CN105688205A - 癌发病抑制剂、抗体产生能力增强剂及肝炎治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供癌发病抑制剂、抗体产生能力增强剂及肝炎治疗剂；本发明人发现：通过给药NK细胞，抑制健康人的癌的发病，并通过将NK细胞和疫苗给药给患者，使抗体产生能力增强，由此完成了本发明。

Description

癌发病抑制剂、抗体产生能力增强剂及肝炎治疗剂
(本申请是：申请人为株式会社赛莱克斯、益山纯一、藤田实彦、申请号为201180068795.4、申请日为2011年03月02日、题为“癌发病抑制剂、抗体产生能力增强剂及肝炎治疗剂”的分案申请。)
技术领域
本发明涉及含有自然杀伤(以下称为NK)细胞作为有效成分的癌发病抑制剂、含有NK细胞作为有效成分的抗体产生能力增强剂、组合作为有效成分的NK细胞和作为有效成分的肝炎疫苗而得到的肝炎治疗剂、包括给药NK细胞的工序的癌发病抑制方法、包括给药NK细胞及疫苗的工序的抗体产生能力增强方法、以及包括给药NK细胞及肝炎疫苗的工序的肝炎治疗方法。
背景技术
(关于癌症预防)
目前，癌症已经成为主要的死亡原因，因此，不仅用于治疗癌症的药品的开发，而且使癌症的危险因子和抑制因子明朗化、并通过排除或吸取这些因子而应用于癌症预防的活动也越发活跃起来。作为代表性的致癌的危险因子，已知有吸烟等生活习惯、肝炎病毒(肝癌)、细小病毒(子宫颈癌)、幽门螺杆菌(胃癌)等的持续感染。作为通过排除该危险因子而最终应用于癌症预防的例子，有用于阻止B型肝炎病毒和细小病毒感染的预防疫苗疗法。
另一方面，关于抑制因子，对食品进行了大规模的流行病学调查。另外，研究报告发现，在药品中，非甾体性抗炎药能减少患大肠癌的风险，选择性雌激素受体调节剂(SERM：SelectiveEstrogenModulator)能减少患乳癌的风险。
作为这些食品或药品的预防癌症的机理，推定为癌细胞的增殖抑制、凋亡诱导、对激素受体的修饰、或者癌细胞的免疫感受性的提高等。
这些预防癌症的见解是基于如何抑制从正常细胞向癌细胞的变异、癌细胞的增殖和转移之类的癌细胞方面的因子的视点来考虑的。另一方面，理论上也可以从与致癌相抗衡的生物体方面的因子、即肿瘤免疫学的见解出发，按照以下方式通过强化免疫监视能力来抑制癌发病。
(关于免疫系统)
在20世纪中期，Burnet通过使用小鼠进行的实验，提倡存在免疫监视机构，该免疫监视机构为：免疫系统发现癌前细胞(precancerous)并将其排除，由此阻止向癌症的恶化，从而维持个体稳态。之后，通过开发转基因小鼠模型，证明了免疫监视机构确实存在，根据Dunn等的免疫编辑(Immunoediting)学说，整理出直至致癌与免疫系统的复杂的关联和过程(非专利文献1：Nat.Immunl.2002；3：991)。
根据免疫编辑学说，将直至致癌的过程分为“清除”(elimination)→“平衡”(equilibrium)→“逃逸”(escape)三个阶段，尤其是最初的“清除”与免疫监视学说大致同义，是在初期的癌细胞尚未形成大的集团之前将其排除的过程。在该过程的前半段，作为自然免疫细胞的NK细胞、NKT细胞、γδT细胞、巨噬细胞、树突细胞分别协力发挥作用，排除肿瘤细胞。在后半段，树突细胞发挥如下作用，即，使T细胞识别癌抗原，产生癌抗原特异辅助性T细胞、细胞毒性T细胞的克隆，获得性免疫能够排除仅靠自然免疫无法排除的癌细胞。
在接下来的“平衡”阶段，即使是保持正常免疫功能的生物体也会进行免疫原性低的癌细胞的选择，最终使癌细胞获得免疫抵抗性，癌细胞逐渐增殖。
第3阶段的“逃逸”是免疫系统已经无法识别癌细胞而导致癌组织急速增大、临床上所见为癌症的阶段。
