JP6136770B2 - 質量分析データ解析装置及び解析方法 - Google Patents

Description

本発明は、ペプチドやタンパク質を含む被検試料に対してＭＳⁿ分析（ただしｎは２以上の整数）を実行して収集されたデータを解析処理することにより、被検試料中のペプチドやタンパク質を同定する質量分析データ解析装置及び解析方法に関する。

近年、ポストゲノム研究としてタンパク質の構造や機能の解析が急速に進められている。このようなタンパク質の構造・機能解析手法（プロテオーム解析）の一つとして、質量分析計を用いたタンパク質の発現解析や一次構造解析が広く行われるようになってきており、四重極型イオントラップなどにおける特定イオンの捕捉と衝突誘起解離（ＣＩＤ）等のイオン解離とを行う、いわゆるＭＳⁿ分析が威力を発揮している。

ＭＳⁿ分析を利用してタンパク質を同定する一般的な手法としては、まず、タンパク質を化学的に又は酵素消化により分解することでペプチド断片の混合物を調製し、このペプチド断片混合物を質量分析に供してマススペクトル（ＭＳ¹スペクトル）を取得する。続いて、ペプチド断片混合物のマススペクトルデータの中から、単一のペプチドに由来する一組の同位体ピーク群をプリカーサイオンとして選択し、該プリカーサイオンに対し衝突誘起解離を実施し、解離により生じたフラグメントイオンの質量分析、つまりＭＳ²分析を実行する。衝突誘起解離により、特定のペプチドを構成するアミノ酸配列の様々な位置で結合が切れ、異なるアミノ酸残基を持つフラグメント（断片）が生じる。そのため、特定のペプチドのアミノ酸配列や構造を反映したＭＳ²スペクトルが得られる。

こうしたＭＳ²スペクトルからペプチドやタンパク質を直接的に同定する手法として最も広く利用されている方法は、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法である。ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法では、タンパク質データベースに登録されているタンパク質を試料調製に使用した酵素によって消化して得られるペプチドに対しコンピュータ内で断片化を計算することで仮想ＣＩＤスペクトルを求め、実測により得られたＭＳ²スペクトルとの一致度が高い仮想ＣＩＤスペクトルが得られるペプチドをデータベース内から検索する。そして、ペプチドの分子量情報（つまりはプリカーサイオンの質量情報）も利用してスペクトルの一致度の信頼性を示す期待値を計算し、この期待値に基づいてペプチドを同定する。このようなＭＳ／ＭＳイオンサーチを行うツール（コンピュータソフトウエア）としては、「X!tandem」や英国マトリクスサイエンス社が提供する「Mascot MS/MS ion search」がよく知られている。

こうしたＭＳ／ＭＳイオンサーチ法では、データベース検索を行う際の制約条件を課すことで探索空間を限定し、それによって偽陽性を減らして同定の信頼度を上げることができる。データベース検索における重要な制約条件の一つが、酵素消化によるタンパク質の切断箇所の指定である。

しかしながら、全てのペプチドについて切断箇所の指定が可能であるわけではない。例えば生体内で前駆体タンパク質より産生される生理活性ペプチド（内因性ペプチド）などのペプチドは特定の消化酵素等で切断されたものでないため、こうしたペプチドをＭＳ／ＭＳイオンサーチ法により同定する際に、酵素等による切断箇所を指定することはできない。そのため、上述したような一般的なペプチド同定方法では、生理活性ペプチドなどを高い信頼度で以て同定することは困難である。また、生理活性ペプチドでは翻訳後修飾（ＰＴＭ＝Post-Translational Modification）や変異が頻繁に起こるが、上記同定方法では、未知の翻訳後修飾や変異が起こった場合に探索空間が広くなるので、ペプチドを正しく同定することは一層困難となる。これに対し、生理活性ペプチドを同定する方法として、以下のような方法が知られている。

（１）SwePep法（非特許文献１参照）
この方法では、標準的なタンパク質データベースの代わりに、既知の生理活性ペプチドのアミノ酸配列を収録したデータベース（SwePepデータベース）を作成しておく。そして、目的ペプチドを実測して得られたマススペクトルにおいて検出されるピークの質量電荷比とSwePepデータベース内のアミノ酸配列の理論的断片の質量電荷比とを照合することによって、候補ペプチドを求める。

（２）IggyPep法（非特許文献２参照）
この方法では、標準的なタンパク質データベースの代わりに、ゲノムを翻訳して作成したタンパク質のアミノ酸配列のデータベース（IggyPepデータベース）を作成しておく。そして、目的ペプチドを実測して得られたマススペクトルにおいて検出されるピークの質量電荷比とIggypepデータベース内のアミノ酸配列の理論的断片の質量電荷比とを照合することによって、候補ペプチドを求める。

（３）HomClus法（非特許文献３参照）
この方法では、目的ペプチドを実測して得られたマススペクトルと既知ペプチドのマススペクトルとの類似性を参考にして、実測したペプチドのアミノ酸配列候補を求める。また、両マススペクトルに現れるピークのシフト量に基づいて、翻訳後修飾や変異を推定する。

