WO2022239862A1 - 組成物およびその用途 - Google Patents

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WO2022239862A1
WO2022239862A1 PCT/JP2022/020222 JP2022020222W WO2022239862A1 WO 2022239862 A1 WO2022239862 A1 WO 2022239862A1 JP 2022020222 W JP2022020222 W JP 2022020222W WO 2022239862 A1 WO2022239862 A1 WO 2022239862A1
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WO
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mir
composition
cells
extracellular vesicles
cell population
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PCT/JP2022/020222
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孝之 浅原
エー．アマンケルディ サリベコフ
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ＳｔｅｍＭｅｄ株式会社
ヒューマンライフコード株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to compositions and uses thereof.
  • an object of the present invention is to provide cell-derived extracellular vesicles that reduce graft rejection and have physiological activity.
  • composition of the present invention contains extracellular vesicles of regenerative cell populations or cultures thereof derived from mononuclear cells derived from biological samples.
  • the present invention provides a composition for use in treating ischemic heart disease, comprising:
  • the composition is the composition of the present invention.
  • the present invention provides a composition for use in promoting proliferation of vascular endothelial cells,
  • the composition is the composition of the present invention.
  • the present invention provides a composition for use in inducing angiogenesis, comprising:
  • the composition is the composition of the present invention.
  • the present invention provides a composition for use in suppressing fibrosis,
  • the composition is the composition of the present invention.
  • extracellular vesicles with reduced graft rejection and physiological activity can be provided.
  • FIG. 1 is a graph showing the particle size, the amount produced per cell, and the average size of extracellular vesicles in Example 1.
  • FIG. 2 is an electron microscope image showing the structure of RAC-derived extracellular vesicles in Example 1.
  • FIG. 3 is a histogram showing the expression of markers in Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing proliferation of HUVEC cells in Example 1.
  • FIG. 5 is a photograph and a graph showing growth areas of HUVEC cells in Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the expression level of miRNA in Example 1.
  • FIG. FIG. 7 is a photograph showing an echogram in Example 1, and a graph showing the ejection fraction and left ventricular inner diameter shortening ratio.
  • FIG. 8 is a graph showing severity of mitral valve regurgitation and left ventricular end-systolic volume in Example 1.
  • FIG. 9 is a graph and photographs showing the degree of fibrosis in Example 1.
  • FIG. 10 is a graph showing the expression level of miRNA in Example 1.
  • FIG. 11 is a photograph showing blood vessels in infarcted myocardial tissue in Example 1.
  • FIG. 12 is a graph showing the expression level of miRNA in Example 1.
  • FIG. 13 is a photograph showing a fluorescent image of infarcted myocardial tissue in Example 1.
  • FIG. 14 is a photograph and a graph showing the luminescence intensity of infarcted myocardial tissue in Example 1.
  • FIG. 15 is a graph showing rat body weight and spleen weight in Example 1.
  • FIG. 15 is a graph showing rat body weight and spleen weight in Example 1.
  • FIG. 16 is a graph showing the percentages of CD3-positive cells, CD4-positive cells, CD8-positive cells, regulatory T cells and CD11b/c-positive cells in Example 1.
  • FIG. 17 is a graph showing the percentages of CD3-positive cells, CD4-positive cells, CD8-positive cells, TNK, iNK, regulatory T cells and CD11b/c-positive cells in Example 1.
  • FIG. 18 is a graph showing the expression level of miRNA in Example 1.
  • FIG. 19 is a graph showing the number of cells in Example 2.
  • FIG. 20 is a graph showing the results of EPC-CFA assay in Example 2.
  • FIG. 21 is a graph showing the expression level of miRNA in Example 3.
  • FIG. 22 is a graph showing the expression level of miRNA in Example 3.
  • a "biological sample” is a sample derived from a living organism, and means a sample from which cells that constitute the living organism can be extracted or isolated.
  • mononuclear cell means a cell with a round nucleus contained in peripheral blood, bone marrow, cord blood, or the like.
  • the mononuclear cells include, for example, lymphocytes, monocytes, macrophages, vascular endothelial progenitor cells, hematopoietic stem cells and the like. Said mononuclear cells may further comprise CD34 and/or CD133 positive cells.
  • extracellular vesicle means a vesicle having a membrane that is secreted from cells.
  • the extracellular vesicles are generally considered to be formed within the endosome of the cell from which they are derived and then released outside the cell.
  • the extracellular vesicle usually includes a lipid bilayer membrane and a lumen, and the lumen has a structure surrounded by the lipid bilayer membrane.
  • the lipid bilayer membrane contains lipids derived from the cell membrane of the cell from which it is derived.
  • the lumen then contains cytoplasm from the cells from which it originates.
  • the extracellular vesicles are classified into, for example, exosomes, microvesicles (MV), apoptotic bodies, etc., according to their size and/or surface markers.
  • regenerative cell population means a cell population containing cells with regenerative function.
  • the regenerative function means a function of repairing or improving a tissue, an organ, or a function of an organ, and any one function may be performed.
  • Specific examples of the regenerative function include vascular endothelial cell proliferation activity and/or angiogenesis promoting activity.
  • a "cell population” means a cell preparation containing desired cells or a composition containing desired cells. Therefore, the cell population can also be referred to herein as, for example, a cell preparation or composition.
  • the ratio of desired cells to all cells (hereinafter also referred to as “purity”) can be quantified, for example, as the ratio of cells expressing one or more markers expressing desired cells.
  • the purity is, for example, the percentage in viable cells. The purity can be measured, for example, by flow cytometry, immunohistochemistry, in situ hybridization, and the like.
  • the purity of the cell preparation is, for example, 50% or higher, 55% or higher, 60% or higher, 65% or higher, 70% or higher, 75% or higher, 80% or higher, 85% or higher, 90% or higher , 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • culture means a product containing cells obtained by culturing a subject cell and/or a culture medium of said cells.
  • umbilical cord means a white tubular tissue that connects the fetus and placenta.
  • the origin of the "umbilical cord” is not particularly limited. , an umbilical cord of a primate mammal, more preferably a human umbilical cord.
  • cord blood means fetal blood contained in the umbilical cord.
  • miRNA means non-coding RNA with a base length of about 18 to about 25 bases.
  • the miRNA can also be referred to as “microRNA”, “miR”, and the like.
  • miRNA precursor means a transcript containing non-coding RNA originating from genomic DNA and containing one or more miRNA sequences. Said miRNA precursors can also be referred to as “pri-miRNA” (pri-miRNA), or “pre-miRNA” (pre-miRNA).
  • pri-miRNA pri-miRNA
  • pre-miRNA pre-miRNA
  • the miRNA precursor usually has a hairpin structure and contains the base sequence of a mature miRNA.
  • mir-X refers to the precursor of miRNA with number X
  • miR-X refers to the mature form of miRNA with number X (miRNA).
  • two miRNAs are denoted with the suffix “-3p” or “-5p” when they originate from opposite arms of the same miRNA precursor.
  • miR-X refers to both -3p and -5p miRNAs when the miRNA precursor contains two miRNAs.
  • miRNA with the low expression level is denoted by an asterisk after the name. is used.
  • Information such as the base sequences of each “mir-X” and “miR-X” can be referred to miRBase (http://www.mirbase.org/).
  • cell proliferation promotion means that the proliferation of target cells is significantly promoted.
  • the target cell is a desired cell.
  • Said facilitation may also be referred to as enhancement, augmentation, or increase.
  • stimulation of cell growth means that a group treated with a test substance is compared with a control group not treated with the test substance or a control group treated with a substance having no cell growth-promoting activity. means that the proliferation of the target cells is significantly promoted. Therefore, in the present specification, even if the cell proliferation activity is reduced in the control group compared to the control group at the start of the test, the cell proliferation of the target cells is significant compared to the control group. , it can be said that "stimulation of cell growth” has occurred.
  • the cell proliferation activity can be measured, for example, according to Example 1 described later.
  • promoted angiogenesis means that the formation or proliferation of blood vessels is significantly promoted. Said facilitation may also be referred to as enhancement, augmentation, or increase.
  • promoting angiogenesis means that the test substance-treated group is compared with a control group that is not treated with the test substance or a control group that is treated with a substance having no angiogenesis-promoting activity. , means that the angiogenesis or hyperplasia is significantly promoted.
  • angiogenesis-promoting activity can be measured, for example, according to Example 1 described later.
  • fibrosis suppression means that fibrosis in a subject is significantly suppressed. Said inhibition may also be referred to as reduction, reduction, inhibition, inhibition or prevention.