由于从“平衡”起越向后发展越难抑制癌症的发展，因此，为了抑制癌症而在最初的“清除”阶段可靠地去除癌细胞是很重要的。但是，由于年龄增长、精神压力等，自然免疫细胞、获得性免疫细胞的功能降低，无法充分发挥癌细胞的排除能力。例如，随着年龄的增加，NK细胞的细胞毒活性或干扰素γ产生能力也会减弱，而据研究报告发现，观察100岁以上的超长寿命者的免疫能力时，自然免疫系统的NK细胞和NKT细胞的功能维持在较高水平(非专利文献2：J.Clin.Immunol.2009；29：416)。
(癌发病抑制手段)
目前研究报告所显示的癌发病抑制手段均局限在直接作用于癌细胞而抑制其发展的食品、营养补品(硒、维生素等)、抗炎药、SERM(选择性雌激素调节剂)，其抑制效果未必高。另外，对因年龄增长等而导致的疫苗效果减弱的对策也停留在增加疫苗佐剂或疫苗的1次给药量、给药次数上。
(关于肝炎)
感染B型肝炎病毒的慢性肝炎患者在全世界有3亿6千万人，作为肝硬化、肝癌的预备人群已成为很大的问题。虽然尝试了将用于预防的B型肝炎疫苗作为B型慢性肝炎的“治疗”疫苗与病毒增殖抑制剂组合使用，但并未观察到令人满意的临床改善效果(非专利文献3：Vaccine2007；25：8585、非专利文献4：Hepat.Res.Treat.2010；2010：817580)。
进而，如新的DNA疫苗(非专利文献5：GeneTher.2006；13：1110)或免疫复合体疫苗(非专利文献6：PLoSOne2008；3：e2565)的临床试验那样，也正在探寻开发“治疗”疫苗疗法。
但是，成问题的是：存在即使给药通常的HB疫苗其抗体效价也不升高或极难升高的集团(例如60岁以上的男性)。
并且，在肝炎的治疗中一般使用干扰素。但是，治疗效果因患者不同而有差异，需要确立新的治疗方法。
(关于抗体产生增强剂)
关于抗体产生增强剂公开有如下的研究报告。
专利文献1，其公开了“以茶多糖类为有效成分的抗体产生诱导剂”。
专利文献2，其公开了“以含有蛋白为特征的疫苗的抗体产生能力增强剂”。
但是，在上述文献中并没有公开或启示关于“包含NK细胞的抗体产生增强剂”的内容。并且，很多研究报告显示，NK细胞会抑制抗体产生能力(非专利文献7：Cell.Immunol.1995；161：42)。即，在以往的见解中，一般认为NK细胞会抑制抗体产生能力。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-340698号
专利文献2：日本特开平5-124972号
非专利文献
非专利文献1：Nat.Immunl.2002；3：991
非专利文献2：J.Clin.Immunol.2009；29：416
非专利文献3：Vaccine2007；25：8585
非专利文献4：Hepat.Res.Treat.2010；2010：817580
非专利文献5：GeneTher.2006；13：1110
非专利文献6：PLoSOne2008；3：e2565
非专利文献7：Cell.Immunol.1995；161：42
发明内容
在癌细胞的“清除”过程中，NK细胞、NKT细胞、γδT细胞、巨噬细胞、树突细胞、T细胞这些各种各样的免疫细胞参与该过程，但是并不清楚哪个免疫细胞在癌细胞的排除中起主要作用。
因此，本发明人等认为“如果能判明该主要的免疫担当细胞，通过人为地提高其功能，从而免疫监视能力提高，能够使“清除”过程再强化，进而通过实施该再强化，与未强化的情况相比，最终能够期待癌发病的降低”。
进而，本发明人等基于“在先前所述的疫苗疗法中，也与癌发病同样，随着年龄的增加，NK细胞、树突细胞的功能降低和幼稚T细胞、B细胞的减少会降低针对外来抗原的免疫反应能力，事实上，在B型肝炎疫苗中，一部分健康人、HIV阳性患者、透析患者、酒精中毒患者无法诱导抗体，被指出无反应性或低反应性”这一见解，认为这种无反应性或低反应性最终会增加慢性肝炎、肝癌的风险。
进而，本发明人认为“通过再次提高成为无反应性或低反应性的原因的降低的免疫反应能力，从而诱导疫苗效果，最终能够预防癌症、尤其是肝癌”。
因此，基于上述见解，本发明人所做的课题为：提供一种癌发病抑制剂、抗体产生能力增强剂及肝炎治疗剂。
