ES2310711T3

ES2310711T3 - Celulas autologas inductoras de la auto-tolerancia de origen monocitico y su uso en preparaciones farmaceuticas.

Info

Publication number: ES2310711T3
Application number: ES04701001T
Authority: ES
Inventors: Bernd Karl Friedrich Kremer; Fred Fandrich; Maren Schulze
Original assignee: Blasticon Biotechnologische Forschung GmbH
Current assignee: Blasticon Biotechnologische Forschung GmbH
Priority date: 2002-07-12
Filing date: 2004-01-09
Publication date: 2009-01-16
Anticipated expiration: 2024-01-09
Also published as: EP1492869A1; CA2492383A1; ZA200601074B; DE10231655A1; RU2005103627A; IL166021A0; CN100523176C; DE60302231T2; ZA200501054B; DK1492869T3; US20060286670A1; EP1492869B9; CN1681918A; EP1492869B1; BR0312693A; DE60320009T2; RU2370535C2; EP1557462A2; JP2005532803A; ATE390480T1

Abstract

Un procedimiento para preparar células para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con los trastornos de la auto-tolerancia en un paciente, caracterizado porque a) los monocitos aislados de la sangre del paciente al que se han de administrar las células se multiplican in vitro en un medio de cultivo adecuado que contiene el factor de crecimiento celular M-CSF; b) los monocitos se cultivan al mismo tiempo o después de la etapa a) en un medio de cultivo que contiene gamma- IFN; y c) las células formadas en la etapa b) se obtienen separando las células del medio de cultivo.

Description

Células autólogas inductoras de la auto-tolerancia de origen monocítico y su uso en preparaciones farmacéuticas.

La invención se refiere a células autólogas de origen monocítico, que son capaces de inducir auto-tolerancia inmunológica en un paciente. Estas células se denominan en adelante "STIC" (Self-Tolerance Inducing Cells: células inductoras de auto-tolerancia). La invención se refiere además al uso de STIC en preparados farmacéuticos para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con trastornos de la auto-tolerancia, como en enfermedades inmunitarias y alergias en particular.

En relación con la invención, el término "autólogas" indica que las STIC se derivan de monocitos de la sangre del propio paciente al que se han de administrar las STIC.

Se ha demostrado por los autores de la presente invención que las células de la invención son capaces de inducir células T reguladoras (Treg_{CD4+25+}). La invención, por tanto, se refiere también a la inducción y/o la preparación in vitro de células T reguladoras.

El sistema inmunitario protege al organismo frente a antígenos potencialmente patógenos, como por ejemplo los microorganismos, al tiempo que normalmente evita reaccionar con constituyentes del propio organismo; esto es, el sistema inmunitario sano tolera los "auto-antígenos".

El trastorno de la auto-tolerancia tiene lugar cuando se organizan respuestas inmunitarias adaptativas (adquiridas) específicas contra auto-antígenos. La consecuencia normal de una respuesta inmunitaria adaptativa contra el antígeno extraño es el aclaramiento o eliminación del antígeno del cuerpo. Sin embargo, cuando se desarrolla una respuesta inmunitaria adaptativa contra autoantígenos, normalmente es imposible que los mecanismos efectores inmunitarios eliminen el antígeno completamente, y de esta forma tiene lugar una respuesta ininterrumpida. La consecuencia es que las rutas efectoras de inmunidad producen daños inflamatorios crónicos a los tejidos, que pueden resultar letales (véase Immuno Biology 5, The Immune System In Health and Disease, Garland Publishing 2001, capítulo 13, páginas 501 a 522).

Las respuestas inmunitarias adaptativas se inician por la activación de células T y/o B específicas del antígeno, y se cree que la autoinmunidad se inicia de la misma forma (Immuno Biology, loc.cit. pág. 501).

Una realización de la invención preferida se refiere al tratamiento y/o la prevención de enfermedades autoinmunitarias usando preparados farmacéuticos que contienen STIC.

Pueden distinguirse dos patrones principales de enfermedades autoinmunitarias. Las enfermedades en las que la manifestación de autoinmunidad está restringida a órganos específicos del cuerpo son conocidas como enfermedades autoinmunitarias "órgano-específicas", mientras que, en las enfermedades autoinmunitarias "sistémicas", son afectados muchos tejidos del cuerpo. Ejemplos de enfermedades autoinmunitarias "órgano-específicas" son la tiroiditis de Hashimoto y la enfermedad de Graves, cada una de las cuales afecta de forma predominante a la glándula tiroides, y la diabetes mellitus insulina-dependiente de tipo I, que afecta a los islotes pancreáticos. Ejemplos de enfermedades autoinmunitarias sistémicas son el lupus eritematoso sistémico y el síndrome primario de Sjögren, en las que tejidos tan diversos como la piel, los riñones y el cerebro pueden estar afectados todos ellos (véase Immuno Biology, loc.cit, página 503).

Hay enfermedades autoinmunitarias que se cree que están mediadas principalmente por células T, como por ejemplo la diabetes mellitus dependiente de la insulina, la artritis reumatoide y la esclerosis múltiple, mientras que, en otros casos, la formación de anticuerpos contra la superficie de la célula o antígenos de matriz desempeña un papel determinante, como por ejemplo en la anemia hemolítica autoinmunitaria, la púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, el síndrome de Goodpasture, el pénfigo vulgar o la fiebre reumática aguda; hay aún otro grupo que son enfermedades del complejo inmunitario, en las que están implicadas tanto las células T como las células B, como por ejemplo crioglobulinemia esencial mixta, lupus eritematoso sistémico o artritis reumatoide (véase Immuno Biology, loc. cit., Fig. 13. 1 en la página 502).

Otra realización de la presente invención se refiere al tratamiento de alergias con las STIC de la invención, formuladas como preparados farmacéuticos.

Recientemente se ha sugerido que las células T reguladoras juegan un importante papel en el control de la homeostasis inmunitaria, esto es, una respuesta inmunitaria orquestada contra cualquier diana infecciosa o relacionada con un antígeno incluyendo la auto-tolerancia inmunológica, véanse Takeshi Takahashi y Shimon Sakaguchi, International Review of Cytology, 225, 1-32 (2003); Shimon Sakaguchi, Vox Sang 83, 151-153 (2002), Kathryn J. Wood y Shimon Sakaguchi, Nature Reviews Immunology, 3. 199-210 (2003).

Como afirman Takahashi et al., loc.cit. página 1, Resumen, "La evidencia acumulada indicó que el control dominante mediado por células T de células T auto-reactivas contribuye al mantenimiento de la autotolerancia inmunológica y su alternación puede conducir al desarrollo de una enfermedad autoinmunitaria. Los esfuerzos para delinear tales poblaciones de células T reguladoras han revelado que las células CD25^{+} dentro de la población de CD4^{+} en animales normales no sometidos previamente a ninguna experimentación (naive), incluyendo personas, poseen la actividad reguladora. Las células T reguladoras CD25^{+} más CD4^{+} son producidas por el timo normal como una subpoblación de células T distintas funcionalmente. Desempeñan papeles críticos no sólo en la prevención de la autoinmunidad sino también en el control de diversas reacciones inmunitarias".

Además de las enfermedades autoinmunitarias mediadas por células T, el compartimiento de células B del sistema inmunitario puede disparar enfermedades autoagresivas asociadas con la producción de anticuerpos dirigidos contra las estructuras de células propias (incluyendo mastocitos), tejidos y órganos.

Es bien sabido que la activación de las células B depende de la ayuda de las células T de manera que las células T colaboradoras estimulan la expansión de células B clonales al tener lugar la presentación de antígenos específicos. Estos antígenos pueden derivarse de alérgenos fragmentados y son después procesados dentro de la célula T para dar péptidos de molécula pequeña. Después estos son presentados de una manera restringida por el MHC (complejo mayor de histocompatibilidad) con el fin de estimular la activación específica del antígeno.

Con el fin de prevenir la activación de las células B descontrolada o excesiva, causada por alérgenos específicos que, por una parte, conduce a enfermedades alérgicas y que, por otra parte, puede inducir el trastorno de la auto-tolerancia (véase antes), las células T reguladoras tienen la capacidad de interferir con la activación de las células B asociada a células T y prevenir la producción de anticuerpos excesiva y descontrolada.

De forma similar a las enfermedades autoinmunitarias, también las enfermedades alérgicas pueden por tanto ser influenciadas y controladas aumentando la cantidad de células T reguladoras (células T CD4^{+}/CD25^{+}). En particular, se ha demostrado en ratones que padecen de EAE ("Experimental Allergic Encephalomyelitis": encefalomielitis alérgica experimental) que la enfermedad remite un par de semanas después de que se hayan administrado células T CD^{+}4 a estos animales, y que la curación está asociada con la resistencia a cualquier otra inducción de la enfermedad (Bach, J. F. "Regulatory T Cells under Scrutiny" Nature Reviews Immunology 3: 189-198 (2003); Lando, Z. et al. "Effect of cyclophosphamide on suppressor-cell activity in mice unresponsive to EAE" J. Immunol. 123: 21556-2160 (1979)). Estos efectos son similares a los mostrados para ratones NOD en los que la progresión de la diabetes autoinmunitaria puede detenerse mediante la administración de células CD4^{+}, dando además lugar a la protección de los ratones contra nuevos brotes de la enfermedad autoinmunitaria (Bach, J. F., loc. cit.).

Ejemplos de enfermedades alérgicas que pueden asociarse con reacciones autoinmunitarias son todos los tipos de alergias inducidas por proteínas no propias, sustancias orgánicas e inorgánicas que encuentran el cuerpo. Es este aspecto son de particular importancia las alergias inducidas por el polen, como p. ej. la fiebre del heno, y las alergias inducidas por alérgenos como fármacos, productos químicos, virus, bacterias, hongos, polvo doméstico, componentes de los alimentos, metales, gas, componentes corporales de animales tales como las escamas de la piel o el pelo, y excreciones animales.

Hasta ahora no se dispone de terapias efectivas para la prevención ni el tratamiento de enfermedades resultantes de la alteración de la auto-tolerancia.

Con respecto a las enfermedades autoinmunitarias específicas de un órgano, normalmente se aplica tratamiento de sustitución, trasplante o tratamiento sintomático con agentes antiinflamatorios como la cortisona. Con respecto a las enfermedades autoinmunitarias sistémicas, frecuentemente se usan para el tratamiento agentes inmunosupresores. Claramente estas "terapias" son problemáticas en muchos aspectos y adolecen de efectos secundarios serios.

Se estima que hasta el 5% de la población está afectada por enfermedades autoinmunitarias (Sakagushi, loc. cit., page 151, columna izquierda). Por consiguiente, existe la urgente necesidad de medios efectivos para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con la alteración de la auto-tolerancia, que sean fáciles de manejar y que no estén asociados con los efectos secundarios amenazadores para la salud, ni con los elevados costes que suponen los métodos y agentes aplicados hasta ahora en el tratamiento de tales enfermedades.

Por consiguiente, el problema que subyace en la presente invención es proporcionar medios mejorados para prevenir y/o tratar enfermedades asociadas con la alteración de la auto-tolerancia.

Para la solución del problema, se propone el uso de de células autólogas inductoras de la auto-tolerancia (STIC) de origen monocítico procedentes de vertebrados, en particular de mamíferos y más preferentemente de seres humanos. Estas células pueden obtenerse por los procedimientos de la presente invención que se describen más adelante, los cuales procedimientos tienen por resultado células modificadas, capaces de aumentar la cantidad de linfocitos T reguladores (células T CD4^{+}/CD25^{+}) en el cuerpo de un individuo. Después de la administración de aproximadamente 10^{5} células/Kg de peso corporal (BW: Body Weight), estas células son adecuadas para prevenir y/o tratar enfermedades asociadas con la alteración de la auto-tolerancia.

M. Lopez et al., European Cytokine Network, vol. 5, nº 4, 1994, páginas 411 a 414, publican el uso de monocitos sanguíneos autólogos para aumentar al número de macrófagos autólogos para reinfusión en experimentos de inmunoterapia del cáncer. La reinfusión de un número elevado de macrófagos autólogos fue bien tolerada y no se observaron en el plasma del paciente aumento de los niveles de TNF-alfa, IL-6 o CD14 soluble (página 413, columna izquierda, párr. 1º y 2º).

Descripción de las figuras

Figura 1: Determinación por citometría de flujo de la capacidad de unión de GM-7 a células monocíticas originales antes (gráfico del lado izquierdo) y después (gráfico del lado derecho) de la modificación de las células de acuerdo con la presente invención. El eje X indica el número de células unidas.

Figura 2: Cultivo mixto de linfocitos de monocitos CD14^{+} procedentes de un individuo B (GM-7^{-}: columna gris; GM-7^{+}: columna negra), células respondedoras procedentes de un donante A MHC-discordante, y células irradiadas procedentes de un donante B para comparar la actividad supresora de las células CD14^{+}/GM-7^{+} y CD14^{+}/GM-7^{-}.

Figura 3: Determinación por citometría de flujo de la cantidad de monocitos CD14^{+} y de linfocitos CD2^{+} en la fracción de monocitos así como de la cantidad de las células CD-14^{+}/CD3^{+} efectivas como TAIC, para determinar la influencia de la purificación de las células para enriquecer monocitos al comienzo del cultivo, sobre la formación de células CD14^{+}/CD3^{+} inmunosupresoras.

Figura 4: Cultivo linfocitario mixto de linfocitos estimulados por PHA (PhaLy) y TAIC ("Mo + Ly" o "Mo"), preincubados en dos experimentos con un inhibidor (1-MT) de indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO) para determinar la influencia de 1-MT sobre la actividad supresora de las TAIC.

Figura 5: Determinación por citometría de flujo de la expresión de GM-7 en la sangre de pacientes postoperatoriamente antes (Figura de la izquierda) y después (Figura de la derecha) de la inyección de TAIC, para determinar la influencia de TAIC sobre la expresión in vivo de GM-7 en las células sanguíneas.

Figura 6: Tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de secciones del colon de ratones que padecen colitis crónica inducida con dextrano sulfato sódico (DSS), que ilustra la condición del colon de un animal del grupo 3 no tratado (Fig. 6A/B), un animal del grupo 1 tratado con STIC el día +1 después del tratamiento con DSS (Fig. 6C/D), un animal del grupo 4 tratado con "células testigo" el día +1 (Fig. 6E) y de un animal tratado con STIC el día +7 (Fig. 6F) (2,5 aumentos en la Fig. 6A/CE; 10 aumentos en la Fig. 6B/D/F).

