JP6962273B2 - 内在性ペプチド同定用スペクトルライブラリ作成方法、内在性ペプチド同定方法、及び内在性ペプチド同定装置 - Google Patents

Description

本発明は、生体内で産生される内在性ペプチドを質量分析を利用して同定する際に使用されるスペクトルライブラリの作成方法、内在性ペプチドを質量分析を利用して同定する同定方法、及び同定装置に関する。

生体内でタンパク質が分解酵素により切断されて産生されたペプチドは一般に、内在性ペプチドと呼ばれる。内在性ペプチドの中で生理機能を有するペプチドは生理活性ペプチドと呼ばれ、その産生や代謝は生体内で厳密に制御されている。一方、活性を持たない内在性ペプチドであっても、その産生量の変化と疾患との関連が示唆されるものが少なくない。そのため、例えば、特定の細胞や組織において特異的に産生され、血液や尿等の体液中に分泌又は排出される内在性ペプチドは、非侵襲性の各種診断マーカーとして有用である。

内在性ペプチドの産生には様々な分解酵素が関わっているため、通常、一種類の前駆体タンパク質からアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列を単に「配列」という場合がある）が異なる複数のペプチドバリアント（以下、単にバリアントという場合がある）が産生される。切断部位となるアミノ酸残基がわずか１残基の相違でしかない場合であっても、こうしたバリアントを厳密に区別して検出する手法として、質量分析法は非常に優れた方法であり、昨今、広く用いられるようになってきている。

一般に、質量分析を利用してペプチドを同定する際には、プロテオーム解析において広く使用されているタンパク質同定法であるタンパク質配列データベース検索法（非特許文献１参照、以下、単にデータベース検索法という）や、スペクトル検索法（非特許文献２参照）などが用いられることが多い。

データベース検索法は現在ペプチド同定に最も広く使用されている方法であり、そのための代表的なソフトウェアとして、マトリクスサイエンス（Matrix Science）社が提供している検索エンジンであるマスコット（Mascot）に含まれるＭＳ／ＭＳイオンサーチ（非特許文献１参照）がよく知られている。データベース検索法では、測定対象のタンパク質又はペプチドを含む試料に対して酵素消化を行うことによって該タンパク質又はペプチドを断片化し、得られた断片ペプチドの混合物に対しＭＳ／ＭＳ（＝ＭＳ²）測定を行ってＭＳ²スペクトルを取得する。そして、タンパク質配列データベースに収録されている様々なタンパク質を同じ酵素で消化して得られる仮想ペプチドの理論的なＭＳ²スペクトルデータを計算し、算出された理論ＭＳ²スペクトルと実測によるＭＳ²スペクトルとを照合することにより、目的とするタンパク質やペプチドのアミノ酸配列を推定しそれらを同定する。

しかしながら、上述したように、内在性ペプチドでは様々な分解酵素が分解に関与するために分解様式がかなり多様であり、酵素によるアミノ酸配列上の切断部位も絞りにくい。そのため、内在性ペプチドのバリアントをデータベース検索法により同定するには、前駆体タンパク質のアミノ酸配列におけるありとあらゆる部位での切断を想定してタンパク質配列データベースについての検索を行う必要がある。そうすると、データベース検索における探索空間がプロテオーム解析の場合の１０００倍近くまで拡がってしまう。そのため、検索に時間を要するだけではなく、統計的に有意なペプチド候補が得られにくくなるため、実測のＭＳ²スペクトルの品質が良好であったとしてもプロテオーム解析と比べると同定感度がかなり低いものとなるおそれがある。

一方、スペクトル検索法では、試料に対して得られた実測のＭＳ²スペクトルをスペクトルライブラリに収録されているＭＳ²スペクトルデータと照合し、複数のピークの質量電荷比m/zの一致性などを判断してアミノ酸配列を推定することにより、目的のペプチドを同定する。この場合、検索対象はスペクトルライブラリに予め収録されているＭＳ²スペクトルに限られるため、データベース検索法のように探索空間が膨大になるおそれはない。また、実測データとスペクトルライブラリ上のデータとの間で、プロダクトイオンの強度プロファイルの類似度を同定の確からしさの指標値であるスコアに反映することができ、そのスコアの精度を高めることができるという特徴がある。

しかしながら、一般的なスペクトル検索法では、実測によるＭＳ²スペクトルとスペクトルライブラリに収録済みであるＭＳ²スペクトルとでしかプロダクトイオンの強度プロファイルの照合が行われないので、データベース検索法と比べると検索の網羅性が劣ることが避けられない。また、同じタンパク質由来であって切断部位は異なるものの部分配列が共通するペプチドに関するＭＳ²スペクトルについて、スペクトルライブラリに収録されているＭＳ²スペクトルに対する適切な処理を行わずにプロダクトイオンの強度プロファイルの照合を行なうと、切断部位の相違等に起因する該強度プロファイルの不一致のために十分な検索性能が得られない。また、同一のペプチドであってもプリカーサイオンの価数の相違等によってプロダクトイオンの強度プロファイルが著しく変動するような場合には、やはり期待されるような検索性能が得られない。

国際公開第２０１７／０４７５８０号公報

「マトリクス・サイエンス−マスコット−ＭＳ／ＭＳ・イオンズ・サーチ（Matrix Science -Mascot- MS/MS Ions Search）」、[online]、マトリクス・サイエンス社（Matrix Science Ltd.）、［平成３０年４月５日検索］、インターネット＜URL: http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=MIS ＞ ステフェン（Stephen E. Stein）、ほか１名、「オプティマイゼイション・アンド・テスティング・オブ・マス・スペクトラル・ライブラリ・サーチ・アルゴリズムス・フォー・コンパウンド・アイデンティフィケイション（Optimization and Testing of Mass Spectral Library Search Algorithms for Compound Identification）」 ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ソサイエティ・マス・スペクトロメトリ（JASMS）、Vol.5、1994年、pp.859-866 村瀬雅樹、ほか６名、「新規内在性ペプチド同定ソフトウエアの尿試料への適用」、日本プロテオーム学会2016年大会（(JHUPO第14回大会)、2P-07

上述したように、内在性ペプチドには生理機能の上で重要な働きを有するものもあるため、試料中の未知の内在性ペプチドを同定しその構造を解析することは医療、製薬、生理学などの分野において非常に重要である。また、生理機能を持たないペプチドであっても、特定の疾病の罹患等によってその構造や産生量が特異的に変化するものはバイオマーカーとして有用であるため、その構造や産生量が変化していないかどうか等を把握することは疾病の診断や治療を行ううえで重要である。しかしながら、質量分析を利用した内在性ペプチドの同定手法は現在まで確立されているとはいえない。

本発明はこうした課題に鑑みて成されたものであり、その一つの目的は、既知のマススペクトルが収録されているスペクトルライブラリを参照するスペクトル検索法を利用して内在性ペプチドの同定を行う際に、ペプチドの同定数つまりは同定感度を向上させることができる内在性ペプチド同定方法及び同定装置を提供することである。

また本発明の他の目的は、そうしたスペクトル検索法により内在性ペプチドを同定する際に好適なスペクトルライブラリを作成することができる内在性ペプチド同定用スペクトルライブラリ作成方法を提供することである。

上記一つの課題を解決するために成された本発明に係る内在性ペプチド同定用スペクトルライブラリ作成方法は、試料中の内在性ペプチドのアミノ酸配列を質量分析を利用したスペクトル検索法により推定して該ペプチドを同定する際に参照されるスペクトルライブラリを作成する内在性ペプチド同定用スペクトルライブラリ作成方法であって、
a)アミノ酸配列が未知である又は既知であるライブラリ作成用内在性ペプチドを含む試料に対しＭＳ¹測定を実行しＭＳ¹スペクトルを取得するＭＳ¹測定実行ステップと、
b)前記ライブラリ作成用内在性ペプチドを含む試料に対し、後記プリカーサイオン選定ステップで選定されたプリカーサイオンについてのＭＳ²（＝ＭＳ／ＭＳ）測定を実行しＭＳ²スペクトルを取得するＭＳ²測定実行ステップと、
c)前記ＭＳ²測定実行ステップで得られた実測ＭＳ²スペクトルに対して網羅的なペプチド同定手法による同定処理を実施することにより、前記ライブラリ作成用内在性ペプチドのアミノ酸配列を同定する又は確認するペプチド同定ステップと、
d)前記ペプチド同定ステップにおいてアミノ酸配列の同定が可能であった又はアミノ酸配列が正当であることが確認されたときに、同一ペプチド由来のＭＳ²スペクトルの中から同定信頼度の高さ若しくは同定時に帰属されたピークの品質の高さを示す指標値に基づいて、相対的に若しくは絶対的に品質が高いＭＳ²スペクトルを選別して、又は、相対的に若しくは絶対的に品質が高い複数のＭＳ²スペクトルを結合し合成することで、品質を向上させた新たなＭＳ²スペクトルを作成し、該選別した又は作成したＭＳ²スペクトルに基づく情報をスペクトルライブラリに登録するライブラリ登録ステップと、
e)前記ライブラリ作成用内在性ペプチドについてのＭＳ¹スペクトルに基づいてＭＳ²測定でターゲットとするプリカーサイオンを選定するものであって、前記ライブラリ登録ステップにおいて、既に実施されたＭＳ²測定で得られたＭＳ²スペクトルの品質が相対的に若しくは絶対的に低いと判定された場合、又は、同定の結果、帰属されたプロダクトイオンが少なく部分構造情報量が少ないと判定された場合に、前記ＭＳ²測定実行ステップによるＭＳ²測定を再度実施するためのプリカーサイオンを新たに選定するプリカーサイオン選定ステップと、
を有することを特徴としている。

