(例如,特定靶向涉及腫瘤生長及進展之分子的小細胞藥物或單株抗體療法)及安寧療護或其一些之組合(在本文中統稱為「抗癌療法」)。
癌症之額外療法包括用於誘導、增強或抑制免疫反應之治療策略,其統稱為「免疫療法(immune therapies、immunotherapies)」(其在本文中亦可通稱為「免疫反應產生療法」)。最近,免疫療法已變得在治療晚期或轉移性實體腫瘤中具有更重大作用。用於癌症之免疫療法通常經設計以增加或刺激病人之自身免疫反應,以更好的控制或消除癌細胞,且另外可支援其他治療,例如化學療法、手術、放射療法及靶向癌症療法之使用。用於腫瘤學中之該等免疫療法之一些實例
包括:(1)PROVENGE®(Dendreon),其中刺激樹突細胞以激活針對抗原之細胞毒性反應用於晚期閹割抗性前列腺癌;(2)T細胞之授受性轉移以激活針對癌症之細胞毒性反應;(3)藉由併入已併入經設計以辨識腫瘤抗原之T細胞受體之病毒來基因改造T細胞;(4)Algenpantucel-L,一種癌症疫苗,其包含經轉染以表現鼠科動物具有潛在抗腫瘤活性之α-1,3-半乳糖基轉移酶之經輻照同種異體胰臟癌細胞;(5)基於病毒載體之免疫療法;及(6)基於酵母之免疫療法。
基於酵母之免疫療法亦稱為TARMOGEN®(GlobeImmune公司,Louisville,Colorado)技術,且通常係指以細胞外方式(在其表面上)、以細胞內方式(內部或胞質內)或以細胞外方式及細胞內方式二者表現一或多種異源性靶抗原之酵母媒介。已大體闡述基於酵母之免疫療法技術(參見例如美國專利第5,830,463號)。某些基於酵母之免疫療法組合物及製造及通常使用其之方法亦詳細闡述於(例如)美國專利第5,830,463號、美國專利第7,083,787號、美國專利第7,736,642號、Stubbs等人之Nat.Med.7:625-629(2001)、Lu等人之Cancer Research 64:5084-5088(2004)及Bernstein等人之Vaccine 2008年1月24日;26(4):509-21中,其每一者之整體以引用的方式併入本文中。用於癌症之基於酵母之免疫療法闡述於(例如)美國專利第7,465,454號、美國專利第7,563,447號、美國專利第8,067,559號、美國專利第8,153,136號、美國專利公開案第2009-0098154號及PCT公開案第WO 07/133835號中,其每一者之整體以引用的方式併入本文。
與其他免疫療法相比,基於酵母之免疫療法具有誘導針對靶抗原之先天性免疫反應以及寬範圍之適應性免疫反應之獨特能力,包括CD4-依賴性TH17及TH1 T細胞反應及抗原特異性CD8+ T細胞反應(其包括細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應),所有均不使用外源性佐劑、細胞因子或其他免疫刺激分子,該等之一些具有毒性問題。此外,舉例
而言,基於酵母之免疫療法組合物抑制調節性T細胞(Treg)成員及/或功能,由此增強通常可能受腫瘤之存在抑制之效應子T細胞反應。而且,與藉由產生抗體反應進行免疫之免疫治療組合物相比,據信由基於酵母之免疫療法所引發之抗原特異性、廣泛式且強效細胞免疫反應在靶向腫瘤細胞中特別有效,即使在面對原本可能係抑制環境之情形中。由於此類型之免疫療法利用抗原呈現細胞呈現相關免疫原之天然能力,無需知道靶抗原之CTL表位或II類MHC表位之精確身份來產生有效的基於酵母之免疫治療,亦無需自病人分離任何免疫細胞來產生免疫治療。實際上,在單一基於酵母之免疫治療組合物中可靶向多個CD4+及CD8+ T細胞表位,且因此不需要使用演算法及複雜公式來識別推定T細胞表位或T細胞反應。
已經開發一系列基於酵母之免疫療法之產品(包括GlobeImmune公司目前處於臨床開發之稱為「GI-4000」之TARMOGEN®產品候選物)以刺激針對病人之腫瘤所表現之Ras突變蛋白的免疫反應。「Ras」係在細胞(包括人類細胞)內部發現之相關蛋白質家族之名稱。所有Ras蛋白質家族成員均屬於稱為小GTPase之一類蛋白質,且涉及信號在細胞內之傳遞(細胞信號轉導)。在美國每年在一系列腫瘤類型中有大約180,000例新癌症病例中發現Ras突變,包括胰臟癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌、子宮內膜癌及卵巢癌以及黑色素瘤及多發性骨髓瘤。研究已顯示,具有Ras突變之腫瘤對習用化學療法以及靶向藥劑之反應性通常比具有正常Ras之腫瘤少。對於一些癌症(例如NSCLC或結腸直腸癌)而言,靶向表皮生長因子受體或EGFR之療法具有改良之臨床結果。然而,腫瘤中Ras突變之存在已與差的預後相關聯,儘管在結腸直腸癌中使用EGFR靶向療法。類似地,其他研究已顯示,患有Ras突變之結腸直腸腫瘤之病人與具有正常Ras之病人相比並不受益於西妥昔單抗(cetuximab)療法(另一種EGFR靶向藥劑),具有
正常Ras之病人當用相同療法治療時具有改良之存活率。因此,具有Ras突變之病人具有較少的可用有效治療選項。由於突變Ras在腫瘤生長中的作用,因此靶向減少含有Ras突變之細胞將使得改良患有許多人類癌症之病人的臨床結果。然而,目前在後期臨床試驗中沒有靶向突變Ras之可用療法。
免疫療法領域中之進展緩慢,但最近臨床成功有力的支援此途徑作為癌症治療模式之潛力。然而,業內需要定義識別將在癌症中自基於免疫之治療獲得臨床益處之病人及在治療之前識別臨床反應者及無反應者之生物標記。免疫療法標記之實例包括CD54表現及介白素12p70產生,但該等還未經充分驗證。亦使用若干種細胞免疫標記分析(細胞因子流式細胞術、MHC四聚體及酶聯免疫吸附點(ELISPOT))。重要的是要注意,預測受益於免疫療法之測試需要標準化以產生可重現及可比較結果。此在此領域中還未實現。
業內需要實際有用的測試用於在治療之前測定給定癌症病人是否可能受益於免疫反應產生療法單獨投與或與其他抗癌藥物療法組合投與,或相反該治療是否不能使給定癌症病人受益。本發明滿足此需要。
關於預測癌症病人自某些類型之藥物受益之所關注其他先前技術包括美國專利第7,736,905號、第7,858,390號;第7,858,389號、第7,867,775號、第8,024,282號;第7,906,342號及第7,879,620號、及2012年1月24日提出申請之申請中美國專利申請案第13/356,730號、及2011年2月22日提出申請之美國專利申請案第12/932,295號(作為US 2011/0208433公開),所有該等均受讓給Biodesix公司。該‘905專利及2011年2月22日提出申請之美國專利申請案第12/932,295號均以引用的方式併入本文中。該‘905專利尤其闡述用於測定NSCLC癌症病人是否可能受益於表皮生長因子受體(EGFR)靶向藥物之基於質譜分析之測
試。此測試以其商業版「VeriStrat」為人所知;應瞭解在以下討論中提及之「VeriStrat」係參考該‘905專利中所闡述之測試。
本發明概言之係關於指導癌症病人之治療方法的領域。在一個態樣中,癌症病人之該治療係針對癌症之免疫療法,且在一個態樣中,治療係針對癌症之基於酵母之免疫療法,且在另一態樣中,治療係針對突變Ras陽性癌(即,通常藉由偵測ras核苷酸序列中之突變,至少一些腫瘤對Ras突變蛋白為陽性之癌症)之基於酵母之免疫療法。在一個態樣中,治療係針對突變Ras陽性胰臟癌之基於酵母之免疫療法。
更具體而言,在一個態樣中,本發明係關於在初始治療之前預測癌症病人是否係可能受益於投與基於酵母之免疫反應產生療法(例如,作為細胞免疫療法藥劑)之一類病人之成員的方法,該免疫反應產生療法係單獨投與或另外利用標準抗癌藥物及/或用於治療癌症之其他治療方案治療。亦揭示識別不可能響應基於酵母之免疫療法及/或免疫療法加上標準化學治療劑之病人的方法。亦揭示識別不太可能或不可能響應基於酵母之免疫療法及/或基於酵母之免疫療法加上標準化學治療劑及/或其他癌症治療(例如,手術切除)之病人的方法。
在另一態樣中,本發明係關於在初始治療之前預測病人是否係可能受益於投與針對突變Ras陽性癌的基於酵母之免疫療法之一類病人之成員的方法,該免疫療法係單獨投與或另外投與標準抗癌藥物及/或用於治療癌症之其他治療方案。亦揭示識別不太可能或不可能響應針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法及/或針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法加上標準化學治療劑及/或其他癌症治療(例如,手術切除)之病人的方法。在一個態樣中,突變Ras陽性癌係胰臟癌。作為一個實例,此文件闡述用於預測胰臟癌症病人是否可能受益
於投與靶向突變Ras之基於酵母之免疫療法(例如,稱為GI-4000之產品系列,其在本文中更詳細闡述)與投與吉西他濱(gemcitabine)組合之方法。
本發明之方法使用自病人之血液源樣本獲得之質譜數據、組態為分類器針對質譜數據進行操作之電腦及包含來自其他癌症病人之類別經標記光譜之訓練集合。
申請者已發現一種在治療之前預測癌症病人可能或不可能受益於基於酵母之免疫反應產生療法單獨投與或與另一抗癌療法組合投與之方法。該方法係基於血液源樣本之質譜分析。血液源樣本(例如,血清、血漿)之使用很重要,因為其藉由觀察免疫系統之循環標記增加量測對免疫療法之總體敏感性之可能性。此外,方法可經由來自血液源樣本之簡單質譜分析測試快速實施,而不需要執行複雜耗時的病人樣本分析或自病人獲得腫瘤樣本。應注意,申請者已證明其自預處理所獲得樣本之測試的有效性。因此,測試之實際實施方案使用來自病人之預處理樣本並預測病人可能或不可能受益於基於酵母之免疫反應產生療法。
本發明之方法採取實際有用的測試的形式,其可借助質譜儀(例如,MALDI TOF儀器)及經組態以用作分類器之通用電腦執行。
在一個態樣中,闡述一種預測癌症病人是否可能受益於基於酵母之免疫反應產生療法單獨投與或另外投與其他抗癌療法之方法,其包含以下步驟:(a)獲得該病人之血液源樣本;(b)對該樣本實施質譜分析並自該樣本獲得質譜;(c)在程式化電腦中,對該質譜執行一或多個預定義之預處理步驟,在執行該等預處理步驟之後獲得在預定義之m/z範圍內該質譜中所選特徵之積分強度值,並將該等積分強度值與包含來自其他癌症病
人之類別經標記光譜的訓練集合相比較且藉此利用類別標記對該質譜進行分類。類別標記預測病人可能或不可能受益於免疫反應產生療法單獨或另外加上其他抗癌療法。舉例而言,類別標記可採取「緩慢」或「快速」之形式,其中「緩慢」指示病人可能受益且癌症之復發或疾病進展的時間相對較慢,而「快速」可指示病人不可能受益且復發或疾病進展之時間相對短暫。當然,可使用其他等效類別標記,例如「受益」、「不受益」、「良好」、「差」或諸如此類。
在一個態樣中,闡述一種預測癌症病人是否可能受益於針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法單獨投與或另外投與其他抗癌療法之方法,其包含以下步驟:(a)獲得欲利用針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法單獨治療或與其他抗癌療法組合治療之病人的血液源樣本;(b)對該樣本實施質譜分析並自該樣本獲得質譜;(c)在程式化電腦中,對該質譜執行一或多個預定義之預處理步驟,在執行該等預處理步驟之後獲得在預定義之m/z範圍內該質譜中所選特徵之積分強度值,並在利用針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法治療之前將該等積分強度值與包含來自其他癌症病人之類別經標記光譜的訓練集合相比較且藉此利用類別標記對該質譜進行分類。類別標記預測病人可能或不可能受益於針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法單獨或另外加上其他抗癌療法。舉例而言,類別標記可採取「緩慢」或「快速」之形式,其中「緩慢」指示病人可能受益且癌症之復發或疾病進展的時間相對較慢,而「快速」可指示病人不可能受益且復發或疾病進展之時間相對短暫。如上所述,可使用其他等效類別標記,例如「受益」、「不受益」、「良好」、「差」或諸如此類。在本發明之一個特定實施例中,執行測試之癌症病人係胰臟癌病人。在此實施例中,針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法可採
取GI-4000(下文詳細闡述)或等效物之形式。在一個態樣中,將針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法連同吉西他濱或等效物投與病人。在本發明此實施例之一個態樣中,突變Ras陽性癌可包括(但不限於)胰臟癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌(CRC)、子宮內膜癌、卵巢癌、黑色素瘤及多發性骨髓瘤。
在一個態樣中,認為上文或本文其他地方所闡述之上述預測方法中之任一者可單獨或作為其他標準抗癌藥劑之佐劑應用於其他癌症病人,包括(例如,但不限於)非小細胞肺癌(NSCLC)病人及結腸直腸癌(CRC)病人,此乃因相信在本發明中可用於分類之質譜特徵尤其與細胞炎性反應之調節及在寬腫瘤類型範圍內之預測性相關聯,如在2011年2月22日提出申請之美國專利申請案第12/932,295號及Biodesix公司之先前引用專利中所解釋。
上文或本文其他地方所闡述方法中之任一者中所用之訓練集合較佳呈來自受益於及不受益於免疫反應產生療法單獨投與或與另一抗癌療法組合投與之其他癌症病人之類別經標記光譜形式。分類中所用病人光譜中之特徵(m/z範圍)可經研究並自形成訓練集合之病人的質譜選擇。吾人推測,美國專利第7,736,905號中所用及本文表3及4所列舉在預測NSCLC病人受益於表皮生長因子受體抑制劑(EGFR-I)之完全不同情形中所建立之一或多個特徵係適用於本發明方法之特徵集合,此乃因其可將宿主免疫學及炎性反應與腫瘤相關聯(參見美國專利申請公開案2011/0208433)。(由於樣本類型實質上不同,因此用於分類之精確特徵值可與‘905專利及下文表1-4中之列表有所不同,例如取決於光譜之預處理期間執行之光譜對準(移位)。)不像該‘905專利中所用之訓練集合(來自響應或不響應EGFR靶向藥物之NSCLC病人的光譜)那樣,本發明方法中所用之訓練集合使用來自受益於免疫反應產生療法單獨投與或與另一抗癌療法組合投與及未能受益之病人的樣本
光譜。應注意,本申請案中之樣本類型不同於該‘905專利中所闡述之血清及血漿。然而,如下文所解釋,根據本文所給出形成訓練集合實例之光譜的研究,光譜中存在可用於分類之其他特徵。
在本發明之另一態樣中,闡述一種治療癌症病人之方法,其包含以下步驟:根據以上或本文其他地方所闡述之預測方法中之任一者實施測試,且若光譜之類別標記指示病人可能受益於基於酵母之免疫反應產生療法,則將基於酵母之免疫反應產生療法單獨投與或與另一抗癌藥劑組合投與該病人。
在一個態樣中,病人另外在利用針對癌症之基於酵母之免疫療法治療之前、與其同時或之後利用一或多種額外抗癌療法治療。在一個實施例中,該額外抗癌療法包括(但不限於)手術(例如,手術切除腫瘤)、化學療法、放射療法、靶向癌症療法(例如,特定靶向涉及腫瘤生長及進展之分子的小細胞藥物或單株抗體療法)及安寧療護或其任一組合。
在本發明之另一態樣中,闡述利用針對癌症之基於酵母之免疫療法治療癌症病人之方法,其包含以下步驟:將針對癌症之基於酵母之免疫療法投與藉由根據上文或本文其他地方所闡述之預測方法中之任一者之測試所選擇的癌症病人,其中光譜之類別標記指示病人可能受益於針對癌症之基於酵母之免疫療法。在一個態樣中,病人另外在利用針對癌症之基於酵母之免疫療法治療之前、與其同時或之後利用一或多種額外抗癌療法治療。在一個實施例中,該額外抗癌療法包括(但不限於)手術(例如,手術切除腫瘤)、化學療法、放射療法、靶向癌症療法(例如,特定靶向涉及腫瘤生長及進展之分子的小細胞藥物或單株抗體療法)及安寧療護或其任一組合。
在本發明之再一態樣中,闡述利用針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法治療癌症病人之方法,其包含以下步驟:根據上文或本
文其他地方所闡述之預測方法中之任一者實施測試,且若光譜之類別標記指示該病人可能受益於針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法,則投與該針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法。在本發明之此態樣中,病人患有癌症,其中已在來自該病人之至少一些腫瘤細胞中識別出突變Ras。在一個態樣中,病人另外在利用針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法治療之前、與其同時或之後利用一或多種額外抗癌療法治療。在一個實施例中,針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法係一系列稱為GI-4000之基於酵母之免疫療法產品或等效物中之產品。在本發明此實施例之一個態樣中,突變Ras陽性癌可包括(但不限於)胰臟癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌(CRC)、子宮內膜癌、卵巢癌、黑色素瘤及多發性骨髓瘤。在一個態樣中,該癌症係胰臟癌。在一個實施例中,該額外抗癌療法包括(但不限於)手術(例如,手術切除腫瘤)、化學療法、放射療法、靶向癌症療法(例如,特定靶向涉及腫瘤生長及進展之分子的小細胞藥物或單株抗體療法)及安寧療護或其任一組合。在一個態樣中,將針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法連同吉西他濱或等效物投與病人。在一個實施例中,病人係胰臟癌病人且療法包含一系列稱為GI-4000之基於酵母之免疫療法產品或等效物(下文詳細闡述)中之產品,其單獨或與吉西他濱或等效物組合。在一個態樣中,癌症病人之腫瘤已在利用基於酵母之免疫療法組合物治療之前手術切除。
在本發明之另一態樣中,闡述利用針對癌症之基於酵母之免疫療法治療癌症病人之方法,其包含以下步驟:將針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法投與藉由根據上文或本文其他地方所闡述之預測方法中之任一者測試選擇之癌症病人,其中光譜之類別標記指示該病人可能受益於針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法。在本發明之此態樣中,該病人患有癌症,其中已在該病人之腫瘤細胞中識別
出突變Ras。在一個態樣中,病人另外在利用針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法治療之前、與其同時或之後利用一或多種額外抗癌療法治療。在一個實施例中,針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法係一系列稱為GI-4000之基於酵母之免疫療法產品或等效物中之產品。在本發明此實施例之一個態樣中,突變Ras陽性癌可包括(但不限於)胰臟癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌(CRC)、子宮內膜癌、卵巢癌、黑色素瘤及多發性骨髓瘤。在一個態樣中,該癌症係胰臟癌。在一個實施例中,該額外抗癌療法包括(但不限於)手術(例如,手術切除腫瘤)、化學療法、放射療法、靶向癌症療法(例如,特定靶向涉及腫瘤生長及進展之分子的小細胞藥物或單株抗體療法)及安寧療護或其任一組合。在一個態樣中,針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法係連同吉西他濱或等效物投與病人。在一個實施例中,病人係胰臟癌病人且該療法包含一系列稱為GI-4000之基於酵母之免疫療法產品或等效物中之產品,其單獨或與吉西他濱或等效物組合。在一個態樣中,癌症病人之腫瘤已在利用基於酵母之免疫療法組合物治療之前手術切除。
