KR20050018998A - 단구성 기원의 이식 조직편 허용 유도성 세포, 및 이의생성 방법 및 용도 - Google Patents

단구성 기원의 이식 조직편 허용 유도성 세포, 및 이의생성 방법 및 용도

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KR20050018998A
KR20050018998A KR10-2005-7000517A KR20057000517A KR20050018998A KR 20050018998 A KR20050018998 A KR 20050018998A KR 20057000517 A KR20057000517 A KR 20057000517A KR 20050018998 A KR20050018998 A KR 20050018998A
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마렌 렁케
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블라스티콘 바이오테크놀로지셰 포르슝 게엠베하
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Abstract

본 발명은 단구성 기원의 이식 조직편 허용 유도성 세포 및 이의 생성 방법 뿐만 아니라 이식 조직편 허용을 발생시키기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 사람 이식 조직편 허용 유도성 세포를 특이적으로 인식하는 모노클로널 항체 GM-7에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 이식 조직편 허용 유도성 세포를 탐지 및/또는 선별하기 위한 항체 GM-7의 용도에 관한 것이다.

Description

단구성 기원의 이식 조직편 허용 유도성 세포, 및 이의 생성 방법 및 용도{Transplant acceptance inducing cells of monocytic origin and their preparation and use}
본 발명은 단구성 기원의 이식 조직편 허용 유도성 세포 및 이의 생성 방법 뿐만 아니라 이식 조직편 허용을 발생시키기 위한 이의 용도에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명이 사람 단구로부터 유래되는 이식 조직편 허용 유도성 세포(본원에서 TAIC로 후술되기도 함)에 관한 것이다.
더우기, 본 발명은 사람으로부터 유래되는 본 발명에 따르는 이식 조직편 허용 유도성 세포를 특이적으로 인식하는 모노클로널 항체 GM-7에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 이식 조직편 허용 유도성 세포를 탐지 및/또는 선별하기 위한 상기 항체 GM-7의 용도에 관한 것이다.
용어 "이식(술)(transplantation)"은 한 개체로부터의 세포, 조직 또는 기관(장기)을 또 다른 개체에 전이시키는 면역학 분야에 사용된다. 이식에 대한 필요성은 건강한 개체(공여자)로부터의 건강한 기관, 조직 또는 세포를 관련 질병을 앓고 있는 개체(수용자 또는 숙주)에게 전이(이식)시킴으로써 수 많은 질병을 치료할 수 있다는 사실을 발견함으로써 비롯된 것이다.
공여자와 수용자 간의 상관 관계에 따라서, 다음 유형의 이식 조직편(transplant)으로 구별할 수 있다:
1. 자가 유래(autologous) 이식 조직편: 이는 동일한 한 개체 내에서 자기 몸의 한 부분이 또 다른 부분으로 이식되는 조직 또는 세포이다.
2. 동족내(isologous) 이식 조직편: 이는 유전적으로 동일한 개체들 간의 전이와 관련이 있다. 이들의 예는 랫트 또는 마우스의 근친계(inbred strain)이다. 사람의 경우, 동족내(동계: syngeneic) 이식 조직편은 유전적으로 동일한(일란성) 쌍생아 간의 것으로 간주될 수 있다.
3. 동종(allogeneic) 이식 조직편: 이 용어는 동일한 종이긴 하지만, 유전적으로 상이한 구성원들 간의 이식 조직편을 지칭하는데, 예를 들어, 한명의 사람 개체로부터 또 다른 사람 개체로 이식되거나, 또는 실험용 동물의 경우에는, 하나의 근친계 동물로부터 또 다른 근친계 동물로 이식된다.
4. 이종(xenogeneic) 이식 조직편: 이는 상이한 종들 간의 전이와 관련이 있는데, 예를 들면, 원숭이 심장을 사람에게 이식하는 것이다.
대체로, 자가 유래 및 동족내 이식 조직편은 거부 반응 측면에서 면역학적 문제점을 전혀 일으키지 않는다. 그러나, 동종 및 이종 이식 조직편의 경우에도 항상 그런 것은 아니다. 이러한 이식 조직편은 수용자의 면역계에 의해 외래인 것으로 인식되어, 비교적 단시간 후에 거부된다. 동종/이종 이식 거부 반응의 경우에는, T-림프구(T-세포로 후술됨)가 중추적인 역할을 한다. 이들 세포는 이들의 주요 조직 적합성 복합체(MHC)를 통하여 외래 세포를 인식한다. 이러한 외래 MHC-복합체는 수용자의 항원-반응성 T-세포를 감작시키는데, 이로써 활성화된 T-세포는 공여자 세포 또는 공여자 조직을 각각 파괴시킨다. 상이한 MHC-복합체를 지닌 세포는 또한 "MHC-상이한" 세포로 지칭된다.
동종 또는 이종 세포, 조직 또는 기관을 이식하면, 2가지 상이한 개체의 세포, 즉 MHC-상이한 세포가 수용자의 혈액 내에 동시에 존재하는 상황이 반드시 일어나게 된다. 이러한 현상은 "키메리즘(chimerism)"으로서 지칭된다. 마이크로-키메리즘과 매크로-키메리즘으로 구별된다. 마이크로-키메리즘은, 예를 들어, 혈액 또는 골수 수혈 후 또는 림프구-풍부 기관(예를 들면, 소장 또는 간) 이식 후, 공여자로부터 유래된 세포가 MHC-상이한 숙주에 영속적으로 남아있긴 하지만, 수 개의 분리된 경우에서만 탐지 가능한 상태를 지칭한다. 용어 매크로-키메리즘은 수용자에게서 탐지된 세포의 5% 이상이 공여자로부터 유래된 것일 때 사용되며, 양 경우에 있어 수용자의 혈액 또는 기관 내에 공여자 세포가 상응하게 탐지되는 혈액과 기관 키메리즘 간의 차이는 구별될 필요가 있다.
키메리즘은 어느 정도까지는 이식 조직편에 대한 관용(tolerance)을 유발시킬 수 있다. 예를 들어, 백혈병 또는 림프종 질환으로 인해, 공여자와 수용자 간에 상당히 상응하는 MHC 패턴을 지닌 동종 골수 이식을 진행시켜야만 하는 사람의 경우에는, 이에 상응하게 골수-절제하는 조건부 처치(conditioning)(개체 자신의 골수와 이로부터 유래된 혈액 세포의 파괴)에 이은 줄기 세포 이식 후에 "공여자 키메리즘"이 관찰되었다. 이들 환자의 경우에는, 혈액 내에서 탐지될 수 있는 세포의 99% 이상이 공여자의 줄기 세포로부터 유래된 것이고, 이러한 키메리즘이 상기 공여자로부터 이식된 모든 기관에 대한 관용의 토대를 형성하였다. 이러한 관찰 결과는 후속 신장, 간 및 폐 세그먼트 기증자를 대상으로 한 일련의 임상 실시예에서 확인되었다[참조: Dey B., et al., "Outcomes of Recipients of both bone marrow and solid organ transplants: A review." Medicine (Baltimore) 77, 355-369 (1989)]. 관용 유도를 위해서는, 공여자 세포의 90% 이상이 동종 수용자의 말초혈 내에 존재하는 것으로서 정의되는 완전한 공여자 키메리즘이 실재하는 것이 중요한 것이 아니라, 공여자 세포의 5% 분획("혼합" 키메리즘으로 지칭됨)으로도 관용을 유도하기에 충분하다는 사실이 밝혀졌다[참조: Acholonu I.N. and Ildstad S.T., "The role of bone marrow transplantation and tolerance: Organ-specific and cellular grafts", Curr. Opin. Organ. Transplant 4, 189-196 (1999)].
기본적으로, 골수 이식(BMTx)에 수반되는 공여자 키메리즘이 관용을 유도한다는 증거가 제시되긴 하였지만, 그럼에도 불구하고 지금까지는, 완전하게 MHC-상이한 공여자와 수용자 집합체의 경우에 성공적인 동종 BMTx를 수행하는 것이 가능하지 않았다. 이는 이를 위해 요구되는 필수 조건부 처치, 즉 수용자의 조건부 처치(상기 참조)가 수용자에 대해 상당한 영향을 미치는 3가지 유형의 위험을 내포하고 있다는 사실 때문이다. 첫 번째로는, 부가의 방사선 치료와 함께 투여되거나 또는 방사선 치료 없이 투여되는, 사용된 화학요법제의 골수 독성으로 인해 현저한 질병률이 야기된다. 두 번째로는, 선행된 조건부 처치에도 불구하고 이식된 골수가 거부될 위험이 있다. 마지막으로는, 이식 조직편과 함께 숙주에게 전이된 T-세포가 숙주 유기체에 대항하여 충돌하는 경우에 이식편 대 숙주 질병(GvHD)이 발병할 위험이 있다[참조: Wolff S.N., "Hematopoietic cell transplant from volunteer unrelated or partially matched related donors: Recent developments." Curr. Opin. Organ. Transplant 5, 372-381 (2000)]. 이러한 질병은 수용자의 면역계가, 골수와 함께 전이된 T-세포가 수용자에게서 치명적인 거부 반응을 유발시킬 수 있을 정도로 선행된 조건부 처치에 의해 약화된 경우에는 언제든지 발병한다.
앞서 언급된 문제점들을 피하기 위해서는, 수용자에 대한 조건부 처치가 가능한 한 약한 수준이 되도록 하는 연구 노력들이 현재 진행중이다. 그러나, 공여자와 수용자 간의 MHC-상이성이 보다 클 수록, 이식된 골수의 거부 반응을 방지하기 위해서는 보다 강력한 조건부 처치가 선택되어야만 하는데, 이로써 이식편 대 숙주 질병(GvHD)의 위험이 다시 증가하게 된다.
지금까지는, 유도된 키메리즘이, 공여자 기관에 대한 안정적인 관용 환경을 보장하기 위해 수용자의 혈액 내에 탐지 가능한 수준으로 유지되어야만 하는 기간에 관해서는 어떠한 상세 연구 조사도 수행된 바가 없었다. 그러나, 마우스 모델로부터의 신뢰할 만한 데이터는 2주 동안 탐지 가능한 매크로-키메리즘이 관용을 유발시키기에 이미 충분하다고 지시하고 있다[참조: Weckerle, T. et al. "Allogeneic bone marrow transplantation with co-stimulatory blockade induces macro-chimerism and tolerance without cytoreductive host treatment." Nat. Med. 6, 464-469 (2000)].
관용을 초래하기 위해 현재 이용 가능한 면역억제제에 대한 대체물을 개발하고자 하는 필요성은 2가지 주요 관점에서 비롯된 것이다. 한 가지 관점으로는, 지금까지 임상적으로 이용 가능한 면역억제제는 만성 이식 거부 반응을 방지할 수 있는 능력이 없었으며, 또 다른 관점으로는, 면역억제제를 영구적으로 투여할 경우에는, 환자가 바이러스, 세균 및 진균에 쉽게 감염되고, 악성 종양 형성을 통하여 상당한 위험을 유발시키고 심혈관계 질환, 특히 심근 경색 및 심부전증을 발병시키는 심각한 부작용이 수반된다는 것이다[참조: Wheeler, D. C. and Steiger, J. "Evolution and Etiology of Cardiovascular Diseases in Renal Transplant Recipients" Transplantation 70, 41-45 (2000)].
다음 문헌에는 트립토판의 선택적인 제거 및/또는 해당 세포를 둘러싸고 있는 환경 하에서의 하나 이상의 트립토판 대사물 증가에 근거하는, 대식 세포-유도된 T-세포 억제 방법이 기재되어 있다[참조: Munn et al. "Inhibition of T Cell Proliferation by Macrophage Tryptophan Catabolism" J. Exp. Med. 189, 1363-1372 (1999)]. 이러한 관찰 결과로부터 출발하여, 상기 저자는 국소 세포외 트립토판 농도를 변형시킴으로써, 특히 IDO-매개된 트립토판-대사를 억제 또는 증가시킴으로써 T-세포 매개된 면역 반응을 변형시키는 방안을 제안하였다[예를 들면, 미국 특허 제6,482,416호 및 제6,451,840호 참조]. 따라서, 이러한 접근법은 T-세포에 대해 지시된 추가의 항원 독립적 및 비특이적 면역억제 만을 제공할 뿐이다.
그러나, 긴급히 필요한 것은 공여자-특이적 관용을 유도하기 위한 임상적으로 적용 가능한 발상(concepts)인데, 즉 공여자로부터 이식된 기관 상에 존재하는 조직 항원에 대한 숙주의 면역 반응이 특이적으로 억제되긴 하지만 숙주의 면역적격성인 경우에는 완전하게 보존된다는 발상이다.
이러한 발상을 통하여, 기관 수요와 기관 공급 간의 불일치는 중장기적인 견지에서 상당히 저하시킬 수 있는데, 이는 이러한 방식으로 훨씬 더 적은 수의 기관이 급성 및 만성 거부 반응에 따른 결과로서 손실될 수 있기 때문이다. 적합한 기관의 부족은 2001년 2월부터 기산된 미국 통계치로써 설명될 수 있다:
"UNOS(미국 기관(장기) 분배 연합망) 국립 기관(장기) 이식 환자 대기 목록 (2001년 2월)"으로부터의 최신 데이터
이식 조직편 유형 대기 목록 상의 환자 수
신장 47,996
간 17,151
췌장 1,060
췌장 섬 세포 185
신장-췌장 2,442
장 151
심장 4,222
심장-폐 210
폐 3,721
환자 총 수 74,800
상기 데이터는 공여자-특이적 관용을 유도하기 위한 발상을 개발하기 위해 막대한 국가적 및 국제적 노력들이 행해지고 있다는 사실을 설명해준다.
결과적으로, 본 발명의 근간을 이루는 문제점은 거부 반응 없이 장기간 동안 해당 외래 세포, 조직 또는 기관을 관용 및/또는 허용하는 방식으로 수용자 유기체의 T-세포에 영향을 미치는 수단을 제공하는 것이다. 이들 수단의 구성과 이들의 제조 방법 또는 용도는 어떠한 윤리적 및/또는 법적 문제점도 유발시키지 말아야 하며, 의도하는 치료학적 용도 목적에 필요한 양과 허용 가능한 제작 비용으로 의도하는 치료학적 용도에 사용하기 위해 이들을 신속하게 제조할 수 있어야만 한다.
상기 문제점을 해결하기 위해, 척추동물, 특히 포유류, 보다 바람직하게는 사람으로부터 본 발명에 따르는 단구성 기원의 이식 조직편 허용 유도성 세포(TAIC)가 제공된다. 놀랍게도, 본 발명에 따라서 변형된, 공여자(기관 공여자)의 혈액으로부터 유래된 단구가 수술전 및/또는 수술후 투여의 경우에, 외래 MHC-복합체에 의해 활성화된 자신의 T-세포에 대항하여 수용자 유기체를 보호함으로써, 이식 조직편의 거부를 방지할 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 이식 조직편 관용을 유도하기 위한 "세포성 치료제"로서 사용된 경우에는, 상기 변형된 세포가 해당 환자에게서 이식편 대 숙주 질병, 종양, 특히 악성 종양의 유도 및 세포성 거부 측면에서 부작용을 전혀 유발시키지 않거나 주목할 만한 부작용을 유발시키지 않는다.
놀랍게도, 본 발명에 따르는 방법이, 면역 억제되지 않은 동종 수용자 내로의 주사 후에, 공여자의 세포 또는 조직에 대항한 천연 면역 반응을 방지할 수 있으므로 말초혈 내에서 3주 이상 동안 순환할 수 있는 세포를 수득하는 방식으로 단구의 시험관내 변형을 유발시킨다는 사실이 밝혀졌다. 체중(BW) kg당 대략 105개 세포를 투여한 후, 이로써 생성된 GM-7 양성 세포의 키메리즘(하기 참조)는 5 내지 20% 영역 내이다. 이러한 일시적인 키메리즘은
a) 바람직하게는 상기 세포를 정맥내 투여한 후 10일 이내에 동일한 공여자로부터의 후속 기관 이식을 위한 장기간 허용을 유도시키고,
b) 세포를 기관 이식에 연속해서 사용하는 경우에 단기간 면역억제 치료와 조합한 장기간 허용을 유도시킨다.