また本発明に係る第１の態様に係る内在性ペプチド同定装置は、上記発明に係る内在性ペプチド同定用スペクトルライブラリ作成方法を実施する装置であり、試料中の内在性ペプチドのアミノ酸配列をスペクトル検索法により推定して該ペプチドを同定する内在性ペプチド同定装置であって、
a)スペクトル検索法によるペプチド同定時に参照される、アミノ酸配列が既知である内在性ペプチドのＭＳ²スペクトルが収録されているスペクトルライブラリと、
b)ＭＳ¹測定及びＭＳ²測定が可能である質量分析部と、
c)アミノ酸配列が未知である又は既知であるライブラリ作成用内在性ペプチドを含む試料に対しＭＳ¹測定を実行してＭＳ¹スペクトルを取得するように前記質量分析部を制御するＭＳ¹測定実行制御部と、
d)前記ライブラリ作成用内在性ペプチドを含む試料に対し、後記プリカーサイオン選定部により選定されたプリカーサイオンをターゲットとするＭＳ²測定を実行しＭＳ²スペクトルを取得するように前記質量分析部を制御するＭＳ²測定実行制御部と、
e)前記ＭＳ²測定実行制御部の制御の下で得られた実測ＭＳ²スペクトルに対して網羅的なペプチド同定手法による同定処理を実施することにより、前記ライブラリ作成用内在性ペプチドのアミノ酸配列を同定する又は確認するペプチド同定部と、
f)前記ペプチド同定部によりアミノ酸配列の同定が可能であった又はアミノ酸配列が正当であることが確認されたときに、同一ペプチド由来のＭＳ²スペクトルの中から同定信頼度の高さ若しくは同定時に帰属されたピークの品質の高さを示す指標値に基づいて相対的に若しくは絶対的に品質が高いＭＳ²スペクトルを選別して、又は、相対的に若しくは絶対的に品質が高い複数のＭＳ²スペクトルを結合し合成することで、品質を向上させた新たなＭＳ²スペクトルを作成し、該選別した又は作成したＭＳ²スペクトルに基づく情報を前記スペクトルライブラリに登録するライブラリ登録部と、
g)前記ライブラリ作成用内在性ペプチドについてのＭＳ¹スペクトルに基づいてＭＳ²測定でターゲットとするプリカーサイオンを選定するものであって、前記ライブラリ登録部において、既に実施されたＭＳ²測定で得られたＭＳ²スペクトルの品質が相対的に若しくは絶対的に低いと判定された場合、又は、同定の結果、帰属されたプロダクトイオンが少なく部分構造情報量が少ないと判定された場合に、前記ＭＳ²測定実行制御部による制御の下でＭＳ²測定を再度実施するためのプリカーサイオンを新たに選定するプリカーサイオン選定部と、
を備えることを特徴としている。

上記ライブラリ作成用内在性ペプチドはアミノ酸配列が既知であっても未知であってもよい。アミノ酸配列が未知である場合、ペプチド同定ステップでは、実測ＭＳ²スペクトルに対して網羅的なペプチド同定手法による同定処理を実施することにより、ライブラリ作成用内在性ペプチドのアミノ酸配列が同定される。一方、アミノ酸配列が既知である場合には、ペプチド同定ステップでは、上記同定処理のほかに、実測ＭＳ²スペクトルから検出されたピーク強度やＳＮ比などを基準として選定された主要ピークと、既知のペプチドから生成されると推定されるプロダクトイオンとの一致度に基づいて、推定されたアミノ酸配列が正当かどうかの確認が行われてもよい。

また本発明においてＭＳ¹測定やＭＳ²測定の際には、ＭＳ²測定が可能である種々の方式の質量分析装置を利用することができる。例えば、タンデム飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ／ＴＯＦＭＳ）、四重極飛行時間型質量分析装置（ｑ−ＴＯＦＭＳ）、イオントラップ飛行時間型質量分析装置（ＩＴ−ＴＯＦＭＳ）、イオントラップ型質量分析装置（ＩＴ−ＭＳ）、リニアイオントラップ型質量分析装置（ＬＩＴ−ＭＳ）などを利用することが可能である。また、１台の質量分析装置においてＭＳ¹測定とＭＳ²測定とを実施しなくてもよく、例えばＭＳ¹測定はＭＳ²測定ができないタイプの質量分析装置、例えば飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦＭＳ）等で行い、ＭＳ²測定はＭＳ²測定が可能である上記のような各種の質量分析装置を用いて実施しても構わない。

上記第１の態様の内在性ペプチド同定装置により実施される本発明に係る内在性ペプチド同定用スペクトルライブラリ作成方法において、プリカーサイオン選定ステップでは、実測のＭＳ¹スペクトルに基づいて、ＭＳ²測定でターゲットとされるプリカーサイオンが選定される。未知試料では、プリカーサイオン強度や質量電荷比を基準として、一度の測定でより多くの同定可能なスペクトルが得られるようにプリカーサイオンが選定される。一方、既知試料の場合には、既知ペプチドの一覧の中から適宜のプリカーサイオンが選定される。ただし、既に或るプリカーサイオンについてＭＳ²測定が実施されており、そのＭＳ²測定により取得された実測のＭＳ²スペクトルの品質が相対的に又は絶対的に低いと判定されている場合には、そのＭＳ²測定におけるプリカーサイオンとは別のプリカーサイオンが再ＭＳ²測定のターゲットとして選定される。

プリカーサ選定ステップにおいて、ＭＳ²測定を再度実施するためのプリカーサイオンを新たに選定する際には、同定信頼度の高さ、又は同定時に帰属された複数のプロダクトイオンの強度の総和やＳＮ比の総和などを指標として品質の高さを判定すればよい。ここで所定の判定閾値に満たない低品質のＭＳ ² スペクトルしか得られていなかった場合には、データの積算回数を初回のＭＳ ² 測定時よりも増やすなどの測定条件を変更するとよい。一方、帰属された系列イオンの種類によりイオン生成量に著しく偏りがある場合には、部分構造情報量が不足していると判定してもよい。例えば、ｙ系列イオンとｂ系列イオンについて、それぞれのプロダクトイオンの強度の総和やＳＮ比の総和の比が１：１０などの所定の閾値以上に偏っている場合などには、部分構造情報量が不足しているとみなして構わない。

このように部分構造情報量が不足している場合には、再測定するプリカーサイオンを選択するために、プリカーサイオンの価数と、同定された又は正当であることが確認されたライブラリ作成用内在性ペプチドのアミノ酸組成と、の少なくともいずれかを利用するとよい。即ち、同じアミノ酸配列であってもプリカーサイオンの価数が異なると開裂の態様が相違するし、また、アミノ酸配列中に塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンなど）が存在するときにはその個数とプリカーサイオンの価数との関係によって開裂の態様が相違する。具体的には、プリカーサイオンの価数が塩基性アミノ酸の個数以下であると、アミノ酸配列上でプロダクトイオンの生成に偏りが生じて検出可能なプロダクトイオン数が減少し、ＭＳ²スペクトルの品質が低くなる傾向にある。そのような場合には、プリカーサイオンの価数が塩基性アミノ酸の個数よりも大きくなるようにプリカーサイオンを選定するとよい。