在使用基於酵母之免疫療法治療患有癌症之病人的方法之任一態樣中,基於酵母之免疫療法可包括(但不限於)表現至少一種與病人之腫瘤相關聯或由其表現之癌症抗原之完整熱不活化重組酵母。在一個態樣中,酵母可來自酵母屬,包括(但不限於)酵母菌(Saccharomyces)。在一個態樣中,酵母可來自酵母種,包括(但不限於)啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。
在另一態樣中,揭示用於預測癌症病人是否可能受益於基於酵母之免疫反應產生療法單獨投與或與另一抗癌藥劑組合投與之系統。系統包括自癌症病人之血液源樣本產生質譜之質譜儀。系統亦包括儲存來自其他癌症病人之類別經標記光譜的訓練集合之機器可讀記憶
體。訓練集合包括複數個不受益於基於酵母之免疫反應產生療法單獨或與另一抗癌藥劑之組合之病人的類別經標記光譜及複數個受益於細胞免疫療法單獨或與另一抗癌藥劑之組合之病人的類別經標記光譜。系統進一步包括電腦系統,其經組態以對質譜進行操作並使用該訓練集合對該質譜進行分類,針對該質譜產生類別標記,其中該類別標記用於預測病人是否可能受益於基於酵母之免疫反應產生療法單獨投與或與另一抗癌藥劑組合投與。
在另一態樣中,揭示用於預測癌症病人是否可能受益於針對癌症之基於酵母之免疫療法單獨投與或與另一抗癌療法組合治療之系統。系統包括自癌症病人之血液源樣本產生質譜之質譜儀。系統亦包括儲存來自其他癌症病人之類別經標記光譜的訓練集合的機器可讀記憶體。訓練集合包括不受益於針對癌症之基於酵母之免疫療法單獨治療或與另一抗癌療法組合治療之複數個病人的類別經標記光譜及受益於針對癌症之基於酵母之免疫療法單獨治療或與另一抗癌療法組合治療之複數個病人的類別經標記光譜。系統進一步包括電腦系統,其經組態以對該質譜進行操作並使用該訓練集合對該質譜進行分類,針對該質譜產生類別標記,其中類別標記用於預測病人是否可能受益於針對癌症之基於酵母之免疫療法單獨投與或與另一抗癌療法組合治療。
在另一態樣中,揭示用於預測癌症病人是否可能受益於針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法單獨投與或與另一抗癌療法組合治療之方法。系統包括自癌症病人之血液源樣本產生質譜之質譜儀。系統亦包括儲存來自其他癌症病人之類別經標記光譜的訓練集合之機器可讀記憶體。訓練集合包括不受益於針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法單獨治療或與另一抗癌療法組合治療之複數個病人的類別經標記光譜及受益於針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法單獨治療或與另一抗癌療法組合治療之複數個病人的類別經標記光譜。
系統進一步包括電腦系統,其經組態以對該質譜進行操作並使用該訓練集合對該質譜進行分類,針對該質譜產生類別標記,其中類別標記用於預測病人是否可能受益於針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法單獨投與或與另一抗癌療法組合治療。在一個態樣中,用於突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法係稱為GI-4000之產品系列中之產品。在一個態樣中,突變Ras陽性癌係選自胰臟癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌(CRC)、子宮內膜癌、卵巢癌、黑色素瘤及多發性骨髓瘤。在一個態樣中,該癌症係胰臟癌。
10‧‧‧峰
12‧‧‧MALDI-TOF靶板
12’‧‧‧佈局
14‧‧‧樣本點或「點」
14’‧‧‧點F17
16‧‧‧位置座標系統/X/Y座標系統
18‧‧‧個別子點/矩形網格
30‧‧‧明亮位置
32‧‧‧暗位置
120‧‧‧相對較高產量之區域/晶體結構
122‧‧‧相對較高產量之區域/晶體結構
124‧‧‧左下方之區域/黑色區域
126‧‧‧基質區域/黑色區域
130‧‧‧儀器工作站
132‧‧‧影像
134‧‧‧一組點
150‧‧‧評估頁面
400‧‧‧實驗室測試處理系統
402‧‧‧血液源樣本
404‧‧‧MALDI-TOF板
406‧‧‧MALDI-TOF質譜儀
408‧‧‧質譜
410‧‧‧數據庫或機器可讀記憶體
412‧‧‧訓練集合
414‧‧‧通用電腦
420‧‧‧遠端MALDI-TOF儀器
422‧‧‧電腦網路
500‧‧‧光柵掃描圖案
502‧‧‧符號集合
以下詳細說明將參照附圖,該等附圖僅以實例方式提供且並非限制,且其中:圖1係示意圖,其顯示在胰臟癌中使用GlobeImmune之靶向突變Ras陽性癌且稱為GI-4000之基於酵母之免疫療法產品系列之2期臨床試驗的設計。
圖2A及2B係Kaplan-Meier曲線圖或無復發存活(RFS)及總體存活(OS),其圖解說明本發明之質譜分析方法識別可能在胰臟癌治療中受益於GI-4000與吉西他濱之組合之病人的能力。
圖3A-3F係在胰臟癌治療中在GI-4000及吉西他濱之研究中胰臟癌針對K-最近鄰分類演算法中所用不同K值,治療組及對照組二者中之病人的RFS及OS的成對Kaplan-Meier曲線圖。在圖3A-3B中,K值為1,在圖3C及3D中K值為3且在3E及3F中K值為5。曲線圖顯示申請者之分類器在治療組(利用吉西他濱及GI-4000二者治療之病人)中將受益病人與未能受益病人分開之能力,但另外治療組中之一些病人比對照組中之一些病人更差。因此,曲線圖證明申請者之質譜方法預測可能受益於利用免疫反應產生療法之治療的病人以及不可能受益於利用免疫反應產生療法之治療的病人的能力。
圖4A-4H係在GI-4000及吉西他濱研究中RFS及OS之Kaplan-Meier曲線圖的集合,如基於使用150,000次射擊利用血液源樣本之「深度MALDI」質譜分析方法使用本文及2012年5月29日提出申請之美國臨時專利申請案第61/652,394號(其內容以引用的方式併入本文中)中所闡述之技術獲得之光譜藉由分類器所定義。圖4A-4B、4C-4D、4E-4F及4G-4H各自基於用於分類之質譜中之不同峰集合分別代表來自四個不同分類器之RFS及OS的曲線圖。
圖5係用於在胰臟癌/GI-4000及吉西他濱研究中所用分類器驗證之交叉驗證方法之流程圖。
圖6係來自圖3E-3F之「稀釋並射擊」分類器的交叉驗證分析之「快速」與「緩慢」群組間針對RFS之風險比之分佈圖。
圖7A係在GI-4000及吉西他濱研究中在交叉驗證分析之測試集合中「快速」及「緩慢」群組之中值RFS之分佈圖。圖7B係在GI-4000及吉西他濱研究之交叉驗證分析中之測試集合中「快速」與「緩慢」群組間之中值差異的分佈圖。兩個圖均使用圖3E-3F之「稀釋並射擊」分類器。
圖8係在圖3E-3F之「稀釋並射擊」分類器的交叉驗證分析中在對照組及測試集合中之「快速」及「緩慢」群組之中值的分佈圖。
圖9係在圖3E-3F之「稀釋並射擊」分類器的交叉驗證分析中「緩慢」群組之測試集合與對照組間之中值差異的分佈圖。
圖10A係在圖3E-3F之「稀釋並射擊」分類器的交叉驗證分析中針對分類器中所用不同K值在對照組中緩慢對快速分類之比率的分佈圖。圖10B係針對K-最近鄰分類器中所用之各種K值在交叉驗證分析中所用測試集合之風險比的圖。
圖11係用於預測癌症病人受益於或不受益於免疫反應產生療法單獨或與其他抗癌藥劑之組合之測試方法的流程圖。
圖12係用於執行血液源病人樣本之測試並預測病人是否可能受益於免疫反應產生療法單獨或與另一抗癌藥劑之組合之系統的圖解說明。
圖13A-13L係在GI-4000及吉西他濱研究中RFS及OS之Kaplan-Meier曲線圖的集合,如基於自深度MALDI方法使用500,000次射擊使用2012年5月29日提出申請之申請中之美國臨時專利申請案第61/652,394號(其內容以引用的方式併入本文中)之技術所獲得之光譜由分類器所定義。圖13A-13B、13C-13D、13E-13F、13G-13H、13I-13J及13K-13L各自基於用於分類之質譜中之不同峰或特徵之集合分別代表來自六個不同分類器之RFS及OS的曲線圖。
圖14係來自針對使用自深度MALDI方法使用150,000次射擊所獲得光譜產生之圖4A-4H的分類器的交叉驗證分析之RFS的「快速」與「緩慢」群組間之風險比的分佈圖。
圖15係來自針對使用自深度MALDI方法使用500,000次射擊所獲得光譜產生之圖13A-13L的分類器的交叉驗證分析之RFS的「快速」與「緩慢」群組間之風險比的分佈圖。
圖16A-16C係在所選質量/電荷範圍(m/z比為7,000至8,000)內之相同樣本之三個MALDI質譜的圖解說明,其圖解說明可偵測峰含量隨射擊次數增加而增加。圖16A之光譜係自2,000次射擊產生,圖16B之光譜係自100,000次射擊產生,且圖16C之光譜係自500,000次射擊產生。注意自本發明方法產生之圖16B及16C的光譜如何揭露在圖16A之光譜(其基本上表現為雜訊)中不存在之關於樣本的大量光譜資訊。
圖16D及16E係質譜之其他實例,其展示本發明深度MALDI方法中所獲得光譜之巨大動態範圍。在圖16D中,在7140Da至7890Da的m/z範圍中之光譜之一部分在圖16D之插圖中放大展示,其顯示在大約500,000次射擊時所獲得之大量光譜資訊。在圖16E中,在插圖中顯
示Y軸經放大之光譜,以展示額外光譜資訊及在m/z約9520之區中的峰,該等峰係利用深度MALDI方法揭露但其在典型的約1,000次射擊光譜中不可見。
圖17A係含有配置成矩形陣列之384個樣本點或「點」之MALDI-TOF靶板的平面圖。點係由行編號1……24及列A……P識別,例如,左上方點識別為A1。圖17B係個別樣本點P1之放大視圖,顯示其被分成具有X/Y位置座標及在點中心之原點(0,0)之5×5矩形網格。矩形網格及位置座標用於自動化光柵掃描方法中以自該點之100,000次或更多次射擊獲取光譜,如本文所詳細闡述。
圖18係沈積於圖17A之MALDI板中單一點之生物樣本/基質混合物之相片。理想地,點含有在該點內之均勻均質結晶樣本,如圖18中所示。
圖19係一種用於自圖18之點獲得100,000次或更多次射擊之可能的光柵掃描圖案之圖解說明。點經光柵掃描多次,例如25次。圖19中所示之每一符號集合(三角形、正方形、X等)描繪其中在單一光柵掃描中掃描(射擊)點之個別離散X/Y位置之集合。在每一位置處,點可經受多次射擊,例如,700次或800次射擊。
圖20係展示圖19之光柵掃描圖案在圖18之樣本點上之疊加的圖解說明。
圖21係來自MALDI-TOF儀器使用者介面之螢幕擷取畫面,其展示對每一位置/光柵來自800次雷射射擊(例如,在圖17B或20之光柵掃描中)之累積光譜進行加和之命令。
圖22係樣本點之一部分之影像,其展示樣本/基質混合物未以空間均勻方式結晶之區域。
圖23係來自MALDI-TOF儀器使用者介面之螢幕擷取畫面,其展示由儀器中之相機捕獲之點的一部分之影像及用於點之自動化光柵掃
描之點群組之選擇。
圖24係來自MALDI-TOF儀器使用者介面之另一螢幕擷取畫面,其展示用於光譜評估、光譜累積及雷射跨越點移動用於以不同圖案觸發之工具。
圖25係用於在數據獲取期間接受或拒絕瞬態光譜之評估頁面的螢幕擷取畫面。
圖26係展示用於消除背景峰之排除列表的螢幕擷取畫面。
本文闡述用於免疫反應產生療法之預測性測試、相關分類器及系統以及藉由該等測試、分類器及系統所識別病人之治療。
特定而言,本文闡述用於在治療之前預測癌症病人可能或不可能受益於基於酵母之免疫反應產生療法單獨投與或與另一抗癌療法組合投與之方法。本文亦闡述在治療之前預測癌症病人可能或不可能受益於投與針對突變Ras陽性癌(包括但不限於胰臟癌)之基於酵母之免疫療法(例如,本文所闡述之GI-4000)之方法。本發明之方法係基於預處理所獲得之血液源樣本(例如,血清或血漿)之質譜分析及基於藉由質譜分析所揭露之樣本中的蛋白質組特徵之分類。血液源樣本之使用很重要,因為其藉由觀察免疫系統之循環標記增加量測對免疫療法之總體敏感性之可能性。此外,方法可經由來自血液源樣本之簡單質譜分析測試快速實施,而不需要執行複雜耗時的病人樣本分析或自病人獲得腫瘤樣本。測試係有用的,此乃因若預測病人可能受益,則可以病人將獲得改良結果之一定信賴度繼續進行治療,而若預先預測病人不可能受益,則可引導病人轉向病人可能獲得益處之其他治療,或可考慮其他治療選項。
本文亦闡述利用針對癌症之基於酵母之免疫反應產生療法單獨治療或與另一抗癌藥劑組合治療病人之方法,其中病人已首先根據上
文或本文其他地方所闡述之預測方法中之任一者藉由方法或測試進行選擇可能受益於針對癌症之免疫反應產生療法(例如,在測試或方法中所產生光譜之類別標記指示病人可能受益於針對癌症之免疫反應產生療法)。
本文亦闡述利用針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法(例如,本文所闡述之GI-4000)單獨治療或與另一抗癌藥劑組合治療病人之方法,其中病人已首先根據上文或本文其他地方所闡述之預測方法中之任一者藉由方法或測試進行選擇可能受益於針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法(例如,測試或方法中所產生光譜之類別標記指示病人可能受益於針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法)。在本發明該等治療方法中之任一者中,方法包括以下步驟:將基於酵母之免疫反應產生療法(其可包括(但不限於)針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法)投與患有表現癌症抗原之癌症、且已藉由如本文所述根據本發明之任一預測方法執行之測試識別或選擇為可能受益於組合物之投與之受試者。
GI-4000-02係在患有R0或R1切除胰臟癌之病人中GI-4000加吉西他濱或安慰劑加吉西他濱之完全登記之2b期隨機、雙盲、安慰劑對照之多中心輔助臨床試驗(參見圖1)。R0切除係定義為在手術切除邊緣不存在顯微鏡可見殘餘病灶。R1切除係定義為在手術切除邊緣存在顯微鏡可見殘餘病灶。R0及R1病人具有不同的預期存活率,其中R0病人平均存活時間較長。在此臨床試驗中,腫瘤組織之樣本係在篩選時期期間自每一受試者獲得且評估腫瘤是否存在Ras突變。若受試者具有產品相關突變,則投與匹配受試者腫瘤中之特定Ras突變的GI-4000基於酵母之免疫療法產品(GI-4000系列係在下文中詳細闡述)。
研究群體係由176個患有Ras突變切除胰臟癌之受試者組成,該等係在美國的39個中心及五個國際中心處登記。切除之後,受試者按期望根據切除狀態分成兩個群組,且將R1及R0兩個群組以一對一比率隨機指派給兩個治療群組以接受40 Y.U.之GI-4000(「Y.U.」係「酵母單位」或「酵母細胞當量」;1 Y.U.=一千萬個酵母細胞)加吉西他濱或安慰劑加吉西他濱。登記39個R1受試者,其中19個指派給GI-4000加吉西他濱群組且20個指派給安慰劑加吉西他濱群組。登記137個R0受試者,其中69個指派給GI-4000加吉西他濱群組且68個指派給安慰劑加吉西他濱群組。將40 Y.U.劑量之GI-4000作為4個單獨10 Y.U.來皮下注射投與,在每一手臂及腿部投與1個劑量。受試者在切除與開始吉西他濱療法之間給與三周劑量之GI-4000或安慰劑。所有受試者在切除之後6周與8周之間開始投與長達每6個月吉西他濱循環。在每一吉西他濱循環之後給與每月劑量之GI-4000或安慰劑以與每月吉西他濱治療之排程間隔一致。每月投與GI-4000或安慰劑,直至受試者退出研究、經歷疾病復發或死亡為止。評估大量疾病特定基線特性,包括以下已顯示對結果有影響之預後因子:(a)淋巴結狀態係定義為存在或不存在胰臟癌細胞之顯微鏡證據。陽性結節視為差的預後指標;(b)體能狀態,其由反映病人之總體健康的5點量表組成(0、1、2、3、4),其中0係最滿意狀態且4係最不滿意狀態;(c)CA19-9,其係胰臟癌細胞之血液生物標記,其作為腫瘤負荷之量度。較高之CA19-9含量與較差之臨床結果相關聯;(d)腫瘤大小(以公分表示),其中較大尺寸通常與交叉結果相關聯;及(e)腫瘤分期,其範圍係自I期至IV期且係基於由原發性腫瘤大小、局部浸潤之程度、區域淋巴結之參與程度及癌症離開原發性腫瘤之全身性擴散組成之標準化評分系統來定義。
此臨床試驗之主要終點係無復發存活。次要終點包括總體存
活、免疫反應及疾病負荷之生物標記(例如CA19-9)。迄今為止,GI-4000與佐劑吉西他濱之組合已在Ras突變陽性R1胰臟癌受試者中顯示對存活之臨床上有意義效應之證據,包括:(a)中值OS提高2.6個月(與14.6個月相比,17.2個月);18%相對提高;(b)GI-4000免疫反應者之中值OS提高5.0個月(與14.6個月相比,19.6個月);34%相對提高;(c)1年內存活中有16%優勢(72%對56%);30%相對提高;及(d)中值RFS提高1個月(GI-4000/吉西他濱之9.6個月對8.5個月);13%相對優勢。此外,GI-4000係免疫原性的且在R1受試者中充分耐受:(a)GI-4000/吉西他濱(gem)組之7/15(47%)對安慰劑/吉西他濱組之1/12(8%)具有Ras突變特異性T細胞反應;及(b)GI-4000已充分耐受,迄今為止沒有重大新的毒性的證據。開發本發明之預測性質譜方法之後觀察到額外的結果,下文將詳細闡述。
本發明質譜方法之實例將在上文所述胰臟癌中GI-4000+吉西他濱2b期臨床試驗中結合樣本研究詳細闡述。一些但非所有接受GI-4000+吉西他濱之組合之病人與接受吉西他濱及安慰劑之病人相比RFS及OS有重大提高。開發分類器以在治療之前預測病人是否係可能受益(在以下討論中「緩慢」)或相反不可能受益(在以下討論中「快速」)之一類病人之成員。圖2A及2B係蛋白質組特徵為陽性之病人的無復發存活(RFS)及總體存活(OS)的Kaplan-Meier曲線圖,此指示其可能受益於GI-4000與吉西他濱之組合。圖2A顯示具有延遲復發(「緩慢」)蛋白質組特徵之受試者的治療群組(GI-4000對安慰劑)的RFS,而圖2B顯示具有延遲復發蛋白質組特徵之受試者的治療群組的OS。曲線圖圖解說明本發明之質譜分析方法識別病人可能受益於GI-4000與吉西他濱之組合治療胰臟癌之能力。下文將結合圖3及4討論顯示本發明方法識別治療組中受益於或不受益於GI-4000與吉西他濱之組合之病人的能
力的本發明研究之其他Kaplan-Meier曲線圖。
在本發明研究中,適用於產生質譜之樣本係自以上詳細闡述之GI-4000-02中登記的90位病人獲得。樣本係源自血液,且在此特定情況中係藉由先前基於密度之分離方法自全血獲得之血漿。全血(於肝素鈉玻璃試管中)係藉由於室溫下隔天送貨自臨床試驗位點由GlobeImmune實驗室接收並在收集30小時內處理。為分離周邊血液單核細胞(PBMC),將血液利用Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水(D-PBS;Gibco/InVitrogen目錄編號14190-250)以大約1:1稀釋,在LeucosepTM試管(Greiner)中之Ficoll-Hypaque梯度上分層並以1000×g在環境溫度下離心10分鐘。自梯度收穫細胞之前,抽取利用D-PBS 1:1稀釋之血漿並在-80℃下冷凍。在用於本發明之質譜中之前,將樣本解凍,分成等份樣本且然後在即將使用之前再次冷凍。
使用標準稀釋並射擊(DNS)方法及「深度MALDI」方法自樣本產生光譜,該等方法闡述於2012年5月29日提出申請之申請中美國臨時申請案第61/652,394號(以引用方式併入本文中)中且下文進一步詳細闡述。