しかしながら、こうした方法でも、次のような理由により生理活性ペプチドを的確に同定することは容易ではない。
即ち、SwePep法やIggyPep法ではＭＳ／ＭＳイオンサーチ法と同様に、予め作成されたデータベースに登録されているペプチドのアミノ酸配列のみを探索の対象としている。そのため、翻訳後修飾や変異を受けたペプチドのアミノ酸配列がデータベースに登録されていないと、ペプチドを正確に同定することは難しい。特に生理活性ペプチドでは翻訳後修飾や変異が起こり易い上にそれが多様であるために、翻訳後修飾や変異を受けたペプチドがデータベースに登録されていない場合が多くなり、結果として同定に至らないケースが多くなってしまう。
一方、HomClus法はデータベース検索によらないので、SwePep法やIggyPep法のような問題はないものの、そもそもマススペクトルの類似性を調べる最適な計算方法が確立されているとはいえない。そのため、実際に同定を試みると、正しい候補ペプチドがリストアップされないというケースが頻発し、同定の信頼性の点で問題がある。

ファルス（M. Falth）、ほか５名、「バリデイション・オブ・エンドジーナス・ペプタイド・アイデンティフィケイション・ユージング・ア・データベース・オブ・タンデム・スペクトラ（Validation of Endogenous Peptide Identifications Using a Database of Tandem Mass Spectra）」、ジャーナル・オブ・プロテオーム・リサーチ（Journal of Proteome research）、2008年、Vol.7、pp.3049-3053 メンスチャート（G. Menschaert）、ほか７名、「ア・ハイブリッド、デ・ノボ・ベースド・ゲノム-ワイド・データベース・サーチ・アプローチ・アプライド・トゥー・ザ・シー・アーチン・ニューロペプタイドーム（A Hybrid, de Novo Based, Genome-Wide Database Search Approach Applied to the Sea Urchin Neuropeptidome）」、ジャーナル・オブ・プロテオーム・リサーチ（Journal of Proteome research）、2010年、Vol.9、pp.990-996 メンスチャート（G. Menschaert）、ほか４名、「スペクトルラル・クラスタリング・イン・ペプタイドミクス・スタディーズ・アロウズ・ホモロジー・サーチング・アンド・モデフィケイション・プロファイリング：オムクラス、ア・バーサティル・ツール（Spectral Clustering in Peptidomics Studies Allows Homology Searching and Modification Profiling： HomClus, a Versatile Tool）」、ジャーナル・オブ・プロテオーム・リサーチ（Journal of Proteome research）、2012年、Vol.11、pp.2774-2785 マン（M. Mann）、ほか１名、「エラー-トレラント・アイデンティフィケイション・オブ・ペプタイズ・イン・シーケンス・データベーシズ・バイ・ペプタイド・シーケンス・タグズ（Error-Tolerant Identification of Peptides in Sequence Databases by Peptide Sequence Tags）」、アナリティカル・ケミストリ（Analytical Chemistry）、1994年、Vol.66、pp.4390-4399

本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、生理活性ペプチドのように消化酵素等によるアミノ酸配列の切断部位を指定することが難しいペプチドについても、従来の同定方法に比べて高い精度、信頼度で以てペプチドを同定することができる質量分析データ解析装置及び質量分析データ解析方法を提供することである。

上記課題を解決するために成された本発明に係る質量分析データ解析装置は、被検試料に対してＭＳⁿ分析（ｎは２以上の整数）を実行することで収集されたＭＳⁿスペクトルデータに基づいて、該被検試料中の目的ペプチドを同定する質量分析データ解析装置であって、
a)既知であるペプチドのアミノ酸配列及びＭＳⁿスペクトル情報から部分的なアミノ酸配列であるシーケンスタグと該シーケンスタグに対応するスペクトルピーク情報とを求めることで、予め、シーケンスタグについてのデータベースを構築しておくタグデータベース構築処理部と、
b)被検試料に対して得られた実測のＭＳⁿスペクトルから抽出されるピーク情報を前記タグデータベース内の情報と照合することにより、目的ペプチドのシーケンスタグを取得するシーケンスタグ取得処理部と、
c)前記シーケンスタグ取得処理部により得られた目的ペプチドに対するシーケンスタグと目的ペプチド由来のプリカーサイオンの質量とを検索条件として前記タグデータベース又はタンパク質データベースにおけるデータベース検索を行うことによりペプチドを同定するペプチド同定処理部と、
を備えることを特徴としている。

また上記課題を解決するために成された本発明に係る質量分析データ解析方法は、被検試料に対してＭＳⁿ分析（ｎは２以上の整数）を実行することで収集されたＭＳⁿスペクトルデータに基づいて、該被検試料中の目的ペプチドを同定する質量分析データ解析方法であって、
a)既知であるペプチドのアミノ酸配列及びＭＳⁿスペクトル情報から部分的なアミノ酸配列であるシーケンスタグと該シーケンスタグに対応するスペクトルピーク情報とを求めることで、予め、シーケンスタグについてのデータベースを構築しておくタグデータベース構築処理ステップと、
b)被検試料に対して得られた実測のＭＳⁿスペクトルから抽出されるピーク情報を前記タグデータベース内の情報と照合することにより、目的ペプチドのシーケンスタグを取得するシーケンスタグ取得処理ステップと、
c)前記シーケンスタグ取得処理ステップにおいて得られた目的ペプチドに対するシーケンスタグと目的ペプチド由来のプリカーサイオンの質量とを検索条件として前記タグデータベース又はタンパク質データベースにおけるデータベース検索を行うことによりペプチドを同定するペプチド同定処理ステップと、
を有することを特徴としている。