ＭＳ²測定実行ステップでは上述のように選定されたプリカーサイオンをターゲットとするＭＳ²測定を実行してＭＳ²スペクトルを取得する。ペプチド同定ステップでは、得られた実測ＭＳ²スペクトルに対して網羅的なペプチド同定手法による同定処理を実施することにより、ライブラリ作成用内在性ペプチドのアミノ酸配列を同定する又は確認する。この網羅的なペプチド同定手法とは典型的にはタンパク質データベースを用いたデータベース検索法である。一例として、特許文献１及び非特許文献３に記載されている既存の内在性ペプチド同定用配列データベース検索ソフトウェアを利用することができる。網羅的なペプチド同定手法を用いることにより、同じ前駆体タンパク質由来の多様なペプチドバリアントも同定することができる。

ライブラリ登録ステップでは、アミノ酸配列の同定が可能であった又はアミノ酸配列が正当であることが確認された場合に、そのライブラリ作成用内在性ペプチドについてのＭＳ²スペクトルにおいて観測されるプロダクトイオンの系列を確認し、ペアであるイオン系列（例えばｙ系列とｂ系列）のイオンが偏りなく検出されているか否かを判定することでＭＳ²スペクトルの品質を評価する。そして、同一ペプチド由来の複数のＭＳ²スペクトルの中から相対的に又は絶対的に品質が高いＭＳ²スペクトルを選別するか、或いは、相対的に又は絶対的に品質が高い複数のＭＳ²スペクトルを結合し合成することで新たなＭＳ²スペクトルを作成する。同一ペプチドから質量電荷比が相違する複数の異なるＭＳ ² スペクトルが得られた場合には、各ＭＳ ² スペクトルから検出されたプロダクトイオンの同位体分布に対してデコンボリューションの手法を適用し、各ＭＳ ² スペクトルから同一の質量電荷比を持つプロダクトイオンの質量を算出して作成したピークリストを結合してもよい。そして、その選別した又は作成したＭＳ²スペクトルから得られるピークの質量電荷比などのスペクトル情報をアミノ酸配列の情報と共にスペクトルライブラリに登録する。

このようにして本発明に係る内在性ペプチド同定用スペクトルライブラリ作成方法では、網羅的なペプチド同定手法で同定されたペプチドバリアントについての高い品質のＭＳ²スペクトルを収録したスペクトルライブラリを構築することができる。また、同一のペプチドについてプリカーサイオンの価数の相違などに起因して開裂様式が異なるプロダクトイオンの強度プロファイルを示すＭＳ²スペクトルを、スペクトルライブラリに収録することもできる。

また上記一つの課題を解決するために成された本発明に係る内在性ペプチド同定方法は、試料中の内在性ペプチドのアミノ酸配列を質量分析を利用したスペクトル検索法により推定して該ペプチドを同定する内在性ペプチド同定方法であって、
a)目的の内在性ペプチドを含む試料に対しＭＳ²測定を実行してＭＳ²スペクトルを取得するＭＳ²測定実行ステップと、
b)前記ＭＳ²測定実行ステップで得られた実測ＭＳ²スペクトルについてスペクトルライブラリを用いたスペクトル検索を行うことでペプチドを推定するものであって
b1)スペクトルライブラリに収録されているＭＳ²スペクトルに対応するプリカーサイオンのアミノ酸配列のＮ末端側及びＣ末端側の一若しくは複数のアミノ酸残基を除去する又は一若しくは複数のアミノ酸残基を付加しつつ、ＭＳ²測定のターゲットであるプリカーサイオンの質量電荷比と一致するものを探索することで、ペプチドバリアントのアミノ酸配列を推定するバリアント配列推定ステップと、
b2)前記バリアント配列推定ステップによるペプチドバリアントのアミノ酸配列推定に利用された元のＭＳ²スペクトルに基づいて、該ペプチドバリアントに対応するＭＳ²スペクトルを生成するスペクトル生成ステップと、
b3)前記スペクトル生成ステップにおいて得られたＭＳ²スペクトルと前記実測ＭＳ²スペクトルとを照合して類似度を求め、該類似度に基づいて前記ペプチドバリアントのアミノ酸配列を推定する類似度算出ステップと、
を有することを特徴としている。

また本発明に係る第２の態様に係る内在性ペプチド同定装置は、上記発明に係る内在性ペプチド同定方法を実施する装置であり、試料中の内在性ペプチドのアミノ酸配列をスペクトル検索法により推定して該ペプチドを同定する内在性ペプチド同定装置であって、
a)前記スペクトル検索法に利用される既知の内在性ペプチドのＭＳ²スペクトルが収録されているスペクトルライブラリと、
b)ＭＳ²測定が可能である質量分析部と、
c)目的とする内在性ペプチドを含む試料に対してＭＳ²測定を実施してＭＳ²スペクトルを取得するように前記質量分析部を制御するＭＳ²測定実行制御部と、
d)前記ＭＳ²測定実行制御部の制御の下で得られた実測ＭＳ²スペクトルについてスペクトルライブラリを用いたスペクトル検索を行うことでペプチドを推定するものであって
d1)スペクトルライブラリに収録されているＭＳ²スペクトルに対応するプリカーサイオンのアミノ酸配列のＮ末端側及びＣ末端側の一若しくは複数のアミノ酸残基を除去する又は一若しくは複数のアミノ酸残基を付加しつつ、ＭＳ²測定のターゲットであるプリカーサイオンの質量電荷比と一致するものを探索することで、ペプチドバリアントのアミノ酸配列を推定するバリアント配列推定部と、
d2)前記バリアント配列推定部によるペプチドバリアントのアミノ酸配列推定に利用された元のＭＳ²スペクトルに基づいて、該ペプチドバリアントに対応するＭＳ²スペクトルを生成するスペクトル生成部と、
d3)前記スペクトル生成部において得られたＭＳ²スペクトルと前記実測ＭＳ²スペクトルとを照合して類似度を求め、該類似度に基づいて前記ペプチドバリアントのアミノ酸配列を推定する類似度算出部と、
を備えることを特徴としている。

上記第２の態様に係る内在性ペプチド同定装置により実施される本発明に係る内在性ペプチド同定方法において、ＭＳ²測定実行ステップでは、目的とする未知の内在性ペプチドを含む試料に対してＭＳ²測定を実行してＭＳ²スペクトルを取得する。一般的なスペクトル検索法では、この実測ＭＳ²スペクトルをスペクトルライブラリに収録されているＭＳ²スペクトルと直接的に照合することでペプチドの同定を試みるが、ここでは、まずバリアント配列推定ステップにおいてペプチドバリアントのアミノ酸配列が推定される。即ち、スペクトルライブラリに収録されている各ＭＳ²スペクトルについて、ＭＳ²スペクトルに対応するプリカーサイオンのアミノ酸配列のＮ末端側及びＣ末端側の一若しくは複数のアミノ酸残基を除去する又は一若しくは複数のアミノ酸残基を付加しつつ、ＭＳ²測定のターゲットであるプリカーサイオンの質量電荷比と一致するものの探索が試みられる。そして、プリカーサイオンの質量電荷比と一致する（質量差が所定範囲内である）ものが見つかったならば、それがペプチドバリアントのアミノ酸配列であると推定する。

次いで、スペクトル生成ステップでは、見いだされたペプチドバリアントのアミノ酸配列推定に利用された元のＭＳ²スペクトルに基づいて、上記のアミノ酸残基の付加や除去に対応した質量を各ピークの質量電荷比に加算したり減算したりすることで、ペプチドバリアントに対応するＭＳ²スペクトルを生成する。ここで生成されるＭＳ²スペクトルはＮ末端側断片のＭＳ²スペクトルとＣ末端側断片のＭＳ²スペクトルに相当するものである。そして、類似度算出ステップでは、こうして得られたＭＳ²スペクトルと実測ＭＳ²スペクトルとについてプロダクトイオンの強度プロファイルの一致性に基づく類似度を求める。即ち、スペクトルライブラリに収録されているＭＳ²スペクトルそのものではなく、ペプチドバリアントを考慮して、つまりは切断部位が多様であることを考慮して変形させたＭＳ²スペクトルと実測ＭＳ²スペクトルとの照合によるスペクトル検索が実施される。

本発明に係る内在性ペプチド同定用スペクトルライブラリ作成方法及び本発明の第１の態様による内在性ペプチド同定装置によれば、スペクトル検索法により内在性ペプチドを同定する際に好適な、つまりは内在性ペプチドの同定感度が高いスペクトルライブラリを作成することができる。また本発明に係る内在性ペプチド同定方法及び本発明の第２の態様による内在性ペプチド同定装置によれば、従来に比べて、内在性ペプチドの同定感度を向上させることができる。

