KR101974842B1 - 중간엽 줄기 세포의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 환자의 전신 염증 반응 증후군(SIRS)의 치료를 위한 중간엽 줄기 세포(MSC)의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 SIRS의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

중간엽 줄기 세포의 용도 {USES OF MESENCHYMAL STEM CELLS}

전신 염증 반응 증후군(SIRS)은 특정한 감염원이 없는 전신의 염증 상태이다. 이는 다수의 인자들, 예를 들어 비 제한적으로 외상, 수술, 부신 기능 부전, 폐 색전증, 심근 경색, 출혈, 과민증, 약물 과용, 면역결핍 및 화상에 의해 유발될 수 있다. 하기 나열된 바와 같이 SIRS의 4 개의 주요 진단상 증상이 존재하나, 이들 중 임의의 2 개가 존재하면 진단에 충분하다(예를 들어 문헌[Nystrom(1998) Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 41, Suppl. A, 1-7]을 참조하시오).

i) 분당 90회 초과 박동의 심박수;

ii) 36 ℃ 이하 또는 38 ℃ 이상의 체온;

iii) 분당 20 회 초과 호흡의 호흡수(빠른 호흡); 및

iv) 4000 세포/㎣ 이하 또는 12000 세포/㎣ 이상의 백혈구 수, 또는 10% 초과의 미숙 호중구의 존재.

SIRS는 급성기 면역원 단백질의 만연된 활성화를 야기하여, 보체계 및 응고 경로에 영향을 주며, 이는 차례로 맥관구조뿐만 아니라 내장 기관에 손상을 유발한다. 후속적으로 다양한 신경내분비 역-조절 시스템들이 활성화하며, 이는 종종 상기 문제를 더욱 크게 한다.

패혈증은 SIRS의 특정한 형태이며, 중환자실에서 가장 흔한 사망 원인이다. 이는 감지되거나 탐지된 감염에 의해 유발된다. 이는 내생적인 염증 전 사이토킨의 과잉활성 및 균형 이탈 네트워크를 특징으로 하며, 종종 만연된 염증 및 혈액 응고에 이르고, 그 결과 적열상태, 발열, 종창, 통증, 기관 기능장애 또는 기관 기능부전이 발생할 수도 있다. 패혈증 중의 혈액 응고는 또한 사지 및 생명 중추 기관들로의 혈행을 감소시킬 수도 있고 기관 기능부전 또는 괴저의 발병에 이르게 할 수 있다.

SIRS와 같이, 패혈증은 종종 신체 전체를 통해 존재하는 급성 염증을 발생시키며 따라서 발열 및 백혈구 증가증(상승된 백혈구 수)과 빈번히 연관된다. 패혈증 이면의 최신 이론은 상기 감염에 대한 숙주의 면역 반응이 SIRS를 촉발하고, 이는 차례로 상술한 증상들을 나타낸다는 것이다. 감염 및 패혈증에 이어서, 조직 관류 및 산소 전달이 감소하여 패혈성 쇼크에 이를 수도 있다. 패혈성 쇼크로 진단되기 위해서는 환자에게서 감염 및 난치성 저혈압의 증거가 있어야 한다.

SIRS, 패혈증 및 패혈성 쇼크는 중증의 의학적 질환이다. 즉각적이고 공격적인 치료에도 불구하고, 상기 질병은 다발성 장기 부전으로 진행하기 쉽고 심지어 사망을 일으킬 수도 있다.

지금까지의 대부분의 치료 전략들은 염증 전 매개체를 표적으로 하였으나, 대규모 다 기관 임상 시험에서 연구 시 환자들의 생존을 개선하는 것으로 밝혀지지는 않았다. 하나의 단일 사이토킨, 예를 들어 TNFα 및 IL-β를 차단하는 것으로 설계된 요법들은 추정 상 이들 염증성 사이토킨들의 이르고 일시적인 동역학으로 인해 제한된 효능을 나타내었다. 최근에, 국제적인 집중 진료 및 감염 질병 전문가들은 SIRS, 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 앓고 있는 환자들에게 제공된 치료를 개선하기 위한 관리 지침을 개발하였다(Dellinger, 2004). 상기 지침은 복잡한 진단 및 치료 결정을 간단한 "임무수행에 필수적인" 임무로 바꾸는 것을 목적으로 하며, 다른 치료들 중에서도 광범위한 항생제, 스테로이드 및 드로트레코긴 알파(활성화된 것)의 투여를 제안한다.

그러나, 패혈증과 관련된 사망률은 30% 내지 50%로 여전한 반면, 패혈성 쇼크에 대한 사망률은 50% 내지 60%로, 훨씬 더 높은 것으로 보고되고 있다. 매년 대략적으로 750,000 건의 새로운 패혈증 사례들이 보고되고 있으며, 이 중 210,000 건 이상이 사망을 일으킨다. 의학적 치료가 더욱 침습적으로 되고 있으므로, SIRS, 패혈증 및 패혈성 쇼크의 발병률은 증가할듯하며, 결과적으로 이들 질환의 새로운 신뢰할만한 치료가 필요하다.

발명의 요약

중간엽 줄기 세포(MSC), 특히 인간 지방 조직 유래한 기질 줄기 세포(hASC)의 투여는 중증 내독소혈증 및 패혈증의 2 가지 생체 내 모델에서 사망을 막는 것으로 밝혀졌으며, 이는 MSC가 SIRS, 패혈증 및 패혈성 쇼크의 치료에 유용할 수도 있다는 증거를 제공한다. MSC는 다양한 염증성 사이토킨 및 케모킨의 전신 수준 감소에 의해서 및 백혈구의 다양한 표적 기관 내로의 침윤 억제에 의한 것을 포함하여, 여러 수준에서 SIRS의 어려운 태양들을 조절하는 작용을 하는 것으로 밝혀졌다.

따라서 본 발명은 환자의 전신 염증 반응 증후군(SIRS)의 치료에 사용하기 위한, 중간엽 줄기 세포(MSC)를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 환자의 전신 염증 반응 증후군(SIRS)을 치료하기 위한 약제의 제조에서 중간엽 줄기 세포(MSC)의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 환자에게 중간엽 줄기 세포(MSC)를 투여함을 포함하는, 상기 환자에게서 전신 염증 반응 증후군(SIRS)을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 및 다른 태양들을 하기에 보다 상세히 개시한다.

본 발명은 SIRS의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

도 1은 세포에 의해 발현된 마커들에 의해 한정되고 면역 형광 염색에 의해 측정된 바와 같은 세포 특성화를 나타낸다. 상기 면역양성 세포의 빈도를 하기와 같이 나타낸다: -, 5% 미만; +/-, 6 내지 15%; +, 16 내지 50%; ++, 51 내지 85%; 및 +++, 86 내지 100%. P, 계대 번호.
도 2는 지방 조직-유래한 기질 줄기 세포의 간접적인 면역 형광 특성화를 나타낸다. 청색은 DAPI-염색된 핵을 가리킨다. (A) CD90; (B) c-키트; 및 (C) 비멘틴.
도 3은 지방흡입 샘플로부터 단리한 세포로부터 수득한 표면 마커들(CD3, CD9, CD10, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD28, CD29, CD31, CD34, CD36, CD38, CD44, CD45, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD54, CD55, CD56, CD58, CD59, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD90, CD95, CD102, CD104, CD105, CD106, CD133, CD166, 글리코포리나, β2 마이크로글로불린, HLA I, HLA II 및 NGFR)의 프로파일에 대한 형광 면역세포측정 분석을 나타낸다.
도 4는 인간 지방 조직으로부터 단리한 중간엽 줄기 세포에서의 IDO의 발현에 대한 염증 전 시약들과의 배양 효과를 나타낸다. A) RT-PCR에 의한 검출. B) 웨스턴 블럿에 의한 검출. IL-1, 인터류킨 1; TNF-α, 종양 괴사 인자-알파; LPS, 리포폴리사카라이드; IFN-γ, 인터페론-감마; C-, 음성 대조군; C+, 양성 대조군; n.i. IFN-γ에 의해 유도되지 않은 세포. 상기 RT-PCR의 로딩 대조군으로서 GAPDH(글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제)를 사용한다.
도 5는 ASC에 의해 발현된 표면 마커들의 프로파일에 대한 형광 면역세포측정 분석을 나타낸다. 아이소타입 대조군들(음성 대조군들)을 회색의 음영으로 나타낸다.
도 6은 IFNγ의 분비 및 PBMC의 증식에 대한 hASC의 자극 효과를 나타낸다.
도 7은 LPS 또는 CLP에 대한 hASC의 반응을 나타낸다: (A) 세포 생존; (B) 간, 장 및 폐의 사이토킨 및 케모킨 수준; (C) 복강을 침윤하는 염증 세포의 농도; (D) 단백질 추출물에서 MPO 활성을 측정함으로써 측정한, 표적 기관 중의 호중구 침윤을 매 12 시간마다 모니터하였다. n = 10 마우스/그룹. *p<0.001 대 대조군(LPS 단독 또는 CLP 단독).

본 발명에 사용된 바와 같이, 하기의 용어 및 어구들은 하기 나타낸 의미들을 가질 것이다. 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술, 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.

관사 "하나의"는 상기 관사의 문법적 목적어의 하나 또는 하나보다 많은(즉 하나 이상)을 지칭한다. 예로서, "하나의 원소"는 하나의 원소 또는 하나보다 많은 원소를 의미한다.

"약"이란 용어는 어떤 값과 관련하여 사용 시 상기 값±10%에 관한 것이다.

"지방 조직"은 임의의 지방 조직을 의미한다. 상기 지방 조직은 예를 들어 피하, 망막/내장, 유방, 생식샘 또는 다른 지방 조직 부위로부터 유래한 갈색 또는 백색의 지방 조직일 수 있다. 바람직하게는, 상기 지방 조직은 피하의 백색 지방 조직이다. 상기 지방 조직은 1 차 세포 배양물 또는 불멸화된 세포 주를 포함할 수 있다. 상기 지방 조직은 지방 조직을 갖는 임의의 유기체로부터의 것일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 지방 조직은 포유동물의 것이고, 추가의 실시태양에서 상기 지방 조직은 인간의 것이다. 지방 조직의 편리한 출처는 지방흡입술이다. 그러나, 상기 지방 조직의 출처도 지방 조직의 단리 방법도 본 발명에 중요한 것은 아님을 이해할 것이다. 본 발명에 개시된 바와 같은 세포가 환자에의 자가 이식을 목적으로 하는 경우, 상기 지방 조직은 상기 환자로부터 단리될 것이다.

"지방 조직-유래한 기질 줄기 세포(ASC)"는 지방 조직, 일반적으로 인간 지방 조직(hASC)으로부터 기원하는 MSC를 지칭한다.