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究后发现，通过给药NK细胞，抑制癌的发病，并通过将NK细胞和疫苗给药给患者，使抗体产生能力增强，由此完成了本发明。
即，本发明如下。
1.一种健康人用癌发病抑制剂，其包含作为有效成分的NK细胞。
2.根据上述1所述的健康人用癌发病抑制剂，其中，上述NK细胞为活化NK细胞。
3.一种健康人的癌发病抑制方法，其特征在于，将活化NK细胞给药给健康人。
4.根据上述3所述的癌发病抑制方法，其中，上述活化NK细胞为源自上述健康人的NK细胞。
5.一种疫苗的抗体产生能力增强剂，其包含作为有效成分的NK细胞。
6.根据上述5所述的抗体产生能力增强剂，其中，上述疫苗为肝炎疫苗。
7.根据上述6所述的抗体产生能力增强剂，其中，上述肝炎疫苗为B型肝炎疫苗。
8.根据上述5～7中任一项所述的抗体产生能力增强剂，其中，上述NK细胞为活化NK细胞。
9.一种肝炎治疗剂，其特征在于，其组合有作为有效成分的NK细胞和作为有效成分的肝炎疫苗。
10.根据上述9所述的肝炎治疗剂，其中，上述肝炎疫苗为B型肝炎疫苗。
11.一种肝炎治疗用试剂盒，其包含疫苗的抗体产生能力增强剂和肝炎疫苗，所述疫苗的抗体产生能力增强剂含有作为有效成分的NK细胞。
12.根据上述11所述的肝炎治疗用试剂盒，其中，上述肝炎疫苗为B型肝炎疫苗。
13.一种患者的疫苗的抗体产生能力增强方法，其包括以下的工序(1)(2)或(1)′(2)′。
(1)将活化NK细胞给药给患者的工序
(2)将疫苗给药给该患者的工序
(1)′将疫苗给药给患者的工序
(2)′将活化NK细胞给药给该患者的工序
14.根据上述13所述的抗体产生能力增强方法，其中，上述活化NK细胞为源自上述患者的NK细胞。
15.根据上述13或14所述的抗体产生能力增强方法，其中，上述疫苗为肝炎疫苗。
16.根据上述15所述的抗体产生能力增强方法，其中，上述肝炎疫苗为B型肝炎疫苗。
17.一种肝炎治疗方法，其包括以下的工序(1)(2)或(1)′(2)′。
(1)将活化NK细胞给药给患者的工序
(2)将疫苗给药给该患者的工序
(1)′将疫苗给药给患者的工序
(2)′将活化NK细胞给药给该患者的工序
18.根据上述17所述的肝炎治疗方法，其中，上述活化NK细胞为源自上述患者的NK细胞。
19.根据上述17或18所述的肝炎治疗方法，其中，上述肝炎为B型肝炎。
(发明效果)
根据本发明的癌发病抑制剂及癌发病抑制方法，抑制了健康人的癌的发病。进而，根据本发明的抗体产生能力增强剂及抗体产生能力增强法方法，即使对于仅利用疫苗难以提升抗体效价的病例，也能够使抗体效价升高。
附图说明
图1是给药的NK细胞数的测量结果(实施例二)。
图2是给药淋巴细胞亚群的解析结果(实施例二)。
图3是NK细胞给药组和非给药组的年龄的分布(实施例二)。
图4是NK细胞给药组和非给药组的NK细胞冻结保存期间(实施例2)。
图5是NK细胞给药组的各健康人的分布(实施例二)。
图6是NK细胞非给药组的各健康人的分布(实施例二)。
图7是NK细胞给药组和非给药组的癌发病率的结果(实施例二)。
图8是各种癌发病抑制率的结果(实施例二)。
图9是NK细胞给药组和T淋巴细胞给药组中给药的NK细胞数的比较(实施例三)。
图10是通过给药活化NK细胞而带来的HBs疫苗效果增强结果(实施例三)。
图11是通过给药活化T细胞而带来的HBs疫苗效果增强结果(实施例三)。
具体实施方式
(NK细胞)
本发明中使用的NK(naturalkiller、自然杀伤)细胞也可以利用通过自身公知的方法获得的任意NK细胞。但是，优选使用活化NK细胞。
另外，NK细胞的提供者(供体)和NK细胞的被提供者(受体)优选为同物种。例如，供体为人时，受体为人。
另外，NK细胞的提供者和NK细胞的被提供者更优选为同一个体。例如，供体为提供者X时，受体为提供者X。
(NK细胞的获得方法)