對稀釋並射擊光譜執行美國專利第7,736,905號及Biodesix公司之先前引用之專利文獻中所闡述之VeriStrat測試,但發現分類器並不能獲得有用資訊。識別出極少的VeriStrat差的樣本且在任一治療組中之VeriStrat良好與差的病人之間未發現顯著差異。
因此,需要利用新訓練集合定義新分類器。吾人推斷VeriStrat特徵可能有用,因為吾人相信宿主對存在之癌症的免疫與炎性反應之間係相關的(參見美國專利申請公開案2011/0208433)。實際上,已發現VeriStrat測試中所用光譜中之質譜特徵(參見下表3及4)可用於胰臟癌研究中之分類,前提條件係適當地定義分類器訓練集合並改變光譜預處理程序,如下文所闡述。分類器設計及訓練集合之此探索將在以下
章節中闡述。
設計分類器以將病人分成對於GI-4000治療具有較好及較差預後者之起點係定義具有較好及較差無復發存活(RFS)之病人的訓練集合。基於RFS之時間分佈,決定將快速復發(「快速」)之病人定義為彼等在276天之前復發的病人,且緩慢復發(「緩慢」)之病人定義為彼等甚至在500天之前未復發之病人。此獲得在「快速」群組中20位病人且在「緩慢」群組中14位病人之訓練集合,其中9位病人具有中間RFS時間。(題外話:實際上,有21位病人甚至在276天之前具有RFS事件,但在計劃開始時遺漏該等病人中一者之光譜,因此此病人初始並未包括在用於「稀釋並射擊」及150,000次射擊深度MALDI分析之訓練集合中,且僅當分類器應用於整個團體時使用。對於500,000次射擊深度MALDI分析而言,此病人包括在訓練集合中且一位具有長復發時間之病人被排除,此乃因經測定來自此病人之血漿樣本係在治療期間獲得。)藉由採用不同的截止點來定義「緩慢」及「快速」群組或藉由快速死亡及緩慢死亡之時間來定義該等群組可能將產生類似結果。
在定義「快速」及「緩慢」群組之訓練集合之後,將欲比較之質譜使用美國專利第7,736,905號之方法進行預處理,包括背景減除、部分離子流正規化及光譜對準。稀釋並射擊光譜及深度MALDI光譜之預處理細節不同,但一般程序係類似的。首先估計背景並將其自光譜中減去。將光譜正規化成部分離子流。計算部分離子流中所用之區可以各種方式選擇,只要其排除質譜中之強及大多數變量峰即可。在給出以下結果之實例稀釋並射擊分類器中,用於部分離子流計算及正規化之區係3kDa-11.4kDa、13kDa-15kDa及16.1kDa-30kDa,但可作出其他選擇。舉例而言,對於基於500,000次射擊之深度MALDI光
譜之分類器而言,用於部分離子流正規化之區係4.9kDa-6.54kDa、12kDa-13.5kDa及18kDa-27kDa。估計光譜中之雜訊。當在光譜中偵測到峰時,可使用對準點之集合使光譜對準。對準點之集合可藉由選擇在光譜中所偵測大多數欲對準光譜共有之峰的子集合編輯,或可預先自已知存在於來自先前經驗之大多數光譜中之峰選擇。在下文所示之稀釋並射擊分類器之情形中,根據先前經驗選擇以下對準點。該等係在以下m/z位置處之峰:6434.5、6632.1、11686.9、12864.8、15131.1、15871.5及28102.5。值得注意的是,若使用自樣本獲得質譜數據之深度MALDI方法(參見下文解釋),則光譜中之其他特徵可用於部分離子流正規化及光譜對準且可使用更適於深度MALDI光譜之用於背景減除的預處理方法。舉例而言,在下文所呈現之基於500,000次射擊深度MALDI光譜之分類器中,使用以下對準點:3315、4153、4457、4710、4855、5289、6431、6629、6835、7561、7931、8202、8807、8912、9707、12856、13735、14031、14134、15117、15856、17366、21046、27890、28019、28067及28228。然而,應注意,對準點之數量及位置之其他選擇對於光譜獲取之兩種方法均係可能的。
預處理光譜使得其能夠相互比較且然後其可基於根據外部因素定義之特徵用於構造分類器,或者可將光譜之群組進行比較以測定群組間表現不同之特徵,然後可選擇該等特徵之子集合併使用此特徵集合建立分類器。具有下文所示結果之分類器中之一者係使用根據外部因素測定之特徵來構建。
由於相信VeriStrat分類器中所用之質譜特徵(參見下表3及4)係與宿主對存在之腫瘤的反應相關聯的炎性過程相聯繫(參見吾人之前於2011年2月22日提出之美國專利申請案第12/932,295號,其以引用方式併入本文中),且與免疫系統對腫瘤之反應相關聯,因此感興趣的是
試圖使用8個VeriStrat特徵以及在GI-4000治療之後根據病人之復發時間定義之新的光譜參考集合。該等結果顯示於下文所闡述之圖3中。然而,其他分類器可使用在兩個參考集合群組之間進行比較期間發現用以區分之特徵來構建。對於稀釋並射擊光譜,該等特徵包括以下中之一或多者:
表1之一或多個特徵可與表2、3及5中之特徵組合使用用於分類器中。
對於150,000次射擊「深度MALDI」光譜,可用於分類之特徵包括以下各項:
對於500,000次射擊之深度MALDI光譜,可用於分類之特徵包括以下各項:
應注意,對光譜正規化之改良可揭露再其他區分峰,因此並不認為以上列表係詳盡的。再次,精確m/z位置稍微位移,取決於在預處理期間之光譜對準。
圖3A-3F之曲線圖顯示使用參考集合之「緩慢」及「快速」定義(「緩慢」=在500天之前無復發事件,「快速」=在276天之前復發)、
VeriStrat特徵定義(表3及4)及稀釋並射擊預處理光譜所建立之分類器之性能。將分類器應用至GI-4000(治療)組之光譜及來自安慰劑(對照)組之46個光譜。分類器基於K-最近鄰分類演算法(參見美國專利第7,736,905號)產生光譜之快速或緩慢類別標記,其中圖3A-3B顯示K=1之分類,圖3C-3D顯示K=3之分類且圖3E及3F顯示K=5之分類。
根據圖3A-3F中所示之該等結果,吾人發現可將治療組(GI-4000+吉西他濱)分成兩個群組「快速」及「緩慢」,其中「快速」群組在RFS及OS兩個方面具有顯著比「緩慢」群組差的結果。與此相比,對照組(吉西他濱+安慰劑)在「快速」及「緩慢」兩個群組中具有類似RFS。在「緩慢」群組中存在有利於GI-4000之RFS方面之治療益處。難以解釋在OS方面之治療效果且可能係在「緩慢」群組中添加GI-4000之治療益處被復發後所接受之治療稀釋。OS之分析亦因在38%團體中事件之設限而複雜化。
應注意,「快速」治療組低於對照組,此指示「快速」病人並不受益於利用GI-4000及吉西他濱治療。因此,分類器提供預測彼等不可能受益於刺激免疫反應之治療之病人的能力。
基於預處理深度MALDI光譜(參見下文闡述及選自訓練集合群組(如上文所定義之「快速」及「緩慢」)之比較之特徵之分類器的性能顯示於圖4A及4B中,其中圖4A顯示分類器在治療組而非在對照組中在RFS方面將快速及緩慢病人分開之能力,且圖4B顯示分類器在治療組而非在對照組中在OS方面將快速及緩慢病人分開之能力。分類器中所用之特徵經選擇以近似表4中之八個特徵。在治療組中「快速」與「緩慢」群組之間觀察到顯著分開,但在對照組中針對RFS及OS二者均未觀察到分開。儘管沒有顯著差異,但與安慰劑之對照組相比,「緩慢」群組對GI-4000治療顯示獲得較好結果之傾向,尤其RFS。
圖4C-4D、4E-4F及4G-4H係三種其他分類器使用樣本之深度MALDI質譜分析及以上表2中所列舉之深度MALDI的77個特徵子集合之RFS及OS的Kaplan-Meier曲線圖。所有三個分類器使用20個來自在276天之前具有復發時間之病人(「快速」)的光譜及14個來自在500天之前沒有復發事件或設限之病人(「緩慢」)的光譜的參考集合、針對深度MALDI光譜最佳化之相同預處理,及在K-最近鄰分類演算法中K=5。
圖4C及4D之分類器使用來自以上表2之77個候選特徵列表之特徵子集合。吾人藉由p值分選該77個特徵且使用闡述其相對表現差異之具有最低p值之20個特徵:
圖4E及4F顯示第三深度MALDI分類器之RFS及OS的Kaplan-Meier曲線圖。在此實例中,使用在VeriStrat特徵之區(表3及4)中或與其強烈相關之來自光譜列表(表2)之特徵。
第四深度MALDI分類器之結果顯示於圖4G-4H中。對於此分類器,使用各群組間之表現位準以相反方式與彼等在圖4E-4F之分類器中者相關聯且不與VeriStrat特徵相關之特徵子集合(表2)。
應注意,圖4A-4H之深度MALDI分類器在治療組中清晰地分開快速及緩慢病人,而在對照組中顯示極少或沒有分開,且因此執行類似於圖3A-3F之「稀釋並射擊」分類器。
在解釋圖3A-3F及4A-4H之結果時,應注意以上結果易於高估在「快速」與「緩慢」群組間之分開,此乃因在分析中使用分類器之參考集合。不幸地,尚未提供用以以獨立方式測試分類器性能之分類器驗證集合。因此,為提供分類器性能之替代評價,實施交叉驗證分析,如以下「分類器之交叉驗證」章節中所述。
在治療組中能夠在RFS方面充分分開「快速」及「緩慢」病人但在對照組中不能分開之分類器亦可使用500,000次射擊深度MALDI光譜構建。深度MALDI光譜對於在此章節中所呈現之所有分類器均以相同方式進行預處理且用於該等分類器之訓練集合再次係先前所定義之「快速」及「緩慢」復發群組。在此深度MALDI分析時,利用相對於章節A及B中所呈現之彼等更新之存活數據且因此該等分類器之性能分析利用更新數據。每一分類器中所用區分特徵之集合係以上表5中97個特徵之子集合。針對每一分類器最佳化選擇用於K-最近鄰分類演算法之K鄰近者。圖13A-13L係RFS及OS之Kaplan-Meier曲線圖,其顯示使用500,000次射擊深度MALDI光譜及表5中所列舉97個特徵之子集合所建立之6個分類器的性能。
圖13A及13B之分類器使用表5中列表之42個特徵之子集合。該等經選擇以包括VeriStrat特徵之m/z區(表3及4)中所含之特徵以及基於低的單變量p值用於區分訓練集合中之「緩慢」與「快速」群組所選之
額外特徵。對於此分類器,發現K=3係最佳的且所用特徵之中心(m/z)列示於表6之第一行中。
圖13C及13D之分類器使用來自表5(給定之特徵m/z之中心)中之列表的32個特徵之子集合,該等特徵係基於用於區分訓練集合中之「緩慢」與「快速」群組之單變量p值以及基於「緩慢」與「快速」群組之間特徵值數量級之幅值比率選擇。此分類器使用K=3及表6之第二行中所列示之特徵。儘管此分類器與先前分類器共有19個特徵,但此分類器亦含有先前分類器中未使用之13個特徵且根據Kaplan-Meier曲線圖仍給出類似性能。
圖13E及13F之分類器係使用類似於先前分類器之準則開發且使用K=5。所用特徵列示於表6之第三行中。分類器之25個特徵中的23個特徵與圖13A及13B之分類器共有且與圖13C及13D之分類器共有一半以上特徵。儘管針對分類器所選特徵之相似性,但在Kaplan-Meier曲線圖中之性能將指示此分類器更多的係結果之預後,而非GI-4000之治療效果的預測。
圖13G及13H之分類器使用表6之第四行中所列示之圖13E及13F之分類器的13個特徵之子集合及K=5;Kaplan-Meier曲線圖指示性能更類似於前兩個深度MALDI分類器(圖13A-D)。
圖13I及13J之分類器未使用表3之VeriStrat特徵的m/z區中的特徵而構建。然而,根據Kaplan-Meier曲線圖可看出其具有與包括來自VeriStrat特徵之m/z區的特徵的分類器類似的性能。所用特徵列示於表6之第五行中且對於此分類器K=7。
圖13K及13L之分類器僅使用表6之最後一行中所列示之8個特徵及K=3。8個特徵中之四者未用於任何其他分類器。儘管如此,藉由Kaplan-Meier曲線圖所評價之性能與所測試之其他分類器並無顯著不
同。
應注意,大多數該等深度MALDI分類器亦清晰地分開治療組中之「快速」及「緩慢」類別之病人,而在對照組中顯示極少分開,且因此執行類似於「稀釋並射擊」分類器及彼等基於較少次射擊之深度MALDI者。
圖3A-3F中所示且以上闡述之「稀釋並射擊」分類器的交叉驗證係藉由以下圖5中所概述之程序實施。
在圖5之程序中,在步驟100處,確定用於分類之特徵(峰或m/z範圍)及預處理步驟(背景減除、正規化及對準)。然後,以廻圈108所指示之反覆方式執行步驟102、104、105及106。在步驟102中,隨機選擇刪除10個光譜以測試分類器性能。在步驟104中,使用與復發(TTR)準則相同之時間自剩餘34個光譜中選擇光譜之參考集合,即「快速」定義為276天之前復發且「緩慢」係如上所定義(在500天之前無復發)。在步驟105處,選擇K最近鄰分類演算法中之K值。在步驟106處,根據風險比(HR)及中值針對光譜之「測試集合」評估分類器性能。光譜之測試集合係參考集合(步驟104)中未包括之治療組的光譜,即在步驟102處刪除之10個光譜加上來自TTR介於276天與500天間之病人的任何其他光譜。將過程重複(108)多次(在此實例中70次)。
應瞭解,圖5之程序具有一般適用性,其中適當選擇參考及測試集合給出所考慮特定研究。
圖5之此交叉驗證將傾向於提供分類器之性能的下限,此乃因其以以下方式低估性能:
1.交叉驗證分類器之參考集合小於初始分類器之集合,此可影響性能。
2.未包括在參考集合中之樣本之測試集合儘管大於之前的10個中間復發光譜,但仍較小。此可導致計算統計中之大的變化性,且在一些情形中當群組大小極小時,該等統計可毫無意義。
3.測試集合不能代表作為整體之治療組團體。其含有較高比率之具有中間復發時間的病人。此不平衡使得難以對測試集合結果與測試集合以外之其他群組(例如對照組)進行比較。
儘管存在該等限制,但使用「快速」及「緩慢」群組之定義及VeriStrat特徵建立之分類器的交叉驗證分析獲得一些有用頓悟。圖6顯示對照組、整個治療組及測試集合(除分類器參考集合以外之治療組)在交叉驗證分析中針對70個實現實例所計算之「快速」與「緩慢」群組之間之風險比分佈。當所有分類器針對對照組產生接近1之HR時,測試集合之中值HR為3.1,接近整個治療組之中值HR。
圖7A及7B顯示在交叉驗證分析中測試集合中「快速」及「緩慢」群組之中值RFS的分佈。在圖7A中,「緩慢」群組之中值以382天為中心,而「快速」群組之中值以274天為中心。圖7B顯示測試集合中「快速」與「緩慢」群組之間之中值差異分佈。中值間之差異以111天為中心(臨床有意義之差異),其中極少實現實例顯示「緩慢」群組之中值小於「快速」群組之中值。儘管測試集合與對照組之比較因兩個群組間之復發時間分佈之不平衡而複雜化,但在對照群組及測試集合內之「快速」及「緩慢」群組之觀測中值顯示「緩慢」測試集合顯著位於「快速」及「緩慢」對照群組之上,其進而位於「快速」測試集合之上。參看圖8,其係在交叉驗證分析中對照組及測試集合中之「快速」及「緩慢」群組之中值之分佈圖。
此外,對於「緩慢」群組而言,測試集合與對照組間之中值差異之分佈指示,在幾乎所有實現實例中,測試集合之中值RFS大於對照組之中值RFS,儘管群體中存在不平衡,參看圖9,其係測試集合
與對照組間「緩慢」群組之中值差異之分佈圖。中值RFS之中值差異為約60天,再次係有意義的臨床差異。
OS之交叉驗證分析因在初始可用之臨床數據中超過總團體之三分之一具有設限數據而受阻。
交叉驗證分析之另一結果係測定緩慢對快速分類之比率對K-最近鄰分類器中所用K之選擇的依賴性。參看圖10A,其係針對分類器中所用不同K值對照組中之緩慢對快速分類之比率的分佈圖。圖10B係針對各種K值針對交叉驗證分析之測試集合所計算之風險比分佈之曲線圖。當進行交叉驗證時,在70次反覆(圖5,步驟105)中之每一者中選擇K為3、5或7。吾人獲得每一者之大約1/3,因此在分佈K=3、5及7中之每一者中存在至少20個值。為瞭解K=1時發生之情形,亦使用K=1重新運行交叉驗證之19次反覆。發現在測試集合中K=5之緩慢對快速之風險比最大。圖10B亦繪製對照組所獲得之交叉驗證分析之所有70次反覆之風險比分佈。圖10B證明在對照組內使用什麼K值皆不會造成大的差異,且分佈相當狹窄。當圖10B與圖10A一起考慮時證明,在K-最近鄰分類演算法中K之多種選擇係可能的,但K=5可能係最佳選擇。
將相同交叉驗證方法應用於先前所給出之四個基於150,000次射擊深度MALDI光譜之分類器顯示,在預測添加GI-4000之相對治療益處方面其中之兩者具有優良性能。圖14顯示在交叉驗證之對照組及測試集合二者中,對於來自圖4A-4H之四個分類器針對RFS分類為「快速」及「緩慢」之病人間之風險比分佈。儘管在測試集合及對照組中來自圖4C-4F之分類器所觀測之中值風險比類似,但在測試集合中另外2個分類器所觀測之中值風險比大於在對照組中所觀測者,此支援Kaplan-Meier曲線圖之性能評估顯示在治療組內在RFS方面「快速」
與「緩慢」群組間之分開大於對照組,且支援分類器對於添加GI-4000至吉西他濱控制方案之預測力。
亦將相同的交叉驗證方法應用於先前所給出且在圖13A-M中評價之六個基於500,000次射擊深度MALDI光譜之分類器。在交叉驗證之對照組及測試集合中每一分類器之風險比分佈顯示於圖15中。此顯示當藉由交叉驗證方法評價性能時,在顯示整個治療對照組之Kaplan-Meier曲線圖中並不總是維持性能之明顯差異。此外,進一步證明甚至在交叉驗證中可使用具有類似性能特性之不同特徵集合來構建許多不同分類器。
應注意,訓練集合可具有不等數量之「快速」及「緩慢」類別之成員。為解決不等群組大小之問題,吾人所選之相對參考群組大小部分地係由於治療組中所獲得之復發時間之分佈。許多病人之復發時間恰巧介於250天與275天之間,可能係由於其與計劃之MRI/CT評價同時發生。因此,似乎並沒有適當位置將群組在彼等時間之間分開。然而,吾人判定無論如何獲得較大的早期復發群組係較佳的且因此吾人寧願此群組中數量更多。K-最近鄰分類演算法可經調整以考慮參考集合中之不同群組大小,因此原則上在訓練集合中具有不等群組大小不是問題。
如整個本揭示內容中所提及,實用有用之測試係由本揭示內容之發現產生。一個態樣在於本發明之測試方法識別特定癌症病人是否係可能或不可能受益於基於酵母之免疫反應產生療法單獨投與或另外投與其他療法之癌症病人群組之成員。再另一態樣在於本發明之測試方法識別特定癌症病人是否係可能或不可能受益於針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法(例如GI-4000)單獨投與或另外投與其他療法
之癌症病人群組之成員。此識別可在治療之前進行。
在一個實例中,方法包括以下步驟:a)自該病人獲得血液源樣本;b)借助質譜儀獲得基於血液之樣本的質譜;c)在程式化電腦中,對該質譜執行預定義之預處理步驟,在執行該等預處理步驟之後獲得在預定義之m/z範圍內該光譜中所選特徵之積分強度值,並將該等積分強度值與包含來自其他癌症病人之類別經標記光譜的訓練集合相比較並利用類別標記對該質譜進行分類。指派給光譜之類別標記用於預測病人可能或不可能受益於基於酵母之免疫反應產生療法單獨投與或另外投與其他療法之形式的治療。
在另一實例中,方法包括以下步驟:a)自該病人獲得血液源樣本;b)借助質譜儀獲得基於血液之樣本的質譜;c)在程式化電腦中,對該質譜執行預定義之預處理步驟,在執行該等預處理步驟之後獲得在預定義之m/z範圍內該光譜中所選特徵之積分強度值,並將該等積分強度值與包含來自其他癌症病人之類別經標記光譜的訓練集合相比較並利用類別標記對該質譜進行分類。指派給光譜之類別標記用於預測病人可能或不可能受益於針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法單獨投與或另外投與其他療法之形式的治療。
測試係以流程圖形式在圖11中作為過程300圖解說明。
在步驟302處,自病人獲得血液源樣本。此實例中之樣本係在對樣本進行一些處理步驟之後的血漿(例如,自全血藉由先前密度分離方法獲得之血漿)。在一個實施例中,將血液源樣本分成三份等份試樣並對等份試樣中之每一者獨立執行質譜分析及後續步驟304、306(包括子步驟308、310及312)、314、316及318。等份試樣之數量可改變,例如可存在4份、5份或10份等份試樣,且每一等份試樣經歷後續處理步驟。
在步驟304處,樣本(等份試樣)經受質譜分析。較佳質譜分析方