Figura 7: Cambios en el peso corporal de ratones que padecen colitis crónica inducida por dextrano sulfato sódico (DSS) en el curso de un periodo de 3 semanas después del final del tratamiento con DSS. Los animales del grupo 1 (\blacksquare) han sido tratados con STIC el día +1, los animales del grupo 2 (\ding{115}) han sido tratados con STIC el día +7, los animales del grupo 3 (\ding{116}) no han sido tratados, mientras que los animales del grupo 4 (\bullet) han sido tratados con "células testigo" el día +1. Los valores son valores medios obtenidos a partir de 5 a 7 ratones por grupo, y la desviación estándar es siempre inferior a \pm 15%.

Figura 8: Resultados de la puntuación de secciones de colon, teñidas histoquímicamente, de ratones que padecen colitis crónica inducida por dextrano sulfato sódico (DSS). Los animales del grupo 1 han sido tratados con STIC el día +1, los animales del grupo 2 han sido tratados con STIC el día +7, los animales del grupo 3 no han sido tratados, mientras que los animales del grupo 4 han sido tratados con "células testigo" el día +1. (Puntuación 0 = hallazgo sano no oclusivo; puntuación 1 = colitis mínima; puntuación 2 = colitis moderada; puntuación 3 = colitis intensa; y puntuación 4 = colitis ulcerosa acompañada por destrucción de la mucosa completa).

Figura 9: Cambios en el peso corporal de ratones del modelo de transferencia SCID CD62L^{+}/CD4^{+} de colitis experimental crónica con referencia al peso de los ratones 6 semanas después del comienzo del experimento cuando reciben la terapia celular. Los animales del grupo 1 (\blacklozenge) han sido tratados con STIC después de seis semanas, los animales del grupo 2 (\blacksquare) no han sido tratados, y los animales del grupo 3 (\ding{115}) han sido tratados con "células testigo" después de seis semanas. Los valores son valores medios obtenidos de 6 ratones por grupo, y la desviación estándar es siempre inferior a \pm 15%.

Figura 10: Medida de la longitud del colon (Fig. 10A) y del peso del bazo (Fig. 10B) de ratones que reciben STIC (grupo 1); de ratones testigo no tratados (grupo 2) y de ratones que reciben "células testigo" (grupo 3) en el modelo de transferencia SCID CD62L^{+}/CD4^{+} de colitis crónica experimental. Los valores son valores medios \pm SEM.

Figura 11: Puntuación de secciones de colon teñidas histoquímicamente de ratones del modelo de transferencia SCID CD62L^{+}/CD4^{+} de colitis crónica experimental seis semanas después de la transferencia de las células. Los animales del grupo 1 han recibido STIC, los animales del grupo 2 no han sido tratados y no han recibido inyección de células, mientras que los animales del grupo 3 han recibido "células testigo". Los valores son valores medios \pm SEM. (Puntuación 0 = hallazgo sano no oclusivo; puntuación 1 = colitis mínima; puntuación 2 = colitis moderada; puntuación 3 = colitis intensa; y puntuación 4 = colitis ulcerosa acompañada por destrucción de la mucosa
completa).

Figura 12: Tinción con H&E de secciones del colon de ratones del modelo de transferencia SCID CD62L^{+}/CD4^{+} de colitis crónica experimental, que ilustra la condición del colon de dos animales no tratados del grupo 2 (Fig. 12A/B), de dos animales del grupo 3 tratados con "células testigo" (Fig. 12C/D) y de dos animales del grupo 1 tratados con STIC (Fig. 12E/F) (100 aumentos).

Sumario de la invención

Las etapas básicas del procedimiento para preparar células autólogas inductoras de auto-tolerancia (STIC) de origen monocítico comprenden:

(a): aislar los monocitos de la sangre del propio paciente al que se han de administrar las células;

(b): propagar los monocitos en un medio de cultivo adecuado que contiene el factor estimulador de colonias de macrófagos (en adelante denominado M-CSF, por sus siglas en inglés) como agente de promoción del crecimiento;

(c): estimular los monocitos con \gamma-interferón (en adelante denominado \gamma-IFN); y

(d): obtener las células inductoras de auto-tolerancia formadas en la etapa (c) separando las células del medio de cultivo.

Un procedimiento similar se describe en la solicitud de patente alemana DE 102 31 655.4 y en la solicitud de patente internacional WO 2004/007701. En las anteriores solicitudes de patente antes mencionadas las células preparadas de esta forma se denominan "células inductoras de la aceptación del transplante" (TAIC: "Transplant Acceptance Inducing Cells"). Se usan para inducir la aceptación del tejido del donante alogénico en el receptor. Es importante que las TAIC descritas en el documento DE 102 31 655.4 y en el documento PCT/EP03/07551 se derivan de monocitos del donante y son administradas al receptor con el fin de inducir la aceptación del transplante. Esto significa que las TAIC son alogénicas respecto del individuo que se ha de tratar con las TAIC.

En cambio, la presente invención se basa en el concepto de "tratamiento autólogo"; esto significa que un individuo que padece de una alteración de la auto-tolerancia, en particular de enfermedades autoinmunitarias y/o alergias, es tratado con células inductoras de la autotolerancia (STIC), que se derivan de monocitos autólogos.

Por consiguiente, aunque las TAIC y las STIC se derivan ambas de monocitos por un procedimiento que es esencialmente el mismo, las TAIC son alogénicas respecto del paciente a tratar, mientras que las STIC son autólogas en este aspecto.

Con respecto al procedimiento para producir STIC, se ha demostrado que la estimulación con \gamma-IFN representa un paso decisivo (véase el Ejemplo 2).

En el contexto de la presente invención, la expresión "células inductoras de autotolerancia (STIC, por sus siglas en inglés) de origen monocítico" designa la población de células que se obtiene de la etapa (d) del procedimiento descrito anteriormente. Esta población de células, junto a las células derivadas de monocitos, que son efectivas en la inducción de autotolerancia, comprende también linfocitos, véase el Ejemplo 4, así como opcionalmente otras células derivadas de la fracción de células mononucleares, como por ejemplo granulocitos. La cantidad de células derivadas de monocitos dentro de la población de STIC es preferentemente del 50 al 90%, más preferentemente del 60 al 70%, referido al número total de células.

Con respecto a la presente invención, la expresión "número total de células" se refiere a la cantidad de células vitales en la población de células que se está considerando. Esta cantidad puede determinarse mediante la "técnica de exclusión de colorante azul de tripano", dado que este colorante permite distinguir células vitales de células no vitales por medios ópticos.

Las STIC pueden usarse normalmente en una cantidad de 10^{4} a 10^{6} células por kilogramo de peso corporal, preferentemente 10^{5} células por kilogramo de peso corporal, para inducir autotolerancia. La administración de STIC puede llevarse a cabo repetidamente.

Las STIC de acuerdo con la presente invención han probado estar exentas de riesgo en cuanto a la formación de malignomas, tanto en pruebas con animales como en cultivo; este es un resultado que no cabría haber esperado en ninguna otra manera debido a la naturaleza de la célula monocítica original a partir de la cual se derivan las células de acuerdo con la presente invención.

Como se explica con detalle más adelante, otras sub-poblaciones de células que tienen propiedades inductoras de autotolerancia optimizadas pueden ser aisladas a partir de la fracción de células presentes en las STIC, que se derivan de monocitos.

Después del cultivo in vitro y la estimulación de las células originales (monocitos) con \gamma-interferón, se forman STIC que comprenden una subpoblación de células, véase el Ejemplo 3, que se une al anticuerpo monoclonal GM-7, que es expresado por la línea de células de hibridoma DSM ACC2542. El anticuerpo monoclonal GM-7 es un anticuerpo del isotipo IgG_{2a} de la inmunoglobulina, cuya cadena ligera muestra el isotipo kappa. La propiedad característica de este anticuerpo es su capacidad estricta para unirse a los monocitos modificados por las condiciones de cultivo de acuerdo con la presente invención, ya que las células monocíticas originales no son reconocidas, es decir, la unión del anticuerpo a las células originales no tiene lugar (véase el Ejemplo 3). Además, se demostró con 20 voluntarios que GM-7 no se une a células humanas de la sangre periférica, véase la Figura 5.

Como se ha descrito en el documento WO 2004/007701, el anticuerpo se preparó inmunizando ratones con TAIC (correspondientes a STIC) derivadas de monocitos humanos, usando métodos conocidos por los profesionales expertos en la técnica (Davis, W. C. "Methods in Molecular Biology: Monoclonal Antibody Protocols", New York: Humana Press Inc. Totowa, 1995). Después se produjo una línea de células de hibridoma por fusión de una célula B que genera el anticuerpo y una célula de mieloma del ratón. Los métodos usados para la preparación de tales líneas de células son conocidos en el estado actual de la técnica (Davis, W. C. "Methods in Molecular Biology: Monoclonal Antibody Protocols", New York: Humana Press Inc. Totowa, 1995; Kohler, G., Milstein, C. "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity", Nature 256, 495-497 (1975)). La línea de células de hibridoma que producen el anticuerpo GM-7 fue depositado de acuerdo con las normas de la Convención de Budapest en el organismo DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultur GmbH, Braunschweig, Alemania) bajo el número de registro DSM ACC2542.

La Figura 1 muestra la capacidad de unión, determinada mediante citometría de flujo, de GM-7 a células monocíticas después de la modificación in vitro de acuerdo con la presente invención. Puede observarse que los monocitos CD14-positivos obtenidos directamente a partir de la fracción de células mononucleares no se unen al anticuerpo GM-7 (la nube sombreada en gris es congruente con el testigo de anticuerpo no sombreado). En cambio, después del cultivo en presencia de M-CSF y la estimulación con \gamma-IFN, parte de los monocitos expresan un antígeno que es reconocido por el anticuerpo monoclonal GM-7. El anticuerpo monoclonal GM-7 fue caracterizado como isotipo \kappa-IgG_{2a}. El procedimiento de acuerdo con la presente invención, en consecuencia, conduce a un cambio en el patrón fenotípico de la expresión del antígeno en la membrana celular de los monocitos modificados (Figura 1).

El anticuerpo monoclonal GM-7 se une específicamente a esa población de células que, entre las células producidas por el procedimiento de acuerdo con la presente invención, inducen las células inductoras de autotolerancia más efectivas (véase la Figura 5).

Por consiguiente, una realización preferida de la presente invención se refiere a tales STIC, que son capaces de unirse al anticuerpo GM-7. Estas células son designadas subsiguientemente como STIC_{GM7}.

El anticuerpo GM-7 de acuerdo con la presente invención, por consiguiente, representa un agente extraordinariamente efectivo y fácil de manejar, para seleccionar y purificar las células que inducen autotolerancia (STIC). Por medio del anticuerpo, es posible de acuerdo con la invención generar una población de STIC homogénea y altamente efectiva.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, las células inductoras de autotolerancia formadas en la etapa (c) del procedimiento de la invención descrito anteriormente, que expresan el antígeno que se une al anticuerpo GM-7, pueden seleccionarse directamente a partir del medio de cultivo de acuerdo con la etapa (c), o bien pueden seleccionarse a partir de la población de células obtenida después de separar las células del medio de cultivo de acuerdo con la etapa (d) del procedimiento de la presente invención antes mencionado, respectivamente, por unión al anticuerpo GM-7 producido por la línea de células de hibridoma DSM ACC2542.

Para seleccionar las STIC de acuerdo con la presente invención, el anticuerpo se pone en contacto con la muestra bajo condiciones que permiten la unión del anticuerpo a las células inductoras de autotolerancia presentes en la muestra. Los complejos de reacción resultantes de la reacción de unión son subsiguientemente separados de la muestra. Con este fin, el anticuerpo puede ser inmovilizado sobre un material portador antes del contacto con la muestra; por ejemplo, puede ser unido a una matriz adecuada para fines cromatográficos o a las llamadas "esferas magnéticas". Este procedimiento permite seleccionar y concentrar células inductoras de autotolerancia a partir de grandes volúmenes de muestra.

Para obtener las células inductoras de autotolerancia, la unión entre el anticuerpo y las células inductoras de autotolerancia se separa después de aislar el complejo de reacción de la muestra. Esto puede llevarse a efecto por métodos conocidos en el estado actual de la técnica, tal como p. ej. por desplazamiento competitivo o mediante lavado con soluciones salinas. Los correspondientes métodos se describen, por ejemplo, en Utz U. et al. ("Analysis of the T-cell Receptor repertoire of human T-cell leukemia virus type-1 (HTLV-1) Tax-specific CD8+ Cytotoxic T Lymphocytes from patients with HTLV-1 associated disease: Evidence for the oligoclonal expansion" J. of Virology Feb. 1996, 843-851).

Además, el anticuerpo monoclonal GM-7 permite la detección cualitativa y cuantitativa de las células inductoras de autotolerancia de origen monocítico de acuerdo con la presente invención en muestras de sangre y/o tejido del paciente in vitro. La formación de complejos de reacción en la muestra, que indican la presencia y, si es el caso, la cantidad de células inductoras de autotolerancia, se detecta por métodos conocidos.

Para detectar los complejos de reacción es posible en este caso acoplar ("marcar") el anticuerpo GM-7, por ejemplo, directamente con una molécula detectable que p. ej. se une covalentemente al anticuerpo. Las moléculas detectables adecuadas se describen en gran número en el campo del diagnóstico molecular e incluyen, entre otras, colorantes fluorescentes tales como isotiocianato de fluoresceína o rodamina-5-isotiocianato de tetrametilo, colorantes luminiscentes, moléculas marcadas radiactivamente y enzimas tales como peroxidasas (véase Lottspeich, F., Zorbas, H. "Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin, 1998).

La detección del anticuerpo tiene lugar dependiendo de la molécula elegida para el marcado del primero. En conexión con la presente invención, el anticuerpo GM-7 fue acoplado con la molécula fluorescente isotiocianato de fluoresceína (FITC) de forma que la detección del anticuerpo pudiera levarse a cabo por medio de citometría de flujo y/o microscopía de fluorescencia. Los métodos para marcar anticuerpos con FITC son conocidos por los profesionales expertos en la técnica que trabajan en este campo.

Alternativamente, el complejo de reacción puede también ser detectado en un procedimiento en dos etapas usando anticuerpos secundarios. En relación con esto, el anticuerpo GM-7 no marcado puede ser detectado en el complejo de reacción con otro anticuerpo marcado (véase Lottspeich, F., Zorbas, H. "Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin, 1998). Este método de detección en dos etapas se considera más sensible que la detección directa del anticuerpo de acuerdo con la presente invención, ya que a un anticuerpo GM-7 pueden unirse varios anticuerpos secundarios marcados (amplificación de señal).