本发明中使用的NK细胞可以通过自身公知的方法来获得(参照：表1)。NK细胞从由外周血、淋巴结、胸腺、骨髓、肿瘤、胸水、腹水或脐带血采集的单核细胞、更优选从外周血单核细胞诱导而获得。
例如，可以利用比重离心法从外周血回收包含NK细胞的单核细胞。另外，例如，可以使用针对在NK细胞上特异性表达的细胞表面标志的抗体，通过细胞分选仪、筛选(panning)、抗体磁珠法等分离NK细胞。
[表1]
NK细胞的培养和增殖方法
(NK细胞的活化方法)
在本发明的NK细胞活化方法中，通过对包含T细胞(Thymus-dependentlymphocyte)及NK细胞的单核细胞给予由CD3拮抗剂及CD52拮抗剂带来的刺激，可以使NK细胞比T细胞更活化，从而无需将NK细胞与K562等混合即可安全且简便地增殖。
尤其是，通过在IL-2的存在下对包含T细胞及NK细胞的单核细胞施加由CD3拮抗剂和CD52拮抗剂带来的刺激，从而与IL-2单独刺激相比，可以使NK细胞比T细胞更为增殖。另外，当使用本发明的NK细胞活化方法时，能够使NK细胞增殖至1000倍以上(参照：日本特开2005-124568号)。
(健康人用癌发病抑制剂)
本发明的健康人用癌发病抑制剂至少包含作为有效成分的NK细胞、优选活化NK细胞，更优选在所有细胞中活化NK细胞的含量最多。
另外，本发明的癌发病抑制剂可以含有NK细胞以外的细胞，例如NKT(natualkillerT)细胞、T细胞、树突细胞、γδT(gammadeltaT)细胞等免疫细胞。而且，本发明的癌发病抑制剂还可以以与用于治疗的任意其他有效成分的混合物的形式含有NK细胞。
本发明的癌发病抑制剂通过将有效量的有效成分与药理学上可接受的一种或一种以上的载体一起混合，并利用制剂学的技术领域中公知的任意方法来制造。药理学上可接受的载体已知有多种物质，可以从这些物质中适当选择使用，可以例示出缓冲液、各种盐、血清、白蛋白、氨基酸等添加物。
另外，本发明中的“健康人”是指通过各种检查或诊断没有被确诊为癌症的哺乳类，也包括患有癌症以外的其他疾病的哺乳类。进而，还包括根据癌细胞或肿瘤的大小而在现阶段不需要治疗的哺乳类。
本发明的健康人用癌发病抑制剂通常以注射剂、点滴剂等剂型来提供。本发明的健康人用癌发病抑制剂优选为在与受体的体液(血液等)等渗的灭菌水性载体中悬浮有活化NK细胞的悬浮液。作为该水性载体，可以举出生理食盐水、磷酸缓冲生理食盐水(PBS)等。在这些水性载体中还可以根据需要添加增溶剂、缓冲剂、等渗剂、无痛剂、保存剂、稳定剂等。
本发明的健康人用癌发病抑制剂中所含的NK细胞和/或活化的NK细胞的浓度通常为约1×105个～1×1011个/ml，优选为约1×106个～1×1010个/ml的范围，但是没有特别限定。细胞浓度过低时，给药需要消耗时间，因此，对患者的负担增大，细胞浓度过高时，可能会使细胞彼此凝集。
(癌发病抑制方法)
在本发明的癌发病抑制方法中，将NK细胞、优选将活化NK细胞给药给健康人。另外，该NK细胞未必必须是源自该健康人的NK细胞。但是，优选至少包括以下工序。
(1)使从健康人获得的NK细胞增殖、活化的工序
(2)将该活化的NK细胞给药给该健康人的工序
另外，NK细胞优选通过注射、点滴等方式给药到人体的血管中。
对于NK细胞或活化处理过的NK细胞的给药，在每次给药时给药102个～1012个，一年重复该给药1～12次，优选进行1～2次给药。
更详细而言，NK细胞或活化处理过的NK细胞的给药量根据给药形态、患者的年龄、体重等而不同，通常，每次给药时，作为活化后的NK细胞的数量，通常以1×107个～1×1011个的用量给药，优选以1×108个～1×1010个的用量给药。
(疫苗的抗体产生能力增强剂)
本发明的疫苗的抗体产生能力增强剂至少包含作为有效成分的NK细胞、优选活化NK细胞，更优选所有细胞中活化NK细胞的含量最多。
另外，本发明的疫苗的抗体产生能力增强剂可以包含NK细胞以外的细胞，例如NKT细胞、T细胞、树突细胞、γδT细胞等免疫细胞。而且，本发明的疫苗的抗体产生能力增强剂也可以以与用于治疗的任意其他有效成分的混合物的形式含有NK细胞。
