TW202003050A

TW202003050A - 增強過繼輸注 t 細胞持久性的方法

Info

Publication number: TW202003050A
Application number: TW108109797A
Authority: TW
Inventors: 阿米爾艾爾佩特
Original assignee: 美商英麥提克斯股份有限公司
Priority date: 2018-03-21
Filing date: 2019-03-21
Publication date: 2020-01-16
Also published as: JP7344898B2; CA3094344A1; MA52138A; JP2021518121A; AU2019240039A1; EP3768330A4; EA202092243A1; WO2019183181A1; SG11202009082YA; CN112512593A; EP3768330A1; DE102018108612A1; KR20200133370A; US11905529B2; US20210017493A1; US20190292520A1

Abstract

本揭示提出了改善 T 細胞療效的方法。在一態樣中，本揭示進一步提出了增強用於過繼細胞轉移或治療 (ACT) 的 T 細胞的持久性的方法。透過本揭示進一步提出了能夠預測過繼輸注 T 細胞持久性的細胞因子敏感性測定 (CSA) 和相關方法。本揭示還提出了有此需要受試者的癌症治療方法以及透過本文描述的方法產生的 T 細胞群。

Description

增強過繼輸注　T　細胞持久性的方法

本申請主張 2018 年 3月 21 日提交的美國臨時申案第 62/646,180 號和 2018 年 4 月 11 日提交的德國專利申請案第 10 2018 108 612.1 號的優先權，各自內容透過引用整體併入本文。

過繼細胞轉移或治療 (ACT) 是一種免疫療法，其涉及離體分離和擴增抗原特異性 T 細胞，以便將該細胞過繼轉移回患者。儘管 ACT 在治療血液惡性病和黑色素瘤中已經獲得臨床益處，但其在治療大多數實體瘤中的療效通常有限，因為轉移的 T 細胞不能發揮作用並無法在體內持續存在。諸如對腫瘤相關抗原 (TAA) 的耐受性和抑制性腫瘤環境引起的腫瘤特異性 T 細胞抑制等因素可能導致這種失敗。此外，廣泛培養腫瘤特異性 T 細胞以獲得足夠數量以輸注給患者的必要性可極大地影響 T 細胞的品質。

T 細胞持久性被視為是 ACT 療效的驅動力，從而將 T 細胞持久性/年輕表型與臨床前和臨床結果相關聯。共同 γ 鏈 (γc)-細胞因子 IL-2 擴增 T 細胞，以增強培養 T 細胞並透過細胞因子介導的信號調節表型。高劑量的 IL-2 也已用於擴增 ACT T 細胞培養物。T 細胞強制表達 IL-2 會延長體外存活以及維持腫瘤特異性和功能。但是，IL-2 可促進 T 細胞的分化，這可能導致 ACT 使用存在不利表型。為了優化 ACT 的離體 T 細胞培養，根據描述，其他 γc-細胞因子（諸如：IL-7、IL-15 和 IL-21）在記憶 T 細胞形成、增殖和存活中發揮作用，導致 T 細胞分化程度較低，但仍能夠增強抗腫瘤反應。

美國專利 7,993,638 描述了針對需要癌症治療受試者的治療方法，包括給予受試者激活細胞毒性 T 淋巴細胞 (CTL)；給予受試者至少兩種影響 CTL 持久性的細胞因子，包括干擾素-α-2b 和白細胞介素-2 (IL-2)。

美國專利 2015/0017120 描述了在接受過繼細胞療法 (ACT) 的癌症受試者中延長轉移細胞持久性、刺激轉移細胞增殖或刺激對靶細胞群的 T 細胞介導免疫反應的方法，包括：給予接受 ACT 的癌症受試者一種藥代動力學延長的 IL-2，其用量可有效延長受試者中轉移細胞的持久性。

但是，仍然需要改善癌症患者的 ACT 結果。申請專利範圍中表徵的實施例提供了該技術問題的解決方案。

如本文所述，本揭示提出了改善 T 細胞療效和存活性的方法。

本揭示進一步提出了用於產生改善過繼免疫療法療效的 T 細胞的方法，包括：從至少一名健康供體、患者或個體獲得 T 細胞，激活 T 細胞，激活後擴增激活 T 細胞約 3 天至約 5 天，收集擴增 T 細胞用於輸注至該至少一名健康供體、患者或個體，其中，相較於激活後擴增約 7 天或更長時間的激活 T 細胞，擴增約 3 天至約 5 天的T 細胞的過繼免疫療法療效得到改善。

在一態樣中，本揭示提出了增加 T 細胞生長的方法，包括：從至少一名健康供體、患者或個體獲得 T 細胞，激活 T 細胞，激活後擴增激活 T 細胞約 3 天至約 5 天，收集擴增 T 細胞用於輸注至該至少一名健康供體、患者或個體，其中，相較於激活後擴增約 7 天或更長時間的激活 T 細胞，擴增約 3 天至約 5 天的T 細胞生長較多。

在另一態樣中，本揭示提出了減少過繼免疫療法中所用 T 細胞的細胞死亡的方法，包括：從至少一名健康供體、患者或個體獲得 T 細胞，激活 T 細胞，激活後擴增激活 T 細胞約 3 天至約 5 天，收集擴增 T 細胞用於輸注至該至少一名健康供體、患者或個體，其中，相較於激活後擴增約 7 天或更長時間的激活 T 細胞，擴增約 3 天至約 5 天的T 細胞的細胞死亡減少。

本揭示進一步提出了一些方法，其中激活 T 細胞在激活後擴增約 4 天，並且其中 T 細胞的過繼免疫療法療效大於激活後擴增約 7 天或更長時間的激活 T 細胞。

本揭示進一步提出了一些方法，其中激活 T 細胞在激活後擴增約 3 天，並且其中 T 細胞的過繼免疫療法療效大於激活後擴增約 6 天或更長時間的激活 T 細胞。

本揭示進一步提出了用於產生改善過繼免疫療法療效的 T 細胞的方法，包括：從至少一名健康供體、患者或個體獲得 T 細胞，激活 T 細胞，用病毒載體轉導激活的 T 細胞，激活後擴增轉導 T 細胞約 3 天至約 5 天，收集擴增的轉導 T 細胞用於輸注至該至少一名健康供體、患者或個體，其中，相較於激活後擴增約 7 天或更長時間的激活和轉導 T 細胞，擴增約 3 天至約 5 天的T 細胞的過繼免疫療法療效得到改善。

在一態樣中，本揭示提出了用於產生改善過繼免疫療法療效的 T 細胞的方法，包括：從至少一名健康供體、患者或個體獲得 T 細胞，激活 T 細胞，激活後擴增激活 T 細胞第一段時間，收集擴增 T 細胞用於輸注至該至少一名健康供體、患者或個體，其中，相較於激活後擴增第二段時間的激活 T 細胞，擴增第一段時間的T 細胞的過繼免疫療法療效得到改善；其中，該第一段時間短於該第二段時間。

在一態樣中，第一段時間為約 2 天至約 5 天，且該第二段時間為約 6 天至約 10 天；第一段時間為約 3 天至約 5 天，且該第二段時間為約 7 天至約 10 天；第一段時間為約 2 天至約 5 天，且該第二段時間為約 6 天至約 14 天；以及第一段時間小於約 6 天，且該第二段時間大於約 7 天。

在一態樣中，擴增 T 細胞為 CD4+ 和/或 CD8+ T 細胞。

在一態樣中，擴增 T 細胞表現為幼稚 T 細胞 (T_N ) 和/或幹記憶 T 細胞 (T_scm )/T 中央記憶 (T_cm ) 表型。

根據其他態樣，T 細胞被刺激物激活。

在另一態樣中，刺激物包括抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體。

在一態樣中，本文所述的 T 細胞用於需要癌症治療患者的過繼免疫療法，其中該癌症選自肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食道癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病 (CLL)、梅克爾細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、急性骨髓性白血病 (AML)、膽囊癌和膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌 (UBC)、急性淋巴母細胞性白血病 (ALL) 和子宮癌 (UEC) 所組成的組。

在一態樣中，本揭示提出了評估 T 細胞存活性的測定法，包括：從至少一名供體、患者或個體獲得 T 細胞，激活 T 細胞，將激活 T 細胞的第一部分擴增一段時間，在存在至少一種細胞因子的情況下培養擴增 T 細胞，在培養 T 細胞中測量細胞因子反應，識別產生最大細胞因子反應的該段時間，和使激活 T 細胞的第二部分擴增產生最大細胞因子反應的該段時間。

本揭示進一步提出了產生 T 細胞的方法，包括：從至少一名供體、患者或個體獲得 T 細胞，激活 T 細胞，將激活 T 細胞的第一部分隨時間擴增，在存在至少一種細胞因子的情況下培養擴增 T 細胞，在培養 T 細胞中測量細胞因子反應，識別產生最大細胞因子反應的一段時間，和使激活 T 細胞的第二部分擴增產生最大細胞因子反應的該段時間。

在一態樣中，T 細胞獲自至少一名健康供體、患者或個體。在另一態樣中，T 細胞獲自至少一名無癌症供體、患者或個體。

在一態樣中，T 細胞對所治療的患者是同種異體的。在另一態樣中，T 細胞對所治療的患者是自體的。

在一態樣中，本揭示提出了在培養之前冷凍激活 T 細胞的擴增第一部分。

在另一態樣中，本揭示提出了在培養之前解凍激活 T 細胞的冷凍擴增第一部分。

在又一態樣中，本揭示提出了在培養之前靜置激活 T 細胞的解凍擴增第一部分。

在另一態樣中，本揭示提出了在擴增前用病毒載體或非病毒載體轉導激活 T 細胞。

在本文所述的一態樣中，載體可以為一種病毒載體，諸如：表達 T 細胞受體 (TCR) 的逆轉錄病毒載體或表達 T 細胞受體 (TCR) 的慢病毒載體或表達 TCR 的非病毒載體（諸如：脂質體）。

在一態樣中，T 細胞擴增在激活後約 1 天至約 15 天、約 2 天至約 14 天、約 3 天至約 13 天、約 3 天至約 12 天、約 3 天至約 11 天、約 3 天至約 10 天、約 3 天至約 9 天、約 3 天至約 8 天、約 3 天至約 7 天、約 3 天至約 6 天、約 3 天至約 5 天、約 3 天至約 4 天、約 4 天至約 6 天或約 4 天至約 5 天的一段時間內測量。

在一態樣中，該至少一種細胞因子選自（白細胞介素）IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21 及其組合組成的組。

在另一態樣中，IL-2 的濃度為約 10 U/ml 至約 500 U/ml、約 10 U/ml 至約 450 U/ml、約 10 U/ml 至約 400 U/ml、約 10 U/ml 至約 350 U/ml、約 10 U/ml 至約 300 U/ml、約 10 U/ml 至約 250 U/ml、約 10 U/ml 至約 200 U/ml、約 10 U/ml 至約 150 U/ml、約 10 U/ml 至約 100 U/ml、約 10 U/ml 至約 50 U/ml、約 20 U/ml 至約 40 U/ml、約 25 U/ml 至約 35 U/ml 或約 30 U/ml 至約 35 U/ml。

在另一態樣中，本文提出的 IL-7 濃度為 0.1 ng/ml 至 50 ng/ml、0.1 ng/ml 至 45 ng/ml、0.1 ng/ml 至 40 ng/ml、0.1 ng/ml 至 35 ng/ml、0.1 ng/ml 至 30 ng/ml、0.1 ng/ml 至 25 ng/ml、0.1 ng/ml 至 20 ng/ml、0.1 ng/ml 至 15 ng/ml、0.1 ng/ml 至 10 ng/ml、0.1 ng/ml 至 5 ng/ml、0.1 ng/ml 至 4 ng/ml、0.1 ng/ml 至 3 ng/ml、0.1 ng/ml 至 2 ng/ml、0.1 ng/ml 至 1 ng/ml 或 0.1 ng/ml 至 0.5 ng/ml。

在另一態樣中，IL-15 的濃度為 0.1 ng/ml 至 50 ng/ml、0.1 ng/ml 至 45 ng/ml、0.1 ng/ml 至 40 ng/ml、0.1 ng/ml 至 35 ng/ml、0.1 ng/ml 至 30 ng/ml、0.1 ng/ml 至 25 ng/ml、0.1 ng/ml 至 20 ng/ml、0.1 ng/ml 至 15 ng/ml、0.1 ng/ml 至 10 ng/ml、0.1 ng/ml 至 5 ng/ml、0.1 ng/ml 至 4 ng/ml、0.1 ng/ml 至 3 ng/ml、0.1 ng/ml 至 2 ng/ml、0.1 ng/ml 至 1 ng/ml 或 0.1 ng/ml 至 0.5 ng/ml。

本揭示進一步提出了一些方法，其中細胞因子反應選自幼稚 T 細胞 (T_N ) 和/或幹記憶 T 細胞 (T_scm )/T 中央記憶 (T_cm ) 的增殖增加、細胞凋亡減少、細胞群增加及其組合的一或多種。

在一態樣中，靜置步驟在約 0.5 小時至約 48 小時、約 0.5 小時至約 36 小時、約 0.5 小時至約 24 小時、約 0.5 小時至約 18 小時、約 0.5 小時至約 12 小時、約 0.5 小時至約 6 小時、約 1 小時至約 6 小時、約 2 小時至約 5 小時、約 3 小時至約 5 小時、或約 1 小時至約 24 小時、約 2至約 24 小時、約 12至約 48 小時、約 0.5 小時至約 120 小時、約 0.5 小時至約 108 小時、約 0.5 小時至約 96 小時、約 0.5 小時至約 84 小時、約 0.5 小時至約 72 小時或約 0.5 小時至約 60 小時的一段時間內進行。

根據本揭示，在一態樣中，抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體各自的濃度為約 0.1 µg/ml 至約 10.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 8.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 6.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 4.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 2.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 1.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.8 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.6 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.25 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.3 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.4 µg/ml 或約 0.4 µg/ml 至約 0.5 µg/ml。

在另一態樣中，激活在約 1 小時至約 120 小時、約 1 小時至約 108 小時、約 1 小時至約 96 小時、約 1 小時至約 84 小時、約 1 小時至約 72 小時、約 1 小時至約 60 小時、約 1 小時至約 48 小時、約 1 小時至約 36 小時、約 1 小時至約 24 小時、約 2 小時至約 24 小時、約 4 小時至約 24 小時、約 6 小時至約 24 小時、約 8 小時至約 24 小時、約 10 小時至約 24 小時、約 12 小時至約 24 小時、約 12 小時至約 72 小時、約 24 小時至約 72 小時、約 6 小時至約 48 小時、約 24 小時至約 48 小時、約 6 小時至約 72 小時或約 1 小時至約 12 小時的時間段內進行。