En consecuencia, el anticuerpo GM-7 permite la detección de STIC en la sangre periférica del paciente tratado con STIC, por ejemplo en forma de "monitorización", durante la cual el número de células en la sangre periférica se determina a intervalos de tiempo específicos.

Como es obvio para un profesional experto en la técnica, es posible preparar anticuerpos monoclonales contra STIC a partir de monocitos también de animales vertebrados no humanos, en particular a partir de monocitos de primates y cerdos, modificados de acuerdo con la presente invención. En este aspecto, la inmunización de los correspondientes animales hospedadores y la generación de la correspondiente línea de células de hibridoma se llevan a cabo como se describió anteriormente para las STIC de origen humano.

Una realización particularmente preferida de la presente invención se refiere a una sub-población de las STIC de la invención, que coexpresan los antígenos CD3 y C14 en su superficie celular. Estas células se indican subsiguientemente como STIC_{CD3+/CD14+}. Como se explica con más detalle más adelante, se ha señalado que estas células inducen la formación de linfocitos T reguladores.

Las STIC que coexpresan los antígenos de superficie CD3 y CD14 pueden ser seleccionadas directamente a partir de las células inductoras de autotolerancia formadas en la etapa (c) del procedimiento de la presente invención anteriormente descrito, o pueden ser seleccionadas a partir de la población de células obtenida después de separar las células del medio de cultivo de acuerdo con la etapa (d) del procedimiento de la presente invención anteriormente mencionado, o alternativamente pueden ser seleccionadas entre la población de STIC_{GM7}.

Además, se ha demostrado por referencia a las TAIC del documento PCT/EP03/07551, que las células preparadas de acuerdo con el procedimiento descrito en el presente texto expresan los genes Foxp3, CTLA4 e Integrina \alpha_{E}\beta_{7} intensamente (véase el Ejemplo 6, que corresponde al ejemplo 12 del documento PCT/EP03/07551). En cambio, estos genes no son expresados, o lo son tan solo en pequeña cuantía, por los monocitos originales. La regulación al alta de la expresión de los genes Foxp3, CTLA4 e Integrina \alpha_{E}\beta_{7} es por tanto una característica de las células STIC_{CD3+/CD14+}.

Como se discute en el Ejemplo 6, la expresión de los marcadores Foxp3, CTLA4 e Integrina \alpha_{E}\beta_{7} fue descrita con anterioridad solamente para los linfocitos T reguladores. Los linfocitos T, que co-expresan los antígenos de superficie CD4 y CD25, son una sub-población de linfocitos T reguladores, que también se señalan como "células supresoras". Su función es suprimir la respuesta inmunitaria del cuerpo. En particular, Foxp3 se ve como un factor de transcripción específico que sirve como gen de control para el desarrollo de células T reguladoras, y que es expresado específicamente por estas células. De acuerdo con la presente invención, se prefiere que las células STIC_{CD3+/CD14+} expresen al menos 1 x 10^{-9}, más preferentemente al menos 5 x 10^{-9}, y de una manera particularmente preferida al menos 1 x 10^{-8} \mug de RNA de Foxp3 por \mug de RNA total.

Del mismo modo CTLA4 se considera como un marcador para la detección de la función reguladora de los linfocitos T, en particular de linfocitos T CD4/CD25 positivos (véase la bibliografía citada en el Ejemplo 6). De acuerdo con la presente invención, las células STIC_{CD3+/CD14+} deben expresar preferentemente al menos 5 x 10^{-7}, más preferentemente al menos 3 x 10^{-6}, y de una manera particularmente preferida al menos 5 x 10^{-6} \mug de RNA de CTLA4 por \mug de RNA total.

La Integrina \alpha_{E}\beta_{7}, que reconoce la cadherina epitelial, fue descrita recientemente por Lehmann et al. en PNAS 99, páginas 13031 a 13036 (2002) como un nuevo marcador para una subpoblación de linfocitos T reguladores muy potentes, que interaccionan con el entorno epitelial. La expresión del RNA de Integrina \alpha_{E}\beta_{7} debe llegar, de acuerdo con la presente invención, en las células STIC_{CD3+/CD14+} a una cantidad de preferentemente al menos 1 x 10^{-12}, más preferentemente al menos 1 x 10^{-11}, y de una manera particularmente preferida al menos 1 x 10^{-10}, y lo más preferentemente al menos 1 x 10^{-9} \mug por 1 \mug de RNA total.

Como se muestra en la Tabla del Ejemplo 6, el co-cultivo directo de las células de la presente invención con linfocitos conduce a un aumento significativo del número de linfocitos T reguladores, en particular de células CD4^{+}/CD25^{+} en la población de linfocitos con una expresión fuertemente regulada al alza, o por exceso, de los genes Foxp3, CTLA4 e Integrina \alpha_{E}\beta_{7}. El Ejemplo demuestra además que este efecto no se observa si las células de la presente invención son co-cultivadas indirectamente con linfocitos.

Estos resultados indican que la estimulación de la formación y/o la propagación de linfocitos T reguladores por las células de la presente invención están implicadas en la inducción de la autotolerancia por estas células.

El Ejemplo 7 (corresponde al Ejemplo 13 del documento PCT/EP03/07551) confirma la hipótesis de una implicación de las células de la presente invención en la inducción de la supresión de una respuesta inmunitaria por referencia a las TAIC del documento PCT/EP03/07551 (véase anteriormente). En este Ejemplo, los linfocitos de animales receptores fueron incubados con células supresoras inmunitarias procedentes de los correspondientes animales donadores in vitro. Para la inducción de la tolerancia, los linfocitos del receptor preincubados con TAIC derivadas del donante fueron inyectados en los animales en vez de TAIC. La tolerancia específica del donante pudo inducirse también de esta manera, mientras que los animales a los que se administraron linfocitos del receptor no co-cultivados con TAIC derivadas del donante, no desarrollaron tolerancia.

Las STIC de la presente invención pueden ser usadas como tales como preparado farmacéutico. Las células obtenidas de la etapa (d) del método de la presente invención como se describe anteriormente pueden ser usadas directamente. Aproximadamente del 10 al 50% de las células totales de las poblaciones así obtenidas están formadas por linfocitos y granulocitos, que proceden del aislado de monocitos inicial (fracción de células mononucleares). Estas células apoyan la formación de las STIC de la presente invención derivadas de los monocitos en la etapa de cultivo (véase el Ejemplo 4); no interfieren con la inducción de autotolerancia si las STIC de la presente invención se usan como preparado farmacéutico.

Sin embargo, de acuerdo con otras realizaciones preferidas de la presente invención, las subpoblaciones STIC_{GM7} y/o STIC_{CD3+/CD14+} pueden ser aisladas de la totalidad de la población de STIC obtenida del procedimiento de la presente invención (véase anteriormente) y pueden ser usadas para la inducción de autotolerancia.

En medios de cultivo (véase el Ejemplo 2), las STIC y/o las STIC_{GM7} y/o STIC_{CD3+/CD14+} pueden guardarse durante al menos 48 horas sin que se pierda su efecto inductor de autotolerancia.

Para su uso como preparado farmacéutico, las STIC y/o las subpoblaciones STIC_{GM-7} y/o STIC_{CD3+/CD14+} suspendidas, p. ej., en suero humano AB0 compatible (adecuado para uso universal) pueden ser administradas por vía intravenosa como transfusión corta.

En este contexto los preparados farmacéuticos pueden comprender las STIC de la presente invención en combinación con agentes antiinflamatorios convencionales y/o inmunosupresores convencionales tales como esteroides, en particular cortisona, metotrexato, ciclofosfamida, azatioprina, ácido 5-aminosalicílico (5-ASA), anticuerpos TNF-\alpha, \alpha-interferón y anticuerpos de células B, tales como p. ej. Rituximab, para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias específicas de un órgano o sistémicas.

Además, las STIC de la presente invención pueden ser usadas para el tratamiento de alergias en combinación con antihistamínicos, preparados de teofilina, \beta-miméticos, esteroides, en particular cortisona, y ácido de cromoglicina.

Descripción detallada de la invención

Las células de partida para el procedimiento de acuerdo con la invención son monocitos sanguíneos autólogos, es decir, monocitos procedentes de la sangre del propio paciente al cual se han de administrar las células de la presente invención. Preferentemente, los monocitos autólogos son procedentes de sangre humana. Los monocitos pueden obtenerse por cualquier procedimiento de aislamiento, en particular por leucoaféresis o a partir de la fracción de células mononucleares de la sangre completa ("buffy coat" o capa leucocítica). La leucoaféresis es particularmente preferida.

Leucoaféresis es un término general para un procedimiento en varias etapas que usa un aparato de aféresis disponible comercialmente, en el que la sangre completa de una sujeto humano es extraída y separada en fracciones, y las fracciones, excepto para la fracción de células mononucleares, son retransfundidas a dicho sujeto humano. Este procedimiento puede llevarse a cabo como se explica con más detalle, p. ej., en el documento EP 0 591 194 B1.

Alternativamente, la sangre puede primero separarse, después del tratamiento habitual con un anticoagulante, en plasma y en glóbulos blancos y glóbulos rojos, usando métodos conocidos en la técnica, preferentemente mediante centrifugación. Después de centrifugar, el plasma estará presente en el sobrenadante; bajo él hay una capa que contiene los glóbulos blancos en su totalidad. Esta capa recibe también el nombre de capa leucocítica o "buffy coat". Debajo de ella está la fase que contiene los glóbulos rojos (hematocrito).

En conexión con el procedimiento de acuerdo con la presente invención, la fracción de células mononucleares se aísla primero y se separa para obtener los monocitos p. ej. centrifugando de acuerdo con métodos conocidos. De acuerdo con una realización del procedimiento preferida, la fracción de células mononucleares se aplica a un medio de separación de linfocitos (Ficoll-Hypaque) y se centrifuga (véase el Ejemplo 1). El Ejemplo 1 describe la realización preferida de la invención, en la que los eritrocitos y las células muertas que podrían estar aún contenidas en la fracción de células mononucleares se separan mediante centrifugación y los glóbulos blancos incluyendo los monocitos están presentes como un material aislado en el medio de separación. A continuación, la fase blanca puede ser cuidadosamente extraída por pipeteo y, para el enriquecimiento de los monocitos dentro del material aislado, se centrifuga y se lava repetidamente. En el curso de este procedimiento, los monocitos se reunirán en el fondo del recipiente de la centrífuga junto con una parte de los linfocitos.

De acuerdo con una realización particularmente preferida del método de la presente invención, las condiciones para obtener el material aislado que contiene los monocitos se controlan de manera que el material aislado contenga aproximadamente del 10 al 50% de linfocitos junto a los monocitos, por referencia al número total de células. Preferentemente el material aislado contiene aproximadamente de 50 a 90%, de una manera particularmente preferida del 60 al 70% de monocitos y aproximadamente del 10 al 50%, de una manera particularmente preferida de 20 a 50% de linfocitos, cada uno de ellos por referencia al recuento total de células, en donde la diferencia será proporcionada opcionalmente por los granulocitos.

Como se muestra en el Ejemplo 4, la presencia de linfocitos en una cuantía del 20 al 30%, referida al recuento total de células, durante el cultivo de los monocitos originales con MCSF y \gamma-interferón, dará lugar a la generación de una cantidad significativamente más elevada de STIC CD3/CD14-doble positivas, como será el caso si están presentes solamente unos pocos linfocitos (aproximadamente 5%) (véase la Figura 3).

Para preparar una cantidad suficiente de STIC, en primer lugar es necesario permitir la propagación de los monocitos. Con este fin pueden usarse medios de cultivo conocidos, adecuados para monocitos; sin embargo, el medio ha de contener el factor de crecimiento M-CSF (factor estimulador de colonias de macrófagos). El M-CSF, también llamado CSF-1, es producido por monocitos, fibroblastos, linfocitos y células endoteliales. La concentración de M-CSF en el medio de cultivo puede alcanzar preferentemente de 2 a 20 \mug/l de medio, más preferentemente de 4 a 6 \mug/l y de una manera particularmente preferida 5 \mug/l.

Preferentemente, el medio de cultivo no contiene el factor estimulador de colonias de macrófagos y de granulocitos (GM-CSF), porque el rendimiento de STIC se reduce en presencia de este factor.

De forma subsiguiente o simultánea, las células han de ser estimuladas con \gamma-IFN, es decir, han de ser cultivadas en presencia de \gamma-IFN. La estimulación de los monocitos con \gamma-IFN tiene lugar después de una fase inicial de propagación que dura de 3 a 6 días, en el medio de cultivo que contiene el factor de crecimiento. Preferentemente en el día 4 después del comienzo del cultivo en presencia de M-CSF, se inicia la estimulación con \gamma-IFN y esta estimulación se prolonga a lo largo de un periodo de preferentemente 24 a 72 horas, más preferentemente de 48 horas bajo condiciones de incubadora, es decir, a 37ºC y en una atmósfera con 5% de CO_{2}.

La concentración de \gamma-IFN en el medio puede ser de 0,1 a 20 ng/ml, preferentemente de 1 a 10 ng/ml y de forma particularmente preferible 5 ng/ml.

La estimulación con \gamma-IFN puede comenzar simultáneamente con la propagación de los monocitos en el medio que contiene el factor de crecimiento. Sin embargo, se prefiere la estimulación después de una fase de propagación inicial de 3 a 6 días de larga, como se indicó anteriormente. La propagación de las células y la estimulación con \gamma-IFN, en conjunto, no debe llevar preferentemente más de 8 días. En cualquier caso, el tratamiento con \gamma-IFN debe llevarse a cabo de forma que después de la fase de propagación dure al menos 24 horas, como máximo 72 horas, y preferentemente 48 horas. El periodo para la propagación y la estimulación de las células debe durar consiguientemente un total de preferentemente 4 a 8 días.

De acuerdo con una realización de la invención preferida, la propagación y la estimulación con \gamma-interferón se lleva a cabo como se indica en el Ejemplo 2, de manera que los monocitos son primeramente propagados en un medio de cultivo que contiene el factor de crecimiento y ese \gamma-IFN es añadido al medio de cultivo al cabo de 3 a 6 días en una cantidad tal que se obtenga en el medio una concentración de 0,1 a 20 ng/ml, preferentemente de 1 a 10 ng/ml, y de forma particularmente preferible 5 ng/ml.