法係基質輔助雷射脫附游離(MALDI)飛行時間(TOF)質譜分析法,但其他方法亦係可能的,包括2012年5月29日提出申請之申請中美國專利臨時申請案第61/652,394號中所揭示之所謂「深度MALDI」質譜分析方法,其內容以引用方式併入本文中(參見下文闡述)。質譜分析產生由在眾多質量/電荷(m/z)值處代表強度值之數據點組成之質譜,如此項技術中習用。在一個實例實施例中,將樣本解凍並以1500rpm在4℃下離心5分鐘。另外,樣本可在MilliQ水中以1:10或1:5稀釋。經稀釋樣本可一式三份點樣於MALDI板上之隨機分配之位置中(即,在三個不同MALDI靶或「點」上,如此項技術中所知)。將0.75ul稀釋樣本點樣於MALDI板之後,可添加0.75ul 35mg/ml芥子酸(存於50%乙腈及0.1%三氟乙酸(TFA)中)並藉由用移液管上下吸取五次來混合。可使板在室溫下乾燥。應瞭解,可根據本發明之原理利用其他技術及程序製備及處理樣本。
可以線性模式使用具有自動或手動光譜收集之Voyager DE-PRO或DE-STR MALDI TOF質譜儀獲取正離子之質譜。(當然,可使用其他MALDI TOF儀器,例如Bruker公司之儀器)。自每一MALDI點內之7個或5個位置收集75個或100個光譜以對於每一樣本試樣產生平均2,000個光譜。光譜係使用蛋白質標準物(胰島素(牛科動物)、硫氧還蛋白(大腸桿菌(E.coli))及脫輔基肌紅蛋白(馬))之混合物外部校準。
應注意,深度MALDI方法可在一個MALDI板點上或在若干個MALDI板點上用於步驟304中(參看下文闡述)。
在步驟306處,使在步驟304中獲得之光譜經受一或多個預定義之預處理步驟。預處理步驟306係在通用電腦中使用對步驟304中所獲得之質譜數據進行操作之軟體指令實施。預處理步驟306包括背景減除(步驟308)、正規化(步驟310)及對準(步驟312)。背景減除步驟較佳涉及在光譜中產生穩定的不對稱背景估計及自光譜中減去背景。步驟
308使用美國專利第7,736,905號(其以引用的方式併入本文中)中闡述之背景減除技術。正規化步驟310涉及背景減除光譜之正規化。正規化可採取部分離子流正規化或總離子流正規化之形式,如美國專利第7,736,905號中所闡述。如U.S.7,736,905中所闡述之步驟312使正規化、背景減除光譜對準至預定義質量標度,該預定義質量標度可係自研究分類器所用之訓練集合中之光譜獲得。預處理步驟亦相當詳細的闡述於以上GI-4000+吉西他濱臨床研究之討論中。然而,預處理之細節(例如,用於部分離子流正規化及對準之特徵或光譜區)可有所變化。
一旦執行預處理步驟306,過程300即進行至獲得在預定義之m/z範圍內之光譜之積分強度的步驟314。正規化及背景減除強度值係在該等m/z範圍內求積分。將此積分值(即,在相應預定義m/z範圍內之強度總和)指派給特徵。預定義m/z範圍可定義為間隔約相應特徵之平均m/z位置,其中寬度對應於在此m/z位置處之峰寬度。此步驟亦進一步詳細揭示於美國專利第7,736,905號中。
在步驟314處,在一個可能實施例中,光譜之強度積分值係在一或多個以下m/z範圍處獲得:
在一個實施例中,獲得多達8個以下表中所列示峰為中心或涵蓋該等峰之m/z範圍的值。該等峰之顯著性及發現方法解釋於美國專利第7,736,905號及美國申請案第12/932,295號(2011年2月22提出申請且作為US 2011/0208433公開)中,該等之內容係以引用的方式併入本文中。在實踐中,表3及4中之以上寬度(範圍)或峰位置可(例如)由於如何執行光譜對準中之變化而稍微改變。進一步應注意,使用「深度MALDI」技術(參見下文闡述),在可能用於分類之光譜中揭露許多特徵。對於稀釋並射擊質譜分析,表1之一或多個峰或表1之特徵與表3及4之組合可用於分類。進一步應注意,使用「深度MALDI」技術,光譜中揭露許多特徵,其組合可用於分類,參見上文所闡述之表2、5及6以及圖4A-4H之實例。
在步驟316處,將在步驟314處所獲得之值提供至分類器,其在說明性實施例中係K-最近鄰(KNN)分類器。分類器利用來自眾多其他病人之類別經標記光譜的訓練集合。訓練集合應包括來自受益於或不受益於免疫反應產生療法(例如針對癌症之基於酵母之免疫療法,其可為針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法)單獨或與其他抗癌療法之組合之病人的類別經標記光譜。舉例而言,上文工作實例中所闡述之GI-4000研究中的訓練集合包括在「快速」及「緩慢」時間方面為復發群組之類別經標記光譜。指派給該等光譜之類別標記將採取「快速」、「緩慢」之形式或等效形式,例如「受益」、「無反應者」、「良好」、「差」等。將KNN分類演算法應用於314處之值以及訓練集
合基本上係在多維特徵空間中根據積分強度值與預定義光譜特徵之比較的距離計算及多數議決演算法,如美國專利第7,736,905號中所解釋。可使用其他分類器,包括概率性KNN分類器、支援向量機或其他分類器。
在步驟318處,分類器產生用於光譜之標記,例如「快速」或「緩慢」。方法可利用單一等份試樣或利用分成三份等份試樣之樣本執行,其中步驟304-318係在來自給定病人樣本之三份單獨等份試樣上平行執行(或使用任何數量之等份試樣)。在步驟320處,進行檢查以測定是否所有等份試樣產生相同類別標記。若未產生相同標記,如步驟322處所指示使未定義(或未確定)結果返回。若所有等份試樣產生相同標記,則如步驟324處所指示報告標記。
如此文件中所闡述,然後在步驟324處所報告之類別標記用於引導病人之治療。舉例而言,預測彼等根據分類步驟標記為「快速」之胰臟癌病人不太可能受益於免疫反應產生療法(例如針對癌症之基於酵母之免疫療法,其可為針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法)單獨治療或與其他抗癌藥劑(包括吉西他濱)組合治療。作為另一實例,若根據測試在分類之後將來自胰臟癌病人之光譜的類別標記識別為「緩慢」,則預測病人可能受益於免疫反應產生療法(例如針對癌症之基於酵母之免疫療法,其可為針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法)單獨或與吉西他濱之組合,且病人繼續藉由免疫反應產生療法(例如針對癌症之基於酵母之免疫療法,其可為針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法)單獨投與或與吉西他濱組合投與進行治療。
應瞭解,步驟306、314、316及318通常係在程式化之通用電腦中使用編碼預處理步驟306、在步驟314中獲得積分強度值、在步驟316中應用KNN分類演算法及在步驟318中產生類別標記之軟體執行。步驟316中所用類別經標記光譜之訓練集合儲存於電腦中之記憶體中
或電腦可存取之記憶體中。
方法及程式化電腦可有利地在實驗室測試處理中心執行,如美國專利第7,736,905號中所述。
注意:表4中所識別峰之m/z值可稍微移位至更高或更低m/z值,此取決於用於對準訓練集合中所用之所有光譜及在預處理中對準測試光譜之光譜對準過程。
圖12係可用於實踐本揭示內容之方法的實驗室測試處理系統400之示意性方塊圖。系統400可在作為實驗室測試處理中心之實驗室中針對眾多病人樣本實施,例如在測試服務提供者商業中。系統400接收血液源樣本402,其可為全血、血漿、血清或執行其他處理步驟之後的血漿(例如,藉由先前基於密度之分離方法自全血獲得之血漿)。將樣本稀釋並使用以上所闡述之程序在MALDI-TOF板404之一或多個點上分成等份試樣,然後將其插入於MALDI-TOF質譜儀406中。質譜儀產生質譜408,質譜係如習用一樣呈數據對(m/z位置、強度)之形式。然後將質譜數據以數位形式儲存於數據庫或機器可讀記憶體410中。記憶體410可由通用電腦414(例如)經由區域網路存取,其細節並不重要。記憶體410進一步儲存訓練集合412之類別經標記光譜。電腦
410實施用於對光譜408執行預處理步驟(背景減除、正規化及對準)之軟體指令及用於在預處理之後相對於光譜且使用訓練集合數據412執行分類演算法(例如K-最近鄰)之程式碼。然後電腦產生如圖11中所解釋之光譜408之類別標記,其如本文所揭示用於引導治療。
測試系統400可自遠端MALDI-TOF儀器420經由電腦網路422接收質譜數據並執行圖11之步驟304-324。MALDI-TOF儀器可與可能附屬於或可能不附屬於實施分類之電腦414之實體的遠端診所、醫院或實驗室相聯繫,然而為確保標準化及可重現性,通常執行分類及類別標記之產生的相同實體亦應執行病人樣本之質譜分析。
在MALDI(基質輔助雷射脫附游離)TOF(飛行時間)質譜分析中,將樣本/基質混合物置於金屬板(稱為MALDI板)上之定義位置(在本文中「點」或「樣本點」)上。將雷射束引導至點上之位置上持續極短暫瞬間(稱為「射擊」),此使得樣本之分子或其他組份脫附並游離。樣本組份「飛行」至離子偵測器。儀器以質譜形式量測樣本中之組份(分子)的質荷比(m/z)及相對強度。
通常,在MALDI-TOF量測中,將數百次射擊施加至MALDI板上之每一點且對所得光譜(每一射擊一個光譜)進行加和或平均以產生每一點之總體質譜。
至少在複合生物樣本(例如血清及血漿)之質譜分析領域中,習用觀點認為不需要使樣本經受多於大約1,000次射擊,否則蛋白質含量將耗盡,儀器中之雷射及偵測器遭受過度磨損,且此外額外射擊將不會揭露關於樣本之大量額外資訊。因此,當自複合生物樣本獲得質譜分析數據時(例如,在生物標記發現研究期間),通常使用500-1000次射擊/樣本點。
在最近的探索性研究中,吾人已發現收集來自相同MALDI點之
多次(多於20,000次,且通常100,000次至500,000次)射擊或來自相同樣本之多個點的累積光譜之組合並進行平均,此使得雜訊對信號之相對位準降低且自複合生物樣本之質譜分析揭露大量額外光譜資訊。此外,使用MALDI TOF MS之各種標準範例似乎是完全錯誤的。首先,在點上之蛋白質含量完全耗盡之前,可對單一點運行數十萬次射擊。第二,經由將多次射擊平均降低雜訊使得先前不可見的峰(即,在1,000次射擊時未出現的峰)出現。第三,當樣本經受極大量的射擊(遠多於1,000次)時,甚至先前可見的峰變得邊界更清晰且使峰強度之量測及樣本間之比較可更可靠。
作為一個實例,已發現,在MALDI-TOF質譜分析中使複合生物樣本(例如基於血液之樣本)在單一點上經受多次射擊(>20,000次且甚至100,000次及500,000次射擊)使得雜訊位準降低並揭露先前不可見的峰(即,在2,000次射擊時未出現的峰)。此外,可實施此而不會耗盡樣本之蛋白質含量。另外,先前可見的峰變得邊界更清晰且使樣本間之比較可更可靠。在基於血液之樣本的標準光譜中(約1,000次射擊),通常可看到60-80個峰,而利用200,000次射擊通常可看到約200-220個峰,利用500,000次射擊通常可看到約450-480個峰,且利用2,800,000次射擊通常可看到約760個峰。應瞭解,此處所報告峰之數量與MALDI-TOF儀器設定有關且該等數量僅係大致指導;視儀器設定以及特定峰偵測演算法(且當然實際樣本)而定,將看到更多或更少的峰。亦必須注意,峰之品質及強度之量化(相對於豐度)亦至少在一定程度上較佳,如下文所論述之圖16A-16D中所圖解說明。
據信在(例如)200,000次射擊時所揭露之峰對應於血清樣本中存在之極少量完整(未經消化)蛋白質。使用本文所闡述且在本文中稱為「深度MALDI」方法(即,每一點大於20,000次射擊,且較佳來自同一點或來自多個點之組合的大約250,000次至750,000次或更多次射擊)
之技術,相信可以半定量及可重現方式偵測非常大量之蛋白質且可能血清樣本中所存在所有蛋白質的至少一半。以半定量方式偵測意味著強度之量測(峰高度、峰下面積)與樣本中蛋白質之絕對豐度或濃度有關。以可重現方式偵測意味著可多次量測相同樣本且在某一可接受變動係數內獲得相同結果。
獲得來自單一MALDI點之多於20,000次射擊可超過現代MALDI-TOF機器之參數;然而,吾人在此文件中闡述若干種圍繞此限制進行之方法。理想地,MALDI-TOF儀器經設計以適應本文件中所闡述之「深度MALDI」方法,且在以下描述中提供關於此機器之若干具體建議,包括自動化光柵掃描特徵及對單一點執行更多次射擊的能力。
使用來自MALDI樣本點之幾十萬次射擊的最迫切問題係在通常的點製備中,僅點內的一些射擊位置獲得足夠的離子流而實質上有助於組合光譜中之信號。儘管已使用勞動密集型手動過程獲得初始結果以在MALDI板上之給定點內目測選擇高離子產量位置用於雷射射擊,且可利用此方法繼續進行,但使選擇用於雷射射擊之位置的過程自動化係可能的且較佳用於本發明之高通量實施方案(否則出於不浪費太多次雷射射擊且使雷射使用壽命實質上退化的簡單原因)。替代方法係以大多數隨機選擇之位置產生高離子流之方式改良MALDI點之品質。兩種方法均可用於產生深度MALDI光譜。
此文件之此章節中闡述多種用於光譜獲取之自動化的方法。獲取之自動化可包括以光柵方式定義點之雷射掃描的最佳運動圖案,並產生用於在點內之離散X/Y座標位置處進行多次光柵掃描之規定序列,以產生來自一或多個點之所謂750,000次或3,000,000次射擊。舉例而言,自四個樣本點中之每一者之250,000次射擊所獲取之光譜可組合成1,000,000射擊光譜。如先前所提及,在含有相同樣本之多個點上所收集之數十萬次射擊至數百萬次射擊可一起進行平均以產生一個
光譜。一種自動化之方法涉及產生用於樣本點之非相鄰X/Y光柵掃描之光柵檔案。另一種方法涉及將點分成子點(sub-spot)網格(例如,3×3或5×5網格)並產生用於在子點之離散X/Y座標位置處進行光柵掃描之光柵檔案。所揭示之第三種方法使用影像分析技術來識別含有相對較高濃度之樣本材料用於光譜獲取(多次射擊)之所關注區域及/或彼等蛋白質濃度相對較低之區域,並在具有相對較高蛋白質濃度之區域中執行光譜獲取。
下文闡述最佳化樣本至MALDI板之施加過程(「點樣」)以在單一點內產生樣本/基質之均勻、均質晶體。此過程有助於使用自動化方法自MALDI板上之單一點獲得數十萬次射擊。
本發明之此發現及方法具有許多應用,包括生物標記發現、測試開發、物質測試、現有測試之驗證及假設產生(例如在生物標記發現努力中)。特別預期該等方法可應用於此文件之其他地方所闡述之預測性測試。該等方法藉由其與現有方法相比以高通量方式可重現地量化複合樣本中更多蛋白質之量的能力而進一步增強「稀釋並射擊」方法在質譜分析研究中之潛力。
此文件之此章節中所使用之術語:
1.術語「瞬態光譜」係指自引導至MALDI點中之單一位置或x/y定位之雷射射擊的單一封包(每一封包係由所定義數量之射擊組成,例如100次、500次、800次射擊等)所獲得之光譜。
2.術語「位置光譜」係指當雷射在MALDI點中之相同位置處射擊x次時一或多個瞬態光譜之累積和。
3.術語「點光譜」係指在整個單一MALDI點上方射擊期間所獲取之所有位置光譜之總和。點光譜可僅使用加和操作以對位置光譜進行加和來獲得,或在對位置光譜執行對準及/或正規化操作(例如,總離子流正規化)之後使用加和操作來獲得。點光譜通常可自MALDI點
上之100,000次至500,000次射擊獲得。獲得點光譜之其他選項係可能的,包括a)對位置光譜執行背景減除及正規化且然後加和;b)對位置光譜執行背景減除及對準且然後加和;c)對位置光譜執行背景減除、對準及正規化且然後加和。已發現,最佳動態範圍係藉由位置光譜之總離子流正規化(關於細節參見美國專利第7,736,905號)且然後加和達成;將在點光譜中實施任何背景減除。
4.術語「射擊位置」係指雷射束截斷MALDI點用於射擊之給定位置。為獲得每一MALDI點200,000次或500,000次射擊,例如,手動地或更佳以自動化方式在點上方使用雷射束之光柵掃描將雷射束在MALDI點上方引導至眾多(例如,數百個)個別射擊位置。如下文所解釋,光柵圖案設計很重要,此乃因通常不期望順序地射擊緊毗鄰點位置。因此,光柵圖案設計順序地選擇具有一定空間間隔之射擊位置並在整個MALDI點上方以空間移位方式重複掃描,以避免順序射擊點中緊毗鄰位置。
5.術語「瞬態光譜過濾」係指用於接受或拒絕瞬態光譜之過濾或選擇過程。作為實例,在瞬態光譜過濾中,為使瞬態光譜被接受,瞬態光譜中在預定m/z範圍內必須存在最小數量(例如,5)的峰,且瞬態光譜中之信雜比必須高於規定臨限值。亦可使用其他過濾準則,例如光譜之總離子流需要超過某一預定義臨限值,或藉由使用下文所解釋之排除列表或納入列表。光譜過濾接受或拒絕整個瞬態光譜。
6.如本文所用,術語「複合生物樣本」係定義為含有數百種或數千種豐度覆蓋大的動態範圍、通常許多數量級之分析物(例如完整蛋白質)的樣本。該等複合生物樣本之實例包括血液或其組份(血清或血漿)、淋巴液、導管液、腦脊髓液及前列腺擠出液(expressed prostatic serum)。該等複合生物樣本亦可由環境或食物樣本組成。
「深度MALDI」方法中所揭露光譜資訊之實例顯示於圖16A-16E
中。圖16A-16C係顯示相同樣本(血清)之三個光譜所選質量/電荷範圍(m/z比為7,000至8,000)之曲線圖,其圖解說明隨射擊次數增加可偵測峰含量增加。圖16A之光譜係自2,000次射擊產生,圖16B之光譜係自100,000次射擊產生,且圖16C之光譜係自500,000次射擊產生。特別地注意圖16A之光譜如何基本上表現為雜訊且表現為含有很少或沒有所關注之可辨別光譜資訊。將圖16A與16B相比較,其中圖16B之光譜(自100,000次射擊獲得之光譜)含有許多圖16A之光譜中不存在之個別峰(例如,在10處所識別之峰)。在圖16C之光譜中,在光譜中展示許多在其他光譜中未展示或者可能在底部光譜中已被視為雜訊之峰。將圖16C及16B與圖16A相比較,很明顯在100,000次射擊及500,000次射擊時揭露大量圖16A之光譜(2,000次射擊)中不存在之光譜資訊,且藉由深度MALDI方法降低雜訊位準,如圖16B及16C中所證實。
圖16B及16C之光譜的光譜靈敏度增加至所規定且可允許峰強度與豐度相關聯之動態範圍。可使用峰強度來分析複合生物樣本是否存在給定濃度之分子。舉例而言,在此方法中,將定義樣本中所關注之分子(具有已知質量),將樣品摻雜至目標豐度位準(莫耳濃度,或ppm)並施加至MALDI板;對板執行多次射擊(例如,多於100,000次)直至分子以特定豐度(強度)可靠地呈現於光譜中(在已知m/z定位處之峰),並記錄射擊次數(「x」)。此用以產生稱為「參考光譜」之程序將經受常規鑒定及標準化方法以確保可靠性,如對所屬技術領域之技術人員顯而易見的。然後,用於測試之所關注樣本將經受MALDI-TOF及x次射擊。若所得光譜揭露在對應於所關注分子之已知定位處之峰強度小於參考光譜中之峰強度,則樣本中所關注分子之濃度小於用於產生參考光譜所用樣本中之分子濃度。此方法可同時用於多種分析物。此外,可在已知濃度範圍內獲得關注分子在x次射擊時的多個參考光譜且測試光譜可與參考光譜相比較以測定測試樣本中關注分子
之近似濃度。此方法可用於許多目的,例如,藥物測試(例如,針對運動員)、代謝物濃度之測試、環境樣本測試等。關注分子可為質量範圍為約1 K道爾頓(Dalton)至50 K道爾頓之蛋白質,例如代謝物、癌症抗原(CA)125、前列腺特異性抗原(PSA)、C反應性蛋白質等。
圖16D係深度MALDI方法中所揭露光譜之巨大動態範圍之圖解說明。圖16D中之插圖係m/z範圍介於7140kDa與7890kDa之間之光譜的一部分,其顯示在約~500,000次射擊時所獲得之光譜及眾多峰10。將背景估計(虛線)疊加於光譜上,將其減去以產生背景減除光譜。注意,插圖且特定而言眾多峰10中之光譜資訊在圖16D之主要部分中並不可見。在圖16E中,在插圖中顯示Y軸經放大之光譜,以顯示額外光譜資訊及特定而言在m/z為約9520之區中之峰的強度資訊,該等峰係利用深度MALDI方法揭露但其在典型約1,000次射擊光譜中不可見。