本发明的疫苗的抗体产生能力增强剂通过将有效量的有效成分与药理学上可接受的一种或一种以上的载体一起混合，并利用制剂学的技术领域中公知的任意方法来制造。药理学上可接受的载体已知有多种物质，可以从这些物质中适当选择使用，可以例示出缓冲液、各种盐、血清、白蛋白、氨基酸等添加物。
(疫苗的抗体产生能力增强方法)
本发明的疫苗的抗体产生能力增强方法中，将NK细胞(优选活化NK细胞)、疫苗给药给患者。另外，该NK细胞未必必须为源自该患者的NK细胞。
但是，优选至少包括以下工序。另外，对于下述(1)和(2)的工序也可以变更其顺序。
(1)将从患者获得的活化NK细胞给药给该患者的工序
(2)将疫苗给药给该患者的工序
(疫苗)
作为能够使用本发明的增强剂的“疫苗”，没有特别限定，可以使用活疫苗、灭活疫苗、肽疫苗、质粒DNA疫苗、抗原抗体复合体疫苗等。疫苗可以使用自身公知的市售的疫苗。
本发明的增强剂优选用于肝炎疫苗，更优选用于B型肝炎疫苗。
(肝炎治疗剂)
本发明的肝炎治疗剂是至少组合有作为有效成分的NK细胞和作为有效成分的肝炎疫苗的肝炎治疗剂。
另外，本发明的治疗剂为能够将作为有效成分的NK细胞和作为有效成分的肝炎疫苗同时或分别给药给患者的形态。
(肝炎治疗用试剂盒)
本发明的肝炎治疗用试剂盒至少包含疫苗的抗体产生能力增强剂和肝炎疫苗，所述疫苗的抗体产生能力增强剂含有作为有效成分的NK细胞。
本发明的试剂盒为能够将抗体产生能力增强剂和肝炎疫苗同时或分别给药给患者的形态。
(肝炎治疗方法)
本发明的肝炎治疗方法中，将NK细胞(优选活化NK细胞)、肝炎疫苗给药给患者。另外，该NK细胞未必必须是源自该患者的NK细胞。
但是，优选至少包括以下工序。另外，对于下述(1)和(2)的工序也可以变更其顺序。
(1)将从肝炎患者获得的活化NK细胞给药给该患者的工序
(2)将肝炎疫苗给药给该患者的工序
(抗体产生能力增强剂、肝炎治疗剂的形态)
对于本发明的抗体产生能力增强剂、肝炎治疗剂的形态，可以以内含于包括能经口给药到生物体内的缓冲水剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆制剂等的药品中的形态来使用，也可以以内含于包括通过皮下注射、肌肉注射、静脉注射等方式非经口给药到生物体内的注射剂、点滴剂、栓剂等的药品中的形态来使用。
本发明的抗体产生能力增强剂、肝炎治疗剂可以经过冻干后使用，也可以以与在治疗效果上可接受的载体、pH缓冲剂、稳定剂、赋形剂等各种添加物一起包含在药品中的形态来使用。
本发明的抗体产生能力增强剂、肝炎治疗剂的给药方法及给药量根据与临床前试验、临床试验的过程的关联来适当决定。在经口给药本发明的抗体产生能力增强剂、肝炎治疗剂时，其给药量通常对于成人为每天约0.01mg～约1000mg(所含的NK细胞和/或活化NK细胞的浓度通常在约1×105个～1×1011个/ml、优选约1×106个～1.0×1010个/ml的范围)，1次或分数次进行该经口给药。另外，在非经口给药本发明的抗体产生能力增强剂、肝炎治疗剂时，其给药量通常对于成人为每次约0.01mg～约1000mg(所含的NK细胞和/或活化NK细胞的浓度通常在约1×105个～1×1011个/ml、优选约1×106个～1×1010个/ml的范围)。
另外，经口给药或非经口给药的药物组合物的给药量根据年龄、体重及病的症状来决定。
(对象)
本发明的癌发病抑制剂、抗体产生能力增强剂、肝炎治疗剂、癌发病抑制方法、抗体产生能力增强方法、以及肝炎治疗方法，以包括人在内的哺乳类为对象。例如可以例示出人、狗、猫、马(尤其是赛马用马)、猪等。
以下，通过实施例来具体说明本发明。另外，这些实施例是为了说明本发明而列举的例子，其并不限定本发明的范围。
实施例一
(NK细胞的培养和增殖)
通过以下的工序，进行自体外周血淋巴细胞的培养和增殖，由此进行活化NK细胞的培养和增殖。