실시예 10에 제시된 바와 같이, 본 발명의 세포의 면역억제 효과는 문(Munn) 등에 의해 관찰된 바와 같이(상기 참조), 트립토판 분해 효소 인돌아민-2,3-디오게나제(IDO)의 발현에 의한 대식 세포-유도된 T-세포 억제와 연관이 없다. 오히려, 본 발명의 TAIC는 한편으론 동종(이계) 반응성 T-세포를 불활성화시키고 또 다른 한편으론 수용자에게서 조절성 T-세포 형성을 유도시킴으로써, 수용자에게서 공여자에 대한 특이적 관용을 유도시킨다(실시예 12 및 13 참조).
따라서, 세포를 둘러 싸고 있는 환경 하의 트립토판을 IDO-매개 제거함으로써 T-세포의 증식을 억제하는, 단구로부터 유래된 대식 세포는 본 발명에 포함되지 않는다.
도 1은 본 발명에 따르는 세포를 변형시키기 전(좌측 그래프) 및 변형시킨 후(우측 그래프), 본래의 단구성 세포에 대한 GM-7의 결합 능력을 유동 세포계수법으로 결정하여 도시한 것이다. x축은 결합된 세포 수를 지시한다.
도 2A는 랫트 모델(그룹당 10마리 동물)에서 공여자-유래된 TAIC를 수술전 투여하거나 투여하지 않으면서 이소(異所)(heterotopic) 심장 이식을 수행한 후 심장 이식 조직편의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선을 도시한 것이다.
도 2B는 -7일 째에 106개의 LEW-유래된 TAIC로 예비처리시킨 바 있는 DA 수용자 랫트의 복부에 이소 이식을 수행한 후 POD(수술후 일수) 150일 째의 LEW 동종 이식 조직편의 조직학적 제제를 도시한 것이다. 배율 인자: 40.
도 2C는 LEW-MHC 부류 I에 특이적인 모노클로널 항체 I1.69로 해당 제제를 표지시킨 후, 106개의 LEW-유래된 TAIC로 예비처리시킨 DA 랫트의 흉선으로부터의 조직학적 제제를 도시한 것이다.
도 2D는 LEW-유래된 TAIC를 주사한 후(랫트 1 내지 3: 106개 세포/kg x BW; 랫트 4: 104개 세포/kg x BW) 면역억제시키지 않은 4마리의 DA 수용자 랫트에게서 공여자-유래된 세포의 유동 세포계수법을 이용한 탐지를 도시한 것이다.
도 3은 랫트 모델(그룹당 6 내지 10마리 동물)에서 사이클로스포린 A(CSA; 5mg/kg x BW) 4회 초기 투여와 조합하여 공여자-유래된 TAIC를 수술후 투여하거나 투여하지 않으면서 이소 심장 이식을 수행한 후 심장 이식 조직편의 카플란-마이어 생존 곡선을 도시한 것이다.
도 4A-C는 그룹당 6마리 동물에서 공여자-유래된 TAIC를 수술전 투여하거나 투여하지 않으면서 이소 이식(A 및 C) 또는 동소(同所)(orthotopic) 이식(B)을 각각 수행한 후 심장(A), 간(B) 및 신장(C) 이식 조직편의 카플란-마이어 생존 곡선을 도시한 것이다.
도 4D-F는 LEW 수용자 랫트 내로 이소 이식을 수행한 후 신장(D), 간(E) 및 피부(F)의 DA 이식 조직편의 조직학적 제제를 도시한 것이다.
도 5A는 랫트 모델(그룹당 6마리 동물)에서 CSA(5mg/kg x BW) 4회 초기 투여와 조합하여 공여자-유래된 TAIC를 수술후 투여하거나 투여하지 않으면서 근친계의 상이한 조합물을 이소 심장 이식한 후 심장 이식 조직편의 카플란-마이어 생존 곡선을 도시한 것이다.
도 5B는 LEW 공여자 동물(그룹당 6마리 동물)로부터의 상이하게 처리된 혈액 단구를 투여한 후 7일 째에 이소 심장 이식을 수행한 후 심장 이식 조직편의 카플란-마이어 생존 곡선을 도시한 것이다.
도 6A는 CSA, 아자티오프린(AZA) 및 스테로이드(STE)의 삼중 면역억제를 사용하여 돼지["비근친계 미니 돼지(outbred minipig)"]에게서 동소 좌측 폐 이식을 수행한 후 폐 이식 조직편의 카플란-마이어 생존 곡선을 도시한 것이다(그룹당 4마리 동물).
도 6B는 POD(수술후 일수) 41일 및 55일 째에 2개의 단일-좌측 폐 이식된 돼지("비근친계 미니 돼지")의 가슴 X선 사진(후방-전방 기술)이다. 이식 후 28일 째에 CSA, AZA 및 스테로이드의 삼중 면역억제를 중단하였다.
도 7은 개체 B로부터의 CD14+ 단구(GM-7-: 회색 칼럼; GM-7+: 검정색 칼럼), MHC-불일치 공여자 A로부터의 반응인자 세포, 및 CD14+/GM-7+ 및 CD14+ /GM-7- 세포의 억제인자 활성을 비교하기 위해 공여자 B로부터 조사된 세포의 혼합 림프구 배양물을 도시한 것이다.
도 8은 TAIC의 억제인자 활성에 대한 억제인자(1-MT)의 영향을 결정하기 위해 인돌아민-2,3-디옥시게나제(IDO)의 억제인자(1-MT)와 함께 2가지 실험에서 예비 항온 배양된, PHA-자극된 림프구(PhaLy) 및 TAIC("Mo+Ly" 또는 "Mo")의 혼합 림프구 배양물을 도시한 것이다.
도 9는 면역억제성 CD14+/CD3+-세포의 형성에 대한, 배양 개시시 단구를 증강시키기 위해 세포를 정제하는 것의 영향을 결정하기 위해, CD14+-단구의 양과 단구 분획 중의 CD2+-림프구의 양 뿐만 아니라 TAIC로서 유효한 CD14+/CD3+ -세포의 양을 유동 세포계수법으로 결정하여 도시한 것이다.
도 10은 혈액 세포 중의 생체내-GM-7-발현에 대한 TAIC의 영향을 결정하기 위해, TAIC를 수술후 주사하기 이전(좌측 그림) 및 이후(우측 그림) 환자 혈액 내에서의 GM-7-발현을 유동 세포계수법으로 결정하여 도시한 것이다.
단구성 기원의 TAIC를 생성하기 위한 본 발명에 따르는 방법의 주요 단계는
(a) 혈액, 바람직하게는 사람 혈액으로부터 단구를 분리하는 단계;
(b) 이러한 단구를, 대식 세포 콜로니 자극 인자(M-CSF로서 후술됨)를 성장 증진제로서 함유하는 적합한 배양 배지에서 증식시키는 단계;
(c) 상기 단구를 γ-인터페론(γ-IFN으로서 후술됨)으로 자극하는 단계; 및
(d) 상기 배양 배지로부터 이식 조직편 허용 유도성 세포를 격리시킴으로써, 단계 c)에서 형성된 이식 조직편 허용 유도성 세포를 수득하는 단계
를 포함한다.
본 발명에 따르면, γ-IFN으로 자극하는 것이 TAIC를 생성하는데 있어 결정적인 단계를 나타내는 것으로 밝혀졌다(실시예 7 참조).
본 발명과 관련하여 용어 "TAIC"(단구성 기원의 이식 조직편 허용 유도성 세포)는 상기 언급된 방법의 단계 d)로부터 수득되는 세포 집단을 지칭한다. 이러한 세포 집단은 본 발명에 따라서 유효한, 단구로부터 유래된 세포 다음으로 림프구(실시예 11 참조) 뿐만 아니라 연막(buffy coat)으로부터 유래된 임의의 추가 세포를, 예를 들어, 과립구로서 포함하기도 한다. TAIC-집단 내의 단구로부터 유래된 세포의 양은 총 세포 수를 기준으로 하여 바람직하게는 50 내지 90%, 보다 바람직하게는 60 내지 70%이다.
본 발명과 관련하여 용어 "총 세포 수"는 고려 중인 세포 집단 내의 생명 유지에 필요한 세포의 양을 지칭한다. 이러한 양은 "트립판 블루 염료 배제 기술"에 의해 결정할 수 있는데, 이는 상기 염료가 광학적 수단에 의해 생명 유지에 필요한 세포를 생명 유지에 필요하지 않은 세포와 구별할 수 있게 해주기 때문이다.
본 발명에 따르는 TAIC는 이식 조직편 허용을 유도하기 위해, 통상적으로 104 내지 106개 세포/체중 kg, 바람직하게는 105개 세포/체중 kg의 양으로 사용될 수 있다. TAIC 투여는 반복해서 수행할 수 있는데, MHC 상이성이 큰 경우에는 대략 10일 간격으로 바람직하게는 3회 투여할 수 있으며, 이때 세포를 이식 전 또는 후에 투여할 수 있다(하기 참조). 이러한 목적을 위해 필요한 세포의 총 수는 채혈한 후 6 내지 8일 이내에 공급될 수 있다.
본 발명에 따르는 세포(TAIC)는 동물 시험과 배양물 모두에서 악성 종양 형성과 관련한 위험이 전혀 없는 것으로 입증되었으며; 이는 본 발명에 따르는 세포가 유래하는 본래의 단구 세포 특성상 기타 어떠한 방식으로든 전혀 예상하지 못한 결과이다.
다음에 설명되는 바와 같이, 본 발명에 따르는 최적의 유효성을 지닌 추가의 세포 아집단은 단구로부터 유래되는 TAIC에 존재하는 세포 분획으로부터 분리시킬 수 있다.
본래의 세포(단구)를 시험관내 배양하고 이를 γ-인터페론으로 자극하면, 하이브리도마 세포주 DSM ACC2542에 의해 발현되는 모노클로널 항체 GM-7과 결합하는 세포 아집단(실시예 9 참조)을 포함하는 TAIC가 형성된다. 이러한 모노클로널 항체 GM-7은 면역글로불린 이소형 IgG2a의 항체(이의 경쇄는 카파-이소형을 나타낸다)이다. 이러한 항체의 특징적인 성질은, 항체가 본 발명에 따르는 배양 조건에 의해 변형된 단구와 결합하는 엄격한 능력에 있는데, 이는 본래의 단구 세포는 인식되지 않기 때문, 즉 상기 항체가 본래의 세포와는 결합하지 않기 때문이다(실시예 9 참조). 또한, 20명의 자원자를 대상으로 한 실험에서는, GM-7이 말초혈 중의 사람 세포와 결합하지 않는 것으로 입증되었다(도 10 참조).
상기 항체는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여, 사람 단구로부터 유래된 TAIC를 사용하여 마우스를 면역시킴으로써 제조하였다[참조: Davis, W.C. "Methods in Molecular Biology: Monoclonal Antibody Protocols", New York: Humana Press Inc. Totowa, 1995]. 이어서, 상기 마우스로부터의 골수종 세포와 상기 항체를 생성하는 B 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마 세포주를 생성시켰다. 이러한 세포주를 생성시키는데 사용된 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Davis, W.C. "Methods in Molecular Biology: Monoclonal Antibody Protocols", New York: Humana Press Inc. Totowa, 1995; Kohler, G., Milstein, C. "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity", Nature 256, 495-497 (1975)]. 항체 GM-7을 생산하는 하이브리도마 세포주는 부다페스트 조약 규칙에 따라서 수탁번호 DSM ACC2542로 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultur GmbH, Braunschweig, Germany)에 기탁되었다.
도 1은 본 발명에 따르는 시험관내 변형 후, 단구성 세포에 대한 GM-7의 결합 능력을 유동 세포계수법으로 결정하여 도시한 것이다. 연막으로부터 직접적으로 수득된 CD14-양성 단구는 항체 GM-7과 결합하지 않는다는 것을 알 수 있다(흐린 음영 회색은 비-음영 항체 대조군과 합치된다). 이와는 대조적으로, M-CSF의 존재 하에 배양하고 γ-IFN으로 자극한 후에는, 단구 일부가 모노클로널 항체 GM-7에 의해 인식되는 항원을 발현한다. 모노클로널 항체 GM-7은 이소형 κ-IgG2a로서 특징지워진다. 본 발명에 따르는 방법은 결과적으로, 변형된 단구의 세포막 상에서의 항원 발현의 표현형 패턴 상의 변화를 유발시킨다(도 1).
모노클로널 항체 GM-7은 본 발명에 따르는 방법에 의해 생성된 세포들 중에서 가장 효과적인 이식 조직편 허용을 유도시키는 세포 집단과 특이적으로 결합한다(도 9 참조).
따라서, 본 발명의 바람직한 양태는 항체 GM-7과 결합할 수 있는 TAIC에 관한 것이다. 이들 세포는 TAICGM7로서 후술된다.
따라서, 본 발명에 따르는 항체 GM-7은 이식 조직편 허용을 유도하는 세포(TAIC)를 선별 및 정제하는데 월등히 유효하고 조작이 용이한 제제를 나타낸다. 이러한 항체를 사용함으로써, 본 발명에 따라서 균질하고도 고도로 유효한 TAIC 집단을 생성시키는 것이 가능하다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 항체 GM-7과 결합하는 항원을 발현하는, 상기 언급된 본 발명의 방법의 단계 c)에서 형성된 이식 조직편 허용 유도성 세포는 단계 c) 후에 배양 배지로부터 직접적으로 선별할 수 있거나, 또는 하이브리도마 세포주 DSM ACC2542에 의해 생산된 항체 GM-7에 결합시킴으로써, 상기 언급된 본 발명의 방법의 단계 d)에 따라서 배양 배지로부터 상기 세포를 격리시킨 후에 수득된 세포 집단으로부터 선별할 수 있다.
본 발명에 따르는 TAIC를 선별하기 위해, 상기 항체가 샘플 중에 존재하는 이식 조직편 허용 유도성 세포와 결합할 수 있게 해주는 조건 하에, 상기 항체를 상기 샘플과 접촉시킨다. 이러한 결합 반응으로부터 비롯된 반응 복합체를 연속해서 샘플로부터 격리시킨다. 이를 위해, 항체를 캐리어 물질 상에 고정화시킨 후에 샘플과 접촉시킬 수 있는데; 예를 들어, 이를 크로마토그래피 목적상 적합한 매트릭스 또는 소위 "자기 비드"에 결합시킬 수 있다. 이러한 과정으로 대용량의 샘플로부터 이식 조직편 허용 유도성 세포를 선별 및 농축시킬 수 있다.
이식 조직편 허용 유도성 세포를 수득하기 위해, 샘플로부터 반응 복합체를 분리시킨 후에 항체와 이식 조직편 허용 유도성 세포 간의 결합을 격리시킨다. 이는 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 경쟁 치환법 또는 염 용액으로의 세척 방법에 의해 수행할 수 있다. 상응하는 방법이, 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Utz U. et al. ("Analysis of the T-cell Receptor repertoire of human T-cell leukemia virus type-1 (HTLV-1) Tax-specific CD8+ Cytotoxic T Lymphocytes from patients with HTLV-1 associated disease: Evidence for the oligoclonal expansion" J. of Virology Feb. 1996, 843-851].
더우기, 모노클로널 항체 GM-7은 환자의 시험관내 혈액 및/또는 조직 샘플 중에서의 본 발명에 따르는 단구성 기원의 이식 조직편 허용 유도성 세포의 정성적 및 정량적 탐지를 가능케 한다. 상기 환자는, 예를 들어, 이식하고자 하는 기관 또는 이미 이식된 기관의 수용자일 수 있다. 이식 조직편 허용 유도성 세포의 존재 여부와, 적용 가능한 경우에는 이의 양을 지시해주는, 샘플 중의 반응 복합체의 형성은 공지된 방법으로 탐지한다.