Preferentemente, el procedimiento de acuerdo con la presente invención se lleva a cabo en recipientes de cultivo cuya superficie ha sido previamente recubierta con suero de ternera fetal (FSC, por sus siglas en inglés) o preferentemente con suero humano AB0 compatible (véase el Ejemplo 2). El recubrimiento con FCS puede tener lugar cubriendo la superficie de los recipientes de cultivo con FCS antes de su uso y, después de un periodo de interacción de unas pocas horas, en particular de 4 a 72 horas, preferentemente de 12 a 48 horas y en particular 24 horas, eliminando el FCS que no se adhiere a la superficie de una manera adecuada. El recubrimiento con suero humano AB0 compatible se lleva a cabo de la misma manera que se describió anteriormente.

Durante la etapa de cultivo las células se depositarán en el fondo del recipiente de cultivo al cabo de aproximadamente 24 horas. Debido a sus propiedades adhesivas, los monocitos y las STIC, derivadas de los monocitos durante el procedimiento, se adherirán al fondo del correspondiente recipiente de cultivo. Si, como se ha descrito en el Ejemplo 2, el medio de cultivo se cambia durante el cultivo, el sobrenadante se elimina al principio cuidadosamente, por ejemplo pipeteándolo o decantándolo, y subsiguientemente se introduce medio de cultivo nuevo. Preferentemente, sin embargo, las células que se adhieren al fondo no se lavan o se lavan cuidadosamente, de forma que no se elimina cualquier posible linfocito presente.

La retirada de las células adherentes puede tener lugar mecánicamente, p. ej. por medio de un rascador fino de células o una espátula.

De acuerdo con una realización preferida del procedimiento de acuerdo con la presente invención, sin embargo, la eliminación completa de la célula tiene lugar por tratamiento con una enzima adecuada, p. ej. con tripsina (véase el Ejemplo 2). La solución de tripsina (0,1 a 0,025 g/l, preferentemente 0,05 g/l) puede dejarse actuar sobre las células durante un tiempo de 2 a 10 minutos a una temperatura entre 35ºC y 39ºC, preferentemente a 37ºC, en presencia de 5% de CO_{2}.

La actividad de la enzima se bloquea entonces de la manera habitual y las STIC, ahora flotando libremente, pueden obtenerse de la forma habitual mediante centrifugación. Entonces están disponibles para uso inmediato, opcionalmente en suspensión en un medio adecuado, p. j. en PBS. Sin embargo, también pueden guardarse durante varios días, en particular durante aproximadamente 2 a 3 días, en un medio nutriente (véase el Ejemplo 2), en donde este medio de conservación no debe contener ni el factor de crecimiento ni \gamma-IFN. Las células pueden guardarse en un medio nutriente tal como STIC durante al menos 48 horas.

Para un almacenamiento durante periodos más largos, las células pueden someterse a congelación profunda (deep freezing, o congelación a baja temperatura). Los protocolos para la congelación a baja temperatura de células vivas son conocidos en el estado actual de la técnica, véase Griffith M. et al., ("Epithelial Cell Culture, Cornea", en Methods of tissue engineering, Atala A. y Lanza R. P., Academic Press 2002, capítulo 4, páginas 131-140). Un medio de suspensión preferido para la congelación a baja temperatura de las células de acuerdo con la presente invención es el suero AB0 compatible o el FCS, ambos suplementados con DMSO.

De acuerdo con una realización de la presente invención, la suspensión de células que contiene células inductoras de autotolerancia obtenidas de las etapas (c) o (d) puede purificarse más con respecto a esas células, que se unen al anticuerpo GM-7, para obtener una subpoblación STIC_{GM7}. Los métodos para tal purificación se describieron antes con detalle.

De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, tales células se seleccionan entre la población de STIC, que coexpresa los antígenos CD3 y CD14 e sus superficies celulares. Los métodos para seleccionar tales células son conocidos en la técnica. Ejemplos de tales métodos son el "Fluorescent-Activating Cell Sorting" (FACS), el "Immuno Magnetic Bead Sorting" y el "Magnetic Activated Cell Sorting" (MACS), o el denominado "Rosetting Method" [véase Gmelig-Meyling F. et al. "Simplified procedure for the separation of human T- and non-T-cells", Vox Sang. 33, 5-8 (1977)].

La selección de la subpoblación de STIC, STIC_{CD3+/CD14+}, puede tener lugar directamente a partir de la subpoblación de STIC obtenida de las etapas (c) o (d) del procedimiento de la presente invención anteriormente descrito, o a partir de la subpoblación STIC_{GM7}. Esta última manera de proceder significa que tendrá lugar un enriquecimiento por etapas de STIC_{CD3+/CD14+}.

En una realización preferida de la presente invención las células de la subpoblación STIC_{CD3+/CD14+} de acuerdo con la invención se usan tal cual para la producción de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento in vivo de enfermedades autoinmunitarias.

Ejemplos de tales enfermedades autoinmunitarias son:

\bullet: Enfermedades reumáticas con características autoinmunitarias, en particular artritis reumatoide, SLE, enfermedad de Sjögren, escleroderma, dermatomiositis, polimiositis, síndrome de Reiter;

\bullet: diabetes mellitus;

\bullet: enfermedades autoinmunitarias de la sangre y de los vasos sanguíneos, en particular anemia hemolítica autoinmunitaria (AIHA), púrpura trombocitopénica autoinmunitaria (ITP), síndrome del anticuerpo anti-fosfolípido, vasculitis (grupo de la poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegener, vasculitis de hipersensibilidad, arteritis de células gigantes), lupus eritematoso sistémico, crioglobulinemia esencial mixta;

\bullet: enfermedades autoinmunitarias del hígado, en particular hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, y colangitis esclerosante primaria;

\bullet: enfermedades autoinmunitarias del tiroides, en particular enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Graves;

\bullet: enfermedades autoinmunitarias del sistema nervioso central, en particular esclerosis múltiple, miastenia gravis; y

\bullet: enfermedades cutáneas ampollosas, en particular pénfigo vulgar, pénfigo vegetans, pénfigo foliáceo, síndrome de Senear-Usher y pénfigo brasileño.

La utilidad de las STIC para inducir autotolerancia se ha demostrado para ratones en dos sistemas modelo de colitis inducida artificialmente que son similares a una enfermedad autoinmunitaria (véanse los Ejemplos 8 y 9).

Estos modelos son la colitis crónica inducida por dextrano sulfato sódico (DSS) (Ejemplo 8) y el modelo de transferencia de SCID CD62L^{+}/CD4^{+} de colitis crónica experimental en ratones (Ejemplo 9). En ambos modelos los ratones desarrollan una colitis crónica con síntomas que son similares a los de la colitis ulcerosa humana.

En ambos sistemas modelo la administración de STIC poco después de la aparición de la enfermedad conduce a la supresión de los síntomas típicos de la colitis en comparación con los animales no tratados o con los animales tratados con "células testigo" que no contienen STIC (véanse los Ejemplos 8 y 9).

Como se discutió anteriormente, las reacciones hiperinmunitarias están también implicadas en el desarrollo de alergias. Se ha demostrado por Bach et al. (loc. cit.) que las células CD4^{+}, que comprenden células CD4^{+}/CD25^{+} como subpoblación, pueden mitigar el progreso de la encefalomielitis alérgica experimental (EAE, por sus siglas en inglés). Dado que, como se muestra en el presente texto, la administración de STIC tiene por resultado la inducción de un aumento de la población de células T CD4^{+}/CD25^{+}, las células son también útiles para el tratamiento de
alergias.

Así, de acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, los productos farmacéuticos que contienen STIC se usan para la prevención y/o el tratamiento de alergias.

Los preparados farmacéuticos pueden contener STIC vitales de acuerdo con la presente invención, que se obtienen de la etapa (d) del procedimiento de la invención, suspendidas en un vehículo aceptable farmacéuticamente, preferentemente en una cantidad de aproximadamente 1 x 10^{5} a 1 x 10^{7} células/ml y más preferentemente de aproximadamente 1 x 10^{6} células/ml de preparado.

En otra realización preferida de la presente invención las células de la subpoblación STIC_{GM7} de acuerdo con la invención se usan como tales para la producción de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento in vivo de enfermedades asociadas con un trastorno de la autotolerancia.

En una realización de la presente invención, tal preparado farmacéutico puede contener células STIC_{CM7} vitales de acuerdo con la invención, que se unen al anticuerpo GM-7, suspendidas en un vehículo líquido aceptable farmacéuticamente, preferentemente en una cantidad de aproximadamente 1 x 10^{6} a 1 x 10^{8} células/ml y más preferentemente de aproximadamente 1 x 10^{7} células/ml de preparado.

En la realización más preferida de la presente invención tal preparado farmacéutico puede contener células
STIC_{CD3+/CD14+} vitales de acuerdo con la invención, que co-expresan los antígenos CD3 y CD14 en una cantidad de preferentemente aproximadamente 5 x 10^{5} a 5 x 10^{7} células/ml y más preferentemente de aproximadamente 5 x 10^{6} células/ml de preparado.

Los preparados farmacéuticos anteriormente descritos pueden contener las células de acuerdo con la presente invención suspendidas en un medio bien tolerado fisiológicamente. Los medios adecuados son por ejemplo solución de Ringer, solución salina fisiológica o solución del albúmina humana del 5 al 20%, y similares.

Las composiciones farmacéuticas que contienen STIC de acuerdo con la presente invención pueden ser administradas a través de una diversidad de vías de administración, dependiendo del sitio o sitios del cuerpo afectados por la correspondiente enfermedad. En realizaciones de la invención preferidas, dichas composiciones farmacéuticas pueden administrarse por vía intravenosa, intraportal, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal o intratecal. Las composiciones farmacéuticas pueden además ser administradas directamente en un órgano específico, tal como el hígado o un músculo, por inhalación o en cavidades corporales.

Los preparados farmacéuticos que contienen STIC como ingredientes activos pueden usarse también para la prevención de enfermedades autoinmunitarias en los casos en los que se conoce el gen responsable del desarrollo de la enfermedad. Si un individuo es diagnosticado como portador de un gen asociado con una o más enfermedades autoinmunitarias, la manifestación de la enfermedad puede ser evitada administrando STIC derivadas de monocitos autólogos en un estadio de vida temprano. En una realización preferida de la presente invención, las STIC autólogas son cocultivadas con linfocitos autólogos y con el péptido expresado por el gen correspondiente. Esto conducirá al desarrollo de linfocitos T reguladores autólogos específicos para el correspondiente producto génico. Estos linfocitos T reguladores pueden entonces ser re-administrados al correspondiente individuo como se describe más adelante en el Ejemplo 7 (corresponde al Ejemplo 13 del documento WO 2004/007701).

En otra realización de la presente invención, las STIC pueden usarse para la prevención en aquellos casos en los que la enfermedad autoinmunitaria ocurre en intervalos, como por ejemplo en la artritis reumatoide. Si el preparado farmacéutico que contiene STIC se administra después de la primera manifestación de la enfermedad, o una manifestación subsiguiente, pueden prevenirse otras manifestaciones.

Los preparados de células de acuerdo con la presente invención pueden contener STIC vitales que se obtienen de la etapa (d) del procedimiento de la invención. Alternativamente, los preparados pueden contener células pertenecientes a las subpoblaciones de células STIC_{GM7}, que se unen al anticuerpo GM-7, o de células STIC_{CD3+/CD14+}, que co-expresan los antígenos CD3 y CD14 en su superficie celular. Los preparados pueden contener las correspondientes células en una cantidad de preferentemente al menos 1 x 10^{5}, mas preferentemente al menos 5 x 10^{5} y lo más preferentemente al menos 1 x 10^{6} por ml suspendidas en un medio de vehículo líquido. El medio puede ser un medio de cultivo de células o un medio de transporte bien tolerado por las células, tal como solución de albúmina humana entre el 5 y el 20%. Alternativamente, las células dentro del preparado pueden ser congeladas a baja temperatura y estar contenidas en un medio de almacenamiento adecuado, tal como, p. ej., RPMI con solución al 50% de albúmina humana y 10% de DMSO.

Finalmente, la presente invención se refiere también a un método en el que las células inductoras de autotolerancia de la presente invención (STIC, STIC_{GM7} o STIC_{CD3+/CD14+}) se usan para generar o expandir linfocitos T reguladores autólogos in vitro. Como se muestra en el Ejemplo 6 (correspondiente al Ejemplo 12 del documento WO 2004/007701, el co-cultivo directo in vitro de TAIC, correspondientes a STIC, con linfocitos conduce a una proliferación significativa de linfocitos T reguladores, en particular de linfocitos CD4^{+}/CD25^{+}. Es por tanto posible generar y/o expandir linfocitos T reguladores autólogos, en particular linfocitos CD4^{+}/CD25^{+}, co-cultivando directamente STIC derivadas de monocitos de un individuo con linfocitos autólogos.

El cultivo directo in vitro significa de acuerdo con la presente invención que las STIC y los linfocitos son co-cultivados en contacto físico directo dentro del mismo medio, como se ejemplifica en el Ejemplo 6.

En este método el medio contiene preferentemente las células correspondientes es decir, STIC y linfocitos, en números de células aproximadamente iguales y cada una en una cantidad de preferentemente al menos 1 x 10^{5}, más preferentemente al menos 5 x 10^{5} y lo más preferentemente al menos 1 x 10^{6} células por ml suspendidas en un medio portador líquido; el medio puede ser un medio de cultivo de células o de transporte bien tolerado por las células, tal como solución de albúmina humana entre el 5 y el 20%. El co-cultivo preferentemente debe tener lugar bajo condiciones fisiológicas a aproximadamente 37ºC, p. ej. en una incubadora, durante preferentemente 3 a 5, más preferentemente 4 días.

Se mostró en el Ejemplo 7 (correspondiente al Ejemplo 13 del documento WO 2004/007701, que la aceptación de un trasplante puede ser inducida no solo administrando al receptor TAIC generadas a partir de monocitos del donante, sino también readministrando al receptor linfocitos del receptor, que previamente han sido directamente co-cultivados in vitro con TAIC preparadas a partir de monocitos del donante como se describió anteriormente. Del mismo modo, la autotolerancia pude inducirse re-administrando al paciente linfocitos autólogos, que previamente han sido co-cultivados directamente con STIC preparadas a partir de los propios monocitos del paciente.

De acuerdo con otra realización de la presente invención, pueden por tanto prepararse in vitro linfocitos T reguladores a partir de linfocitos que se originan del individuo a tratar, co-cultivando directamente los linfocitos de este individuo con STIC que se originan a partir de monocitos de este individuo. La re-administración de los linfocitos co-cultivados al receptor conducirá a la inducción de la autotolerancia, como se muestra en el Ejemplo 7.