本発明に係る質量分析データ解析方法を実施する本発明に係る質量分析データ解析装置において、ペプチド同定処理部は、被検試料に対して実測されたＭＳⁿスペクトルから得られる情報に基づいてペプチドを同定するために、シーケンスタグサーチ（Sequence Tag search）法を利用する。シーケンスタグサーチを実行するツールとしては例えば、英国マトリクスサイエンス社が提供する「Mascot Sequence Query」がよく知られている（非特許文献４参照）。

シーケンスタグは一般に、ＭＳⁿ分析の際のプリカーサイオンの質量電荷比、ＭＳⁿスペクトル中の或るイオンＰ１の質量、ＭＳ²スペクトル中の別の或るイオンＰ２の質量、その二つのイオンＰ１、Ｐ２の質量の差分に対応した部分的なアミノ酸配列、を情報として含む。即ち、シーケンスタグサーチでは、プリカーサイオンの質量電荷比、部分的なアミノ酸配列、及び、その部分的なアミノ酸配列の開始点ピークと終点ピークの質量電荷比、を用いてペプチドを同定する。こうしたシーケンスタグサーチ法は、ＭＳ／ＭＳイオンサーチと比較すると、少ないピークからでも高い信頼度で以てペプチドを同定することができるという特徴があるが、高い同定精度を確保するには高い信頼度のシーケンスタグを与える必要がある。

目的ペプチドを実測して得られたＭＳ²スペクトルに現れるピークの間隔は１又は複数のアミノ酸残基の分子量に相当するから、一般的には、デノボシーケンシングなどにより、各ピークの間隔からシーケンスタグを抽出する。これに対し、本発明に係る質量分析データ解析装置ではタグデータベース構築処理部が、アミノ酸配列等が既知である多数のペプチドに関する情報から予め、シーケンスタグに関するデータベースを構築しておく。このタグデータベースには例えば、上述したように、部分的なアミノ酸配列、プリカーサイオンの質量電荷比、その部分的なアミノ酸配列の開始点ピークの質量電荷比、及び、終点ピークの質量電荷比、さらには、その部分的なアミノ酸配列が抽出された元のペプチド、などを対応付けて格納しておけばよい。シーケンスタグのアミノ酸配列長は適宜に決めることができるが、短すぎると検索したときに候補の数が多くなりすぎ、一方、長すぎると、検索したときに該当する候補がなくなるおそれがある。そのため、アミノ酸配列長さを３〜５程度にしておくとよい。

なお、タグデータベース構築処理部は、タグデータベースに登録するシーケンスタグのアミノ酸配列が翻訳後修飾又は変異を受けたものであることが分かっている場合には、それを示す情報を該シーケンスタグに対応付けて記録することが好ましい。これにより、後述するシーケンスタグ取得処理部によるシーケンスタグ抽出の段階で、翻訳後修飾又は変異を受けたシーケンスタグも抽出することが可能となり、翻訳後修飾又は変異を受けたペプチドの同定が一層容易になる。

被検試料に対して得られた実測のＭＳⁿスペクトルデータが与えられると、シーケンスタグ取得処理部は、その実測ＭＳⁿスペクトルから求まるピーク情報等をタグデータベース内の情報と照合し、目的ペプチドに対応するシーケンスタグを取得する。このときには、ペプチドのアミノ酸配列全体ではなく一部の配列のみを対象にピーク質量の一致性を評価するので、その配列以外の部分が相違するペプチドもヒットし、通常、複数のシーケンスタグが抽出される。そのため、正解のペプチド由来ではないシーケンスタグも抽出されるが、該シーケンスタグ以外の部分で翻訳後修飾や変異を受けている正解のペプチド由来ではないシーケンスタグもほぼ漏れなく抽出されることになる。つまり、偽のシーケンスタグが含まれる可能性は高いものの、正解のシーケンスタグが欠落する可能性は小さく、その点で抽出されたシーケンスタグの信頼性は高いということができる。

そして、ペプチド同定処理部はシーケンスタグサーチ法を用い、上記シーケンスタグ取得処理部により得られたシーケンスタグに基づいてペプチドを同定する。その際には、タグデータベース構築処理部において作成されたタグデータベースを用いてもよいし、一般的なタンパク質データベースを用いてもよい。ただし、それらデータベースには翻訳後修飾や変異を受けたペプチドが全て登録されているわけではないから、翻訳後修飾や変異を受けた可能性が高い場合には、それを条件としたデータベース検索を行うことが望ましい。

そこで、上記ペプチド同定処理部は、目的ペプチド由来のプリカーサイオンの質量とタグデータベースに登録されているプリカーサイオンの質量との差がある場合に、その差に相当する翻訳後修飾又は変異を受けているとの条件を付してデータベース検索を行うようにするとよい。