本発明の一実施例である内在性ペプチド同定システムのブロック構成図。 本実施例の内在性ペプチド同定システムにおけるスペクトルライブラリ作成の処理の流れを示すフローチャート。 本実施例の内在性ペプチド同定システムにおけるペプチド同定の処理の流れを示すフローチャート。 [Ｍ＋Ｈ]⁺＝m/z 1510.9であるウロモジュリンペプチド［配列：ＳＶＩＤＱＳＲＶＬＮＬＧＰＩ］（２価）のＭＳ²スペクトルにおけるピークの帰属結果を示す図。 [Ｍ＋Ｈ]⁺＝m/z 1581.9であるウロモジュリンペプチド［配列：ＩＤＱＳＲＶＬＮＬＧＰＩＴＲ］（２価）のＭＳ²スペクトルにおけるピークの帰属結果を示す図。 [Ｍ＋Ｈ]⁺＝m/z 1581.9であるウロモジュリンペプチド［配列：ＩＤＱＳＲＶＬＮＬＧＰＩＴＲ］（３価）のＭＳ²スペクトルにおけるピークの帰属結果を示す図。 本実施例の内在性ペプチド同定システムにおけるペプチド同定処理の一例の説明図。 本実施例の内在性ペプチド同定システムにおけるペプチド同定処理を実施したときの、照合先のＭＳ²スペクトルと照合元（実測）のＭＳ²スペクトルとの間の類似度の分布を示す図。

まず本発明に係る内在性ペプチド同定システムの一実施例について、添付図面を参照して説明する。
図１は本実施例による内在性ペプチド同定システムのブロック構成図である。

この内在性ペプチド同定システムは、質量分析部１と、データ処理部２と、タンパク質配列データベース３とを備える。また、データ処理部２は、機能ブロックとして、スペクトル解析部２１と、プリカーサイオン選定部２２と、ペプチド同定部２３と、ライブラリ登録処理部２４と、スペクトルライブラリ２５と、解析結果出力部２６とを備える。さらに、ペプチド同定部２３は、データベース（ＤＢ）検索実行部２３１と、スペクトル検索実行部２３２とを含み、該スペクトル検索実行部２３２は、バリアント配列推定部２３２１、スペクトル合成部２３２２、及び、類似度算出部２３２３、を備える。

通常、データ処理部２は、パーソナルコンピュータ又はより高性能なワークステーション等をハードウェア資源とし、該コンピュータにインストールされた専用の制御・処理ソフトウェアを該コンピュータ上で動作させることでそれぞれの機能を達成する構成である。

この内在性ペプチド同定システムは、スペクトルライブラリ２５に事前に格納されている多数の内在性ペプチドについてのマススペクトル（ＭＳ²スペクトル）の情報を用いて、分析対象である試料に含まれる内在性ペプチドのペプチド配列（アミノ酸配列）を推定し、決定されたアミノ酸配列をペプチド同定結果として解析結果出力部２６から出力するものである。

質量分析部１はペプチドを含む試料に対してＭＳ²測定が可能である質量分析装置であり、高スループットで且つ質量分解能や質量精度が高いことが望ましい。例えば、ＭＡＬＤＩイオン源とタンデム飛行時間型質量分析装置を組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦＭＳのほか、四重極飛行時間型質量分析装置（ｑ−ＴＯＦ ＭＳ）、イオントラップ飛行時間型質量分析装置（ＩＴ−ＴＯＦＭＳ）、イオントラップ型質量分析装置（ＩＴ−ＭＳ）、リニアイオントラップ型質量分析装置（ＬＩＴ−ＭＳ）などを用いることができる。

質量分析部１では試料に対してＭＳ¹測定を行うことで、所定の質量電荷比範囲に亘るイオンの信号強度を示すＭＳ¹スペクトルデータを取得する。又は、試料に対して所定のプリカーサイオンについてのＭＳ²測定を行うことで、所定の質量電荷比範囲に亘るプロダクトイオンの信号強度を示すＭＳ²スペクトルデータを取得する。得られたスペクトル（ＭＳ¹スペクトル又はＭＳ²スペクトル）データはスペクトル解析部２１に入力され、スペクトル解析部２１はスペクトルデータに基づいて所定の基準に従いピークを抽出し、ピークの質量電荷比や信号強度などを含むスペクトル情報を作成する。

ペプチド同定部２３においてデータベース検索実行部２３１は、与えられた実測ＭＳ²スペクトルのスペクトル情報とタンパク質配列データベース３とに基づいて、タンパク質配列データベース検索法によるペプチド同定処理を実行する。なお、このデータベース検索実行部２３１によるペプチド同定処理は後述するスペクトルライブラリ作成時にのみ実施される。このときに使用されるタンパク質配列データベース３としては、様々な既存のタンパク質データベース、例えばスイスバイオインフォマティクス研究所（略称：SIB）等が提供している「Swiss-Prot」、米国国立生物工学情報センター（略称：NCBI）が提供している「NCBI Nr」などを用いることができる。

ライブラリ登録処理部２４は、データベース検索実行部２３１によりペプチド配列が同定された又は確認された内在性ペプチドのスペクトル情報を、スペクトルライブラリ２５に登録する。スペクトルライブラリ２５に登録されるデータは、ＭＳ²スペクトルから抽出されたイオンピーク（質量電荷比、信号強度、価数）のピークリスト、及び、プリカーサイオンの質量電荷比を含む。また、ＭＳ²スペクトル上のイオンピークの質量電荷比を価数に依らず１価イオン相当の質量電荷比に変換し、つまりは多価イオンが観測されるＭＳ²スペクトルを１価イオンのＭＳ²スペクトルに変換したうえで該ＭＳ²スペクトルから得られるピークリストをスペクトルライブラリ２５に登録してもよい。

スペクトル検索実行部２３２は、与えられた実測ＭＳ²スペクトルのスペクトル情報と上述のようにスペクトルライブラリ２５に登録されているスペクトル情報とに基づいて、目的とする内在性ペプチドのアミノ酸配列を推定する。上述したように、このときにはタンパク質配列データベース３は使用されず、データベース検索実行部２３１も機能しない。

プリカーサイオン選定部２２は、実測のＭＳ¹スペクトルに基づいてＭＳ²測定のためのプリカーサイオンを選定するが、或るプリカーサイオンについてのＭＳ²測定によってＭＳ²スペクトルが得られている場合には、そのＭＳ²スペクトルの品質を評価し、その品質が低い場合には、実測のＭＳ¹スペクトルに基づいて別の質量電荷比のプリカーサイオンを選定する機能を有する。ここで、別の質量電荷比のプリカーサイオンを選定する際には、プリカーサイオンの価数と、測定済みのＭＳ²スペクトルに基づくデータベース検索によって同定されたペプチドのアミノ酸配列中に存在する塩基性アミノ酸配列数とを利用することができる。また、ペアであるｙ系列イオンとｂ系列イオンの一方のみが検出され、他方が実質的に検出されないとき、つまりはプロダクトイオンの量にイオン系列に関する偏りがあるときに、ＭＳ²スペクトルの品質が低いと判断すればよい。
次に、本実施例の内在性ペプチド同定システムにおける特徴的な処理動作を説明する。

［スペクトルライブラリ作成処理］
本実施例の内在性ペプチド同定システムでは、まず、アミノ酸配列が既知である又は未知であるライブラリ作成用内在性ペプチドを実測し同定した結果に基づいて、スペクトルライブラリ２５を作成しておく。このスペクトルライブラリ作成処理について、図２に示すフローチャートを参照して説明する。

質量分析部１は、ライブラリ作成用内在性ペプチドを含む試料について質量分析（ＭＳ¹測定）を実行しＭＳ¹スペクトルを取得する（ステップＳ１０）。スペクトル解析部２１は得られたＭＳ¹スペクトル上でピークを抽出し、プリカーサイオン選定部２２は複数のピークの中から所定の基準に従いＭＳ²測定対象のプリカーサイオンを１又は複数選定する。例えば、信号強度が所定の閾値以上であるイオンピークをプリカーサイオンとして選定すればよい。そして質量分析部１は、上記ライブラリ作成用内在性ペプチドを含む試料に対し、選定された１又は複数のプリカーサイオンについてのＭＳ²測定をそれぞれ実行し、ＭＳ²スペクトルを取得する（ステップＳ１１）。