"구조적으로"란 용어는 임의의 특정 유도 부재 하의 유전자의 발현을 의미하는 것으로 이해된다.

"배양"이란 용어는 배지에서의 세포, 유기체, 다세포 존재 또는 조직의 생육을 지칭한다. "배양하는"이란 용어는 상기와 같은 생육을 성취하는 임의의 수단을 지칭하며, 여러 단계를 포함할 수도 있다. "추가로 배양하는"이란 용어는 세포, 유기체, 다세포 존재 또는 조직을 특정한 생육 단계로 배양하고, 이어서 또 다른 배양 방법을 사용하여 상기 세포, 유기체, 다세포 존재 또는 조직을 또 다른 생육 단계로 가져가는 것을 지칭한다. "세포 배양"은 시험관 내 세포의 생육을 지칭한다. 상기와 같은 배양에서, 상기 세포는 증식하지만 조직 자체로 조직화하지 않는다. "조직 배양"은 시험관 내에서 조직, 예를 들어 근본 기관 또는 성인 기관의 외식체를 그의 구조 및 기능을 보존하도록 유지 또는 생육함을 지칭한다. "단층 배양"은 세포가 적합한 배지에서 주로 서로 및 기질에 부착하면서 번식하는 배양을 지칭한다. 더욱 또한, "현탁 배양"은 세포가 적합한 배지에서 현탁되면서 번식하는 배양을 지칭한다. 마찬가지로, "연속 흐름 배양"은 세포 생육, 즉 생육력을 유지시키기 위해서 새로운 배지의 연속적인 흐름 하에서 세포 또는 외식체를 배양함을 지칭한다. "처리된 배지"란 용어는 상등액, 예를 들어 배양된 세포/조직이 없는 것을 지칭하며, 배양된 세포와 일정 시간 접촉 후에 상기 배지는, 세포에 의해 생산되고 배양물 내로 분비된 특정한 주변분비 및/또는 자가분비 인자들을 포함하도록 변경된다. "합류 배양"은 모든 세포들이 접촉하고 있고 따라서 배양 용기의 전면을 덮는 세포 배양이며, 상기 세포들이 또한 그들의 최대 밀도에 도달했음을 의미하지만, 합류는 분열이 멈추거나 개체의 크기가 증가하지 않을 것임을 반드시 의미하는 것은 아니다.

"배양 배지" 또는 "배지"란 용어는 당해 분야에 인지되어 있으며, 일반적으로는 살아있는 세포의 배양에 사용되는 임의의 물질 또는 제제를 지칭한다. 세포 배양에 관하여 사용된 바와 같은 "배지"란 용어는 상기 세포 주변 환경의 성분들을 포함한다. 배지는 고체, 액체, 기체 또는 상과 물질의 혼합물일 수 있다. 배지는 액체 생육 배지뿐만 아니라 세포 생육을 지속시키지 않는 액체 배지를 포함한다. 배지는 또한 젤라틴 배지, 예를 들어 아가, 아가로스, 젤라틴 및 콜라겐 기질을 포함한다. 예시적인 기상 배지는 페트리 디쉬 또는 다른 고체 또는 반고체 지지체 상에서 생육하는 세포에 노출되는 기체 상을 포함한다. "배지"란 용어는 또한, 아직 세포와 접촉하지 않았다 하더라도, 세포 배양에 사용할 목적인 물질을 지칭한다. 즉, 세균 배양을 위해 준비된 영양소 풍부 액체가 배지이다. 유사하게, 물 또는 다른 액체와 혼합 시 세포 배양에 적합하게 되는 분말 혼합물을 "분말화된 배지"라 칭할 수도 있다. "합성 배지"는 화학적으로 한정된(대개는 정제된) 성분들로 제조된 배지를 지칭한다. "합성 배지"는 불충분하게 특성화된 생물학적 추출물들, 예를 들어 효모 추출물 및 육수를 함유하지 않는다. "풍부 배지"는 대부분의 또는 모든 생육 가능한 형태의 특정 종들의 생육을 지지하도록 설계된 배지를 포함한다. 풍부 배지는 종종 복합적인 생물학적 추출물들을 포함한다. "고 밀도 배양의 생육에 적합한 배지"는 다른 조건들(예를 들어 온도 및 산소 전달 속도)이 상기와 같은 생육을 허용하는 경우 세포 배양물이 3 이상의 OD600에 도달하도록 하는 임의의 배지이다. "기본 배지"란 용어는 임의의 특별한 영양소 보충이 필요하지 않은 다수 유형의 미생물의 생육을 촉진하는 배지를 지칭한다. 대부분의 기본 배지는 일반적으로 4 개의 기본적인 화학 그룹, 즉 아미노산, 탄수화물, 무기 염 및 비타민을 포함한다. 기본 배지는 일반적으로 혈청, 완충제, 생육 인자, 지질 등과 같은 보충물이 첨가되는, 보다 복잡한 배지의 토대로서 작용한다. 기본 배지의 예로는 비 제한적으로 이글 기본 배지, 최소 필수 배지, 둘베코의 변형된 이글 배지, 배지 199, 영양소 혼합물 햄(Ham)의 F-10 및 햄의 F-12, 맥코이(McCoy)의 5A, 둘베코의 MEM/F-I 2, RPMI 1640, 및 아이스코베(Iscove)의 변형된 둘베코의 배지(IMDM)가 있다.

"포함하다" 및 "포함하는"이란 용어는 총괄적이고 개방된 의미로 사용되며, 추가적인 요소들을 포함시킬 수도 있음을 의미한다.

본 발명에 사용된 "포함하여"란 용어는 "비 제한적으로 포함하여"를 의미한다. "포함하여" 및 "비 제한적으로 포함하여"는 호환적으로 사용된다.

"마커"는 존재, 농도, 활성 또는 인산화 상태가 검출될 수 있고 세포의 표현형을 식별하는데 사용되는 생물 분자를 지칭한다.

"중간엽 줄기 세포(MSC)"는 다분화능 줄기 세포이다, 즉 상기 세포는 다수의 상이한 유형들의 세포를 생성시킬 수 있는 세포이다. 상기 용어는 조골세포, 연골세포, 지방세포 또는 근세포 중 하나 이상으로 분화할 수 있는 세포를 지칭한다. MSC를 임의의 유형의 조직으로부터 단리할 수도 있다. 일반적으로 MSC는 골수, 지방 조직, 탯줄 또는 말초 혈액으로부터 단리될 것이다. 본 발명에 사용된 MSC는 일부 실시태양에서 골수(BM-MSC) 또는 지방 조직(ASC)으로부터 단리될 수 있다. 본 발명의 바람직한 태양에서, MSC를 자체가 지방 조직으로부터 수득된 지방기질세포로부터 수득한다.

상기 주제 방법에 의해 치료되는 "환자" 또는 "숙주"는 인간 또는 비 인간 동물을 의미할 수 있다.

"약학 조성물"이란 용어는 치료에 사용하고자 하는 조성물을 지칭한다. 본 발명의 조성물은 SIRS, 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크 및 패혈증-유사 질환들을 치료하는데 사용하고자 하는 약학 조성물이다. 본 발명의 조성물은 MSC 이외에, 비-세포 성분을 포함할 수도 있다. 상기와 같은 비-세포 성분의 예로는 비 제한적으로 단백질, 아미노산, 핵산, 뉴클레오타이드, 조효소, 산화방지제 및 금속 중 하나 이상을 포함할 수도 있는 세포 배양 배지가 있다.

본 발명에 사용된 "약학적으로 허용 가능한"이란 어구는 유효한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 이익/위험 비에 상응하는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여형을 지칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 어구는 주제 화합물을 하나의 기관, 또는 신체의 일부로부터 또 다른 기관, 또는 상기 신체의 일부로 운반하거나 수송함에 관련된, 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 상기 제형의 다른 성분들과 상용성이고 환자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다.

"표현형"이란 용어는 세포의 관찰 가능한 특징들, 예를 들어 크기, 형태, 단백질 발현 등을 지칭한다.

"전구 세포"란 용어는 자신보다 더 분화된 자손을 생산하는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 예를 들어, 상기 용어는 미분화된 세포, 또는 증식할 수 있고 다수의 모 세포를 생성시키는 능력을 갖는 전구 세포를 더 많이 생성시키고 차례로 분화되거나 분화 가능한 딸 세포를 생성시킬 수 있는 최종 분화가 모자라는 정도로 분화된 세포를 지칭할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 전구 세포란 용어는 후예(자손)가, 종종 상이한 방향으로, 분화에 의해, 예를 들어 배아 세포 및 조직의 점진적인 다변화에서 발생하는 바와 같이, 완전히 개별적인 특성을 획득함으로써 분화하는 일반화된 모 세포를 지칭한다. 세포 분화는 전형적으로는 다수의 세포 분열을 통해 발생하는 복잡한 과정이다. 분화된 세포는 다분화능 세포로부터 유래할 수 있고 상기 다분화능 세포 자신은 다분화능 세포로부터 유래할 수 있다 등이다. 이들 다분화능 세포들이 각각 줄기 세포를 고려할 수 있지만, 세포 유형 각각이 생성시킬 수 있는 범위는 상당히 다양할 수 있다. 일부 분화된 세포는 또한 보다 큰 발생 잠재력을 갖는 세포를 생성시키는 능력을 갖는다. 상기와 같은 능력은 타고나거나 또는 다양한 인자들로 처리 시 인위적으로 유도될 수 있다. 상기 정의에 의해, 줄기 세포는 또한 전구 세포일 뿐만 아니라 종말에 분화된 세포에 보다 직접적인 전구체일 수 있다.

"증식"은 세포 수의 증가를 지칭한다. "증식하는" 및 "증식"은 유사분열중인 세포를 지칭한다.

본 발명에서 "전신 염증 반응 증후군"(또는 "SIRS")이란 용어는 그의 통상적인 의미에 따라 사용되며, 감염원이 없는 전신의 염증 상태를 지칭한다. SIRS의 4 개의 주요 진단상 증상들이 존재하지만, 이들 중 임의의 2 개가 존재하면 진단에 충분하다(예를 들어 문헌[Nystrom(1998) Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 41, Suppl. A, 1-7]을 참조하시오).

"패혈증"이란 용어는 의심되거나 입증된 감염에 의해 유발되는 SIRS의 한 형태이다(예를 들어 문헌[Nystrom(1998) Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 41, Suppl. A, 1-7]을 참조하시오). 패혈증에 이르는 감염은 예를 들어 바이러스, 진균, 원생동물 또는 세균에 의해 유발될 수 있다.

"중증 패혈증"이란 용어는 기관 기능장애, 저관류 또는 저혈압과 관련된 패혈증을 지칭한다(예를 들어 문헌[Nystrom(1998) Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 41, Suppl. A, 1-7]을 참조하시오).