圖16A係含有配置成矩形陣列之384個樣本點或「點」14之MALDI-TOF靶板12的平面圖。點係由行編號1......24及列A......P識別,例如,左上方點識別為A1。圖16B係疊加於具有原點(0,0)之X/Y座標系統16上之個別樣本點P1(14)之放大視圖。樣本點14顯示分成5×5矩形網格25個個別子點18。矩形網格18及位置座標系統16係用於自動化光柵掃描方法中以自該點之100,000次或更多次射擊獲取光譜,如本文所詳細闡述。
最初注意到,多次射擊(>20,000次)之自動化產生並非絕對必需的且可使用當前可用MALDI-TOF儀器之現有特徵。一般而言,在本發明深度MALDI技術中,重要的是選擇在MALDI點上當暴露於雷射射擊時產生高蛋白質產量之位置。現有質譜儀中之標準軟體允許使用正則預定義路徑(即,正方形圖案、六邊形圖案、螺旋圖案(自點之中心))在點上方移動。MALDI板上之射擊位置係在稱為「教示
(teaching)」(Bruker公司之現有MALDI-TOF儀器中存在之FlexControlTM(Bruker)質譜控制軟體之一部分)之過程中定義。(儘管在本文偶爾提及Bruker公司儀器之特徵,但本發明方法當然不限於任何特定儀器或特定製造商之儀器。)
含有均勻地分佈於點內之樣品/基質混合物之MALDI點的實例顯示於圖18中。Bruker公司之質譜儀包括顯示MALDI點之各區域之內置相機;在手動選擇中將挑選明亮位置30以使雷射瞄準此處。應避免暗位置32。有時明亮位置並不產生良好產量,此可與鹽晶體之存在有關。在射擊之過程中,點中之區域可變得耗盡;因此需要避免暗區域(具有低產量之耗盡區域)。手動方法將繼續進行以在射擊過程期間獲取並展示點之影像。
在初步試驗之過程中,發現隨著使用越來越多次射擊變得越來越難以發現良好位置。當同一點重複使用時亦發現此效應,例如在先前50萬次射擊之後增加第二個50萬次射擊。第二輪並未使得質譜之雜訊位準的降低如所預期的那樣多。實際上,所得平均光譜可具有更差之總體品質,此可能係由對來自太多空白位置之射擊進行平均引起的。若僅使用肉眼來選擇射擊位置並接受或拒絕光譜而不使用瞬態光譜過濾,則此可能導致針對早期位置之獲取偏差,且需要控制該等偏差。若使用自動化光柵掃描及位置光譜過濾,則消除此偏差。
然而,為增加通量,期望使位置選擇之過程自動化並獲得來自給定點之高射擊次數。在以下章節中闡述若干種方法。下文所闡述之方法能夠在13-15分鐘內自位於MALDI板之三個點(250,000次射擊/點)上之樣本獲取750,000次射擊,其中樣本要求係3微升血清。
儘管已使用勞動密集型手動過程獲得結果以在MALDI板上之給定點內目測選擇位置用於多次射擊以獲得100,000次或500,000次射擊/
點,且可利用此方法繼續進行,但使選擇用於雷射射擊之位置的過程自動化係可能的且此文件中闡述若干種方法。獲取之自動化可包括以光柵方式定義點之雷射掃描的最佳運動圖案,及在點內之離散X/Y位置處用於多次光柵掃描之序列產生,以產生來自樣本點之(例如)100,000次、250,000次或500,000次射擊。一種自動化之方法涉及產生用於樣本點之非相鄰X/Y光柵掃描之光柵檔案。光柵圖案設計很重要,此乃因通常不期望順序地射擊緊毗鄰點位置。因此,光柵圖案設計順序地選擇具有一定空間間隔之射擊位置並在整個MALDI點上方以空間移位方式重複掃描以避免順序射擊點中之緊毗鄰位置並選擇新的射擊位置。
另一種方法涉及將點分成子點網格(例如,3×3或5×5網格)(參見圖17B)並針對在子點之離散X/Y位置處之光柵掃描產生光柵檔案。
所揭示之第三種方法使用影像分析技術來識別含有相對較高濃度之樣本材料用於光譜獲取之所關注區域(多次射擊)及/或彼等樣本(例如,蛋白質)濃度相對較低之區域,並避免在具有相對較低樣本(例如,蛋白質)濃度之區域中進行光譜獲取。
一種獲得來自點之多次射擊之過程的自動化方法涉及產生用於樣本點之非相鄰X/Y光柵掃描之光柵檔案。此將結合圖19及20闡述。
圖19係用於自圖18之點14獲得100,000次或更多次射擊之光柵掃描圖案500之圖解說明。點14以順序方式經光柵掃描多次,例如25次。圖19中所示之符號集合502描繪其中點以單一光柵掃描來掃描(射擊)之個別離散X/Y位置。X/Y位置係根據在中心處具有原點(定位0,0)之圖中所示的座標系統來定義。在掃描期間,當將雷射引導至每一位置時,在該位置處之樣本可經受多次射擊,例如,每一定位/位置700次或800次射擊。自圖19中所示之圖案應注意到,每一光柵掃描係由
點內之個別離散位置處之射擊組成。個別光柵掃描係順序地實施,由此避免射擊點中之緊毗鄰位置。圖20顯示將圖19之光柵圖案疊加於圖18之點上方。
產生具有如圖19中所示非相鄰X/Y座標用於光柵掃描之25個光柵檔案之程序闡述於2012年5月29日提出申請之美國臨時申請案61/652,394之附錄中,且感興趣的讀者可定向至此文件用於進一步參考。
此方法之目的係使在樣本點(即,點A1、點A2等)上手動選擇位置/光柵之過程自動化,以在數據獲取期間產生「可接受」光譜並繼續進行直至幾十萬個光譜添加至加和緩衝器為止。對幾十萬個光譜進行加和/平均增加信雜比,且因此允許偵測明顯更多的峰,如先前所闡述。
如上文所闡述利用非相鄰光柵掃描之情況一樣,當如圖18中所示樣本/基質混合物實質上均勻且均質地分佈於整個點上方時,使用本章節中所述之網格工作良好。達成此之目前較佳方法稍後在此文件中針對稀釋並射擊血清及芥子酸(基質)闡述。由於此均勻分佈,因此可自樣本點上之實質上所有位置/光柵獲取光譜,此消除針對「可接受」光譜預先評估所有位置/光柵之需要。
在樣本點上收集幾十萬個光譜可藉由以下達成:定義將點14細分成子點或網格元件18且覆蓋樣本點之網格(圖17B),及自每一子點18內之每一位置/網格點/光柵收集定義數量之光譜,直至期望數量之光譜添加至加和緩衝器為止。Bruker軟體之先前版本在自動模式中僅允許對每一樣本點最大20,000個總光譜進行加和(圖21)。
為避開此限制,最初定義5×5網格區域(圖17B,16),其將每一樣本點分成25個8×8網格或子點18(圖17B)。針對每一網格或子點18產
生單獨的光柵檔案。儀器經指示以在網格18內之每一位置/光柵處獲取800個光譜(射擊),直至將20,000個光譜添加至(光譜)加和緩衝器為止。此時,自動化方法應指示儀器移動至下一網格或子點18且使用下一光柵檔案並產生另一20,000個光譜。在實踐中,設計25個光柵檔案,其一者用於每一子點18,其中之每一者附接至單獨的autoExecuteTM(Bruker)方法,其根據方法內之評估準則設定獲取數據。
此程序容許使用Bruker之flexcontrolTM軟體工具每批20,000次射擊獲取500,000個射擊光譜(20,000個射擊光譜/網格×25個網格),而無需使用成像應用(例如flexImagingTM(Bruker))。此程序之結果係一個樣本點25個光譜檔案,每一者含有一個包含20,000個射擊光譜之加和光譜。然後可對該25個光譜檔案進行加和以產生自500,000次射擊所獲得的MALDI板上之單一點之總體光譜,例如如圖16C、16D及16E中所示。
最新版本之flexcontrol TM(Bruker)允許累積來自高達500,000次射擊之加和光譜。舉例而言,在圖21中,autoExecuteTM(Bruker)方法編輯器允許對800個射擊步驟(每一位置/光柵800次射擊)中之20,000次射擊加和。
然而,每一樣本點只能收集一個加和光譜(x個瞬態光譜之總和)。為自單一樣本點獲取若干批次之加和光譜,吾人不得不對MS儀器中之現有軟體特徵進行調整。利用該等調整,可自一個或若干個組成網格之光柵(例如上文所闡述者)獲取光譜,並個別地保存每一瞬態或位置光譜。舉例而言,儀器可經指示以收集並保存在圖17B中之網格或子點18中之每一光柵(x,y定位)處所獲取之每一800發射位置光譜,而無需添加至求和緩衝器。對樣本點A1、A2、A3等內之所有子點重複相同過程(例如,可自250個光柵/樣本點獲取800個射擊光譜=
200,000次射擊/樣本點)。可在應用或不應用光譜過濾之情況下在autoExecute TM(Bruker)中獲取位置光譜。
光譜獲取自動化之一個選項係影像處理技術以識別具有高蛋白質產量/高樣本濃度之點上之空間位置,尤其在樣本未空間均勻地分佈於點上而是集中於離散區域中之情形中。在一個可能實施例中,使用儀器中所包括之相機獲取訓練點(training spot)之光學影像。然後,自訓練點上之多個位置的光柵獲取質譜。使用所得質譜結合點之光學影像產生分類機制,以根據光學影像偵測自給定樣本製備製得之其他點之高產量位置。此分類然後將應用於實際樣本點。儘管此係一種完美的解決方案,但會遇到捕獲相機原始數據(camera feed)及相機影像之位置至雷射射擊位置之重複校準的問題。
一種替代方法係使用質譜儀直接以質譜成像方法之形式研究點。此想法係首先在點上之精密標度(正方形)圖案之每一位置處以低數量之射擊(數十次)運行初步掃描及射擊。將收集該等光柵位置中之每一者的光譜,且將記錄每一位置之總離子流或在某一預定義m/z範圍內之離子流。將基於來自初步掃描運行之N個最高強度位置產生新的光柵檔案,並用於最終質譜獲取中。此方法利用Bruker FlexImagingTM軟體作為最可行解決方案來在質譜成像運行中產生多個光譜。用軟體分析該等光譜,並產生最終光柵掃描圖案。儘管此方法可能對於使用芥子酸作為基質之標準稀釋並射擊過程係有用的,但對於其他基質及預分餾樣本集合(例如CLCCA,參見Leszyk,J.D.Evaluation of the new MALDI Matrix 4-Chloro-a-Cyanocinnamic Acid,J.Biomolecular Techniques,21:81-91(2010))及諸如NOG沈澱等其他方法而言將係次最佳的(Zhang N.等人,Effects of common surfactants on protein digestion and matrix-assisted laser desorption/ionization mass
spectrometric analysis of the digested peptides using two-layer sample preparation.Rapid Commun.Mass spectrom.18:889-896(2004))。此替代方法之重要態樣係查找MS成像部分中之獲取設定以便不會產生太大的檔案。標準獲取檔案大約為1百萬位元組,且對於400×400光柵掃描(400個位置,每一位置400次射擊)而言產生16,000個光譜。由於對該等光譜之要求並不繁重,且僅需要估計總離子流,因此可以低解析度設定工作。可自自動光譜獲取設定直接獲得可用位置列表,即,獲得成功獲取或獲取失敗的列表。根據吾人的研究,似乎可使用質量過濾作為MS成像包之一部分以產生符合一定準則之位置列表(經由檔案列表辨識)。儘管此將極大地有助於產生原型工作流,但其將需要經由專用軟體最佳化以避免半手動過程。
圖22展示使用CLCCA作為基質之MALDI點之區,其中高產量區域係由線性結構組成且低產量之區域顯示為暗區域。對於該等情況而言,在基質樣本結晶極不均勻之地方(如圖20中所示),影像分析方法似乎最敏感。影像分析識別相對較高產量之區域(120,122)。相對較低產量之區域(例如左下方之區域124)及基質區域126係藉由影像分析軟體識別並在射擊期間忽略。
識別點上之相對高及相對低產量之區域的影像分析軟體可採取多種形式,且可由熟悉此項技術者開發。舉例而言,點之黑色及白色影像(圖19)係由像素陣列組成,每一者具有8位元量化值,其中0為黑色(無信號)且255為白色(飽和)。過濾可用於識別相對較高產量之區域,例如藉由識別像素值大於(例如)100之像素之別為「高產量」且像素值低於40之像素識別為相對「低產量」。然後可對對應像素具有100或以上之值的樣本點之該等區域進行掃描。當該等區域經測定具有鹽晶體或導致低產量之其他性質時,亦可將像素值為240-255之點位置濾除。再參照圖22,晶體結構120、122之像素的像素值在100至
240的範圍內且因此將被掃描,而黑色區域124及126將不被掃描。亦可使用形態處理技術來識別諸如圖22之晶體120等結構。影像分析軟體可包括形態處理及過濾二者以測定掃描區域。另外,在掃描過程期間點可改變(由於樣本耗盡)且在掃描期間可運行影像處理以最佳化自點產生100,000次或更多次射擊之過程期間的射擊,及在射擊期間避免彼等低樣本濃度之位置。
圖23係MALDI-TOF儀器之螢幕擷取畫面,其顯示包括點14(在此情況中板之點F17)之影像132之儀器工作站130的顯示器。板之佈局顯示於12’處,其中點F17在14’處指示。選擇一組點134(D9至F20)以自動化模式使用上述影像分析方法運行。
圖24係儀器之另一螢幕擷取畫面。當前儀器允許使用者設定評估區以接受或拒絕瞬態光譜(使用評估標籤),設定每一點累積多少個光譜(使用累積標籤)及跨越該點「移動」以便可以某一圖案觸發雷射(使用「移動」標籤,如所示)。選項包括隨機行進或以圖案(例如,六邊形或螺旋形)移動。軟體亦允許使用者持續觸發雷射且根據該等參數獲取並添加至總光譜,直至自射擊位置收集750次射擊之光譜為止,且然後移動至下一射擊位置。可設置在射擊位置被認為係失敗點之前的嘗試次數。識別可能的低產量之區域並避免在該等區域中射擊之影像分析方法有助於明顯減少或消除該等失敗判斷。
圖25顯示選擇用於接受或拒絕瞬態光譜之質量範圍的評估頁面,如在150處所指示。在獲取期間,若瞬態光譜不具有在預定義範圍內(在此情況中5,000Da至18,000Da)且超過臨限值集合(基於解析度、信號強度或其他因素)之峰,則其將被拒絕。換言之,瞬態光譜將不會添加至加和緩衝器以形成位置光譜(對來自所有射擊之光譜進行加和)。
圖26顯示若存在不想納入評估中之特定峰,則可製作排除列表
並將該等峰標記為「背景峰」之評估頁面。軟體具有用於定義背景峰之基質的預定義「對照列表」,或可輸入峰列表。
一般而言,深度MALDI技術可擴展以將來自多個點之光譜組合。舉例而言,可自標準MALDI板上之點A1、A2、A3、A4及A5(參見圖17A)之每一者獲得樣本之500,000次射擊,並將所得光譜組合(加和)成一個由2,500,000個光譜(射擊)之和組成之總體光譜。根據先驗,沒有理由相信不能將來自多個點之光譜組合以達到極高的射擊次數,即100個點×1百萬次射擊,每一者可給出來自100百萬次射擊之結果。此程序可存在實際限制,例如,雷射可能經常會失敗。
在此方法之一個實例中,可使用先前所闡述之技術使用用於掃描多個點之手動或自動產生光柵自MALDI板上之相同血清的多個點收集5百萬次射擊之光譜。在此方法中,較佳在MALDI板上可重現地獲得單一樣本之均質點。此可使用本文所闡述之方法達成。
1.將經稀釋血清點樣於MALDI靶板上。
程序:將血清以1:10利用HPLC級水稀釋並渦旋。將樣本與基質(20mg/ml芥子酸存於50%ACN/0.1%TFA中)以1:1(v/v)在0.5ml microfuge試管中混合並渦旋。將4μl基質/樣本混合物點樣於MALDI靶之一或多個點上。
在此實例中使用MALDI板中之36個點(位置):
試管1:在MALDI板之位置E13、E14及E15上點樣(參見圖2A)
試管2:在位置E16、E17及E18上點樣
試管3:在位置E19、E20及E21上點樣
試管4:在位置E22、1E23及E24上點樣
試管5:在位置F1、F2及F3上點樣
試管6:在位置F4、F5及F6上點樣
試管7:在位置F7、F8及F9上點樣
試管8:在位置F10、F11及F12上點樣
試管9:在位置F13、F14及F15上點樣
試管10:在位置F16、F17及F18上點樣
試管11:在位置F19、F20及F21上點樣
試管12:在位置F22、F23及F24上點樣
樣本點E13至F18(試管1-10)係在渦旋之後使用同一移液管尖端直接施加3次(3×每一試管的15μl中的4ul;而最後六個樣本點F19-F24(試管11及12)係如點E13-F18一樣施加,但在板上用移液管上下吸取。
藉由將靶板置於試驗臺上使MALDI板上之點於環境溫度下乾燥。
結果:對於點E13至F17(直接施加至板上而無進一步板上混合)而言,每一試管之第三點明顯比前兩個點均質。目測評價均質性:第三點最佳,第二點係第二佳,第一點具有最小均質,除E23以外,其係來自試管4之三個點的第二者但是看起來比第二點樣更像來自每一試管之第三點樣。
在試管中藉由渦旋混合並在板上用移液管上下吸取之樣本點F18、F19、F20、F21、F23及F24相當相似且具有與E13至F17之集合中之第三點相同之均勻外觀。F22看起來與E23相同。
來自大約312,500次射擊/點之質譜數據係在執行以上程序之後自16個MALDI點獲得:
E15、E18、E21、E23、E24、F3、F6、F9、F12、F15、F18、F19、F20、F21、F23及F24。
使用以上所闡述之光柵掃描檔案,對來自每一點之光譜進行加和以產生自大約5,000,000次射擊獲得之樣本之總體光譜。
最佳化樣本至MALDI板之施加(點樣)
最佳化樣本至MALDI板之施加以將均質且均勻分佈之結晶樣本提供至MALDI板上之每一樣本點,其一個實例顯示於圖15中。如下所述執行若干試驗以尋找將樣本混合物供應至MALDI板上之點(「點樣」)之最佳程序。該等試驗闡述於此章節中。
初始,製備具有血清之若干不同製劑。除非另有說明,否則將2μl基質進行點樣。除非另有說明,否則將稀釋樣本及基質介質在樣本製備試管中混合。除非另有說明,否則不會自單一製備試管點樣1個點以上,此乃因自樣本製備試管取出多個等份試樣影響結晶。
實施產生均質點之磨光鋼板(Ground Steel Plate)試驗。該等程序係如下:
1.將樣本以1:10稀釋(2μl樣本+18μl水),然後以1:1(v/v)與存於50%ACN/0.1%TFA中之基質(芥子酸25mg/ml)混合並將2μl基質點樣。此程序不能產生良好的均質晶體。
2.用基質裝填尖端。將2μl基質吸取至點樣尖端並使其停留30秒。將樣本以1:10稀釋(2μl樣本+18μl水),然後以1:1(v/v)與存於50%ACN/0.1%TFA中之基質(芥子酸25mg/ml)混合。將過量基質自移液管尖端排除。將移液管尖端置於樣本基質混合物中並用移液管上下吸取3次。在不更換尖端之情形下將2μl樣本基質混合物進行點樣。此程序形成均質之良好晶體。由於此係磨光鋼板,因此樣本基質混合物不會如在拋光鋼板上鋪展那樣多。留在移液管尖端之乾燥晶體可藉由作為進一步晶體形成之晶種而改良結晶。
3.研究溫度對結晶之影響。將樣本以1:10稀釋(2μl樣本+18μl水),然後以1:1(v/v)與存於50%ACN/0.1%TFA中之基質(芥子酸25mg/ml)混合。將樣本置於37℃水浴中達5分鐘。將樣本自水浴移除並立即點樣。此程序不能產生良好的均質晶體。
4.重複以上試驗2,只是用4μl樣本混合物而非2μl進行點樣。此程序形成均質之良好晶體。用4μl進行點樣完全覆蓋點直徑並產生良好晶體及數據。此係目前認為最佳之程序。
此處用於點樣之程序係以舉例方式而非以限制方式提出,且當然自所揭示方法有所變化係可能的。舉例而言,可將基質與樣本材料在試管中混合並在點樣之前將其放置數分鐘。已注意到,獲得的均質晶體越多,自同一試管使用同一移液管尖端獲得之點越多。舉例而言,可自同一試管使用同一移液管尖端點樣10個點並僅收集最後5個左右點之數據;或者可在開始在MALDI板上點樣之前丟棄來自該試管之前5份4μl等份試樣。
亦已發現根據1中之程序但使用同一移液管尖端在拋光之鋼靶板上對同一樣本試管點樣10次(每一點2.5μl)獲得類似結果(光譜品質)。
可實施技術可重現性研究以(例如)每天以100個批次運行1,000次技術重複。可研究對樣本(點)製備(在板上或脫離板)之依賴,尤其看製備方法是否產生更均勻離子流產量,例如樣本稀釋度之變化。亦可監測點至點間之高產量位置的數量如何變化以及如何將此變化最小化。在高粒度位準下監測及記錄所有獲取及製備係良好實踐。
樣本間可重現性之類似問題可相對於樣本間變化來研究。可出現的新現象:一些樣本可能富含蛋白質,且導致具有更多高產量位置