スペクトル解析部２１は得られたＭＳ²スペクトル上でプロダクトイオン由来のピークを抽出してピークリストを作成し、このリストを含むスペクトル情報をペプチド同定部２３に入力する。データベース検索実行部２３１は、タンパク質配列データベース３に収録されているタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を利用して、網羅的にライブラリ作成用内在性ペプチドの同定を試みる（ステップＳ１２）。なお、このときのデータベース検索実行部２３１における同定処理は、本発明者らが開発した、特許文献１及び非特許文献３に記載の既存の内在性ペプチド同定用配列データベース検索ソフトウェアを利用することができる。もちろん、このときのペプチド同定法はこれに限らないが、できるだけ網羅的な同定であることが望ましい。

ペプチドが同定できたならば、ライブラリ登録処理部２４はその同定に使用されたＭＳ²スペクトルの品質を評価する。具体的には例えば、同定されたライブラリ作成用内在性ペプチドについての実測ＭＳ²スペクトルにおいて観測されるプロダクトイオンの系列を確認し、ペアであるｙ系列とｂ系列のイオンが同じ程度の信号強度で観測されているか否か、即ち、偏りなく検出されているか否かを判定する。そして、その判定結果を指標化して指標値が所定の閾値を超えるものを品質が高いＭＳ²スペクトル、閾値未満のものを品質が低いＭＳ²スペクトルであるとみなす。或いは、同定の際に同時に得られるスコアなどの同定信頼度を示す指標値に基づいてＭＳ²スペクトルの品質の高低を判断してもよい。そして、品質の高いと判定されたＭＳ²スペクトルがあれば、そのＭＳ²スペクトルに基づくスペクトル情報をライブラリ登録候補として選定する（ステップＳ１３）。

また、同定された一つのペプチドに由来するＭＳ²スペクトルが複数あり、それらがいずれも高い品質であると判定された場合には、その高品質である複数のＭＳ²スペクトルを結合し合成することで新たなＭＳ²スペクトルを作成し、これをライブラリ登録候補として選定してもよい。さらにまた、同一ペプチドに由来する複数の異なる強度プロファイルのＭＳ ² スペクトルが得られた場合には、各ＭＳ ² スペクトルにおいて検出されたプロダクトイオンの同位体分布に対しデコンボリューションを行い、各ＭＳ ² スペクトルから同一の質量電荷比を持つプロダクトイオンの質量を算出して作成したピークリストを結合し、これをライブラリ登録候補としてもよい。

なお、ライブラリ作成用内在性ペプチドのアミノ酸配列が既知である場合、上記ステップＳ１２では、その既知であるアミノ酸配列を用いて同定結果が正しいか否かを確認し、同定結果が正しくなければ、上記ステップＳ１３の処理をパスしてステップＳ１４へ進めばよい（図２では記載を省略）。同定結果であるアミノ酸配列の確認は、例えば、実測により得られたＭＳ²スペクトルにおいて検出された複数のピークの中でピーク強度やＳＮ比などを基準として選定された主要ピークと、既知のペプチドからＣＩＤにより生成されると推定されるプロダクトイオンとの質量電荷比の一致度に基づいて行うことができる。一方、ライブラリ作成用内在性ペプチドのアミノ酸配列が未知である場合には、ステップＳ１２において同定された結果が正しいとみなしてステップＳ１３の処理を実施すればよい。

ステップＳ１３の処理のあと、プリカーサイオン選定部２２は、必要に応じて、実測のＭＳ¹スペクトルに基づいて再度ＭＳ²測定を行うべきプリカーサイオンがあるか否かを確認し、適切なプリカーサイオンの選定を試みる（ステップＳ１４）。具体的には、ステップＳ１３でＭＳ²スペクトルの品質が低いと判定されてライブラリ登録候補が選定されなかったときにプリカーサイオンの再選定を行うとよい。また、ステップＳ１２での同定により帰属された系列イオンの種類によってイオン生成量に著しく偏りがある場合には、部分構造情報量が不足していると判断してプリカーサイオンの再選定を行うとよい。具体的には例えば、ｙ系列イオンのプロダクトイオンに対応するピークの信号強度の総和又はＳＮ比の総和と、ｂ系列イオンのプロダクトイオンに対応するピークの信号強度の総和又はＳＮ比の総和とをそれぞれ計算し、その強度総和の比又はＳＮ比総和の比が１：１０など所定の閾値以上に差がある場合などには、部分構造情報量が不足していると推定すればよい。

後述するように、同じアミノ酸配列のイオン種であってもイオンの価数が異なると、或いは、そのイオンの価数とアミノ酸配列中の塩基性アミノ酸の数との関係によって、ＣＩＤによる開裂の態様が相違し、その結果、ＭＳ²スペクトルにおけるプロダクトイオンの強度プロファイルが相違することがある。そこで、プリカーサイオンの再選定方法としては例えば、同じイオン種で価数が異なるイオンピークがＭＳ¹スペクトルで観測されるか否かを判定し、観測される場合にそれをプリカーサイオンとして再選定すればよい。

こうした再測定対象のプリカーサイオン候補が存在しなければ、ステップＳ１５からＳ１７へと進み、ライブラリ登録処理部２４は、ステップＳ１３でライブラリ登録候補として挙げたＭＳ²スペクトルのスペクトル情報を抽出して、アミノ酸配列情報等と共にスペクトルライブラリ２５に登録する。一方、再測定対象のプリカーサイオン候補が存在する場合には、ステップＳ１５からＳ１６へと進み、質量分析部１はプリカーサイオン選定部２２で新たに選定されたプリカーサイオンをターゲットとするＭＳ²測定を実行する。そして、新たなＭＳ²スペクトルが得られたならばステップＳ１６からＳ１２へと戻り、そのＭＳ²スペクトルについて上述したようにステップＳ１２以降の処理を繰り返す。

以上のようにして、本実施例の内在性ペプチド同定システムでは、ライブラリ作成用内在性ペプチドを実測し同定した結果に基づいて、事前にスペクトルライブラリ２５を作成しておく。

［スペクトルライブラリ作成の具体例］
上記手順によるスペクトルライブラリ作成の具体的な一例を説明する。ここでは、質量分析部１としてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ又はＬＣ−ＩＴ−ＴＯＦＭＳを用い、ヒトの尿由来の試料に対しＭＳ²測定を実施しＭＳ²スペクトルを取得した。このＭＳ²スペクトルに基づいて既存の内在性ペプチド同定用配列データベース検索ソフトウェアを用いてペプチドの同定を試みた結果、下の表１に示す価数が２である二種のウロモジュリンペプチド（ペプチドバリアント）が同定された。ここで使用した内在性ペプチド同定用配列データベース検索ソフトウェアは本発明者らが開発したものであり、特許文献１及び非特許文献３に記載のものである。

表１において、[Ｍ＋Ｈ]⁺は多価イオンを１価イオンに換算した場合の質量電荷比m/z、Chargeはプリカーサイオンの価数、Sequenceは同定されたペプチドのアミノ酸配列、Start AAはウロモジュリン前駆体タンパク質において同定されたペプチドのＮ末端のアミノ酸残基番号、End AAはウロモジュリン前駆体タンパク質において同定されたペプチドのＣ末端のアミノ酸残基番号、Basic AAはウロモジュリン前駆体タンパク質において同定されたペプチド中の塩基性アミノ酸の数、である。

次に、上記の同定された各ペプチドに対応する実測のＭＳ²スペクトルの品質を評価するために、それら実測のＭＳ²スペクトル上で観測される各プロダクトイオンピークについて、ｙ／ｂ系列イオンとしての帰属を試みた。図４は、[Ｍ＋Ｈ]⁺＝m/z 1510.9であるウロモジュリンペプチド［配列：ＳＶＩＤＱＳＲＶＬＮＬＧＰＩ］（２価）のＭＳ²スペクトルにおけるピークの帰属結果を示す図である。この図から明らかであるように、このウロモジュリンペプチドをプリカーサイオンとしたＭＳ²スペクトルでは、ペアであるｙ系列イオンとｂ系列イオンとがほぼ満遍なく生成されている。したがって、このＭＳ²スペクトルの品質は高いということができる。