  • fibrosis inhibition means that a group treated with a test substance compares with a control group not treated with the test substance or a control group treated with a substance having no fibrosis-inhibiting activity. , meaning that the subject's fibrosis is significantly suppressed. Therefore, in the present specification, even if fibrosis is suppressed in the control group compared to the control group at the start of the test, fibrosis in the subject is significantly suppressed compared to the control group. If so, it can be said that "fibrosis inhibition” has occurred.
  • the fibrosis-suppressing activity can be measured, for example, according to Example 1 described later.
  • graft rejection refers to cell, tissue, organ, or organ transplantation to eliminate grafts induced in the host due to differences in major histocompatibility antigens. It means the host reaction to Said graft rejection can also be referred to as “alloreaction” or “allograft rejection” when within the same species.
  • the graft rejection can also be referred to as “xenograft rejection” in the case of xenograft rejection.
  • the "graft rejection” can be measured, for example, according to Example 1 described later.
  • “suppression of graft rejection” or “suppression of immune rejection” means that graft rejection or immune rejection is significantly suppressed. Said inhibition may also be referred to as reduction, reduction, inhibition, inhibition or prevention.
  • the “inhibition of graft rejection” means that the graft rejection is significantly inhibited in the group treated with the test substance compared to the control group treated with the substance that induces graft rejection. means that As a specific example, when examining the graft rejection of the extracellular vesicles, the group treated with the extracellular vesicles is compared with a control group treated with the cells derived from the extracellular vesicles. When graft rejection is significantly inhibited, it can be said that the extracellular vesicle inhibits graft rejection.
  • the "graft rejection” can be measured, for example, according to Example 1 described later.
  • extraction means a state in which a specific component is more concentrated than before extraction. For this reason, said extraction can also be referred to as concentration or enrichment. Said “extraction” can be carried out, for example, by obtaining at least one concentration step.
  • isolated means a state in which a specific component has been identified and separated, and/or recovered from the component in its natural state. Said “isolation” can be carried out, for example, by obtaining at least one purification step.
  • positive (+) means a negative control cell that does not express the antigen or an antibody that does not react with the antigen by an analysis method such as flow cytometry that is detected using an antigen-antibody reaction. It means that a high signal is detected compared to the control reaction.
  • negative (-) means that an equivalent or lower signal is detected compared to a negative control reaction using a negative control cell that does not express the antigen or an antibody that does not react with the antigen. means.
  • treatment means therapeutic treatment and/or prophylactic treatment.
  • treatment means treating, curing, preventing, arresting, ameliorating, ameliorating a disease, condition, or disorder, or halting, arresting, reducing, or delaying the progression of a disease, condition, or disorder. do.
  • prevention means reducing the likelihood of developing a disease or condition or delaying the onset of a disease or condition.
  • the “treatment” may be, for example, treatment of a patient who develops the target disease, or treatment of a model animal of the target disease.
  • the term "effective dose” means an amount sufficient to obtain a therapeutic effect for the disease when administered to a patient with the disease.
  • subject means an animal or an animal-derived cell, tissue, or organ, and is particularly used to include humans.
  • Said animal means both human and non-human animals.
  • non-human animals include mammals such as mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses, pigs, monkeys, dolphins, and sea lions.
  • the present invention provides cell-derived extracellular vesicles with reduced graft rejection and bioactivity, or compositions comprising the same.
  • Extracellular vesicles of the present invention are extracellular vesicles of regenerative cell populations or cultures thereof derived from mononuclear cells derived from biological samples.
  • Compositions of the invention also include extracellular vesicles of regenerative cell populations or cultures thereof derived from mononuclear cells from biological samples. Since the extracellular vesicles or composition of the present invention suppresses the above-mentioned graft rejection and is derived from the above-mentioned regenerative cell population, they have physiological activities such as vascular endothelial cell growth promotion activity and angiogenesis promotion activity. have Therefore, the extracellular vesicles or composition of the present invention can be suitably used for treating ischemic heart disease or improving prognosis, for example, as described later.
  • the regenerative cell population is a cell population induced from mononuclear cells derived from the biological sample.
  • the regenerative cell population includes, for example, cells with regenerative function inducible from the mononuclear cells.
  • the cells having regenerative function include, for example, vascular endothelial progenitor cells, anti-inflammatory macrophages, and the like, and may also include Th2 cells, regulatory T cells (Treg), and the like.
  • the vascular endothelial progenitor cells and the anti-inflammatory macrophages for example, have angiogenesis-promoting activity and anti-inflammatory activity as the regeneration function, so that at an inflammatory site such as an ulcer, not only angiogenesis but also inflammation It is extremely useful in that it can be suppressed.
  • the regenerative cell population contains one or more types of cells having the regenerative function.
  • the vascular endothelial progenitor cells are cells that have the ability to differentiate into vascular endothelial cells.
  • the vascular endothelial progenitor cells can be identified using cell surface markers such as CD34, CD133, KDR (Kinase insert domain receptor, CD309), and CD105.
  • the vascular endothelial progenitor cells may be further classified according to the degree of differentiation.
  • the vascular endothelial progenitor cells can be further classified into differentiated EPC colony cells and undifferentiated EPC colony cells.
  • the differentiated EPC colony cells mainly contain cells with a diameter of 20 to 50 ⁇ m (CFU-large cell-like EC, hereinafter also referred to as “large EPC colony”).
  • the undifferentiated EPC colony cells mainly contain cells with a diameter of 20 ⁇ m or less (CFU-small cell-like EC, hereinafter also referred to as “small EPC colony”).
  • the small EPC colonies that appear at an early stage can be said to be EPC colonies at an early stage of differentiation with excellent proliferative ability, and the large EPC colonies that appear at a later stage are vascular cells. It can be said to be an EPC colony at a late stage of differentiation with excellent development (neogenesis) (see, for example, Masuda H. et al., Circulation Research, 109: 20-37 (2011)).
  • the differentiated EPC colony cells are, for example, superior in regenerative functions such as angiogenesis or repair compared to the undifferentiated EPC colony cells. Therefore, the vascular endothelial progenitor cells are differentiated EPC colony forming cells. Preferably.
  • the anti-inflammatory macrophage is a type of macrophage that secretes anti-inflammatory cytokines (IL-10, IL-4) and the like, and is a cell that contributes to angiogenesis or repair. Said anti-inflammatory macrophages can be identified using cell surface markers such as, for example, CD206, CD163, CD169.
  • the anti-inflammatory macrophages are preferably M2 macrophages because they are excellent in regenerative functions such as angiogenesis or repair.
  • the proportion of cells having regenerative function in all cells of the regenerative cell population is not particularly limited, and is, for example, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more. , 40% or more, 45% or more, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96 % or greater, 97% or greater, 98% or greater, or 99% or greater.
  • the proportion of cells can be calculated, for example, by measuring the proportion of target cell surface marker-positive cells using the cell surface marker having regenerative function. Said measurement can be carried out, for example, using a flow cytometry method.
  • the ratio of the cells having a regenerative function to the total cells of the regenerative cell population is, for example, usually twice the ratio of the corresponding cells having a regenerative function in the mononuclear cells derived from the biological sample, Preferably, the increase is four times or more.
  • the ratio of the cells having a regenerative function to the total cells of the regenerative cell population is, for example, the ratio of CD34-positive cells and CD206 It can be calculated as a total percentage of the percentage of positive cells.
  • the biological sample used for inducing the regenerative cell population may be a biological sample containing the mononuclear cells. Said mononuclear cells are abundant in blood and lymph.
  • said biological sample may be a tissue, organ and/or organ, including blood and/or lymph vessels, or may be blood and/or lymph. Specific examples of the biological sample include bone marrow; blood such as umbilical cord blood and peripheral blood; lymph fluid; and the like.
  • the biological sample may be a biological sample collected from a subject of administration, treatment, or treatment of the extracellular vesicles and/or composition of the present invention (hereinafter collectively referred to as "administration subject"). It may be a biological sample collected from a subject other than the subject. It is desirable to use a biological sample collected from a person other than the administration subject from the viewpoint of not being subject to restrictions during preparation.
  • the regenerative cell population may be cells (allogeneic cells) derived from a biological sample collected from a subject other than the subject of administration, or derived from a biological sample collected from the subject of administration, as described in the examples below. cells (autologous cells).
  • the extracellular vesicles can be suitably prepared even using a biological sample collected from a person other than the administration subject, because the graft rejection reaction is suppressed.
  • the extracellular vesicles exert therapeutic effects without being eliminated by immune rejection or the like, for example.