また、上述したように、タグデータベースには、シーケンスタグ毎に部分的なアミノ酸配列の開始点ピークと終点ピークの質量電荷比とが登録されており、これを実測ＭＳⁿスペクトルから得られるピークの質量電荷比と比較することで、プリカーサイオンの質量差がシーケンスタグのアミノ酸配列の相違によるものか、或いはシーケンスタグ以外のアミノ酸配列の相違によるものかを識別することが可能である。そこで、上記ペプチド同定処理部は、目的ペプチド由来のプリカーサイオンの質量と上記タグデータベースに登録されているプリカーサイオンの質量との差がある場合に、その差がシーケンスタグに対応するアミノ酸配列部分か否かを識別し、シーケンスタグに対応するアミノ酸配列部分に上記質量差がある場合には、その差に相当する翻訳後修飾又は変異を受けているように該シーケンスタグのアミノ酸配列を修正したうえでデータベース検索を行うようにするとよい。

これにより、シーケンスタグサーチに使用されるデータベースに、翻訳後修飾や変異を受けた目的ペプチドが登録されていない場合であっても、また、その翻訳後修飾や変異を受けているアミノ酸配列がペプチドのアミノ酸配列全長のいずれに存在する場合でも、正解の目的ペプチドを正しく同定できる可能性を高めることができる。

本発明に係る質量分析データ解析装置及び解析方法によれば、ペプチドを同定する際に用いられるデータベースに翻訳後修飾や変異を受けた目的ペプチドが登録されていない場合でも、目的ペプチドを高い確度で同定することができる。また、本発明に係る質量分析データ解析装置及び解析方法によれば、目的ペプチドに対して高い信頼度のシーケンスタグを求めてシーケンスタグサーチに供することができるので、翻訳後修飾や変異を受けているかいないかにかかわらず、高い精度で以てペプチドを同定することができる。

本発明に係る質量分析データ解析装置を含むタンパク質同定システムの一実施例の全体構成図。 本実施例のタンパク質同定システムにおける概略的なタンパク質同定処理の流れを示すフローチャート。 図２中のステップＳ１における処理の詳細なフローチャート。 タグデータベースに含まれる情報の一例を示す図。 図２中のステップＳ３における処理の詳細なフローチャート。 図２中のステップＳ４における処理の詳細なフローチャート。 図２中のステップＳ５の処理の結果、表示部の画面上に表示される表示例を示す図。 図２中のステップＳ５の処理の結果、表示部の画面上に表示される他の表示例を示す図。

以下、本発明に係る質量分析データ解析装置を含むタンパク質同定システムの一実施例について、添付図面を参照して説明する。図１は本実施例のタンパク質同定システムの全体構成図である。

本実施例のタンパク質同定システムは、質量分析計１と、スペクトルデータ収集部２と、データ解析部３と、入力部４と、表示部５と、タンパク質データベース６と、を備える。データ解析部３が本発明に係る質量分析データ解析装置に相当する要素であり、データ解析部３は、タグデータベース構築処理部３１、タグデータベース３２、シーケンスタグ取得処理部３３、ペプチド同定処理部３４、解析結果表示処理部３５、などの機能ブロックを含む。なお、図１ではデータ解析部３に含まれていないタンパク質データベース６を、データ解析部３に含むようにしてもよい。ここで、タンパク質データベース６は一般に公開されている様々なデータベース（例えばSwiss-Protデータベースなど）を利用することができる。
また、質量分析計１以外は、コンピュータを中心に構成することができ、主要な機能はコンピュータにインストールされた専用の制御・処理用ソフトウエアをコンピュータ上で実行することにより実現されるものとすることができる。

質量分析計１は特にその構成を問わないが、高い質量精度、質量分解能が要求される。例えば、エレクトロスプレイイオン化（ＥＳＩ）イオン源やＭＡＬＤＩイオン源を用いたイオントラップ飛行時間型質量分析計又はＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計などが用いられる。また、インソース分解を利用してもよい。

図２は、本システムにおける概略的なタンパク質同定処理の流れを示すフローチャートである。
このタンパク質同定システムでは、事前に、つまり目的とする被検試料中の未知ペプチドの同定の実行前に、タグデータベース構築処理部３１は、同定済みペプチドのアミノ酸配列及び実測ＭＳⁿスペクトル情報、並びにタンパク質データベース６に格納されている情報に基づいてタグデータベース３２を構築しておく（ステップＳ１）。

タグデータベース３２が構築されている状況の下で、質量分析計１により未知ペプチドを含む被検試料が測定され、スペクトルデータ収集部２は質量分析計１によって得られたマススペクトルデータ、ＭＳⁿスペクトルデータを収集して記憶する（ステップＳ２）。典型的にはｎは２であるＭＳ²スペクトルデータを収集すればよいが、場合によっては、ｎが３以上のＭＳⁿスペクトルデータが必要となる。

シーケンスタグ取得処理部３３は実測されたＭＳⁿスペクトルデータを読み込み、該スペクトルから抽出したピーク情報についてタグデータベース３２を用いたデータベース検索を行うことにより、実測データに対応する、つまりは同定対象である目的ペプチドに対応するシーケンスタグを求める（ステップＳ３）。通常、ここでは複数のシーケンスタグが求まる。