在一態樣中，透過本文所述方法獲得的 T 細胞為 CD3⁺ CD8⁺ T 細胞。

在一態樣中，本揭示提出了透過利用本文所述方法和方法步驟評估 T 細胞存活性的方法。在一態樣中，本文所述方法僅包括體外方法步驟。在其他態樣中，本文所述方法不包括體內方法步驟。在又一態樣中，本文所述方法包括體外和體內進行的方法步驟的組合。

在一態樣中，本文所述方法不包括利用轉基因動物（例如，轉基因小鼠）進行的分析或評估。在又一態樣中，本文所述方法能夠比涉及利用轉基因動物（例如，轉基因小鼠）的方法更快地確定 T 細胞產生和/或 T 細胞存活性的條件。

在另一態樣中，本文所述方法提出了能夠用於輸注入有需要患者或受試者中的存活 T 細胞。在另一態樣中，本文所述方法在體外進行且可預測體內結果。在其他態樣中，本揭示提出了高通量體外測定方法，其可預測用於輸血 T 細胞的體內存活性。

在一態樣中，本說明書提出了能夠預測過繼輸注 T 細胞持久性的細胞因子反應 (CR) 測定和相關方法。在一態樣中，本說明書提出了細胞因子敏感性測定方法，其能夠測量體外擴增長度對於對細胞因子反應能力的影響且在不存在持續細胞因子刺激的情況下的存活。

在另一態樣中，本文所述方法可用於透過利用高通量體外方法確定哪些類型的 T 細胞在體內持續存在。

還提出了包含本文產生和所述的 T 細胞的藥物組合物。在另一態樣中，本文所述的藥物組合物包括藥物可接受載劑、賦形劑或其鹽。

透過本揭示進一步提出了透過本文所述方法產生的 T 細胞群。在一態樣中，T 細胞為工程化 T 細胞。

在一態樣中，本說明書提出了實體瘤中 T 細胞體內持久性的預測方法，包括：解凍擴增複數個擴增時間的冷凍保存 T 細胞，在不存在細胞因子的情況下靜置解凍 T 細胞，接種靜置的 T 細胞，培養接種 T 細胞至少一個時間週期，其中，在至少一個時間週期開始時，將一或多種細胞因子加入培養物中，其中，在至少一個時間週期結束時，該一或多種加入細胞因子被耗盡，在至少一個時間週期內的複數個時間點對培養 T 細胞進行取樣，測量取樣 T 細胞的細胞因子反應，從複數個擴增時間識別表現出最大細胞因子反應的取樣 T 細胞的擴增時間，和將擴增識別擴增時間的 T 細胞配製為用於治療實體瘤的組合物。

在另一態樣中，複數個擴增時間為激活後約 1 天至約 15 天、約 2 天至約 14 天、約 3 天至約 13 天、約 3 天至約 12 天、約 3 天至約 11 天、約 3 天至約 10 天、約 3 天至約 9 天、約 3 天至約 8 天、約 3 天至約 7 天、約 3 天至約 6 天、約 3 天至約 5 天、約 3 天至約 4 天、約 4 天至約 6 天或約 4 天至約 5 天。

在另一態樣中，一個週期時間週期為每個週期 1-10 天、每個週期 2-10 天、每個週期 3-10 天、每個週期 4-10 天、每個週期 5-10 天、每個週期 6-10 天、每個週期 7-10 天、每個週期 8-10 天或每個週期 9-10 天，

在另一態樣中，該至少一個週期時間週期為 1 個週期時間週期、2 個週期時間週期、3 個週期時間週期、4 個週期時間週期、5 個週期時間週期、6 個週期時間週期、7 個週期時間週期、8 個週期時間週期、9 個週期時間週期或 10 個週期時間週期。

在另一態樣中，實體瘤選自肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食道癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑色素瘤、乳腺癌、梅克爾細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、膽囊癌和膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌 (UBC) 和子宮癌 (UEC) 所組成的組。

在本文所述的一態樣中，與體外擴增較長時間的 T 細胞相比，最小擴增的工程化 T 細胞因幼稚性以及在體內增殖和持續存在的能力增加表現出更高的臨床療效。在一態樣中，相對於約 7 天至約 10 天的較長時間表達，最小擴增的工程化 T 細胞擴增約 3 天至約 5 天。

在本文所述的一態樣中，擴增約 3 天至約 5 天較短時間的 T 細胞透過1) 增殖、2) 減少細胞凋亡和 3) 持久性相較於透過相同方法但擴增時間增加至約 7 天至約 10 天產生的 T 細胞表現出細胞因子反應增加。

在一態樣中，過繼細胞轉移或治療 (ACT) 包括一種治療方法，其中細胞從供體移除、在體外培養和/或操作、並給予患者以治療疾病。在一些實施例中，轉移的細胞可能為自體細胞，這表示患者充當自己的供體。在一些實施例中，轉移的細胞可能為淋巴細胞（例如，T 細胞）。在一些實施例中，轉移的細胞可能在給予患者之前進行基因工程改造。例如，轉移的細胞可能被改造以表達對受關注抗原具有特異性的 T 細胞受體 (TCR)。在一個實施例中，轉移的細胞可能被改造以表達嵌合抗原受體 (CAR)。在某些實施例中，轉移的細胞可能被改造（例如，透過轉染或綴合）以表達增強細胞抗腫瘤活性的分子，諸如：細胞因子（IL-2、IL-12）、抗細胞凋亡分子（BCL-2、BCL-X）或趨化因子（CXCR2、CCR4、CCR2B）。在某些實施例中，轉移的細胞可能被改造以表達 CAR 和增強細胞抗腫瘤活性或持久性的分子。

在一態樣中，本揭示涉及一些方法，其中過繼細胞轉移或治療 (ACT) 的結果可透過向癌症受試者給予最小擴增的 T 細胞進行改善。

治療方法

在一態樣中，本文所述的擴增工程化 T 細胞可用於治療與細胞凋亡或分化過程異常相關的疾病（例如，細胞增殖性疾病或細胞分化性疾病，諸如，癌症）。可適合用本發明的方法治療的癌症非限制性實例描述如下。

細胞增殖和/或分化疾病的實例可能包括癌症（例如，癌、肉瘤、轉移性疾病或造血腫瘤疾病，例如，白血病）。轉移性腫瘤可起因於多種原發性腫瘤類型，包括但不限於攝護腺癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌和肝癌。因此，本揭示的組合物（例如，最小離體擴增的工程化 T 細胞）可給予患有癌症的患者。

本文所用的術語「癌症」（或「癌性」）、「過度增殖性」和「腫瘤性」可用於指具有自主生長能力的細胞（亦即，以快速增殖細胞生長為特徵的異常狀態或病症）。過度增殖性和腫瘤性疾病狀態可歸類為病理性的（亦即，表徵或構成疾病狀態），也可歸類為非病理性的（亦即，偏離正常但與疾病狀態無關）。這些術語旨在包括所有類型的癌性生長或致癌過程、轉移性組織或惡性轉化細胞、組織或器官（不論組織病理學類型或侵襲性階段如何）。「病理性過度增殖」細胞可能在以惡性腫瘤生長為特徵的疾病狀態中發生。非病理性過度增殖細胞的實例可能包括與傷口修復相關的細胞增殖。

術語「癌症」或「腫瘤」可用於指各種器官系統的惡性腫瘤（包括影響肺、乳腺、甲狀腺、淋巴腺和淋巴組織、胃腸器官和泌尿生殖道的惡性腫瘤）以及指腺癌（通常認為包括惡性腫瘤，諸如大多數結腸癌、腎細胞癌、攝護腺癌和/或睾丸腫瘤、非小細胞肺癌、小腸癌和食道癌）。關於本發明的方法，癌症可以為任何癌症，包括任何急性淋巴細胞癌、急性骨髓性白血病、肺泡橫紋肌肉瘤、骨癌、腦癌、乳腺癌、肛門癌、肛管癌或肛門直腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸癌、膽囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、外陰癌、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓性癌、子宮頸癌、神經膠質瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌、惡性間皮瘤、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、腹膜癌、網膜癌、及腸系膜癌、咽癌、攝護腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、軟組織癌、睾丸癌、甲狀腺癌、輸尿管癌、膀胱癌和消化道癌（諸如，例如食道癌、胃癌、胰腺癌、胃癌、小腸癌、胃腸道類癌瘤）、口腔癌、結腸癌和肝膽癌。

術語「癌」是指上皮或內分泌組織的惡性腫瘤，包括呼吸系統癌、胃腸系統癌、泌尿生殖系統癌、睾丸癌、乳腺癌、攝護腺癌、內分泌系統癌和黑色素瘤。示例性癌包括由子宮頸、肺、攝護腺、乳房、頭頸部、結腸和卵巢組織形成的癌。該術語還可能包括癌肉瘤，其包括由癌性和肉瘤組織組成的惡性腫瘤。「腺癌」是指源自腺體組織的癌或其中腫瘤細胞形成可識別腺體結構的癌。

增殖性疾病的其他實例可能包括造血腫瘤疾病。本文所用的術語「造血腫瘤疾病」可能包括涉及造血來源增生/腫瘤細胞的疾病，例如，源自骨髓、淋巴或紅細胞譜系或其前體細胞。優選地，該等疾病可能起因於分化差的急性白血病（例如，成紅細胞白血病和急性巨核細胞白血病）。其他示例性骨髓疾病可能包括但不限於急性早幼粒細胞白血病 (APML)、急性骨髓性白血病 (AML) 和慢性骨髓性白血病 (CML)（綜述於 Vaickus, L. (1991)Crit. Rev. in Oncol./Hemotol .11:267-97)；淋巴惡性腫瘤包括但不限於急性淋巴母細胞性白血病 (ALL)（其包括 B 系 ALL和 T 系 ALL）、慢性淋巴細胞白血病 (CLL)、幼淋巴細胞白血病 (PLL)、毛細胞白血病 (HLL) 和瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症 (WM)。其他形式的惡性淋巴瘤可能包括但不限於非霍奇金淋巴瘤及其變體、外周 T 細胞淋巴瘤、成人 T 細胞白血病/淋巴瘤 (ATL)、皮膚 T 細胞淋巴瘤 (CTCL)、大顆粒淋巴細胞白血病 (LGF)、霍奇金病和裏德-斯特恩伯格病。

本領域技術人員應當理解，足以減少腫瘤生長和大小的最小擴增的工程化 T 細胞的量或治療有效量不僅可能根據所選的特定組合物而且可能根據給藥途徑、所治療病症的性質、以及患者的年齡和狀况而有所變化，且最終由患者的醫生或藥劑師自行決定。可提供本發明方法中使用的最小擴增的工程化 T 細胞的時間長度因個體而不同。本領域技術人員應當理解，本文提及的治療可擴展至所述癌症和症狀的預防和治療。

術語「T 細胞」或「T 淋巴細胞」可能包括胸腺細胞、幼稚 T 淋巴細胞、未成熟 T 淋巴細胞、成熟 T 淋巴細胞、靜置 T 淋巴細胞或激活 T 淋巴細胞。適用於特定實施例的說明性 T 細胞群包括但不限於輔助性 T 細胞（HTL；CD4+ T 細胞）、細胞毒性 T 細胞（CTL；CD8+ T 細胞）、CD4+CD8+ T 細胞、CD4-CD8− T 細胞或其他任何 T 細胞子集。適用於特定實施例的其他說明性 T 細胞群包括但不限於表達以下一或多種標誌物的 T 細胞：CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD197 和 HLA-DR，且若需要，可透過陽性或陰性選擇技術進一步分離。

外周血單核細胞 (PBMC) 是指具有圓形細胞核的任何血細胞（亦即，淋巴細胞、單核細胞或巨噬細胞）。這些血細胞是免疫系統中抵抗感染和適應入侵者的關鍵組成部分。淋巴細胞群由 CD4+ 和 CD8+ T細胞、B 細胞和自然殺手細胞、CD14+ 單核細胞和嗜鹼性粒細胞/嗜中性粒細胞/嗜酸性粒細胞/樹突細胞組成。這些細胞通常使用 FICOLL™（一種分離血液層的親水性多糖）從全血或白細胞包中分離，單核細胞和淋巴細胞在血漿層下形成血沉棕黃層。在一個實施例中，「PBMC」是指包含至少 T 細胞和任選 NK 細胞以及抗原提呈細胞的細胞群。

術語「激活」指 T 細胞已被充分刺激而誘導可檢測細胞增殖的狀態。在特定的實施例中，激活還可與誘導細胞因子產生和可檢測的效應子功能相關。術語「激活的 T 細胞」尤其指正在增殖的 T 細胞。僅透過 TCR 產生的信號不足以完全激活 T 細胞，還需要一或多種輔助信號或共刺激信號。因此，T 細胞激活包括透過 TCR/CD3 複合體的主要刺激信號以及一或多種輔助共刺激信號。共刺激可以透過已經接受主要激活信號的 T 細胞的增殖和/或細胞因子產生來證明，諸如透過 CD3/TCR 複合體或透過 CD2 的刺激。

本文所使用的靜置 T 細胞意味著不分裂或產生細胞因子的 T 細胞。與激活的 T 細胞（約 12-15 微米）相比，靜置 T 細胞較小（約 6-8 微米）。

本文所使用的預引發 T 細胞為靜置 T 細胞，其已經預先激活至少一次並已從激活刺激中移除至少約 1 小時、至少約 2 小時、至少約 3 小時、至少約 4 小時、至少約 5 小時、至少約 6 小時、至少約 12 小時、至少約 24 小時、至少約 48 小時、至少約 60 小時、至少約 72 小時、至少約 84 小時、至少約 96 小時、至少約 108 小時或至少約 120 小時。或者，靜置可能在約 0.5 小時至約 120 小時、約 0.5 小時至約 108 小時、約 0.5 小時至約 96 小時、約 0.5 小時至約 84 小時、約 0.5 小時至約 72 小時、約 0.5 小時至約 60 小時、約 0.5 小時至約 48 小時、約 0.5 小時至約 36 小時、約 0.5 小時至約 24 小時、約 0.5 小時至約 18 小時、約 0.5 小時至約 12 小時、約 0.5 小時至約 6 小時、約 1 小時至約 6 小時、約 2 小時至約 5 小時、約 3 小時至約 5 小時或約 4 小時至約 5 小時的時間段內進行。預引發的 T 細胞通常具有記憶表型。