반응 복합체를 탐지하기 위해, 항체 GM-7을, 예를 들어, 이러한 항체와 공유적으로 결합하는 탐지 가능한 분자와 직접적으로 커플링("표지")시키는 것이 가능하다. 탐지 가능한 적합한 분자의 상당 수가 분자 진단학 분야에 보고되었으며, 이의 예에는 형광성 염료, 예를 들면, 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 테트라메틸 로다민-5-이소티오시아네이트, 발광성 염료, 방사성 표지된 분자 및 효소, 예를 들면, 퍼옥시다제가 포함된다[참조: Lottspeich, F., Zorbas, H. "Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin, 1998].
항체 탐지는 이러한 항체를 표지시키기 위해 선택된 분자에 따라서 이루어진다. 본 발명과 관련하여, 항체 GM-7을 형광성 분자 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)와 커플링시켜, 항체의 탐지가 유동 세포계수법 및/또는 형광 현미경검사를 통하여 수행될 수 있도록 한다. 항체를 FITC로 표지시키는 방법은 당업자들에게 공지되어 있다.
또 다른 한편, 반응 복합체는 2차 항체를 사용하는 2-단계 공정으로 탐지할 수 있다. 이와 관련하여, 표지되지 않은 항체 GM-7을 추가의 표지된 항체와의 반응 복합체에서 탐지할 수 있다[참조: Lottspeich, F., Zorbas, H. "Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin, 1998]. 이러한 2-단계 탐지 방법은 본 발명에 따르는 항체의 결합을 직접적으로 탐지하는 것 보다 상당히 더 민감한데, 이는 여러 차례 표지된 2차 항체가 하나의 GM-7 항체에 결합될 수 있기 때문이다(시그널 증폭).
항체 GM-7은 결과적으로, TAIC로 처리된 환자의 말초혈 중에서의 TAIC의 탐지를, 예를 들어, "모니터링" 형태로 가능케 하는데, 이 동안에 말초혈 중의 세포 수는 특정 시간 간격으로 결정된다. 공여자의 단구로부터 생성된 TAIC가 존재한다는 것은 이식 조직편 수용자의 말초혈 중에서의 동물 시험에서, 이식된 기관의 관용과 상관이 있다는 사실이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 이러한 발견으로 인해 결과적으로, 임상의는 순차적으로 임의로 투여하는 면역억제제의 투여량을 감소시키거나 면역억제제 투여를 없앨 수 있다. 기존에는, 환자의 면역계가 이식 후 소정의 시점에서 관용을 나타내었는지에 관한 정확한 증거를 제공하는 것이 임상적 측면에서는 가능하지 않았었다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 비-사람 척추동물의 단구, 특히 본 발명에 따라서 변형된 영장류 및 돼지의 단구로부터 유래된 TAIC에 대항한 모노클로널 항체를 제조하는 것이 가능하다. 이와 관련하여, 상응하는 숙주 동물을 면역시키고 상응하는 하이브리도마 세포주를 생성시키는 것은 사람 기원의 TAIC에 대해 상기 언급된 바와 같이 수행한다. 기타 종으로부터 유효한 TAIC 집단을 생성시키는 것은 이종 이식 의학 분야에 있어 중요한 공헌을 한다.
특히 바람직한 본 발명의 양태는 항원 CD3과 CD14를 세포 표면 상에 동시 발현하는, 본 발명의 TAIC 아집단에 관한 것이다. 이들 세포는 TAICCD3+/CD14+로서 후술된다. 상기 세포는 지금까지 당해 기술 분야에 보고된 바가 없었다. 단구 및 단구로부터 유래된 공지된 세포는 표면 마커 CD14를 수반하지만, 이들이 동시에 표면 마커 CD3을 부가적으로 수반하지는 않는다.
표면 항원 CD3과 CD14를 동시 발현하는 TAIC는 상기 언급된 본 발명의 방법의 단계 c)에서 형성된 이식 조직편 허용 유도성 세포로부터 직접적으로 선별할 수 있거나, 이들은 상기 언급된 본 발명의 방법의 단계 d)에 따라서 배양 배지로부터 세포를 격리시킨 후에 수득된 세포 집단으로부터 선별할 수 있거나, 또는 TAICGM7 집단으로부터 선별할 수 있다.
추가로, TAICCD3+/CD14+가 유전자 Foxp3, CTLA4 및 인테그린 αEβ7를 강력하게 발현한다는 사실이 본 발명에 따라서 밝혀졌다(실시예 12 참조). 이와는 대조적으로, 이들 유전자는 본래의 단구에 의해 전혀 발현되지 않거나 적은 수준으로만 발현된다. 따라서, 유전자 Foxp3, CTLA4 및 인테그린 αEβ7의 발현을 상향 조절하는 것이 TAICCD3+/CD14+-세포의 특징이다.
실시예 12에 논의되는 바와 같이, 마커 Foxp3, CTLA4 및 인테그린 αEβ7의 발현은 기존에 조절성 T-림프구에 대해서만 보고되었다. 표면 항원 CD4와 CD25를 동시 발현하는 T-림프구는 조절성 T-림프구의 아집단이고, 이는 또한 "억제인자 세포"로서 지시되기도 한다. 이들의 기능은 신체의 면역 반응을 억제하는 것이다. 특히, Foxp3은 조절성 T-세포의 발생에 대한 제어 유전자로서 작용하고 이들 세포에 의해 특이적으로 발현되는 특이적 전사 인자로서 여겨진다. 본 발명에 따르면, TAICCD3+/CD14+-세포가 총 RNA 1㎍당 1 x 10-9㎍ 이상, 보다 바람직하게는 5 x 10 -9㎍ 이상의 Foxp3-RNA를 발현하고, 특히 바람직한 방식으로는 1 x 10-8㎍ 이상의 Foxp3-RNA를 발현한다.
CTLA4는 T-림프구, 특히 CD4/CD25 양성 T-림프구의 조절 기능을 탐지하기 위한 마커로서 유사하게 관찰된다(실시예 12에 인용된 문헌 참조). 본 발명에 따르면, TAICCD3+/CD14+-세포는 총 RNA 1㎍당 바람직하게는 5 x 10-7㎍ 이상, 보다 바람직하게는 3 x 10-6㎍ 이상의 CTLA4-RNA를 발현하고, 특히 바람직한 방식으로는 5 x 10-6㎍ 이상의 CTLA4-RNA를 발현한다.
상피성 카드헤린(Cadherin)을 인식하는 인테그린 αEβ7은 최근에, 상피성 환경과 상호 작용하는 고도로 강력한 조절성 T-림프구의 아집단에 대한 신규한 마커로서 보고되었다[참조: Lehmann et al. in PNAS 99, pages 13031-13036 (2002)]. TAICCD3+/CD14+-세포에서의 인테그린 αEβ7-RNA의 발현 양은 본 발명에 따라서, 총 RNA 1㎍당 바람직하게는 1 x 10-12㎍ 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-11㎍ 이상이어야 하고, 특히 바람직한 방식으로는 1 x 10-10㎍ 이상, 가장 바람직하게는 1 x 10-9㎍ 이상이어야 한다.
실시예 12의 표에 제시된 바와 같이, 본 발명의 TAIC를 림프구와 함께 직접적으로 동시 배양하면, 강력하게 상향 조절된 유전자 Foxp3, CTLA4 및 인테그린 αEβ7 발현을 나타내는 조절성 T-림프구의 수, 특히 림프구 집단 내의 CD4/CD24 이중-양성 세포 수가 현격하게 증가된다. 상기 실시예는 이러한 효과가 TAIC를 림프구와 함께 간접적으로 동시 배양한 경우에는 관찰되지 않는다는 사실을 추가로 입증해준다.
이들 결과는 TAIC에 의한 조절성 T-림프구의 형성 및/또는 증식의 자극이 본 발명의 TAIC에 의한 이식 조직편 허용 유도와 관련이 있다는 것을 지시해준다.
실시예 13은 이러한 가설을 확인시켜 준다. 이 실시예에서는, 실시예 3, 4, 5, 6 및 7의 수용자 동물로부터의 림프구를 시험관 내에서 각각의 공여자 동물로부터의 TAIC와 함께 항온 배양하였다. 관용을 유도하기 위해, 상기 수용자로부터의 림프구와 함께 예비-항온 배양시킨 TAIC를 TAIC 대신 동물에게 주사하였다. 공여자 특이적 관용이 이러한 방식으로 또한 유도될 수 있었지만, 공여자 유래된 TAIC와 함께 동시 배양되지 않은 수용자 림프구가 투여된 동물은 관용을 발생시키지 못하였다.
본 발명의 TAIC 자체를 약제학적 제제로서 사용할 수 있다. 상기 언급된 바와 같은 본 발명의 방법의 단계 d)로부터 수득된 세포를 직접 사용할 수 있다. 이로써 수득된 집단 총 세포수의 약 10 내지 50%가 초기 단구 분리물(연막)으로부터 유래하는 림프구 및 과립구에 의해 형성된다. 이들 세포는 배양 단계시 단구로부터 유래된 본 발명의 TAIC의 형성을 지지해주며(실시예 11 참조); 이들은 본 발명의 TAIC가 약제학적 제제로서 사용된 경우에도 관용 유도를 방해하지 않는다.
그러나, 본 발명의 추가의 바람직한 양태에 따르면, 아집단 TAICGM7 및/또는 TAICCD3+/CD14+는 본 발명의 방법(상기 참조)으로부터 수득된 TAIC 집단 전체로부터 분리할 수 있고 이를 관용 유도에 사용할 수 있다.
배양 배지(실시예 2 참조)에서는, TAIC 또는 TAICGM7 및/또는 TAICCD3+/CD14+를 이들의 관용 유도성 효과가 상실되지 않게 하면서 48시간 이상 동안 유지시킬 수 있다.
약제학적 제제로서 사용하기 위해서는, 예를 들어, 사람 AB 혈청(보편적으로 사용하기 적합함) 중에 현탁시킨 TAIC 또는 아집단 TAICGM7 및/또는 TAICCD3+/CD14+ 를 단 이입(short transfusion)으로서 정맥내 투여할 수 있다. 동종 이식의 경우에 이식 조직편 허용을 유도하기 위해, 공여자의 단구로부터 발생된 TAIC 또는 아집단 TAICGM7 및/또는 TAICCD3+/CD14+를 MHC-상이한 수용자에게 수술전 또는 수술후에 주사할 수 있다. 수술전에 투여하는 경우에는, TAIC를 수술하기 대략 1주 전에 1 내지 3회 주사해야 한다. 수술후에 투여하는 경우에는, 수술 시기와 세포 단일 투여 시기 사이의 기간이 7일 보다 길어서는 안된다. 이때 본 발명에 따르는 TAIC 또는 아집단 TAICGM7 및/또는 TAICCD3+/CD14+는 이식 조직편에 대항한 수용자 면역계의 T-세포 반응에 저항할 수 있으며, 장기간 이식 조직편 허용을 보장하기에 충분히 긴 시간 동안 수용자 혈액 내에 유지될 수 있다.
수술전 정맥내 주사는 살아있는 개체로부터의 기증과 관련하여 고려될 수 있지만; 사체 기증(시체로부터의 혈액 및 기관)이 논쟁이 되는 경우에는, 본 발명에 따르는 TAIC 또는 아집단 TAICGM7 및/또는 TAICCD3+/CD14+를 수술후 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 사체 기증의 경우에는, 기관 보존을 위해 주동맥을 관형성시킴으로써, 공여자의 신체를 관류 매질로 플러싱한다. 이러한 경우, 대정맥을 통하여 정맥혈을 통상 흡인 배출시킨 다음, 경사 제거한다. 본 발명에 따라서 사용될 TAIC를 수득하기 위해, 이러한 정맥혈을 수집하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 처리할 수 있다. 사체 기증의 경우 또 다른 대안에서는, TAIC를 공여자 비장으로부터의 세포(림프구 및 단구)로부터 수득할 수도 있다.
사체 기증과 연계하여 본 발명에 따르는 TAIC를 수술후 적용하는 경우에는, 이식 시기와 공여자 혈액으로부터 수득된 TAIC의 공급 시기 사이에 일어나는 기관의 급성 거부 반응을 방지하기 위해, 본 발명의 TAIC를 면역억제제와 조합 투여함으로써 이식 시기와 세포 적용 시기 사이 간격을 극복할 수 있다. 이와 관련해서, 통상적인 면역억제제, 예를 들면, 칼시뉴린(calcineurin) 억제제, 예를 들어, 사이클로스포린 A(CSA) 또는 타크롤리무스, 또는 아자티오프린(AZA), 미코페놀레이트 모페틸, 라파마이신, 모노클로널 항체(ATG, ALG; 단, 디클리지우맙 또는 바실릭시맙은 제외된다) 또는 스테로이드(STE)와의 치료학적 조합물을 고려할 수 있다. 수용자 혈액 내에 면역억제제(공지된 IL-2-수용체-α 모노클로널 항체, 예를 들면, 디클리지우맙 및 바실릭시맙은 제외된다)가 존재하는 것이 한편으론 면역억제제의 효능, 다른 한편으론 TAIC의 효능에 불리한 영향을 전혀 미치지 않는다.
이러한 관점에서, 본 발명에 따라서 변형시킨 단구성 기원의 세포를 어떠한 세포성 이식 조직편(예를 들면, 도세포, 간 세포, 완전히 성장한 줄기 세포, 및 기타 모든 프로그램된 세포 유형 또는 조직 유형) 및 기관(예를 들면, 신장, 간, 심장)에 대한 "관용 전이를 위한 비히클"로서도 사용할 수 있는데, 단 이들 세포는 이식하고자 하는 세포(기관)와 유전적으로 동일해야만 하는데, 즉 이들 세포는 공여자 자신으로부터 유래되거나 또는 이의 동일한 쌍생아로부터 유래되어야만 한다. TAIC는 이식된 세포/기관이 새로운 환경에 착생하도록 함으로써 장기간 면역억제 요법의 부작용으로 앓고 있는 수용자를 구제하여, 이들의 보호 기능을 충촉시킨다.
본 발명에 따르는 방법에 대한 출발 세포는 혈액 단구이다. 이들은 바람직하게는, 사람 혈액으로부터의 단구이다. 이식 조직편 허용을 유도하기 위해서는, 세포가 이식 조직편의 공여자(또는 자신과 동일한 쌍생아)로부터 유래되어야만 한다. 예를 들어, 원숭이 또는 돼지 기관을 사람에게 이종 이식하는 경우에는, 본 발명에 따르는 TAIC가 결과적으로 해당 공여자 동물의 단구로부터 유래되어야만 한다.
이러한 단구를 수득하기 위해, 혈액을 먼저, 항응고제로 표준 처리한 후에, 당해 분야에 공지된 방법, 바람직하게는 원심분리시킴으로써 혈장과 백혈구 및 적혈구로 분리시킬 수 있다. 원심분리 후, 혈장이 상등액에 존재할 것이며; 이 아래에는 백혈구를 온전히 함유하는 층이 놓여 있다. 이러한 층은 연막으로서 지칭되기도 한다. 이 아래에는 적혈구를 함유하는 상이 놓여 있다(헤마토크리트: hematocrit).
본 발명에 따르는 방법과 관련해서 언급하면, 상기 연막 층을 먼저, 예를 들어, 공지된 방법에 따라서 원심분리시킴으로써 분리 및 격리시켜 단구를 수득한다. 바람직한 방법 양태에 따르면, 상기 연막 층을 림프구 분리용 배지(예: Ficoll Hypaque) 상으로 피복시킨 다음, 원심분리시킨다(실시예 1 참조). 실시예 1에는 연막 내에 여전히 함유되어 있는 적혈구와 사멸 세포를 원심분리시킴으로써 격리시키고, 단구를 포함한 백혈구가 상기 분리용 배지 상에 분리물로서 존재하는 본 발명의 바람직한 양태가 기재되어 있다. 그 후, 단구의 백 상(white phase)을 조심스럽게 피펫 제거하고, 분리물 내의 단구를 증강시키기 위해, 반복적으로 원심분리시킨 다음 세척한다. 이러한 과정 동안, 단구는 림프구 일부와 함께 원심분리용 용기 바닥에 모아질 것이다.