得られたシーケンスタグはペプチド同定処理部３４に引き渡され、ペプチド同定処理部３４はこのシーケンスタグの情報とＭＳⁿ分析実行時のプリカーサイオンの質量などの情報を用いたシーケンスタグサーチによるデータベース検索を行うことによって、目的ペプチドを同定する（ステップＳ４）。そして、解析結果表示処理部３５は、ペプチド同定処理部３４において同定されたペプチドについてタグデータベース３２を参照してタンパク質情報を取得し、ペプチドとタンパク質情報とを解析結果として表示部５に表示する（ステップＳ５）。

次に、図２中の各ステップについて詳細に説明する。図３は、主としてタグデータベース構築処理部３１により実施されるステップＳ１における処理の詳細なフローチャートである。
タグデータベース構築処理部３１はまず、既に同定された一つのペプチドの実測ＭＳⁿスペクトルにおいて検出されたピーク（フラグメントピーク）の情報（質量電荷比、信号強度など）を含むピークリスト、及び該ペプチドの同定されたアミノ酸配列を、そのペプチド及び該ペプチドを含むタンパク質の情報とともに読み込む（ステップＳ１０１）。次にタグデータベース構築処理部３１は、新たに読み込んだペプチドが含まれるタンパク質が既にタグデータベース３２に登録されているタンパク質であるか否かをチェックする（ステップＳ１０２）。未登録である場合には該タンパク質を登録対象とし（ステップＳ１０３）、次に読み込んだペプチドがタグデータベース３２に登録されているペプチドであるか否かをチェックする（ステップＳ１０４）。未登録である場合には該ペプチドを登録対象とし（ステップＳ１０５）ステップＳ１０６以降へと進む。ステップＳ１０４で既に登録済みのペプチドであると判定された場合には、ステップＳ１０４からＳ１０１へと戻り、別の同定済みのペプチドについて同じ処理を実施する。

一方、タグデータベース３２に未登録のペプチドであると判定されると、タグデータベース構築処理部３１は、そのペプチドのアミノ酸配列から理論的なフラグメントイオンの質量電荷比を計算する（ステップＳ１０６）。またタグデータベース構築処理部３１は、実測に基づくピークリスト中で主要なピークを抽出する。典型的には、信号強度が大きい順に所定の個数のピークを抽出し、各ピークの質量電荷比と信号強度を求めればよい（ステップＳ１０７）。そして、ペプチドのアミノ酸配列、理論的なフラグメントイオンの質量電荷比情報、及び実測に基づくピーク情報に基づいて、実測上観察される所定の配列長（所定のアミノ酸残基個数）の部分的アミノ酸配列を求め、これをシーケンスタグとして、該シーケンスタグに対応するｂ系列イオンの質量電荷比、ｙ系列イオンの質量電荷比などの情報を収集する（ステップＳ１０８）。

次いで、求めたシーケンスタグが翻訳後修飾又は変異を含むアミノ酸配列であるか否かを判定し（ステップＳ１０９）、翻訳後修飾又は変異を含むシーケンスタグである場合にはその旨を示すフラグを付加する（ステップＳ１１０）。そして、求めたシーケンスタグのアミノ酸配列と、そのシーケンスタグが得られたペプチドのアミノ酸配列やプリカーサイオンの質量、該ペプチドを含むタンパク質などの情報とを併せて、タグデータベース３２に登録する。この際、翻訳後修飾又は変異を含むシーケンスタグであることを示すフラグが付加されている場合には、その情報も併せて登録する（ステップＳ１１１）。そのあと、同定済みの他のペプチドがあればステップＳ１１２からＳ１０１へと戻り、上述の処理を繰り返すし、他のペプチドがなければ処理を終了する。

図４はタグデータベース３２に登録される情報の一例を示す図である。この例では、シーケンスタグのアミノ酸配列長をアミノ酸残基３個に限っており、一つのシーケンスタグの情報は、アミノ酸残基３文字で表されるタグ名称（図４中の「Tag」）、ｂ系列のフラグメントイオンの質量電荷比とピーク強度（図４中の「MassIonB」）、ｙ系列のフラグメントイオンの質量電荷比とピーク強度（図４中の「MassIonY」）、「Tag」に関連する最大強度のピークの質量電荷比（図４中の「PilotPeak1」）、「Tag」に関連する２番目に大きい強度のピークの質量電荷比（図４中の「PilotPeak2」）、翻訳後修飾や変異の有り／無し情報（図４中の「Modification Tag」）、タンパク質の識別番号（図４中の「ProteinID」）、及び、ペプチドの識別番号（図４中の「PeptideID」）、を含む。

図４から、同一タンパク質（つまり「ProteinID」が同一であるタンパク質）に含まれる同一のペプチド（つまり「PeptideID」が同一であるペプチド）から、複数のシーケンスタグが生成されていることが分かる。例えば図４において、「Tag」がＤＰＨ、ＰＨＡ、ＨＡＣ、ＡＣＹ、ＣＹＳ、ＹＳＴである６種類のシーケンスタグはいずれも、ProteinID＝１であるタンパク質に含まれ、PeptideID＝６であるペプチドから生成されたシーケンスタグである。このうち、「Tag」がＨＡＣ、ＡＣＹ、ＣＹＳである３種類のシーケンスタグは、翻訳後修飾又は変異を受けているシーケンスタグである。