一方、図５は、[Ｍ＋Ｈ]⁺＝m/z 1581.9であるウロモジュリンペプチド［配列：ＩＤＱＳＲＶＬＮＬＧＰＩＴＲ］（２価）のＭＳ²スペクトルにおけるピーク帰属結果を示す図である。この図から、このウロモジュリンペプチドをプリカーサイオンとしたＭＳ²スペクトルでは、専らｙ系列イオンのみが観測され、ｂ系列イオンは殆ど検出されていないことが分かる。即ち、ペアであるｙ／ｂ系列イオンが偏って生成されており、このＭＳ²スペクトルの品質は相対的に低いということができる。

同定された上記二つのペプチドはいずれも価数が２であり、プリカーサイオンの質量電荷比にも大きな差はない。しかしながら、それらペプチドのアミノ酸組成を調べると、塩基性アミノ酸残基（Ａｒｇ又はＨｉｓ、Ｌｙｓ）の数が[Ｍ＋Ｈ]⁺＝m/z 1510.9のペプチドでは１個であるのに対し、[Ｍ＋Ｈ]⁺＝m/z 1581.9のペプチドでは２個であり、プリカーサイオンの価数と同じ値であることが判明した。

プリカーサイオンの価数が塩基性アミノ酸の数以下である場合（この例では、[Ｍ＋Ｈ]⁺＝m/z 1581.9（２価）のペプチドの場合）、ＣＩＤによる開裂やその開裂後の電荷の保持に関与するプロトンが塩基性アミノ酸の側鎖に長くとどまってしまいペプチド主鎖上を自由に移動できない。そのため、ＣＩＤの開裂によって生成される各プロダクトイオンの量に主鎖上での偏りが生じる可能性が高くなる。図５に示したＭＳ²スペクトルにおいてｂ系列イオンが殆ど検出されないのは、こうした理由によるものと推定される。

そこで、ＭＳ²スペクトルが低品質であると判定された[Ｍ＋Ｈ]⁺＝m/z 1581.9（２価）のペプチドイオンに代わるプリカーサイオンとして、同じペプチドの３価のイオンに着目した。この３価のイオンではプリカーサイオンの価数が塩基性アミノ酸の数よりも大きいので、２価のイオンに比べてｂ系列のプロダクトイオンが検出される可能性が高くなる筈である。そこで、[Ｍ＋Ｈ]⁺＝m/z 1581.9であるウロモジュリンペプチド［配列：ＩＤＱＳＲＶＬＮＬＧＰＩＴＲ］（３価）をターゲットとするＭＳ²測定を実行し、それにより得られたＭＳ²スペクトルにおけるピークの帰属を試みたところ、図６に示す結果が得られた。

この場合、上述した２価のウロモジュリンペプチドと[Ｍ＋Ｈ]⁺は同じであるものの、ｙ系列イオンとともにｂ系列イオンも生成されていることが確認できた。したがって、この場合には、[Ｍ＋Ｈ]⁺＝m/z 1510.9であるウロモジュリンペプチド［配列：ＳＶＩＤＱＳＲＶＬＮＬＧＰＩ］（２価）のＭＳ²スペクトルとともに、この[Ｍ＋Ｈ]⁺＝m/z 1581.9であるウロモジュリンペプチド［配列：ＩＤＱＳＲＶＬＮＬＧＰＩＴＲ］（３価）のＭＳ²スペクトルをスペクトルライブラリ２５に登録すればよい。

なお、図２に示したフローチャートでは、ステップＳ１４及びＳ１６において必要に応じて再測定対象のプリカーサイオンを選定し、その選定されたプリカーサイオンについてのＭＳ²測定を実施するようにしているが、取得できるＭＳ²スペクトルの数に上限が設定されているなどの理由によって、同じ分子由来のプリカーサイオンについて価数が相違する複数のプリカーサイオンに対するＭＳ²スペクトルを取得できない場合もある。その場合には、同一分子由来であって価数のみが異なる２個以上のピークが検出されたときに価数が最も高い又は価数が高いほうのピークを優先してプリカーサイオンを定め、ＭＳ²測定を実行するとよい。何故なら、そのほうが、ｙ系列イオン、ｂ系列イオンが満遍なく観測される、つまりは品質の高いＭＳ²スペクトルが得られる可能性が高いからである。

［スペクトル検索によるペプチド同定処理］
次に、事前にスペクトルライブラリ２５が構築されている状態の下で実施される目的とする内在性ペプチドの同定処理について図３に示すフローチャートを参照して説明する。

質量分析部１は、同定対象である未知の内在性ペプチドを含む目的試料についてＭＳ²測定を実行し、ＭＳ²スペクトルを取得する（ステップＳ２０）。スペクトル解析部２１は得られたＭＳ²スペクトル上でピークを抽出してピークリストを作成し、このピークリストとプリカーサイオンの質量電荷比、さらには前駆体タンパク質のアミノ酸配列などの照合元の情報をペプチド同定部２３に入力する。この場合、ペプチド同定部２３においてデータベース検索実行部２３１ではなくスペクトル検索実行部２３２が以下のような処理を実行する。

まず、バリアント配列推定部２３２１はスペクトルライブラリ２５から照合先となる一つのＭＳ²スペクトルを選定する（ステップＳ２１）。なお、未知の内在性ペプチドについて何らかの条件で絞り込みが可能である場合には、スペクトルライブラリ２５に収録されている内在性ペプチドをその絞り込み条件に従って絞り込み、その絞り込みに残ったペプチドに対応するＭＳ²スペクトルの一つを選定すればよい。

バリアント配列推定部２３２１は、選定した一つのＭＳ²スペクトルに対応するアミノ酸配列のＮ末端側及びＣ末端側でそれぞれ一又は複数のアミノ酸残基を除去したり逆に一又は複数のアミノ酸残基を付加したりすることで、上記照合元のＭＳ²スペクトルのプリカーサイオンと質量電荷比が一致する（実際には質量電荷比の差が所定の許容値以内となる）ようなバリアントのアミノ酸配列を探索する（ステップＳ２２）。アミノ酸残基を付加する際には、照合元のＭＳ²スペクトルに対応する前駆体タンパク質のアミノ酸配列を参照すればよい。

ステップＳ２２で該当するバリアントのアミノ酸配列が見つからなかった場合には、ステップＳ２３でＮｏと判定されステップＳ２６に進み、スペクトルライブラリ２５に収録されている全ＭＳ²スペクトル（又は絞り込み後の全ＭＳ²スペクトル）についてステップＳ２１〜Ｓ２３又はＳ２１〜Ｓ２５の処理が終了したか否かを判定する。そして、未処理のＭＳ²スペクトルがあればステップＳ２６からＳ２１に戻り、スペクトルライブラリ２５において別のＭＳ²スペクトルを選定して処理を繰り返す。

一方、ステップＳ２２で該当するバリアントのアミノ酸配列が見つかった場合には、ステップＳ２３からＳ２４へと進み、照合先のＭＳ²スペクトルに基づいてペプチドバリアントのＣ末端側断片スペクトルとＮ末端側断片スペクトルとのペアであるＭＳ²スペクトルペアを作成する。具体的には、ステップＳ２２においてバリアントのアミノ酸配列を推定する際に一方の末端から除去したアミノ酸残基に相当する分の質量をＭＳ²スペクトルの各ピークの質量電荷比から差し引いたプリフィックススペクトルと、上記バリアントのアミノ酸配列を推定する際に他方の末端に付加したアミノ酸残基に相当する分の質量をＭＳ²スペクトルの各ピークの質量電荷比に加えたサフィックススペクトルとを作成する。

なお、検索性能の低下や誤検出を防ぐために、照合先のＭＳ²スペクトルにおいてサフィックススペクトルには不要であるＮ末端断片ピークとして帰属されるピークが検出された場合には、該ピークがサフィックススペクトルに含まれないように除去してもよい。また同様に、照合先のＭＳ²スペクトルにおいてプリフィックススペクトルには不要であるＣ末端断片ピークとして帰属されるピークが検出された場合には、該ピークがプリフィックススペクトルに含まれないように除去してもよい。