本揭示的實施例可能包括在不存在細胞因子或存在細胞因子（例如 IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21 或其組合，諸如：IL-7 + IL-15）的情況下靜置約 0.5 小時至約 48 小時、約 0.5 小時至約 36 小時、約 0.5 小時至約 24 小時、約 0.5 小時至約 18 小時、約 0.5 小時至約 12 小時、約 0.5 小時至約 6 小時、約 1 小時至約 6 小時、約 2 小時至約 5 小時、約 3 小時至約 5 小時、約 4 小時至 6 小時、約 1 小時至約 24 小時、約 2至約 24 小時、約 12至約 48 小時、約 0.5 小時至約 120 小時、約 0.5 小時至約 108 小時、約 0.5 小時至約 96 小時、約 0.5 小時至約 84 小時、約 0.5 小時至約 72 小時或約 0.5 小時至約 60 小時，例如：約 4小時至約 6 小時。

在適應性免疫反應期間和之後控制淋巴細胞擴增和收縮可能是維持健康免疫系統所必需的。淋巴細胞凋亡的外在和內在途徑可程式設計為在適當的時間消除細胞以確保免疫穩態。若沒有這種淋巴細胞凋亡屏障，激活淋巴細胞長時間持續存在和/或不加約束的積聚可導致免疫病理學、自身免疫和淋巴樣癌症。

圖 1 顯示，與大多數體細胞一樣，幼稚和記憶 T 細胞可在通常靜止的代謝狀態下工作並利用線粒體氧化磷酸化 (OXPHOS) 產生 ATP。但是，在 T 細胞受體 (TCR) 刺激後，即使在存在氧氣的情況下，反應的 T 細胞也迅速轉向使用糖酵解作用（Warburg 效應）。激活的 T 細胞可能增殖並獲得有效的效應子功能（例如，產生 IFN-γ），這可能與糖酵解代謝相關。在 T 細胞反應過程中細胞代謝的這些變化可能嚴重影響細胞存活和分化（包括記憶的產生）。但是，在該擴增和有氧糖酵解窗口期，效應子 T 細胞可能對再刺激誘導的細胞死亡 (RICD) 變得敏感。

再刺激誘導的細胞死亡 (RICD) 是一種細胞凋亡程序，其最終可設定感染期間效應子 T 細胞擴增的上限。RICD 的敏感性可能依賴於之前的激活、透過細胞因子（諸如，IL-2）的細胞週期誘導，以及隨後透過 TCR 傳播的強烈再刺激信號（其在亞組效應子中誘導細胞凋亡）。與效應子 T 細胞不同，幼稚和靜置記憶 T 細胞可能對 RICD 具有相對抗性。透過在抗原誘導的擴增期限制效應子 T 細胞數量，這種自我調節的死亡途徑可透過預防對宿主的過度、非特異性免疫病理學損傷來幫助維持免疫穩態。實際上，如 X聯淋巴增殖性疾病患者中所示，RICD 缺陷可導致過多的 T 細胞積聚和對宿主組織的致死性損傷。

細胞因子戒斷誘導的細胞死亡 (CWID) 是一種負責殺滅大多數效應子 T 細胞的細胞凋亡程序，由清除感染後細胞因子（例如 IL-2）水平減弱引發，且可挽救選定少數存活作為記憶 T 細胞。儘管過量的合成代謝（例如，糖酵解）可能使效應子 T 細胞更容易受 RICD 影響，但另一方面，分解代謝（例如，自噬和脂肪酸氧化 (FAO)）可保護來自不同記憶區室的 T 細胞免於細胞因子戒斷誘導的死亡。因此，CWID 敏感性可能在確定有哪些以及多少 T 細胞在收縮中存活並進入記憶庫中起主要作用，從而影響源自不同記憶亞組的二次反應。

CWID 和 RICD 可作為固線反饋應答程序在免疫反應的不同階段發揮作用，其受到細胞、抗原和細胞因子動態定位的影響。兩個過程都由抗原和 IL-2 以及其他生長/存活細胞因子的可用性精確調節。從機制上來說，這兩個過程都可能透過細胞凋亡的不同生化機制（稱為內源性和外源性途徑）來消除 T 細胞。內源性途徑受調節線粒體外膜電位 (MOMP) 的 Bcl-2 家族蛋白的相對表達控制。當線粒體去極化後，細胞色素 c 釋放可催化酶原 9 的裂解和激活。外源性細胞凋亡主要透過腫瘤壞死因子受體 (TNFR) 超家族（諸如，Fas）的死亡受體 (DR) 而收到信號。

CWID 誘導內源性細胞凋亡。戒斷 IL-2 或其他 γ 鏈細胞因子特異性地上調和激活 Bim，而 Bim 是一種拮抗抗細胞凋亡 Bcl-2 家族蛋白（例如，Bcl-2、Bcl-xL 和 Mcl-1）功能的關鍵促凋亡蛋白並激活 Bax，這導致線粒體透化。RICD 可歸因於透過 Fas 的外源性細胞凋亡信號，其可透過暴露於再刺激 T 細胞表面上的膜錨定 FasL 以順式或反式受到刺激。

由於分解代謝（亦即，自噬）可保護源自不同記憶區室的 T 細胞免受細胞因子戒斷誘導的死亡（亦即， CWID），因此，離體 T 細胞擴增的一個目的可能是增加記憶形成細胞（諸如：幼稚 T 細胞 (T_N ) 和/或幹記憶 T 細胞 (T_scm )/T 中央記憶 (T_cm ) 細胞）的數量。

圖 2 顯示了治療實體瘤和非實體瘤的常規 ACT T 細胞的差異。為了治療實體瘤，可透過抗 CD3 和抗 CD28 抗體激活 T 細胞，然後擴增一段時間。在實體瘤環境中激活/擴增的工程化 T 細胞擷取同源抗原與非實體瘤、非同源抗原和有限的細胞凋亡抑制物相比下降，因此可能經歷離體擴增期間誘導的內源性細胞凋亡途徑，例如：損傷誘導的細胞死亡 (DICD) 或 CWID。為了治療非實體瘤，在含有腫瘤和抗原提呈細胞的同源抗原富含環境的非實體瘤環境中激活/擴增的工程化 T 細胞不太可能因 CWID 經歷細胞凋亡，但比較可能因抗原刺激增加而經歷激活誘導的細胞死亡 (AICD)，表明治療實體瘤可能需要 T 細胞對 CWID 的承受力強於對 AICD 的承受力。

圖 3 顯示，為了測試體外擴增 T 細胞在細胞因子刺激戒斷中（例如，在實體瘤中）存活的能力，可使用細胞因子敏感性測定法。另一方面，為了測試體外擴增 T 細胞在重複 TCR 刺激中（例如，在非實體瘤中）存活和發揮作用的能力，可使用連續殺滅測定法。

表 1 總結了非實體瘤和實體瘤之間體內 T 細胞存活的差異。表 1：體內 T 細胞存活模型

由於靶向抗原剝奪環境中之實體瘤的ACT 中的體外擴增 T 細胞之存活可能比靶向非實體瘤者更依賴於細胞因子，因此，體外記憶形成和 CWID 減少對於靶向實體瘤的體外擴增 T 細胞比靶向非實體瘤者可能更為關鍵。因此，選擇可以在 ACT 中以高通量患者特異性方式在體內持續存在的 T 細胞類型可提高靶向實體瘤的臨床療效。本揭示的細胞因子敏感性測定法可用於預測和選擇哪些類型的擴增 T 細胞可在體內在抗原剝奪環境中持續存在。

T 細胞的來源

在 T 細胞擴增和基因修飾之前，可從受試者中獲得 T 細胞來源。T 細胞可從許多來源獲得，包括外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤。在某些實施例中，可使用本領域可獲得的任何數量的 T 細胞系。在某些實施例中，T 細胞可使用本領域技術人員已知的任何數量的技術（例如，Ficoll™ 分離技術）從受試者中採集的血液單位中獲得。在一個優選實施例中，來自個體循環血液的細胞可透過血液成分單採術獲得。血液成分單採術產品通常含有淋巴細胞，包括 T 細胞、單核細胞、粒細胞、B 細胞、其他有核白細胞、紅細胞和血小板。透過血液成分單採術收集的細胞可能進行洗滌，以除去血漿部分並將細胞置於合適的緩衝液或培養基中用於隨後的處理步驟。可用磷酸鹽緩衝鹽水 (PBS) 洗滌細胞，也可用缺乏鈣並且可能缺乏鎂或者可能缺乏許多（若不是全部的話）二價陽離子的洗滌溶液洗滌細胞。在沒有鈣的情況下初始激活步驟可能導致激活放大。如本領域普通技術人員應當容易理解的，洗滌步驟可透過本領域技術人員已知的方法完成，諸如：根據製造商的說明透過使用半自動「流經(flow-through)」離心機（例如，Cobe 2991 ceil 處理器、Baxter CytoMate 或Haemonetics Cell Saver 5）。洗滌後，可將細胞重懸浮於各種生物相容性緩衝液（諸如，例如，無 Ca³⁺ 、無 Mg²⁺ PBS、PlasmaLyte A）或含有或不含緩衝液的其他鹽水溶液中。或者，可除去血液成分單採樣本中不需要的組分，並將細胞直接重懸浮於培養基中。

在另一實施例中，可透過裂解紅細胞和耗盡單核細胞從外周血淋巴細胞中分離 T 細胞，例如，透過 PERCOLL™ 梯度離心或透過逆流離心淘洗法。可透過正選或負選技術進一步分離特定的 T 細胞亞群，諸如 CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+ 和 CD45RO+T 細胞。例如，在一個實施例中，可透過與抗 CD3/抗 CD28（亦即，3x28）-綴合珠（諸如，DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T）培育足以正選所需的 T 細胞的時間段來分離 T 細胞。

透過負選來富集 T 細胞群可透過針對負選擇細胞獨有的表面標誌物的抗體組合來實現。一種方法可以是透過負磁免疫性黏附或流式細胞術進行的細胞分選和/或選擇，其使用針對存在於負選擇細胞上的細胞表面標誌物的單克隆抗體混合物。例如，為了透過負選富集CD4+ 細胞，單克隆抗體混合物通常可包括 CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR 和 CD8 的抗體。在某些實施例中，可能需要富集或正選調節性 T 細胞，其通常可表達 CD4+、CD25+、CD62L1、GITR+ 和 FoxP3+。或者，在某些實施例中，T 調節細胞可被抗 CD25 綴合珠或其他類似選擇方法耗盡。

為了透過正選或負選而分離所需的細胞群，細胞和表面（例如，諸如珠等顆粒）的濃度可不同。在某些實施例中，可能需要顯著降低體積，其中珠和細胞可混合在一起（亦即，增加細胞濃度），以確保細胞和珠的最大接觸。例如，在一個實施例中，可使用 20 億個細胞/ml 的濃度。在一個實施例中，可使用 10 億個細胞/ml 的濃度。在另一實施例中，可使用大於 1 億個細胞/ml。在另一實施例中，可使用 1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 或 5 千萬個細胞/ml 的細胞濃度。在再一實施例中，可使用 7.5、8、8.5、9、9.5 千萬或 1 億個細胞/ml 的細胞濃度。在進一步的實施例中，可使用 1.25 或 1.5 億個細胞/ml 的濃度。使用高濃度可導致增加的細胞產量、細胞激活和細胞擴增。此外，使用高細胞濃度可允許更有效地捕獲可能弱表達受關注靶抗原的細胞（諸如，CD28 陰性 T 細胞）或者來自存在許多腫瘤細胞的樣本（亦即，白血病血液、腫瘤組織等）的細胞。此類細胞群可能具有治療價值並且是期望獲得的。例如，使用高濃度細胞可允許更有效地選擇 CD28 表達通常較弱的 CD8+ T 細胞。在一相關實施例中，可能需要使用較低濃度的細胞。透過顯著稀釋 T 細胞和表面的混合物（例如，諸如珠等顆粒），可以使顆粒和細胞之間的相互作用最小。這可能選擇表達大量與顆粒結合的所需抗原的細胞。

無論是在 T 細胞的基因修飾之前還是之後，該等細胞一般均可透過使用，例如：美國專利號 6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041 和美國專利申請公開案號 2006/0121005 所述的方法進行激活和擴增。這些專利和申請案各者的內容透過完整引用併入本文。擴增 T 細胞群的其他策略描述參見，例如：Dudley等人Journal of Immunotherapy 2003; 26:332-42；Rasmussen等人，Journal of Immunological Methods 2010; 355:52-60；以及Somerville等人，Journal of Translational Medicine 2012; 10:69。前述參考文獻的全部內容透過引用整體併入本文。

給予自體細胞

自體細胞可透過本領域已知的任何合適途徑給予。優選地，細胞可以動脈內或靜脈內輸注給予，持續約 30 至約 60 分鐘。其他代表性給藥途徑可包括腹膜內、鞘內和淋巴管內給藥。

同樣地，可給予任何合適劑量的自體細胞。例如，在一個實施例中，可給予約 1.0×10⁸ 個細胞至約 1.0×10¹² 個細胞。在一個實施例中，可給予約 1.0×10¹⁰ 個細胞至約 13.7×10¹⁰ 個 T 細胞，平均大約 5.0×10¹⁰ 個 T 細胞。或者，在另一實施例中，可給予約 1.2×10¹⁰ 至約 4.3×10¹⁰ 個 T 細胞。

在一個實施例中，用於 ACT 的自體細胞可能為淋巴細胞（例如，T 細胞）。在一個實施例中，T 細胞可為「年輕」（例如，19-35 天齡）T 細胞，例如，美國專利號 8,383,099 中所述，其內容透過引用整體併入本文。年輕 T 細胞被認為比老 T 細胞具有更長的端粒，且在一些情況下，更長的端粒長度可能與改善 ACT 後臨床結果相關。

在一態樣中，本文所述的 T 細胞和 T 細胞產生方法可與 ACT 的一或多種代表性策略結合使用：腫瘤浸潤淋巴細胞 (TIL)、抗原擴增的CD8+ 和/或CD4+ T 細胞、經基因修飾以表達特異性識別腫瘤抗原的 T 細胞受體 (TCR) 的 T 細胞、以及經基因修飾以表達嵌合抗原受體 (CAR) 的 T 細胞。這些方法中每一種方法的簡要和非限制性描述如下。

腫瘤浸潤淋巴細胞 (TIL)