  • the extracellular vesicles can be prepared, for example, as an off-the-shelf formulation.
  • the method for preparing the biological sample is not particularly limited, and can be set appropriately according to the type of the biological sample, for example.
  • the biological sample when the biological sample is bone marrow, the biological sample can be obtained, for example, by performing bone marrow aspiration on the subject.
  • the biological sample when the biological sample is peripheral blood, the biological sample can be obtained by collecting venous blood, for example.
  • the biological sample is umbilical cord blood, the biological sample can be obtained, for example, by isolating the umbilical cord and then collecting the blood in the umbilical cord.
  • the method for isolating mononuclear cells from the biological sample can be carried out according to a method commonly practiced in the art. It can be carried out by separating the mononuclear cells from other components using a nuclear cell separation solution.
  • a method for inducing the cells having the regenerative function from the mononuclear cells derived from the biological sample can be carried out, for example, by a known method depending on the type of the cells having the regenerative function.
  • the induction method includes, for example, culturing the mononuclear cells in the presence of SCF, IL-6, FLT3L, TPO, and/or VEGF.
  • the induction method includes, for example, culturing the mononuclear cells in the presence of IL-10, IL-4, M-CSF and/or G-CSF. It can be implemented by
  • the induction method is preferably a method capable of inducing both the vascular endothelial progenitor cells and the anti-inflammatory macrophages from the mononuclear cells.
  • the induction method for example, reference can be made to the induction method described in International Publication No. 2014/051154.
  • the regenerative cell population can induce cells having the regenerative function, including extracellular vesicles having the pro-angiogenic activity and the anti-inflammatory activity.
  • IL-6 interleukin-6
  • FMS-like tyrosine kinase 3 ligand Flt3L
  • TPO thrombopoietin
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the mononuclear cells to be cultured may be a desired cell population obtained by selecting a desired cell population from the biological sample-derived mononuclear cells, or the biological sample-derived mononuclear cells themselves. may be used.
  • mononuclear cells to be cultured mononuclear cells obtained without sorting CD34 and/or CD133 positive cells (unsorted mononuclear cells) are preferably used.
  • the differentiated EPC colony-forming cells are increased (amplified) compared to, for example, the case of using mononuclear cells sorted as CD34-positive cells, and the A cell population with increased (amplified) anti-inflammatory macrophages and increased (amplified) anti-inflammatory Th2 cells and regulatory T cells is formed. Therefore, by using the unsorted mononuclear cells, for example, it is possible to obtain, as the regenerative cell population, a cell population enriched with cells having the regenerative function. It is possible to obtain extracellular vesicles with excellent physiological activities such as proliferation-promoting activity, angiogenesis-promoting activity, fibrosis-suppressing activity, graft rejection-suppressing activity, and immunosuppressive activity.
  • the SCF is a glycoprotein with a molecular weight of about 30,000 consisting of 248 amino acids. Said SCF is produced in soluble and membrane-bound forms by alternative splicing.
  • the SCF used for the culture may be any type of SCF as long as it is useful for culturing regenerative cell populations such as EPCs. A soluble form is preferred.
  • the origin of the SCF is not particularly limited, it is preferably a recombinant, and particularly preferably a human recombinant, because it is expected to be supplied stably. Said human recombinant SCF is commercially available.
  • the concentration of SCF in the medium can be set according to the type of SCF, and is not particularly limited as long as it is useful for culturing regenerative cell populations such as EPCs.
  • the concentration of SCF in the medium is, for example, 10 to 1000 ng/ml, preferably 50 to 500 ng/ml, more preferably about 100 ng/ml. be.
  • the IL-6 is a glycoprotein with a molecular weight of about 21,000 that was isolated as a factor that induces the terminal differentiation of B cells into antibody-producing cells. It is known to be involved in the phase reaction, etc.
  • the origin of IL-6 is not particularly limited, but a recombinant is preferable, and a human recombinant is particularly preferable, since a stable supply is expected. Said human recombinant IL-6 is commercially available.
  • the concentration of IL-6 in the medium varies depending on the type of IL-6 used, but is not particularly limited as long as it is useful for culturing regenerative cell populations such as EPCs.
  • the concentration of IL-6 in the medium is, for example, 1 to 500 ng/ml, preferably 5 to 100 ng/ml, more preferably , about 20 ng/ml.
  • the Flt3L is known as a receptor tyrosine kinase ligand that plays an important role in the control of early hematopoiesis.
  • Flt3L is known to be a product of several alternative splicings, and is reported to stimulate the proliferation of hematopoietic stem cells.
  • the Flt3L may be any type of Flt3L as long as it is useful for culturing regenerative cell populations such as EPCs.
  • the origin of Flt3L is not particularly limited, it is preferably a recombinant, particularly preferably a human recombinant, because it is expected to be supplied stably. Said human recombinant Flt3L is commercially available.
  • the concentration of Flt3L in the medium varies depending on the type of Flt3L used, but is not particularly limited as long as it is useful for culturing regenerative cell populations such as EPCs.
  • the concentration of Flt3L in the medium is, for example, 10 to 1000 ng/ml, preferably 50 to 500 ng/ml, more preferably about 100 ng/ml. be.
  • the TPO is a type of hematopoietic cytokine, and is known to act specifically on the process of megakaryocyte production from hematopoietic stem cells and promote the production of megakaryocytes.
  • the origin of the TPO is not particularly limited, it is preferably a recombinant, and particularly preferably a human recombinant, because it is expected to be supplied stably.
  • Said human recombinant TPO is commercially available.
  • the concentration of TPO in the medium varies depending on the type of TPO used, but is not particularly limited as long as it is useful for culturing regenerative cell populations such as EPCs.
  • the concentration of TPO in the medium is, for example, 1 to 500 ng/ml, preferably 5 to 100 ng/ml, more preferably about 20 ng/ml. be.
  • the VEGF is a growth factor that specifically acts on EPCs and is known to be produced mainly in perivascular cells. Said VEGF produces several types of VEGF proteins with different sizes by alternative splicing.
  • the VEGF may be any type of VEGF, preferably VEGF165, as long as it allows colony formation of the EPCs contained in the regenerative cell population.
  • the origin of the VEGF is not particularly limited, it is preferably a recombinant, particularly preferably a human recombinant, because it is expected to be supplied stably. Said human recombinant VEGF is commercially available.
  • the concentration of VEGF in the medium varies depending on the type of VEGF used, and is not particularly limited as long as it is useful for culturing regenerative cell populations such as EPCs.
  • the concentration of VEGF in the medium is, for example, about 5-500 ng/ml, preferably about 20-100 ng/ml, more preferably about 50 ng/ml.
  • factors derived from animals of the same or different species as the animal from which the mononuclear cells are derived are used, and factors derived from the same species of animals are preferably used.
  • a regenerative cell population suitable for allogeneic transplantation such as allogeneic transplantation and extracellular vesicles derived therefrom can be obtained.
  • extracellular vesicles suitable for allogeneic transplantation can be obtained by using mononuclear cells derived from the administration subject.
  • the obtained regenerative cell population and extracellular vesicles derived therefrom are susceptible to infection at the time of administration, etc. Can reduce risk and rejection.
  • the medium used for the culture may be prepared by dissolving the various factors in a basal medium to a predetermined concentration, or a concentrated solution (stock solution) containing the various factors may be prepared in advance and added to the desired medium. You may prepare by diluting to a predetermined density
  • the medium used for the culture may be prepared by dissolving various factors necessary for a commercially available basal medium to a predetermined concentration and then sterilizing by filtration sterilization or the like, or a stock solution sterilized by filtration sterilization or the like. may be prepared by aseptically adding and diluting into commercially available basal media.
  • the sterilization by filtration can be performed according to a method commonly practiced in the art, and can be performed using, for example, a Millipore filter with a pore size of 0.22 ⁇ m or 0.45 ⁇ m.
  • a basal medium commonly used in the art can be used, for example, a basal medium known as a medium for proliferation of hematopoietic stem cells can be used.
  • the basal medium may be a serum-containing medium or a serum-free medium, ie a serum-free medium.
  • a serum-free medium is used as the medium and/or the basal medium, thereby efficiently culturing (inducing) the regenerative cell population from the mononuclear cells. It can be induced (amplified) well. Therefore, the medium is preferably a serum-free medium.
  • the medium or basal medium include DMEM, MEM, IMDM and the like.
  • the medium contains at least one factor, preferably three or more factors, more preferably all factors selected from the group consisting of SCF, IL-6, FLT3L, TPO, and VEGF. Therefore, the medium used for the culture contains, for example, any of the following.