"패혈성 쇼크"란 용어는 관류 이상의 존재와 함께, 유체에 의한 적합한 소생에도 불구하고 저혈압(난치성 저혈압)을 갖는 패혈증을 지칭한다(예를 들어 문헌[Nystrom(1998) Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 41, Suppl. A, 1-7]을 참조하시오).

"패혈증-유사 질환"이란 용어는 환자가 패혈증 또는 패혈성 쇼크와 유사한 증상들을 나타내지만 염증 매개체의 캐스케이드 및/또는 혈류역학 매개변수들의 변화가 감염성 인자에 의해 주로 또는 초기에 유발되지 않는 상태를 지칭한다. 예를 들어 패혈증-유사 질환은 급성 또는 만성 간 부전 환자(문헌[Wasmuth HE, et al. J Hepatol. 2005 Feb; 42(2): 195-201]을 참조하시오), 심장 정지 후에 소생-후 질병을 앓고 있는 환자(문헌[Adrie C et al. Curr Opin Crit Care. 2004 Jun; 10(3): 208-12]을 참조하시오), 암 화학요법 후 패혈증-유사 증상을 앓고 있는 환자(문헌[Tsuji E et al. Int J Cancer. 2003 Nov 1; 107(2):303-8]을 참조하시오), 재조합 TNF-알파에 의한 온열의 격리된 수족 관류를 수행중인 환자(문헌[Zwaveling JH et al. Crit Care Med. 1996 May; 24(5): 765-70]을 참조하시오) 또는 신생아에서 패혈증-유사 질환(문헌[Griffin MP et al. Pediatr Res. 2003 Jun; 53(6): 920-6]을 참조하시오)에서 볼 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "용액"이란 용어는 본 발명에 사용된 MSC가 생육 가능하게 남는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.

"실질적으로 순수한"이란 용어는 MSC 집단에 관하여, 세포 수의 약 75% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상이 MSC인 세포 집단을 지칭한다. 즉, "실질적으로 순수한"이란 용어는 MSC 집단에 관하여, 계통 위탁 세포 수의 약 20% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만을 함유하는 세포 집단을 지칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "지지체"는 지방 조직-유래한 기질 줄기 세포의 생육을 위한 토대 또는 기반으로서 작용할 수 있는 임의의 장치 또는 물질을 지칭한다.

"치료제" 또는 "요법"은 숙주에 대해 목적하는 생물 효과를 가질 수 있는 작용제를 지칭한다. 화학요법제 및 유전자 독성제는 각각 생물학적과 상반되게, 기원이 화학적인 것으로 일반적으로 공지되거나, 또는 특정한 작용 기전에 의해 치료 효과를 일으키는 치료제의 예이다. 생물 기원 치료제의 예로는 생육 인자, 호르몬 및 사이토킨이 있다. 다양한 치료제들이 당해 분야에 공지되어 있으며 그들의 효과에 의해 식별될 수 있다. 몇몇 치료제는 세포 증식 및 분화를 조절할 수 있다. 예로서 화학요법적 뉴클레오타이드, 약물, 호르몬, 비-특이(비-항체) 단백질, 올리고뉴클레오타이드(예를 들어 표적 핵산 서열(예를 들어 mRNA 서열)에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드), 펩타이드, 및 펩타이드유사물질이 있다.

본 발명의 조성물은 실질적으로 순수한 MSC 집단 또는 그의 자손을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 세포 배양 성분, 예를 들어 아미노산, 금속 및 조효소 인자들 중 하나 이상을 포함하는 배양 배지를 또한 포함할 수도 있다. 상기 조성물은 다른 기질 세포의 소집단을 포함할 수도 있다. 상기 조성물은 또한 특정 환경 하에서, 예를 들어 이식, 연속 배양 하의 생육, 또는 생체적합물질 또는 조성물로서 사용 하에 상기 MSC의 생육 및 생존을 지지할 수 있는 다른 비-세포 성분들을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 세포의 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상이 MSC인 세포 집단을 포함할 수 있다. 즉, 일부 실시태양에서 상기 조성물 중의 세포의 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상이 MSC이다.

본 발명의 조성물은 수, 또는 상기 조성물의 중량 또는 부피에 의해 계산된, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 MSC를 포함할 수 있다.

상기 MSC는 마커 CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105 중 하나 이상(예를 들어 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상, 8 개 이상, 9 개 이상, 또는 10 개 이상)을 유의 수준으로 발현할 수 있다.

상기 MSC는 마커 CD9, CD44, CD54, CD90 및 CD105 중 하나 이상(예를 들어 2 개 이상, 3 개 이상, 또는 4 개 이상)을 발현할 수 있다. "발현된"이란 용어는 세포 내 마커의 존재를 개시하는데 사용된다. 발현되는 것으로 간주되기 위해서, 마커는 검출 가능한 수준으로 존재해야 한다. "검출 가능한 수준"은 상기 마커를 표준 실험 방법론 중 하나, 예를 들어 PCR, 블럿팅 또는 FACS 분석을 사용하여 검출할 수 있음을 의미한다. MSC 집단의 표현형 표면 마커 특성화를 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행할 수 있다. 예로서, 비 제한적으로 상기 표현형 특성화를 개별적인 세포 염색에 의해 수행할 수 있다. 상기와 같은 염색은 항체의 사용을 통해 성취될 수 있다. 이는 표지된 항체의 사용에 의한 직접 염색, 또는 상기 세포 마커에 특이적인 1 차 항체에 대한 2 차 표지 항체의 사용에 의한 간접 염색일 수 있다. 항체 결합을 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 검출할 수 있다. 항체 결합을 또한 유식 세포측정, 면역형광 현미경 검사 또는 방사선사진술에 의해 검출할 수 있다.

*한편으로 또는 또한, 유전자는 30 PCR 주기(이는 세포당 약 100 개 이상 사본의 세포 중 발현 수준에 상응한다) 후에 발현을 합리적으로 검출할 수 있는 경우 본 발명 집단의 세포에 의해 발현되는 것으로 간주된다. "발현되다" 및 "발현"이란 용어는 상응하는 의미를 갖는다. 상기 한계 아래의 발현 수준에서, 마커는 발현되지 않는 것으로 간주한다. 본 발명의 성인 줄기 세포 중의 마커의 발현 수준과 또 다른 세포, 예를 들어 배아 줄기 세포 중의 동일 마커의 발현 수준 간의 비교를 바람직하게는 동일한 종으로부터 단리된 2 개의 세포 유형을 비교함으로써 수행할 수 있다. 바람직하게는 상기 종은 포유동물이고, 보다 바람직하게는 상기 종은 인간이다. 상기와 같은 비교를 편의상 역 전사효소 폴리머라제 쇄 반응(RT-PCR) 실험을 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명에 사용된 MSC 세포 집단은 또한 상기 세포가 검출 가능한 수준으로 특정한 마커의 선택을 발현하지 않음을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 정의된 바와 같이, 상기 마커를 음성 마커라 한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 줄기 세포 집단은 상기 단리된 성인 줄기 세포 집단 세포의 약 70% 이상이 마커의 검출 가능한 발현을 나타내지 않는 경우 상기 마커를 발현하지 않는 것으로 간주한다. 다른 실시태양에서, 상기 줄기 세포 집단 세포의 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상 또는 약 97% 이상 또는 약 98% 이상 또는 약 99% 이상 또는 100%가 상기 마커의 어떠한 검출 가능한 발현도 보이지 않을 것이다. 다시, 검출 가능한 발현의 결여는 RT-PCR 실험의 사용을 통해 또는 FACS를 사용하여 입증될 수 있다.

따라서 본 발명의 조성물은 마커 CD34, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 및 CD133 중 하나 이상(예를 들어 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상, 8 개 이상, 9 개 이상 또는 10 개 이상)을 유의수준으로 발현하지 않는 MSC를 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상(세포의 수, 또는 조성물의 중량 또는 부피 기준으로) 포함할 수 있다.

따라서 본 발명의 조성물은 마커 CD11b, CD11c, CD14, CD31, CD34, CD45, CD133 및 HLAII 중 하나 이상(예를 들어 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상, 또는 8 개 이상)을 유의수준으로 발현하지 않는 MSC를 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상(세포의 수, 또는 조성물의 중량 또는 부피 기준으로) 포함할 수 있다.

따라서 본 발명의 조성물은 마커 c-키트, 비멘틴 및 CD90 중 하나 이상(예를 들어 2 개 이상 또는 3 개 전부)을 유의수준으로 발현하는 MSC를 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상(세포의 수, 또는 조성물의 중량 또는 부피 기준으로) 포함할 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 c-키트, 비멘틴 및 CD90을 유의수준으로 발현하는 세포를 95% 이상 포함한다.

본 발명의 조성물은 마커 CD34, 인자 VIII, 알파-액틴, 데스민, S-100 및 케라틴 중 하나 이상(예를 들어 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 또는 6 개 전부)을 유의수준으로 발현하지 않는 MSC를 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상(세포의 수, 또는 조성물의 중량 또는 부피 기준으로) 포함할 수 있다.

본 발명 조성물 중의 MSC의 농도는 약 1 x 10⁴ 세포/㎖ 이상, 약 1 x 10⁵ 세포/㎖ 이상, 약 1 x 10⁶ 세포/㎖ 이상, 약 10 x 10⁶ 세포/㎖ 이상 또는 약 40 x 10⁶ 세포/㎖ 이상일 수 있다.

일부 실시태양에서, 본 발명 조성물 중 MSC의 약 40% 이상(예를 들어 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상)을 이들의 증식 능력, 이동 능력, 생존 능력, 치료 효과 및 면역조절 성질 중 하나 이상을 향상시키기 위해서 예비-자극한다. 일부 실시태양에서, 예비-자극은 상기 MSC를 사이토킨과 접촉시킴으로써 성취될 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 예비-자극은 상기 MSC를 IFN-γ와 접촉시킴으로써 성취될 수 있다.

본 발명의 몇몇 실시태양에서, 상기 MSC를 0.1 내지 100 ng/㎖의 IFN-γ 농도를 사용하여 예비-자극할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기 MSC를 0.5 내지 85 ng/㎖, 1 내지 70 ng/㎖, 1.5 내지 50 ng/㎖, 2.5 내지 40 ng/㎖, 또는 3 내지 30 ng/㎖의 IFN-γ 농도를 사용하여 예비-자극할 수도 있다. 예비-자극은 약 12 시간보다 긴 자극 시간에 걸쳐 일어날 수 있다. 에비-자극은 약 13 시간보다 긴, 약 18 시간보다 긴, 약 24 시간보다 긴, 약 48 시간보다 긴, 또는 약 72 시간보다 긴 자극 시간에 걸쳐 일어날 수 있다.