上述したようにタグデータベース３２に含まれる情報は実際に同定されたペプチドに基づいて作成されたものであるから、高い信頼性を有している。もちろん、シーケンスタグのアミノ酸配列は短いので、シーケンスタグとペプチドとは一対一の関係とはならず、図４に例示したように、一つのペプチドに複数のシーケンスタグが対応付けられ、また逆に、異なる複数のペプチドに「Tag」が同一であるシーケンスタグが対応付けられる。

図５は、主としてシーケンスタグ取得処理部３３により実施されるステップＳ３における処理の詳細なフローチャートである。
シーケンスタグ取得処理部３３はまず、アミノ酸配列が未知である目的ペプチドに対して実測されたＭＳⁿスペクトルにおいて検出されたピークの情報（質量電荷比、信号強度など）を含むピークリストを読み込む（ステップＳ２０１）。次いで、読み込んだピークリストの中で信号強度が最大であるピークと信号強度が２番目に大きいピークとの二つのピークについて質量電荷比を求め、これら値がタグデータベース３２に登録されている「PilotPeak1」及び「PilotPeak2」に一致する（厳密には所定許容範囲内に収まる）ようなシーケンスタグをタグデータベース３２から抽出する（ステップＳ２０２）。

さらに、タグデータベース３２から抽出された複数のシーケンスタグについて、タグデータベース３２中の「MassIonB」及び「MassIonY」と質量電荷比が一致する実測ピークリスト中のピークの信号強度値に応じて、シーケンスタグ毎にスコアをつける（ステップＳ２０３）。そして、最終的に、先に抽出されたシーケンスタグの中でスコアが高いシーケンスタグを、目的のペプチドに対応するシーケンスタグとして選択する（ステップＳ２０４）。一般的には、一つのシーケンスタグが他のシーケンスタグよりも有意にスコアが高ければ、その一つのシーケンスタグを目的ペプチドに対応するシーケンスタグとして選択すればよいが、複数のシーケンスタグのスコアが近く有意な差がつかない場合には、複数のシーケンスタグを目的ペプチドに対応するシーケンスタグとして選択するとよい。

図６は、主としてペプチド同定処理部３４により実施されるステップＳ４における処理の詳細なフローチャートである。
ペプチド同定処理部３４は、ステップＳ３において決定された１又は複数のシーケンスタグに対応付けてタグデータベース３２に登録されているペプチドの質量Ｐtを該タグデータベース３２から取得する（ステップＳ３０１）。そして、そのペプチドの質量Ｐtと目的ペプチドをＭＳ²分析したときのプリカーサイオンの質量Ｐiとに差があるか否かを判定する。即ち、質量差ΔＰ＝｜Ｐi−Ｐt｜を計算し（Ｓ３０２）、このΔＰが所定許容値以下であるか否かを判定することにより質量差があるか否かを判断する（ステップＳ３０３）。

ステップＳ３０３において質量差が無いと判定された場合には、決定されたシーケンスタグは適切であると判断できる。そこで、上記ステップＳ３で選択されたシーケンスタグ、即ち「Tag」で示される部分的アミノ酸配列を含み、プリカーサイオンの質量電荷比、「Tag」で示される部分的アミノ酸配列からＣ末端方向の質量電荷比、及び、Ｎ末端方向の質量電荷比がいずれも一致するペプチドをタグデータベース３２から検索する（ステップＳ３０６）。

具体的には、例えば「Mascot Sequence Query」などのシーケンスタグサーチを実行すればよい。「Mascot Sequence Query」を用いる場合、データベース検索によりヒットしたペプチドにはその検索の信頼度を表すスコアや期待値などが付される。そこで、複数のペプチドがヒットした場合でも或る一つのペプチドの信頼度指標値が他のペプチドの信頼度指標値に比べて有意に高い場合には、そのペプチドのみを、同定したペプチドとして挙げればよい。一方、信頼度指標値に有意な差がつかない等、唯一のペプチドを同定できない場合には、可能性のある複数のペプチドを上記信頼度指標値とともに候補として選出すればよい。

一方、ステップＳ３０３において質量差ΔＰがあると判定された場合には、この質量差が翻訳後修飾又は変異によるものである可能性がある。そこで、ｂ系列、ｙ系列それぞれのフラグメントイオンの質量電荷比に同じ質量差ΔＰがあるか否かを判定することにより、シーケンスタグの部分に翻訳後修飾又は変異があるか否かを判定する（ステップＳ３０４）。フラグメントイオンの質量電荷比に質量差ΔＰがあると判定された場合には、シーケンスタグに翻訳後修飾又は変異があるものと判断できる。そこで、その質量差に応じて翻訳後修飾又は変異を想定してシーケンスタグのアミノ酸配列を修正し（ステップＳ３０５）たうえで、上述したステップＳ３０６へと進む。一方、フラグメントイオンの質量電荷比に上記質量差ΔＰがないと判定された場合、つまりシーケンスタグには翻訳後修飾や変異がないと判定された（ステップＳ３０４でＮｏ）場合には、その質量差から想定される既知の翻訳後修飾又は変異があるとの条件を付けて、シーケンスタグサーチ法などを用いたデータベース検索により、該当するペプチドを探索する（ステップＳ３０７）。