(工序1)
相对于磷酸缓冲液(PBS)20ml，制作正克隆(Orthoclone)OKT3：0.1μl/ml(抗CD3抗体，从杨森制药公司(JanssenPharmaceuticalK.K.)获得)及阿伦单抗(MABCAMPATH)：20μl～40μl/ml(抗CD52抗体、可从拜耳医药公司(BayerAG)获得)的溶液。
(工序2)
将工序1的溶液分别分注到不同的225cm2的烧瓶(frasco)中，在4℃下静置一晚。
(工序3)
将工序2的烧瓶用PBS清洗2次。
(工序4)
从健康人采取肝素抗凝外周30ml，利用将Ficoll-PaquePlus(从AmershamPharmaciaBiotech株式会社获得)用作介质的密度梯度离心法，分离外周血单核细胞(PBMC)。
(工序5)
使工序4中分离出的PBMC以0.5×106～1×106个/ml的浓度悬浮在包含IL-2(500单位/ml、Chiron公司)的NKGM培养基(从日本KOHJIN生物有限公司(KohjinBioCo.，Ltd.)获得)中，再添加患者血浆2％～10％，制成培养液。在该阶段，培养液为60ml～120ml。将该培养液添加到工序3中得到的经固相化抗体处理后的培养烧瓶中。然后，在5％CO2培养器内37℃的环境下进行培养。
(工序6)
在从培养开始起的第3～5天，培养出多个菌落，确认已母细胞化(blast化)后，追加20％～100％培养液，再添加500单位/ml的IL-2。通常，该时期是从培养开始起第3天。
(工序7)
在从在工序6中追加培养液后进入对数增殖期的第1～3天(多为第1天)，将含有活化淋巴细胞的培养液注入NKGM-B(1升装的袋)。再将其分注入2～3袋。分注后，以3～4天为间隔，每袋添加100ml～300mlNKGM培养基及10～20万单位IL-2。
(工序8)
在培养开始起第14～21天，将培养液从袋转移到离心管，将其以600G离心10分钟。从离心管吸引上清液而残留颗粒后，对颗粒加入PBS进行清洗，再次进行离心操作。重复该操作2～3次，充分清洗培养淋巴细胞。最后，收集颗粒，使其悬浮在生理食盐水100ml中，在其中添加人血清白蛋白2％～4％。最后，确认到无菌测试、内毒素测试为阴性。
(冻结保存和解冻)
在培养开始后第3～7天清洗培养细胞，与作为保存液的KMBANKER(日本KOHJIN生物有限公司)一起加入冻结用管中，在液氮罐内保持在-190℃以下进行保存。解冻后，在添加有IL-2的NKGM培养液中培养10～14天。
(培养液中的活化淋巴细胞的解析结果)
在上述培养和增殖后的NK细胞表面出现CXCR3趋化因子受体、NKG2D、TRAIL、特异性活化受体NKp30、NKp44、NKp46的表达。而且，确认到：在培养NK细胞中IFNγ持续产生，在直至至少3周的培养中，以K562为靶的细胞毒活性维持在较高水平。
由以上可以确认：在溶液中活化NK细胞以高浓度存在。
实施例二
(通过给药活化NK细胞对癌发病进行抑制情况的确认)
将包含从健康人得到的活化NK细胞的培养淋巴细胞给药给该健康人。然后，确认该给药后的健康人和未给药的健康人的癌发病率。详细情况如下。
(NK细胞的给药)
将实施例一的培养淋巴细胞解冻，用添加有IL-2的NKGM培养液培养10～14天后，将其进行清洗，使其悬浮在100ml的生理食盐水中，从健康人的静脉进行滴液给药。
每次给药的自培养淋巴细胞数为10.7×109个(参照：图1)。此外，给药的淋巴细胞中，包含最多CD3-CD56+NK细胞或CD56+淋巴细胞(图2)。
另外，给药的详细情况如下。
(健康人的NK细胞给药组和非给药组)
从2006年起开始进行了能够对一个健康人给药10次或其以上量的NK细胞的冻结保存。以到2011年为止最低保存了13个月以上的103例作为对象。其中，根据本人的要求而在保存期间给药1次以上的“给药组”为53例(男性31例、女性22例)，不希望给药的“非给药组”为50例(男性25例、女性25例)。给药组共计给药242次，每人的给药次数为1次～57次，中间值为3次。距离癌发病的期间设为从保存开始直至癌发病的月数。