Los linfocitos T reguladores así preparados pueden ser aislados por FACS como se describe en el presente texto (véase anteriormente) y pueden ser usados en un preparado farmacéutico para prevenir y/o tratar enfermedades asociadas con el trastorno de la autotolerancia, en el que las células son suspendidas en un vehículo aceptable farmacéuticamente como se describió anteriormente.

La invención se ilustra con más detalle mediante ejemplos.

Si no se define dentro de los ejemplos, la composición de los medios y sustancias usados es como sigue:

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1. Solución de penicilina/estreptomicina

\quad: 10.000 unidades de penicilina en forma de sal sódica de penicilina G y 1000 \mug de estreptomicina en forma de sulfato de estreptomicina por ml de solución fisiológica de cloruro sódico (NaCl 0,85%) (Gibco Catalogue nº 15140122).

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2. Tripsina-EDTA

\quad: 0,5 g de tripsina y 0,2 g de EDTA (4 Na)/l

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3. RPMI 1640 (1x, líquido (11875) contiene L-glutamina

\quad: Medios RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 son formulaciones enriquecidas que pueden usarse comúnmente para células de mamíferos.

1

2

Referencia: Moore G, E,, et al., J.A.M.A. 199: 519 (1967).

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4. PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco) véase J. Exp. Med. 98:167 (1954)

3

4

5. Ficoll-Hypaque

\quad: Medio para separación de linfocitos (copolimerizado de sacarosa y epiclorhidrina Mg 400.000; densidad 1,077, ajustado con diatrizoato sódico).

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6. L-Glutamina

\quad: Líquido: 29,2 mg/ml

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7. Factor estimulador de la colonia de macrófagos (M-CSF)

\quad: M-CSF humano recombinante procedente de E. coli; contiene como monómero (18,5 kD) 135 restos de aminoácidos incluyendo la metionina N-terminal; está presente como homodímero con una masa molar de 37 kD (Sigma Catalogue No. M 6518).

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8.\gamma-Interferón (\gamma-IFN)

\quad: \gamma-IFN humano recombinante procedente de E. coli; proteína de 16,7 kD que contiene 143 restos de aminoácidos (CHEMICON Catalogue No. IF002).

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9. Dextrano sulfato sódico

\quad: Sigma Aldrich 31403, sal, peso molecular 40 kD.

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Ejemplo 1

Separación de monocitos de la sangre completa

Se obtuvo la sangre completa de pacientes humanos por dos métodos diferentes:

a) Leucoaféresis: La leucoaféresis se llevó a cabo usando un sistema de aféresis COBE® Spectra^{TM} (Gambro BCT, Lakewood, CO, EE.UU.) en el modo mononuclear (MNZ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (COBE Sprectra Version 4.7/5.1/6.0/7.0).

b) Separación convencional de los componentes sanguíneos: se mezclaron 450 ml de sangre completa en un juego de bolsas de triple cámara con 63 ml de una solución de estabilizante que contenía, por litro de agua, 3,27 g de ácido cítrico, 26,3 g de citrato sódico, 25,5 g de dextrosa y 22,22 g de dihidroxifosfato sódico para evitar la coagulación de la sangre y para alimentar a las células. El pH de la solución era de 5,6 a 5,8.

Para separar los componentes de la sangre se llevó a cabo subsiguientemente la "centrifugación sharp" de esta mezcla a 4000 rpm durante 7 minutos a 20ºC. Esto tuvo por resultado la estratificación de los componentes corpusculares y no corpusculares en tres capas. Usando el juego de bolsas en una máquina de compresión proporcionada para este fin, los eritrocitos se prensaron entonces en la bolsa inferior, el plasma se prensó en la bolsa superior y la llamada capa leucocítica ("buffy coat") quedó en la bolsa del medio y contenía un volumen de aproximadamente 50 ml.

A partir de ambos métodos, la cantidad de 50 ml de fracción de células mononucleares recién obtenidas se dividió entonces en dos porciones de 25 ml cada una, y se aplicaron sobre 25 ml de medio de separación de Ficoll-Hypaque respectivamente que habían sido previamente introducidos en dos tubos Falcon de 50 ml.

Este preparado se centrifugó durante 30 minutos a 2500 rpm sin frenado. A continuación, cualquier eritrocito o célula muerta que pudieran estar aún presentes en la fracción de células mononucleares estaba bajo la fase de Ficoll, mientras que los glóbulos blancos, incluyendo los monocitos, se separaron en el Ficoll en forma de interfase
blanca.

Subsiguientemente, la interfase blanca incluyendo los monocitos se retiró cuidadosamente mediante pipeteo y se mezcló con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Este preparado fue después centrifugado tres veces durante 10 minutos a 1800 rpm con frenado, retirándose el sobrenadante mediante pipeteo después de cada proceso de centrifugación, e introduciéndose cada vez PBS fresco.

Los sedimentos de células reunidos en el fondo del recipiente de centrifugación (tubos Falcon) contenían la fracción de células mononucleares, es decir, los monocitos.

c) Los monocitos requeridos para los experimentos 8 y 9 con ratones (realizados con ratones genéticamente idénticos) fueron obtenidos de los bazos de ratones donantes singénicos. Los bazos se pasaron por un tamiz de malla pequeña bajo un ligera presión y las células así separadas se resuspendieron en PBS. Las células esplénicas suspendidas se pusieron en capa sobre 25 ml de un medio de separación Ficoll-Hypaque que había sido introducido previamente en tubos Falcon de 50 ml. Después se siguió con el procedimiento de la misma forma que se describió
antes.

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Ejemplo 2

Propagación y modificación de los monocitos

El cultivo y la propagación de los monocitos se llevó a cabo en medio nutriente con la siguiente composición:

100

El medio nutriente contenía 2,5 \mug/500 ml de M-CSF.

Los monocitos aislados en el Ejemplo 1 se suspendieron en una cantidad total de 10^{6} células en 10 ml del medio nutriente y se transfirieron a una placa Petri (de 100 mm de diámetro). La placa Petri se había llenado previamente con FCS inactivado puro y el FCS se había vertido después de 24 horas con el fin de obtener, de esta forma, una placa recubierta con FCS.

La placa Petri se cubrió con la cubierta apropiada y se guardó durante 3 días en una incubadora a 37ºC. Las células se sedimentaron en el fondo de la placa Petri al cabo de 24 horas. El día dos, el sobrenadante se separó mediante pipeteo y la placa Petri se llenó de nuevo con 10 ml de medio nutriente fresco.

El día 4, se añadieron 50 ng de \gamma-interferón en 10 ml de medio nutriente y la placa de Petri se cerró de nuevo y se guardó durante 48 horas más en la incubadora a 37ºC.

A continuación, se pipetearon en la placa Petri 10 ml de solución de tripsina diluida 1:10 con PBS. La placa Petri cerrada se guardó durante 10 minutos en la incubadora a 37ºC.

Después de esto, la separación de las células que se adhieren al fondo de la placa Petri se llevó a cabo con un rascador de células de forma tal que la mayor parte (más del 90%) de las células flotaban en el sobrenadante.

El sobrenadante total (10 ml de solución de tripsina + 10 ml de medio) se separó pipeteando, se combinó en un tubo Falcon de 50 ml y se centrifugó durante 10 minutos a 1800 rpm. Después se desechó el sobrenadante y se añadió medio nutriente nuevo (véase anteriormente) al precipitado (el sedimento celular que queda), añadiéndose 1 ml de nutriente por 10^{6} células. La determinación del recuento celular para la determinación de la dosificación exacta tuvo lugar de acuerdo con métodos conocidos, véase Hay R. J., "Cell Quantification and Characterisation", en Methods of Tissue Engineering, Academic Press 2002, capítulo 4, pp. 55-84.

Esta suspensión de células se centrifugó (1800 rpm, 10 minutos, véase anteriormente) y el sedimento celular se incorporó bien sea a PBS o, para aplicación humana, a NaCl (fisiol.). Subsiguientemente, la administración intravenosa puede tener lugar directamente o en el plazo de 48 horas.

Alternativamente, después de centrifugar y desechar el sobrenadante que contiene tripsina, se añadió FCS/DMSO como medio de congelación a las células, y éstas fueron congeladas a baja temperatura en un volumen de 10 ml.

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El medio de congelación contenía 95% de FCS y 5% de DMSO. En cada caso, aproximadamente 10^{6} células fueron incorporadas a 1 ml de medio y se enfriaron en los pasos siguientes:

30 minutos en hielo;

2 horas a -20ºC en la caja de Styropor pre-enfriada;

24 horas a -80ºC en Styropor;

almacenamiento en tubos pequeños en nitrógeno líquido (N_{2}) a -180ºC.

La Figura 1 muestra los cambios fenotípicos en la expresión del antígeno, determinada por citometría de flujo, en los monocitos usados después del cultivo, y la estimulación con \gamma-interferón de las células monolíticas originales. El cultivo y la estimulación con \gamma-interferón de las células monolíticas originales conduce a un aumento significativo de la unión de GM-7 después de la modificación (gráfico de la derecha en la Fig. 1) en comparación con las células antes de la modificación (gráfico de la izquierda en la Fig. 1).

Los Ejemplos 3 a 7, más adelante, están tomados del documento WO 2004/007701. Caracterizan las células inductoras de aceptación de trasplante (TAIC) descritas en el presente texto. Debido a la similitud de las TAIC del documento PCT/EP03/07551 y las células inductoras de autotolerancia (STIC) de la presente invención (véase anteriormente), los resultados expuestos en estos ejemplos son también aplicables a las STIC.

Más concretamente, los resultados de los Ejemplos 3 a 7 que siguen indican:

\bullet: que una población de células con función supresora optimizada puede ser aislada a partir de la población de TAIC obtenida después del cultivo de monocitos originales con M-CSF y la estimulación con \gamma-IFN a través de la disponibilidad del anticuerpo monoclonal GM-7 (Ejemplo 3);

\bullet: que los linfocitos presentes en la fracción de monocitos tienen una gran influencia sobre la generación de células CD14^{+}/CD3^{+} efectivas como TAIC (Ejemplo 4);

\bullet: que el inhibidor de IDO, 1-metiltriptófano, no tiene influencia sobre la función supresora de las TAIC (Ejemplo 5);

\bullet: que el co-cultivo directo in vitro de TAIC del donante A junto con linfocitos de un donante B induce la formación de células T reguladoras, es decir, linfocitos CD4^{+}/CD25^{+} (Ejemplo 6); y

\bullet: que la interacción física célula con célula entre TAIC del donante y linfocitos del receptor in vivo induce la generación de células T reguladoras capaces de prevenir el rechazo de órganos (Ejemplo 7).

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Ejemplo 3

Unión del anticuerpo GM-7 a TAIC

El anticuerpo monoclonal GM-7 fue generado inmunizando ratones con TAIC humanas que habían sido preparadas como se describe en el documento PCT/EP03/07551. Las células de hibridoma que producen el anticuerpo fueron depositadas en la "Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen" bajo el número de entrada DSM ACC2542. Los resultados expuestos más adelante demuestran que el anticuerpo se une específicamente a un antígeno que se expresa solamente en células CD14^{+} que habían sido sometidas a la modificación ex situ del día 6 con M-CSF y a la estimulación con \gamma-IFN del día 2, de acuerdo con la presente invención.

La Figura 1 muestra la capacidad de unión, determinada por citometría de flujo, de GM-7 a células monocíticas después de la modificación in vitro, es decir después de la transformación en TAIC. Puede observarse que los monocitos CD14-positivos obtenidos directamente a partir de la capa leucocítica no se unen al anticuerpo GM-7 (imagen de la izquierda; la nube sombreada en gris corresponde al testigo de anticuerpo). En cambio, parte de los monocitos expresan un antígeno después del cultivo en M-CSF y la estimulación con \gamma-IFN, antígeno que es reconocido por el anticuerpo monoclonal GM-7. Después del cultivo como se describe en el Ejemplo 2, aproximadamente el 80% de los monocitos transformados pueden unirse al anticuerpo monoclonal GM-7 (imagen de la derecha).

En otro experimento, la actividad supresora de las células CD14^{+}/GM-7^{+} fue comparada con la de las células CD14^{+}/GM-7^{-} en un cultivo mixto de linfocitos (MLC). El MLC se llevó a cabo como se describe en Kurnick, J. T. "Cellular Assays" en: Diagnostic Immunopathology, [Colvin R. B., Bhan A. K., McCluskey, R. U. (ed.), Raven Press, Nueva York, páginas 751-771 (1994)].

En este ejemplo, las TAIC proceden de un individuo B. Como se muestra en la Figura 2, existe una diferencia significativa entre la actividad supresora de las TAIC GM-7 positivas y de las GM-7 negativas. Solamente la fracción GM-7 positiva de la población de TAIC obtenida después de 6 días de tratamiento con M-CSF y 2 días de estimulación con \gamma-INF muestra un efecto de inhibición significativo sobre la actividad de proliferación de las células T de células respondedoras del individuo A después de la estimulación con células de B.

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Ejemplo 4

Influencia de los linfocitos sobre la formación de células CD3^{+}/CD14^{+} durante el cultivo de monocitos

La influencia de los linfocitos presentes en la fracción de monocitos sobre la generación de células CD14^{+}/CD3^{+} efectivas como TAIC, fue determinada por comparación de dos esquemas diferentes.

Para el primer esquema (indicado subsiguientemente como "Mo") la fracción de monocitos se tomó inicialmente de la interfase de la capa leucocítica como se describe en el Ejemplo 1. Como se describe en el Ejemplo 2, las células fueron subsiguientemente transferidas a la etapa de cultivo con M-CSF. Dentro del plazo de una hora después del punto de inicio del cultivo, los monocitos que se adhieren al fondo del frasco de cultivo de tejido se lavaron cinco veces con 10 ml de PBS cada vez, y la cantidad de linfocitos presentes en el cultivo se redujo así a menos del 5% (4,8 \pm 2,4%), mientras que la cantidad de linfocitos enriquecidos (CD14^{+}) así obtenidos fue superior al 90% (92 \pm 5,6%). Componentes celulares adicionales dentro del esquema fueron linfocitos B y granulocitos.

Las células en el segundo esquema (subsiguientemente indicado como "Mo + Ly") se tomaron también de la interfase de la capa leucocítica como fracción de monocitos como se describe en el Ejemplo 1. Sin embargo, a diferencia del esquema "Mo", las células que se adhieren al fondo del frasco de cultivo de tejido se lavaron solamente una vez al cabo de 24 horas a partir del comienzo de la fase de cultivo, como se describe en el Ejemplo 2. Como resultado, se obtuvo una población de células que estaba compuesta por 45 \pm 5,3% de monocitos CD14^{+} y 23,5 \pm 8,9% de linfocitos CD2^{+}. Como en el esquema "Mo", también estaban presentes linfocitos y granulocitos en este esquema.