以上のようにして、本実施例のタンパク質同定システムにおけるデータ解析処理では、ペプチドに翻訳後修飾又は変異がある場合でも、該修飾や変異を受けた部分を或る程度推定したうえでデータベース検索によりペプチド探索を行うことができるので、高い精度での同定が期待できる。

図７及び図８はそれぞれ、ステップＳ４の処理の結果、表示部５の画面上に表示される表示例である。
この結果表示画面１００において、左上部のタグ検索結果表示欄１０１には、ステップＳ３における検索の結果として得られたシーケンスタグが一覧表示される。また右上部のペプチド検索結果表示欄１０２には、ステップＳ４における検索によって得られたペプチドのアミノ酸配列が一覧表示される。また、参考情報として、左下部には、このペプチドを含むタンパク質を示すタンパク質情報表示欄１０３が配置され、右下部には、タンパク質情報表示欄１０３中に表示された又はその中で選択されたタンパク質全体のアミノ酸配列を示すタンパク質アミノ酸配列表示欄１０４が配置されている。

図７に示した例では、目的ペプチドに対するＭＳ²分析の際のプリカーサイオンの質量電荷比は１５４４Daである。
図７中のタグ検索結果表示欄１０１には、ランク１位でヒットしたシーケンスタグのアミノ酸配列はＳＧＰでその検索の信頼度を示すスコアは３７であり、そのシーケンスタグはアミノ酸配列がＱＥＹＤＥＳＧＰＳＩＶＨＲ（質量１５１６．８６）であるペプチドの実測結果及び同定結果に基づいてタグデータベース３２に登録されたことが示されている。また、ペプチドの検索結果表示欄１０２には、アミノ酸配列がＱＥＹＤＥＳＧＰＳＩＶＨＲであるペプチドに対しシーケンスタグに相当する部分からＮ末端側に２７．８３８Daの翻訳後修飾又は変異を受けた（本例ではFormyl（N-term）と呼ぶ翻訳後修飾を受けた）ものがヒットしていることが示されている。
また、タンパク質アミノ酸配列表示欄１０４には、タンパク質のアミノ酸配列の中で検索によりヒットしたペプチド部分が赤文字でカラー表示されている（なお、図７ではカラー表示に代えて下線を付している）。これによって、同定されたペプチドがタンパク質全長の中でどの部分であるのかも、直感的に理解することができる。

図８に示した例では、目的ペプチドに対するＭＳ²分析の際のプリカーサイオンの質量電荷比は１５０２Daである。
この例では、アミノ酸配列がＡＧＰであるシーケンスタグが１位でヒットしているが、これはタグデータベース３２に登録されているアミノ酸配列ＳＧＰが変異を受けたものである。実測のプリカーサイオンの質量電荷比は１５０２Daであるが、これはプロトン１個分の質量（約１Da）だけ大きいので、シーケンスタグサーチ法によるデータベース検索では−１６．１６Da（＝１５００．７−１５１６．８６）の翻訳後修飾又は変異を受けているとの条件の下にデータベース検索を行い、ＱＥＹＤＥＳＧＰＳＩＶＨＲであるアミノ酸配列のＮ末端から６番目のアミノ酸残基ＳがＡに変異したペプチドを同定した。
タンパク質アミノ酸配列表示欄１０４には、タンパク質のアミノ酸配列の中で、検索によりヒットしたペプチド部分が赤文字でカラー表示されていることは図７と同様である。

このようにして、本実施例のタンパク質同定システムでは、翻訳後修飾や変異を受けたペプチドについても、ペプチドが的確に同定され、そのペプチドのアミノ酸配列や、該ペプチドを含むタンパク質の情報、さらにはタンパク質のアミノ酸配列中における同定されたアミノ酸配列の位置などが、結果表示画面１００により分かり易く分析者に提示される。

なお、このように同定されたペプチドに関する情報は、図３に示したフローチャートに従ってタグデータベース３２に登録されることが好ましい。それによって、新たなペプチドが同定される毎にタグデータベース３２自体が充実してゆくことになり、同定の精度向上が期待できる。

上記実施例では、目的ペプチドに対応するシーケンスタグが得られあとに、該シーケンスタグを用いたシーケンスタグサーチ法によるデータベース検索をタグデータベース３２に対して実行していた。これに対し、シーケンスタグを用いたシーケンスタグサーチ法によるデータベース検索を、一般のタンパク質データベース６に対して行うようにしてもよい。タグデータベース３２には同定されたペプチドに基づく情報しか登録されていないが、タンパク質データベース６にはより広範な情報が登録されているので、広範なタンパク質を検索対象とすることができる。これによって、例えば、マウスのタンパク質データベースを使用して、相同性の高いラットのタンパク質を同定することが可能になる。