(给药组和非给药组的分布)
两组全部例子的分布即年龄(图3)及保存期间(图4)在统计学上无显著性差异。给药组和非给药组的总体并无差异，由此可知：可以在两组的比较中统计性地表示通过给药NK细胞而对癌发病进行抑制的情况。
(给药组的癌发病抑制效果的确认)
在保存期间被诊断为癌症者，在“给药组”中有1例，在“非给药组”中有7例(表2、图5及图6)。由以该保存期间为横轴的发病率曲线进行时序检验(Logranktest)(图7)。结果确认到两组的癌发病率有显著性差异，其相对危险性(RelativeRisk)为0.24，通过给药，使癌症被抑制76％。
[表2]
癌发病部位和直至发病的保存期间
(通过给药NK细胞对癌发病进行抑制与其他癌症预防法的比较)
示出作为已知的癌症预防法的硒(BJUInt.2003；91：608)、咖啡(Nutr.Cancer2010；62：21)、绿茶(Am.J.Epidemiol.2008；167：71)、三苯氧胺(Lancet2003；361：296)、雷洛昔芬(JAMA.1999；281：2189)、阿斯匹林(J.Natl.CancerInst.2009；101：256)和本发明的癌发病抑制效果(表3、图8)。本发明的癌发病抑制效果显示出比其他方法更优异的效果。
[表3]
各种癌症预防的相对危险率
实施例三
(通过给药活化NK细胞使抗体效价升高的确认)
将源自5名健康人(A～E)的活化NK细胞以及HB疫苗分别给药给其自身1～3次，确认到抗体效价的升高。
作为对照，将源自健康人(F～H)的“未大量增殖NK细胞的活化T淋巴细胞”以及HB疫苗分别给药给其自身，确认到抗体效价的升高。
另外，未大量增殖NK细胞的活化T淋巴细胞的培养和增殖方法如下。
(活化T淋巴细胞的培养和增殖方法)
为得到自活化T淋巴细胞，通过以下工序进行了外周血淋巴细胞的培养和增殖。
(工序1)
相对于磷酸缓冲液(PBS)20ml，在活化T细胞的培养中，制作抗CD3抗体5μl/ml(正克隆OKT3，从杨森制药公司获得)的溶液。
(工序2)
将工序1的溶液分别分注在不同的225cm2的烧瓶中，在4℃下静置一晚。
(工序3)
将工序2的烧瓶用PBS清洗2次。
(工序4)
从健康人(F～H)采取肝素抗凝外周血30ml，利用将Ficoll-PaquePlus(可从AmershamPharmaciaBiotech株式会社获得)用作介质的密度梯度离心法分离外周血单核细胞(PBMC)。
(工序5)
使工序4中分离出的PBMC以0.5×106～1×106个/ml的浓度悬浮在包含IL-2(500单位/ml、Chiron公司)的NKGM培养基(从日本KOHJIN生物有限公司获得)中，再添加患者血浆2％～10％，制成培养液。在该阶段，培养液为60ml～120ml。将该培养液添加到工序3中得到的经固相化抗体处理后的培养烧瓶中。然后，在5％CO2培养器内37℃的环境下进行培养。
(工序6)
在从培养开始起的第3～5天，培养出多个菌落，确认已母细胞化(blast化)后，再追加20％～100％培养液，并添加了500单位/ml的IL-2。通常，该时期是从培养开始起第3天。
(工序7)
在从在工序6中追加培养液后进入对数增殖期的第1～3天(多为第1天)，将含有活化淋巴细胞的培养液注入NKGM-B(1升装的袋)。通常将其分注入2～3袋。分注后，以3～4天为间隔，每袋添加100ml～300mlNKGM培养基及10万单位～20万单位IL-2。
(工序8)
在培养开始起第14～21天，将培养液从袋转移到离心管中，将其以600G离心10分钟。从离心管吸引上清液而残留颗粒后，对颗粒加入PBS进行清洗，再次进行离心操作。重复该操作2～3次，充分清洗培养淋巴细胞。最后，收集颗粒，使其悬浮在生理食盐水100ml中，在其中添加人血清白蛋白2％～4％。最后，确认到无菌测试、内毒素测试为阴性。