之點。可獲得來自一些樣本屬性方式(光學密度及色彩)之多種量度或使樣本獲取裝置(例如,針對血清)標準化以產生更多可重現程序。可使用儘可能具有異質源之組合樣本集合以試圖涵蓋大部分變化。此一集合將自研究現有集合且根據已知樣本收集及條件匹配來獲得,此增強現有樣本數據庫之使用。
觀察光譜中之多個峰引起在此方法中可看見之豐度範圍及實際可見之蛋白質類型之問題。此涉及在複合樣本之MALDI MS中由於「離子抑制」(來自較豐富蛋白質之離子抑制來自較不豐富蛋白質之離子信號,因此使得較不豐富蛋白質不可偵測的概念)而無法觀察較低豐度離子之「習用觀點」。此想法似乎僅基於未觀察到較低豐度離子。實際上,峰含量增加之觀察結果(參見例如圖16C)對此解釋提出了一些質疑。相反,看起來必須重視MALDI MS之(半)定量性質。若吾人贊同蛋白質豐度跨越在多個數量級內之寬範圍,則將期望相應質譜藉由展現峰高度(更確切地說峰下面積)之巨大差異模擬此行為。吾人並未期望在MALDI光譜中觀察到低豐度蛋白質,並非因為其不能離子化,而是因為對應於低豐度蛋白質之峰的振幅將極低。由於質譜分析中之慣常做法係集中於大的峰,且由於較低豐度峰的數量級將較小,因此之前沒有觀察到該等峰並不奇怪。此並非說諸如離子抑制等現象不發生,或離子化概率不起作用,而是說該等現象並未完全抑制源自低豐度蛋白質之峰,且若在光譜之低密度區中找到低豐度蛋白質峰,則確實變得可觀測。因此,對覆蓋顯著百分比之血清蛋白質體之探索可視為對擴展質譜之動態範圍的探索。正如任何其他基於計數之技術,此問題之簡單解決方案係藉由增加所偵測離子之數量(每飛行時間方格)增加統計。
為在此與習用觀點相悖之簡單解釋中獲得更多信心,可希望建
立質譜之動態範圍並將其與蛋白質之豐度相關聯。此將根據分析化學觀點實施以下二者:建立靈敏度曲線(作為m/z之函數),以及識別對應於一些峰之蛋白質及經由諸如ELISA等正交技術進行該等蛋白質之相對豐度量測。
本發明之方法可與用於分餾樣本之沈澱方法(例如NOG沈澱、脫脂質化等)組合使用。該等方法亦可與諸如CLCCA等其他基質一起使用。該等方法可能亦可極大地受益於深度MALDI方法。使用樣本預分餾之初步數據指示確實看到不同峰,但峰含量遠達不到最佳。此可預期一個目的係除去高豐度蛋白質。
在過去試圖使用耗盡及/或質量過濾來降低如白蛋白及血紅蛋白等不期望蛋白質之含量,但該等方法均未能完全移除,且該等峰之殘餘仍可見。針對經耗盡或質量過濾樣本使用本文所闡述之深度MALDI方法將產生較佳結果,因為大峰之降低亦將降低看到較低豐度蛋白質所需之動態範圍。
在autoExecuteTM(Bruker)方法中,可定義過濾設定以僅收集符合一定準則之瞬態光譜;在吾人之情況中,希望僅添加總離子流大於外部定義之臨限值的瞬態光譜(由<xx>次射擊引起)。儘管此在簡單方式中看起來不可能,但處理方法標籤中之過濾準則可用於類似目的。另一選擇為,峰評估方法中可存在可針對此目的調諧之參數。儘管此不降低射擊次數,但其可克服初期射擊之射擊偏差問題,即,不獲取僅由雜訊組成之瞬態。在加和瞬態光譜中使用自動化過濾操作以產生位置光譜避免該偏差問題。
考慮到由雷射照明之大小以及預光柵化步驟之最小網格大小之
限制,很可能在標準點上具有足夠離子產量之射擊位置不充足。解決此之簡單途徑係增加點大小。FlexImagingTM(Bruker)軟體將使此極為簡單。亦存在可能適用於此目的之MS成像應用中所用之正方形點樣區域的選項。使用較大點之額外益處將係不必擔心是否可定位類似數量之適宜射擊位置並產生在點間具有類似品質之光譜。樣本體積看來並不存在問題。若較大點係可能的,則將減少用於處理同一獲取之多個點之後勤,此可係高射擊次數所需要的。
關於「深度MALDI」方法之再其他考慮因素闡述於2012年5月29日提出申請之美國臨時申請案第61/652,394號且感興趣讀者可定向至此文件。
此揭示內容之一個實例係關於基於酵母之免疫療法組合物,其經設計以在患有癌症之病人中刺激對抗由腫瘤細胞表現之癌症抗原的治療免疫反應。方法包括將針對癌症之基於酵母之免疫療法組合物(即,包含癌症抗原)投與患有表現該癌症抗原之癌症的受試者之步驟,且該受試者已藉由根基本文所述之本發明質譜預測方法中之任一者執行之測試識別或選擇為可能受益於該組合物之投與。
更特定而言,在一個態樣中,闡述利用針對癌症之基於酵母之免疫療法治療癌症病人之方法。方法包括以下步驟:(a)根據本文所述之預測方法中之任一者實施測試,且若光譜之類別標記指示該病人可能受益於針對癌症之基於酵母之免疫療法,(b)投與針對癌症之基於酵母之免疫療法。在一個態樣中,病人另外在利用針對癌症之基於酵母之免疫療法治療之前、與其同時或之後利用一或多種額外抗癌療法治療。在一個實施例中,該額外抗癌療法包括(但不限於)手術(例如,手術切除腫瘤)、化學療法、放射療法、靶向癌症療法(例如,特定靶向涉及腫瘤生長及進展之分子的小細胞藥物或單株抗體療法)及
安寧療護或其任一組合。
在另一態樣中,本揭示內容係關於利用針對癌症之基於酵母之免疫療法治療癌症病人之方法。方法包括將針對癌症之基於酵母之免疫療法投與已藉由根據本文所述本發明之預測方法中之任一者的測試選擇之癌症病人之步驟,其中光譜之類別標記指示病人可能受益於針對癌症之基於酵母之免疫療法。在一個態樣中,病人另外在利用針對癌症之基於酵母之免疫療法治療之前、與其同時或之後利用一或多種額外抗癌療法治療。在一個實施例中,該額外抗癌療法包括(但不限於)手術(例如,手術切除腫瘤)、化學療法、放射療法、靶向癌症療法(例如,特定靶向涉及腫瘤生長及進展之分子的小細胞藥物或單株抗體療法)及安寧療護或其任一組合。
在本發明之再一態樣中,闡述利用針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法治療癌症病人之方法。此方法包括以下步驟:(a)根據以上所闡述之預測方法中之任一者實施測試,且若光譜之類別標記指示該病人可能受益於針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法,(b)投與針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法。在一個態樣中,病人另外在利用針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法治療之前、與其同時或之後利用一或多種額外抗癌療法治療。在一個實施例中,針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法係一系列稱為GI-4000之基於酵母之免疫療法產品或等效物中之產品。在本發明此實施例之一個態樣中,突變Ras陽性癌可包括(但不限於)胰臟癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌(CRC)、子宮內膜癌、卵巢癌、黑色素瘤及多發性骨髓瘤。在一個態樣中,該癌症係胰臟癌。在一個實施例中,該額外抗癌療法包括(但不限於)手術(例如,手術切除腫瘤)、化學療法、放射療法、靶向癌症療法(例如,特定靶向涉及腫瘤生長及進展之分子的小細胞藥物或單株抗體療法)及安寧療護或其任一組合。在
一個態樣中,將針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法連同吉西他濱或等效物投與病人。在一個實施例中,病人係胰臟癌病人且該療法包含一系列稱為GI-4000之基於酵母之免疫療法產品或等效物中之產品,其單獨或與吉西他濱組合。在一個態樣中,癌症病人之腫瘤已在利用基於酵母之免疫療法組合物治療之前手術切除。
在本發明之再一態樣中,闡述利用針對癌症之基於酵母之免疫療法治療癌症病人之方法。方法包括將針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法投與藉由根據本文所述本發明之預測方法中之任一者的測試選擇之癌症病人的步驟,其中光譜之類別標記指示該病人可能受益於針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法。在一個態樣中,病人另外在利用針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法治療之前、與其同時或之後利用一或多種額外抗癌療法治療。在一個實施例中,針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法係一系列稱為GI-4000之基於酵母之免疫療法產品或等效物中之產品。在本發明此實施例之一個態樣中,突變Ras陽性癌可包括(但不限於)胰臟癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌(CRC)、子宮內膜癌、卵巢癌、黑色素瘤及多發性骨髓瘤。在一個態樣中,該癌症係胰臟癌。在一個實施例中,該額外抗癌療法包括(但不限於)手術(例如,手術切除腫瘤)、化學療法、放射療法、靶向癌症療法(例如,特定靶向涉及腫瘤生長及進展之分子的小細胞藥物或單株抗體療法)及安寧療護或其任一組合。在一個態樣中,將針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法連同吉西他濱或等效物投與病人。在一個實施例中,病人係胰臟癌病人且該療法包含一系列稱為GI-4000之基於酵母之免疫療法產品或等效物中之產品,其單獨或與吉西他濱組合。在一個態樣中,癌症病人之腫瘤已在利用基於酵母之免疫療法組合物治療之前手術切除。
本揭示內容使用術語「基於酵母之免疫療法」,該片語可與「基
於酵母之免疫治療組合物」、「基於酵母之免疫療法產品」、「基於酵母之免疫療法組合物」、「基於酵母之組合物」、「基於酵母之免疫治療」、「基於酵母之疫苗」或該等片語之衍生物互換使用。如本文所用,基於酵母之免疫治療組合物係指包括酵母媒介組份及靶向受試者之疾病或病狀之抗原組份之組合物(即,針對癌症之基於酵母之免疫治療組合物包括酵母媒介組份及靶向病人之癌症的癌症抗原組份)。
可用於本發明包含突變Ras抗原之基於酵母之免疫治療組合物靶向病人之突變Ras陽性腫瘤。此組合物可係指「酵母-Ras免疫療法組合物」或「表現Ras抗原之基於酵母之免疫治療組合物」或「針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法」。針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法包括(但不限於)稱為「GI-4000」之一系列基於酵母之免疫療法產品。
結合酵母媒介,包括於基於酵母之免疫療法產品中之癌症抗原(例如,突變Ras抗原)最通常由酵母媒介表現為重組蛋白質(例如,藉由完整酵母或酵母球形質體,其可視情況進一步處理成酵母胞質體、酵母殘骸(yeast ghost)或酵母膜提取物或其部分),但本發明之實施例係將一或多種該等癌症抗原加載於酵母媒介中或以其他方式與酵母媒介複合、附接至酵母媒介、與酵母媒介混合或與酵母媒介一起投與以形成本發明中可用之組合物。
在本發明之一個態樣中,用於本發明之一或多種基於酵母之免疫療法組合物之抗原包括任一癌症或腫瘤相關抗原。在一個態樣中,抗原包括與前腫瘤性或增殖狀態相關聯之抗原。抗原亦可與癌症相關聯或造成癌症。此抗原可為腫瘤特異性抗原、腫瘤相關抗原(TAA)或組織特異性抗原、其表位或其表位促效劑。癌症抗原包括(但不限於)任何腫瘤或癌症之抗原,包括(但不限於)黑色素瘤、鱗狀細胞癌、乳癌、頭頸癌、甲狀腺癌、軟組織肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、前列腺癌、
卵巢癌、膀胱癌、皮膚癌、腦癌、血管肉瘤(angiosarcomas)、血管肉瘤(hemangiosarcomas)、肥大細胞瘤、白血病、淋巴瘤、原發性肝癌、肺癌、胰臟癌、胃腸癌(包括結腸直腸癌)、腎細胞癌、造血系統腫瘤及其轉移性癌。
適宜癌症抗原包括(但不限於)突變Ras腫瘤蛋白(參見例如美國專利第7,465,454號及第7,563,447號)、癌胚抗原(CEA)及其表位(例如CAP-1、CAP-1-6D)(GenBank登記號M29540或Zaremba等人,1997,Cancer Research 57:4570-4577)、MART-1(Kawakami等人,J.Exp.Med.180:347-352,1994)、MAGE-1(美國專利第5,750,395號)、MAGE-3、GAGE(美國專利第5,648,226號)、GP-100(Kawakami等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 91:6458-6462,1992)、MUC-1(例如,Jerome等人,J.Immunol.,151:1654-1662(1993))、MUC-2、正常及突變p53腫瘤蛋白(Hollstein等人,Nucleic Acids Res.22:3551-3555,1994)、PSMA(前列腺特異性膜抗原;Israeli等人,Cancer Res.53:227-230,1993)、酪胺酸酶(Kwon等人,PNAS 84:7473-7477,1987)、TRP-1(gp75)(Cohen等人,Nucleic Acid Res.18:2807-2808,1990;美國專利第5,840,839號)、NY-ESO-1(Chen等人,PNAS 94:1914-1918,1997)、TRP-2(Jackson等人,EMBOJ,11:527-535,1992)、TAG72、KSA、CA-125、PSA(前列腺特異性抗原;Xue等人,The Prostate,30:73-78(1997))、HER-2/neu/c-erb/B2(美國專利第5,550,214號)、EGFR(表皮生長因子受體;Harris等人,Breast Cancer Res.Treat,29:1-2(1994))、hTERT、p73、B-RAF(B-Raf原致癌基因絲胺酸/蘇胺酸-蛋白質激酶;Sithanandam等人,(1990),Oncogene 5(12):1775-80)、腺瘤大腸瘜肉(APC)、Myc、von Hippel-Lindau蛋白質(VHL)、Rb-1、Rb-2、雄激素受體(AR)、Smad4、MDR1(亦稱為P-糖蛋白)、Flt-3、BRCA-1(乳癌1;美國專利第5,747,282號)、BRCA-2
(乳癌2;美國專利第5,747,282號)、Bcr-Abl、pax3-fkhr、ews-fli-1、Brachyury(GenBank登記號NP_003172.1或NM_003181.2;Edwards等人,1996,Genome Res.6:226-233)、HERV-H(人內源性逆轉錄病毒H)、HERV-K(人內源性逆轉錄病毒K)、TWIST(GenBank登記號NM_000474及NP_000465)、間皮素(Kojima等人,1995,J.Biol.Chem.270(37):21984-90;Chang及Pastan,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(1):136-40)、NGEP(在前列腺中表現之新基因(New Gene Expressed in Prostate);Bera等人,2004,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(9):3059-3064;Cereda等人,2010,Cancer Immunol.Immunother.59(1):63-71;GenBank登記號AAT40139或AAT40140)、該等抗原及組織特異性抗原之修飾形式、該等抗原之剪接變體及/或該等抗原之表位促效劑。其他癌症抗原已為此項技術所知。其他癌症抗原亦可藉由此項技術中已知之方法識別、分離並選殖,例如彼等揭示於美國專利第4,514,506號中者。癌症抗原亦可包括一或多種生長因子及每一者之剪接變體。
在本發明之一個態樣中,癌症抗原係癌胚抗原(CEA),包含其表位或由組成之多肽,例如CAP-1、CAP-1-6D(GenBank登記號M29540或Zaremba等人,1997,Cancer Research 57:4570-4577)、經修飾CEA、CEA之剪接變體、該等CEA蛋白質之表位促效劑及/或包含CEA之至少一個免疫原性結構域或其促效劑表位之融合蛋白。在一個態樣中,CEA係經修飾CEA,其對應於具有由2007年3月1日公開之美國專利公開案第US 2007_0048860號中之SEQ ID NO:46代表之胺基酸序列之經修飾CEA,其由該公開案中之核苷酸序列SEQ ID NO:45編碼。
在本發明之一個態樣中,基於酵母之免疫療法組合物靶向人類Brachyury。Brachyury抗原及靶向brachyury之基於酵母之免疫療法組合物已闡述於2012年9月20日公開之PCT公開案第2012/125998號中。
在本發明之一個態樣中,基於酵母之免疫療法組合物靶向黏蛋白-1(MUC-1)。MUC-1抗原及靶向MUC-1之基於酵母之免疫療法組合物已闡述於2013年2月21日公開之PCT公開案第2013/025972號中。
在本發明之一個態樣中,基於酵母之免疫療法組合物靶向突變Ras陽性癌。ras係已知在特定位置發生若干突變之致癌基因且與一或多種癌症類型之發展相關聯。因此,針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法產品包括含有已知在某些癌症中已突變之胺基酸殘基之Ras的至少一個免疫原性結構域。該等癌症包括(但不限於)胰臟癌、NSCLC、結腸直腸癌、子宮內膜癌及卵巢癌、以及黑色素瘤及多發性骨髓瘤。在一個態樣中,針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法產品含有兩個、三個或更多個Ras之免疫原性結構域,其中每一結構域含有已知在某些癌症中出現之一或多個不同Ras突變,以涵蓋若干或所有在Ras蛋白質中發生之已知突變。舉例而言,在本發明之一個態樣中,基於酵母之免疫治療組合物中所用之Ras抗原相對於野生型Ras蛋白質包含含有胺基酸位置12、13、59、61、73、74、75、76、77及/或78之野生型Ras蛋白質之至少5-9連續胺基酸殘基,其中在位置12、13、59、61、73、74、75、76、77及/或78處之胺基酸殘基相對於野生型Ras蛋白質已突變。在一個態樣中,癌症抗原包括:(a)包含至少來自野生型Ras蛋白質之位置4-20或至少來自位置8-16之蛋白質,惟在位置12處之胺基酸殘基相對於野生型Ras蛋白質經突變除外;(b)包含至少來自野生型Ras蛋白質之位置5-21或至少來自位置9-17之蛋白質,惟在位置13處之胺基酸殘基相對於野生型Ras蛋白質經突變除外;(c)包含至少來自野生型Ras蛋白質之位置51-67或至少來自位置55-63之蛋白質,惟在位置59處之胺基酸殘基相對於野生型Ras蛋白質經突變除外;(d)包含至少來自野生型Ras蛋白質之位置53-69或至少來自位置57-65之蛋白質,惟在位置61處之胺基酸殘基相
對於野生型Ras蛋白質經突變除外;(e)包含至少來自野生型Ras蛋白質之位置65-81或至少來自位置69-77之蛋白質,惟在位置73處之胺基酸殘基相對於野生型Ras蛋白質經突變除外;(f)包含至少來自野生型Ras蛋白質之位置66-82或至少來自位置70-78之蛋白質,惟在位置74處之胺基酸殘基相對於野生型Ras蛋白質經突變除外;(g)包含至少來自野生型Ras蛋白質之位置67-83或至少來自位置71-79之蛋白質,惟在位置75處之胺基酸殘基相對於野生型Ras蛋白質經突變除外;(h)包含至少來自野生型Ras蛋白質之位置69-84或至少來自位置73-81之蛋白質,惟在位置77處之胺基酸殘基相對於野生型Ras蛋白質經突變除外;(i)包含至少來自野生型Ras蛋白質之位置70-85或至少來自位置74-82之蛋白質,惟在位置78處之胺基酸殘基相對於野生型Ras蛋白質經突變除外;及/或(j)包含至少來自野生型Ras蛋白質之位置68-84或至少來自位置72-80之蛋白質,惟在位置76處之胺基酸殘基相對於野生型Ras蛋白質經突變除外。應注意,該等位置通常對應於K-Ras、N-Ras及H-Ras蛋白質,且對應於人類及小鼠序列以及其他序列,此乃因人類及小鼠序列在Ras蛋白質之該等區域中一致且因為K-Ras、H-Ras及N-Ras在Ras蛋白質之該等區域中一致。