一種 ACT 策略涉及從腫瘤片段或腫瘤轉移灶的單細胞酶消化物離體擴增的自體 TIL 移植。腫瘤中的 T 細胞浸潤本質上為多克隆的，並且總體識別多種腫瘤抗原。例如，請參見 Rosenberg等人，N. Engl. J. Med. (1988) 319:1676-1680，其內容透過引用整體併入本文。

在一示例性 TIL ACT 方案中，可切除患者的腫瘤並在無菌條件下切成小的（例如，3-5 mm² ）片段。可將片段置於具有生長培養基的培養板或燒瓶中，並用高劑量 IL-2 處理。此初始 TIL 擴增期（也稱為「REP 前」期）通常持續約 3 至約 5 周，在此期間可產生約 5×10⁷ 或更多的 TIL。然後，可對所得的 TIL 以進一步擴增（例如，遵循快速擴增方案 (REP)）以產生適於輸注到受試者的 TIL。REP 前的 TIL 可冷凍保存供較晚擴增，也可立即擴增。還可篩選 REP 前 TIL 以在擴增前識別具有高抗腫瘤反應性的培養物。典型的 REP 可能涉及在存在輻照 PBMC 飼養細胞下使用 T 細胞刺激抗體（例如，抗CD3 mAb）激活 TIL。飼養細胞可從患者或健康供體受試者中獲得。可以將約 6,000 U/mL 濃度的 IL-2 加入 REP 培養物以促進 TIL 細胞快速分裂。以這種方式擴增 TIL 可能需要大約 2 周或更長時間，並可形成約 100-1,500 億個 TIL 的細胞庫。擴增細胞可進行洗滌和合併，並可適合於輸注到患者體內。患者通常可接受 10⁹ ~ 10¹¹ 個細胞 1 或 2 次輸注（間隔 1-2 周）。給予患者高劑量 IL-2 治療（例如，每 8 小時 7.2×10⁵ IU/kg，持續約 2 至約 3 天）以有助於對輸注後的 TIL 細胞提供支持。例如，請參見 Rosenberg等人，Nat. Rev. Cancer (2008) 8:299-308，其內容透過引用整體併入本文。輸注之前，患者可任選地接受使用環磷醯胺 (Cy) 和氟達拉濱 (Flu) 進行淋巴細胞清除。例如，請參見 Dudley 等人，Science (2003) 298:850-854，其內容透過引用整體併入本文。另外，為了防止再次出現內源性調節性 T 細胞 (Treg)，併用全身輻照 (TBI) 與淋巴細胞清除，例如，請參見 Dudley等人，J. Clin. Oncol. (2008) 26(32):5233-5239，其內容透過引用整體併入本文。

向接受 ACT 方案的受試者輸注最小擴增的 TIL 可提升轉移細胞的持久性，刺激轉移細胞的持久性、增殖和存活，並改善腫瘤消退。

抗原擴增的 CD8+ 和 / 或 CD4+ T 細胞

可用抗原體外刺激自體外周血單核細胞 (PBMC) 以產生可用於 ACT 的腫瘤抗原特異性或多克隆 CD8 +和/或 CD4+ T 細胞克隆。例如，請參見 Mackensen等人，J. Clin. Oncol . (2006) 24(31): 5060-5069；Mitchell等人，J. Clin. Oncol . (2002) 20(4):1075-1086；Yee等人，Proc. Natl. Aad. Sci. USA (2002) 99(25):16168-16173；Hunder等人，N. Engl. J. Med . (2008) 358(25):2698-2703；Verdegaal等人，Cancer Immunol. Immunother . (2001) 60(7):953-963，各自內容透過引用併入本文。為了避免從幼稚 PBMC 群擴增腫瘤特異性 T 細胞的過程耗時且勞動密集，最近描述了一種方法，其中可使用表達 HLA-A0201、共刺激分子和膜結合細胞因子的人工抗原提呈細胞 (aAPC) 多重刺激自體 PBMC 從而產生用於 ACT 的抗原特異性 T 細胞。例如，請參見 Suhoski等人，Mol. Ther. (2007) 15(5):981-988；Butler等人，Sci. Transl. Med . (2011) 3(80):80ra34，其內容透過引用整體併入本文。

在一個實施例中，可透過體外用一或多種可任選地從載體表達之癌症抗原（包括其抗原部分，諸如，表位或細胞），在存在 T 細胞生長因子（諸如， 300 IU/ml IL-2 或 IL-15）的情況下（優選為IL-2）刺激外周血單核細胞 (PBMC) 來快速擴增 T 細胞。可透過使用脈衝到表達 HLA-A2 的抗原提呈細胞上的相同癌症抗原再刺激而快速擴增體外誘導的 T 細胞。或者，可用例如經輻照的自體淋巴細胞或用經輻照的 HLA-A2+ 同種異體淋巴細胞和 IL-2 再刺激該等 T 細胞。

在一個實施例中，細胞群可富集 CD8+ T 細胞。例如，T 細胞培養物可使用 CD8 微珠分離（例如，使用 Clini-MACSPplus CD8 微珠系統 (Miltenyi Biotec^TM )）耗盡 CD4+ 細胞和富集 CD8+ 細胞。富集 CD8+ T 細胞可透過去除 CD4+ T 調節細胞而改善 ACT 的結果。

向接受 ACT 方案的受試者輸注最小擴增的 T 細胞（例如，從 PBMC 刺激中獲得 CD8+ 和/或 CD4+ T 細胞），可提升轉移細胞的持久性，刺激轉移細胞的持久性、增殖和存活，並改善腫瘤消退。

經基因修飾以表達特異性識別腫瘤抗原的 T 細胞受體 (TCR) 的 T 細胞

在一些情況下，可能無法獲得 ACT 所需的量之對腫瘤抗原具有高親合力的 TIL。因此，可能需要對淋巴細胞進行基因修飾，以獲得可在輸注入受試者之前特異性識別受關注抗原的細胞群。編碼 TCR 的基因可以從以高親合力特異性識別癌抗原的 T 細胞中分離。從外周血中分離的 T 淋巴細胞可用逆轉錄病毒或慢病毒轉導，該病毒含有編碼具有所需特異性的 TCR 的基因。此方法可允許快速產生用於 ACT 的大量腫瘤抗原特異性 T 細胞。

可使用 Heemskerk等人Hum Gene Ther . 19:496-510 (2008) 和 Johnson等人Blood 114:535-46 (2009) 中描述的轉導技術轉導 T 細胞，以表達對癌抗原具有抗原特異性的 T 細胞受體 (TCR)。這些參考文獻的內容透過引用整體併入本文。使用經基因修飾以表達 TCR（可識別受關注抗原）的 T 細胞的 ACT 可根據 Morgan等人，Science (2006) 314(5796):126-129 公開的臨床試驗方案進行。此參考文獻的內容透過引用整體併入本文。

向接受 ACT 方案的受試者輸注最小擴增的 T 細胞（例如，經基因工程改造以表達識別腫瘤抗原之 TCR（或經修飾的 TCR）的 T 細胞），可提升轉移細胞的持久性，刺激轉移細胞的持久性、增殖和存活，並改善腫瘤消退。

在一態樣中，能夠與本文所述的方法和實施例一起使用的 TAA 肽包括，例如，美國專利公開號 20160187351、美國專利公開號 20170165335、美國專利公開號 20170035807、美國專利公開號 20160280759、美國專利公開號 20160287687、美國專利公開號 20160346371、美國專利公開號 20160368965、美國專利公開號 20170022251、美國專利公開號 20170002055、美國專利公開號 20170029486、美國專利公開號 20170037089、美國專利公開號 20170136108、美國專利公開號 20170101473、美國專利公開號 20170096461、美國專利公開號 20170165337、美國專利公開號 20170189505、美國專利公開號 20170173132、美國專利公開號 20170296640、美國專利公開號 20170253633、美國專利公開號 20170260249、美國專利公開號 20180051080 和美國專利公開號 20180164315 所述的 TAA 肽，本文所述的這些專利公開案和序列表各項內容透過引用整體併入本文。在一態樣中，本文所述的 T 細胞選擇性地識別提呈上述一或多個專利和公開案中所述 TAA 肽的細胞。

在一態樣中，能夠與本文所述方法一起使用的 T 細胞受體包括，例如，美國專利公開號 20170267738、美國專利公開號 20170312350、美國專利公開號 20180051080、美國專利公開號 20180164315、美國專利公開號 20180161396、美國專利公開號 20180162922、美國專利公開號 20180273602、美國專利公開號 20190002556、美國專利公開號 20180135039 中所述的方法，這些專利公開案的各項內容透過引用整體併入本文。

在另一態樣中，能夠與本文所述的方法和實施例一起使用的 TAA 包括選自 SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 157 的至少一種。在一態樣中，T 細胞選擇性地識別提呈 SEQ ID NO:1-157 或本文所述任何專利或申請案中所述 TAA 肽的細胞。

經基因修飾以表達嵌合抗原受體 (CAR) 的 T 細胞

基因工程改造T 細胞以表達如上述具有所需特異性的 TCR 可能是非常有前景的 ACT 方法。儘管如此，仍然存在工程化 TCR α 和 β 鏈與內源性 TCR 鏈錯配的可能性。此外，使用表達工程化 TCR 的細胞的 ACT 是否能成功取決於在被靶向癌細胞中由 TCR 所識別的特定 MHC 分子的表達情況。為了避免這些可能的複雜情況，T 細胞可替代地經工程改造以表達嵌合抗原受體 (CAR)。

CAR 的最簡單形式可能含有與跨膜結構域偶聯的抗原結合結構域和來自 CD3 ζ 鏈細胞質尾部的信號傳導結構域。有證據表明 CD3 ζ 鏈可能不足以完全激活轉導 T 細胞。因此，CAR 可優選含有抗原結合結構域、共刺激結構域和 CD3 ζ 信號傳導結構域。共刺激結構域與 CD3 ζ 信號傳導結構域組合使用模擬 T 細胞激活的雙信號模型。CAR 抗原結合結構域可以為抗體或抗體片段，諸如，Fab 或 scFv。

抗原結合結構域透過跨膜結構域與CD3 ζ 信號傳導結構域和共刺激結構域分開。跨膜結構域可衍生自任何跨膜蛋白。在一個實施例中，可使用與 CAR 中的一個結構域天然相關的跨膜結構域。在另一實施例中，使用了外源或合成跨膜結構域。在一些實施例中，可選擇跨膜結構域或透過氨基酸取代來修飾跨膜結構域，以最小化與其他膜蛋白的相互作用。

可在 CAR 的細胞外結構域和跨膜結構域之間或在 CAR 的細胞質結構域和跨膜結構域之間任選地摻入一間隔區。該間隔區可為任何寡肽或多肽，其功能是將跨膜結構域連接到細胞外結構域或細胞質結構域。間隔區可含有至多 300 個氨基酸，優選為 10 至 100 個氨基酸，且更優選為 25 至 50 個氨基酸。

CAR 的細胞內結構域可能負責激活免疫細胞的至少一種正常效應子功能，該免疫細胞中表達 CAR。效應子功能可包括：例如，細胞溶解活性或輔助活性，諸如，分泌細胞因子。因此，分子的細胞內信號傳導結構域可能指蛋白質的一部分，其轉導效應子功能信號並指導細胞執行專門功能。儘管可使用整個細胞內信號傳導結構域，但是在許多情況下可能使用細胞內結構域的一部分，只要所選部分可轉導效應子功能信號即可。CAR 的細胞質結構域可包括 CD3 ζ 信號傳導結構域自身或與共刺激結構域組合。共刺激結構域包含共刺激分子的細胞內結構域。共刺激分子可能為促進淋巴細胞對抗原有效反應的細胞表面分子。在一些實施例中，共刺激結構域可能含有共刺激分子的細胞內結構域，諸如：4-1BB、CD27、CD28、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83 配體或其組合。在一示例性實施例中，共刺激分子可為 4-1BB 或 CD28 的細胞內結構域。

向接受 ACT 方案的受試者輸注最小擴增的 T 細胞（例如，經基因工程改造以表達識別腫瘤抗原之 CAR 的 T 細胞），可提升轉移細胞的持久性，刺激轉移細胞的持久性、增殖和存活，並改善腫瘤消退。

如上所述，治療實體瘤可能需要 T 細胞對 CWID 的承受力強於對 AICD 的承受力。確定製造的 T 細胞在同源抗原限制實體瘤環境中之持久性的常規方法通常取決於動物模型。相反地，本揭示的實施例使用體外測定法作為替代方法來確定可增強體內 T 細胞持久性的 T 細胞製造條件。為此，可在非同源抗原或低同源抗原環境中測試製造的 T 細胞。例如，在不存在同源抗原提呈細胞（例如：同源抗原提呈腫瘤細胞、樹突細胞或巨噬細胞）的情況下，製造的 T 細胞可以以低密度在培養物中接種，例如，約 1,000 至約 1x10⁶ 個細胞/cm² 、約 1,000 至約 500,000 個細胞/cm² 、約 1,000 至約 250,000 個細胞/cm² 、約 1,000 至約 200,000 個細胞/cm² 、約 1,000 至約 150,000 個細胞/cm² 、約 1,000 至約 100,000 個細胞/cm² 、約 1,000 至約 50,000 個細胞/cm² 、約 1,000 至約 10,000 個細胞/cm² 或約 1,000 至約 5,000 個細胞/cm² 。為了在細胞因子刺激減少的環境中測試製造的 T 細胞，製造的 T 細胞可在非同源抗原或低同源抗原環境中在存在低濃度（例如：約 1 至約 1,000 ng/ml、約 1 至約 500 ng/ml、約 1 至約 250 ng/ml、約 1 至約 100 ng/ml、約 1 至約 50 ng/ml、約 5 至約 50 ng/ml、約 5 至約 40 ng/ml、約 5 至約 30 ng/ml、約 5 至約 20 ng/ml 或約 5 至約 10 ng/ml）細胞因子的情況下培養一段長時間，例如，約 1 至約 30 天、約 2 至約 25 天、約 3 至約 21 天、約 3 至約 14 天、約 3 至約 10 天或約 3 至約 7 天。實例：

實例 1

細胞因子敏感性測定法 (CSA)

為了研究離體 T 細胞擴增長度對 T 細胞合適性的作用，製造 T 細胞 4 天、7 天或 10 天。在此製造後，透過 CSA 分析 T 細胞並分析以下指標：(1) 透過 T 細胞的倍數生長測得的細胞存活，(2) 透過碘化丙啶和膜聯蛋白-V 染色測得的細胞凋亡，(3) 透過稀釋增殖染料 PkH67 測得的分裂，(4) 透過流式細胞術測得的細胞因子受體表達，和 (5) 透過流式細胞術測得的 T 細胞記憶表型。