  • the medium more preferably contains SCF, IL-6, FLT3L, TPO, and VEGF.
  • the medium more preferably comprises about 50 ng/ml VEGF, about 100 ng/ml SCF, about 20 ng/ml IL-6, 100 ng/ml FLT3L, and about 20 ng/ml TPO.
  • the mononuclear cell culture using the medium containing the various factors can be performed by adding the cell suspension containing the mononuclear cells to the medium containing the various factors.
  • a bodily fluid containing the mononuclear cells for example, bone marrow fluid, umbilical cord blood, peripheral blood
  • the conditions for culturing the mononuclear cells are not particularly limited, and the conditions usually used in the art can be used. As a specific example, the culture conditions are, for example, culturing at 37° C. for 7 days or more (eg, 10 days or more) in a 5% CO 2 atmosphere.
  • the concentration of the mononuclear cells in the medium is not particularly limited as long as it enables the culture of regenerative cell populations such as EPCs.
  • the concentration (seeding density) of the mononuclear cells in the medium is, for example, about 0.5 to 10 ⁇ 10 5 cells/ml, more preferably about 1 to 5 ⁇ 10 5 cells/ml, still more preferably about 3-4 ⁇ 10 5 cells/ml.
  • the culture of the regenerative cell population may be a culture obtained by inducing the regenerative cell population from the mononuclear cells, or a culture obtained by culturing the induced regenerative cell population.
  • the medium and culture conditions for the regenerative cell population are not particularly limited, and for example, the description of the medium and culture conditions for the mononuclear cells can be used.
  • the medium for the regenerative cell population can be, for example, a medium obtained by adding serum, preferably human-derived serum, to the basal medium.
  • the origin of the serum may be the same as or different from that of the regenerative cell population, but is preferably the same.
  • the serum may contain the extracellular vesicles. Therefore, when the serum is added to the basal medium, it is preferable to use serum from which extracellular vesicles have been removed.
  • the extracellular vesicle-depleted serum is commercially available.
  • the serum concentration is, for example, 1 to 20 (v/v)%, preferably 1 to 10 (v/v)%.
  • Culturing of the regenerative cell population can be performed by adding a cell suspension containing the regenerative cell population to a medium for the regenerative cell population.
  • the conditions for culturing the regenerative cell population are not particularly limited, and the conditions usually used in the art can be used.
  • the culture conditions are, for example, culturing at 37° C. for 1 to 10 days (eg, 1 to 2 days) in a 5% CO 2 atmosphere.
  • the concentration (seeding density) of the regenerative cell population in the medium is not particularly limited as long as the regenerative cell population can be cultured.
  • the concentration (seeding density) of the regenerative cell population in the medium is, for example, about 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 7 cells/ml, more preferably about 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 6 cells/ml. ml, more preferably about 5 ⁇ 10 5 cells/ml.
  • Said extracellular vesicles are secreted from the cell from which they are derived, as described above.
  • said extracellular vesicles may be isolated or extracted from said regenerative cell population or culture thereof.
  • the extracellular vesicles When extracted or isolated from the regenerative cell population, the extracellular vesicles are, for example, disrupted the regenerative cell population to release intracellular extracellular vesicles of the regenerative cell population, After separating the soluble fraction from the resulting suspension, the soluble fraction can be isolated or extracted by subjecting the soluble fraction to a method for isolating or extracting extracellular vesicles.
  • the method for isolating or extracting the extracellular vesicles can be performed according to a method commonly practiced in the art, for example, a method using centrifugation, It can be performed by a membrane protein derived from a regenerative cell population, an affinity purification method using the membrane protein, filtration using a porous membrane such as a filter, or the like.
  • a membrane filter for example, a commercially available membrane filter can be used, and as a specific example, a membrane filter with a pore size of 0.22 ⁇ m (manufactured by Millipore) can be used.
  • Membrane proteins of the extracellular vesicles are described below.
  • a commercially available kit may be used for the isolation or extraction of the extracellular vesicles, and as a specific example, the qEv isolation kit (manufactured by Izon Sciences) can be used.
  • the centrifugation conditions may be conditions that allow the extracellular vesicles to be precipitated. ⁇ 180,000 xg for 20-60 minutes.
  • the temperature during the centrifugation is, for example, 0 to 10°C, preferably 0 to 4°C.
  • the culture is, for example, composed of the regenerative cell population and its medium (conditioned medium or culture supernatant).
  • said extracellular vesicles when isolated from said culture, may be isolated or extracted from said regenerative cell population or said conditioned medium, or both said regenerative cell population and said conditioned medium. can be separated from
  • the method for separating the regenerative cell population and the conditioned medium from the culture can be performed according to a method commonly practiced in the art, for example, filter filtration, centrifugation, etc. .
  • the extracellular vesicles can be isolated or extracted in the same manner as the extraction or isolation from the regenerative cell population described above.
  • the method for isolating or extracting the extracellular vesicles is, for example, a method using centrifugation, a membrane protein derived from a regenerative cell population present in the membrane of the extracellular vesicles, or the It can be carried out by an affinity purification method using a membrane protein, filtration using a porous membrane such as a filter, or the like.
  • a commercially available kit may be used for the isolation or extraction of the extracellular vesicles, and as a specific example, the qEv isolation kit (manufactured by Izon Sciences) can be used.
  • the extracellular vesicles contain components derived from the regenerative cell population.
  • the extracellular vesicle has, for example, a lipid bilayer membrane and a lumen, and the lumen is surrounded by the lipid bilayer membrane.
  • the lipid bilayer membrane is, for example, derived from the membrane of the regenerative cell population, specifically the membrane of the cells of the regenerative cell population. Examples of the membrane include cell membranes; membranes of intracellular organelles such as mitochondria, endoplasmic reticulum, endosomes, lysosomes, and Golgi apparatus; and the like.
  • the lumen has, for example, cytoplasm derived from the regenerative cell population, specifically cytoplasm derived from cells of the regenerative cell population.
  • said extracellular vesicles comprise, for example, miRNA, DNA and/or proteins derived from the cytoplasm of cells of said regenerative cell population.
  • the lipid bilayer membrane of the extracellular vesicles includes, for example, membrane components of the cells of the regenerative cell population.
  • the extracellular vesicles can be defined using, for example, membrane components present in the regenerative cell population.
  • the membrane components include membrane proteins.
  • the membrane proteins include extracellular vesicle markers such as CD9, CD63, Alix (ALG-2-interacting protein X), Hsp-70 (Heat Shock Protein 70); cell surface markers of the cells; .
  • the cell surface marker can be appropriately determined according to the cell type.
  • the cell surface markers include, for example, CD34, CD133, KDR (Kinase insert domain receptor, CD309), CD105, and the like.
  • the cell surface markers include, for example, CD206, CD163, CD169 and the like.
  • the lipid bilayer membrane of the extracellular vesicle contains, for example, one or more membrane components.
  • the membrane component can be measured by flow cytometry using, for example, an antibody against the molecule of interest.
  • the lumen of the extracellular vesicles contains, for example, the cytoplasm of the cells of the regenerative cell population.
  • the extracellular vesicles can be defined using, for example, cytoplasmic components present in the regenerative cell population. Examples of the cytoplasmic components include miRNA and the like.
  • the miRNAs are, for example, miR-15b-5p, miR-29b-3p, miR-29c-3p, miR-92a-2-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-133a-3p, miR-133b, miR-146a-3p, miR-146b-5p, miR-150-5p, miR-181b-3p, miR-195-3p, miR-195-5p, miR-200b-5p, miR-302a- 5p, miR-142-3p, miR-10a-3p, miR-17-3p, miR-20b-5p, miR-21-5p, miR-24-2-5p, miR-29a-5p, miR-30b- 5p, miR-30c-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-32-5p, miR-92a-3p, miR-103a-2-5p, miR-144-5p, miR-148a- 3p, miR-199b-5p,
  • miRNAs in particular miR-92a-2-5p, miR-133a-3p, miR-133b, miR-146a-3p, miR-200b-5p, miR-302a-5p and miR-142-3p is assumed to be a specific miRNA in extracellular vesicles of said regenerative cell population.
  • the lumen of the extracellular vesicles contains miR-92a-2-5p, miR-133a-3p, miR-133b, miR-146a-3p, miR-200b-5p, miR-302a-5p, and /or preferably contains miR-142-3p.
  • the lumen of the extracellular vesicle contains, for example, one or more cytoplasmic components.
  • Said cytoplasmic components can be measured by flow cytometry, for example using antibodies against the molecule of interest.