La determinación de las cantidades de los correspondientes tipos de células en la población total de células para cada esquema se llevó a cabo mediante citometría de flujo de tres esquemas experimentales cada uno (veáse la Figura 3). Los resultados se exponen como valores medios incluyendo la desviación estándar.

La células CD14^{+}/CD3^{+} no pueden determinarse ni en el esquema "Mo" ni en el esquema "Mo + Ly" al comienzo del cultivo (d 0 = día 0). Después de un periodo de cultivo de cinco días, se terminó el experimento y las células se caracterizaron mediante análisis de FACS (Fluorescent-Activating Cell Sorting) después de despegar las células del fondo del frasco de cultivo de tejidos como se describe en el Ejemplo 2. Se encontró que la cantidad relativa de células CD14^{+} disminuye en estos esquemas, del 92% al 42% en el esquema "Mo", y del 45% al 28% en el esquema "Mo + Ly". Al parecer, los linfocitos proliferan más rápidamente que los monocitos; la cantidad relativa de linfocitos aumentó en el esquema "Mo" del 4,8% al 68,9% y en el esquema "Mo + Ly" del 23,5% al 50,6%. Durante el cultivo, se formaron células CD14^{+}/CD3^{+} efectivas como TAIC en ambos cultivos. Es importante en este contexto que se observa un aumento significativamente más alto de las células CD14^{+}/CD3^{+} en el esquema "Mo + Ly" con una cantidad de 32,0 \pm 5,3%, frente al esquema "Mo" con solamente 7,2 \pm 3,2%.

Estos resultados demuestran que la purificación de las células para el enriquecimiento en monocitos hasta una cantidad relativa de más del 90% al comienzo del cultivo, tiene una influencia negativa en la generación de las células CD14^{+}/CD3^{+} inmunosupresoras en la población de TAIC, mientras que el método descrito en los Ejemplos 1 y 2 conduce a un rendimiento de células CD14^{+}/CD3^{+} significativamente más alto.

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Ejemplo 5

Determinación de la influencia del inhibidor de IDO, 1-metil-triptófano, sobre la actividad inmunosupresora de las TAIC

Con el fin de aclarar si el inhibidor de la enzima indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO) 1-metiltriptófano (1-MT) influye sobre la función supresora de las TAIC generadas en los esquemas "Mo" y "Mo + Ly" (véase el Ejemplo 4), se estableció una variedad de cultivos mixtos de linfocitos (MLC) con células T estimuladas con PHA (fitohemaglutinina) en presencia y en ausencia de 1-MT.

En estos cultivos mixtos de linfocitos, se transfirieron 50.000 linfocitos con 2 \mug de PHA a los pocillos de una placa de 96 pocillos, seguido por un periodo de proliferación a lo largo de 144 horas (indicado como "PhaLy"). Se analizaron linfocitos cultivados solamente en medio sin adición de PHA, como otro testigo (indicado como "Ly").

Con el fin de determinar la proliferación de linfocitos estimulados con PHA en los distintos co-cultivos, se realizaron y se examinaron los 4 esquemas siguientes:

PhaLy + "Mo + Ly": Linfocitos estimulados con PHA y TAIC [10^{5} células procedentes del esquema "Mo + Ly" de acuerdo con el Ejemplo 4].

PhaLy + "Mo + Ly" + 1-MT: Linfocitos estimulados con PHA y TAIC en presencia de 2 \mumoles de 1-MT [10^{5} células procedentes del esquema "Mo + Ly" de acuerdo con el Ejemplo 4].

PhaLy + "Mo": Linfocitos estimulados con PHA y TAIC [10^{5} células procedentes del esquema "Mo" de acuerdo con el Ejemplo 4].

PhaLy + "Mo" + 1-MT: Linfocitos estimulados con PHA y TAIC en presencia de 2 \mumoles de 1-MT [10^{5} células procedentes del esquema "Mo" de acuerdo con el Ejemplo 4].

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Después de 144 horas de cultivo, todos los testigos o co-cultivos se siguieron cultivando durante 24 horas en presencia de ^{3}[H]-timidina ("pulsada") y a continuación se determinó la cantidad incorporada de timidina marcada radiactivamente como cuentas por minuto (cpm), véase la Figura 4. En esta disposición, la cantidad de radiactividad determinada es una medida para la cantidad de timidina marcada incorporada al DNA, y por tanto es una medida de la velocidad de proliferación de los linfocitos. Los valores expuestos en la Figura 4 corresponden a valores medios a partir de determinaciones triples de 3 experimentos cada uno con indicación de la desviación
estándar.

Los resultados demostraron que los linfocitos no estimulados con PHA ("Ly") no proliferan significativamente, siendo la radiactividad media observada 367 cpm (véase la Figura 4). En cambio, la estimulación con 2 \mug de PHA conduce a un aumento significativo en la velocidad de proliferación de los linfocitos ("PhaLy"), midiéndose la incorporación más alta a un valor medio de 18459 cpm en estas muestras.

La adición de TAIC a los cultivos de linfocitos claramente redujo la tasa de proliferación de forma intensa si se añadían células del esquema "Mo + Ly" del Ejemplo 4 (PhaLy + "Mo + Ly", valor determinado 1498 cpm), y de forma menos intensa cuando se añadían células del esquema "Mo" del Ejemplo 4 (PhaLy + "Mo", valor medido
3369 cpm).

Los resultados obtenidos después de la adición de 2 \mumoles de 1-metiltriptófano (1-MT) a los esquemas que contienen "Mo + Ly" y "Mo" con linfocitos estimulados demostraron que el 1-metiltriptófano (1-MT) aumenta la función supresora de las TAIC de forma sinérgica, siendo la disminución más intensa con las TAIC procedentes del esquema "Mo + Ly" (valor medido 267 cpm) que con las TAIC del esquema "Mo" (valor medido 390 cpm).

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Ejemplo 6

Co-cultivo in vitro de TAIC humanas con linfocitos alogénicos para generar células T reguladoras

Para examinar si las TAIC inducen en el receptor la formación de células T reguladoras, es decir, linfocitos CD4^{+}/CD25^{+}, se realizaron varios cultivos in vitro diferentes de TAIC con linfocitos, y se analizó la formación de células T reguladoras resultantes de los mismos.

Con este fin, las TAIC del donante A fueron co-cultivadas directa o indirectamente in vitro junto con linfocitos de un donante B. En el co-cultivo directo, se posibilitó el contacto directo de célula con célula entre las TAIC (del donante A) y los linfocitos (del donante B), mientras que, en el co-cultivo indirecto, una membrana ("cell culture insert", 0,4 \mum de tamaño de poro, Falcon, orden nº 353090) permitía el intercambio de medio pero inhibía el contacto físico de las dos poblaciones de células. El co-cultivo directo o indirecto se lleva a cabo preferentemente durante 3 a 5 días, más preferentemente durante 4 días, bajo condiciones de incubadora, es decir, a 37ºC y en una atmósfera con 5% de
CO_{2}.

Después de cultivar, se determinó el correspondiente número de células T reguladoras (CD4^{+}/CD25^{+}) en ambos esquemas, así como en los testigos, en los que las TAIC o los linfocitos, respectivamente, fueron cultivados solos. Además, el número de células CD3^{+}/CD14^{+}, que representan el componente de la población de células TAIC que tiene la función supresora más significativa en el cultivo mixto de linfocitos, fue determinado en el esquema testigo, en el que las TAIC fueron cultivadas solas.

En todos los esquemas, los antígenos de superficie de las células fueron determinados por análisis de FACS (Fluorescent-Activating Cell Sorting) y se analizó la cantidad de las correspondientes poblaciones de células en la cantidad total de células.

Además, la expresión relativa de tres nuevos genes maestros expresados específicamente por células T reguladoras (Foxp3, CTLA-4 e Integrina \alpha_{E}\beta_{7}) fue determinada mediante PCR en la correspondiente población de células (véase la Tabla). El Foxp3 es un factor de transcripción específico, que se considera como gen de control para el desarrollo de células T reguladoras, y que es expresado específicamente por estas células [véase Hori, S. et al., "Control of Regulatory T-cell Development by the Transcription Factor Foxp3", Science 299, 1057-1061
(2003)].

\newpage

El CTLA-4 es otro factor que se usa como marcador para la determinación de la función reguladora de las células T CD4^{+}/CD25^{+} (véase Khattri, R. et al., "An essential role for Scurfin in CD4 ^{+}/CD25 ^{+} T regulatory cells", Nature Immunology, online publication, doi:10.1038/ni909 (2003); Shimizu, J. et al. "Stimulation of CD25^{+}/CD4^{+} regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance", Nature Immunology, online publication, doi:10.1038/ni759 (2003); Cobbold, S. P. et al. "Regulatory T cells in the induction and maintenance of peripheral transplantation tolerance", Transpl. Int. 16(2), 66-75 (2003)].

La Integrina \alpha_{E}\beta_{7} es una integrina que se une a Catherine epiteliales y que puede ser usada como marcador para la sub-población más potente de células T CD25^{+} reguladoras [véase Lehmann, J. et al. "Expression of the integrin \alpha_{E}\beta_{7} identifies unique sub-sets of CD25^{+} as well as CD25^{-} regulatory T cells" PNAS 99(20), 13031-13036
(2002)].

La determinación de la expresión de Fosp3, CTLA-4 e integrina \alpha_{E}\beta_{7} se llevó a cabo por medio de PCR cuantitativa usando como controles GAPDH y \beta-actina, dos "genes domésticos"; los valores determinados, por una parte, se relacionaron entre ellos, ajustándose en 1 el valor obtenido para las células CD14^{+}/CD3^{-}; por otra parte, las cantidades absolutas de RNA se indicaron en \mug por \mug de RNA total, con el fin de correlacionar la supresión medida efectuada por las TAIC in vitro y la formación de las células CD4^{+}/CD25^{+} doble positivas con la tasa de expresión de los genes respectivos. Se usaron métodos estándar para la PCR cuantitativa, que son conocidos por los expertos en la técnica (véase Lottspeich, F., Zorbas, H. "Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin,
1998).

La Tabla muestra que dentro de la población de linfocitos obtenida del co-cultivo directo, el porcentaje de células CD4^{+}/CD25^{+} doble positivas aumenta varias veces hasta un valor de 8,7% en comparación con la cantidad de linfocitos CD4^{+}/CD25^{+} obtenidos del co-cultivo indirecto o del testigo, que son casi idénticas con 2,38% y 2,65%, respectivamente.

La sub-población de células CD4^{+}/CD25^{+} expresa las cantidades relativas más altas de mRNA de todos los genes maestros ensayados, en comparación con la expresión en células CD4^{+}/CD25^{-} (véase la Tabla). Mientras que la expresión de Foxp3 aumenta en aproximadamente un factor de 10 (37 frente a 3,75), la expresión de CTLA-4 alcanza una expresión máxima incluso más alta (4699 frente a 0,376). El aumento de la expresión de integrina \alpha_{E}\beta_{7} del tercer gen maestro en las células CD4^{+}/CD25^{+} durante el co-cultivo es casi tan alta como para CTLA-4, ya que la cantidad absoluta de m-RNA de integrina \alpha_{E}\beta_{7} sube hasta 1,4 x 10^{-9} en las células CD4^{+}/CD25^{+} en comparación con 3,4 x 10^{-12} \mug de mRNA/\mug de RNA total en las células CD4^{+}/CD25^{-}.

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(Tabla pasa a página siguiente)

5

\newpage

Después del co-cultivo indirecto, la cantidad relativa de mRNA de Foxp3 en la sub-población CD4^{+}/CD25^{+} asciende a tan solo 10 y es incluso más baja que la cantidad relativa expresada por los linfocitos del testigo, que expresa una cantidad relativa de mRNA de Foxp3 de 15.

La cantidad relativa de mRNA de CTLA-4 expresada por los linfocitos del testigo es tan baja como 0,375 en la población CD4^{+}/CD25^{+} y 0,1 en la población CD4^{+}/CD25^{-}.

La expresión de CTLA-4 en la sub-población CD14^{+}/CD3^{+} de las células TAIC fue similar a la expresión de Foxp3 y fue también significativamente más alta que en todas las demás poblaciones de células.

En este aspecto, es digno de mención el hecho de que la expresión de CTLA-4 (valor relativo de 12500) era varias veces más intensa en la subpoblación CD14^{+}/CD3^{+} que la expresión de Fosp3, que mostró un valor relativo de
50.

No fue detectable ninguna expresión de la integrina \alpha_{E}\beta_{7} en la sub-población CD14^{+}/CD3^{-} de las TAIC, mientras que, de forma similar al comportamiento de la expresión de los otros dos genes analizados, la expresión de la integrina en la subpoblación CD14^{+}/CD3^{+} de las TAIC, medida como valor absoluto en \mug de RNA por \mug de RNA total, alcanzó el valor más alto (3,4 x 10^{9} \mug de RNA/\mug de RNA total).

Este significativo aumento de la expresión de los tres marcadores de linfocitos Foxp3, CTLA-4 e integrina \alpha_{E}\beta_{7} en las TAIC derivadas de monocitos en comparación con linfocitos normales es totalmente inesperada y hasta ahora no había sido nunca observada en monocitos ni en células derivadas de monocitos.

En conclusión, los resultados de este Ejemplo como se muestra anteriormente demuestran lo siguiente: Si se parte de la suposición de que el nivel de expresión de Foxp3, CTLA-4 e integrina \alpha_{E}\beta_{7} se correlaciona con las propiedades inmunorreguladoras de las correspondientes células, se demostró aquí que la actividad supresora de la subpoblación CD3^{+}/CD14^{+} de las TAIC está asociada con una elevada expresión de estos tres genes. Esto es incluso más sorprendente cuando se considera que estos marcadores han sido hasta ahora descritos solamente para linfocitos, pero nunca en células de origen monocítico.

Se mostró además que el co-cultivo directo de TAIC con linfocitos conduce a una cantidad significativamente más alta de linfocitos CD4^{+}/CD25^{+} en comparación con el co-cultivo indirecto y el cultivo de solamente linfocitos. Esto apoya la suposición de que también in vivo (es decir, en un paciente) se forman células T reguladoras después de la administración de TAIC. Estos resultados son conformes con la función inmunorreguladora conocida de los linfocitos CD4^{+}/CD25^{+} y con el hecho de que el contenido de mRNA de Foxp3, CTLA-4 e integrina \alpha_{E}\beta_{7} en estas células es significativamente más alto que en los linfocitos co-cultivados indirectamente o en los linfocitos
testigo.