본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 MSC는

a) 항원-제공 세포(APC)에 특이적인 마커를 발현하지 않고,

b) 인돌아민 2,3-다이옥시게나제(IDO)를 구조적으로 발현하지 않고,

c) 인터페론-감마(IFN-γ)로 자극 시 IDO를 발현함

을 특징으로 할 수 있다.

본 발명과 관련하여 유용한 MSC는 T 세포 활성화를 억제하는 능력을 갖는다. T 세포 활성화를 사이토킨 분비 및 T 세포 증식에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 MSC는 바람직하게는 부합하지 않는 PBMC와 함께 배양 시 IFNγ의 증식 또는 분비를 유도해내지 못한다. 본 발명의 MSC는 또한 IFNγ의 분비 및 초항원 SEB에 의한 PBMC 자극의 증식을 억제할 수 있다.

실시예에 상세히 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 MSC(이 경우, hASC)에 의한 처리는 네독소혈증의 마우스 모델에서 내독소 주입 및 맹장 천공에 의해 야기된 사망률에 대해, 용량-의존적인 방식으로, 보호하는 것으로 밝혀졌으며(도 7A), 상기 모델에서 무기력, 설사, 웅크림, 및 털세움(나타내지 않음)을 포함한 패혈증의 임상적 징후를 또한 약화시켰다. 패혈성 쇼크의 병인은 조직 손상, 다발성 장기 부전 및 사망에 이를 수 있는 압도된 염증 및 면역 반응을 특징으로 한다. 패혈증 동물에 대한 hASC의 투여는 염증 매개체의 수준을 감소시키고 패혈증 동안 주요 감염 기관에서 IL-10을 증가시켰다(도 7B). 따라서, 본 발명에 따라 사용된 MSC는 주요 기관들에서 TNFα, IL-6, IL-1β, IL-12, IFNγ, Rantes 및 MIP-2 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 개 전부를 포함한 염증 매개체들을 감소시킨다. 본 발명에 따라 사용된 MSC는 바람직하게는 또한 패혈증 동안 상기 주요 기관들에서 IL-10의 수준을 현저하게 증가시킨다. MSC에 의한 처리는 또한 염증 세포의 복강, 폐, 간 및 내장 내로의 침윤을 현저하게 감소시킬 것이다(도 7C & 7D 참조).

실시예들의 결과는 hASC가 상기 질환의 특징적인 악화된 염증 반응을 하향 조절함으로써 마우스를 내독소혈증 사망으로부터 보호함을 가리킨다. 마우스의 내독소혈증 사망으로부터의 보호는 투여된 세포 수의 증가에 따라 증가한다. 본 실시예에서 100만 세포/마우스의 투여 시, 상기 마우스의 60%가 생존하는 반면 세포를 받지 않은 마우스는 어느 것도 생존하지 못했다. 상기 생존율은 상기 마우스 내로 주입된 세포 수가 증가할 때 증가할 수 있다. 이들 실시예는 MSC, 특히 hASC가 SIRS, 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크 및 패혈증-유사 질환의 치료에 유용할 수도 있다는 증거를 제공한다.

본 발명의 조성물은 MSC의 자손을 함유할 수 있다. 상기와 같은 자손은 MSC의 후속 세대뿐만 아니라 상기 MSC의 분화를 유도함으로써 생성된 계통 위탁 세포를 포함할 수도 있다. 상기와 같은 분화를 시험관 내에서 유도할 수도 있다. 자손 세포를 모 집단으로부터 임의의 수의 계대배양 후에 획득할 수도 있음을 이해할 것이다. 그러나, 몇몇 실시태양에서, 상기 자손 세포를 상기 모 집단으로부터 약 2 회, 약 3 회, 약 4 회, 약 5 회, 약 6 회, 약 7 회, 약 8 회, 약 9 회, 또는 약 10 회의 계대배양 후에 획득할 수도 있다.

본 발명의 조성물을 멸균 조건 하에서 제공할 수 있으며, 상기 조성물은 바이러스, 세균 및 다른 병원균이 없을 수 있다. 본 발명의 조성물을 발열원이 없는 제제로서 제공할 수도 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 조성물을 전신 투여(예를 들어 직장, 코, 구강, 질에 의해, 이식된 저장기를 통해 또는 흡입을 통해)용으로 제조할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 조성물을 국소 투여용으로 제조할 수 있다. 본 발명의 조성물을 비 경구 경로에 의해 투여할 수도 있다. 조성물을 피하, 피 내, 정맥 내, 근육 내, 관절 내, 활액 내, 흉골 내, 경막 내, 병변 내, 림프 내 및 두개 내에 의해 투여할 수도 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명에 사용된 MSC는 치료하려는 환자에 대해 자기 조직일 수 있다. 추가의 실시태양에서, 본 발명에 사용된 MSC는 치료하려는 환자에 대해 동종 이계(allogeneic)이거나 이종일 수 있다. 선행의 연구들은 동종 이계 골수-유래한 기질 줄기 세포 및 지방 조직-유래한 기질 세포가 시험관 내에서 동종 이계 림프구와 접촉하게 되는 경우 림프구 면역 반응을 일으키지 않음을 입증하였다. 결과적으로, 공여체로부터 유래한 동종 이계 지방 조직-유래한 기질 줄기 세포를 이론적으로는, MHC 불친화성과 상관없이, 임의의 환자의 치료에 사용할 수 있다. 동종 이계 줄기 세포를 사용하는 실시태양에서, 지원이 되는 치료가 필요할 수도 있다. 예를 들어, 면역억제제를 공지된 방법에 따라, 이식편-대-숙주-병(GVHD)의 예방을 위한 치료 전, 치료 도중 및/또는 치료 후에 투여할 수 있다. 투여에 앞서, 상기 세포를 또한 당해 분야에 공지된 방법에 따라, 상기 환자로부터 상기 세포로의 면역 반응을 억제하도록 또는 이와 역으로 변경시킬 수도 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 조성물을 치료하려는 환자의 하나 이상의 표적 부위에 상기 조성물을 주입 또는 이식함으로써 투여할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 본 발명의 조성물을, 주입 또는 이식에 의해 상기 환자 내로 상기 조성물의 도입을 용이하게 하는 전달 장치에 의해 삽입할 수도 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 전달 장치는 카테터를 포함할 수도 있다. 추가의 실시태양에서, 상기 전달 장치는 주사기를 포함할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 일반적으로는 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제를 포함할 것이다. 상기와 같은 담체 및 희석제의 예는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 당, 예를 들어 락토오스, 글루코스 및 슈크로스; 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스, 및 그의 유도체, 예를 들어 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말화된 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 부형제, 예를 들어 코코아 버터 및 좌약 왁스; 오일, 예를 들어 땅콩유, 면실유, 잇꽃유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예를 들어 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스터, 예를 들어 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제, 예를 들어 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; 알긴산; 발열원이 없는 물; 등장성 염수; 링거액; 에틸 알콜; pH 완충 용액; 폴리에스터, 폴리카보네이트 및/또는 폴리무수물; 및 약학 제형에 사용되는 다른 무독성의 상용성 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 무균성이며 쉽게 주입 가능한 정도로 유동성일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 제조 및 보관 조건 하에서 안정성일 수 있으며 미생물, 예를 들어 세균 및 진균의 오염 작용에 대해, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살의 사용을 통해 보존될 수 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물은 하나 이상(또는 2 개 이상, 또는 3 개 이상, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5)의 추가의 치료제, 예를 들어 하기 중에서 선택된 치료제를 함유할 수도 있다: 진통제, 예를 들어 비스테로이드성 소염 약물, 아편제 작용물질 또는 살리실레이트; 감염 방지제, 예를 들어 구충제, 항혐기제, 항생제, 아미노글리코사이드 항생제, 항진균성 항생제, 세팔로스포린 항생제, 마크로리드 항생제, β-락탐 항생제, 페니실린 항생제, 퀴놀론 항생제, 설폰아미드 항생제, 테트라사이클린 항생제, 항마이코박테리아제, 항결핵성 항마이코박테리아제, 항원충제, 항말라리아성 항원충제, 항바이러스제, 항레트로바이러스제, 살개선제, 소염제, 코르티코스테로이드 소염제, 항소양성 마취제, 국소 항감염제, 항진균성 국소 항감염제, 항바이러스성 국소 항감염제; 전해성 신장 작용제, 예를 들어 산성화제, 알칼리화제, 이뇨제, 탄소성 탈수효소 억제제 이뇨제, 고리 이뇨제, 삼투성 이뇨제, 칼륨-절약 이뇨제, 티아지드 이뇨제, 전해질 보충제, 및 요산배설 촉진제; 효소, 예를 들어 췌장 효소 및 혈전용해 효소; 위장약, 예를 들어 설사억제제, 구토억제제, 위장 소염제, 살리실레이트 위장 소염제, 제산성 항궤양제, 위산-펌프 억제제 항궤양제, 위점막 항궤양제, H2-차단제 항궤양제, 담석용해제, 소화제, 구토제, 완하제 및 대변연화제, 및 위장관운동촉진제; 일반 마취제, 예를 들어 흡입 마취제, 할로겐화된 흡입 마취제, 정맥 내 마취제, 바비튜레이트 정맥 내 마취제, 벤조다이아제핀 정맥 내 마취제, 및 아편제 작용물질 정맥 내 마취제; 호르몬 또는 호르몬 변경제, 예를 들어 낙태약, 부신 호르몬제, 코르티코스테로이드 부신 호르몬제, 안드로젠, 항-안드로젠, 면역생물제, 예를 들어 면역글로불린, 면역억제제, 변성독소, 및 백신; 국소 마취제, 예를 들어 아미드 국소 마취제 및 에스터 국소 마취제; 근골격제, 예를 들어 항통풍성 소염제, 코르티코스테로이드 소염제, 금 화합물 소염제, 면역억제성 소염제, 비 스테로이드성 소염제(NSAID), 살리실레이트 소염제, 미네랄; 및 비타민, 예를 들어 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 및 비타민 K.

또 다른 실시태양에서, 추가의 치료제는 생육 인자, 또는 세포 증식 또는 활성화에 영향을 미치는 다른 분자일 수 있다. 추가의 실시태양에서 상기 생육 인자는 최종 분화를 유도할 수도 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 생육 인자는 천연 생육 인자의 변체 또는 단편일 수 있다. 상기와 같은 변체의 생성 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 보존적 아미노산 변화의 생성, 또는 돌연변이에 의해서 및 필요한 기능을 위해 생성되는 변체의 분석을 포함할 수 있다.