  • the cytoplasmic component is a nucleic acid molecule
  • the cytoplasmic component can be measured using, for example, a sequencer or the like.
  • the miRNAs are, for example, miR-15b-5p, miR-29b-3p, miR-92a-2-5p, miR-146a-3p, miR-146b-5p, miR -150-5p, miR-195-3p, miR-195-5p, miR-200b-5p, miR-302a-5p, and/or miR-142-3p.
  • the miRNAs are, for example, miR-10a-3p, miR-17-3p, miR-20b-5p, miR-21-5p, miR-24-2-5p , miR-29a-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-32-5p, miR-92a-3p, miR-103a-2-5p , miR-144-5p, miR-148a-3p, miR-199b-5p, miR-200a-3p, miR-205-5p, miR-210-3p, miR-221-5p, miR-324-5p, miR -363-3p, miR-373-3p, miR-509-3p, miR-633, and/or let-7c-5p.
  • miR-20b-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-32-5p, miR-92a-2-5p, miR- 92a-3p, miR-199b-5p, miR-200a-3p, miR-363-3p, and miR-509-3p are generally known to have anti-apoptotic activity.
  • miRNAs In the miRNA, miR-17-3p, miR-20b-5p, miR-103a-2-5p, miR-150-5p, miR-181b-3p, miR-200a-3p, miR-205-5p, miR- 302a-5p, miR-324-5p, miR-363-3p, and miR-633 are generally known to have cell growth promoting activity. Among the miRNAs, miR-150-5p is generally known to have cell migration-promoting activity.
  • miRNA-21-5p, miR-29a-5p, miR-29b-3p, miR-29c-3p, miR-133a-3p, miR-133b, miR-200a-3p, and miR-373-3p is generally known to have antifibrotic activity, particularly TGF- ⁇ expression-suppressing activity.
  • miRNAs In the miRNA, miR-15b-5p, miR-29c-3p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-146a-3p, miR-146b-5p, miR-181b-3p, miR-195- 3p, miR-195-5p, miR-200b-5p, miR-210-3p, miR-221-5p, miR-633, and let-7c-5p can generally have pro-angiogenic activity.
  • miRNAs miR-10a-3p, miR-21-5p, miR-24-2-5p, miR-142-3p, miR-144-5p, and miR-148a-3p are generally anti-inflammatory known to be active.
  • the components contained in the lumen may be replaced with components other than the cytoplasm of the regenerative cell population.
  • the lumen carries the desired cargo.
  • the cargo include low-molecular-weight compounds, proteins such as antibodies, peptides, and nucleic acids.
  • the average diameter (weighted average) of the extracellular vesicles is, for example, 1 to 500 nm, preferably 10 to 250 nm, more preferably 30 to 150 nm.
  • the average diameter can be measured according to Example 1 described later.
  • the average diameter of the extracellular vesicles can be adjusted, for example, by filtering the liquid containing the extracellular vesicles using a filter or the like having a desired pore size.
  • the extracellular vesicles or composition of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier includes a suspending agent, a solubilizer, a stabilizer, a tonicity agent, a preservative, an antiadsorption agent, a surfactant, a diluent, a medium, and a pH adjuster for administering the extracellular vesicles.
  • soothing agents, buffering agents, sulfur-containing reducing agents, antioxidants, etc. and can be appropriately added within a range that does not impair the effects of the present invention.
  • Extracellular vesicles or compositions of the invention may be used, for example, in vitro or in vivo .
  • Extracellular vesicles or compositions of the invention can be used, for example, as research reagents or as pharmaceuticals.
  • the subject of administration of the extracellular vesicles or composition of the present invention is not particularly limited.
  • the administration subject includes, for example, humans or non-human animals other than humans.
  • non-human animals include mammals such as mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses, pigs, monkeys, dolphins, and sea lions; birds; fish;
  • the subject of administration includes, for example, cells, tissues, organs, organs, etc., and the cells are, for example, cells collected from living organisms.
  • tissue, organ, or organ includes, for example, a tissue (biological tissue) or organ collected from a living body.
  • the cells include muscle cells, iPS cells (induced pluripotent stem cells), stem cells, and the like.
  • the administration subject includes, for example, subjects diagnosed or suspected of having ischemic heart disease.
  • the ischemic heart disease include myocardial infarction, peripheral artery disease, myocardial ischemia-reperfusion injury, severe lower extremity ischemia, and the like.
  • the conditions for use (administration conditions) of the extracellular vesicles or composition of the present invention are not particularly limited, and for example, the dosage form, administration period, dosage, etc. can be appropriately set according to the type of administration subject.
  • Methods for administering extracellular vesicles or compositions of the present invention include, for example, oral administration and parenteral administration such as intravenous administration. Intravenous administration is preferred, as it can be administered over a period of time.
  • the dosage of the extracellular vesicles or compositions of the invention is an effective dosage, specifically for the treatment of ischemic heart disease when administered to a subject relative to the disease compared to a subject who has not been administered. It is the amount at which an effect (therapeutic effect) can be obtained.
  • the dose can be appropriately determined according to, for example, the age, body weight, symptoms, etc. of the subject.
  • the dose is, for example, 10 4 to 10 9 extracellular vesicles/kg body weight, 10 4 to 10 8 cells/kg body weight, 10 4 to 10 7 extracellular vesicles per administration. /kg body weight, preferably 10 4 to 10 8 cells/kg body weight, 10 4 to 10 7 cells/kg body weight.
  • the number of administrations of the extracellular vesicles or composition of the present invention is one or more.
  • the plurality of times is, for example, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times or more.
  • the frequency of administration may be appropriately determined while confirming the therapeutic effect of the subject.
  • the administration interval can be appropriately determined while confirming the therapeutic effect of the subject, for example, once a day, once a week, once every two weeks, once a month, once every three months. , once every six months, etc.
  • the extracellular vesicles or composition of the present invention suppresses the graft rejection reaction and is derived from the regenerative cell population, and thus has physiological activities such as angiogenesis-promoting activity. Therefore, the extracellular vesicles or composition of the present invention can be suitably used for treating ischemic heart disease or improving prognosis, for example, as described later.
  • the invention provides compositions or methods of using same for use in treating ischemic heart disease.
  • the present invention is a composition for use in treating ischemic heart disease, said composition being the extracellular vesicles or composition of the present invention.
  • the present invention also provides a method for treating a patient with ischemic heart disease, comprising administering the extracellular vesicles or composition of the present invention to the patient with ischemic heart disease.
  • the ischemic diseases include, for example, myocardial infarction, peripheral artery disease, myocardial ischemia-reperfusion injury, severe lower extremity ischemia, and the like.
  • the present invention provides compositions for use in promoting proliferation of vascular endothelial cells or methods of using the same.
  • the present invention is a composition for use in promoting proliferation of vascular endothelial cells, wherein the composition is the extracellular vesicle or composition of the present invention.
  • the present invention also provides a method for promoting proliferation of vascular endothelial cells, comprising the step of promoting proliferation of the vascular endothelial cells by contacting the vascular endothelial cells with a composition, wherein the composition comprises: including extracellular vesicles or compositions of the invention.
  • the present invention provides compositions for use in inducing angiogenesis or methods of using the same.
  • the present invention is a composition for use in inducing angiogenesis, wherein the composition is the extracellular vesicle or composition of the present invention.
  • the present invention is also a method of inducing angiogenesis using the extracellular vesicles or compositions of the present invention.
  • the extracellular vesicles or composition is administered to a subject for which angiogenesis is to be induced.
  • the subject to induce angiogenesis is, for example, a patient with ischemic heart disease.
  • the induction of angiogenesis can also be referred to as the induction of angiogenesis in the heart of the patient or in sites where ischemia-reperfusion injury has occurred (eg, central or peripheral blood vessels).
  • the present invention provides a composition for use in inhibiting fibrosis or a method using the same.
  • the present invention is a composition for use in suppressing fibrosis, wherein the composition is the extracellular vesicle or composition of the present invention.
  • the present invention also provides a method for suppressing fibrosis, which uses the extracellular vesicles or composition of the present invention.
  • the extracellular vesicles or composition is administered to a subject whose fibrosis is to be suppressed.
  • Patients with ischemic heart disease for example, can be mentioned as subjects for which fibrosis is to be suppressed.
  • the induction of angiogenesis can also be referred to as suppression of fibrosis in the patient's heart or sites where ischemia-reperfusion injury has occurred (eg, central or peripheral blood vessels).
  • the present invention is an extracellular vesicle or composition for use in treating ischemic heart disease.