CSA 顯示，透過以下觀察評估，在 CSA 內進行評估時，擴增時間延長可能導致 T 細胞合適性顯著降低：(1) T 細胞存活降低，(2) 細胞凋亡增加，(3) 分裂速率下降，(4) 細胞因子受體表達相關性，和 (5) T_naïve/scm 區室存活降低。

CSA 進行 21 天，每份樣本在 7 個時間點進行分析，這可定義時間行為的單個指標。為此目的，計算時間資料的曲線下面積（積分），並將其用作代表以下結果中 21 天內樣本行為的單個定義指標。

可從健康的同種異體供體或患者中獲得血液成分單採 T 細胞。這些 T 細胞可在存在 IL-2 的情況下用激活抗 CD3 抗體（例如，OKT3）、或者在存在 IL-2 的情況下用抗 CD3-和抗 CD28 抗體包覆的順磁珠、或者用表達 4-1BBL 和 Fc 受體的人工抗原提呈細胞 (aAPC) 用 OKT3 和 IL-2 來激活或刺激。然後可使用逆轉錄病毒或慢病毒平臺用重組 TCR 來轉導激活的 T 細胞。轉導的 T 細胞可擴增不同的時間長度，例如，4 天（第 4 天）、7 天（第 7 天）或 10 天（第 10 天），其中激活於第 0 天開始。由於重組 TCR 可摻入 T 細胞基因組，因此，擴增期間產生的所有子細胞也可表達重組 TCR。擴增/轉導的 T 細胞可立即使用，也可冷凍保存供將來使用。

圖 4 顯示了本文所述的細胞因子敏感性測定法的一實施例。圖 4 中，冷凍保存或冷凍的擴增 TCR 轉導的 T 細胞（例如，4 天、7 天或 10 天）可在沒有細胞因子的情況下解凍並靜置 4 小時，然後以有限的數量（例如，2 x 10⁵ 個細胞/孔）加入細胞培養孔中。可加入以變化濃度的增殖染料（例如 PkH26 染料）和各細胞因子（例如，IL-2、IL-15、IL-7 或其組合），並且培育一段時間（例如，21 天）。可在 21 天的測定期間每 7 天（亦即，在第 0 天、第 7 天和第 14 天）將新鮮細胞因子加至培養的 T 細胞中。在測定中每 7 天即將結束時，與測定開始時相比，培養基的細胞因子水平降低。在測定的不同時間，可收集擴增的工程化 T 細胞，並例如透過膜聯蛋白-V 染色、記憶表型（例如，CD45RO 和 CCR7 標誌物）和細胞因子受體表達（例如 IL-2 受體 (CD25)、IL-7 受體 (CD127) 和 IL-15 受體 (CD122)）來分析細胞數量、增殖、凋亡。

實例 2

為期 21 天的測定中 ， T 細胞體外擴增時間縮短表現出持久的 T_scm 樣表型 （ 體內療效所需 ）

圖5A-5D 顯示了 TCR 轉導 T 細胞的表型，該等 T 細胞從健康供體中獲得並擴增 (A) 0 天、(B) 4 天、(C) 7天和 (D) 10 天。擴增 T 細胞與淋巴細胞透過 CD45RO 染色分離，隨後透過 CCR7 染色以區分 T_naïve /T_scm (CD45RO-CCR7+)，例如：23.2%（第 4 天擴增的 T 細胞）、16.4%（第 7 天擴增的 T 細胞）和 22.9%（第 10 天擴增的 T 細胞）。與第 0 天（49.4%，未擴增）相比，第 4 天、第 7 天和第 10 天擴增的 T 細胞顯示T_scm 樣表型的細胞數量下降。

為了檢查細胞因子剝奪對 TCR 轉導 T 細胞的影響，在存在 IL-15 的情況下將擴增 4 天、7 天或 10 天的 T 細胞培養 21 天。在 21 天的測定期間，每 7 天（亦即第 0 天、第 7 天和第 14 天）向培養的 T 細胞中加入新鮮的IL-15 (10 ng/ml)。當培養物中的 IL-15 水平最低時，在每 7 天 IL-15 加料結束時（亦即第 7 天、第 14 天和第 21 天）使用 CD45RO 和 CCR7 染色透過流式細胞術檢查 T_scm 樣表型。

圖6A-6I 指示，在整個 21 天的測定中，透過保留 T_scm 樣（亦即， T_naive /T_scm ）細胞群，第 4 天擴增的 T 細胞顯示了更好的 IL-15 敏感性。由於 T_scm 樣表型與體內 T 細胞持久性相關，因此，這些結果表明，較早（例如，約 4 天）擴增的工程化 T 細胞可能比擴增較長時間（例如，大於或等於約 7 天）者更好。

為了研究哪些 T 細胞記憶區室持續存在，培養期間每 7 天進行基於流式細胞術的 T 細胞表型分析。

圖 20A 顯示，在擴增第 21 天時，3 天（早期）擴增樣本中幼稚 (scm) 和中央記憶 (T_cm ) T 細胞的百分比顯著較高，而 7 天（中期）和 10 天（晚期）擴增樣本中這兩個較低分化的 T 細胞區室均大大下降。

圖 20B 一致地顯示，在用 IL-15 培養期間第 7 天前，基於 PkH 稀釋的 CCR7 表達細胞增殖增加，表明擴增下降可透過增加細胞因子受體的表達而導致保留增殖可能性。總體而言，此資料顯示早期擴增的 T 細胞保留了能夠應對 IL-2、IL-7 和 IL-15 而增殖的一群早期分化 CD8+ T 細胞。

實例 3

T 細胞體外擴增時間縮短與存活增加相關

在無額外抗原或 CD3 刺激而存在 IL-7、IL-15 或 IL-2 的情況下，評估解凍擴增 T 細胞的存活能力。第 4 天擴增的 T 細胞能夠在所有三種細胞因子條件下實質上生長超過較晚擴增的 T 細胞，在 IL-7、IL-15 和 IL-2 中峰值倍數生長約 10 倍、30 倍和 15 倍。相反地，第 7 天和第 10 天擴增的 T 細胞不能在任何細胞因子條件下維持實質的生長。此外，在缺乏所有細胞因子的情況下，無論擴增方案長度如何，各 T 細胞群以相似的速度死亡。

為了確定細胞因子剝奪對擴增 T 細胞增殖或存活的影響，在 21 天內測量了存在 IL-2、IL-7 或 IL-15 的情況下擴增 TCR 轉導 T 細胞的細胞生長。圖 7A-7C 顯示，在 21 天期間內，第 4 天擴增的 T 細胞與擴增較長時間者（例如，第 7 天和第 10 天擴增）相比在存在 (A) IL-7、(B) IL-15和 (C) IL-2 的情況下表現出更高的細胞生長或更多的存活細胞。虛線設定為 1，指示相對於起始細胞數的倍數生長無差異。

在存在較高濃度細胞因子（例如，IL-2 (300 U/ml)（圖 8A）、IL-7 (10.0 ng/ml)（圖 8B）或 IL-15 (10.0 ng/ml)（圖 8C））的情況下，較早擴增的 TCR 轉導 T 細胞隨時間變化的細胞行為比擴增較長時間者更好。每個倍數生長曲線的總體存活透過計算曲線下面積確定。透過對三個生物供體的分析，得出一種趨勢，即較早擴增的 T 細胞表現優於較晚擴增的細胞。對於 IL-2，第 4 天和第 7 天擴增細胞之間的存活下降約 5 倍，第 7 天和第 10 天擴增細胞之間的存活下降約 2 倍。對於 IL-7，第 4 天和第 7 天擴增細胞之間的總體存活下降約 6 倍，第 7 天和第 10 天擴增細胞之間下降約 4 倍。對於 IL-15，第 4 天和第 7 天擴增細胞之間的總體存活下降約 8 倍，第 7 天和第 10 天擴增細胞之間下降約 6 倍。儘管由於供體與供體之間的差異很大而無統計學顯著意義，但是存在一致的趨勢是：較早擴增的細胞比較晚擴增的細胞存活多。

在測定第 21 天時，在存在較高濃度細胞因子（例如，IL-2 (300 U/ml)（圖 8D）、IL-7 (10.0 ng/ml)（圖 8E）或 IL-15 (10.0 ng/ml)（圖 8F））的情況下，較早擴增的 TCR（例如，CD8Vb8+）轉導的 T 細胞的總體存活比擴增較長時間者更好。

在存在較低濃度細胞因子（例如 IL-2 (30 U/ml)（圖 9A）、IL-7 (1.0 ng/ml)（圖 9B）或 IL-15 (1.0 ng/ml)（圖 9C））的情況下也觀察到類似的結果。例如，在測定第 21 天時，擴增 4 天的 T 細胞與擴增較長時間（例如，擴增 7 天和 10 天）的 T 細胞相比存活更好。這些結果顯示 T 細胞體外擴增時間縮短與細胞因子剝奪條件下存活增加相關。

實例 4

T 細胞體外擴增時間縮短與細胞凋亡減少相關

由於較早擴增細胞的倍數生長增加和分裂增加，因此，如碘化丙啶 (PI) 和膜聯蛋白-V染色評估的細胞凋亡可能相應減少。

為了確定細胞因子剝奪對擴增 T 細胞凋亡的影響，在 21 天內測量了在存在 IL-2、IL-7 或 IL-15 的情況下擴增 T 細胞的細胞凋亡。圖 10A-10C 顯示，擴增 4 天的 T 細胞與擴增 7 天和 10 天者相比在存在 (A) IL-7 (10 ng/ml)、(B) IL-15 (10 ng/ml) 和 (C) IL-2 (300 IU/ml) 的情況下包含的凋亡細胞較少。透過排除碎片和低 FSC 群來門控淋巴細胞的細胞凋亡百分比。圖 11A-11C 顯示，在測定第 10 天時，擴增約 4 天的 TCR 轉導 T 細胞之透過曲線下面積測定的總體細胞凋亡較低。對於 IL-2 的條件，第 4 天和第 7 天細胞之間的細胞凋亡存在統計學上不顯著增加（約 1.8 倍），而第 4 天和第 10 天細胞之間存在統計學上顯著增加（約 3 倍）(p = 0.0092)。對於 IL-7 的條件，第 4 天和第 7 天細胞之間的細胞凋亡存在統計學上不顯著增加（約 2 倍），而第 4 天和第 10 天細胞之間存在統計學上顯著增加（約 7 倍）(p ＜ 0.0001)。對於 IL-15 的條件，第 4 天和第 7 天細胞之間的細胞凋亡存在統計學上不顯著增加（約 1.6 倍），而第 4 天和第 10 天細胞之間存在統計學上顯著增加（約 5.5 倍）(p = 0.0010)。

圖 12 指示，在測定第 10 天時，在存在 IL-15 (10 ng/ml) 的情況下，擴增 4 天的 T 細胞含有的凋亡細胞（4.97%，膜聯蛋白-V +/PI-）(A) 例如，少於擴增較長時間者， (B) 第 7 天（10.6%，膜聯蛋白-V +/PI-）和 (C) 第 10 天（18.2%，膜聯蛋白-V +/PI-）。這些結果證明 T 細胞體外擴增時間縮短與細胞因子剝奪條件下細胞凋亡減少相關。

實例 5

T 細胞體外擴增時間縮短與細胞分裂增加相關

為了確定細胞因子對擴增 T 細胞的細胞分裂的影響，測量了在存在 IL-2、IL-7 或 IL-15 的情況下擴增 T 細胞的細胞分裂。圖 13A-13C 顯示，較早擴增（例如，第 4 天）的 TCR 轉導 T 細胞在存在 (A) IL-7 (10 ng/ml)、(B) IL-15 (10 ng/ml) 和 (C) IL-2 (300 IU/ml) 的情況下比擴增較長時間（例如，第 7 天和第 10 天）者包含更多的分裂細胞。由於測定 10 天後缺乏第 10 天細胞的細胞，因此，資料顯示至多 10 天。在測定第 10 天時，在存在較高濃度細胞因子（例如，IL-2 (300 U/ml)（圖 14A）、IL-7 (10.0 ng/ml)（圖 14B）或 IL-15 (10.0 ng/ml)（圖 14C））的情況下，較早擴增的 TCR 轉導 T 細胞（例如，第 4 天擴增）的分裂細胞比擴增較長時間者（例如，第 7 天和第 10 天擴增）更多。較早擴增細胞（例如，第 4 天）的分裂情況按 CSA 中 10 天內每個時間點稀釋增殖染料的細胞百分比進行計算。分析最長 10 天，這是因為較晚擴增的細胞在第 10 天後無足夠的細胞進行準確分析。對於 IL-2，第 4 天和第 7 天擴增細胞之間的總體分裂下降約 30%，且第 4 天和第 10 天擴增細胞之間下降約 50%，p = 0.0307。對於 IL-7，看到相同的趨勢，亦即，第 4 天和第 7 天擴增細胞之間下降約 40%，且第 4 天和第 10 天擴增細胞之間下降約 80%，p = 0.0006。對於 IL-15，觀察到相同的趨勢，亦即，第 4 天和第 7 天擴增細胞之間下降約 20%，且第 4 天和第 10 天擴增細胞之間下降約40%，p = 0.0025。

細胞因子敏感性可由細胞因子誘導的細胞分裂水平來確定。為了確定擴增 T 細胞的細胞因子敏感性，測定中在細胞因子非限制性條件下（例如，3 天）測量 IL-2、IL-7 或 IL-15 誘導的擴增 T 細胞總體細胞分裂。可透過在測定中計算 3 天內的細胞分裂曲線下面積進行積分從而計算總體細胞分裂。圖 15A-15C 顯示，較早擴增的（例如，第 4 天）T 細胞在存在 (A) IL-7 (10.0 ng/ml)、(B) IL-15 (10.0 ng/ml) 和 (C) IL-2 (300 IU/ml) 的情況下比擴增較長時間（例如，第 7 天和第 10 天）者包含更多的分裂細胞。這些結果顯示，T 細胞體外擴增時間縮短比擴增時間較長的 T 細胞對細胞因子的反應更好。類似地，在測定第 3 天時，在存在較高濃度細胞因子（例如，IL-2 (300 U/ml)（圖 16A）、IL-7 (10.0 ng/ml)（圖 16B）或 IL-15 (10.0 ng/ml)（圖 16C））的情況下，較早擴增的 T 細胞比擴增較長時間者細胞分裂更多。