そのあと類似度算出部２３２３は、上記ＭＳ²スペクトルペアと照合元である実測のＭＳ²スペクトルとについて類似度を算出し、その類似度算出結果を照合先に情報と共に一旦保存する（ステップＳ２５）。例えば類似度スコアは、照合元のＭＳ²スペクトルと照合先のサフィックススペクトルとの内積、及び、照合元のＭＳ²スペクトルと照合先のプリフィックススペクトルとの内積、の和とすることができる。ただし、内積のみならず確率モデルベースのものなど、一般的にスペクトル検索に使われる様々な類似度の算出方式（例えば非特許文献２参照）を採用することができる。また、ＭＳ²測定時のピーク生成量や検出量のばらつきの影響による誤同定を抑えるために、ピーク強度に代えてピーク強度の対数をとったものを用いて類似度を算出するようにしてもよい。また、ステップＳ２４においてＭＳ²スペクトルペアとして求まったサフィックススペクトルとプリフィックススペクトルとについて独立に類似度スコアを算出してそれらを加算するのではなく、その二つのＭＳ²スペクトルのピーク列を一つのＭＳ²スペクトルに統合した上で、二つのＭＳ²スペクトルを合成したＭＳ²スペクトルを仮に作成し、そのＭＳ²スペクトルと照合元のＭＳ²スペクトルとから類似度スコアを算出してもよい。

類似度スコアが得られたならば上記ステップＳ２６の判定処理を行い、スペクトルライブラリ２５に未処理のＭＳ²スペクトルがあればステップＳ２１に戻る。一方、ステップＳ２６でＹｅｓと判定されると、類似度算出部２３２３は一時保存されている類似度算出結果を確認し、最も高い類似度が所定の閾値以上であるか否かを判定することで同定が可能であったか否かを判定する（ステップＳ２７）。同定が可能であると判定されると、最も高い類似度を示す又は類似度が所定閾値以上であるペプチドバリアントのアミノ酸配列の情報を同定結果として解析結果出力部２６に出力し、例えば表示画面上に表示してユーザに提示する（ステップＳ２９）。

一方、ステップＳ２７で同定不可であると判定されると、プリカーサイオン選定部２２は、目的試料に対してすでに実行されたＭＳ²測定とは異なるプリカーサイオンを選定し（ステップＳ２８）ステップＳ２０に戻って再度ＭＳ²測定を実行する。そのあとは、得られたＭＳ² スペクトルに基づいてステップＳ２１〜Ｓ２７の処理を実行する。具体的には例えば、照合元ＭＳ²スペクトルのプリカーサイオンと１価当たりの質量電荷比が同一であり且つ価数が高いプリカーサイオンがＭＳ¹スペクトル上にないかどうか探索し、ＭＳ²測定を実行可能である程度の信号強度を示すピークがＭＳ¹スペクトル上で見つかった場合に、このイオンを新たなプリカーサイオンとして再度ＭＳ²測定を実施するとよい。ただし、再ＭＳ²測定のためのプリカーサイオンの選定方法は、これに限るものではない。

なお、スペクトルライブラリ２５に登録されている全てのＭＳ²スペクトルに対して同定閾値以上となるペプチドが見つからなかった場合、すぐに同定不可と判定するのではなく、サフィックススペクトルとプリフィックススペクトルのいずれか一方に対してのみの類似度スコアを算出し直し、高い類似度スコアが得られるほうのＭＳ ² スペクトルからペプチドバリアントを求めてもよい。この場合、上記理由により、推定したペプチドバリアントのアミノ酸配列に含まれる塩基性アミノ酸残基数がプリカーサイオンの価数以上である場合に妥当な推定結果であるとしてもよい。そして、こうしたスペクトル検索を行っても同定に至らなかった場合に同定不可（ステップＳ２７でＮｏ）と判定すればよい。

［ペプチド同定の具体例］
上記手順によるスペクトル検索によるペプチド同定処理の具体的な一例を説明する。ここでは、ヒトの尿由来の試料に対してＭＳ²測定を行うことで得られたＭＳ²スペクトルをスペクトル検索の照合元とする。いま、このＭＳ²スペクトルは、[Ｍ＋Ｈ]⁺＝m/z 982.6をターゲットとするものであるとする。また、スペクトルライブラリ２５上に登録されている[Ｍ＋Ｈ]⁺＝m/z 1510.9のウロモジュリンペプチド［配列：ＳＶＩＤＱＳＲＶＬＮＬＧＰＩ］（２価）のＭＳ²スペクトルを照合先としてスペクトル検索を試みたものとする。

バリアント配列推定部２３２１は、照合先のペプチドのアミノ酸配列である［ＳＶＩＤＱＳＲＶＬＮＬＧＰＩ］のＮ末端側及びＣ末端側のアミノ酸配列を元のアミノ酸残基を少なくとも１個以上残すという条件の下で伸縮させつつ、プリカーサイオン（[Ｍ＋Ｈ]⁺）の質量電荷比が照合元の質量電荷比m/z 982.6となるアミノ酸配列がないかどうか探索を行った。その結果、ペプチドバリアントのアミノ酸配列は、Ｎ末端側のアミノ酸残基を７個（つまりはＳＶＩＤＱＳＲ）削除し、Ｃ末端側のアミノ酸を前駆体タンパク質配列を参考として２残基だけ伸長した配列［ＶＬＮＬＧＰＩＴＲ］であると推定された。

これを受けてスペクトル合成部２３２２は、図７に示すように、照合先である[Ｍ＋Ｈ]⁺＝m/z 1510.9のペプチドのＭＳ²スペクトルを大元のシードスペクトルとして、その照合先のペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から推定される配列ＶＬＮＬＧＰＩＴＲとの差分である７残基分の質量電荷比に相当する785.4Daを差し引いたプリフィックススペクトルを作成した。また同様に、Ｃ末端側の差分である２残基分の質量電荷比に相当する257.15Daを加算してサフィックススペクトルを作成した。

類似度算出部２３２３は、上述したように、照合元のＭＳ²スペクトルと上記サフィックススペクトルとの内積、及び、照合元のＭＳ²スペクトルと上記プリフィックススペクトルとの内積、の和により類似度スコアを算出した。

図８は、照合先のＭＳ²スペクトル（プリカーサイオンm/z 1510及び1912）と実測のＭＳ²スペクトルとの間で算出した類似度スコアの分布を示す図である。横軸は質量電荷比、縦軸は類似度スコアである。

この結果によれば、類似性のない照合先のＭＳ²スペクトルとの類似度スコアは０．２程度以下、過去に同定されたウロモジュリンペプチドのうち照合先ペプチドと１残基以上重複するペプチドのＭＳ²スペクトルとの類似度スコアは０．２〜１．０程度、同一ペプチドのＭＳ²スペクトルとの類似度スコアは１．４程度に分布していた。そこで、同定されているか否かを判定するための類似度スコアの閾値を０．２に定めた。そのうえで、照合元のＭＳ²スペクトルをＭＳ²スペクトルペアと照合して類似度スコアを算出したところ、類似度スコアは０．６３となった。これは上記の閾値以上であり、照合元のＭＳ²スペクトル（プリカーサイオンm/z 982.6）からアミノ酸配列がＶＬＮＬＧＰＩＴＲであるペプチドバリアントの同定が可能であることが確認できた。

なお、上記実施例では、多価イオンを１価イオンに変換したあとの質量電荷比をスペクトル情報としてスペクトルライブラリ２５に登録していたが、こうした変換を行わなくてもスペクトル情報に含まれる価数の情報を参照することにより、上記説明と同様の検索処理を実施可能であることは明白である。

また、上記実施例は本発明の一例にすぎず、上記記載の変形例以外でも、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

１…質量分析部
２…データ処理部
２１…スペクトル解析部
２２…プリカーサイオン選定部
２３…ペプチド同定部
２３１…データベース（ＤＢ）検索実行部
２３２…スペクトル検索実行部
２３２１…バリアント配列推定部
２３２２…スペクトル合成部
２３２３…類似度算出部
２４…ライブラリ登録処理部
２５…スペクトルライブラリ
２６…解析結果出力部
３…タンパク質配列データベース

Claims (6)