また、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

１…質量分析計
２…スペクトルデータ収集部
３…データ解析部
４…入力部
５…表示部
６…タンパク質データベース
３１…タグデータベース構築処理部
３２…タグデータベース
３３…シーケンスタグ取得処理部
３４…ペプチド同定処理部
３５…解析結果表示処理部
１００…結果表示画面
１０１…タグ検索結果表示欄
１０２…ペプチド検索結果表示欄
１０３…タンパク質情報表示欄
１０４…タンパク質アミノ酸配列表示欄

Claims (8)

1. 被検試料に対してＭＳⁿ分析（ｎは２以上の整数）を実行することで収集されたＭＳⁿスペクトルデータに基づいて、該被検試料中の目的ペプチドを同定する質量分析データ解析装置であって、
   a)既知であるペプチドのアミノ酸配列及びＭＳⁿスペクトル情報から部分的なアミノ酸配列であるシーケンスタグと該シーケンスタグに対応するスペクトルピーク情報とを求めることで、予め、シーケンスタグについてのデータベースを構築しておくタグデータベース構築処理部と、
   b)被検試料に対して得られた実測のＭＳⁿスペクトルから抽出されるピーク情報を前記タグデータベース内の情報と照合することにより、目的ペプチドのシーケンスタグを取得するシーケンスタグ取得処理部と、
   c)前記シーケンスタグ取得処理部により得られた目的ペプチドに対するシーケンスタグと目的ペプチド由来のプリカーサイオンの質量とを検索条件として前記タグデータベース又はタンパク質データベースにおけるデータベース検索を行うことによりペプチドを同定するペプチド同定処理部と、
   を備えることを特徴とする質量分析データ解析装置。
2. 請求項１に記載の質量分析データ解析装置であって、
   前記タグデータベース構築処理部は、シーケンスタグのアミノ酸配列が翻訳後修飾又は変異を受けたものである場合に、それを示す情報を該シーケンスタグに対応付けて記録することを特徴とする質量分析データ解析装置。
3. 請求項１又は２に記載の質量分析データ解析装置であって、
   前記ペプチド同定処理部は、目的ペプチド由来のプリカーサイオンの質量と前記タグデータベースに登録されているプリカーサイオンの質量との差がある場合に、その差に相当する翻訳後修飾又は変異を受けているとの条件を付してデータベース検索を行うことを特徴とする質量分析データ解析装置。
4. 請求項３に記載の質量分析データ解析装置であって、
   前記ペプチド同定処理部は、目的ペプチド由来のプリカーサイオンの質量と前記タグデータベースに登録されているプリカーサイオンの質量との差がある場合に、その差がシーケンスタグに対応するアミノ酸配列部分か否かを識別し、
   シーケンスタグに対応するアミノ酸配列部分に前記差がある場合には、その差に相当する翻訳後修飾又は変異を受けているように該シーケンスタグのアミノ酸配列を修正したうえでデータベース検索を行うことを特徴とする質量分析データ解析装置。
5. 被検試料に対してＭＳⁿ分析（ｎは２以上の整数）を実行することで収集されたＭＳⁿスペクトルデータに基づいて、該被検試料中の目的ペプチドを同定する質量分析データ解析方法であって、
   a)既知であるペプチドのアミノ酸配列及びＭＳⁿスペクトル情報から部分的なアミノ酸配列であるシーケンスタグと該シーケンスタグに対応するスペクトルピーク情報とを求めることで、予め、シーケンスタグについてのデータベースを構築しておくタグデータベース構築処理ステップと、
   b)被検試料に対して得られた実測のＭＳⁿスペクトルから抽出されるピーク情報を前記タグデータベース内の情報と照合することにより、目的ペプチドのシーケンスタグを取得するシーケンスタグ取得処理ステップと、
   c)前記シーケンスタグ取得処理ステップにおいて得られた目的ペプチドに対するシーケンスタグと目的ペプチド由来のプリカーサイオンの質量とを検索条件として前記タグデータベース又はタンパク質データベースにおけるデータベース検索を行うことによりペプチドを同定するペプチド同定処理ステップと、
   を有することを特徴とする質量分析データ解析方法。
6. 請求項５に記載の質量分析データ解析方法であって、
   前記タグデータベース構築処理ステップでは、シーケンスタグのアミノ酸配列が翻訳後修飾又は変異を受けたものである場合に、それを示す情報を該シーケンスタグに対応付けて記録することを特徴とする質量分析データ解析方法。
7. 請求項５又は６に記載の質量分析データ解析方法であって、
   前記ペプチド同定処理ステップでは、目的ペプチド由来のプリカーサイオンの質量と前記タグデータベースに登録されているプリカーサイオンの質量との差がある場合に、その差に相当する翻訳後修飾又は変異を受けているとの条件を付してデータベース検索を行うことを特徴とする質量分析データ解析方法。
8. 請求項７に記載の質量分析データ解析方法であって、
   前記ペプチド同定処理ステップでは、目的ペプチド由来のプリカーサイオンの質量と前記タグデータベースに登録されているプリカーサイオンの質量との差がある場合に、その差がシーケンスタグに対応するアミノ酸配列部分か否かを識別し、
   シーケンスタグに対応するアミノ酸配列部分に前記差がある場合には、その差に相当する翻訳後修飾又は変異を受けているように該シーケンスタグのアミノ酸配列を修正したうえでデータベース検索を行うことを特徴とする質量分析データ解析方法。

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