(培养活化NK细胞或者T细胞给药以及B型肝炎疫苗的给药顺序)
对于NK细胞给药组，向5名健康人(A～E)从其肘静脈给药自身的培养活化NK细胞，3天后，肌肉注射基因重组HB疫苗0.5ml(Bimmugen，日本财团法人化学及血清疗法研究所)。在给药疫苗4周后，调查HBs抗体效价。在该组合中，在第1次后的6周之后进行第2次，在6个月后进行第3次。另外，对于A和C在1次给药后结束。
另外，作为对照，对于T淋巴细胞给药组，向3名健康人(F～H)分别静脉注射“不含大量NK细胞的培养活化T淋巴细胞”，并将HB疫苗给药给其自身。给药的间隔与NK给药组相同。
(NK细胞数的测量)
取包含实施例一中得到的NK细胞的培养淋巴细胞(悬浮在生理食盐水中)及悬浮在上述生理食盐水中的淋巴细胞放入微量离心管(Eppendorftube)中，在其中加入规定的标记抗体，利用常规方法将细胞染色。对于染色过的细胞立即用流式细胞计进行解析，测量CD3-CD56+NK细胞数。
(NK细胞数的测量结果)
将包含实施例一中得到的NK细胞的培养淋巴细胞及悬浮在上述生理食盐水中的淋巴细胞中的NK细胞数的平均值示于图9中。
图9是标绘了各例的给药NK细胞数的平均值的图。在NK细胞给药组(A～E)中给药NK细胞数的平均值为4.8×109个，而在T淋巴细胞给药组(F～H)中给药NK细胞数的平均值为0.5×109个。由此，与T淋巴细胞给药组相比较，NK细胞给药组中给药了约10倍的NK细胞。
(HBs抗体效价的测量方法)
使用自身公知的CLIA法(化学发光免疫分析法、chemiluminescentimmunoassay)测量从上述给药前后的健康人A～H获得的血中的HBs抗体效价。该方法的正常值小于10.0mIU/ml。
(HBs抗体效价的测量结果)
将从健康人A～H获得的血中的HBs抗体效价示于图10和图11中。在5例的4例(80％：A、B、C、D这4名)中，能够诱导显著高的抗体效价(参照：图10)。
另一方面，在作为对照的活化T淋巴细胞(给药的NK细胞少于1亿个)和B型肝炎疫苗的给药中，未发现抗体效价的明显升高(参照：图11)。
由以上可知，通过给药NK细胞及B型肝炎疫苗，能够提高抗体效价。尤其是当还考虑到健康人A～D是抗体效价不易升高的60岁以上的男性时，本发明表现出非常优异的抗体效价升高效果。
(总论)
由上述实施例三的结果可知，当将NK细胞以及肝炎疫苗给药给患者时，能够治疗肝炎。
(产业上的可利用性)
本发明能够提供新型的癌发病抑制剂及抗体产生能力增强剂。

Claims (8)

1.NK细胞作为有效成分在制备疫苗的抗体产生能力增强剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疫苗为肝炎疫苗。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肝炎疫苗为B型肝炎疫苗。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的应用，其特征在于，所述NK细胞为活化NK细胞。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的应用，其特征在于，所述抗体产生能力增强剂的给药对象为60岁以上的人。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗体产生能力增强剂的给药对象为60岁以上的人。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述给药对象为男性。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述给药对象为男性。
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