하나의 실시태양에서, MSC를 하나 이상(또는 2 개 이상, 또는 3 개 이상, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 또는 5 개)의 추가의 치료제와 함께 환자에게 투여할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 MSC 및 상기 하나 이상의 추가의 치료제를 상기 환자에게 동시에 투여할 수도 있다. 다른 실시태양에서, 상기 MSC 및 하나 이상의 추가의 치료제를 상기 환자에게 연속적으로 투여할 수도 있다. 상기 하나 이상의 추가의 치료제를 상기 MSC의 투여 전 또는 후에 투여할 수 있다.

MSC 및 임의의 추가의 치료제의 투여량은 환자의 증상, 연령 및 체중, 치료하거나 예방하려는 질환의 성질 및 중증도, 투여 경로, 및 상기 추가의 치료제의 형태에 따라 변할 것이다. 본 발명의 조성물을 단일 용량 또는 분할 용량으로 투여할 수 있다. MSC 및 임의의 추가의 치료제(들)의 적합한 투여량은 공지된 기법에 의해 결정될 수 있다.

주어진 환자에게서 가장 유효한 치료를 생성시키는 임의의 특정 작용제의 정확한 투여 시간 및 양은 상기 작용제의 활성, 약동학, 및 생물학적 이용 가능성, 환자의 생리 조건(연령, 성별, 질병 유형 및 단계, 일반적인 신체 조건, 주어진 약물의 투여량 및 유형에 대한 반응성), 투여 경로 등에 따라 다를 것이다. 본 발명에 제공된 정보를 상기 치료의 최적화, 예를 들어 최적 투여 시간 및/또는 양의 측정(단지 통상적인 실험만을 필요로 할 것이다), 예를 들어 상기 환자의 모니터링 및 투여랑 및/또는 타이밍의 조절에 사용할 수 있다. 상기 환자를 치료하는 동안, 상기 환자의 건강을 24-시간 주기 동안 소정의 시간에서 관련 지수 중 하나 이상을 측정함으로써 모니터할 수 있다. 투여량, 투여 시간 및 제형을 포함한 치료 섭생들을 상기와 같은 모니터링의 결과에 따라 최적화할 수 있다.

치료를 상기 최적 용량 미만의 보다 적은 투여량으로 시작할 수 있다. 그 후에, 상기 투여량을 최적의 치료 효과가 획득될 때까지 조금씩 증가시킬 수 있다.

여러 치료제의 병행 사용은 임의의 개별적인 성분에 필요한 투여량을 줄일 수 있는데, 그 이유는 상기 상이한 성분들의 효과의 개시 및 지속이 칭찬할만하기 때문이다. 상기와 같은 병행 요법에서, 상기 상이한 활성제들을 함께 또는 별도로, 및 동시에 및 당일 내에 상이한 시기에 전달할 수 있다.

본 발명 조성물의 제조 방법에 제한이 없고 임의의 방식으로 제조된 본 발명의 조성물이 본 발명의 범위 내에 포함됨은 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 MSC를 수거하고; (b) 효소 처리에 의해 세포 현탁액을 수득하고; (c) 상기 세포 현탁액을 침전시키고 배양 배지에 상기 세포를 재현탁하고; (d) 상기 세포를 약 10일 이상 배양하고; (g) 상기 세포를 2 회 이상 계대 배양하기 위해 팽창시킴을 포함하는, 본 발명 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 사용하기 위한 MSC를 본 발명의 조성물을 도입하려는 환자의 말초 혈액, 골수 또는 지방 조직으로부터 단리할 수 있다. 그러나, 상기 MSC를 또한 상기 환자와 동일하거나 상이한 종의 임의의 유기체로부터 단리할 수도 있다. MSC를 갖는 임의의 유기체는 잠재적인 후보일 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 유기체는 포유동물일 수 있고, 또 다른 실시태양에서 상기 유기체는 인간이다.

하나의 바람직한 실시태양에서, 지방-유래한 MSC를 필수적으로 문헌[Zuk et al., 2001]에 개시된 바와 같이 수득할 수 있다. 상기 방법에 따르면, 지방기질세포를 지방 조직 및 상기로부터 유래한 세포로부터 수득한다. 상기 방법의 과정 중에, 상기 세포를 바람직하게는 오염 세포찌꺼기 및 적혈구를 제거하기 위해, 바람직하게는 PBS로 세척할 수도 있다. 상기 세포를 바람직하게는 PBS 중의 콜라게나제로 절단한다(예를 들어 37 ℃에서 30 분간, 0.075% 콜라게나제; I형, Invitrogen, Carlsbad, CA). 나머지 적혈구를 제거하기 위해서, 상기 절단된 샘플을 세척하고(예를 들어 10% 소 태아 혈청으로), 160 mmol/L ClNH4로 처리하고, 최종적으로 DMEM 완전 배지(10% FBS, 2 mmol/L 글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM)에 현탁할 수 있다. 상기 세포를 40 ㎛ 나일론 메쉬를 통해 여과할 수 있다. 상기 방식으로 단리한 세포를 조직 배양 플라스크 상에 시딩하고(바람직하게는 2 내지 3 x 104 세포/cm2), 상기 배양 배지를 매 3 내지 4일마다 바꾸면서, 37 ℃ 및 5% CO2에서 팽창시킬 수 있다. 세포를 바람직하게는, 배양물이 90%의 합류율에 도달하면 새로운 배양 플라스크(1,000 세포/cm2)로 넘긴다.

몇몇 실시태양에서, 상기 세포를 약 15일 이상, 약 20일 이상, 약 25일 이상, 또는 약 30일 이상 배양할 수 있다. 배양물 중의 세포의 팽창은 상기 세포 집단에서 상기 세포 표현형의 동종성을 개선시킬 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 상기 세포를 3 회 이상 계대 배양을 위해 배양물에서 팽창시키거나 "3회 이상 계대 배양시킨다". 또 다른 실시태양에서, 상기 세포를 4 회 이상, 5 회 이상, 6 회 이상, 7 회 이상, 8 회 이상, 9 회 이상 또는 10 회 이상 계대 배양시킨다. 상기 세포를, 상기 세포 표현형의 동종성이 개선되고 차별적인 능력이 유지된다면 배양물에서 무한정 팽창시킬 수도 있다.

세포를 줄기 세포 배양 분야에 공지된 임의의 기법에 의해 배양할 수 있다. 다양한 배양 기법들뿐만 아니라 이들의 규모 확대에 대한 논의를 문헌[Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition, Wiley-Liss 2000]에서 찾을 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포를 단층 배양에 의해 배양한다. 조직 배양에서 MSC를 지원할 수 있는 임의의 배지를 사용할 수도 있다. 상기 MSC의 생육을 지원하는 배지 제형으로는 비 제한적으로 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM), 알파 변형된 최소 필수 배지(αMEM), 및 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트 미디어 1640(Roswell Park Memorial Institute Media 1640)(RPMI Media 1640)이 있다. 전형적으로, 0 내지 20%의 소 태아 혈청(FBS)을 상기 기질 세포의 생육을 지원하기 위해서 상기 배지에 첨가할 것이다. 그러나, 기질 세포 및 연골세포에 대한 FBS 중의 필수 생육 인자, 사이토킨, 및 호르몬이 확인되고 상기 생육 배지 중에 적합한 농도로 제공된다면 합성 배지를 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 배지는 하나 이상의 관심 화합물, 예를 들어 비 제한적으로 기질 세포에 대한 항생제, 유사분열 또는 분화 화합물을 함유할 수도 있다. 본 발명의 세포를 축축한 배양기에서 31 내지 37 ℃의 온도에서 생육시킬 수 있다. 이산화 탄소 함량을 2 내지 10%로 유지시키고 산소 함량을 1 내지 22%로 유지시킬 수 있다. 세포는 상기 환경에서 약 4 주까지의 기간 동안 남아있을 수 있다.

상기 배지에 첨가될 수 있는 항생제로는 비 제한적으로 페니실린 및 스트렙토마이신이 있다. 상기 화학 합성 배양 배지 중의 페니실린의 농도는 약 10 내지 약 200 단위/㎖일 수 있다. 상기 화학 합성 배양 배지 중의 스트렙토마이신의 농도는 약 10 내지 약 200 ug/㎖일 수 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 MSC를 플라스미드, 바이러스 또는 또 다른 벡터 전략을 사용하여 관심 핵산으로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염시키거나 형질도입시킬 수 있다. 관심 핵산은 비 제한적으로 회복시키려는 조직 유형, 예를 들어 장벽 또는 질벽에서 발견된 세포 외 기질 성분의 생산을 향상시키는 유전자 산물을 암호화하는 것들을 포함한다.

조절 유전자를 지니는 바이러스 벡터의 상기 기질 줄기 세포 내로의 형질도입을, 비 제한적으로 약 10:1 내지 2000:1의 감염 배수(바이러스 단위:세포)로 정제된(예를 들어 염화 세슘 띠 염색에 의해) 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노-관련된 바이러스를 포함하는 바이러스 벡터를 사용하여 수행할 수 있다. 세포를 양이온 세제, 예를 들어 폴리에틸렌이민 또는 리포펙타민^TM의 부재 또는 존재 하에서 약 1 내지 약 24 시간의 기간 동안 무 혈청 또는 혈청 함유 배지 중에서 상기 바이러스에 노출시킬 수 있다(Byk T. et al.(1998) Human Gene Therapy 9:2493-2502; Sommer B. et al.(1999) Calcif. Tissue Int. 64:45-49).

*벡터 또는 플라스미드를 줄기 세포로 운반하는 다른 적합한 방법들은 지질/DNA 복합체, 예를 들어 미국 특허 제 5,578,475; 5,627,175; 5,705,308; 5,744,335; 5,976,567; 6,020,202; 및 6,051,429 호에 개시된 것들을 포함한다. 적합한 시약은 리포펙타민, 멤브레인 여과된 수 중의 다중 양이온 지질 2,3-다이올레일옥시-N-[2(스페르민카복스-아미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄 트라이플루오로아세테이트(DOSPA)(화학 초록 등록명칭: N-[2-(2,5-비스[(3-아미노프로필)아미노]-1-옥스펜틸}아미노)에틸]-N,N-다이메틸-2,3-비스(9-옥타데세닐옥시)-1-프로판아미늄 트라이플루오로아세테이트), 및 중성 지질 다이올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)의 3:1(w/w) 리포솜 제형을 포함한다. 예로서 리포펙타민 2000 TM 제형(Gibco/Life Technologies # 11668019로부터 입수할 수 있다)이 있다. 다른 시약으로는 FuGENETM 6 형질감염 시약(80% 에탄올 중의 비-리포솜 형태의 지질과 다른 화합물과의 블렌드, Roche Diagnostics Corp. # 1814443으로부터 수득할 수 있다); 및 LipoTAXITM 형질감염 시약(Invitrogen Corp.로부터의 지질 제형, #204110)이 있다. 줄기 세포의 형질감염을 예를 들어 문헌[M.L. Roach and J.D. McNeish(2002) Methods in Mol. Biol. 185:1]에 개시된 바와 같이, 일렉트로포레이션에 의해 수행할 수 있다. 안정한 유전자 변경을 갖는 줄기 세포의 생산에 적합한 바이러스 벡터 시스템은 아데노바이러스 및 레트로바이러스를 기본으로 할 수 있으며, 상업적으로 입수할 수 있는 바이러스 성분을 사용하여 제조할 수 있다.