본 발명의 방법의 특히 바람직한 양태에 따르면, 단구 함유 분리물을 수득하기 위한 조건은 분리물이 세포 총 수를 기준으로 하여 단구 다음으로 림프구를 약 10 내지 50% 함유하도록 제어된다. 바람직하게는, 상기 분리물이 세포 총 계수를 기준으로 하여 각각 단구 약 50 내지 90%, 특히 바람직하게는 60 내지 70%와, 림프구 약 10 내지 50%, 특히 바람직하게는 20 내지 50%를 함유하는데, 나머지는 과립구에 의해 임의로 제공될 것이다.
실시예 11에 제시된 바와 같이, 본래의 단구를 M-CSF 및 γ-인터페론과 함께 배양하는 동안, 세포 총 계수를 기준으로 하여 림프구가 20 내지 30% 정도로 존재하게 되면, 상당히 다량의 CD3/CD14-이중 양성 TAIC가 생성될 것인데, 이는 단지 적은 양의 림프구(약 5%) 만이 존재하는 경우에도 마찬가지일 것이다.
충분한 양의 TAIC를 생성하기 위해서는, 먼저 단구를 증식시키는 것이 필요하다. 이를 위해, 단구에 적합한 성장 배지를 사용할 수 있지만, 이러한 배지는 성장 인자 M-CSF(대식 세포-콜로니-자극 인자)를 함유해야만 한다. M-CSF(CSF-1로 지칭되기도 함)은 단구, 섬유아세포, 림프구 및 내피 세포에 의해 생성된다. 배양 배지 중의 M-CSF의 농도는 배지 1리터당 바람직하게는 2 내지 20㎍, 보다 바람직하게는 4 내지 6㎍, 특히 바람직하게는 5㎍일 수 있다.
연속해서 또는 동시에, 상기 세포를 γ-IFN으로 자극해야만 하는데, 즉 γ-IFN의 존재 하에 배양해야만 한다. 단구를 γ-IFN으로 자극하는 것은 이러한 성장 인자를 함유하는 배양 배지에서 3 내지 6일 동안 지속되는 초기 증식 상 이후에 일어난다. 바람직하게는, 배양을 개시한 후 4일째에 γ-IFN 자극을 수행하고, 이러한 자극을 항온 배양기 조건하, 즉 37℃ 및 5% CO2 대기 하에, 바람직하게는 24 내지 72시간, 보다 바람직하게는 48시간 동안 연장한다.
배지 중의 γ-IFN의 농도는 0.1 내지 20ng/ml, 바람직하게는 1 내지 10ng/ml, 특히 바람직하게는 5ng/ml일 수 있다.
γ-IFN으로의 자극은 성장 인자를 함유하는 배지에서 단구의 증식과 동시에 시작할 수 있다. 그러나, 상기 언급된 바와 같이 초기 증식 상을 3 내지 6일 동안 지속시킨 후에 자극하는 것이 바람직하다. 세포의 증식과 γ-IFN으로의 자극은 전반적으로, 8일을 초과하여 일어나지 않는 것이 바람직하다. 어떠한 경우든, γ-IFN으로의 처리는 증식 상 후에 24시간 이상, 최대 72 시간, 바람직하게는 48시간 동안 지속되도록 수행해야 한다. 세포를 증식 및 자극하기 위한 기간은 결과적으로, 바람직하게 총 4 내지 8일간 지속되어야 한다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 증식 및 γ-인터페론으로의 자극은 실시예 2에 지시된 바와 같이, 성장 인자를 함유하는 배양 배지에서 단구를 먼저 증식시킨 후, 0.1 내지 20ng/ml, 바람직하게는 1 내지 10ng/ml, 특히 바람직하게는 5ng/ml의 농도가 배지 중에서 수득되는 양으로 γ-IFN를 3 내지 6일 후에 배양 배지에 가하는 방식으로 수행한다.
바람직하게는, 본 발명에 따르는 방법을, 이의 표면을 태아 송아지 혈청(FCS) 또는 사람 AB 혈청으로 미리 피복시킨 바 있는 배양 용기에서 수행한다(실시예 2 참조). FCS로 피복시키는 것은, 사용 전에 배양 용기의 표면을 FCS로 덮은 다음, 수 시간의 상호작용 기간, 특히 4 내지 72시간, 바람직하게는 12 내지 48시간, 특히 24시간 후에, 표면에 부착되지 않은 FCS를 적당한 방식으로 제거함으로써 수행할 수 있다.
배양 단계 동안, 세포는 약 24시간 후에 배양 용기 바닥에 침강될 것이다. 이때 이들의 부착 특성으로 인해, 단구 및 해당 공정 동안 단구로부터 유래된 TAIC는 각각의 배양 용기 바닥에 부착될 것이다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, 배양 동안 배양 배지를 변화시킬 경우에는, 상등액을, 예를 들어, 피펫 제거하거나 경사 제거함으로써 초기에 조심스럽게 제거한 다음, 신선한 배양 배지를 이에 채워 넣는다. 그러나, 바람직하게는 바닥에 부착되는 세포는 세척되지 않거나 단지 조심스럽게 세척되기 때문에, 존재하는 어떠한 림프구도 제거하지 못한다.
부착되는 세포를 떨어지게 하는 것은, 예를 들어, 미세한 세포 스크래퍼 또는 압설자를 사용하여 기계적으로 수행할 수 있다.
그러나, 본 발명에 따르는 방법의 바람직한 양태에 따르면, 세포를 완전히 떨어지게 하는 것은 적합한 효소, 예를 들면, 트립신으로 처리함으로써 수행된다(실시예 2 참조). 이러한 트립신 용액(0.1 내지 0.025g/l, 바람직하게는 0.05g/l)은 5% CO2의 존재 하의 35 내지 39℃, 바람직하게는 37℃에서 2 내지 10분 동안 세포 상에 대해 작용하도록 할 수 있다.
이어서, 효소 활성을 통상의 방법으로 차단시키고, 지금 자유로이 부유하는 TAIC를 원심분리에 의한 통상의 방식으로 수득할 수 있다. 이때 이들은 적합한 배지(예: PBS) 중의 임의의 현탁액으로, 즉시 사용에 이용 가능한다. 그러나, 이들을 영양 배지에서 수 일, 특히 대략 2 내지 3일 동안 유지시킬 수도 있으며(실시예 2 참조); 이러한 보존용 배지는 성장 인자나 γ-IFN를 전혀 함유하지 말아야 한다. 세포를 TAIC와 같은 영양 배지에서 48시간 이상 동안 유지시킬 수 있다.
보다 장기간에 걸쳐 저장하기 위해, 세포를 급속 동결시킬 수 있다. 살아 있는 세포를 급속 동결시키는 프로토콜은 당해 기술 분야에 공지되어 있다[참조: Griffith M., et al. ("Epithelial Cell Culture, Cornea", in Methods of tissue engineering, Atala A. and Lanza R.P., Academic Press 2002, Chapter 4, pages 131-140]. 본 발명에 따르는 세포를 급속 동결시키는데 바람직한 현탁 배지는 FCS 함유 DMSO이다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 단계 c) 또는 d)로부터 수득된 이식 조직편 허용 유도성 세포를 함유하는 세포 현탁액을, 아집단 TAICGM7를 수득하도록 항체 GM-7과 결합하는 세포에 대해 추가로 정제할 수 있다. 이러한 정제 방법은 상기에 상세히 언급되어 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에 따르면, 상기 세포는 세포 표면 상에 항원 CD3과 CD14를 동시 발현하는 TAIC 집단으로부터 선별한다. 이러한 세포의 선별 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 방법의 예는 "형광-활성화 세포 분류법"(FACS), "면역 자기 비드 분류법" 및 "자기 활성화 세포 분류법"(MACS), 또는 소위 "로제팅 방법(Rosetting Method)"이다[참조: Gmelig-Meyling, F. et al. "Simplified procedure for the separation of human T- and non-T-cells", Vox Sang. 33: 5-8 (1977)].
TAIC 아집단 TAICCD3+/CD14+의 선별은 상기 언급된 본 발명의 방법의 단계 c) 또는 d)로부터 수득된 TAIC 집단, 또는 TAICGM7-아집단으로부터 직접적으로 수행될 수 있다. 후자 방식은 TAICCD3+/CD14+의 순차적 증강이 일어나게 할 방법을 진행시키는 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에서는, 본 발명에 따르는 TAIC 자체가, 이식 조직편 거부 반응을 생체내 억제시키기 위한 약제학적 조성물을 제조하는데 사용된다.
이러한 약제학적 제제는 바람직하게는 약 1 x 105 내지 1 x 107개 세포/제제 ml, 보다 바람직하게는 약 1 x 106개 세포/제제 ml의 양으로 약제학적으로 허용되는 담체 중에 현탁된, 본 발명의 방법의 단계 d)로부터 수득되는 본 발명에 따르는 생명 유지에 필요한 TAIC를 함유할 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서는, 본 발명에 따르는 TAICGM7 아집단 세포 자체가 이식 조직편 거부 반응을 생체내 억제시키기 위한 약제학적 조성물을 제조하는데 사용된다.
이러한 약제학적 제제는 바람직하게는 약 1 x 106 내지 1 x 108개 세포/제제 ml, 보다 바람직하게는 약 1 x 106개 세포/제제 ml의 양으로 약제학적으로 허용되는 액상 담체 중에 현탁된, 항체 GM-7과 결합하는 본 발명에 따르는 생명 유지에 필요한 TAICGM7 세포를 함유할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서는, 본 발명에 따르는 TAICCD3+/CD14+ 아집단 세포 자체가 이식 조직편 거부 반응을 생체내 억제시키기 위한 약제학적 조성물을 제조하는데 사용된다.
이러한 약제학적 제제는 바람직하게는 약 5 x 105 내지 5 x 107개 세포/제제 ml, 보다 바람직하게는 약 5 x 106개 세포/제제 ml의 양으로, 항원 CD3과 CD14를 동시 발현하는 본 발명에 따르는 생명 유지에 필요한 TAICCD3+/CD14+ 세포를 함유할 수 있다.
상기 언급된 약제학적 제제는 생리학적으로 널리 관용되는 배지에 현탁된 본 발명에 따르는 세포를 함유할 수 있다. 적합한 배지는, 예를 들어, 링거 용액, 생리 식염수 또는 5 내지 20% 사람 알부민 용액 등이다.
본 발명에 따르는 세포 제제는 본 발명의 방법의 단계 d)로부터 수득되는 생명 유지에 필요한 TAIC를 함유할 수 있다. 또 다른 한편, 상기 제제는 항체 GM-7과 결합하는 아집단 TAICGM7 세포, 또는 항원 CD3과 CD14를 세포 표면 상에 동시 발현하는 아집단 TAICCD3+/CD14+ 세포에 속하는 세포를 함유할 수 있다. 상기 제제는 액상 담체 배지에 현탁된 각각의 세포를 바람직하게는 1 x 105개 이상 세포/ml, 보다 바람직하게는 5 x 105개 이상 세포/ml, 가장 바람직하게는 1 x 106개 이상 세포/ml의 양으로 함유할 수 있다. 배지는 세포에 의해 널리 관용되는 세포 배양물 또는 수송 배지, 예를 들면, 5 내지 20% 사람 알부민 용액일 수 있다. 또 다른 한편, 상기 제제 내의 세포를 급속 동결시킬 수 있고, 이는 적합한 저장 배지, 예를 들면, 50% 사람 알부민 용액과 10% DMSO를 수반한 RPMI 내에 함유될 수 있다.
최종적으로, 본 발명은 또한, 본 발명의 이식 조직편-허용 유도성 세포(TAIC, TAICGM7 또는 TAICCD3+/CD14+)를 시험관 내에서 조절성 T-림프구를 생성 또는 확장시키기 위해 사용하는 방법에 관한 것이다. 실시예 12에 제시된 바와 같이, TAIC를 림프구와 함께 시험관 내에서 직접적으로 동시 배양하면, 조절성 T-림프구, 특히 CD4+/CD25+ 림프구가 상당히 증식된다[참조: Wood and Sakaguchi: "Regulatory Cells in Transplantation Tolerance", Nature Review Immunology 3, 199-210 (2003)]. 따라서, 실시예 12에 기재된 바와 같이 TAIC를 림프구와 함께 직접적으로 동시 배양함으로써 조절성 T-림프구, 특히 CD4+/CD25+ 림프구를 생성 및/또는 확장시킬 수 있다.
TAIC와 림프구를 동일한 배지 내에서 직접적으로 물리적 접촉시켜 동시 배양하는, 본 발명에 따르는 직접적인 시험관내 배양 방법이 실시예 12에 예시되어 있다.
이러한 방법에서는, 상기 배지가 바람직하게는 각각의 세포, 즉 TAIC와 림프구를 대략 등가 세포수로 함유하고, 각각 바람직하게는 1 x 105개 이상 세포/ml, 보다 바람직하게는 5 x 105개 이상 세포/ml, 가장 바람직하게는 1 x 106개 이상 세포/ml의 양으로 액상 담체 배지 중에 현탁되고; 상기 배지는 세포에 의해 널리 관용되는 세포 배양물 또는 수송 배지, 예를 들면, 5 내지 20% 사람 알부민 용액일 수 있다. 동시 배양은 바람직하게는, 약 37℃ 하에, 예를 들어, 항온 배양기 내에서, 바람직하게는 약 3 내지 5일, 보다 바람직하게는 4일 동안 생리적 조건 하에 수행해야 한다.
실시예 13에 제시된 바와 같이, 이식 조직편 허용은 공여자 단구로부터 발생된 TAIC를 수용자에게 투여함으로써 유도시킬 수 있을 뿐만 아니라 상기 언급된 바와 같이 공여자 단구로부터 생성된 TAIC와 함께 시험관 내에서 미리 직접적으로 동시 배양시킨 수용자 림프구를 수용자에게 재투여함으로써 유도시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가 양태에 따르면, 수용자로부터의 림프구를 해당 이식 조직편의 공여자로부터 유래하는 TAIC와 함께 직접적으로 동시 배양함으로써, 조절성 T-림프구를 이식 조직편의 수용자로부터 유래하는 림프구로부터 시험관 내에서 제조할 수 있다. 동시 배양된 림프구를 수용자에게 재투여하면, 실시예 13에 제시된 바와 같이 수용자에 의한 이식 조직편 허용이 유발될 것이다.
이로써 제조된 수용자 유래된 조절성 T-림프구는 본원에 기재된 바와 같이 FACS에 의해 분리할 수 있고(상기 참조) 수용자에게서의 이식 조직편 거부 반응을 방지하기 위한 약제학적 제제에 사용할 수 있는데, 여기서는 상기 세포가 상기 언급된 바와 같이 약제학적으로 허용되는 담체 중에 현탁된다.
본 발명은 다음 실시예를 통하여 추가로 상세하게 예시된다.
본 실시예 내에서 별도로 규정되지 않는 한, 사용된 배지와 물질의 조성은 다음과 같다:
1. 페니실린/스트렙토마이신 용액:
생리적 염화나트륨 용액(NaCl 0.85%) 1ml당 페니실린 G의 나트륨 염으로서의 페니실린 10,000 단위 및 스트렙토마이신 설페이트로서의 스트렙토마이신 1000㎍(Gibco Catalogue No. 15140122).
2. 트립신-EDTA
0.5g 트립신 및 0.2g EDTA (4 Na)/l
3. RPMI 1640(1x, 액상(11875))은 L-글루타민을 함유한다
RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 배지 1640은 포유류 세포에 광범위하게 사용될 수 있는 증강된 제형이다.