實例 6

體外擴增時間縮短與細胞因子敏感性增加相關

基於淋巴細胞百分比的 CD25 表達或 CD25 表達的平均熒光強度 (MFI) 與對 CSA 中 IL2 誘導的存活反應之間存在強相關性（分別為 R² =0.82；R² =0.89）。基於淋巴細胞百分比的 CD127 表達與對 CSA 中 IL7 誘導的存活反應之間無相關性 (R² =0.04)。有趣的是，CD127 表達的 MFI 與 IL7 誘導的存活之間存在中度相關性 (R² =0.76)。基於淋巴細胞百分比的 CD122 表達與對 CSA 中 IL15 誘導的存活反應之間存在弱相關性 (R² =0.42)，或 CD122 表達的 MFI 與之存在中度相關性 (R² =0.67)。

細胞因子敏感性還可透過在存在細胞因子的情況下介導細胞信號傳導途徑的細胞因子受體的表達水平來確定。CSA 測量對細胞因子誘導的存活、增殖和凋亡的反應。這些變化可能與測定開始時每個 T 細胞群內各細胞因子受體的表達相關。因此，分別測量了 IL-2、IL-7 和 IL-15 細胞因子受體的定義亞基（亦即， CD25、CD127 和 CD122）的表達。值得注意的是，儘管 CD122 通常被指定為 IL-15 受體的反應性亞基，但是，它是 IL-2 和 IL-15 受體的共有亞基。例如，圖 16D 顯示，第 4 天（測定中 3 天後）擴增的 T 細胞與擴增較長時間者（例如，第 7 天和第 10 天）相比表達更多的 IL-2 受體 (CD25)。圖 17A 顯示 IL-2 受體 (CD25) 表達的這種增加（在第 4 天擴增的 TCR 轉導 T 細胞接受測定之前測量）與 IL-2 介導的細胞存活增加有良好的相關性，例如，R² = 0.89 和 0.82。AUC 表示曲線下面積。圖 17B 顯示，IL-2 受體 (CD25) 表達的這種增加也與 IL-2 介導的細胞分裂增加有良好的相關性，例如，R² = 0.81 和 0.69。

圖 18A 和 18B 分別顯示，IL-15 受體 (CD122) 表達（在第 4 天擴增的 TCR 轉導 T 細胞接受測定之前測量）與 IL-15 介導的細胞存活增加中度相關（例如，R² = 0.67 和 0.42），並且與 IL-15 介導的細胞分裂也中度相關（例如，R² = 0.55 和 0.67）。

圖 19A 和 19B 分別顯示，IL-7 受體 (CD127) 表達（在第 4 天擴增的 TCR 轉導 T 細胞接受測定之前測量）與 IL-7 介導的細胞存活增加相關性差（例如，R² = 0.76 和 0.004），並且與 IL-7 介導的細胞分裂的相關性也差（例如，R² = 0.61 和 0.08）。

這些測定結果顯示，與擴增時間較長（例如，約 7 天至約 10 天）的細胞相比，較早製造的（或最小擴增的）工程化 T 細胞（例如，約 3 天至約 5 天）表現更好。例如，如圖 20 所示，與體外擴增較長時間（例如，約 7 天至約 10 天）的工程化 T 細胞相比，最小擴增者（例如，約 3 至約 5 天）因幼稚性增加，例如，幼稚 T 細胞 (TN) 和/或幹記憶 T 細胞 (T_scm )/T 中央記憶 (T_cm ) 的細胞群增加、增殖能力增加和持久性增加（例如，透過減少 CWID 誘導的細胞凋亡），可能顯示出更好的臨床療效。

實例 7

CD3/CD28 製造期間的細胞作用機制 (MOA) 表型分析

根據 CSA 的結果，T 細胞似乎對增殖細胞因子的反應能力較低，部分原因可能是由於細胞因子受體表達的損失。這些資料表明，第 10 天擴增的 T 細胞中有一小部分可保留對細胞因子反應的能力。這項觀察結果表明，T 細胞群的異質性可能對觀察到的行為發揮作用。為了研究這種多樣性和可能性的損失，分析了 T 細胞擴增對 (1) 最終相對端粒長度、(2) 端粒酶活性、(3) 共刺激分子表達和 (4) 全 RNA 測序分析的影響。

端粒長度隨著CD3/CD28 製造延長而減少

端粒長度的損失標誌著功能失調細胞，因為它們變得高度分化並最終衰老。為了研究這種效應是否在我們的差異擴增 T 細胞中發生，使用熒光原位雜交測定法來評估 T 細胞相對於內部細胞系對照的相對端粒長度 (RTL)。

圖 22 顯示，對於所分析的所有四名供體 (D1-D4)，在整個擴增方案中均存在 RTL 損失，第 4 天的擴增細胞 RTL 最高。當所有供體合併為一組時，第 4 天和第 7 天擴增的細胞之間 RTL 損失大約為 20%，且第 7 天和第 10 天擴增的細胞之間 RTL 又損失 10%。資料中也存在年齡偏差的徵兆，在第 10 天擴增的時間點進行比較時，年齡小供體的平均 RTL 比年齡大供體長。供體年齡：D1：50 歲、D2：31 歲、D3：49 歲、亦即D4：45 歲。

端粒酶活性在 CD3/CD28 製造延長期間降低

根據 CD3 + CD28 刺激後端粒長度減少和端粒酶誘導存在異質性，透過酶聯免疫吸附測定法 (ELISA) 確定了活性端粒酶的水平。

圖 23 顯示，第 4 天和第 7 天擴增培養物之間存在統計學上不顯著的降低（約 10%）。相反地，第 4 天和第 10 天的擴增細胞之間活性降低統計學上顯著的 40% (p = 0.0004)，並且第 7 天和第 10 天之間降低統計學上也顯著的約 25% (p = 0.0165)。總之，延長擴增產生細胞的 RTL 和活性端粒酶最終水平皆存在著擴增相關的損失，因此可能較不適合於額外的擴增。

CD3/CD28 製造期間的 T 細胞早期記憶表型損失

CSA 結果顯示，差異擴增細胞之間在起始記憶區室方面可能存在明顯差異。對起始記憶區室進行更高解析度分析，以檢測差異擴增樣本之間的差異。

圖 24 顯示，第 4 天、第 7 天和第 10 天之間的 T_naive/scm 區室存在統計學上不顯著的小差異（平均值為 20.03%、11.1%、17.47 % 的 CD8 細胞）。但是，第 4 天、第 7 天和第 10 天擴增的細胞之間，Tcm 區室內存在統計學上顯著的差異 (p ＜ 0.05)（平均值為 58.27、37.73 和 16.8 % 的 CD8 細胞）。第 4 天、第 7 天和第 10 天擴增的細胞之間，T_em 區室內存在統計學上顯著的差異 (p ＜ 0.05)（平均值為 18.9、48.13 和 58.9% 的 CD8 細胞）。第 4 天、第 7 天和第 10 天擴增的細胞之間，T_emra 區室內存在統計學上不顯著的小差異（平均值為 2.70、3.06 和 6.80 % 的 CD8 細胞）。這些結果顯示，主要記憶區室差異可能存在於 T_cm 至 T_em 轉變中，較晚擴增的細胞包含較少的 T_cm T 細胞和較多的T_em T 細胞。

CD28 和 CD27 表達在 CD3/CD28 製造期間的損失

除常規記憶區室外，還對細胞進行了共刺激標誌物 CD28 和 CD27 表達的表型分析，這兩種標誌物已知與體內增加 T 細胞持久性相關。

圖 25 顯示，CD3 + CD28 擴增期間，CD28 和 CD27 皆逐步損失，製造期第 10 天前損失最大。儘管第 4 天、第 7 天和第 10 天擴增培養物之間的比較均無統計學顯著意義 (p ＜ 0.05)，但第 4 天和第 10 天擴增培養物之間 CD27+CD28+ 區室內存在具有顯著性的趨勢 (p = 0.0520)（平均值為 58.47 和 21.43% 的 CD8 細胞）。此外，第 4 天和第 10 天擴增的細胞之間，存在雙陰性 CD27-CD28- 區室富集 (p = 0.1581)（平均值為 10.24% 和 29.77% 的 CD8 細胞）。

差異基因表達分析將較早擴增細胞之聚簇識別為相較於較晚擴增細胞獨特的聚簇

儘管資料表明差異擴增 T 細胞之間存在表型差異，但是探索可能限於所研究的指定靶標（例如，CD28 或 T 細胞記憶區室）數量。為了擴大表型研究的範圍，在擴增 4、7 或 10 天的三個生物供體中進行全 RNA 測序。

圖 26 顯示，根據聚簇分析結果，第 4 天的擴增細胞相較於第 7 天（以中間聚簇出現）有不同分組，而第 10 天的細胞以其獨特的聚簇出現。這些結果顯示，與第 7 天和第 10 天的擴增細胞相比，第 4 天的擴增細胞有明顯不同的聚簇模式。此資料支持 T 細胞擴增的線性分化模型，其中 RNA 水平在整個擴增方案中逐漸變化。

與較晚的擴增樣本相比，較早擴增細胞顯示出差異表達基因數量增加

進行全 RNA 測序以分析三個生物供體第 4、7 和 10 天擴增細胞之間的差異表達基因 (DEG)。

圖 27 顯示了基因表達譜在製造過程的最早期改變，證據為：第 4 天與第 7 天比較時有 5,078 個 DEG，並且第 4 天與第 10 天比較時有 5,643 個 DEG。對於這兩組，上調和下調基因的分佈大致相等。相反地，當第 7 天與第 10 天製造的細胞進行比較時，DEG 相對較少，識別了 90 個基因等分在上調和下調基因之間。

京都基因和基因組百科全書 (KEGG) 的分析強調整個製造過程中細胞週期相關基因的損失和細胞凋亡相關基因的上調

為了更好地理解製造過程中發生的驟然基因表達變化，進行了 KEGG 途徑分析以識別在不同基因組中過度代表的基因途徑。根據從 CSA 獲得的功能性結果（例如，存活、分裂和細胞凋亡），KEGG 途徑可能與 T 細胞增殖和持久性有關。

圖 28 顯示，製造過程中較晚的時間點與第 4 天相比，DNA 複製和細胞週期基因途徑存在顯著的下調。讓這種效應更惡化的是，製造過程中同一時期有細胞凋亡（p53 信號傳導基因途徑）的顯著上調。與圖 27 中的基因表達結果一樣，製造過程中第 7 天和第 10 天之間幾乎沒有顯著富集的途徑。

實例 8

方法

T 細胞製造

健康供體全血購自 Hemacare，並且PBMC 透過 Ficoll 梯度分離。將 PBMC 在補充有 5% 人 AB 血清 (Gemini 100-318) 培養基的 TexMACS (Miltenyi 130-097-196) 中激活 16-24 小時，方法是：以 1x 10⁶ 個活 PBMC/ml 接種於組織培養瓶上，該等組織培養瓶用 PBS (Lonza 17-516F) 中的 1 ug/ml 抗-CD3 (eBioscience 16-0037-85) 和1 μg/ml 抗-CD28 (eBioscience 16-0289-85) 抗體在攝氏 4度下包覆過夜。次日，分離總細胞並重懸至 1x 10⁶ 個活細胞/ml，並將 5ml 細胞接種入 Grex24 孔板 (Wilson Wolf 80192M) 的孔中。在存在 10 ng/ml IL-7 (peprotech 200-07)、100 ng/ml IL-15 (peprotech 200-15) 和 10 　g/ml 魚精蛋白硫酸鹽的情況下，用 TCR 慢病毒構建體（由 Lentigen 生產）模擬轉導或轉導細胞。次日，向細胞中加入 35 mL 補充有上述濃度 IL-7 和 IL-15 的完全 TexMACS。讓細胞再生長 2、5 或 8 天，具體時間取決於所需的製造時間（總共 4 天、7天或 10 天）。製造完成後，進行細胞計數，並且以5 x 10⁶ /ml在 Cyrostore10 中冷凍，在攝氏 -80度下放置 16-24 小時，然後在 LN2 氣相下長期保存直至需要使用。

PkH67 染色

可透過增殖染料 PkH67 的稀釋來測量細胞分裂。按照製造商的方案進行 PkH67 (Sigma PKH67GL) 染色，例外情況是，第 4 天製造的細胞以 2X 濃度染色以將與第 7 天或第 10 天製造的細胞相比細胞大小更大的因素考慮進去。在流式細胞術存活性染料染色之前進行 PkH 染色。

細胞因子敏感性測定法 (CSA)

將 T 細胞產物解凍並在補充有 5% 人 AB 血清和 100 U/mL Benzonase (Sigma E10114) 的 TexMACS 中以 1-2 x 10⁶ /ml 的濃度靜置約 4 小時。靜置期後，用 PkH 標記細胞，並在 Grex24 孔燒瓶中培養 2 x 10⁵ 個淋巴細胞，用 IL-7、IL-15 或 IL-2 (R&D Systems 202-IL) 滴定，共培養 21 天。在此期間，每 3 天至 4 天透過體積流式細胞術計數細胞，且每 7 天用記憶 T 細胞板進行表型分析。每 7 天將細胞因子補充至起始濃度。

流式細胞儀染色和採集

對活細胞進行定量並重懸至PBS 中的 1-2 x 10⁶ 個活細胞/ml，然後根據製造商的方案用活-死染色法進行染色。然後用 Flow 緩衝液洗滌細胞，之後以所需的抗體濃度重懸細胞（如下列各表所示），並在攝氏 4度下避光染色 15-30 分鐘，例外情況是，CCR7 染色在攝氏 37度下在沒有血清的 RPMI (Gibco 11835-030) 中進行。然後用 Flow 緩衝液洗滌細胞並重懸於固定緩衝液中，且在攝氏 4度下保存直至在 BD Fortessa 或 Miltenyi MACSQuant 分析儀上採集。以下各表包括用於所有流式細胞儀染色的試劑。

端粒長度測定

根據製造商的說明 (Dako/Agilent K5327) 測定相對端粒長度。簡言之，將 T 細胞以 1:1 的比例與對照 1301 腫瘤細胞（4N 基因組）混合。然後通透化細胞，且將端粒 PNA FITC 探針雜交過夜。次日，進行反向碘化丙啶染色以區分完整的細胞，並透過流式細胞術採集細胞。測試細胞的端粒長度計算為與對照 1301 腫瘤細胞系端粒長度之比。

CDR3 測序 (Adaptive Biotech) 和 T 細胞受體可變 β 鏈測序分析

使用 immunoSEQ® Assay (Adaptive Biotechnologies, Seattle, WA) 對人 TCR β 鏈的 CDR3 區進行免疫測序。在偏差控制的多重 PCR 中擴增提取的基因組 DNA，然後進行高通量測序。將序列摺疊並過濾，以識別和定量每個獨特 TCRβ CDR3 區域的絕對豐度，以用於進一步的分析。