조절 유전자를 지니는 플라스미드 벡터의 상기 MSC 내로의 형질감염을 칼슘 포스페이트 DNA 침전 또는 양이온 세제 방법(리포펙타민^TM, DOTAP)의 사용에 의한 단층 배양으로, 또는 플라스미드 DNA 벡터의 생체적합성 중합체 내로의 직접적인 통합에 의한 3차원 배양(Bonadio J. et al.(1999) Nat. Med. 5:753-759)으로 성취할 수 있다.

상기 유전자에 의해 암호화된 작용성 단백질의 추적 및 검출을 위해서, 상기 바이러스 또는 플라스미드 DNA 벡터는 쉽게 검출할 수 있는 마커 유전자, 예를 들어 그린 형광 단백질 또는 베타-갈락토시다제 효소(이들 둘 모두 조직화학적 수단에 의해 추적할 수 있다)를 함유할 수 있다.

이제 본 발명을 하기의 실시예에 의해 추가로 예시할 것이다. 이들 실시예는 단지 예시에 의해 제공되며 제한을 의도하지는 않는다.

실시예

1. 물질 및 방법 - 세포 제제

1.1 중간엽 줄기 세포( MSC )

인간 지방-유래한 MSC(hASC)를 필수적으로 개시된 바와 같이(Zuk et al 2001) 수득하고 WO2006/037649에 개시된 바와 같이 필수적으로 제조하였다. 간략히, 인간 지방 조직으로부터 수득한 지방기질세포를 BPS로 2 회 세척하여 오염 세포찌꺼기 및 적혈구를 제거하고, 37 ℃에서 30 분간 PBS 중의 0.075% 콜라게나제(I형, Invitrogen, Carlsbad, CA)로 절단하였다. 상기 절단된 샘플을 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 세척하고, 160 mmol/L ClNH₄로 처리하여 남아있는 적혈구를 제거하고, DMEM 완전 배지(10% FBS, 2 mmol/L 글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM)에 현탁하고 40 ㎛ 나일론 메쉬를 통해 여과하였다. 세포를 조직 배양 플라스크 상에 시딩하고(2 내지 3 x 10⁴ 세포/㎠), 상기 배양 배지를 매 3 내지 4일마다 바꾸면서, 37 ℃ 및 5% CO₂에서 팽창시켰다. 세포를 배양물이 90%의 합류율에 도달했을 때 새로운 배양 플라스크(1,000 세포/㎠)로 넘겼다. 6 내지 9 회의 집단 계대를 갖는 총 6 개의 상이한 샘플을 상기 연구에 사용하였다.

1.1.1 인터페론-감마(IFN-γ)에 의한 인돌아민 2,3-다이옥시게나제(IDO)의 유도

MSC를 인간 지방 조직(ASC)으로부터 단리하고, 조직 배양 플레이트 상에 10,000 세포/㎠의 밀도로 시딩하고, 앞서 세포 팽창에 대해 개시한 조건에서 48 시간 동안 배양하였다. 하기의 염증성 자극을 도 4에 도시된 바와 같이 상기 세포의 일부에 가하였다:

·인터류킨-1(IL-1): 3 ng/㎖

·인터페론-감마(IFN-γ): 3 ng/㎖

·종양 괴사 인자-알파(TNF-α): 5 ng/㎖

·리포폴리사카라이드(LPS): 100 ng/㎖

상기 세포를 30 분 내지 48 시간 범위의 기간 동안 상응하는 자극의 존재 하에서 배양하고, 이어서 트립신 절단에 의해 수거하고, 프로테아제 억제제를 함유하는 RIPA 완충액(50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF(페닐-메틸설포닐플루오라이드), 1 mM EDTA(에틸렌다이아민테트라아세트산), 5 ㎍/㎖ 아프로티닌, 5 ㎍/㎖ 류펩틴, 1% 트리톤 x-100, 1% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS)에 용해시켰다. 세포 용해물에 대해 IDO-특이성 단클론 항체(마우스 단클론 IgG, 클론 10.1, Upstate cell signaling solutions로부터)를 사용하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. RNA를 상기 처리된 세포로부터 단리하고, 상기 IDO cDNA(GenBank 수탁 번호 M34455(GI:185790))에 특이적인 프라이머를 사용하여 역 전사-폴리머라제 쇄 반응(RT-PCR)에 의해 분석하였다.

순 방향: 5' GGATTCTTCCTGGTCTCTCTATTGG 3'

역 방향: 5' CGGACTGAGGGATTTGACTCTAATG 3'

1.1.2 개선된 동종성을 갖는 지방기질세포로부터 줄기 세포의 제조

세포를 24-웰 플레이트에서 유리 커버 슬립 상에 DMEM + 10% FBS 중에 저 밀도로 도말하였다. 세포를 PBS로 세척하고 -20 ℃에서 10 분간 아세톤에 고정시켰다. α-액틴의 염색을 위해서, 세포를 RT에서 10 분간 4% 파라포름알데하이드에 고정시켰다. 4% 염소 혈청 및 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 차단한 후에, 세포를 4 ℃에서 밤새 하기 세포 마커에 대한 1 차 항체와 지시된 희석비로 배양하였다: (i) 알파-액틴; Dako, Glostrup, Denmark; 1/50; (ii) 비멘틴; Sigma, St. Louis, USA; 1/200; (iii) CD90; CYMBUS, Biotechnology LTD, Chandlers Ford, Hants, UK; 1/50; (iv) 인자 VIII; Dako; 1/100; (v) CD 34; Chemicon, CA, USA; 1/100; (vi) c-키트; Chemicon; 1/100; (vii) 데스민; Dako; 1/100; (viii) 사이토케라틴; Dako; 1/100 및 (ix) S-100; Dako; 1/50. 이어서 세포를 적합한 형광 아이소티오시아네이트(FITC)-접합되거나 또는 테트라메틸로다민 아이소티오시아네이트 클로라이드(TRITC)-접합 2 차 항체(Sigma; 1/50)와 함께 RT에서 45 분간 배양하였다. 핵을 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 카운터염색하고, 세포를 모바이글로우(Mobiglow)(MoBiTec, Gottingen, Germany)에 올려놓고 형광 현미경 이클립스(Eclipse) TE300(Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 각각의 경우에, 면역양성 세포의 수를 측정하고 염색된 핵의 수와 비교하였다. 랜덤하게 선택된 시야를 Spotl 카메라(Diagnostic Instruments Inc., Tampa, FL, USA)를 통해 컴퓨터(MacIntosh G3; Apple Computer Inc., Cupertino, Ca, USA)로 보냈다. 인간 대동맥 평활근 세포, 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 및 인간 활액 섬유아세포를 다양한 항체들에 의한 면역염색을 위한 양성 대조군으로서 사용하였다.

계대 1에서, 고 농도(90 내지 95%)의 지방-유래한 기질 줄기 세포는 중간엽 세포골격 세포의 마커인 비멘틴을 발현하였다(도 1). 비멘틴의 발현은 계대 9를 포함하여 상기 계대 9까지 동일한 수준을 유지하였다. 다른 마커들의 수준은 시간에 따라 떨어졌다. 예를 들어, 계대 1에서 LPA-유래한 세포의 17%에서 발견된 α-액틴은 계대 7에서는 더 이상 검출할 수 없었다. 내피 세포의 마커, 폰 빌레브란트 인자(인자 VIII) 및 CD34(또한 내피 세포의 표면상에서 발견된다)는 단지 계대 1 내지 3에서 검출되었다(각각 7% 및 12% 면역양성 세포). 대조적으로, 세포 증식의 마커인 c-키트(CD117)의 발현은 시간에 따라 증가하였으며, 계대 4로부터 전방으로 99% 면역양성 세포를 갖는다(도 2). 초기에 LPA-유래한 세포의 대략 80%에서 발현된 섬유아세포 마커 CD90은 계대 6으로부터 세포의 99%에서 발견되었다. 신경외배엽 마커 S100 또는 외배엽 마커 케라틴의 발현은 LPA-유래한 세포 중 어느 것에서도 어느 때도 관찰되지 않았다. 계대 수의 증가에 따라 관찰된 마커의 변화는 상기 수득된 세포 제제의 동종성의 증가를 가리킨다.

세포 생육을 정량분석하기 위해서, 세포를 5 x 10³ 세포/㎠의 농도로 24-웰 플레이트에 도말하였다. 세포를 기층에 부착시킨 후에(3 시간), 배양 배지를 1% 항생제 + 0.5%, 2%, 5% 또는 10% FBS가 보충된 DMEM으로 교체하였다. 혈청의 각 배치의 시험을 위한 양성 대조군으로서, 인간 지방-유래한 기질 줄기 세포를 또한 배양하고 그의 생육 속도를 측정하였다. 배지를 매 2일마다 교체하였다. 24 시간의 간격 후에, 세포를 1% 글루타르알데하이드로 고정시키고, 웰 당 세포 수를 크리스탈 바이올렛에 의한 핵 염색에 의해 측정하고, 595 ㎚에서 흡광도를 모니터하였다. 표준 곡선을 작성하여 웰 당 세포 수와 595 ㎚에서의 흡광도 간의 관계를 확립시켰다(r² = 0.99).

보다 표준화되고 덜 주관적인 방식으로 상기 세포를 분석하기 위해서, 상기 세포에 대해 형광 활성화된 세포 분류기(FACS) 분석을 또한 수행하였다. 일반적으로, 상기 유식 세포측정 분석은 형광 마커에 직접(공유적으로) 또는 간접(2차 형광-표지된 항체) 결합되는 항체에 의한 표면 항원의 검출을 허용한다. 다른 한편으로, 상술한 면역조직화학 분석은 상기 세포의 투과성 및 후속적인 항체 결합을 필요로 한다. 따라서, 후자는 표적 단백질 및 항체에 따라 개별적으로 최적화된 프로토콜을 필요로 한다. 더욱이, 상기 세포막의 투과성으로 인해, 내부적으로 및 외부적으로 발현된 마커 단백질들을 구별하는 것이 가능하지 않다.

표면 항원의 검출을 위해 면역세포측정에 사용되는 프로토콜을 표준화하며, 이는 단지 적합한 음성 대조군만을 필요로 한다. 더욱이, 상기 FACS 분석은 양성 세포의 퍼센트 및 발현 수준의 평가를 허용한다. 상기 평가는 면역조직화학을 사용하는 주관적인 성질의 것일 뿐이며, 실험마다 다양할 수 있고, 이는 상기 FACS 분석의 경우 발생하지 않는다.