  • the present invention is also an extracellular vesicle or composition for use in promoting proliferation of vascular endothelial cells.
  • the present invention is an extracellular vesicle or composition for use in promoting angiogenesis.
  • the present invention is an extracellular vesicle or composition for use in suppressing fibrosis.
  • Example 1 It was confirmed that the extracellular vesicles of the present invention have vascular endothelial cell proliferation activity, angiogenesis-promoting activity, fibrosis-suppressing activity, and reduced graft rejection.
  • a regenerative cell population was prepared by deriving from human peripheral blood mononuclear cells. First, 20-100 ml of peripheral blood was collected from healthy volunteers aged 20-55 using a heparinized butterfly needle attached to a 50 ml syringe. Prior to the collection, informed consent was obtained from each healthy subject. In addition, the collection was performed under the approval of the Medical Research Committee of Tokai University School of Medicine, and the obtained peripheral blood samples were handled in accordance with the biological guidelines for human samples. In addition, the following animal experiments were conducted in accordance with the guidelines for handling experimental animals (National Research Council) and with the approval of the Animal Care and Use Committee of Tokai University School of Medicine.
  • PBMNC peripheral blood mononuclear cells
  • the CD34 positive rate was 0.23 ⁇ 0.03% and the CD133 positive rate was 0.20 ⁇ 0.07% in the isolated PBMNC.
  • the number of CD34-positive cells per 100 ml of peripheral blood was (27.8 ⁇ 4.5) ⁇ 10 4 and the number of CD133-positive cells was (23.2 ⁇ 6.9) ⁇ 10 4 .
  • the serum-free medium (hereinafter also referred to as "QQ medium” or “QQcm") used for culturing (inducing) the regenerative cell population is stemline (trademark) II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium (Sigma-Aldrich, Cat No. S0192).
  • QQ medium used for culturing (inducing) the regenerative cell population
  • stemline trademark
  • QQcm Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium
  • rhSCF (Concentration of each factor in QQ medium): 100 ng/ml rhFlt3L (manufactured by Peprotech, Inc., Cat. No. #300-19): 100 ng/ml rhTPO (manufactured by Peprotech, Inc., Cat. No. #300-18): 20 ng/ml rhVEGF (manufactured by Peprotech, Inc., Cat. No. #100-02): 50 ng/ml rhIL-6 (manufactured by Peprotech, Inc., Cat. No. #200-06): 20 ng/ml Penicillin/streptomycin (manufactured by Gibco, Cat. No. 15140122: 100 U/100 ⁇ g/ml) r: recombinant h: human-derived
  • the composition of the extracellular vesicle-producing medium was X-vivo 15 medium (manufactured by Lonza, Cat. No. BE02-054Q) supplemented with 5 (v/v)% exosome-depleted fetal bovine serum.
  • the resulting cell suspension was plated in 10 cm dishes at 2.5 ⁇ 10 5 cells/ml/dish (250k) or 5 ⁇ 10 5 cells/ml/dish (500k) for 48 hours after seeding. cultured.
  • the culture supernatant (conditioned medium) was recovered, and the cells were removed by centrifuging the culture supernatant at 300 ⁇ g and 4° C. for 10 minutes.
  • the obtained supernatant fraction was centrifuged at 2000 ⁇ g and 12° C. for 20 minutes, and the supernatant fraction was collected to remove apoptotic bodies and microvesicles.
  • the supernatant fraction was filtered through a 0.2 ⁇ m filter (manufactured by Millipore Merck, Cat. No. SLGS033SS) to remove extracellular vesicles with a particle size exceeding 200 nm. Then, the obtained filtrate was centrifuged at 174000 ⁇ g and 4° C.
  • CM-Dil dye (C7000, manufactured by Thermo Fisher) was added to the filtrate after filtration through the 0.2 ⁇ m filter so that the concentration became 2 ⁇ mol/l. , labeled. After centrifuging the obtained reaction solution at 174000 ⁇ g and 4° C. for 110 minutes, the extracellular vesicles were washed with PBS and centrifuged under the same conditions. A similar wash and hyperopia was performed again. Then, the collected precipitate was suspended in the medium or buffer solution (up to 3 ⁇ 50 ⁇ l) used in each experiment described below.
  • extracellular vesicles were measured after calibrating the flow cytometer (DxFlex FACS machine, manufactured by Beckman Coulter) using latex beads of different sizes (100 nm or 200 nm). Furthermore, the particle size of each extracellular vesicle was calculated by comparing the intensity of the obtained side scattered light (SSC) with the intensity of the latex beads and the intensity of each extracellular vesicle. Then, based on the obtained particle diameters, the average diameter (weighted average) was calculated.
  • SSC side scattered light
  • the particle size of each extracellular vesicle was calculated in the same manner except that a nanoparticle tracking analysis (NTA) device (ZetaView (registered trademark), manufactured by DKSH) was used, The average diameter (weighted average) was calculated. Then, it was confirmed that the average diameter obtained by the flow cytometer and the average diameter obtained by the NTA apparatus were almost the same value.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • the expression of the marker is determined by anti-CD9 antibody (PE-labeled, Biolegend, Cat. No. #312106) or anti-CD63 antibody (PE-labeled, Biolegend, Cat. No. #353004). After staining with anti-Alix antibody (Alexa 594-labeled, Biolegend, Cat. No. #634504) and anti-Hsp-70 antibody (Alexa 488-labeled, Biolegend, Cat. No. #648003), It was measured using the flow cytometer described above. Controls were performed in the same manner except that control antibodies were used instead of various antibodies.
  • the amount of extracellular vesicles produced per cell (the number of extracellular vesicles) per 2.5 ⁇ 10 5 cells was calculated based on the sample volume counted and measured by the flow cytometer. .
  • the structure of the lipid membrane and lumen was observed using a scanning electron microscope (JEM-1400, manufactured by JEOL Ltd.).
  • the reference example was performed in the same manner, except that human-derived mesenchymal stem cells (MSC, manufactured by Lonza, Cat. No. BE02-054Q) were used instead of the RAC. These results are shown in FIGS. 1-3. Statistical processing in the graph was performed using the Mann-Whitney test.
  • Figure 1 is a graph showing the particle size, production amount per cell, and average size of extracellular vesicles.
  • FIG. 1 shows the result of particle diameter
  • (B) shows the result of production amount
  • (C) shows the result of average diameter.
  • the horizontal axis indicates the particle diameter (logarithm) and the vertical axis indicates the relative number.
  • the horizontal axis indicates the type of sample
  • the vertical axis indicates the number of extracellular vesicles produced.
  • the horizontal axis indicates the type of sample
  • the vertical axis indicates the average diameter. As shown in FIGS.
  • RAC-derived extracellular vesicles are slightly larger than MSC-derived extracellular vesicles (MSCev), and the average diameter of RACev is 145 nm. while MSCev was 130 nm.
  • RAC produced significantly more extracellular vesicles per cell than MSC.
  • FIG. 2 is an electron microscope image showing the structure of RAC-derived extracellular vesicles.
  • RACev has a lipid bilayer membrane structure and a lumen, the lumen is surrounded by the lipid bilayer membrane, and has a structure similar to that of extracellular vesicles such as MSCev. I was able to confirm that I have.
  • FIG. 3 is a histogram showing the expression of markers.
  • (A) shows the results of RACev
  • (B) shows the results of MSCev.
  • the horizontal axis indicates the intensity of SSC or the fluorescence intensity of each marker
  • the vertical axis indicates the count.
  • FIGS. 3A and 3B the horizontal axis indicates the intensity of SSC or the fluorescence intensity of each marker, and the vertical axis indicates the count.
  • the left diagram of FIG. 3(A) it was found that the particle size of extracellular vesicles can be measured with a flow cytometer by using latex beads with a known particle size.
  • the expression of CD63 and CD9 was confirmed in RACev.
  • RACev had a higher expression level of CD63 than MSCev. Although not shown in FIG. 3(A), the expression of Alix and HSP70 was also confirmed in RACev. These results show that RACev expresses exosome markers and can be distinguished from MSCev by CD9 and Alix expression.
  • vascular endothelial Cell Growth-Promoting Activity The vascular endothelial cell growth-promoting activity of RACev was examined using human fetal vascular endothelial cells (HUVEC, manufactured by Lonza, Cat. No. C2517A, Batch #. 18TL061650). . Specifically, after collecting HUVECs that have been subcultured 3 to 4 times, Cytopainter dye (manufactured by Abcam, Cat. No. #ab176735) is added and incubated at 37° C. for 10 to 30 minutes. HUVEC cells were labeled. After the labeling, centrifugation and washing were repeated twice.