1. 試料中の内在性ペプチドのアミノ酸配列を質量分析を利用したスペクトル検索法により推定して該ペプチドを同定する際に参照されるスペクトルライブラリを作成する内在性ペプチド同定用スペクトルライブラリ作成方法であって、
   a)アミノ酸配列が未知である又は既知であるライブラリ作成用内在性ペプチドを含む試料に対しＭＳ¹測定を実行しＭＳ¹スペクトルを取得するＭＳ¹測定実行ステップと、
   b)前記ライブラリ作成用内在性ペプチドを含む試料に対し、後記プリカーサイオン選定ステップで選定されたプリカーサイオンについてのＭＳ²（＝ＭＳ／ＭＳ）測定を実行しＭＳ²スペクトルを取得するＭＳ²測定実行ステップと、
   c)前記ＭＳ²測定実行ステップで得られた実測ＭＳ²スペクトルに対して網羅的なペプチド同定手法による同定処理を実施することにより、前記ライブラリ作成用内在性ペプチドのアミノ酸配列を同定する又は確認するペプチド同定ステップと、
   d)前記ペプチド同定ステップにおいてアミノ酸配列の同定が可能であった又はアミノ酸配列が正当であることが確認されたときに、同一ペプチド由来のＭＳ²スペクトルの中から同定信頼度の高さ若しくは同定時に帰属されたピークの品質の高さを示す指標値に基づいて、相対的に若しくは絶対的に品質が高いＭＳ²スペクトルを選別して、又は、相対的に若しくは絶対的に品質が高い複数のＭＳ²スペクトルを結合し合成することで、品質を向上させた新たなＭＳ²スペクトルを作成し、該選別した又は作成したＭＳ²スペクトルに基づく情報をスペクトルライブラリに登録するライブラリ登録ステップと、
   e)前記ライブラリ作成用内在性ペプチドについてのＭＳ¹スペクトルに基づいてＭＳ²測定でターゲットとするプリカーサイオンを選定するものであって、前記ライブラリ登録ステップにおいて、既に実施されたＭＳ²測定で得られたＭＳ²スペクトルの品質が相対的に若しくは絶対的に低いと判定された場合、又は、同定の結果、帰属されたプロダクトイオンが少なく部分構造情報量が少ないと判定された場合に、前記ＭＳ²測定実行ステップによるＭＳ²測定を再度実施するためのプリカーサイオンを新たに選定するプリカーサイオン選定ステップと、
   を有することを特徴とする内在性ペプチド同定用スペクトルライブラリ作成方法。
2. 請求項１に記載の内在性ペプチド同定用スペクトルライブラリ作成方法であって、
   前記プリカーサイオン選定ステップでは、プリカーサイオンの価数と、同定された又は正当であることが確認されたライブラリ作成用内在性ペプチドのアミノ酸組成と、の少なくともいずれかを利用してＭＳ²測定を再度実施するためのプリカーサイオンを新たに選定することを特徴とする内在性ペプチド同定用スペクトルライブラリ作成方法。
3. 試料中の内在性ペプチドのアミノ酸配列をスペクトル検索法により推定して該ペプチドを同定する内在性ペプチド同定装置であって、
   a)スペクトル検索法によるペプチド同定時に参照される、アミノ酸配列が既知である内在性ペプチドのＭＳ²スペクトルが収録されているスペクトルライブラリと、
   b)ＭＳ¹測定及びＭＳ²測定が可能である質量分析部と、
   c)アミノ酸配列が未知である又は既知であるライブラリ作成用内在性ペプチドを含む試料に対しＭＳ¹測定を実行してＭＳ¹スペクトルを取得するように前記質量分析部を制御するＭＳ¹測定実行制御部と、
   d)前記ライブラリ作成用内在性ペプチドを含む試料に対し、後記プリカーサイオン選定部により選定されたプリカーサイオンをターゲットとするＭＳ²測定を実行しＭＳ²スペクトルを取得するように前記質量分析部を制御するＭＳ²測定実行制御部と、
   e)前記ＭＳ²測定実行制御部の制御の下で得られた実測ＭＳ²スペクトルに対して網羅的なペプチド同定手法による同定処理を実施することにより、前記ライブラリ作成用内在性ペプチドのアミノ酸配列を同定する又は確認するペプチド同定部と、
   f)前記ペプチド同定部によりアミノ酸配列の同定が可能であった又はアミノ酸配列が正当であることが確認されたときに、同一ペプチド由来のＭＳ²スペクトルの中から同定信頼度の高さ若しくは同定時に帰属されたピークの品質の高さを示す指標値に基づいて相対的に若しくは絶対的に品質が高いＭＳ²スペクトルを選別して、又は、相対的に若しくは絶対的に品質が高い複数のＭＳ²スペクトルを結合し合成することで、品質を向上させた新たなＭＳ²スペクトルを作成し、該選別した又は作成したＭＳ²スペクトルに基づく情報を前記スペクトルライブラリに登録するライブラリ登録部と、
   g)前記ライブラリ作成用内在性ペプチドについてのＭＳ¹スペクトルに基づいてＭＳ²測定でターゲットとするプリカーサイオンを選定するものであって、前記ライブラリ登録部において、既に実施されたＭＳ²測定で得られたＭＳ²スペクトルの品質が相対的に若しくは絶対的に低いと判定された場合、又は、同定の結果、帰属されたプロダクトイオンが少なく部分構造情報量が少ないと判定された場合に、前記ＭＳ²測定実行制御部による制御の下でＭＳ²測定を再度実施するためのプリカーサイオンを新たに選定するプリカーサイオン選定部と、
   を備えることを特徴とする内在性ペプチド同定装置。
4. 請求項３に記載の内在性ペプチド同定装置であって、
   前記プリカーサイオン選定部は、プリカーサイオンの価数と、同定された又は正当であることが確認されたライブラリ作成用内在性ペプチドのアミノ酸組成と、の少なくともいずれかを利用してＭＳ²測定を再度実施するためのプリカーサイオンを新たに選定することを特徴とする内在性ペプチド同定装置。
5. 試料中の内在性ペプチドのアミノ酸配列を質量分析を利用したスペクトル検索法により推定して該ペプチドを同定する内在性ペプチド同定方法であって、
   a)目的の内在性ペプチドを含む試料に対しＭＳ²測定を実行してＭＳ²スペクトルを取得するＭＳ²測定実行ステップと、
   b)前記ＭＳ²測定実行ステップで得られた実測ＭＳ²スペクトルについてスペクトルライブラリを用いたスペクトル検索を行うことでペプチドを推定するものであって
   b1)スペクトルライブラリに収録されているＭＳ²スペクトルに対応するプリカーサイオンのアミノ酸配列のＮ末端側及びＣ末端側の一若しくは複数のアミノ酸残基を除去する又は一若しくは複数のアミノ酸残基を付加しつつ、ＭＳ²測定のターゲットであるプリカーサイオンの質量電荷比と一致するものを探索することで、ペプチドバリアントのアミノ酸配列を推定するバリアント配列推定ステップと、
   b2)前記バリアント配列推定ステップによるペプチドバリアントのアミノ酸配列推定に利用された元のＭＳ²スペクトルに基づいて、該ペプチドバリアントに対応するＭＳ²スペクトルを生成するスペクトル生成ステップと、
   b3)前記スペクトル生成ステップにおいて得られたＭＳ²スペクトルと前記実測ＭＳ²スペクトルとを照合して類似度を求め、該類似度に基づいて前記ペプチドバリアントのアミノ酸配列を推定する類似度算出ステップと、
   を有することを特徴とする内在性ペプチド同定方法。
6. 試料中の内在性ペプチドのアミノ酸配列をスペクトル検索法により推定して該ペプチドを同定する内在性ペプチド同定装置であって、
   a)前記スペクトル検索法に利用される既知の内在性ペプチドのＭＳ²スペクトルが収録されているスペクトルライブラリと、
   b)ＭＳ²測定が可能である質量分析部と、
   c)目的とする内在性ペプチドを含む試料に対してＭＳ²測定を実施してＭＳ²スペクトルを取得するように前記質量分析部を制御するＭＳ²測定実行制御部と、
   d)前記ＭＳ²測定実行制御部の制御の下で得られた実測ＭＳ²スペクトルについてスペクトルライブラリを用いたスペクトル検索を行うことでペプチドを推定するものであって
   d1)スペクトルライブラリに収録されているＭＳ²スペクトルに対応するプリカーサイオンのアミノ酸配列のＮ末端側及びＣ末端側の一若しくは複数のアミノ酸残基を除去する又は一若しくは複数のアミノ酸残基を付加しつつ、ＭＳ²測定のターゲットであるプリカーサイオンの質量電荷比と一致するものを探索することで、ペプチドバリアントのアミノ酸配列を推定するバリアント配列推定部と、
   d2)前記バリアント配列推定部によるペプチドバリアントのアミノ酸配列推定に利用された元のＭＳ²スペクトルに基づいて、該ペプチドバリアントに対応するＭＳ²スペクトルを生成するスペクトル生成部と、
   d3)前記スペクトル生成部において得られたＭＳ²スペクトルと前記実測ＭＳ²スペクトルとを照合して類似度を求め、該類似度に基づいて前記ペプチドバリアントのアミノ酸配列を推定する類似度算出部と、
   を備えることを特徴とする内在性ペプチド同定装置。

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