상기 세포의 상기와 같은 면역표현형에 의한 특성화를 새로 단리한 세포에서, 배양 기간 후에, 예를 들어 7일, 4주 및 3개월 배양 후에 수행할 수 있다. 상이한 시기에서의 표면 마커들의 분석은 배양 중 상기 표현형의 동종성 평가를 허용한다. 배양 0 개월 내지 3 개월째에 3 명의 건강한 공여자로부터 수득한 샘플로부터 수득한 표현형을 설명하는 상기 분석 및 데이터의 예가 2005년 2월 25일자로 출원된 미국 특허 출원 제 11/065,461 호(상기는 본 발명에 참고로 인용되어 있다)에 충분히 개시되어 있다.

상술한 방법에 의해 단리 후, 상기 환자 중 한 명으로부터의 지방-유래한 기질 줄기 세포를 일련의 표면 마커의 존재/부재에 의해 특성화하였다. 이를 하기 위해서, 하기 표면 마커들의 발현을 유식 세포측정에 의해 모니터하였다:

인테그린: CD11b, CD18, CD29, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD61, CD04.

조혈 마커; CD3, CD9, CD10, CD13, CD16, CD14, CD19, CD28, CD34, CD38, CD45, CD90, CD133, 글리코포린.

생육 인자 수용체: CD105, NGFR.

세포 외 기질 수용체: CD15, CD31, CD44, CD50, CD54, CD62E, CD62I, CD62P, CD102, CD106, CD146, CD166.

기타: CD36, CD55, CD56, CD58, CD59, CD95, HLA-I, HLA-II, β2-마이크로글로불린.

특성화하려는 세포를 트립신에 의한 온화한 절단에 의해 수거하고, PBS로 세척하고, 분석하려는 표면 마커 각각에 대한 플루오레세인(FITC) 또는 피코에리쓰린(PE) 표지된 항체 마커와 함께 4 ℃에서 30 분간 배양하였다. 상기 세포 마커들을 세척하고 에픽스(Epics)-XL 세포측정기(Coulter)를 사용하여 바로 분석하였다. 대조군으로서, 세포를 FITC 또는 PE로 표지된 상응하는 동위원소의 비특이성 항체로 염색하였다. 상기 표면 마커들의 발현 프로파일의 분석으로부터(도 3A/3B), 마커가 세포 집단을 한정하고 이를 다른 유형의 세포들에 대해 식별되고 분화될 수 있게 하는 것을 측정하는데 사용되는 기준은 하기와 같았다:

1. 2005년 2월 25일자로 출원된 미국 특허 출원 제 11/065,461 호(본 발명에 참고로 인용된다)에서 건강한 공여자의 지방-유래한 기질 줄기 세포를 사용하여 수행된 실험에서 배양 중 샘플에 따라 또는 시간에 따라 변화하는 마커들은 버린다.

2. 마커들을 그들의 생물학적 관련성의 함수로서 선택하고, 특정한 세포 유형의 특징적인 마커는 버린다(예를 들어 CD3은 림프구에 독점적인 마커이다).

*상기 기준을 적용하여, 다분화능 줄기 세포 집단을 CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105의 발현에 대해 양성이고; CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 및 CD133의 발현 결여로서 특성화한다.

1.2 말초 혈액 단핵 세포( PBMC )

PBMC를 Ficoll-Hypaque 구배(실온에서 20 분, 2000 rpm)로 밀도 침전에 의해 건강한 지원자의 전혈로부터 유래한 버피 코트 제제로부터 단리하였다. 상기 구배 계면으로부터 회수한 세포를 RPMI 1640 완전 배지(8% 인간 AB 혈청, 2 mM L-글루타민, 1% 나트륨 피루베이트, 1% 불필수 아미노산, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% 2-머캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640 배지이다)에서 2 회 세척하고 배양 또는 추가의 정제에 바로 사용하였다. T 세포를 단리하기 위해서, PBMC를 4 ℃에서 1 시간 동안 항-CD8, -CD14, -CD19, -CD20 및 -CD56 mAb(모두 Coulter Immunotech로부터)와의 배양에 의해 유착 세포로부터 고갈시킨 다음, 항-마우스 IgG-코팅된 자기 비드와 함께 4 ℃에서 1 시간 동안 배양시켰다. 비드-결합된 세포를 자기 장치에 의해 PBMC로부터 제거하였다. 세포의 자극을 최소화하기 위해서, 모든 정제 단계를 혈청 부재 하에서 수행하였다. T 세포의 순도는 유식 세포측정에 의해 평가 시 >96%이었다. CD4+ T 세포를 CD4 단리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 전체 PBMC로부터 음성 선택에 의해 단리하여, 94 내지 98%의 순도를 갖는 CD4+ 세포 집단을 제공하였다.

1.3 세포 배양

CD4+ T 세포(5x104) 및 다양한 수의 단핵구, DC, 또는 전체 PBMC를 평면 바닥 96-웰 플레이트(Corning, Corning, NY)에서 초항원 스타필로코커스 장독소 E(SEB, 1 ng/㎖, Sigma)의 존재 또는 부재 하에서 및 지시된 수의 hASC의 존재 또는 부재 하에서 배양하였다. 72 내지 96 시간 배양 후에, 세포 증식을 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics) GmbH(Mannheim, Germany)로부터의 세포 증식 분석(BrdU)을 사용하여 평가하였다. 배양 상등액 중의 사이토킨 함량을 하기와 같이 특정한 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 일부 배양을 TGFβ(10 ㎍/㎖) 또는 IL-10(10 ㎍/㎖), 인도메타신(20 μmol/L) 또는 재조합 TNFα(20 ng/㎖) 또는 IFNγ(200 ng/㎖)(모두 BD Pharmingen, San Jose, CA and R&D Systems, Minneapolis, MN으로부터)에 대한 중화 항체의 존재 하에서 수행하였다. 상기 억제 반응의 세포-접촉 의존성을 측정하기 위해서, SEB-자극된 PBMC(105)를 트랜스웰(Transwell) 시스템(Millipore, 0.4 ㎛ 기공)의 상부 삽입물에 놓고, hASC(2 x 10⁴)을 하부 웰에서 조사된(30 Gy) 세 번째-부분 PBMC(5 x 10⁴)의 부재 또는 존재 하에 놓았다. 4일째에, 상기 상부 구획 중의 PBMC의 증식 반응을 측정하였다. hASC 배양물로부터 상등액을 생성시키기 위해서, hASC(10⁵)를 25-㎠ 플라스크에서 24 시간 동안 TNFα(20 ng/㎖), IFNγ(200 ng/㎖) 또는 이들 모두로 자극하거나 또는 동종 이계 PBMC(2 x 10⁶)로 4일간 자극하였다. 상기 상등액들을 모으고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하고, SEB-활성화된 PBMC 배양물에 가하였다.

hASC의 존재 하에서 생성된 T 세포의 억제 능력을 측정하기 위해서, T 세포를 자기 비드-표지된 항-CD3 단클론 항체(Miltenyi Biotec)를 사용한 양성 면역자기 선택에 의해 4일 후에 SEB-활성화된 ASC-PBMC 배양물로부터 단리하였다. 생육 가능한 세포를 림포프레프(Lymphoprep)(Nycomed Pharma AS)와의 밀도 구배 원심분리에 의해 회수하고 IL-2(20 U/㎖)가 보충된 RPMI 완전 배지에서 2일간 안정시키고, 항-CD3 항체(5 ㎍/㎖)로 자극한 T 세포에 2차 배양물 중의 상이한 비로 가하였다.

1.4 MSC 의 특성화

세포 특성화를 1 내지 25 회의 계대 배양 세포를 사용하여 수행하였다. 지방 조직으로부터의 세포를 하기를 포함한 일련의 표면 마커의 존재/부재에 대해 형광 마커(즉, 형광 면역세포측정에 의해)로 표지한 항체를 사용하여 유식 세포측정에 의해 분석하였다:

-항원 제공 세포(APC)의 마커: CD11b, CD11c, CD14, CD45 및 HLAII.

-내피세포의 마커: CD31.

-기타 마커: CD9, CD34, CD90, CD44, CD54, CD105 및 CD133.

상기 유식 세포측정 분석에 사용된 항체는 하기와 같았다:

-CD9: 클론 MM2/57 마우스 IgG2b - FITC 표지된 항체(Serotec);

-CD11b: 클론 ICRF44 마우스 IgG1 - FITC 표지된 항체(Serotec);

-CD11c: 클론 BU15 마우스 IgG1 - FITC 표지된 항체(Serotec);

-CD14: 클론 UCHM1 마우스 IgG2a - FITC 표지된 항체(Serotec);

-CD31: 클론 WM59 마우스 IgG1 - FITC 표지된 항체(Serotec);

-CD34: 클론 QBEND 10 마우스 IgG1 - FITC 표지된 항체(Serotec);

-CD44: 클론 F10-44-2 마우스 IgG2a - FITC 표지된 항체(Serotec);

-CD45: 클론 F10-89-4 마우스 IgG2a - FITC 표지된 항체(Serotec);

-CD54: 클론 15.2 마우스 IgG1 - FITC 표지된 항체(Serotec);

-CD90: 클론 F15-42-1 마우스 IgG1 - FITC 표지된 항체(Serotec);

-CD105: 클론 SN6 마우스 IgG1 - FITC 표지된 항체(Serotec); 및

-항 인간 HLA II 부류 DP, DQ, DR: 클론 WR18 마우스 IgG2a - FITC 표지된 항체(Serotec);

-CD133: 클론 293C3 마우스 IgG2b - PE 표지된 항체(Miltenyi Biotec).

상기 분석된 세포들(도 5)은 CD9, CD44, CD54, CD90 및 CD105의 경우 양성이고, CD11b, CD11c, CD14, CD31, CD34, CD45, CD133 및 HLAII의 경우 음성이었다. 상기 세포들은 내피 또는 APC 계통에 특이적인 상기 시험된 마커들 모두(CD11b, CD11c, CD14, CD45 및 HLAII)의 경우 음성이었다.