성분 분자량 농도(mg/l) 몰 농도(nM)
무기 염
질산칼슘(Ca(NO3)24H2O) 236 100.00 0.424
염화칼륨(KCl) 75 400.00 5.30
황산마그네슘(MgSO4) 120 48.84 0.407
염화나트륨(NaCl) 58 6000.00 103.44
중탄산나트륨(NaHCO3) 84 2000.00 23.800
인산나트륨(Na2HPO4) 142 800.00 5.63
추가 성분
글루코즈 180 2000.00 11.10
글루타치온(환원) 307 1.50 0.0032
페놀 레드 398 5.00 0.0125
아미노산
L-아르기닌 174 200.00 1.10
L-아스파라긴 132 50.00 0.379
L-아스파라긴산 133 20.00 0.150
L-시스테인 디하이드로클로라이드 313 65.00 0.206
L-글루탐산 147 20.00 0.136
L-글루타민 146 300.00 2.05
글리신 75 10.00 0.133
L-히스티딘 155 15.00 0.0967
L-하이드록시프롤린 131 20.00 0.153
L-이소루이신 131 50.00 0.382
L-루이신 131 50.00 0.382
L-리신 하이드로클로라이드 146 40.00 0.219
L-메티오닌 149 15.00 0.101
L-페닐알라닌 165 15.00 0.0909
L-프롤린 115 20.00 0.174
L-세린 105 30.00 0.286
L-트레오닌 119 20.00 0.168
L-트립토판 204 5.00 0.0245
L-티로신 이나트륨, 이수화물 261 29.00 0.110
L-발린 117 20.00 0.171
비타민
바이오틴 244 0.20 0.008
D-칼슘 판토테네이트 477 0.25 0.0005
염화콜린 140 3.00 0.0214
폴산 441 1.00 0.0022
i-이노시톨 180 35.00 0.194
니아신아미드 122 1.00 0.0081
p-아미노벤조산(PABA) 137 1.00 0.0072
피리독신 HCl 206 1.00 0.0048
리보플라빈 376 0.20 0.0005
티아민 HCl 337 1.00 0.0029
비타민 B12 1355 0.005 0.00000369
[참조: Moore G.E., et al., J.A.M.A. 199: 519 (1967)]
4. PBS (Dulbecco's 인산염 완충 식염수) [참조: J. Exp. Med. 98: 167 (1954)]:
성분 g/l
KCl 0.2
KH2PO4 0.2
NaCl 8.00
Na2PHO4 1.15
5. 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque):
림프구 분리용 배지(삭카로즈/에피클로로하이드린 공중합물 Mg 400,000; 밀도 1.077, 나트륨 디아트리조에이트로 조정됨).
6. L-글루타민
액상: 29.2 mg/ml
7. 대식 세포-콜로니 자극 인자 (M-CSF)
이. 콜라이로부터의 재조합 사람 M-CSF; 단량체(18.5kD)로서, N-말단 메티오닌을 포함한 135개 아미노산 잔사를 함유함; 몰 질량이 37kD인 동종-이량체(homodimer)로서 존재함; (SIGMA 카탈로그 번호 M 6518)
8. γ-인터페론 (γ-IFN)
이. 콜라이로부터의 재조합 사람 γ-IFN; 143개 아미노산 잔사를 함유하는 16.7kD 단백질 (CHEMICON 카탈로그 번호 IF002).
실시예 1
전혈로부터의 단구 분리
혈액 응고를 피하고 세포를 공급하기 위해, 삼중 챔버 봉지 세트 중에서 사람 전혈 450ml를, H2O 1리터당 3.27g의 시트르산, 26.3g의 삼나트륨 시트레이트, 25.5g의 덱스트로즈 및 22.22g 나트륨 디하이드록시 포스페이트를 함유하는 안정화제 용액 63ml와 혼합한다. 이 용액의 pH는 5.6 내지 5.8이다.
이어서, 상기 혼합물을 20℃에서 7분 동안 4000rpm으로 "신속한 원심분리"를 수행하여 혈액 성분을 분리시킨다. 이로써, 소체 성분과 비-소체 성분의 3겹 층배열이 형성된다. 이러한 목적을 위해 제공된 압축기 내에서 상기 봉지 세트를 사용함으로써, 적혈구를 하단 봉지 내로 압착시키고, 혈장은 상단 봉지 내로 압착시키며, 소위 연막은 중간 봉지 내에 유지시키는데, 이는 대략 50ml 용적을 함유한다.
이어서, 신선하게 수득된 연막 50ml의 양을 각 25ml씩 2 분획으로 나눈 다음, 이들 각각을, 사전에 2개의 50ml 팔콘(Falcon) 튜브 내로 도입시킨 25ml의 피콜-하이파크 분리용 배지 상으로 층 형성시킨다.
상기 제제를 30분 동안 2500rpm으로 연속해서(제동없이) 원심분리시킨다. 그 후, 연막에 여전히 존재하는 사멸 세포와 적혈구는 피콜 상 아래에 놓여져 있는 반면, 단구를 포함한 백혈구는 피콜 상에 백색의 분열간기(interphase)로서 분리되었다.
이어서, 단구를 포함한 백색 분열간기를 조심스럽게 피펫팅하여 제거하고, 인산염 완충 생리 식염수(PBS) 10ml와 혼합하였다.
이어서, 상기 제제를 10분 동안 3회 제동을 걸면서 1800rpm으로 원심분리시키고; 각 원심분리 공정 후에 상등액을 피펫팅하여 제거하고, 신선한 PBS를 도입한다.
원심분리용 용기(피콜 튜브) 바닥에 모아진 세포 펠릿은 단핵성 세포 분획, 즉 단구를 함유하였다.
랫트 실험에 필요한 단구를 제조하기 위해, 유전적으로 동일한 공여자 랫트 4마리 각각으로부터 백혈구 25ml를 분리하고, 각각을 피콜-하이파크 분리용 배지 25ml 상으로 층 형성시킨다. 이어서, 상기 언급된 바와 동일한 방식으로 상기 과정을 지속한다. 또 다른 한편, 피콜 상에서의 유사한 분리 단계를 비장 세포 현탁액에 대해서도 적용할 수 있다.
실시예 2
단구의 증식 및 변형
단구를 배양하고 증식시키는 것은 다음 조성의 영양 배지에서 수행하였다:
RPMI 1640 배지 440ml
태아 송아지 혈청(FCS), 또는 AB 혈청 50ml
페니실린/스트렙토마이신 용액 5ml
총 용적 500ml
상기 영양 배지는 2.5㎍/500ml의 M-CSF를 함유한다.
실시예 1에서 분리된 단구를, 상기 영양 배지 10ml 중에서의 총 106개 세포의 양으로 현탁시키고, 페트리 디쉬(petri dish)(직경 100mm) 상으로 옮긴다. 이러한 페트리 디쉬에, 순수한 불활성화 FCS를 미리 채워 놓고, 24시간 후에 FCS를 경사 제거하여, 이러한 방식으로 FCS-피복된 디쉬를 수득하였다.
상기 페트리 디쉬에 적당한 뚜껑을 덮고, 37℃ 하의 항온 배양기에서 3일 동안 유지시켰다. 24시간 후에, 세포는 페트리 디쉬 바닥에 침강하였다. 격일로 상등액을 피펫팅하여 제거하고, 페트리 디쉬에 신선한 영양 배지 10ml를 다시 채워 넣었다.
4일째에는, 10ml 영양 배지 중의 50ng의 γ-인터페론을 가하고, 상기 디쉬를 다시 밀봉한 다음, 37℃ 하의 항온 배양기 내에서 48시간 더 유지시켰다.
이의 후속으로, PBS를 사용하여 각각 1:10으로 희석시킨 트립신 용액 10ml를 피펫팅하여 페트리 디쉬에 도입하였다. 밀봉시킨 페트리 디쉬를 37℃ 하의 항온 배양기에서 10분 동안 놓아 두었다.
그 후, 페트리 디쉬 바닥에 부착되어 있는 세포의 분리는 세포의 대부분(>90%)이 상등액에 부유하도록 하는 방식으로 세포 스크래퍼를 이용하여 수행하였다.
총 상등액(10ml 트립신 용액 + 10ml 배지)을 피펫팅하여 제거하고, 50ml 팔콘 튜브에 합한 다음, 10분 동안 1800rpm으로 원심분리시킨다. 이어서, 상등액을 경사 제거하고, 신선한 영양 배지(상기 참조)를 침전물(나머지 세포 펠릿)에 가하는데, 106개 세포당 1ml의 영양분이 가해진다. 정확한 용량을 결정하기 위한 세포 계수치의 결정은 공지된 방법에 따라서 이루어졌다[참조: Hay R.J., "Cell Quantification and Characterisation" in Methods of Tissue Engineering, Academic Press 2002, Chapter 4, S. 55-84].
이러한 세포 현탁액을 원심분리(1800rpm, 10분, 상기 참조)시키고, 세포 펠릿을 PBS 내로 혼입하거나 또는 사람에게 적용하는 경우에는 NaCl(생리) 내로 혼입한다. 이어서, 직접 또는 48시간 내에 정맥내 투여를 수행할 수 있다.
또 다른 한편으론, 트립신 함유 상등액을 원심분리 및 경사 제거한 후, FCS/DMSO를 동결 배지로서 세포에 가하고, 이들을 10ml의 용적으로 급속 동결시킨다.
동결 배지는 95% FCS와 5% DMSO를 함유하였다. 각 경우에 있어, 대략 106개 세포를 배지 1ml에 혼입하고, 다음 단계로 냉각시킨다:
얼음 상에서 30분;
예비-냉각된 스티로포프(Styropor) 박스에서 -20℃ 하에 2시간;
스티로포르에서 -80℃ 하에 24시간;
-180℃ 하에 액체 질소(N2) 중의 작은 튜브에서 저장.
도 1은 본래의 단구성 세포의 배양 및 γ-IFN 자극 후에 사용된 단구 상에서의 항원 발현 상의 표현형 변화를 유동 세포계수법으로 결정하여 도시한 것이다.
실시예 3
이식 조직편 수용자의 면역계를 필수 조건부 처치하기 위한 이식 조직편 허용 유도성 세포(TAIC)의 용도
이식 전에 잠재적 수용자를 처리하기 위한 TAIC의 용도는, 예를 들어, 기관 공여자와 이러한 공여자 기관을 이식받을 수용자 간의 기관 이식에 앞서 정화시킨 바 있는 임상 생체 기증의 경우에 제공된다.
이러한 경우, 문헌[참조: Ono, K. and Lindsey, E. S. "Improved technique of heart transplantation in rats". J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57, 225-229 (1969)]에 기재된 기술을 사용하여 숫컷 랫트의 근친계 조합물 LEW[RT1.1](본 발명과 관련하여 "LEW"로서 지칭됨) → DA[RT1.av1](본 발명과 관련하여 "DA"로서 지칭됨)에 대한 랫트 모델에서 이소 심장 이식을 수행하였다. 이식하기 7일 전에(-7일째에), LEW 단구로부터 유래된 106개 TAIC를 PBS 1ml 중에서 DA 수용자 랫트에게 정낵내 투여하였다. 연속해서, LEW 랫트 계통으로부터 심장을 취한 지 7일 후에 이식을 수행하는데, 이러한 심장은 DA 수용자 동물의 복부(복강) 내로 이소 이식되었다. 사용된 랫트 계통은 근친계이기 때문에, 본 발명에 따르는 TAIC는 이식된 LEW 심장과 동일한 조직 항원을 발현하였다.
대조 목적으로, 소위 제3계(third strain) 이식을 수행하였다. 이를 위해, 동일한 LEW 공여자 동물로부터 유래하는 TAIC(106개)를 -7일째(즉, 수술을 시행하기 7일전)에 다시 DA 동물에게 정맥내 주사하였다. 7일 후에, CAP[RT1.c](본 발명과 관련하여 "CAP"로서 지칭됨) 랫트 근친계로부터 꺼낸 심장의 이식을 수행하였다. CAP 랫트는 반수체형 RT1.c를 발현하므로, 이들은 LEW 공여자 동물과 완전하게 MHC-불일치한다(MHC-상이하다). 다음에는, 이소 심장 이식을 수행한 개개 시험 그룹(n=10)이 상세히 기재되어 있다:
1. LEW → DA; 처리되지 않음;
2. LEW → DA; 106개의 LEW 유래된 TAIC를, LEW 심장 이식하기 7일 전에 정맥내 투여함;
3. CAP → DA; 106개의 LEW 유래된 TAIC를, LEW 심장 이식하기 7일 전에 정맥내 투여함;
4. CAP → DA; 처리되지 않음;
5. LEW → LEW; 처리되지 않음;
6. LEW → LEW; 106개의 LEW 유래된 TAIC를, LEW 심장 이식하기 7일 전에 정맥내 투여함.
심장 기관의 카플란-마이어 생존 곡선으로부터 알 수 있는 바와 같이(도 2A), 10개의 LEW 심장 중의 9개가 DA 수용자 동물에 의해 장기간(>150일) 허용된 반면, CAP 제3계 심장은 6.7±0.8일 후에 급격히 거부되었다. TAIC를 미리 투여하지 않은 경우에도, LEW 심장은 7.2±1.0일 후에 급격히 거부되었다. 6.7±0.8일 후에 DA 동물에서 자극된 면역 반응에 의한 CAP 심장 거부 반응은, 그룹 3 및 그룹 4 각각과 비교해서, 6.9±1.0일 후에 DA 랫트의 CAP 심장이 거부되는 처리되지 않은 대조군 그룹에서와 동일한 시간 범위 내에서 일어났다. LEW →LEW 체계로 동계 이식된 모든 심장은 TAIC 예비처리 과정이 수행되었는지의 여부에 상관없이 장시간(>150일) 생존하였다. 이로부터, TAIC가 이식편 대 숙주 질병 측면에서 수용자 유기체에게 위험을 유발시키지 않는다는 결론을 유추해낼 수 있다. 더우기, 상기 결과로부터, 이식하기 1주 전에 106개의 TAIC를 정맥내 투여하는 것이 장시간 기관 허용을 유도할 수 있는 가능성을 열어주었다는 결론을 유추해낼 수 있다. 이와 같이 하여 유도된 관용은 공여자-특이적인데, 이는 DA 랫트를 LEW-유래된 TAIC로 상응하게 예비처리하는 것이 CAP 제3계 심장 이식 조직편에 대한 관용을 유도하지 않기 때문이다. 동계 LEW → LEW 체계에서는, TAIC를 부가로 투여하는 것이 수용자 동물의 생존에 영향을 미치지 않을 뿐만 아니라 이식 조직편의 생존에도 전혀 영향을 미치지 않는다.
도 2B는 DA 수용자 랫트의 복부 내로 이소 이식을 수행한 후, 수술후 일수(POD) 150일에 LEW 동종 이식 조직편에 대한 조직학적 평가 결과를 도시한 것이다. 이식하기 7일 전에 수용자 랫트를 106개의 LEW-유래된 TAIC로 예비처리하였다. 이러한 이식 조직편은 수용자 랫트로부터 이를 제거하기 까지는(POD 150) 만족할 만한 기능을 나타내었다(강력한 심장 박동). 조직학적 제제(x40)는 어떠한 급성 및 만성 거부 반응 적응증(indication)도 나타내지 않으면서 단핵성 세포와의 최소한도의 침윤과, 건강한 심장 근육 형태 및 정상적인 혈관성 내피 조직을 나타내었다.
이와 관련하여 주목할 만한 사실은 공여자-유래된 세포(LEW-MHC 부류 I-특이적 항체 I1.69를 사용한 면역조직화학적 탐지에 의해 탐지됨)가 DA 수용자 랫트의 흉선에서 1년 동안 징기간 탐지될 수 있었다는 것이다. 도 2C는 POD 150에 제거된, 106개의 LEW-유래된 TAIC로 예비처리된 DA 랫트 흉선의 조직학적 제제를 도시한 것이다. 이러한 제제를 LEW-MHC 부류 I에 특이적인 모노클로널 항체 I1.69로 표지시킨다. 상기 도면에 도시된 바와 같이, TAIC를 투여하면, 흉선의 전이증식이 발생하는데, 여기서는 성숙한 T-세포에 대한 공여자-유래된 MHC 항원의 표시가 일어났으며; 상기 항체로 표지될 수 있는 세포 소집단이 명백하게 인식될 수 있다.