如本文所用,術語「GI-4000」一般係指一系列基於酵母之免疫療法組合物(TARMOGEN®產品),其中每一基於酵母之免疫療法組合物表現靶向人類癌症中觀察到之Ras突變的一或多種Ras突變。該等突變與腫瘤之發展相關聯。臨床中所用且本文實例中所闡述之GI-4000目前係由一系列四種基於酵母之免疫療法產品版本組成,其個別地標識為GI-4014、GI-4015、GI-4016及GI-4020。每一型式係熱不活化的整體(完整)啤酒酵母菌酵母,其以重組方式表現含有三種Ras突變(相對於天然Ras蛋白質位於位置12處之一個突變及相對於天然Ras蛋白質位於位置61處之兩個不同突變)之獨特組合之融合蛋白,其共同地靶
向人類癌症中所觀察到之7種最常見Ras突變(4種在位置12處之不同突變及3種在位置61處之不同突變)。在GI-4000臨床研究中,每一病人之腫瘤經測序以識別病人之腫瘤中所含之特異性Ras突變且然後投與含有所識別突變蛋白質之相應酵母-Ras免疫療法產品。GI-4000系統中之每一產品均單獨製造並裝小瓶。
更具體而言,在目前臨床中所用之一系列GI-4000產品(個別地標識為GI-4014、GI-4015、GI-4016及GI-4020)中由基於酵母之免疫治療組合物表現之每一融合蛋白的胺基酸序列通常自N-端至C-端具有以下總體結構:(1)兩個胺基酸N-端肽序列(M-V)、(2)對應於具有對應於天然Ras蛋白質之位置61之單一胺基酸取代的Ras之位置56-67之胺基酸序列,及(3)對應於具有分別對應於天然Ras蛋白質之位置12及61之兩個單一胺基酸取代之Ras之位置2-165的胺基酸序列。每一融合蛋白中三個胺基酸取代之特定組合使一種融合蛋白與另一種區別開來。靶向突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法產品內之其他結構及免疫原性結構域之組織係可能的,且詳細闡述於(例如)美國專利第7,465,454號中。
核苷酸及編碼GI-4014之構造體的經翻譯胺基酸序列分別由SEQ ID No:1及2代表。GI-4014包含以下Ras突變:Q61L-G12V-Q61R。核苷酸及編碼GI-4015之構造體的經翻譯胺基酸序列分別由SEQ ID No:3及4代表。GI-4015包含以下Ras突變:Q61L-G12C-Q61R。核苷酸及編碼GI-4016之構造體的經翻譯胺基酸序列分別由SEQ ID No:5及6代表。GI-4016包含以下Ras突變:Q61L-G12D-Q61R。核苷酸及編碼GI-4020之構造體的經翻譯胺基酸序列分別由SEQ ID No:7及8代表。GI-4020包含以下Ras突變:Q61L-G12R-Q61H。
本發明亦包括上述Ras抗原中之任一者的同系物之用途。在一個態樣中,本發明包括Ras抗原之用途,該Ras抗原之胺基酸序列在蛋白
質或融合蛋白之全長內或相對於融合蛋白之定義片段或形成融合蛋白一部分之定義蛋白質或其結構域(免疫原性結構域或功能結構域(即,具有至少一種生物活性之結構域))與本文所述之任一Ras抗原的胺基酸序列(包括由本文之特定序列識別符代表的任何Ras抗原)至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。除非另有說明,否則如本文所用,提及百分數(%)一致性係指同源性之評估,其使用以下執行:(1)BLAST 2.0 Basic BLAST同源性搜尋,其利用標準預設參數使用針對胺基酸搜尋之blastp及針對胺基酸搜尋之blastn,其中查詢序列藉由預設值針對低複雜性區域過濾(闡述於Altschul,S.F.、Madden,T.L.、Schääffer,A.A.、Zhang,J.、Zhang,Z.、Miller,W.及Lipman,D.J.(1997)「Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs.」Nucleic Acids Res.25:3389-3402中,其以整體引用的方式併入本文中);(2)BLAST 2對準(使用下文所闡述之參數);(3)及/或利用標準預設參數之PSI-BLAST(位置特異性反覆BLAST(Position-Specific Iterated BLAST))。
在本發明中所用之任一基於酵母之免疫療法組合物中,涉及酵母媒介之以下態樣包括於本發明中。根據本發明,酵母媒介係任一酵母細胞(例如,整體或完整細胞)或其衍生物(參見下文),其可組合一或多種抗原、其免疫原性結構域或其表位在本發明可用之治療組合物中使用。因此酵母媒介可包括(但不限於)活的完整(整體)酵母微生物(即,具有其所有組份(包括細胞壁)之酵母細胞)、被殺死(死亡)或不活化完整酵母微生物或完整/整體酵母之衍生物,其包括:酵母球形質體(即,缺少細胞壁之酵母細胞)、酵母胞質體(即,缺少細胞壁及細胞核之酵母細胞)、酵母殘骸(即,缺少細胞壁、細胞核及細胞質之酵母細胞)、子細胞酵母膜提取物或其部分(亦稱為酵母膜粒子且先前稱
為子細胞酵母粒子)、任何其他酵母粒子或酵母細胞壁製備物。該等酵母媒介詳細闡述於(例如)美國專利第5,830,463號、美國專利第7,083,787號及美國專利第7,736,642號中,其揭示內容以引用的方式併入本文中。
任一酵母菌株均可用於產生用於本發明之基於酵母之免疫療法產品。可用於本發明之酵母菌株屬包括(但不限於)酵母屬、念珠菌屬(Candida)、隱球菌屬(Cryptococcus)、漢遜氏酵母菌屬(Hansenula)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母菌屬(Pichia)、紅酵母菌屬(Rhodotorula)、裂殖酵母菌屬(Schizosaccharomyces)及耶氏酵母(Yarrowia)。可用於本發明之酵母菌株種包括(但不限於)啤酒酵母菌、卡爾酵母菌(Saccharomyces carlsbergensis)、白色念珠菌(Candida albicans)、乳酒念珠菌(Candida kefyr)、熱帶念珠菌(Candida tropicalis)、羅倫特隱球菌(Cryptococcus laurentii)、新型隱球酵母菌(Cryptococcus neoformans)、異常漢遜氏酵母菌(Hansenula anomala)、多形漢遜氏酵母菌(Hansenula polymorpha)、脆壁克魯維酵母菌(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis)、馬克斯克魯維酵母菌乳酸變種(Kluyveromyces marxianus var.lactis)、巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、深紅酵母菌(Rhodotorula rubra)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)及解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)。應瞭解,許多該等種包括意欲包括在以上種內之各種亞種、型、亞型等。
產生可用於本發明之基於酵母之免疫療法產品之方法先期已闡述於(例如)美國專利第5,830,463號、美國專利第7,083,787號及美國專利第7,736,642號,其揭示內容以引用的方式併入本文中。通常,可用於本發明之基於酵母之免疫療法產品已經殺死或不活化。將酵母殺死或使其不活化可藉由此項技術中已知之各種適宜方法中之任一者完
成。舉例而言,酵母之熱不活化係不活化酵母之標準途徑,且熟悉此項技術者可(若期望)藉由此項技術中已知之標準方法監測靶抗原之結構變化。另一選擇為,可使用其他使酵母不活化之方法,例如化學、電、放射或UV方法。
酵母媒介可使用熟悉此項技術者已知之許多技術調配成本發明之基於酵母之免疫療法組合物或產品(包括欲投與受試者之製劑)。舉例而言,酵母媒介可藉由凍乾來乾燥。包含酵母媒介之調配物亦可藉由將酵母裝填成餅狀物或片狀物來製備,例如針對在烘焙或釀造操作中所用之酵母所實施者。此外,酵母媒介可與醫藥上可接受之賦形劑混合,例如宿主或宿主細胞容忍之等滲緩衝液。該等賦形劑之實例包括水、鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、葡萄糖溶液、漢克氏溶液(Hank's solution)及其他生理平衡鹽水溶液。亦可使用非水性媒劑,例如固定油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酸酯。其他有用調配物包括含有黏度增強劑(例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、甘油或葡萄糖)之懸浮液。賦形劑亦可含有少量添加劑,例如增強等滲性及化學穩定性之物質。標準調配物可為液體可注射劑或可吸收於適宜液體中呈用於注射之懸浮液或溶液之固體。因此,在非液體調配物中,賦形劑可包含(例如)葡萄糖、人類血清白蛋白及/或防腐劑,其可在投與之前添加無菌水或鹽水。組合物應經調配以適於投與人類受試者(例如,製造條件應適用於人類,且用於完成組合物及/或製備用於投與免疫治療之劑量的任何賦形劑或調配物應適用於人類)。在本發明之一個態樣中,基於酵母之免疫治療組合物經調配用於藉由藉由(例如)非經腸途徑投與注射病人或受試者(例如,藉由皮下、腹膜內、肌肉內或皮內注射或另一適宜非經腸途徑)。
治療方法包括將基於酵母之免疫治療組合物遞送(投與、免疫)給受試者或個體。投與過程可在擬體內或活體內執行,但通常在活體內執行。基於酵母之免疫療法組合物之投與可係全身性的、黏膜及/或
接近靶位點之位置(例如,靠近腫瘤之位點)。適宜投與途徑將為熟悉此項技術者顯而易見,此取決於欲預防或治療之癌症類型及/或靶細胞群體或組織。投與之各種可接受方法包括(但不限於)靜脈內投與、腹膜內投與、肌肉內投與、結節內投與、冠狀動脈內投與、動脈內投與(例如,至頸動脈)、皮下投與、經皮遞送、氣管內投與、關節內投與、心室內投與、吸入(例如,氣溶膠)、顱內、脊柱內、眼內、耳內、鼻內、經口、肺投與、導管浸潤及直接注射於組織中。在一個態樣中,投與途徑包括:靜脈內、腹膜內、皮下、皮內、結節內、肌肉內、經皮、吸入、鼻內、經口、眼內、關節內、顱內及脊柱內。非經腸遞送可包括皮內、肌肉內、腹膜內、胸膜內、肺內、靜脈內、皮下、心房導管及靜脈導管途徑。耳內遞送可包括滴耳劑、鼻內遞送可包括滴鼻劑或鼻內注射,且眼內遞送可包括滴眼劑。氣溶膠(吸入)遞送亦可使用此項技術中之標準方法執行(參見,例如Stribling等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 189:11277-11281,1992)。在一個態樣中,本發明之基於酵母之免疫治療組合物係皮下投與。在一個態樣中,基於酵母之免疫治療組合物係直接投與至腫瘤環境中。
一般而言,基於酵母之免疫治療組合物之適宜單一劑量係當在適當時期內投與一或多次時,能夠以有效引起對抗一或多種癌症抗原或表位之抗原特異性免疫反應之量將酵母媒介及癌症抗原有效提供至病人體內之給定細胞類型、組織或區域之劑量。舉例而言,在一個實施例中,用於本發明之基於酵母之免疫治療之單一劑量係約1×105個至約5×107個酵母細胞當量/公斤投與組合物之有機體的體重。在一個態樣中,用於本發明之基於酵母之免疫治療之單一劑量係約0.1 Y.U.(1×106個細胞)至約100 Y.U.(1×109個細胞)/劑量(即,每一有機體)(包括任何臨時劑量),增量為0.1×106個細胞(即,1.1×106、1.2×106、1.3×106...)。如本文所用,術語「Y.U.」係「酵母單位」或「酵母細
胞當量」,其中1個Y.U.=10百萬個酵母細胞。在一個實施例中,劑量包括介於1 Y.U.與40 Y.U.之間之劑量、介於1 Y.U.與50 Y.U.之間之劑量、介於1 Y.U.與60 Y.U.之間之劑量、介於1 Y.U.與70 Y.U.之間之劑量或介於1 Y.U.與80 Y.U.之間之劑量,且在一個態樣中,介於10 Y.U.與40 Y.U.、50 Y.U.、60 Y.U.、70 Y.U.或80 Y.U之間。在一個實施例中,劑量係在個體之不同位點處但在同一投藥時期投與。舉例而言,40 Y.U.劑量可藉由在一個投藥時期將10 Y.U.劑量注射至個體之四個不同位點來投與,或20 Y.U.劑量可藉由在同一投藥時期將5 Y.U.劑量注射至個體之四個不同位點或藉由將10 Y.U.劑量注射至個體之兩個不同位點來投與。本發明包括在個體之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個不同位點處以一定量(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 Y.U.或更多)投與基於酵母之免疫療法組合物以形成單一劑量。
舉例而言,當針對抗原之免疫反應衰退或視需要提供免疫反應或誘導針對一或多種特定抗原之記憶反應時,投與基於酵母之免疫治療組合物之「強化劑(boosters、boosts)」。強化劑可在初始投與之後以約1、2、3、4、5、6、7或8週間隔至每月一次、每兩月一次、每季度一次、每年一次、若干年投與。在一個實施例中,投與時間表係在數週、數月、數年之時期內投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次單一劑量者。在一個實施例中,每週一次投與劑量達1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個劑量,隨後視需要每月劑量以達成期望治療結果。可投與其他劑量,即使病人之腫瘤復發或在病人被視為消退之後。
在一個態樣中,個體另外利用至少一種可用於治療癌症之其他治療化合物或治療方案(抗癌療法)治療。可用於治療癌症之額外試劑、組合物或方案(例如,治療方案)包括(但不限於)化學療法、腫瘤
之手術切除、放射療法、同種異體或自體幹細胞移植、細胞因子療法、繼承性T細胞移植,及/或投與第二免疫治療組合物(例如,額外基於酵母之免疫療法、基於重組病毒之免疫療法(病毒載體)、細胞因子療法、免疫刺激療法(包括具有免疫刺激性質之化學療法)、DNA疫苗及其他免疫療法組合物及/或靶向癌症療法(例如,特定靶向涉及腫瘤生長及進展之分子之小細胞藥物、生物製劑或單株抗體療法,包括(但不限於)選擇性雌激素受體調節劑(SERM)、芳香酶抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑、組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、類視色素受體活化劑、凋亡刺激劑、血管生成抑制劑、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑或免疫刺激劑)。該等額外治療劑及/或治療方案中之任一者可在本發明之免疫療法組合物之前、與其同時、與其交替或在其之後或在不同時間點投與。舉例而言,當與化學療法或靶向癌症療法組合給予個體時,可期望在化學療法或靶向癌症療法之劑量之間的「假期」期間投與基於酵母之免疫療法組合物,以最大化免疫療法組合物之功效。腫瘤之手術切除可能經常先於在投與基於酵母之免疫療法組合物,但在投與基於酵母之免疫療法組合物期間或之後可發生額外或初次手術。
舉例而言,在關於本文所述之本發明治療方法之任一實施例中,在一個態樣中,當個體患有癌症時,個體正利用或已經利用另一癌症療法治療。該療法可包括任一治療方案或使用本文先前所闡述之任一治療化合物或試劑,包括(但不限於)化學療法、放射療法、靶向癌症療法、腫瘤之手術切除、幹細胞移植、細胞因子療法、繼承性T細胞移植及/或投與第二免疫治療組合物。在投與第二免疫治療組合物之情形中,該等組合物可包括(但不限於)額外基於酵母之免疫療法、基於重組病毒之免疫療法(病毒載體)、免疫刺激療法(包括具有免疫刺激性質之化學療法)、DNA疫苗及其他免疫療法組合物。
如本文所用,「治療」癌症或其任一排列形式(例如,「癌症治療」等)通常係指一旦出現癌症(例如,一旦個體中已經診斷或偵測出癌症)即投與本發明之基於酵母之免疫療法組合物,其中治療之至少一個治療目標(與缺少此治療時相比)包括:減少腫瘤負荷、抑制腫瘤生長、增加個體之無復發存活、增加個體之總體存活、延遲、抑制、終止或防止轉移癌之發作或發展(例如藉由延遲、抑制、終止或防止除腫瘤遷移之發展之發作及/或原發性癌以外之組織之腫瘤浸潤及/或與癌症之轉移進展相關聯之其他過程)、延遲或終止癌症進展、改良針對腫瘤之免疫反應、改良針對腫瘤抗原之長期記憶免疫反應及/或改良個體之總體健康。「預防」或「保護」免於癌症或其任一排列形式(例如,「癌症預防」等)通常係指在出現癌症之前或在出現癌症之特定階段或癌症中之腫瘤抗原表現之前投與本發明之組合物,其中至少一個治療目標(與缺少此治療時相比)包括:預防或延遲癌症之發作或發展,或在治療之後可能發生癌症時,至少減小癌症之嚴重性(例如,減小腫瘤生長之等級、終止癌症進展、改良針對癌症之免疫反應、抑制轉移過程)或改良個體之結果(例如,改良無復發存活及/或總體存活)。
在本發明之治療方法中,基於酵母之免疫療法組合物及其他抗癌療法可投與任何動物,包括任何脊椎動物,且特定而言投與脊椎動物綱哺乳動物之任一成員,包括(但不限於)靈長類動物、齧齒類動物、家畜及家養寵物。「個體」係脊椎動物,例如哺乳動物,包括(但不限於)人類。術語「個體」可與術語「動物」、「受試者」或「病人」互換使用。
根據本發明,本文通用之術語「抗原」係指:蛋白質之任一部分(肽、部分蛋白質、全長蛋白質),其中蛋白質係天然存在或以合成方式衍生;細胞組合物(整個細胞、細胞溶解產物或破碎細胞)、有機
體(整個有機體、溶解產物或破碎細胞)或碳水化合物、或其他分子或其一部分。抗原可引發對抗免疫系統之元件(例如,T細胞、抗體)所遇到之相同或類似抗原之抗原特異性免疫反應(例如,體液及/或細胞介導之免疫反應)。
抗原可小至單一表位、單一免疫原性結構域或更大,且可包括多個表位或免疫原性結構域。同樣地,抗原之大小可小至約8-12個胺基酸(即,肽)且大至:全長蛋白、多聚體、融合蛋白、嵌合蛋白、整個細胞、整個微生物或其任一部分(例如,整個細胞之溶解產物或微生物之提取物)。此外,抗原可包括碳水化合物,其可加載於酵母媒介或本發明之組合物中。應瞭解,在一些實施例中(例如,當抗原係由來自重組核酸分子之酵母媒介表現時),抗原係蛋白質、融合蛋白、嵌合蛋白或其片段,而非整個細胞或微生物。
當抗原欲在酵母中表現時,抗原具有能夠在酵母中以重組方式表現之最下大小,且長度通常係至少或大於25個胺基酸,或長度至少或大於26個、至少或大於27個、至少或大於28個、至少或大於29個、至少或大於30個、至少或大於31個、至少或大於32個、至少或大於33個、至少或大於34個、至少或大於35個、至少或大於36個、至少或大於37個、至少或大於38個、至少或大於39個、至少或大於40個、至少或大於41個、至少或大於42個、至少或大於43個、至少或大於44個、至少或大於45個、至少或大於46個、至少或大於47個、至少或大於48個、至少或大於49個或至少或大於50個胺基酸,或長度至少25-50個胺基酸,長度至少30-50個胺基酸,或長度至少35-50個胺基酸,或長度至少40-50個胺基酸,或長度至少45-50個胺基酸。可表現更小的蛋白質,且可表現相當大的蛋白質(例如,長度為數百個胺基酸或甚至長度為幾千個胺基酸)。在一個態樣中,可表現全長蛋白質或其結構或功能結構域或其自N-端及/或C-端缺少一或多個胺基酸之免疫原性