TCR-β 測序結果的統計學分析

克隆性定義為 1-Peilou 均勻度，並透過以下公式計算生產性重排：

其中 pi 為重排 i 的比例豐度，且N 為重排的總數。克隆性數值範圍為 0 至 1，並且描述頻率分佈的形狀：克隆性數值接近 0 表示頻率分佈非常均勻，而該等數值接近 1 表示分佈越來越不對稱，其中少數克隆出現頻率高。統計學分析使用 R 版本 3.2 進行。

RNAseq (Novogene) 資料分析

下游分析使用包括 STAR、HTseq、Cufflink 和我們打包的脚本在內的程序組合進行。使用 Tophat 程式解析比對，且透過 DESeq2/edgeR 確定差異表達。GO 和 KEGG 富集用 ClusterProfiler 實施。透過 Star-fusion 和 rMATS 軟體檢測基因融合和可變剪接事件的差異。

映射至參考基因組的 RNAseq (Novogene) 讀數

參考基因組和基因模型說明文件直接從基因組網站瀏覽器 (NCBI/UCSC/Ensembl) 上下載。參考基因組的索引使用 STAR 構建，並使用STAR (v2.5) 將配對末端清潔讀數與參考基因組進行比對。STAR 使用 Maximal Mappable Prefix (MMP) 方法，可為接合讀數生成精確的映射結果。

基因表達水平 RNAseq (Novogene) 定量

使用 HTSeq v0.6.1 對每個基因的映射讀數數量進行計數。然後根據基因的長度以及映射至該基因的讀數計數計算每個基因的 FPKM。FPKM（每百萬映射讀數外顯子模型的每千鹼基讀數）同時考慮了測序深度和基因長度對讀數計數的影響，並且是估計基因表達水平的常用方法。

RNAseq (Novogene) 差異表達分析

對於具有生物學重複物的 DESeq2，使用 DESeq2 R 包 (2_1.6.3) 進行兩個條件/組（每個條件兩個生物學重複物）之間的差異表達分析。DESeq2 是使用基於負二項分佈的模型確定數位基因表達資料中差異表達的常規統計方法。使用控制假發現率 (FDR) 的 Benjamini 和 Hochberg 方法調整所得的p 值。DESeq2 發現調整後p 值＜ 0.05的基因被指定為差異表達基因。

對於無生物學重複物的 edgeR，每個測序文庫在差異基因表達分析之前，透過一個縮放標準化因子用 edgeR 程式包調整讀數計數。使用 edgeR R 包 (3.16.5) 對兩個條件進行差異表達分析。使用 Benjamini & Hochberg 方法調整p 值。校正後p 值0.05和絕對倍數變化 1 設定為顯著差異表達的閾值。

RNAseq (Novogene) 相關性

為了可以進行對數調整，具有0 個 FPKM的基因賦值為 0.001。使用 R 中的 cor.test 函數並設定選項 alternative（替代值）=「greater（更大）」和 method（方法）=「Spearman」來確定相關性。

RNAseq (Novogene) 聚簇

為了識別差異之間的相關性，使用表達水平 FPKM聚簇不同樣本以瞭解相關性，其使用有熱圖功能的層次聚簇距離法、使用輪廓係數的 SOM（自組織映射）和 kmeans 來適應 R 中含默認參數的最優分類。

差異表達基因的 RNAseq (Novogene) GO和 KEGG 富集分析

差異表達基因的基因本體論 (GO) 富集分析透過聚簇 Profiler R 包實施，該軟體包中對基因長度偏差進行了校正。校正後 p 值小於 0.05 的 GO 術語被認為顯著富集差異表達基因。KEGG 是一個資料庫資源，用於從分子水平資訊（特別是基因組測序和其他高通量產出實驗技術生成的大規模分子資料集）中瞭解生物系統（諸如，細胞、生物體和生態系統）的高級別功能和效用。Cluster Profiler R 包用於測試 KEGG 途徑中差異表達基因的統計學富集。

本揭示的優點可包括細胞因子敏感性測定法，其可用於確定哪些類型的體外製造 T 細胞透過以高通量患者特異性方式增加轉移細胞的增殖和存活以及減少細胞凋亡從而可能在體內持續存在，因而改善腫瘤消退並提高 ACT 的療效。

圖 1 顯示了 T 細胞凋亡（例如，再刺激誘導的細胞死亡 (RICD) 和細胞因子戒斷誘導的細胞死亡 (CWID)）和記憶形成。(Voss等人，Cancer Letters 408 (2017) 190-196，其內容在此透過引用整體併入）。

圖 2 顯示了在分別透過抑制內在或外在細胞凋亡途徑靶向非實體瘤和實體瘤的 ACT 中的體內 T 細胞存活模型。

圖 3 顯示了分別透過連續殺滅測定或細胞因子敏感性測定方法在靶向非實體瘤和實體瘤的 ACT 中測試體內 T 細胞存活的模型。

圖 4 顯示了根據本揭示的一個實施例的細胞因子敏感性測定。

圖 5A-5D 顯示了體外擴增期間的 T_scm 樣形成，其特徵在於 CD45RO (低) 和 CCR7+。

圖 6A-6I 顯示了在測定 21 天內早期擴增的 T_scm 保持 IL-15 細胞因子敏感性。

圖 7A-7C 顯示了早期擴增細胞（擴增約 4 天）表現出，與 7 天和 10 天擴增相比，細胞生長增加。圖下的標籤代表細胞因子的使用量。線性二次線擬合用於建立細胞行為的模型。在為期 21 天內存在 10 ng/ml IL-7 (A)、10 ng/ml IL-15 (B) 或 300 U/mL IL-2 (C) 的情況下評估擴增 4、7 或 10 天的 T 細胞，每 2-3 天取樣一次。倍數生長計算為起始 T 細胞數與指定時間點 T 細胞數的比率。請注意，每個繪圖在 Y 軸上比例均不同，以便於資料可視化。最佳擬合線由細胞存活的線性二次方程推導出。

圖8A-8C 顯示了 T 細胞體外擴增時間縮短（擴增約 4 天）相較於 7 天和 10 天擴增與較高細胞因子濃度下的存活增加相關。在存在 300 U/ml IL-2 (A)、10 ng/ml IL-7 (B)、10 ng/ml IL-15 (C) 的情況下或為期 21 天內評估擴增 4、7 或 10 天的 T 細胞，每 2-3 天取樣一次。總體存活為倍數生長圖的曲線下面積，如圖 7A-7C 所示。每個點代表每個供體的三個技術性重複物，顯示總共 3 個供體。

圖8D-8F 顯示轉導 T 細胞體外擴增時間縮短與較高細胞因子濃度下的存活增加相關。

圖9A-9C 顯示 T 細胞體外擴增時間縮短與較低細胞因子濃度下的存活增加相關。

圖 10A-10C 顯示 T 細胞體外擴增時間縮短與細胞凋亡減少相關。

圖11A-11C 顯示 T 細胞體外擴增時間縮短與較高細胞因子濃度下的細胞凋亡減少相關。在為期 21 天內在存在 300 U/ml IL-2 (A)、10 ng/ml IL-7 (B) 或 10 ng/ml IL-15 (C) 的情況下評估擴增 4、7 或 10 天的 T 細胞，每 2-3 天取樣一次。總體細胞凋亡基於測定中第 10 天前碘化丙啶和膜聯蛋白-V 染色陽性的淋巴細胞百分比進行計算。每個點代表每個供體的三個技術性重複物，顯示總共 3 個供體。

圖 12A-12C 顯示 T 細胞體外擴增時間縮短與細胞凋亡減少相關。

圖13A-13C顯示 T 細胞體外擴增時間縮短與存在 (A) IL-7、(B) IL-15 和 (C) IL-2 的情況下細胞分裂增加相關。

圖14A-14C 顯示轉導 T 細胞體外擴增時間縮短與較高細胞因子濃度下的細胞分裂增加相關。在存在 300 U/ml IL-2 (A)、10 ng/ml IL-7 (B)、10 ng/ml IL-15 (C) 的情況下或為期 21 天內評估擴增 4、7 或 10 天的 T 細胞，每 2-3 天取樣一次。總體分裂基於淋巴細胞百分比進行計算，其中在測定中第 10 天前檢測到 PkH67 的可檢測稀釋。每個點代表每個供體的三個技術性重複物，顯示總共 3 個供體。

圖15A-15C顯示 T 細胞體外擴增時間縮短與對 (A) IL-7、(B) IL-15 和 (C) IL-2 的敏感性增加相關。

圖16A-16C 顯示轉導 T 細胞體外擴增時間縮短與較高細胞因子濃度下的細胞分裂增加相關。

圖 16D 顯示轉導 T 細胞體外擴增時間縮短與 CD25 表達增加相關。

圖 17 顯示 IL-2 受體 (CD25) 表達與在存在 IL-2 的情況下之存活/分裂之間的相關性。

圖 18 顯示 IL-15 受體 (CD122) 表達與在存在 IL-15 的情況下之存活/分裂之間的相關性。

圖 19 顯示 IL-7 受體 (CD127) 表達與在存在 IL-7 的情況下之存活/分裂之間的相關性。

圖 20 顯示 T 細胞體外擴增時間縮短保留 T 細胞可能性。(Voss等人，Cancer Letters 408 (2017) 190-196，其內容在此透過引用整體併入）。

圖21A 顯示細胞記憶區室在第 0 天以及為期 21 天的培養期間每 7 天透過流式細胞術測量一次。T_naive/scm = CCR7+CD45RO-、T_cm =CCR7+CD45RO+、T_em =CCR7-CD45RO+、以及T_eff =CCR7-CD45RO-。

圖 21B 顯示在培養開始時用 PkH 增殖染料標記輸入細胞，並在培養期間第 7 天前基於 PkH 稀釋測量不同記憶區室的增殖。

圖 22 顯示 CD3/CD28 T 細胞擴增期間端粒長度連續損失。相對於 4 個健康供體 (D1-D4) 的腫瘤細胞系對照細胞，透過熒光原位雜交評估相對端粒長度。每個樣本點代表技術性二重複中的一個重複物。供體年齡：D1：50 歲、D2：31 歲、D3：49 歲、D4：45 歲。

圖 23 顯示端粒酶活性隨著 CD3/CD28 T 細胞擴增延長而降低。端粒酶活性根據 T 細胞擴增第 4 天、第 7 天或第 10 天所獲取細胞的全細胞裂解物透過基於 ELISA 的比色測定法測量。每個點代表來自總共 5 個生物學重複物的一個技術性三重複樣本。

圖 24 顯示了來自三個生物供體 D4、D5 和 D6 的 CD3/CD28 製造期間的 T 細胞分化。培養代表性 PBMC，然後在指定的擴增日透過流式細胞術進行表型分析。基於 CD45RO 和 CCR7 表達定義記憶表型，T_naive/scm = CD45RO-CCR7+、T_cm = CD45RO+CCR7+、T_em = CD45RO+CCR7-、以及T_emra = CD45RO-CCR7-。

圖 25 顯示了來自三個生物供體 D1、D7 和 D8 的 CD3/CD28 製造期間的共刺激損失。T 細胞擴增期間第4、7 和 10 天，透過流式細胞術評估 CD27 和 CD28 的表達。

圖 26 顯示差異基因表達分析將較早擴增細胞之聚簇識別為相較於較晚擴增細胞獨特的聚簇。三個生物供體（D4、D5 和 D6）擴增 4、7 或 10 天，然後分離全 RNA 並發送至 Novogene 進行 RNA 測序分析和生物資訊學分析。

圖 27 顯示了 T 細胞製造期間的 RNAseq 分析。火山圖式比較 (A) 第 4 天與第 7 天、(B) 第 4 天與第 10 天以及 (C) 第 7 天與第 10 天的 T 細胞製造期間的 RNAseq 資料。差異表達基因 (DEG) 截止值設定為向上或向下 1 倍，padj 值小於 0.05。每個圖的圖例中顯示 DEG 的數量。

圖 28 顯示了 T 細胞製造期間的京都基因和基因組百科全書 (KEGG) 途徑分析。左圖顯示樣本之間上調的途徑。右圖顯示樣本之間下調的途徑。對於每個上調或下調，引用較晚的時間點（亦即，day_7 vs day_4_down 表示第 7 天樣本與第 4 天樣本相比下調的途徑）。