실시예 4
수용자에게서 공여자-유래된 변형 단구의 탐지
해당 DA 동물 내에서 LEW-유래된 TAIC를 정맥내 주사함으로써 혼합 키메리즘을 유도시키는 것이 본 발명에 따라서 유도된 관용에 대한 적절한 이유로서 간주될 수 있다. 따라서, LEW-유래된 TAIC를 주사한 후, 유동 세포계수법으로 측정된 세포의 5% 이상이 장기간(>45일) 동안 수용자 동물의 혈액 내에서 탐지될 수 있는지를 검사하기 위한 시험을 수행하였다. 유동 세포계수법은 당해 분야에 보고된 바와 같이 수행하였다[참조: Preffer F.I., "Flow cytometry" In: Diagnostic Immunopathology, Colvin RB, Bhan AK, McCluskey, RT(eds.), Raven Press New York, pp. 725-449 (1994)]. DA 수용자 혈액에서의 LEW 공여자 세포의 탐지는 LEW-MHC 부류 I 항원을 특이적으로 탐지하는 모노클로널 항체 I1.69를 사용하여 수행하였다[참조: Fandrich F., et al. Nature Med. 8, 171-178 (2002)]. 수용자 동물의 말초혈 중에서, 106 또는 104개 TAIC/kg x BW를 각각 투여한 후, 실시예 3에 기재된 LEW → DA 이식 4가지에 대해 결정된 키메리즘 데이터가 도 2D에 제시되어 있다.
면역억제 처리시키지 않은 4마리의 DA 수용자 랫트에게 LEW-유래된 TAIC를 주사한 후(106개 세포/kg x BW를 랫트 1 내지 3에게 주사하고, 104개 세포/kg x BW를 랫트 4에게 주사하였다), 랫트 1 내지 3은 DA 수용자 혈액 내에서 보다 장기간 키메리즘(60-80일)을 나타내었는데, 이는 공여자-유래된 세포에 기인된 것일 수 있다. 공여자-유래된 세포의 탐지는 LEW-MHC 부류 I-특이적 항체 I1.69(랫트의 LEW 계통 MHC 부류 I 양성 세포와만 결합하고 랫트의 DA 계통 세포와는 교차-반응하지 않는 모노클로널 항체)를 사용하여 유동 세포계수법으로 결정함으로써 이루어졌다. 말초혈의 모든 유사 세포는 이의 세포 표면 상에 MHC 부류 I 항원을 발현하기 때문에, DA 랫트의 말초혈 내의 공여자 세포의 비율은 I1.69를 사용하여 고도로 정확하게 결정할 수 있다. 도 2D의 그래프에 도시된 바와 같이, 4마리 동물 중 3마리에게서 세포의 10% 이상이, TAIC를 정맥내 주사한 후 처음 6주 이내에, I1.69에 의해 표지된 공여자 항원을 발현한다. 주사한지 60일 후에는, 이들 DA 랫트의 말초혈 중에서의 키메리즘의 비율이 실질적으로 떨어지고, 100일째가 되면 완전히 사라지게 된다. 그러나, 이러한 일시적인 키메리즘은 공여자 키메리즘의 결여에도 불구하고 더 이상 거부되지 않는(100일 후) 이중 시간(즉, TAIC 주사 후 7일) 후에 이식된 LEW 심장의 이식 조직편 생존과 밀접한 상관이 있다(본 실시예에서 랫트 1 내지 3). 한편, 104개 세포/kg x BW를 투여한 후의 단기간 키메리즘의 유도(랫트 4; <20일)는, 이식된 심장의 장기간 이식 조직편 허용을 보장해주지 못한다.
실시예 5
이식 후 공여자-유래된 세포의 투여
수용자에게 이식된 기관의 상응하는 장기간 허용을 유도할 수 있는 수술후 TAIC 투여 정도를 결정하기 위해, 임상용으로 기증된 사체(시체)를 대상으로 하여 평가 시험을 수행하였다. 이를 위해, 이소 심장 이식술을 LEW → DA 랫트 근친계 모델에서 수행하였다. DA 수용자 랫트에게는 이식 후 0, 1, 2 및 3일째에 사이클로스포린 A(CSA)를 5mg CSA/kg x BW의 투여량으로 4회 정맥내 투여하였다. 7일째에, 106개의 LEW-유래된 TAIC를 DA 수용자 랫트의 꼬리 정맥 내로 정맥내 투여하였다. 다음 실험 그룹이 대조군으로서 제공되었다(n=6-10):
1. LEW → DA; 처리되지 않음;
2. LEW → DA; CSA, 5mg/kg x BW를 0, 1, 2 및 3일째에 정맥내 투여함;
3. LEW → DA; CSA, 5mg/kg x BW를 0, 1, 2 및 3일째에 정맥내 투여함 + 106개의 LEW 유래된 TAIC를 7일째에 정맥내 투여함;
4. LEW → DA; 106개의 LEW 유래된 TAIC를 7일째에 정맥내 투여함;
5. CAP → DA; CSA, 5mg/kg x BW를 0, 1, 2 및 3일째에 정맥내 투여함 + 106개의 LEW 유래된 TAIC를 7일째에 정맥내 투여함.
DA 수용자 랫트를 POD(수술후 일수) 7일째에 106개의 LEW-유래된 TAIC로 수술후 정맥내 처리하면, 0 내지 3일째부터 CSA의 초기 4회 투여(5mg/kg x BW, 정맥내)가 수행된 경우에는 장기간 관용이 야기된다. CSA의 초기 투여가 필요한데, 이는 POD 7일째(수술후 일수)에 106개의 TAIC를 단일 투여하는 단독 처치는 6가지 경우 중 1가지 경우에서만 급성 거부 반응을 방지해주기 때문이다. 이러한 경우에 선택된 CSA 용량은 준치료 효과 만을 나타내는데, 이는 이식 조직편의 생존이 연장되는 경우일지라도 CSA 만을 투여해서는 장기간 허용을 전혀 유도할 수 없기 때문이다. 이와 같이 유도된 이식 조직편 허용은 공여자-특이적인데, 이는 DA 랫트를 LEW-유래된 TAIC로 상응하게 처리하는 것이 CAP 제3계 심장 이식 조직편에 대한 어떠한 관용도 유도시키지 않기 때문이다.
도 3에 도시된 바와 같이, 실험 그룹 1의 심장은 7.0±0.8일 후에 급격히 거부되었다. 그룹 2의 심장은 14.4±7.0일 후에 느리게 거부되었다. 그룹 3의 심장은 6가지 경우중 5가지 경우에서 150일 이상 동안 허용되었다. 랫트계에서는 100일 이상 동안의 기관 허용이 장기간 허용으로 간주되는데, 이는 근친계 랫트의 평균 예상 수명이 대략 2년 정도이기 때문이다. 수술후에 TAIC(106개 세포) 만을 투여하는 것은 6가지 경우중 1가지 경우에서만 급격한 거부 반응을 방지할 수 있었는데, 이는 심장 기관이 22.6±31.6일 후에 박동을 중지하였기 때문이다(그룹 4). CAP 심장을 지닌 제3계 대조군은 유도된 이식 조직편 허용 특이성을 나타내었는데, 이는 제3계 심장이 7.4±2.2일 후에 다시 급격히 거부되었기 때문이다. 이들 결과는 또한, TAIC를 부가 적용하면, CAP 심장에 대한 급성 거부 반응을 방지해주지 못하는 어떠한 일반적인 면역억제도 발생할 수 없다는 사실을 입증해준다.
실시예 6
TAIC에 의해 유도된 장기간 허용의 기관 특이성에 관한 연구 조사
TAIC가 단지 심장 이식 조직편에 대한 공여자 항원에 대항하여 수용자에 의해 지시된 동종 특이적 면역 반응에 대항한 보호 효과를 제공할 있다는 가능성을 배제하기 위해, 강력하게 거부하는 DA → LEW 랫트 근친계 중의 다음 실험 그룹(n=6)에 다음 기관을 이식하였다:
1. DA(신장) → LEW; 처리되지 않음;
2. DA(신장) → LEW; 106개의 DA-유래된 TAIC를, 이식전 -7 및 -1일째에 정맥내 투여함;
3. LEW(신장) → LEW; 처리되지 않음;
4. DA(간) → LEW; 처리되지 않음;
5. DA(간) → LEW; 106개의 DA-유래된 TAIC를, 이식전 -7 및 -1일째에 정맥내 투여함;
6. LEW(간) → LEW; 처리되지 않음;
7. DA(피부) → LEW; 처리되지 않음;
8. DA(피부) → LEW; 106개의 DA-유래된 TAIC를, 이식전 -7 및 -1일째에 정맥내 투여함;
9. LEW(피부) → LEW; 처리되지 않음;
도 4A-C에 예시된 카플란-마이어 플롯에 의해 도시된 바와 같이, 6개의 신장 기관 중의 6개, 6개의 간 기관 중의 5개 및 6개의 피부 이식편 중의 5개가 LEW 수용자 랫트에 의해 장기간(>150일) 허용되었다. 모든 동계 기관 이식은 합병증을 유발시키지 않으면서 기술적 실행의 대조군으로서 제공되었으며, 공여자 동물에게 제한없이 허용되었다(생존 곡선에는 제시되지 않음). 결과적으로, 이들 시험 과정들은 2 x 106개의 TAIC를 미리 정맥내 주사하는 것이, 이식된 기관의 80% 이상에 대한 장기간 기관 허용을 유도시킨다는 사실을 보여주기도 한다.
이어서, TAIC를 선행 투여하거나 투여하지 않으면서 이식시킨, 상기 열거된 신장-, 간- 및 피부 이식 조직편을 조직학적으로 검사하였다. 도 4D는 이식전 -7일 및 -1일째에 체중 kg당 106개의 TAIC를 2회 정맥내 주사한 결과, 이식된 신장의 형태가 본래의 것으로 나타날 수 있는 반면(대조용 신장 및 동계 이식 조직편 LEW →LEW 참조), 처리되지 않은 동종 대조군 그룹 DA → LEW에서는 이식 조직편이 틈새에 명백히 침윤된 것을 인식(수술후 14일째)할 수 있다는 것을 도시한 것이다. TAIC 예비-처리과정을 거치지 않아 POD 12일째에 완전히 거부된 동종 간 이식 조직편(도 4E)(TAIC를 수반하지 않은 DA → LEW)은 유사한 방식으로 행동하는 반면, TAIC를 미리 투여하면, 간 이식 조직편의 실질(parenchyma)이 동계 이식 조직편과 비교해서 완전하게 균일하고 본래대로인 것으로 여겨질 수 있다. 동종 피부 이식 조직편(DA)은 또한, (동계 LEW 이식 조직편과 비교해서) 합병증 없이 완전히 치유되는 반면, 동시에 이식된 CAP 제3계 이식편은 수술후 12일째에 바로 거부되었다. 이러한 실시예는 TAIC에 의해 유도된 관용의 특이성을 입증해주는데, 이는 LEW 수용자 동물을 -7일 및 -1일째에 DA-유래된 TAIC로 예비-처리하면, DA 이식 조직편의 허용이 유발되는 반면, 0일째에 동시에 이식된 CAP 피부 이식편은 급격히 거부되기 때문이다(도 4F).
실시예 7A
TAIC에 의해 유도된 장기간 기관 허용의 반수체형 특이성에 관한 연구 조사
TAIC가 단지 선택된 랫트 근친계 조합물 LEW → DA에서만 장기간 기관 허용을 유도한다는 가능성을 배제하기 위해, 다음 추가의 근친계 조합물을 이소 심장 이식 조직편 모델(n=6)에서 검사하였다. 이를 위해, 특히 근친계 BN[RT1.n](본 발명과 관련해서 "BN"으로서 지칭됨)를 또한 사용하였다:
1. DA → LEW; 처리되지 않음;
2. DA → LEW; CSA 5mg/kg x BW를, 0, 1, 2, 3일째에 정맥내 투여함 + 106개의 DA-유래된 TAIC/kg x BW를, 수술후 7 및 10일째에 정맥내 투여함;
3. CAP → LEW; 처리되지 않음;
4. CAP → LEW; CSA 5mg/kg x BW를, 0, 1, 2, 3일째에 정맥내 투여함 + 106개의 CAP-유래된 TAIC/kg x BW를, 수술후 7 및 10일째에 정맥내 투여함;
5. BN → LEW; 처리되지 않음;
6. BN → LEW; CSA 5mg/kg x BW를, 0, 1, 2, 3일째에 정맥내 투여함 + 106개의 BN-유래된 TAIC/kg x BW를, 수술후 7 및 10일째에 정맥내 투여함.
랫트 근친계 모델에서 공지된 가장 강력한 거부 반응과 연관이 있는 소위 "고-반응인자(high-responder)" 조합물(DA → LEW)에서는, 106개의 TAIC를 수술후에 1회 정맥내 투여하고서는 장기간 허용을 달성할 수 없다는 사실이 이미 예비 실험으로부터 공지된 바 있다. 따라서, TAIC를 2회 투여함으로써 수용자 동물 내의 TAIC 존재량을 증가시키기 위한 시도가 이루어졌다. 도 5A에 예시된 상응하는 생존 곡선에 의해 제시된 바와 같이, 수술후 7일 및 10일째에 TAIC를 2회 투여하면, 실험 그룹 2의 6가지 경우중 4가지에서, 실험 그룹 4의 6가지 경우중 5가지에서 장기간 기관 허용이 제공되었다. BN → LEW 계통 조합물에서는 이식된 모든 기관이 어떠한 급성 거부 반응 적응증도 없이 장기간 생존하였다. 이식된 심장이 장기간(>150일) 허용되는 모든 경우에서는, TAIC 투여 후 처음 20일 내지 45일 동안에 수용자 동물에게서 혼합 키메리즘이 탐지될 수 있었다. 그러나, 수용자의 말초혈 내에 공여자 세포가 결여됨으로써 초기 기관 부전증이 항상 수반되었다. 이들 데이터로부터, TAIC 세포가 21일 이상 동안 탐지될 수 있는 혼합 공여자 키메리즘을 유도하는 경우에만, TAIC를 정맥내 투여하는 것이 장기간 기관 허용을 유발시킨다는 결론을 유추해낼 수 있다. 이는 또한 도 2D에 제시된 실험 결과를 확인시켜 준다.
체중 kg당 106개의 TAIC를 수술후 7일 및 10일째에 수용자 동물에게 정맥내 투여함으로써, 초기에 CSA를 부가적으로 4회 투여하는 경우에는 3가지 모든 근친계 조합물 중의 80% 이상에서 장기간 관용을 결과적으로 유도시킬 수 있었다.
실시예 7B
생체내 관용 유도에 대한 M-CSF-처리된 단구의 γ-IFN 자극 유의성에 관한 연구 조사
추가로 상세히 기재되는 생체내 관용 발생에 대한, M-CSF-처리된 혈액 단구를 γ-인터페론으로 부가 자극한 효능을 성상 확인할 수 있도록 하기 위해, 다음 시험 그룹을 이소 심장 이식을 위한 LEW → DA 랫트 근친계 모델(그룹당 6마리 동물)에서 검사하였다:
1. LEW → DA; 106개/kg x BW의 LEW-유래된 혈액 단구(배양되지 않은 단구)를, 심장 이식전 -7일째에 정맥내 투여함;
2. LEW → DA; 106개/kg x BW의 LEW-유래된 혈액 단구(M-CSF로 처리됨)를, 심장 이식전 -7일째에 정맥내 투여함;
3. LEW → DA; 106개/kg x BW의 LEW-유래된 혈액 단구(γ-IFN로 자극시킴)를, 심장 이식전 -7일째 정맥내 투여함;
4. LEW → DA; 106개/kg x BW의 LEW-유래된 혈액 단구(M-CSF로 처리됨과 동시에 γ-IFN로 자극시킴)를, 심장 이식전 -7일째 정맥내 투여함.
도 5B의 카플란-마이어 생존 곡선에 의해 도시된 바와 같이, 배양되지 않은 신선한 LEW-유래된 혈액 단구를 심장 이식전 7일째에 정맥내 투여하는 것이, DA 공여자 동물 내에서의 LEW 심장의 급성 동종 이식 조직편 거부 반응을 방지할 수 없었다. 이러한 실험 그룹의 이식 조직편은 평균(±SD) 7.8±0.8일 후에 거부되었다. 그러나, M-CSF와 함께 6일간에 걸쳐 배양된 단구를 미리 투여하면, 기관 생존 시간이 상당히 연장되었는데, 이는 본 실험 그룹에서의 거부 반응이 평균 35.0±51.5일 후에나 관찰되었기 때문이다. 신선한 혈액 단구를, M-CSF를 함유하지 않는 RPMI 배지 중에서 48시간에 걸쳐 γ-IFN로만 자극하는 것이, 심장 이식 조직편의 급성 거부 반응을 방지할 수 없었는데 평균 7.8±1.2일 후에 심장 박동이 정지되었다. 신선한 혈액 단구를 6일간에 걸쳐 M-CSF로 처리하고 이들 세포를 48시간에 걸쳐 γ-IFN으로 부가 자극시키는 것 만으로도(5일 및 6일째), 6개의 이식 조직편 중의 4개에서 장기간 기관 관용(>150일)이 야기되었다. 이러한 결과는 생체내 관용을 발생시키기 위해서는 M-CSF 처리된 단구를 γ-IFN으로 부가 자극시키는 것이 결정적으로 중요하다는 사실을 보여준다.