結構域(例如,自N-端及/或C-端缺少約1個與約20個胺基酸之間)。融合蛋白及嵌合蛋白亦係本發明中可表現之抗原。「靶抗原」係本發明之免疫治療組合物特異性靶向之抗原(即,期望引起對抗其之免疫反應的抗原)。舉例而言,「Ras抗原」係自一或多種Ras蛋白質衍生、設計或產生之抗原,以便靶向該抗原亦靶向腫瘤所表現之相應Ras蛋白質。「突變Ras抗原」特定指含有一或多個胺基酸突變之Ras抗原。為用於本發明中,該等突變對應於在腫瘤之Ras蛋白質中發現之突變且與腫瘤之發展及/或腫瘤之進展相關聯。
當提及刺激免疫反應時,術語「免疫原」係術語「抗原」之子集合,且因此,在一些情況中可與術語「抗原」互換使用。如本文所用,免疫原闡述引起體液及/或細胞介導之免疫反應之抗原(即,係免疫原性的),以便將免疫原投與個體增強針對個體之免疫系統所遇到之相同或類似抗原之抗原特異性免疫反應。在一個實施例中,基於酵母之免疫療法組合物中所含之免疫原引起細胞介導之免疫反應,包括CD4+T細胞反應(例如,TH1、TH2及/或TH17)及/或CD8+ T細胞反應(例如,CTL反應)。
當投與動物時,給定抗原之「免疫原性結構域」可為含有至少一個作為免疫原之表位之抗原的任何部分、片段或表位(例如,肽片段或子單元或抗體表位或其他構象表位)。因此,免疫原性結構域大於單一胺基酸且具有至少足以含有至少一個可作為免疫原之表位之大小。舉例而言,單一蛋白質可含有多個不同免疫原性結構域。免疫原性結構域無需在蛋白質內為線性序列(例如在體液免疫反應之情形中),其中涵蓋構象結構域。
表位在本文中係定義為在免疫系統之適當共刺激信號及/或活化細胞之情況中,當提供至免疫系統時足以引發免疫反應之給定抗原內之單一免疫原性位點。換言之,表位係實際上由免疫系統之組件辨識
之抗原之一部分,且亦可稱為抗原決定位。熟悉此項技術者應認識到,T細胞表位之大小及組成不同於B細胞或抗體表位,且藉助I類MHC途徑呈現之表位之大小及結構屬性不同於藉助II類MHC途徑呈現之表位。舉例而言,由I類MHC分子呈現之T細胞表位之長度通常介於8個與11個胺基酸之間,而由II類MHC分子呈現之表位之長度限制較少且可為8個胺基酸至高達25個胺基酸或更長。此外,T細胞表位具有預測結構特性,此取決於表位所結合之特定MHC分子。表位可為線性序列表位或構象表位(保守結合區)。大多數抗體辨識構象表位。
儘管已詳細闡述本發明之各種實施例,但顯而易見熟悉此項技術者將構想出彼等實施例之修改及改變。然而,應明確瞭解該等修改及改變在本發明如隨附申請專利範圍中所闡述之範圍內。
<110> 美商拜歐迪希克斯公司
美商環球免疫公司
喬安娜 羅德
亨瑞奇
<120> 用於選擇及淘汰癌症病人接受免疫反應產生療法之質譜方法
<130> 12-621-PRO
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 537
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(537)
<400> 1
<210> 2
<211> 178
<212> PRT
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<223> 合成構建體
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<213> 人工
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<223> 合成構建體
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<221> CDS
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<400> 7
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<212> PRT
<213> 人工
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<223> 合成構建體
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Claims (75)
- 一種預測癌症病人是否可能受益於針對癌症之基於酵母之免疫反應產生療法單獨投與或另外投與另一抗癌療法之方法,其包含以下步驟:(a)獲得該病人之血液源樣本;(b)對該樣本實施質譜分析並自該樣本獲得質譜;(c)在程式化電腦中,對該質譜執行一或多個預定義之預處理步驟,在執行該等預處理步驟之後獲得在預定義之m/z範圍內該質譜中所選特徵之積分強度值,並將該等積分強度值與包含來自其他癌症病人之類別經標記光譜的訓練集合相比較並利用類別標記對該質譜進行分類;其中該類別標記預測該病人是否可能受益於該基於酵母之免疫反應產生療法單獨或另外加上其他抗癌療法。
- 如請求項1之方法,其中該基於酵母之免疫療法包含針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法。
- 如請求項3之方法,其中該針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法包含GI-4000或等效物。
- 如請求項3之方法,其中該用於突變Ras陽性癌療法之基於酵母之免疫療法係與吉西他濱(gemcitabine)或等效物組合投與該病人。
- 如請求項1之方法,其中該癌症病人包含胰臟癌病人。
- 如請求項2之方法,其中該癌症病人包含胰臟癌病人。
- 如請求項1之方法,其中該訓練集合包含來自受益於及不受益於該基於酵母之免疫反應產生療法或免疫療法單獨投與或與另一抗癌療法組合投與之其他癌症病人之類別經標記光譜。
- 如請求項1之方法,其中該等所選特徵包括一或多個列示於表1、2、3、4、5或6中之特徵。
- 一種預測癌症病人是否不可能受益於基於酵母之免疫反應產生療法單獨投與或與另一抗癌療法組合投與之方法,其包含以下步驟:(a)獲得該病人之血液源樣本;(b)對該樣本實施質譜分析並自該樣本獲得質譜;(c)在程式化電腦中,對該質譜執行一或多個預定義之預處理步驟,在執行該等預處理步驟之後獲得在預定義之m/z範圍內該質譜中所選特徵之積分強度值,並將該等積分強度值與包含來自其他癌症病人之類別經標記光譜的訓練集合相比較並利用類別標記對該質譜進行分類;其中該類別標記預測該病人是否不可能受益於該基於酵母之免疫反應產生療法單獨或另外加上另一抗癌療法。
- 如請求項9之方法,其中該針對癌症之基於酵母之免疫療法包含針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法。
- 如請求項10之方法,其中該針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法包含GI-4000或等效物。
- 如請求項10之方法,其中該病人經預測不可能受益於該用於突變Ras陽性癌療法之基於酵母之免疫療法與吉西他濱或等效物組合投與。
- 如請求項9之方法,其中該癌症病人包含胰臟癌病人。
- 如請求項9之方法,其中該訓練集合包含來自受益於及不受益於該免疫療法單獨投與或與另一抗癌療法組合投與之其他癌症病人之類別經標記光譜。
- 如請求項9之方法,其中該等所選特徵包含一或多個列示於表 1、2、3、4、5或6中之特徵。
- 一種用於預測癌症病人是否可能受益於基於酵母之免疫反應產生療法單獨投與或與另一抗癌療法組合投與之系統,其包含以下各項之組合:質譜儀,其自該癌症病人之血液源樣本產生質譜;機器可讀記憶體,其儲存來自其他癌症病人之類別經標記光譜的訓練集合,該訓練集合包括來自複數個不受益於該基於酵母之免疫反應產生療法單獨或與該另一抗癌療法之組合之病人的類別經標記光譜及來自複數個受益於該免疫反應產生療法單獨或與該另一抗癌藥劑之組合之病人之類別經標記光譜;及電腦系統,其經組態以對該質譜進行操作並使用該訓練集合對該質譜進行分類,針對該質譜產生類別標記,其中該類別標記預測該病人是否可能受益於該基於酵母之免疫反應產生療法單獨投與或與另一抗癌藥劑組合投與。
- 如請求項16之系統,其中該類別標記預測該病人是否可能受益於針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法之投與。
- 如請求項16之系統,其中該針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法包含GI-4000或等效物。
- 如請求項16之系統,其中該類別標記預測病人是否可能受益於將GI-4000及吉西他濱投與該病人。
- 如請求項16之系統,其中該癌症病人包含胰臟癌病人。
- 如請求項16之系統,其中該電腦經組態以獲得在包括表1、2、3、4、5或6中所列示該等特徵中之一或多者之m/z範圍中該光譜中之特徵的積分強度值。
- 一種用於預測癌症病人是否不可能受益於基於酵母之免疫反應產生療法單獨投與或與另一抗癌療法組合投與之系統,其包含 以下各項之組合:質譜儀,其自該癌症病人之血液源樣本產生質譜;機器可讀記憶體,其儲存來自其他癌症病人之類別經標記光譜的訓練集合,該訓練集合包括來自複數個不受益於該免疫反應產生療法單獨或與該另一抗癌療法之組合之病人的類別經標記光譜及來自複數個受益於該免疫反應產生療法單獨或與該另一抗癌藥劑組合之病人的類別經標記光譜;及電腦系統,其經組態以對該質譜進行操作並使用該訓練集合對該質譜進行分類,針對該質譜產生類別標記,其中該類別標記預測該病人是否不可能受益於基於酵母之免疫療法單獨或與另一抗癌藥劑之組合。
- 如請求項22之系統,其中該針對癌症之基於酵母之免疫療法包含針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法。
- 如請求項23之系統,其中該針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法包含GI-4000或等效物。
- 如請求項24之系統,其中該類別標記預測該病人是否不可能受益於GI-4000及吉西他濱之投與。
- 如請求項24之系統,其中該癌症病人包含胰臟癌病人。
- 如請求項22之系統,其中該電腦經組態以獲得在包括表1、2、3、4、5或6中所列示該等特徵中之一或多者之m/z範圍中該光譜中之特徵的積分強度值。
- 如請求項1之方法,其中該對該樣本實施質譜分析之步驟包含實施MALDI TOF質譜分析。
- 如請求項28之方法,其中該MALDI-TOF質譜分析包含實施該血液源樣本經受多於20,000次雷射射擊之深度MALDI質譜分析。
- 如請求項1之方法,其中該等預定義m/z區係自研究癌症病人之 血液源樣本之複數個質譜獲得,該等質譜中之每一者係藉由該等血液源樣本經受多於20,000次雷射射擊之深度MALDI質譜分析獲得。
- 如請求項16之系統,其中該質譜儀包含經組態以藉由使該血液源樣本經受多於20,000次雷射射擊獲得光譜之MALDI-TOF質譜儀。
- 一種非暫時性電腦可讀媒體,其儲存呈包含來自複數個癌症病人之類別經標記質譜用於分類器之訓練集合形式之數據,該訓練集合包括來自複數個不受益於基於酵母之免疫反應產生療法單獨或與另一抗癌療法之組合之癌症病人的類別經標記質譜及來自複數個受益於該基於酵母之免疫反應產生療法單獨或與該另一抗癌療法之組合之癌症病人的類別經標記質譜,該類別標記指示受益或非受益之狀態。
- 如請求項32之非暫時性電腦可讀媒體,其中該媒體儲存呈包含來自複數個癌症病人之類別經標記質譜用於分類器之訓練集合形式之數據,該訓練集合包括來自複數個不受益於針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法單獨或與該另一抗癌療法之組合之癌症病人的類別經標記質譜及來自複數個受益於該針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法單獨或與該另一抗癌療法之組合之癌症病人的類別經標記質譜,該類別標記指示受益或非受益之狀態。
- 如請求項33之媒體,其中該等類別標記指示該訓練集合中之該等病人受益或不受益於投與GI-4000與吉西他濱之組合。
- 如請求項32之媒體,其中該訓練集合中之該等癌症病人包含胰臟癌病人。
- 如請求項32之媒體,其中該媒體儲存呈分類器形式之程式碼用 於比較該訓練集合中包括一或多個列示於表1、2、3或4中之特徵之特徵與測試質譜,以藉此產生用於該測試質譜之類別標記。
- 一種用於對質譜分類之系統,其包含:如請求項32之非暫時性電腦可讀媒體,及通用電腦,其組態為分類器以使用如請求項32之訓練集合對癌症病人之光譜分類。
- 如請求項37之系統,其中該電腦實施K最近鄰分類器。
- 一種產生分類器用於在治療之前預測癌症病人是否可能受益於基於酵母之免疫反應產生療法單獨或與另一抗癌療法之組合之方法,其包含以下步驟:a)對在藉由該基於酵母之免疫反應產生療法單獨治療或與另一抗癌療法組合治療之後所獲得之許多病人樣本執行質譜分析並產生相應質譜集合;b)藉由將自其獲得步驟a)中之該等樣本的該等病人分成對應於該等病人是否受益於該治療之兩個群組產生用於分類器之訓練集合,並將類別標記指派給該等各別光譜(例如,「良好」/「差」、「快速」/「緩慢」);c)分析來自該兩個群組之該等光譜以識別該等光譜中該兩個群組中之該等病人所特有之可區別特徵;及d)藉由使用該等類別經標記光譜及步驟c)中所識別可區別特徵將分類演算法應用於來自投與該治療之其他病人的光譜的測試集合,測試該等可區別特徵預測病人受益於該治療之能力並評價該分類演算法之性能。
- 如請求項39之方法,其包含在該兩個群組之病人中使用光譜中的不同可區別特徵重複該等步驟b)、c)及d)。
- 如請求項39之方法,其中該分類演算法包含K-最近鄰演算法。
- 如請求項39之方法,其中該步驟a)之質譜分析包含MALDI-TOF質譜儀中之深度MALDI質譜分析,其中該樣本經受多於20,000次雷射射擊。
- 如請求項39之方法,其中該等可區別特徵包含一或多個列示於表1、2、3、4、5或6中之特徵。
- 如請求項39之方法,其進一步包含基於該訓練集合中該等光譜中之特徵執行該等光譜之部分離子流正規化。
- 如請求項39之方法,其中該等類別標記係藉由研究該訓練集合中該等病人之臨床數據來測定。
- 一種基於酵母之免疫療法在製造藥劑中之用途,該藥劑用於治療已藉由質譜分析及分類測試選擇之癌症病人的癌症,該測試包含以下步驟:(a)對來自該病人之血液源樣本實施質譜分析並自該樣本獲得質譜;(b)在程式化電腦中,對該質譜執行一或多個預定義之預處理步驟,在執行該等預處理步驟之後獲得在預定義之m/z範圍內該質譜中所選特徵之積分強度值,並將該等積分強度值與包含來自利用該基於酵母之免疫療法治療之其他癌症病人之類別經標記光譜的訓練集合相比較並利用類別標記對該質譜進行分類;且其中針對該質譜之該類別標記指示該病人可能受益於該針對癌症之基於酵母之免疫療法。
- 如請求項46之用途,其中一或多種額外抗癌療法係在利用該針對癌症之基於酵母之免疫療法治療之前、與其同時或之後投與。
- 如請求項47之用途,其中該等額外抗癌療法係選自:手術、化 學療法、放射療法、靶向癌症療法、安寧療護或其任一組合。
- 如請求項46之用途,其中該基於酵母之免疫療法係表現來自該病人之癌症的一或多種癌症抗原的完整熱不活化重組酵母。
- 如請求項49之用途,其中該酵母係來自啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。
- 如請求項46之用途,其中該病人患有突變Ras陽性癌且其中投與該病人針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法。
- 如請求項51之用途,其中一或多種額外抗癌療法係在利用該針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法治療之前、與其同時或之後投與。
- 如請求項52之用途,其中該等額外抗癌療法係選自:手術、化學療法、放射療法、靶向癌症療法、安寧療護或其任一組合。
- 如請求項51之用途,其中該突變Ras陽性癌係選自:胰臟癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌(CRC)、子宮內膜癌、卵巢癌、黑色素瘤或多發性骨髓瘤。
- 如請求項51之用途,其中該突變Ras陽性癌係胰臟癌。
- 如請求項51之用途,其中該針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法係表現突變Ras抗原之完整熱不活化重組酵母。
- 如請求項55之用途,其中該針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法係GI-4000系列基於酵母之免疫療法產品中之產品或等效物。
- 如請求項57之用途,其中該產品係選自GI-4014、GI-4015、GI-4016或GI-4020。
- 如請求項51之用途,其中該藥劑係與吉西他濱或等效物組合投與。
- 如請求項51之用途,其中該癌症病人之腫瘤已在利用該基於酵 母之免疫療法治療之前手術切除。
- 如請求項49之用途,其中該訓練集合包含來自受益於及不受益於該基於酵母之免疫療法單獨投與或與另一抗癌療法組合投與之其他癌症病人的類別經標記光譜。
- 如請求項49之用途,其中該等預定義特徵包括一或多個列示於表1、2、3、4、5或6中之特徵。
- 如請求項49之用途,其中對該樣本實施之該質譜分析包含實施MALDI-TOF質譜分析。
- 如請求項63之用途,其中該MALDI-TOF質譜分析包含實施該血液源樣本經受多於20,000次雷射射擊之深度MALDI質譜分析。
- 如請求項49之用途,其中該等預定義m/z區係自研究藉由深度MALDI質譜分析獲得之癌症病人之複數個質譜來獲得,其中該等癌症病人之血液源樣本經受多於20,000次雷射射擊。
- 一種基於酵母之免疫療法在製造用於治療癌症之方法中之藥劑中的用途,其中該方法包含:a)對來自癌症病人之血液源樣本實施質譜分析並自該樣本獲得質譜;b)在程式化電腦中,對該質譜執行一或多個預定義之預處理步驟,在執行該等預處理步驟之後獲得在預定義之m/z範圍內該質譜中所選特徵之積分強度值,並將該等積分強度值與包含來自利用該基於酵母之免疫療法治療之其他癌症病人之類別經標記光譜的訓練集合相比較並利用類別標記對該質譜進行分類;及c)當針對該質譜之該類別標記指示該病人可能受益於該針對癌症之基於酵母之免疫療法時,將該藥劑投與該癌症病人。
- 如請求項66之用途,其中該病人另外在利用該針對癌症之基於 酵母之免疫療法治療之前、與其同時或之後利用一或多種額外抗癌療法治療。
- 如請求項66之用途,其中該基於酵母之免疫療法係來自表現該病人之癌症的一或多種癌症抗原的啤酒酵母菌之完整熱不活化重組酵母。
- 如請求項66之用途,其中該病人患有突變Ras陽性癌且其中投與該病人針對突變Ras陽性癌之基於酵母之免疫療法。
- 如請求項69之用途,其中產品係選自GI-4014、GI-4015、GI-4016或GI-4020。
- 如請求項66之用途,其中該訓練集合包含來自受益於及不受益於該基於酵母之免疫療法單獨投與或與另一抗癌療法組合投與之其他癌症病人的類別經標記光譜。
- 如請求項66之用途,其中該等預定義特徵包括一或多個列示於表1、2、3、4、5或6中之特徵。
- 如請求項66之用途,其中對該樣本實施之該質譜分析包含實施MALDI-TOF質譜分析。
- 如請求項73之用途,其中該MALDI-TOF質譜分析包含實施該血液源樣本經受多於20,000次雷射射擊之多次射擊質譜分析。
- 如請求項66之用途,其中該等預定義m/z區係自研究藉由多次射擊質譜分析獲得之癌症病人之複數個質譜來獲得,其中該等癌症病人之血液源樣本經受多於20,000次雷射射擊。
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