國內寄存資訊 (請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無

國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims

一種產生 T 細胞的方法，其包括：從至少一個個體中獲得 T 細胞，激活該等 T 細胞，將該等激活 T 細胞的一第一部分擴增一段時間，在該存在至少一種細胞因子的情況下培養該等擴增 T 細胞，在該等培養 T 細胞中測量一細胞因子反應，識別產生一最大細胞因子反應的該段時間，和使該等激活 T 細胞的一第二部分擴增產生一最大細胞因子反應的該段時間。
如請求項 1 所述的方法，其還包括在培養之前冷凍該等激活 T 細胞的該擴增第一部分。
如請求項 2 所述的方法，其還包括在培養之前解凍激活 T 細胞的該冷凍擴增第一部分。
如請求項 3 所述的方法，其還包括在培養之前靜置該等激活 T 細胞的該解凍擴增第一部分。
如請求項 1-4 中任一項所述的方法，其中該等 T 細胞被含有抗 CD3 抗體和一抗 CD28 抗體的一刺激物激活。
如請求項 1-5 中任一項所述的方法，其中該段時間為激活後約 1 天至約 15 天、約 2 天至約 14 天、約 3 天至約 13 天、約 3 天至約 12 天、約 3 天至約 11 天、約 3 天至約 10 天、約 3 天至約 9 天、約 3 天至約 8 天、約 3 天至約 7 天、約 3 天至約 6 天、約 3 天至約 5 天、約 3 天至約 4 天、約 4 天至約 6 天或約 4 天至約 5 天。
如請求項 1-6 中任一項所述的方法，其中該至少一種細胞因子選自白細胞介素 2 (IL2)、白細胞介素 7 (IL7)、白細胞介素 15 (IL15) 及一其組合組成的該組。
如請求項 7 所述的方法，其中 IL-2 的該濃度為約 10 U/ml 至約 500 U/ml、約 10 U/ml 至約 450 U/ml、約 10 U/ml 至約 400 U/ml、約 10 U/ml 至約 350 U/ml、約 10 U/ml 至約 300 U/ml、約 10 U/ml 至約 250 U/ml、約 10 U/ml 至約 200 U/ml、約 10 U/ml 至約 150 U/ml、約 10 U/ml 至約 100 U/ml、約 10 U/ml 至約 50 U/ml、約 20 U/ml 至約 40 U/ml、約 25 U/ml 至約 35 U/ml 或約 30 U/ml 至約 35 U/ml。
如請求項 7 所述的方法，其中 IL-7 的該濃度為0.1 ng/ml 至 50 ng/ml、0.1 ng/ml 至 45 ng/ml、0.1 ng/ml 至 40 ng/ml、0.1 ng/ml 至 35 ng/ml、0.1 ng/ml 至 30 ng/ml、0.1 ng/ml 至 25 ng/ml、0.1 ng/ml 至 20 ng/ml、0.1 ng/ml 至 15 ng/ml、0.1 ng/ml 至 10 ng/ml、0.1 ng/ml 至 5 ng/ml、0.1 ng/ml 至 4 ng/ml、0.1 ng/ml 至 3 ng/ml、0.1 ng/ml 至 2 ng/ml、0.1 ng/ml 至 1 ng/ml 或 0.1 ng/ml 至 0.5 ng/ml。
如請求項 7 所述的方法，其中 IL-15 的該濃度為0.1 ng/ml 至 50 ng/ml、0.1 ng/ml 至 45 ng/ml、0.1 ng/ml 至 40 ng/ml、0.1 ng/ml 至 35 ng/ml、0.1 ng/ml 至 30 ng/ml、0.1 ng/ml 至 25 ng/ml、0.1 ng/ml 至 20 ng/ml、0.1 ng/ml 至 15 ng/ml、0.1 ng/ml 至 10 ng/ml、0.1 ng/ml 至 5 ng/ml、0.1 ng/ml 至 4 ng/ml、0.1 ng/ml 至 3 ng/ml、0.1 ng/ml 至 2 ng/ml、0.1 ng/ml 至 1 ng/ml 或 0.1 ng/ml 至 0.5 ng/ml。
如請求項 1-10 中任一項所述的方法，其中該細胞因子反應選自幼稚 T 細胞 (T_N ) 和/或幹記憶 T 細胞 (T_scm )/T 中央記憶 (T_cm ) 的增殖增加、細胞凋亡減少、細胞群增加及一其組合的一或多種。
如請求項 4 所述的方法，其中該靜置在約 0.5 小時至約 48 小時、約 0.5 小時至約 36 小時、約 0.5 小時至約 24 小時、約 0.5 小時至約 18 小時、約 0.5 小時至約 12 小時、約 0.5 小時至約 6 小時、約 1 小時至約 6 小時、約 2 小時至約 5 小時、約 3 小時至約 5 小時、約 4 小時至約 6 小時、約 1 小時至約 24 小時、約 2至約 24 小時、約 12至約 48 小時、約 0.5 小時至約 120 小時、約 0.5 小時至約 108 小時、約 0.5 小時至約 96 小時、約 0.5 小時至約 84 小時、約 0.5 小時至約 72 小時或約 0.5 小時至約 60 小時的一段時間內進行。
如請求項 5 所述的方法，其中該抗 CD3 抗體和該抗 CD28 抗體各自的一濃度為約 0.1 µg/ml 至約 10.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 8.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 6.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 4.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 2.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 1.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.8 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.6 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.25 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.3 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.4 µg/ml 或約 0.4 µg/ml 至約 0.5 µg/ml。
如請求項 1-13 中任一項所述的方法，其中該激活在約 1 小時至約 120 小時、約 1 小時至約 108 小時、約 1 小時至約 96 小時、約 1 小時至約 84 小時、約 1 小時至約 72 小時、約 1 小時至約 60 小時、約 1 小時至約 48 小時、約 1 小時至約 36 小時、約 1 小時至約 24 小時、約 2 小時至約 24 小時、約 4 小時至約 24 小時、約 6 小時至約 24 小時、約 8 小時至約 24 小時、約 10 小時至約 24 小時、約 12 小時至約 24 小時、約 12 小時至約 72 小時、約 24 小時至約 72 小時、約 6 小時至約 48 小時、約 24 小時至約 48 小時、約 6 小時至約 72 小時或約 1 小時至約 12 小時的一時間段內進行。
如請求項 1-14 中任一項所述的方法，其中該獲得的 T 細胞為一 CD3⁺ CD8⁺ T 細胞。
如請求項 1-15 中任一項所述的方法，其還包括收集該等激活 T 細胞的該擴增第二部分用於輸注至該至少一名供體、患者或個體。
一種治療一癌症患者的方法，包括向該患者給予一有效量的如請求項 1-16 中任一項所述的該等激活 T 細胞的該收集擴增第二部分。
如請求項 17 所述的方法，其中該等 T 細胞從該患者身上獲得。
如請求項 17 所述的方法，其中該等 T 細胞從該健康供體身上獲得。
如請求項 17 所述的方法，其中該癌症選自肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食道癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病 (CLL)、梅克爾細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、急性骨髓性白血病 (AML)、膽囊癌和膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌 (UBC)、急性淋巴母細胞性白血病 (ALL) 和子宮癌 (UEC) 所組成的該組。
一種藥物組合物，其包含如請求項 1-16 中任一項所述的該等激活 T 細胞的該收集擴增第二部分和一藥物可接受載劑。
一種增加該 T 細胞生長的方法，其包括：從至少一名健康供體、患者或個體獲得 T 細胞，激活該等 T 細胞，激活後擴增該等激活 T 細胞約 3 天至約 5 天，收集該等擴增 T 細胞用於輸注至該至少一名健康供體、患者或個體，其中，相較於激活後擴增約 7 天或更長時間的激活 T 細胞，擴增約 3 天至約 5 天的該等T 細胞生長較多。
如請求項 22 所述的方法，其中該等 T 細胞在激活後擴增約 4 天，並且其中該等 T 細胞的該生長大於激活後擴增約 7 天或更長時間的激活 T 細胞。
如請求項 22-23 中任一項所述的方法，其中該等擴增 T 細胞為 CD4+ 和/或 CD8+ T 細胞。
如請求項 22-24 中任一項所述的方法，其中該等 T 細胞被含有抗 CD3 抗體和一抗 CD28 抗體的一刺激物激活。
如請求項 22-25 中任一項所述的方法，其中擴增約 3 天至約 5 天的該等 T 細胞用於需要癌症治療的一患者的過繼免疫療法，其中該癌症選自肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食道癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病 (CLL)、梅克爾細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、急性骨髓性白血病 (AML)、膽囊癌和膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌 (UBC)、急性淋巴母細胞性白血病 (ALL) 和子宮癌 (UEC) 所組成的該組。
一種減少過繼免疫療法中所用 T 細胞的細胞死亡的方法，其包括：從至少一名健康供體、患者或個體獲得 T 細胞，激活該等 T 細胞，激活後擴增該等激活 T 細胞約 3 天至約 5 天，收集該等擴增 T 細胞用於輸注至該至少一名健康供體、患者或個體，其中，相較於激活後擴增約 7 天或更長時間的激活 T 細胞，擴增約 3 天至約 5 天的該等T 細胞的該細胞死亡減少。
如請求項 27 所述的方法，其中該等擴增 T 細胞為 CD4+ 和/或 CD8+ T 細胞。
如請求項 27-28 中任一項所述的方法，其中該表現為一幼稚 T 細胞 (T_N ) 和/或幹記憶 T 細胞 (T_scm )/T 中央記憶 (T_cm ) 表型的擴增 T 細胞數量多於該激活後擴增長於約 7 天的該等激活 T 細胞。
一種用於產生改善過繼免疫療法療效的 T 細胞的方法，包括：從至少一名健康供體、患者或個體獲得 T 細胞，激活該等 T 細胞，激活後擴增該等激活 T 細胞約 3 天至約 5 天，收集該等擴增 T 細胞用於輸注至該至少一名健康供體、患者或個體，其中，相較於激活後擴增約 7 天或更長時間的激活 T 細胞，擴增約 3 天至約 5 天的該等T 細胞的該過繼免疫療法療效得到改善。
如請求項 30 所述的方法，其中該等 T 細胞在激活後擴增約 4 天，並且其中該等 T 細胞的該過繼免疫療法療效大於激活後擴增約 7 天或更長時間的激活 T 細胞。
如請求項 30-31 中任一項所述的方法，其中該等擴增 T 細胞為 CD4+ 和/或 CD8+ T 細胞。
如請求項 30-32 中任一項所述的方法，其中該等擴增 T 細胞表現為一幼稚 T 細胞 (T_N ) 和/或幹記憶 T 細胞 (T_scm )/T 中央記憶 (T_cm ) 表型。
如請求項 30-33 中任一項所述的方法，其中該等 T 細胞被含有抗 CD3 抗體和一抗 CD28 抗體的一刺激物激活。
如請求項 30-34 中任一項所述的方法，其中該等擴增約 3 天至約 5 天的 T 細胞用於一需要癌症治療患者的過繼免疫療法，其中該癌症選自肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食道癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病 (CLL)、梅克爾細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、急性骨髓性白血病 (AML)、膽囊癌和膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌 (UBC)、急性淋巴母細胞性白血病 (ALL) 和子宮癌 (UEC) 所組成的該組。
如請求項 30-35 中任一項所述的方法，其中相較於激活後擴增約 7 天或更長時間的激活 T 細胞，擴增約 3 天至約 5 天的該等T 細胞表現增殖和存活增加。
如請求項 1、22、27 和 30中任一項所述的方法，其還包括在該擴增前使用一病毒載體轉導該等激活的 T 細胞，其中該病毒載體是表達一 T 細胞受體 (TCR) 的一逆轉錄病毒載體。
如請求項 37 所述的方法，其中該病毒載體是表達一 T 細胞受體 (TCR) 的一慢病毒載體。
一種 T 細胞群，其透過如請求項 1、22、27 和 30中任一項所述的方法產生。
一種 T 細胞群，其透過如請求項 1-16 中任一項所述的方法產生。
如請求項 1-16 中任一項所述的方法，其中該培養在沒有一抗原提呈細胞下進行。
如請求項 41 所述的方法，其中該培養以約 1,000 至約 1x10⁶ 個細胞/cm² 、約 1,000 至約 500,000 個細胞/cm² 、約 1,000 至約 250,000 個細胞/cm² 、約 1,000 至約 200,000 個細胞/cm² 、約 1,000 至約 150,000 個細胞/cm² 、約 1,000 至約 100,000 個細胞/cm² 、約 1,000 至約 50,000 個細胞/cm² 、約 1,000 至約 10,000 個細胞/cm² 或約 1,000 至約 5,000 個細胞/cm² 的一密度接種該等擴增 T 細胞。
如請求項 41 所述的方法，其中該培養包括以約 1,000 至約 200,000 個細胞/cm² 、約 1,000 至約 150,000個細胞/cm² 或約 1,000 至約 100,000 個細胞/cm² 的一密度接種該等擴增 T 細胞。
一種一實體瘤中 T 細胞體內持久性的預測方法，其包括：解凍擴增複數個擴增時間的冷凍保存 T 細胞，在該不存在一細胞因子的情況下靜置該等解凍 T 細胞，接種該等靜置的 T 細胞，培養該等接種 T 細胞至少一個時間週期，其中，在該至少一個時間週期的該開始時，將一或多種細胞因子加入該培養物中，以及其中，在該至少一個時間週期的該結束時，該一或多種加入細胞因子被耗盡，在該至少一個時間週期期間的複數個時間點對該等培養 T 細胞進行取樣，測量該等取樣 T 細胞的一細胞因子反應，從該複數個擴增時間識別表現出一最大細胞因子反應的該等取樣 T 細胞的一擴增時間，和將擴增該識別擴增時間的該等 T 細胞配製為用於治療該實體瘤的一組合物。
如請求項 44 所述的方法，其中該等 T 細胞在激活後擴增約 1 天至約 15 天、約 2 天至約 14 天、約 3 天至約 13 天、約 3 天至約 12 天、約 3 天至約 11 天、約 3 天至約 10 天、約 3 天至約 9 天、約 3 天至約 8 天、約 3 天至約 7 天、約 3 天至約 6 天、約 3 天至約 5 天、約 3 天至約 4 天、約 4 天至約 6 天或約 4 天至約 5 天。
如請求項 44-45 中任一項所述的方法，其中，該靜置在約 0.5 小時至約 48 小時、約 0.5 小時至約 36 小時、約 0.5 小時至約 24 小時、約 0.5 小時至約 18 小時、約 0.5 小時至約 12 小時、約 0.5 小時至約 6 小時、約 1 小時至約 6 小時、約 2 小時至約 5 小時、約 3 小時至約 5 小時、或約 1 小時至約 24 小時、約 2至約 24 小時、約 12至約 48 小時、約 0.5 小時至約 120 小時、約 0.5 小時至約 108 小時、約 0.5 小時至約 96 小時、約 0.5 小時至約 84 小時、約 0.5 小時至約 72 小時或約 0.5 小時至約 60 小時的一段時間內進行。
如請求項 44-46 中任一項所述的方法，其中，該接種以約 1,000 至約 200,000 個細胞/cm² 、約 1,000 至約 150,000個細胞/cm² 或約 1,000 至約 100,000 個細胞/cm² 的一密度進行。
如請求項 44-47 中任一項所述的方法，其中該一或多種細胞因子選自白細胞介素 2 (IL2)、白細胞介素 7 (IL7)、白細胞介素 15 (IL15) 及一其組合組成的該組。
如請求項 44-48 中任一項所述的方法，其中該一個時間週期為每個週期 1-10 天、每個週期 2-10 天、每個週期 3-10 天、每個週期 4-10 天、每個週期 5-10 天、每個週期 6-10 天、每個週期 7-10 天、每個週期 8-10 天或每個週期 9-10 天。
如請求項 44-49 中任一項所述的方法，其中該至少一個時間週期為 1 個時間週期、2 個時間週期、3 個時間週期、4 個時間週期、5 個時間週期、6 個時間週期、7 個時間週期、8 個時間週期、9 個時間週期或 10 個時間週期。
如請求項 44-50 中任一項所述的方法，其中該細胞因子反應選自幼稚 T 細胞 (T_N ) 和/或幹記憶 T 細胞 (T_scm )/T 中央記憶 (T_cm ) 的增殖增加、細胞凋亡減少、細胞群增加及一其組合的一或多種。
如請求項 44-51 中任一項所述的方法，其中該實體瘤選自肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食道癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑色素瘤、乳腺癌、梅克爾細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、膽囊癌和膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌 (UBC) 和子宮癌 (UEC) 所組成的該組。