실시예 8
TAIC에 의해 유도된 장기간 기관 허용의 종 특이성에 관한 연구 조사
TAIC가 단지 선별된 랫트 동물 종에서만 장기간 기관 허용을 효과적으로 유도할 수 있다는 가능성을 배제하기 위해, 단구성 기원 세포를 실시예 2에 상세된 방법과 유사한 방식으로 공여자 돼지로부터 분리함으로써, 1000U/10ml를 24시간에 걸쳐 영양 배지에 가하여 γ-IFN으로의 자극을 수행하였다. 연속해서, 사람의 기관에 필적하는 기관을 거부하는 능력을 지니고 있는 "SLA-부정합 미니 돼지"에 대한 좌측 폐 이식 모델에서, 급성 거부 반응을 억제하는 TAIC의 유효성에 대한 연구를 수행하였다. 이러한 경우에는, 공여자 돼지의 좌측 폐를 절제하고, 이를 유전적으로 상이한 수용자 돼지에게 동소 이식한다(즉, 수용자 돼지로부터 좌측 폐를 제거한 후 좌측 흉강에 이식한다). 폐 절제시, 공여자 혈액 500ml를 동시에 채취하여 상기 돼지의 단구로부터 TAIC를 제조하는데 제공하였다.
공여자 동물 모두는 체중이 30 내지 35kg이다. 다음 실험 그룹이 돼지(n=4)에서 정립되었다:
1. 총 28일 동안, CSA 5g/일, 50mg 아자티오프린/일, 25mg 메틸 프레드니솔론/일;
2. 그룹 1 + 공여자 돼지의 108개 골수 세포(BM)/kg x BW 수용자 돼지 + 수용자 돼지의 4.5Gy 전신 조사(WBI);
3. 그룹 1 + 공여자 돼지로부터 유래된 106개 TAIC/kg x BW, 폐 이식 수술후 7일 및 10일째.
도 6A에 도시된 바와 같이, 그룹 1에서 폐 이식 조직편의 거부 반응은 면역억제가 종결된 후 평균 50.3±9.9일에 일어났다. 한편, 그룹 2의 동물은 102.3±81.0일 후에 이들의 기관이 거부당했다. 2회 반복된 TAIC 처리와 조합한 삼중 면역억제는 기관의 생존 시간을 292±135.5일로 연장시키며, 4마리 동물 중 3마리는 장기간 기관 허용(>350일)을 나타낸다. 그룹 3의 모든 경우에는, >21일 동안 혼합 공여자 키메리즘이 수용자 혈액에서 관찰될 수 있는 반면, 그룹 1과 2의 동물들은 단지 6 내지 8일 동안의 단기간 혼합 키메리즘을 나타내었다. 도 6B는 실험 그룹 1 돼지의 폐 이식 조직편(POD 41)과 실험 그룹 3으로부터의 TAIC로 처리된 돼지의 폐 이식 조직편(이식후 55일째; B)을 도시한 것이다. 반면, 심장 실루엣(silhouette) 주변의 좌측 흉벽에 대한 돌출부에서 가시적 투명도 감소(음영)는 실험 그룹 1 돼지에서 거부된 폐 이식의 적응증으로서 여겨질 수 있으며, TAIC로 처리된 동물의 가슴 X-선 사진은 심장 실루엣에 대하여 우수한 한계 결정을 나타내는, 눈에 띄지 않는 X선 폐 및 이식 조직편 발견을 각각 보여준다.
실시예 9
TAIC에 대한 항체 GM-7의 결합
실시예 2에 기재된 바와 같이 제조한 사람 TAIC로 마우스를 면역시킴으로써, 모노클로널 항체 GM-7를 생성시킨다. 이러한 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 기탁기관("Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen")에 수탁번호 DSM ACC2542로 기탁되었다. 다음에 보고된 결과는 상기 항체가, 본 발명에 따라서 6일간 M-CSF와 함께 다른 위치(ex situ)에서 변형시키고 2일간 γ-IFN로 자극시킨 바 있는 CD14+ 세포 상에서만 발현하는 항원과 특이적으로 결합한다는 사실을 입증해준다.
도 1은 시험관내 변형 후, 즉 TAIC로의 형질전환 후 단구성 세포에 대한 GM-7의 결합 능력을 유동 세포계수법으로 결정하여 도시한 것이다. 연막으로부터 직접적으로 수득된 CD14-양성 단구는 항체 GM-7과 결합하지 않는다는 사실을 알 수 있다(회색 음영은 항체 대조군에 상응할 수 있다). 이와는 반대로, 단구 일부가 M-CSF 하에서의 배양과 γ-IFN로의 자극 후에 특정 항원을 발현하는데, 이러한 항원은 모노클로널 항체 GM-7에 의해 인식된다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 배양한 후, 형질전환된 단구의 약 80%가 모노클로널 항체 GM-7과 결합할 수 있다.
추가의 실험에서는, CD14+/GM-7+ 세포의 억제인자 활성을 혼합 림프구 배양물(MLC) 중에서 CD14+/GM-7- 세포의 억제인자 활성과 비교하였다. MLC는 다음 문헌에 기재된 바와 같이 수행하였다[참조: Kurnick, J.T. "Cellular Assays" in: Diagnostic Immunopathology, [Colvin R.B., Bhan A.K., McCluskey, R.U. (ed.), Raven Press, New York, pages 751-771 (1994)].
본 실시예에서는, TAIC가 개체 B로부터 유래된다. 도 7에 도시된 바와 같이, GM-7 양성 TAIC와 GM-7 음성 TAIC의 억제인자 활성 간에는 유의차가 존재한다. 6일간 M-CSF로 처리하고 2일간 γ-IFN로 자극한 후에 수득된 TAIC 집단의 GM-7 양성 분획 만이, 개체 B 세포로의 자극 후 개체 A의 반응인자 세포의 T-세포 증식 활성에 대한 상당한 억제 효과를 나타낸다.
이들 데이터는 모노클로널 항체 GM-7의 가용성으로 인해 본래의 단구를 M-CSF와 함께 배양하고 γ-IFN로 자극한 후에 수득된 TAIC 집단으로부터, 최적의 억제인자 기능을 지닌 세포 집단을 임상 목적으로 분리할 수 있다는 것을 지시해준다.
실시예 10
TAIC의 면역억제 활성에 대한 IDO 억제제 1-메틸-트립토판의 영향 결정
효소 인돌아민-2,3-디옥시게나제(IDO)의 억제제인 1-메틸트립토판(1-MT)이 "Mo" 및 "Mo+Ly" 설정물(실시예 11 참조)에서 생성된 TAIC의 억제인자 활성에 영향을 미치는지를 명료하게 하기 위해, 1-MT의 존재 및 부재 하에 PHA(피토해마글루티닌) 자극된 T-세포를 수반한 각종 혼합 림프구 배양물(MLC)을 확립하였다.
이들 혼합 림프구 배양물 중에서, 2㎍ PHA를 수반한 50,000개의 림프구를 96-웰 판의 웰에 옮긴 다음, 144시간에 걸쳐 증식시킨다("PhaLy"로서 지시됨). PHA를 부가하지 않은 배지에서만 배양된 림프구를 추가의 대조군("Ly"로서 지시됨)으로서 수행하였다.
상이한 보조-배양물에서의 PHA-자극된 림프구의 증식을 결정하기 위해, 다음 4가지 설정물을 수행하고 검사하였다:
PhaLy + "Mo+Ly": PHA-자극된 림프구 및 TAIC[실시예 11에 따르는 설정물 "Mo+Ly"로부터의 105개 세포].
PhaLy + "Mo+Ly" + 1-MT: 2μmol 1-MT의 존재 하에 PHA-자극된 림프구 및 TAIC[실시예 11에 따르는 설정물 "Mo+Ly"로부터의 105개 세포].
PhaLy + "Mo": PHA-자극된 림프구 및 TAIC[실시예 11에 따르는 설정물 "Mo"로부터의 105개 세포].
PhaLy + "Mo" + 1-MT: 2μmol 1-MT의 존재 하에 PHA-자극된 림프구 및 TAIC[실시예 11에 따르는 설정물 "Mo"로부터의 105개 세포].
144시간 동안 배양한 후, 모든 대조군 또는 보조-배양물을 3[H]-티미딘("펄스됨")의 존재 하에 24시간 동안 추가로 배양한 후, 방사성 표지된 티미딘의 혼입량을 분당 계수(cpm)로서 결정하였다(도 8 참조). 이러한 배열에서는 결정된 방사능 양이 DNA 내로 혼입된 표지된 티미딘 양에 대한 측정치이므로, 이는 림프구 증식 속도에 대한 측정치이다. 도 8에 보고된 값은 3가지 실험 각각의 3회 결정치로부터의 평균 값 ± 표준 편차에 상응한다.
상기 결과는 PHA로 자극되지 않은 림프구("Ly")는 유의적으로 증식되지 않는다는 사실을 입증해주었으며, 관찰된 평균 방사능 양은 367cpm이다(도 8 참조). 이와는 반대로, 2㎍ PHA로 자극하면 림프구("PhaLy")의 증식 속도가 상당히(유의적) 증가하며, 이들 샘플에서 가장 많은 혼입량은 평균 18459cmp으로 측정되었다.
TAIC를 림프구 배양물에 부가하면, 실시예 11로부터의 설정물 "Mo+Ly"로부터의 세포가 부가된 경우에는 증식 속도가 강력하게 감소되었으며(PhaLy + "Mo+Ly", 결정치 1498cpm), 실시예 11로부터의 설정물 "Mo"로부터의 세포가 부가된 경우에는 증식 속도가 상기 보다는 덜 강력하게 감소되었다(PhaLy + "Mo", 결정치 3369cpm)
자극된 림프구를 수반한 "Mo" 및 "Mo+Ly"를 함유하는 설정물에 2μmol 1-메틸-트립토판(1-MT)를 부가한 후에 수득된 결과는, 1-메틸-트립토판(1-MT)이 TAIC의 억제인자 기능을 상승적으로 증가시킴으로써, 설정물 "Mo"로부터의 TAIC를 사용한 경우(측정치 390cpm) 보다 설정물 "Mo+Ly"로부터의 TAIC를 사용한 경우(측정치 267cpm)에 보다 강력한 감소가 이루어졌다는 것을 입증해준다.
실시예 11
단구 배양 동안 CD3 + /CD14 + -세포의 형성에 대한 림프구의 영향
TAIC로서 유효한 CD14+/CD3+-세포의 발생에 대한, 단구 분획 내에 존재하는 림프구의 영향은 2가지 상이한 설정물을 비교함으로써 결정하였다.
제1 설정물("Mo"로서 후속 지시됨)의 경우에는, 단구 분획을 실시예 1에 기재된 바와 같은 연막의 분열간기로부터 초기에 채집하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, 세포를 연속해서 M-CSF와의 배양 단계에 전달하였다. 배양 출발 시점으로부터 1시간 이내에, 조직 배양 플라스크 바닥에 부착되어 있는 단구를 각 10ml PBS로 5회 세척함으로써, 배양물에 존재하는 림프구의 양을 <5%(4.8±2.4%)로 감소시켰지만, 이로써 수득된 증강된 단구(CD14+)의 양은 90% 이상(92±5.6%)이다. 상기 설정물 내의 부가의 세포 성분은 B-림프구와 과립구이다.
제2 설정물("Mo+Ly"로서 후속 지시됨) 내의 세포를 또한, 실시예 1에 기재된 바와 같이 단구 분획으로서 "연막"의 분열간기로부터 채집하였다. 그러나, 설정물 "Mo"와는 상이한, 조직 배양 플라스크 바닥에 부착되어 있는 세포는 실시예 2에 기재된 바와 같이, 배양을 개시한지 24시간 후에 1회만 세척하였다. 그 결과, 45±5.3% CD14+-단구와 23.5±8.9% CD2+-림프구로 구성된 세포 집단이 수득되었다. 설정물 "Mo"에서와 같이 림프구와 과립구가 또한 상기 설정물에 존재하였다.
설정물당 총 세포 집단 내의 각각의 세포 유형 양을 결정하는 것은 3가지 실험용 설정물 각각에 대한 유동 세포계수법을 통하여 수행하였다(도 9 참조). 그 결과가 표준 편차를 포함한 평균치로서 보고된다.
CD14+/CD3+-세포는 배양 초기에는(0일째) 설정물 "Mo"에서 결정될 수 없을 뿐만 아니라 설정물 "Mo+Ly"에서도 결정될 수 없다. 5일 간의 배양 기간 후, 실험을 종결하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 조직 배양 플라스크 바닥으로부터 세포를 떨어지게 한 후 FACS 분석에 의해 세포를 성상 확인하였다. 그 결과, CD14+-세포의 상대량이 이들 설정물에서 감소되는데, 설정물 "Mo"에서는 92%에서 42%로 감소되고 설정물 "Mo+Ly"에서는 45%에서 28%로 감소된 것으로 밝혀졌다. 외관상으로는, 림프구가 단구보다 더 빠르게 증식하는데, 림프구의 상대량은 설정물 "Mo"에서는 4.8%에서 69.8%로 증가하였고 설정물 "Mo+Ly"에서는 23.5%에서 50.6%로 증가하였다. 배양 동안, TAIC로서 유효한 CD14+/CD3+-세포가 양 배양물에서 형성된다. 이러한 맥락에서, CD14+/CD3+-세포의 양 증가가 단지 7.2±3.2% 만을 나타내는 설정물 "Mo"와는 대조적으로, 설정물 "Mo+Ly"에서는 32.0±5.3%의 상당히 높은 CD14+/CD3+-세포량 증가가 관찰된다는 사실이 중요하다.
이들 결과는 배양 초기에 90% 이상의 상대량으로 단구를 증강시키기 위해 세포를 정제하는 것이, TAIC 집단에서 면역억제성 CD14+/CD3+-세포의 생성에 대해 부정적인 영향을 미치는 반면, 실시예 1 및 2에 기재된 방법은 상당히 높은 수율의 CD14+/CD3+-세포를 제공해준다는 사실을 입증해준다.
실시예 12
조절성 T-세포를 생성하기 위해 동종 림프구와 사람 TAIC를 시험관 내에서 동시 배양함
TAIC가 수용자에게서 조절성 T-세포, 즉 CD4+/CD25+-림프구의 형성을 유도시키는지를 검사하기 위해, TAIC와 림프구와의 몇 가지 상이한 시험관내 배양을 수행하고, 이로부터 비롯되는 조절성 T-세포의 형성을 분석하였다.