  • HUVEC human fetal vascular endothelial cells
  • the obtained HUVEC cells were seeded in a 3.5 cm dish at 5 ⁇ 10 4 cells/2 ml/dish.
  • EGM-2 manufactured by Lonza
  • EBM-2 manufactured by Lonza
  • Extracellular vesicles isolated from 250k or 500k RAC or MSCs were then added to each dish. Then, it was cultured for 2 days under the above culture conditions. After the culture, each dish was observed using a phase-contrast microscope (6-well dish, manufactured by Falcon). In the phase-contrast images obtained, the number of cells per field of view (HPF) was counted, and the ratio of the area occupied by HUVEC cells to the total area was calculated as the growth area.
  • HPF phase-contrast microscope
  • HUVEC cells were recovered from the dish, and division of the HUVEC cells was measured using the above label as an index using a flow cytometer (FACS Verse, manufactured by BD Biosciences). Moreover, control was implemented similarly except that RACev and MSCev were not added.
  • miRNA analysis was performed on RACev and MSCev added during HUVEC cell culture.
  • miRNA was purified using miRNA purification kits (miRNeasy mini kit and RNeasy MinElute Cleanup Kit, manufactured by QIAGEN).
  • a library for sequencing was prepared using the obtained miRNA and a library construction kit (QIAseq (trademark) miRNA Library Kit, manufactured by Qiagen, Cat. No. #331505).
  • QIAseq (trademark) miRNA Library Kit manufactured by Qiagen, Cat. No. #331505
  • a quality check of the library was performed using Agilent Bioanalyze and a DNA chip (High Sensitivity DNA chip, manufactured by Agilent Technologies).
  • the sequence of the library was decoded as a 76 bp (bp) single-ended read using a next-generation sequencer (NextSeq 500, manufactured by Illumina). Then, from the obtained sequence data, the expression level of each miRNA (miR-181b-3p, miR-150-5p, miR-302a-5p, miR-92a-2-5p) was calculated. The relative expression level was calculated based on the expression level of each miRNA in HUVEC cells to which extracellular vesicles were not added.
  • NextSeq 500 next-generation sequencer
  • Figure 4 is a graph showing the proliferation of HUVEC cells.
  • the horizontal axis indicates the type of sample, and the vertical axis indicates the number of cells per field of view (HPF).
  • RACev and MSCev promoted proliferation of vascular endothelial cells compared to controls.
  • RACev significantly promoted the proliferation of vascular endothelial cells compared to MSCev (MSCev-250K vs. RACev-250K: P>0.001, MSCev-500K vs. RACev-500K : P>0.0001).
  • FIG. 5 is a photograph and graph showing the growth area of HUVEC cells.
  • (A) shows a phase contrast image
  • (B) shows a graph of growth regions.
  • the horizontal axis indicates the type of sample
  • the vertical axis indicates the growth region.
  • RACev and MSCev increased the growth area of vascular endothelial cells compared to the control.
  • RACev significantly increased the growth area of vascular endothelial cells compared to MSCev (MSCev-500K vs. RACev-500K: P>0.0007). .
  • FIG. 6 is a graph showing the expression level of miRNA.
  • the horizontal axis indicates the type of miRNA, and the vertical axis indicates the relative expression level.
  • RACev significantly increased miRNAs with anti-apoptotic activity (miR-92a-2-5p) and miRNAs with mitogenic activity (miR-181b-3p, miR -150-5p, miR-302a-5p) and miRNA with cell migration promoting activity (miR-150-5p) were highly expressed. From these results, it was found that RACev exhibits proliferation-promoting activity for vascular endothelial cells by transporting miRNAs with anti-apoptotic activity and miRNAs with mitogenic activity.
  • ischemic heart disease prognosis is improved when angiogenesis occurs due to proliferation of vascular endothelial cells. Therefore, we confirmed that RACev contributes to improvement of ischemic heart disease using a rat model of myocardial infarction. Specifically, Lewis rats (male, 6 to 10 weeks old, weighing 150 to 250 g, purchased from Charles River Japan) were intubated, and 3 to 4% sevoflurane (manufactured by Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd.) was added at 15 ml/ml. Anesthesia was achieved by inhalation at kg for 65-70 minutes.
  • ischemia-reperfusion injury was induced by reperfusion after 30 minutes of ischemia for the left anterior descending artery (LAD). After the induction, the ribcage was closed immediately.
  • extracellular vesicles (RACev or MSCev) isolated from 500 k RACs or MSCs were diluted with PBS, and the resulting dilutions were incubated for a predetermined time (30 minutes after induction of ischemia-reperfusion injury). , 1 and 2 days later) via the tail vein.
  • the degree of ischemic heart disease was assessed by echocardiography. Specifically, using an echocardiography device (manufactured by Aloka) equipped with a 3.5 MHz probe, left ventricular end diastolic diameter (LVDD), left ventricular end systolic diameter (LVDS), and mitral regurgitation (MR) severity, E-wave and A-wave heights, and left atrial and ascending aorta sizes were measured. The measurements were performed initially before the induction of the ischemia-reperfusion injury (baseline) and then weekly for up to 4 weeks after the induction of the injury. The severity of mitral valve regurgitation was evaluated according to the following criteria.
  • %FS left ventricular diameter shortening fraction
  • Score 3 (severe): reflux reaching the left atrium wall
  • Score 2 (moderate): reflux reaching 2/3 of the left atrium
  • Score 1 (mild/slight): reflux reaching 1/3 of the left atrium
  • FIG. 7 is a photograph showing an echogram and a graph showing the ejection fraction and the left ventricle inner diameter shortening fraction.
  • (A) is the control result
  • (B) is the MSCev result
  • (C) is the RACev result
  • (D) is the ejection fraction result
  • (E) is the left ventricle diameter.
  • Shortening rate results are shown.
  • long arrows indicate examples of LVDD
  • short arrows indicate examples of LVDS.
  • the horizontal axis indicates the time before and after induction of the ischemia-reperfusion injury
  • the vertical axis indicates the ejection fraction.
  • the horizontal axis indicates the time before and after the induction of ischemia-reperfusion injury, and the vertical axis indicates the left ventricular inner diameter shortening ratio.
  • RACev improved ejection fraction and significantly improved left ventricular fractional shortening compared to controls and MSCev.
  • FIG. 8 is a graph showing the severity of mitral valve regurgitation and the left ventricular end-systolic volume.
  • (A) shows the results of severity of mitral valve regurgitation
  • (B) shows the results of left ventricular end-systolic volume.
  • the horizontal axis indicates the time before and after induction of the ischemia-reperfusion injury
  • the vertical axis indicates the severity of mitral regurgitation.
  • the horizontal axis indicates the time before and after induction of the ischemia-reperfusion injury
  • the vertical axis indicates the left ventricular end-systolic volume.
  • RACev improved the severity of mitral regurgitation compared to controls and MSCev and returned to normal levels 4 weeks after the ischemia-reperfusion injury. rice field. Also, as shown in FIG. 8(B), RACev improved left ventricular end-systolic volume compared to controls and MSCev. It is presumed that RACev improved the severity of mitral regurgitation.
  • Fibrosis occurs in ischemic heart disease caused by ischemia-reperfusion injury. Therefore, it was confirmed whether fibrosis is suppressed by administration of RACev.
  • hearts were harvested from the rats. After perfusion with PBS containing 1000 U/ml heparin, the heart was fixed overnight (about 8 hours) with 4% paraformaldehyde (manufactured by Fujifilm, Cat. No. #163-20145). After the fixation, the heart was embedded in paraffin and 3-4 ⁇ m thick paraffin-embedded sections were prepared.
  • FIG. 9 is a graph and photographs showing the degree of fibrosis.
  • (A) shows the size of interstitial fibrosis
  • (B) shows representative examples of each sample.
  • dark gray areas indicate fibrosis areas.
  • FIG. 9A the horizontal axis indicates the type of sample, and the vertical axis indicates the size of interstitial fibrosis.
  • RACev and MSCev significantly suppressed the degree of fibrosis compared to control.
  • FIG. 10 is a graph showing the expression level of miRNA.
  • the horizontal axis indicates the type of miRNA, and the vertical axis indicates the relative expression level.
  • RACev had significantly higher expression levels of miRNAs having fibrosis-suppressing activity than MSCev. From these results, it was found that RACev exhibits anti-fibrosis activity by transporting miRNAs having anti-fibrosis activity.