1.5 사이토킨 및 호르몬 측정

결장 점막에서 사이토킨 측정을 위해, 단백질 추출물을 0.5 mmol/L DTT, 및 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 펩스타틴 및 류펩틴(Sigma)을 함유하는 프로테이나제 억제제의 칵테일 10 ㎍/㎖과 함께, 50 mmol/L 트리스-HCl, pH 7.4 중의 결장 분절(50 ㎎ 조직/㎖)의 균질화에 의해 단리하였다. 샘플을 30,000 g에서 20 분간 원심분리하고 사이토킨 측정시까지 -80 ℃에서 보관하였다. 상기 혈청, 결장 단백질 추출물 및 배양 상등액 중의 사이토킨, 케모킨 및 HGF 수준을 제조사의 권장에 따라 BD 파밍겐(San Diego, CA) 및 R&D 시스템스(Minneapolis, MN)로부터의 포착/비오틴화된 검출 Ab를 사용하여 특이적 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 배양 상등액 중의 PGE₂ 및 HGF 수준을 경쟁적인 효소 면역분석 키트(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI)를 사용하여 측정하였다. 자극된 MLN 세포 중의 사이토킨의 세포 내 분석을 위해서, 10⁶ 세포/㎖을 모멘신의 존재 하에서 PMA(10 ng/㎖) + 이오노마이신(20 ng/㎖)으로 8 시간 동안 자극하였다. 세포를 4 ℃에서 30 분간 PerCP-항-CD4 mAb로 염색하고, 세척하고, 사이토픽스/사이토펌(Cytofix/Cytoperm)(Becton Dickinson)으로 고정시키고/사포닌 투과성으로 만들고, 0.5 ㎍/FITC- 및 PE-접합된 항-사이토킨 특이적 mAb(BD Pharmingen)의 샘플로 염색하고, FACScalibur 유식 세포측정기 상에서 분석하였다. 단핵구/대식세포와 T 세포 공급원을 구별하기 위해서, 세포 내 사이토킨 분석을 상기 PerCP-표지된 CD4 T 세포 집단에서 독점적으로 수행하였다.

1.6 마이엘로퍼옥시다제 분석

결장에서의 호중구 침윤을 앞서 개시된 바와 같이(Buras et al.(2005) Nature Reviews: Drug Discovery 4(10), 854-865) 마이엘로퍼옥시다제(MPO) 활성을 측정함으로써 모니터하였다. 간략히, 결장 분절을 0.5% 헥사데실트라이메틸암모늄 브로마이드가 있는 포스페이트 완충액(50 mmol/L, pH 6.0) 중에 50 ㎎/㎖로 균질화하였다. 샘플을 3 회 동결 및 해동시키고, 30,000 g에서 20 분간 원심분리하였다. 상등액을 0.167 ㎎/㎖ o-다이아니시딘(Sigma) 및 0.0005% H₂O₂가 있는 50 mmol/L 포스페이트 완충액 pH 6.0의 분석 완충액으로 1:30 희석하고, 비색분석 반응을 분광광도계(Beckman Instruments, Irvine, CA)에서 1 내지 3 분간 450 ㎚에서 측정하였다. 습윤 조직의 그램당 MPO 활성을 하기와 같이 계산하였다: MPO 활성(U/g 습윤 조직) = (A₄₅₀)(13.5)/조직 중량(g)(여기에서 A₄₅₀은 상기 반응의 개시 후 1 내지 3 분째에 450 ㎚의 흡광도 변화이다). 상기 계수 13.5는 1U MPO 활성이 1 μmol 퍼옥시다제/분을 감소시키는 효소의 양을 나타내도록 실험적으로 측정되었다.

1.7 통계학적 분석

모든 결과를 그룹당 n 실험 또는 마우스의 평균±SD로서 나타낸다. 통계적 유의수준에 대한 비모수 데이터를 비교하기 위한 만-휘트니 U-시험을 모든 임상 결과 및 세포-배양 실험에 적용하였다. 체중 변화를 윌콕슨 합치된-부호 순위 검정을 사용하여 비교하였다. 생존을 카플란-마이어 로그 순위 검정에 의해 분석하였다. P<0.05를 유의수준으로 간주하였다.

2. 실시예 1 - hASC 는 효능 있는 면역조절 활성을 나타낸다

본 연구에서 T-세포 활성화를 억제하는 hASC의 능력을 사이토킨 분비 및 T-세포 증식에 의해 측정된 바와 같이 시험하였다. hASC는 합치되지 않은 PBMC(나타내지 않음)와 함께 배양 시 IFNγ의 증식 또는 분비를 유도해내지 못했다. 더욱이, hASC는 IFNγ의 분비를 현저하게 억제하였으며 PBMC의 증식은 초항원 SEB에 의해 자극되었다(도 6). 상기 억제 효과는 상기 공-배양물에 첨가된 hASC의 수와 직접적으로 상관이 있으며(도 6), SEB의 농도에 의존하지 않았다(나타내지 않음).

3. 실시예 2 - LPS 및 CLP (맹장 결찰 및 천공)에 의한 SIRS 의 유도

내독소혈증을 유도하기 위해서, Balb/c 마우스에게 LPS(400 ㎍/마우스)를 i.p. 주입하였다. 마우스를 LPS 주입 후 30 분째에 배지 또는 hASC(지시될 때 10⁵ 내지 10⁶ 세포)로 i.p. 처리하였다. 동물들을 생존 및 다른 임상적 징후, 예를 들어 곤두선 털, 무기력, 설사의 기색, 체중 손실에 대해 매 12 시간마다 모니터하였다. 일부 동물을 LPS 주입 후 상이한 시기에 죽이고, 혈액 샘플을 심장 천자에 의해 채혈하고, 복막 삼출액, 간, 폐 및 소장을 수거하였다. 조직 시편을 단백질 추출 및 사이토킨 측정, 및 MPO 활성 측정을 위해 액체 질소에서 바로 동결시켰다. 상기 복막 현탁액을 1800 g에서 5 분간 원심분리하고, 복막 세포를 카운트하고 PBS/3 mmol/L EDTA 배지로 3 x 10⁶ 세포/㎖로 조절하였다. 상이한 복막 부분 모집단 중의 생육 가능한 세포의 수를 유식 세포측정(FACScan; BD Biosciences, Mountain View, CA)에 의해 측정하였다. 간략히, 복막 림프구, 대식세포 및 호중구를 이들의 상이한 전방 산란 및 측면 산란 특징에 따라 분류하고 카운트하였다.

고-용량 LPS에 의해 유도된 내독소혈증의 모델 이외에, 복막염의 CLP 모델을 사용하였는데, 그 이유는 상기가 인간 패혈증 및 중증 패혈증의 임의의 새로운 치료에 중요한 임상 전 시험의 가장 신뢰할만한 실험 모델인 것으로 생각되기 때문이다.

hASC에 의한 처리는 내독소 주입 및 맹장 천공에 의해 유발된 사망에 대해 용량-의존적인 방식으로 보호하고(도 7A) 무기력, 설사, 웅크림 및 털세움(나타내지 않음)을 포함하여, 패혈증의 임상적 징후를 약화시켰다. 패혈성 쇼크의 병인은 조직 손상, 다발성 장기 부전 및 사망에 이를 수 있는 압도된 염증 및 면역 반응을 특징으로 한다. 패혈증 동물에 대한 hASC의 투여는 패혈증 중에 주요 감염 기관에서 염증 매개체(TNFα, IL-6, IL-1β, IL-12, IFNγ, Rantes 및 MIP-2)의 수준을 감소시키고 IL-10을 증가시켰다. 최종적으로, hASC에 의한 처리는 염증 세포의 복강, 폐, 간 및 장 내로의 침윤을 감소시켰다(도 7C & 7D). 상기 결과는 hASC가 상기 질환의 특징적인 악화된 염증 반응을 하향 조절함으로써 마우스를 내독소혈성 사망으로부터 보호함을 가리킨다.

이들 실시예는 MSC, 특히 hASC가 SIRS, 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크 및 패혈증-유사 질환의 치료에 유용할 수 있다는 증거를 제공한다.

지금까지 SIRS, 패혈증 및 패혈성 쇼크에 대한 대부분의 치료 전략들은 염증-전 매개체를 표적으로 하여 왔으며 임상 시험에서 크게 성공하지는 못한 것으로 나타났다. 하나의 단일 사이토킨, 예를 들어 TNFα 또는 IL-1β를 차단하도록 설계된 요법들은 이들 염증성 사이토킨의 이르고 일시적인 동역학 프로파일로 인해 제한된 효능을 나타내었다. 본 발명에 이르러 중간엽 줄기 세포(MSC), 특히 인간 지방 조직 유래한 기질 줄기 세포(hASC)의 투여가 중증 내독소혈증 및 패혈증의 2 개의 생체 내 모델에서 사망을 막는 것으로 밝혀졌으며, 이는 MSC가 SIRS, 패혈증 및 패혈성 쇼크의 치료에 유용할 수 있다는 증거를 제공한다. MSC는 다양한 염증성 사이토킨 및 케모킨의 전신 수준 감소에 의한 것, 및 다양한 표적 기관 내로의 백혈구 침윤의 억제에 의한 것을 포함하여, 여러 수준에서 SIRS의 어려운 태양들을 조절하는 작용을 하는 것으로 밝혀졌다.

Claims (30)

1. 환자의 중증 패혈증의 치료에 사용하기 위한, 중간엽 줄기 세포(MSC)를 포함하고, 상기 MSC가 지방 조직 유래한 기질 줄기 세포(ASC)이며, 상기 MSC가 3회 이상 계대 배양을 위해 배양물에서 팽창된 것인, 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 중증 패혈증은 바이러스, 진균 또는 원생동물에 의해 유발되는 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 중증 패혈증은 세균에 의해 유발되는 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 1항에 있어서,
   상기 MSC를 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제 중에서 투여하는 조성물.
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 MSC의 50% 이상이 마커 CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105 중 하나 이상을 발현하는 조성물.
8. 제 1 항에 있어서,
   상기 MSC의 50% 이상이 마커 CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 및 CD133 중 하나 이상을 발현하지 않는 조성물.
9. 제 1 항에 있어서,
   상기 MSC를 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제 중에서 투여하는 조성물.
10. 제 1 항에 있어서,
    상기 MSC를 전신적으로 투여하는 조성물.
11. 제 1 항에 있어서,
    상기 MSC를 국소적으로 투여하는 조성물.
12. 제 1 항에 있어서,
    상기 MSC를 피하, 피 내, 정맥 내, 근육 내, 관절 내, 활액 내, 흉골 내, 경막 내, 병변 내 또는 두개 내 경로를 통해 투여하는 조성물.
13. 제 1 항에 있어서,
    상기 MSC가 치료하려는 환자에 대해 동종이계(allogeneic)인 조성물.
14. 제 1 항에 있어서,
    상기 MSC를 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 투여하는 조성물.
15. 제 14 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 추가의 치료제가 진통제, 감염 방지제, 전해성 또는 신장 작용제, 효소, 위장약, 일반 마취제, 호르몬 또는 호르몬 변경제, 면역생물제, 국소 마취제, 근골격제, 생육 인자 또는 세포 증식 또는 활성화에 영향을 미치거나 최종 분화를 유도하는 다른 분자, 및 이들의 단편 또는 변체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
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