이를 위해, 공여자 A의 TAIC를 공여자 B의 림프구와 함께 시험관 내에서 직접 또는 간접적으로 동시 배양하였다. 직접적인 동시 배양에서는, (공여자 A)의 TAIC와 (공여자 B의) 림프구 간의 직접적인 세포-대-세포 접촉이 가능하였지만, 간접적인 동시 배양에서는 막("세포 배양 삽입물", 0.4㎛ 공극 크기, Falcon, 주문 번호 353090)이 배지의 교환을 허용하였지만, 두 세포 집단의 물리적 접촉을 억제하였다. 직접 또는 간접적인 동시 배양은 항온 배양기 조건 하에, 즉 37℃ 및 5% CO2 대기 하에 바람직하게는 3 내지 5일, 보다 바람직하게는 4일 동안 수행한다.
배양한 후, 조절성 T-세포(CD4+/CD25+) 각각의 수를 양 설정물에서 뿐만 아니라 대조군(여기서는 TAIC 또는 림프구를 각각 단독으로 배양하였다)에서 결정하였다. 추가로, 혼합 림프구 배양물에서 가장 유의적인 억제인자 기능을 지닌 TAIC-세포 집단의 성분을 나타내는 CD3+/CD14+-세포의 수를 대조군 설정물(여기서는 TAIC를 단독으로 배양하였다)에서 결정하였다.
모든 설정물에서, FACS 분석당 세포의 표면 항원을 결정하고, 세포 총 수 중의 각각의 세포 집단의 양을 분석하였다.
추가로, 조절성 T-세포에 의해 특이적으로 발현된 3가지 신규한 마스터(master) 유전자(Foxp3, CTLA-4 및 인테그린 αEβ7)의 상대적 발현을 각각의 세포 집단에서 PCR함으로써 결정하였다(표 참조). Foxp3은 조절성 T-세포의 발생에 대한 제어 유전자로서 고려되고 이들 세포에 의해 특이적으로 발현되는 특이적 전사 인자이다[참조: Hori, S. et al., "Control of Regulatory T-cell Development by the Transcription Factor Foxp3", Science 299, 1057-1061 (2003)].
CTLA-4는 CD4+/CD25+-T-세포의 조절 기능을 결정하기 위한 마커로서 사용되는 추가의 인자이다[참조: Khattri, R. et al., "An essential role for Scurfin in CD4+/CD25+ T regulatory cells", Nature Immunology, online publication, doi:10.1038/ni909 (2003); Shimizu, J. et al. "Stimulation of CD25+/CD4+ regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance", Nature Immunology, online publication, doi:10.1038/ni759 (2003); Cobbold, S. P. et al. "Regulatory T cells in the induction and maintenance of peripheral transplantation tolerance", Transpl. Int. 16(2), 66-75 (2003)].
인테그린 αEβ7은 상피성 카테린과 결합하고 조절성 CD25+-T-세포의 가장 강력한 아집단에 대한 마커로서 사용될 수 있는 인테그린이다[참조: Lehmann, J. et al. "Expression of the integrin αEβ7 identifies unique subsets of CD25 + as well as CD25- regulatory T cells" PNAS 99(20), 13031-13036 (2002)].
Foxp3-, CTLA-4- 및 인테그린 αEβ7-발현의 결정은 대조군으로서 2개의 "하우스키핑 유전자"인 GAPDH 및 β-악틴을 사용하여 정량적 PCR함으로써 수행하였다. 결정된 값은 한편으론, 서로에 대한 관계에 놓아두었는데, CD14+/CD3+-세포에 대해 수득된 값이 1로 설정되었고, 또 다른 한편으론 RNA 절대량이 총 RNA ㎍당 ㎍으로 지시되어, 시험관 내에서 TAIC에 의해 발휘된 억제 측정치 및 CD4+/CD25+ 이중 양성 세포 형성을 각각의 유전자의 발현 속도와 상호 관련시켰다. 당업자에게 공지되어 있는 표준 방법을 정량적 PCR에 사용하였다[참조: Lottspeich, F., Zorbas, H. "Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg- Berlin, 1998].
다음 표는 직접적인 동시-배양으로부터 수득된 림프구 집단 내에서의 이중 양성 세포 CD4+/CD25+의 비율(%)이, 간접적인 동시-배양 또는 대조군으로부터 수득된 CD4+/CD25+ 림프구의 양(이는 각각 2.38% 및 2.65%에 거의 상응한다)과 비교해서 8.7% 정도로 많이 증가한다는 것을 보여준다.
CD4+/CD25+ 세포 아집단은 CD4+/CD25- 세포에서의 발현과 비교해서, 시험된 모든 마스터 유전자로부터 가장 높은 상대량의 mRNA를 발현한다(표 참조). Foxp3의 발현이 대략 10배수(37 대 3.75) 정도 증가하긴 하지만, CTLA-4 발현은 훨씬 더 높은 최대 발현에 도달된다(4699 대 0.376). 동시-배양 동안 CD4+/CD25+ 세포에서의 제3 마스터 유전자 인테그린 αEβ7의 발현 증가는 거의 CTLA-4에 대해서 만큼이나 높은데, 이는 인테그린 αEβ7 mRNA의 절대량이 CD4+/CD25- 세포에서의 3.4 x 10-12㎍ mRNA/㎍ 총 RNA와 비교해서, CD4+/CD25+ 세포에서 1.4 x 10-9 ㎍ mRNA/㎍ 총 RNA로 상승되기 때문이다.
간접적인 동시-배양 후, CD4+/CD25+ 아집단에서의 Foxp3-mRNA의 상대량은 단지 10에 상응하는데, 이는 대조군의 림프구에 의해 발현된 상대량(이는 Foxp3-mRNA를 15의 상대량으로 발현한다) 만큼이나 낮다.
대조군의 림프구에 의해 발현된 CTLA-4-mRNA의 상대량은 CD4+/CD25+ -집단에서는 0.375 정도로 낮고 CD4+/CD25- 집단에서는 0.1 정도로 낮다.
[표]
표면 마커 CD3, CD4, CD14, CD25를 참조로 하여 직접 및 간접적인 동시-배양 후 세포 총 량 중에서의 특이적 세포 집단의 양 결정; 및 이들 세포 집단에서 3가지 유전자(Foxp3, CTLA-4 및 인테그린 αEβ7)의 RNA의 절대량 및 상대적 발현량 결정
대조군 직접 동시-배양 간접 동시-배양
TAIC 림프구 림프구 림프구
CD14+/CD3+ CD14+/CD3- CD4+/CD25+ CD4+/CD25- CD4+/CD25- CD4+/CD25- CD4+/CD25- CD4+/CD25-
FACS[% 양성 세포] 41 20 2.65 30.8 8.7 49 2.38 27.6
상대적 Foxp3-발현[PCR] 50 1 15 1.5 37 3.76 10 1.5
RNA 절대량 Foxp3 1.6x10-8 3.2x10-10 4.8x10-9 8x10-10 1.2x10-8 1.2x10-9 3.2x10-9 4.8x10-10
상대적 CTLA4-발현[PCR] 12500 1 0.375 0.1 4699 0.376
RNA 절대량 CTLA4 6.5x10-6 5.2x10-10 1.9x10-10 5.2x10-10 2.4x10-6 1.9x10-10
RNA 절대량 인테그린 αEβ7 3.4x10-9 탐지 가능하지 않음 1.4x10-9 3.4x10-12
TAIC 세포의 CD14+/CD3+ 아집단에서의 CTLA-4의 발현은 Foxp3의 발현과 유사하고, 또한 기타 모든 세포 집단에서 보다 상당히 더 높다.
이와 관련하여, CD14+/CD3+ 아집단에서의 CTLA-4 발현(상대값 12,500)이 상대값 50을 나타내는 Foxp3-발현 보다 훨씬 더 배가되었다는 사실은 주목할만한 일이다.
TAIC의 CD14+/CD3- 아집단에서는 인테그린 αEβ7 의 발현이 전혀 탐지 가능하지 않았지만, 분석된 다른 2가지 유전자의 발현 행위와 유사하게, ㎍ RNA/㎍ 총 RNA의 절대치로서 측정된 TAIC의 CD14+/CD3+ 아집단에서의 상기 인테그린의 발현은 최고치에 도달하였다(3.4 x 109㎍/㎍ 총 RNA).
정상적인 림프구와 비교해서, 단구로부터 유래된 TAIC 상에서의 3가지 림프구 마커 Foxp3, CTLA-4 및 인테그린 αEβ7의 상당한 발현 증가는 전적으로 예상치 못한 일이며, 단구 또는 단구로부터 유래된 세포 상에서는 지금까지 전혀 관찰된 바가 없었다.
결론적으로 언급하면, 상기 제시된 바와 같은 본 실시예의 결과는 다음 사실을 나타낸다: Foxp3-, CTLA-4- 및 인테그린 αEβ7-발현 수준이 각각의 세포의 면역조절 특성과 상관이 있다는 가정으로부터 출발할 경우에는, TAIC의 CD3+/CD14+ 아집단의 억제인자 활성이 이들 3가지 유전자의 높은 발현과 연관이 있다는 사실이 본원에서 입증되었다. 이는 이들 마커가 지금까지는 단지 림프구에 대해서만 보고되었고 단구성 기원의 세포에서는 전혀 보고된 바가 없다는 사실을 고려할 때 상당히 놀라운 일이다.
TAIC를 림프구와 함께 직접 동시-배양하면, 간접적인 동시-배양과 림프구 만을 배양하는 것과 비교해서 상당히 많은 양의 CD4+/CD25+ 림프구가 생성된다는 사실이 추가로 밝혀졌다. 이는 TAIC의 투여 후에 생체 내에서(즉, 환자에게서) 조절성 T-세포가 또한 형성된다는 가설을 뒷받침해준다. 이들 결과는 CD4+/CD25+ 림프구의 공지된 면역조절 기능과 부합되고, 이들 세포 중에서의 Foxp3-, CTLA-4- 및 인테그린 αEβ7-mRNA의 함량이 간접 동시-배양된 림프구 또는 대조군 림프구에서 보다 상당히 더 많다는 사실과 부합된다.
실시예 13
시험관 내에서 TAIC와 동시-배양된 림프구에 의한 이식 조직편 관용의 생체내 유도
실시예 12에 제시된 결과 및 결론은 생체내 동물 실험에서 확인되었다. 실시예 3, 4, 5, 6 및 7에 기재된 과정과는 상이하게, 선별된 LEW →DA 근친계 조합물의 동물에게는 관용을 유도하기 위한 LEW-유래된 TAIC를 주사하지 않았지만, 5일 간에 걸쳐 공여자로부터의 (LEW)-유래된 TAIC를 미리 직접적으로 동시-배양하였거나 또는 대조군으로서 배지 내에 단독으로 배양시킨 수용자로부터의 DA-림프구를 본 실시예의 동물에게 주사하였다.
동종 심장 이식에 앞서 자가 유래의 동시-배양된 DA-림프구가 주사된 동물에게는 공여자 특이적 관용이 발생된 반면, 배양되지 않은 본래의 대조군 DA-림프구가 주사된 대조군 동물은 이식된 심장을 10 내지 14일 이내에 급격히 거부하였다.
이들 결과는 공여자-TAIC와 수용자-림프구 간의 물리적 세포-대-세포 상호작용이, 수용자의 동계 면역계를 변형시킬 수 있는 조절성 T-세포의 생성을 유도시켜, 잠재적으로 동종(이계) 반응성 T-세포를 억제시키고, 이로써 기관 거부 반응을 방지시킨다는 사실을 지시해준다.
이들 결과는 공여자-TAIC와 수용자-림프구 간의 물리적 세포-대-세포 상호작용이, 수용자의 동계 면역계를 변형시킬 수 있는 조절성 T-세포의 생성을 유도시켜, 잠재적으로 동종(이계) 반응성 T-세포를 억제시키고, 이로써 기관 거부 반응을 방지시킨다는 사실을 지시해준다.

Claims (28)

  1. a) 혈액으로부터 단구를 분리하는 단계;
    b) 이러한 단구를, 세포성 성장 인자 M-CSF를 함유하는 적합한 배양 배지에서 증식시키는 단계;
    c) 상기 단구를, γ-IFN을 함유하는 배양 배지에서 단계 b)와 동시에 또는 이후에 배양하는 단계; 및
    d) 단계 c)에서 형성된 이식 조직편 허용 유도성 세포를 상기 배양 배지로부터 격리시킴으로써, 상기 이식 조직편 허용 유도성 세포를 수득하는 단계
    를 포함함을 특징으로 하는, 단구성 기원의 이식 조직편 허용 유도성 세포의 생성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단구가 사람 기원의 것임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단구 다음으로 림프구의 양이, 분리물 중의 세포 총 수를 기준으로 하여 10% 이상으로 존재하는 방식으로, 단구를 혈액으로부터 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 형성되거나 또는 단계 d)에서 수득된 이식 조직편 허용 유도성 세포가, 하이브리도마 세포주 DSM ACC2542에 의해 생산된 항체와의 결합에 의해 선별되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항의 단계 c)에서 형성되거나 단계 d)에서 수득되었거나, 또는 제4항에 따르는 선별 단계에서 수득된 이식 조직편 허용 유도성 세포 중에서, 세포 표면 상에 항원 CD3과 CD14를 동시-발현하는 세포를 선별하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 배양 배지 중의 M-CSF 농도가 1 내지 20㎍/l임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 b)의 후속으로, γ-IFN을 함유하는 배양 배지에서 24 내지 72시간 동안 단구를 배양하는데, 이러한 γ-IFN의 존재 하에서의 배양이 배양 단계 b)를 시작한지 3 내지 6일 후에 시작하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 배양 배지 중의 γ-IFN 농도가 0.1 내지 20ng/ml임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 b) 및 c)의 총 배양 기간이 4 내지 8일임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항의 단계 d)의 후속으로, 또는 제4항 및 제5항에 따르는 선별 단계의 후속으로, 세포를 적합한 세포 배양 배지, 또는 PBS 또는 NaCl 용액에 현탁시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 동결용 배지에 현탁시킨 다음, 급속 동결시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 동결용 배지가 태아 송아지 혈청(FCS) 또는 사람 AB 혈청 및 DMSO를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 수득 가능한, 단구성 기원의 이식 조직편 허용 유도성 세포.
  14. 제13항에 있어서, 세포 표면 상에 항원 CD3과 CD14를 동시 발현하는 것을 특징으로 하는 이식 조직편 허용 유도성 세포.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 사람 기원의 것임을 특징으로 하는 이식 조직편 허용 유도성 세포.
  16. 적합한 배지 중에 제13항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 이식 조직편 허용 유도성 세포를 함유하는 세포 제제.
  17. 단구성 기원의 이식 조직편 허용 유도성 세포를 함유하는 약제학적 조성물.
  18. 제13항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 이식 조직편 허용 유도성 세포 또는 제16항에 따르는 세포 제제를 함유하는 약제학적 조성물.
  19. 이식 조직편 거부 반응 억제용 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 제13항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 이식 조직편 허용 유도성 세포 또는 제16항에 따르는 세포 제제의 용도.
  20. 조절성 T-림프구를 시험관내 생성 및/또는 증식시키기 위한, 제13항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 이식 조직편 허용 유도성 세포 또는 제16항에 따르는 세포 제제의 용도.
  21. 제20항에 있어서, 조절성 T-림프구가 세포 표면 상에 항원 CD4와 CD25를 동시 발현하는 용도.
  22. a) 제13항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 이식 조직편 허용 유도성 세포 또는 제16항에 따르는 세포 제제를 T-림프구 제제와 동시-배양하는 단계; 및
    b) 조절성 T-림프구를 배양 배지로부터 임의로 수득하는 단계
    를 포함함을 특징으로 하는, 조절성 T-림프구의 생성 및/또는 증식 방법.
  23. 제22항에 있어서, 조절성 T-림프구가 세포 표면 상에 항원 CD4와 CD25를 동시-발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 조절성 T-림프구가 FACS 분류법에 의해 배양 배지로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 수득 가능한 조절성 T-림프구.
  26. 하이브리도마 세포주 DSM ACC2542.
  27. 하이브리도마 세포주 DSM ACC2542에 의해 생산된 항체.
  28. 이식 조직편 허용 유도성 세포의 탐지 및/또는 선별을 위한, 제22항에 따르는 항체의 용도.
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