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Ejemplo 7

Inducción in vivo de la tolerancia al trasplante por linfocitos co-cultivados con TAIC in vitro

Los resultados y conclusiones presentados en el Ejemplo 6 fueron confirmados in vivo en un experimento con animales. En este ejemplo, animales en combinaciones endogámicas seleccionadas fueron inyectados con linfocitos del receptor que, durante un periodo de 5 días, fueron previamente co-cultivados directamente con TAIC del donante. Otros animales fueron inyectados con linfocitos del receptor, que fueron cultivados solos en un medio como
testigos.

Los animales que habían recibido linfocitos co-cultivados autólogos del receptor antes de un trasplante de corazón alogénico, desarrollaron tolerancia específica del donante, mientras que los animales testigo que han recibido linfocitos testigo sin tratamiento previo no co-cultivados del receptor, rechazaron de forma aguda el corazón trasplantado en un plazo de 10 a 14 días.

Esto se muestra también mediante determinación por citometría de flujo de la expresión de GM-7 en la sangre de pacientes postoperatoriamente antes (Figura de la izquierda) y después (Figura de la derecha) de la inyección de los linfocitos co-cultivados con TAIC. La fracción de células que unen GM-7 sube de aproximadamente 0,5% antes de la inyección a aproximadamente 21% después de la inyección, lo que indica el desarrollo de células T reguladoras capaces de unirse a GM-7.

Estos resultados indican que la interacción física de célula con célula entre TAIC del donante y linfocitos del receptor induce la generación de células T reguladoras que, por sí mismas, son capaces de modificar el sistema inmunitario singénico de los receptores, de forma tal que las células T potencialmente aloreactivas son suprimidas y de esta forma se previene el rechazo del órgano.

\newpage

Ejemplo 8

Uso de células inductoras de autotolerancia (STIC) para el tratamiento de colitis crónica inducida con dextrano sulfato sódico (DSS)

La colitis puede inducirse químicamente en ratones mediante administración oral de dextrano sulfato sódico por medio del agua potable. La administración durante un periodo de 7 días tiene por resultado el desarrollo de colitis aguda, y la administración repetida que comprende al menos cuatro ciclos de administración de DSS seguidos por 10 días de agua normal tiene por resultado el desarrollo de una colitis crónica similar a la colitis ulcerosa humana.

Este sistema está bien establecido para exámenes inmunológicos o moleculares [véanse, p. ej., Herfarth, H. et al. "Nuclear factor \kappaB activity and intestinal inflammation in dextran sulphate sodium (DSS)-induced colitis in mice is suppressed by gliotoxin" Clin. Exp. Immunol. 120, 59-65 (2000); Egger, B et al. "Mice lacking transforming growth factor a have an increased susceptibility to dextran sulfate-induced colitis" Gastroenterology 113, 825-832 (1997)] y se usa aquí para examinar el potencial de las STIC en el tratamiento de la versión crónica de la colitis inducida por DSS semejante a la colitis ulcerosa autoinmunitaria humana.

Ratones BALB/c hembra normales (de 20 gramos cada uno) se mantuvieron con acceso ilimitado al agua y con un pienso estándar. Los ratones recibieron cuatro ciclos de agua que contiene 5% (p/v) de dextrano sulfato sódico (DSS; la solución se denomina en adelante agua con DSS) seguida por agua sin tratar de acuerdo con el esquema
siguiente:

6

Al cabo del día 58, todos los ratones muestran síntomas de colitis crónica que dura al menos 2 meses (Fig. 6 A y 6 B).

Los ratones fueron a continuación asignados aleatoriamente a cuatro grupos diferentes:

grupo 1 (n = 5): el día +1 (día 59) después de completarse el cuarto ciclo de ser alimentados con agua con DSS, los ratones recibieron 62,5 unidades internacionales de heparina en 0,25 ml de PBS por vía intravenosa (para prevenir la trombosis), seguidas 30 segundos después por la administración de 5 x 10^{6} STIC de un ratón donante genéticamente idéntico (véase el Ejemplo 2) por vía intravenosa en 1 ml de PBS.

grupo 2 (n = 7): el día +7 (día 65) después de completarse el cuarto ciclo de ser alimentados con agua con DSS, los ratones recibieron 62,5 unidades internacionales de heparina en 0,25 ml de PBS por vía intravenosa (para prevenir la trombosis), seguidas 30 segundos después por la administración de 5 x 10^{6} STIC de un ratón donante genéticamente idéntico (véase el Ejemplo 2) por vía intravenosa en 1 ml de PBS.

Grupo 3 (n = 12): primer grupo testigo que se somete al tratamiento con DSS pero no recibe ninguna inyección de células.

Grupo 4 (n = 6): segundo grupo testigo que se somete al tratamiento con DSS; el día +1 (día 59) después de completarse el cuarto ciclo de ser alimentados con agua con DSS, los ratones recibieron 62,5 unidades internacionales de heparina en 0,25 ml de PBS por vía intravenosa (para prevenir la trombosis), seguidas 30 segundos después por la administración de 5 x 10^{6} "células testigo" de un ratón donante genéticamente idéntico (véase el Ejemplo 1) por vía intravenosa en 1 ml de PBS (las "células testigo" son una mezcla de células de la médula ósea, células de sangre periférica y células esplénicas que representan las células antes del cultivo para producir las STIC de acuerdo con el ejemplo 2, es decir, células no cultivadas obtenidas del bazo de ratones singénicos).

Todos los ratones fueron sacrificados el día 79, tres semanas después de completarse el cuarto ciclo de alimentación con agua con DSS.

En el curso de los experimentos el peso de los animales se midió tres veces por semana durante la inducción con DSS y después de las tres semanas siguientes. Los cambios del peso corporal de los animales se expresan en porcentaje (pérdida o ganancia de peso) con referencia al peso de los ratones el día 59, cuando recibieron la terapia celular. Los cambios en el margen de aproximadamente 5 a 15% se considera que son significativos.

Los cambios en el peso corporal de los ratones en el curso del periodo de 3 semanas después del final del tratamiento con DSS se muestran en la Figura 7. Como puede observarse, la administración de STIC el día +1 (grupo 1 = \boxempty) conduce a una ganancia de peso adecuada dependiente de la edad, que no puede encontrarse ni en los animales no tratados (grupo 3 = \ding{116}) ni en animales tratados con "células testigo" el día +1 (grupo 4 = \bullet) ni en animales tratados con STIC el día +7 (grupo 2 = \ding{115}) durante el progreso de la enfermedad. Estos valores son valores medios obtenidos a partir de 5 a 7 ratones por grupo, y la desviación estándar es siempre inferior a \pm 15%.

En otro experimento, el tejido del colon fue teñido histológicamente con hematoxilina y eosina (H&E). La tinción con H&E se llevó a cabo como se describe en Woods, A. E. y Ellis, R. C. (eds.) (Laboratory Histopathology: A Complete Reference, vol. 1 & 2; Churchill and Livingstone, 1994). La condición de la mucosa teñida fue puntuada por dos patólogos que actuaban independientemente y que eran desconocedores del diseño experimental, de acuerdo con el esquema siguiente:

puntuación 0: hallazgo no oclusivo sano;

puntuación 1: colitis mínima;

puntuación 2: colitis moderada;

puntuación 3: colitis severa; y

puntuación 4: colitis ulcerosa acompañada por la destrucción de toda la mucosa.

Los resultados de la puntuación se muestran en la Figura 8. Tres semanas después de completarse el cuarto ciclo de alimentación con agua con DSS, los animales testigo del grupo 3 (sin inyección de células) tienen una puntuación media de aproximadamente 4, mientras que los animales del grupo 1 (administración de STIC el día +1) o del grupo 2 (administración de STIC el día +7) tienen puntuaciones medias reducidas significativamente, de aproximadamente 1 (grupo 1) y aproximadamente 1,5 (grupo 2), respectivamente. Los animales tratados con "células testigo" (grupo 4) tienen una puntuación media de aproximadamente 3, que es casi tan alta como la puntuación de los ratones no tratados (grupo 3).

Estos resultados son consistentes con los hallazgos de una evaluación histológica de las secciones de colon teñidas (tinción con H&E, véase anteriormente), como puede verse en el Figura 6. Esta evaluación es la más crítica para la determinación del efecto del tratamiento con STIC. La Fig. 6 A (2,5 aumentos) y la Fig. 6 B (10 aumentos) ilustran la condición del colon de un animal no tratado del grupo 3, con una mucosa ampliamente destruida, y estando los tejidos circundantes invadidos profundamente por células inflamatorias. Estas Figuras muestran un estado avanzado de colitis. Contrariamente al avance de la progresión de la colitis en animales no tratados (Fig. 6A/B), la morfología de la mucosa se mantiene en gran medida en animales del grupo 1 que recibieron STIC el día +1 (Fig. 6C (2,5 aumentos) y 6D (10 aumentos)). Solamente pueden observarse signos menores de inflamación y destrucción de la mucosa en estos animales, pero no de invasión de los tejidos circundantes. Las secciones del colon de un animal del grupo 4 tratado con "células testigo" el día +1 (Fig. 6E; 2,5 aumentos) y de un animal del grupo 2 tratado con STIC el día +7 (Figura 6F; 2,5 aumentos) muestran síntomas de colitis avanzada con una mucosa destruida en gran parte y estando los tejidos circundantes profundamente invadidos por células inflamatorias similares a las observadas en los animales no tratados (Fig. 6A/B).

Los resultados de los experimentos anteriores indican que las STIC administradas el día +1 después del final del tratamiento con DSS para la inducción de colitis, son capaces de suprimir o aliviar claramente los síntomas de colitis. Los animales tratados con STIC no pierden peso de forma significativa (Fig. 7), su puntuación histológica es significativamente reducida en comparación con los animales no tratados (Fig. 8), y la condición global de la mucosa del colon es casi normal, como puede verse por tinción histológica de secciones del colon (Fig. 6 C/D). Las STIC administradas el día +7 (grupo 2) no son capaces de tratar la colitis desarrollada durante el periodo de 7 días antes de la administración de las STIC. Aunque no hay reversión del curso de la colitis que tiene lugar, el progreso de la enfermedad se detiene, como puede verse a partir de la puntuación histológica más baja de un animal del grupo 2 en comparación con un animal del grupo 3 no tratado (Fig. 8). Este fenómeno es específico para el modelo de colitis inducida por DSS usado en este ejemplo, y no puede ser transferido fácilmente a otras
condiciones.

La mezcla de células de la médula ósea, células de la sangre periférica y células esplénicas que representan las células no cultivadas obtenidas del bazo de ratones singénicos, no es factible para el tratamiento de la colitis, ya que los animales tratados con estas células (grupo 4) muestran síntomas tan graves como los animales no tratados (Fig. 6 E/F; Fig. 7 y 8). Esto proporciona una evidencia clara de que solamente las STIC son capaces de tratar la colitis y no otras células presentes en la mezcla de células de las que se desarrollan las STIC durante el cultivo.

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Ejemplo 9

Uso de células inductoras de auto-tolerancia (STIC) para el tratamiento de la colitis inducida en ratones SCID por transferencia de linfocitos CD4^{+}CD62L^{+}

La inducción artificial de colitis en ratones SCID (Severe Combined ImmunoDeficiency: inmunodeficiencia grave combinada) es otra solución para el análisis de las STIC y de su potencial en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.

Los ratones SCID no poseen células T ni B. Su sistema inmunitario puede ser reconstituido por transferencia de una subpoblación especifica de células del tiroides. Estas células, llamadas células CD4^{+}CD62L^{+} o CD62L^{high}, repueblan el sistema inmunitario pero, debido a la falta de control, inducen también el desarrollo de colitis espontánea con inflamación crónica. Este sistema modelo es el llamado "modelo de transferencia de SCID CD62L^{+}/CD4^{+} de colitis experimental crónica en ratones" [véase p. ej. [see e.g. Mudter, J. et al. "A new model of chronic colitis in SCID mice induced by adoptive transfer of CD62L^{+}CD4^{+} T cells: Insights into the regulatory role of interleukin-6 on apoptosis" Pathobiology 70, 170-176 (2002)] que permite análisis más específicos de poblaciones de células implicadas en el desarrollo en colitis como ejemplo de enfermedades autoinmunitarias.

El modelo se usa en el presente texto para examinar el potencial de las STIC en el tratamiento de la colitis inducida por un sistema inmunitario desorganizado. Este modelo permite estudios más mecanísticos, pero se considera que es el sistema más débil en comparación con el sistema modelo DSS (véase el Ejemplo 8 anteriormente) porque el sistema inmunitario no es repoblado totalmente.

Los ratones BALB/c SCID (de 18 a 22 g cada uno) reciben una inyección intraperitoneal de 1 x 10^{6} células T CD4^{+}/CD62L-selectina^{high}, aisladas de los bazos de ratones BALB/c normales, usando el sistema de clasificación de células de esferas magnéticas "Macs" (Milteny Biotech, Alemania) en PBS. Los ratones se mantuvieron con acceso ilimitado al agua y con pienso estándar.

Dentro de las 4 a 6 semanas después de la transferencia de las células T CD4^{+}/CD62L-selectina^{high}, los ratones desarrollaron colitis. El desarrollo de colitis se determina enjuiciando los cambios de peso.

Los ratones fueron asignados a continuación aleatoriamente a tres grupos diferentes:

grupo 1 (n=10): 6 semanas después de la iniciación de la inducción de colitis por administración de las células T CD4^{+}/CD62L-selectina^{high}, los ratones recibieron 62,5 unidades internacionales de heparina en 0,25 ml de PBS por vía intravenosa (para prevenir la trombosis), seguidas 30 segundos después por la administración de 5 x 10^{6} STIC de un ratón donante genéticamente idéntico (véase el Ejemplo 21) por vía intravenosa en 1 ml de PBS,

grupo 2 (n=10): primer grupo testigo que recibe solamente las células T CD4^{+}/CD62L-selectina^{high}, pero no recibieron ninguna otra inyección de células después de 6 semanas,

grupo 3 (n=10): segundo grupo testigo que recibe las células T CD4^{+}/CD62L-selectina^{high}. Después de 6 semanas los ratones recibieron 62,5 unidades internacionales de heparina en 0,25 ml de PBS por vía intravenosa (para prevenir la trombosis), seguidas 30 segundos después por la administración de 5 x 10^{6} "células testigo" de un ratón donante genéticamente idéntico (véase el Ejemplo 2) por vía intravenosa en 1 ml de PBS. Las "células testigo" son las mismas que se definen en el Ejemplo 8 (mezcla no cultivada de células de la médula ósea, células de sangre periférica y células esplénicas).

Todos los animales fueron sacrificados de 10 a 12 semanas después de la transferencia de las células T inductoras de la enfermedad o cuando los animales testigo desarrollan síntomas de colitis, juzgados por los cambios de peso dentro del grupo testigo básico 2.

De modo similar al modelo DSS descrito en el ejemplo 8, el peso corporal de los animales se midió tres veces por semana durante todo el periodo experimental. Los cambios en el peso corporal de los animales se expresan en porcentaje (de pérdida o de ganancia de peso) con referencia al peso de los ratones 6 semanas después del comienzo del experimento cuando reciben la terapia celular. De nuevo, se considera que son significativos los cambios en el intervalo de aproximadamente 5 a 15%.

Los cambios en el peso corporal de los ratones en el curso de todo el periodo experimental se muestran en la Fig. 9. Después de 6 semanas los ratones de todos los grupos son de casi el mismo peso corporal. Mientras la administración de STIC después de 6 semanas (grupo 1 = \blacklozenge) más adelante conduce a una ganancia de peso adecuada dependiente de la edad, los ratones del grupo de animales no tratados (grupo 2 = \blacksquare) así como los ratones tratados con "células testigo" después de 6 semanas (grupo 3 = \ding{115}) muestran un aumento de peso corporal comparativamente reducido (grupo 2) o ningún aumento en absoluto (grupo 3) durante el progreso de la enfermedad. Los valores son valores medios obtenidos de 6 ratones por grupo, y la desviación estándar es siempre inferior a \pm 15%.

Inmediatamente después de sacrificar los animales, se determinó la longitud del colon y el peso del bazo de estos animales. Ambos valores permiten una estimación del alcance de la inflamación, pero no son muy sensibles.

La Figura 10 ilustra los resultados de las medidas de la longitud del colon (Fig. 10A) y el peso del bazo (Fig. 10B). Como puede observarse en esta Figura, los cólones de los animales tratados con STIC son significativamente más largos (aproximadamente 11 cm) y sus bazos significativamente más pequeños (aproximadamente 50 mg) que los de los animales testigo. Los animales testigo del grupo 2 tienen cólones acortados (aproximadamente 10,3 cm) y bazos agrandados (aproximadamente 100 mg) indicadores de una inflamación grave, mientras que los animales que reciben células testigo (grupo 3) desarrollan síntomas de colitis menos graves (longitudes de colon de aproximadamente 10,6 cm y pesos del bazo de aproximadamente 60 mg) en comparación con los animales testigo (grupo 2), pero una colitis más avanzada en comparación con los animales tratados con las STIC (grupo 1).

Subsiguientemente, en otro experimento, el tejido del colon fue teñido histológicamente con hematoxilina y eosina (tinción con H&E; Woods, A. E. y Ellis, R. C. (eds.); Laboratory Histopathology: A Complete Reference, vol. 1 y 2; Churchill and Livingstone, 1994). Como ya se ha descrito en el Ejemplo 8, la condición de la mucosa fue puntuada por dos patólogos que actúan independientemente, y que eran desconocedores del diseño experimental. El esquema de puntuación para la mucosa fue el mismo que en el Ejemplo 8:

puntuación 0: hallazgo no oclusivo sano;

puntuación 1: colitis mínima;

puntuación 2: colitis moderada;

puntuación 3: colitis severa; y

La puntuación media se muestra en la Figura 11. Seis semanas después de la transferencia del tratamiento los animales testigo del grupo 2 que no reciben inyección de células tienen una puntuación media de aproximadamente 3, que indica colitis severa. Los ratones del grupo 1 que reciben STIC y los ratones del grupo 2 que reciben células testigo después de 6 semanas tienen puntuaciones medias significativamente reducidas de aproximadamente 1,5 (que indica una colitis mínima; grupo 1) y aproximadamente 2,5 (que indica una colitis moderada; grupo 2),
respectivamente.

Estos resultados son de nuevo consistentes con los hallazgos de una evaluación histológica de las secciones de colon teñidas con H&E como puede verse en la Figura 12 (100 aumentos). La Figura 12 A/B ilustra la condición de los cólones de los animales del grupo 3 que permanecieron sin tratar después de la inducción de colitis con células T CD62L^{high}. Ambos ejemplos muestran una acusada infiltración con células mononucleares y una pérdida sustancial de integridad de la mucosa, lesión de la cavidad e infiltración de la submucosa y de la capa muscularis propia. La inyección de "células testigo" (monocitos no M-CSF y estimulados con \gamma-interferón derivados de la sangre, la médula ósea y/o tejido del bazo) como se ha descrito, no previene la infiltración de células mononucleares y la pérdida de mucosa, como puede verse en la Figura 12 C/D. Ambas muestras indican también infiltración submucosal con linfocitos, pero la muscularis propria está aún intacta. La administración de STIC después de la inducción de colitis con células T CD62L^{high} mejoró profundamente la integridad mucosal (Fig. 12E/F). En secciones de colon de ambas muestras puede verse solamente infiltración menor de linfocitos, no pérdida de cavidad y no daños en las capas de mucosa y muscularis propria dentro de los segmentos de intestino analiza-
dos.

De modo similar a los resultados obtenidos para la administración de STIC para el tratamiento de colitis crónica inducida por dextrano sulfato sódico (DSS) (véase el Ejemplo 8 anteriormente), se indica en el presente texto, usando el modelo de transferencia de SCID CD62L^{+}/CD4^{+} de colitis experimental crónica en ratones, que las STIC son capaces de suprimir o aliviar claramente los síntomas de la colitis inducida. Los ratones tratados con STIC muestran una adecuada ganancia de peso dependiente de la edad (Fig. 9), su colon es significativamente más largo (Fig. 10A) y el peso de su bazo es significativamente más bajo (Fig. 10B) que el de los ratones del grupo testigo que padecen inflamación grave del colon. Finalmente, la puntuación histológica de los ratones tratados con STIC es significativamente más baja en comparación con los animales no tratados (Fig. 11) y el análisis histológico de secciones de colon de los ratones tratados con STIC muestra solamente síntomas menores o ningún síntoma de colitis
(Fig. 12).

En comparación con el efecto del tratamiento de la colitis con STIC, la mezcla de células de la médula ósea, células de sangre periférica y células de bazo que representan las células no cultivadas obtenidas del bazo de ratones singénicos, muestra una eficacia significativamente reducida, ya que los animales tratados con estas células (grupo 3) muestran síntomas más graves que los que se encuentran en animales tratados con STIC (Fig. 9, 10A/B, 11 y 12). Al contrario que los resultados obtenidos en el Ejemplo 8 usando el sistema modelo DSS, en el modelo de inducción de colitis con células CD62L^{high} las células testigo son capaces de aliviar los síntomas hasta cierto punto, ya que los animales que reciben las células testigo muestran síntomas menos graves en comparación con los animales testigo que no reciben ninguna célula.

De acuerdo con los resultados del Ejemplo 8, esto proporciona de nuevo una clara evidencia de que las STIC de la presente invención son capaces de tratar enfermedades autoinmunitarias.

Claims

1. Un procedimiento para preparar células para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con los trastornos de la auto-tolerancia en un paciente, caracterizado porque

a): los monocitos aislados de la sangre del paciente al que se han de administrar las células se multiplican in vitro en un medio de cultivo adecuado que contiene el factor de crecimiento celular M-CSF;

b): los monocitos se cultivan al mismo tiempo o después de la etapa a) en un medio de cultivo que contiene \gamma-IFN; y

c): las células formadas en la etapa b) se obtienen separando las células del medio de cultivo.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1ª, caracterizado porque los monocitos son de origen humano.

3. Un procedimiento según las reivindicaciones 1ª o 2ª, caracterizado porque los monocitos se aíslan de la sangre de manera que junto a los monocitos también están presentes linfocitos en una cantidad de al menos 10%, por referencia al número total de células en el material aislado.

4. Un procedimiento según las reivindicaciones 1ª a 3ª, caracterizado porque las células formadas en la etapa b) u obtenidas en la etapa c) se seleccionan por unión con el anticuerpo producido por la línea de células de hibridoma DSM ACC2542.

5. Un procedimiento según las reivindicaciones 1ª a 4ª, caracterizado porque entre las células formadas en la etapa b) u obtenidas en la etapa c) de la reivindicación 1ª u obtenidas en la etapa de selección según la reivindicación 4ª, se seleccionan aquellas células que co-expresan los antígenos CD3 y CD14 en su superficie celular.

6. Un procedimiento según las reivindicaciones 1ª a 5ª, caracterizado porque la concentración de M-CSF en el medio de cultivo es de 1 a 20 \mug/l.

7. Un procedimiento según las reivindicaciones 1ª a 6ª, caracterizado porque, después de la etapa a), los monocitos se cultivan durante un tiempo de 24 a 72 horas en un medio de cultivo que contiene \gamma-IFN, comenzando el cultivo en presencia de \gamma-IFN de 3 a 6 días después del comienzo de la etapa a) del cultivo.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7ª, caracterizado porque la concentración de \gamma-IFN en el medio de cultivo es de 0,1 a 20 ng/ml.

9. Un procedimiento según las reivindicaciones 1ª a 8ª, caracterizado porque el periodo de cultivo total en las etapas a) y b) es de 4 a 8 días.

10. Un procedimiento según las reivindicaciones 1ª a 9ª, caracterizado porque subsiguientemente a la etapa c) de la reivindicación 1ª o subsiguientemente a las etapas de selección según las reivindicaciones 4ª y 5ª, las células se suspenden en un medio de cultivo adecuado o en una solución de PBS o de NaCl.

11. Un procedimiento según las reivindicaciones 1ª a 10ª, caracterizado porque las células se suspenden en un medio de congelación y subsiguientemente se someten a congelación a baja temperatura.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11ª, caracterizado porque el medio de congelación comprende suero de ternera fetal (FCS) o suero humano AB0 compatible y DMSO.

13. Un procedimiento según las reivindicaciones 1ª a 10ª, caracterizado porque las células obtenidas de la etapa c) de las reivindicaciones 1ª a 3ª o 6ª a 10ª, o las células obtenidas de las etapas de selección de las reivindicaciones 4ª o 5ª, se formulan en un preparado farmacéutico.

14. Células que co-expresan los antígenos CD3 y CD14 en su superficie celular para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con los trastornos de la auto-tolerancia en un paciente, que pueden obtenerse por cualquiera de los procedimientos según las reivindicaciones 1ª a 12ª.

15. Células según la reivindicación 14ª, caracterizadas porque son de origen humano.

16. Preparado celular que contiene las células según las reivindicaciones 14ª o 15ª en un medio adecuado.

17. Composición farmacéutica que contiene células de origen monocítico, que co-expresan los antígenos CD3 y CD14 en su superficie celular, para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con trastornos de la auto-tolerancia en un paciente.

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18. Composición farmacéutica que contiene las células según las reivindicaciones 14ª o 15ª, o el preparado de células según la reivindicación 16ª, o las células obtenidas de la etapa c) de la reivindicación 1ª, o las células obtenidas de la etapa de selección de la reivindicación 4ª.

19. Composición farmacéutica según las reivindicaciones 17ª y 18ª para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.

20. Composición farmacéutica según las reivindicaciones 17ª y 18ª para la prevención y/o el tratamiento de alergias.

21. Uso de las células según las reivindicaciones 14ª o 15ª, o de las células obtenidas de la etapa c) de las reivindicaciones 1ª a 3ª o 6ª a 10ª, o de las células obtenidas de las etapas de selección de las reivindicaciones 4ª o 5ª, o del preparado de células según la reivindicación 16ª, para elaborar una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con trastornos de la auto-tolerancia.

22. El uso según la reivindicación 21ª, para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades autoinmuntarias.

23. El uso según la reivindicación 22ª, caracterizado porque la enfermedad autoinmunitaria es una o más de las enfermedades elegidas entre enfermedades reumáticas con características autoinmunitarias, diabetes mellitus, enfermedades autoinmunitarias del tiroides, enfermedades autoinmunitarias del sistema nervioso central, y enfermedades cutáneas ampollosas.

24. El uso según la reivindicación 21ª para la prevención y/o el tratamiento de alergias.

25. El uso según la reivindicación 24ª, caracterizado porque la alergia se elige entre alergias inducidas por proteínas no propias, sustancias orgánicas y/o sustancias inorgánicas.

26. El uso según la reivindicación 25ª, caracterizado porque la alergia se elige entre fiebre del heno y/o alergias inducidas por fármacos, productos químicos, virus, bacterias, hongos, componentes alimentarios, metales, gases, escamas cutáneas animales, pelo y/o excreciones animales.

27. El uso de células inductoras de autotolerancia según las reivindicaciones 14ª o 15ª, o de las células obtenidas de la etapa c) de las reivindicaciones 1ª a 3ª o 6ª a 10ª, o de las células obtenidas de las etapas de selección de las reivindicaciones 4ª o 5ª, o del preparado de células según la reivindicación 16ª, para generar in vitro y/o propagar linfocitos T reguladores autólogos.

28. El uso según la reivindicación 27ª, en el que los linfocitos T reguladores co-expresan los antígenos CD4 y CD25 en su superficie celular.

29. Un procedimiento para la generación y/o propagación de linfocitos T reguladores autólogos, caracterizado porque las células inductoras de autotolerancia según las reivindicaciones 14ª o 15ª, o las células obtenidas de la etapa c) de las reivindicaciones 1ª a 3ª o 6ª a 10ª, o las células obtenidas de las etapas de selección de las reivindicaciones 4ª o 5ª, o el preparado de células según la reivindicación 16ª, se co-cultivan con un preparado de linfocitos T autólogos.

30. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29ª, en el que los linfocitos T reguladores se obtienen del medio de cultivo.

31. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 29ª o 30ª, caracterizado porque los linfocitos T reguladores co-expresan los antígenos CD4 y CD25 en su superficie celular.

32. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 29ª o 31ª, caracterizado porque los linfocitos T reguladores se obtienen del medio de cultivo mediante clasificación por FACS.

33. El uso de anticuerpos producidos por la línea de células de hibridoma DSM ACC2542 para la detección y/o selección de células obtenidas por el procedimiento de las reivindicaciones 1ª a 14ª adecuadas para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con trastornos de la autotolerancia en un paciente.