  • the blood vessel density was calculated from the obtained microscopic images. Controls were performed similarly except that RACev and MSCev were not administered. In addition, for RACev and MSCev added during the culture of HUVEC cells, each miRNA (miR-126-3p, mmiR-195-3p, miR-29c-3p, miR- 126-5p, miR-15b-5p, miR-195-5p, miR-200b-5p, miR-146a-3p, miR-146-5p) were calculated. These results are shown in FIGS. 11-12. For statistical processing in the graph, Dunn's multiple comparison test was performed.
  • FIG. 11 is a photograph and graph showing blood vessels in infarcted myocardial tissue.
  • (A) shows blood vessels in infarcted myocardial tissue and
  • (B) shows the density of blood vessels.
  • the horizontal axis indicates the type of sample, and the vertical axis indicates the density of blood vessels in the infarcted myocardial tissue.
  • RACev significantly increased vascular density compared to controls and MSCev.
  • FIG. 12 is a graph showing the expression level of miRNA.
  • the horizontal axis indicates the type of miRNA, and the vertical axis indicates the relative expression level.
  • RACev had significantly higher expression levels of miRNAs having angiogenesis-promoting activity than MSCev. These results show that RACev exhibits pro-angiogenic activity by transporting miRNAs having pro-angiogenic activity.
  • Example 1 ischemia-reperfusion injury was induced, and the thorax was quickly closed after the induction.
  • Extracellular vesicles (RACev or MSCev) isolated from 500 k RACs or MSCs were then diluted in PBS and the resulting dilutions were administered via the tail vein immediately after induction of the ischemia-reperfusion injury. .
  • Hearts were harvested from the rats 3.5 hours after the administration. Then, the accumulation of RACev in the infarcted myocardial tissue of the heart was measured using a fluorescence imaging system (IVIS Lumina III, Perkin Elmer). The excitation wavelength was 520 nm and the emission wavelength was 570 nm.
  • a luminance value per unit area was calculated from the measured values obtained.
  • 6 ⁇ m-thick frozen sections were prepared from the collected hearts, and the obtained frozen sections were observed with a confocal microscope (LSM880, Carl Zeiss) after nuclear staining. Controls were performed similarly except that RACev or MSCev was not administered. These results are shown in FIGS. 13-14. Statistical processing in the graph was performed using the Mann-Whitney test.
  • FIG. 13 is a photograph showing a fluorescent image of infarcted myocardial tissue.
  • the upper row shows the control results
  • the middle row shows the MSCev results
  • the lower row shows the RACev results.
  • the left column is the result of detection of labeled extracellular vesicles (RACev or MSCev)
  • the middle column is the result of detection of labeled extracellular vesicles (RACev or MSCev) and nuclei
  • the right column is These merge results are shown.
  • RACev and MSCev were observed to accumulate in infarcted myocardial tissue.
  • RACev was accumulated more than MSCev, and uptake into the nuclei of cardiomyocytes was observed as indicated by arrows in the figure.
  • FIG. 14 is a photograph and graph showing the luminescence intensity of infarcted myocardial tissue.
  • (A) is a photograph showing the luminescence intensity of the infarcted myocardial tissue
  • (B) is a graph showing the luminescence intensity per unit area.
  • RACev was observed to accumulate more extracellular vesicles in the infarcted myocardial tissue than MSCev. From the above, it was confirmed that RACev is excellent in accumulating in inflamed tissue.
  • spleens were harvested and weighed.
  • peripheral blood and spleens were collected 4 weeks after the induction.
  • the percentages of CD3-positive cells, CD4-positive cells, CD8-positive cells, regulatory T cells and CD11b/c-positive cells in the peripheral blood were measured using a flow cytometer.
  • the ratio of CD3-positive cells, CD4-positive cells, CD8-positive cells, TNK, iNK and antigen-presenting cells, which are markers of graft rejection in the spleen, to regulatory T cells was measured using a flow cytometer. was measured using Controls were performed similarly except that RACev and MSCev were not administered.
  • FIG. 15 is a graph showing rat body weight and spleen weight.
  • (A) shows the results of rat body weight
  • (B) shows the results of spleen weight.
  • the horizontal axis indicates the time of measurement based on ischemia-reperfusion induction
  • the vertical axis indicates the body weight of the rat.
  • the horizontal axis indicates the time of measurement based on ischemia-reperfusion induction (IR-injury)
  • the vertical axis indicates the weight of the spleen.
  • FIGS. 15(A) and (B) there was no difference between RACev, MSCev and controls, and no graft rejection was observed.
  • FIG. 16 is a graph showing the ratio of CD3-positive cells, CD4-positive cells, CD8-positive cells, regulatory T cells and CD11b/c-positive cells.
  • the horizontal axis indicates the type of sample, and the vertical axis indicates the proportion of each cell. As shown in Figure 16, there was no difference between RACev, MSCev and controls and no graft rejection was observed.
  • FIG. 17 is a graph showing the ratio of CD3-positive cells, CD4-positive cells, CD8-positive cells, TNK, iNK, regulatory T cells and CD11b/c-positive cells.
  • the horizontal axis indicates the type of sample, and the vertical axis indicates the percentage of each cell. As shown in Figure 17, there was no difference between RACev, MSCev and controls and no graft rejection was observed.
  • FIG. 18 is a graph showing the expression level of miRNA.
  • the horizontal axis indicates the sample type, and the vertical axis indicates the relative expression level.
  • RACev had a significantly higher expression level of miRNA (miR-142-3p) having immunosuppressive activity (anti-inflammatory) than MSCev.
  • miR-142-3p is known to be contained in exosomes released by regulatory T cells (Treg). These results suggest that RACev suppresses graft rejection by transporting miRNAs with immunosuppressive activity.
  • the extracellular vesicles of the regenerative cell population i.e., the extracellular vesicles of the present invention, have vascular endothelial cell proliferation activity, angiogenesis-promoting activity, and fibrosis-suppressing activity. , and graft rejection were found to be reduced.
  • Example 2 It was confirmed that a regenerative cell population can be induced by culturing peripheral blood mononuclear cells or cord blood mononuclear cells with various factors.
  • Peripheral blood mononuclear cells were prepared in the same manner as in Example 1(1).
  • Cord blood mononuclear cells were also prepared in the same manner, except that cord blood was used instead of the peripheral blood.
  • peripheral blood mononuclear cells and the umbilical cord blood mononuclear cells were regenerated in the same manner as in Example 1 (1) except that the serum-free medium and each factor were used under conditions 1 to 6 below.
  • Sexual cell populations (RAC) were prepared.
  • the combination of the peripheral blood mononuclear cells and condition 6 below corresponds to the culture conditions of Example 1(1).
  • the number of cells in the resulting regenerative cell population was counted.
  • the relative ratio of the number of cells was calculated based on the number of seeded cells. Controls were the peripheral blood mononuclear cells and cord blood mononuclear cells.
  • SS3G Serum-free medium StemSpan SFEM (manufactured by Stemcell Technologies) Each factor: rhSCF: 100ng/ml rhFlt3L: 100ng/ml rhTPO: 20ng/ml ⁇ Condition 2: SS5G Serum-free media: StemSpan SFEM Each factor: rhSCF: 100ng/ml rhFlt3L: 100ng/ml rhTPO: 20ng/ml rhVEGF: 50ng/ml rhIL-6: 20ng/ml ⁇ Condition 3: SC3G Serum-free medium: StemCell Each factor: rhSCF: 100ng/ml rhFlt3L: 100ng/ml rhTPO: 20ng/ml ⁇ Condition 4: SC5G Serum-free medium: StemCell Each factor: rhSCF: 100ng/ml rhFlt3L: 100ng/ml
  • FIG. 19 is a graph showing the number of cells.
  • (A) shows the results using peripheral blood mononuclear cells
  • (B) shows the results using cord blood mononuclear cells.
  • the horizontal axis indicates the conditions
  • the vertical axis indicates the relative ratio of cell numbers.
  • FIG. 19(A) when the peripheral blood mononuclear cells were used, the number of cells decreased under any conditions.
  • the number of cells increased by using 5 factors compared to the case of using 3 factors.
  • the cord blood mononuclear cells when the cord blood mononuclear cells were used, the number of cells decreased under any conditions.
  • StemSpan SFEM was used as the serum-free medium, the number of cells increased compared to when other media were used.
  • EPC-CFA EPC colony formation assay
  • FIG. 20 is a graph showing the results of the EPC-CFA assay.
  • (A) shows the results using peripheral blood mononuclear cells
  • (B) shows the results using cord blood mononuclear cells.
  • the horizontal axis indicates the conditions
  • the vertical axis indicates the number of colonies of each EPC cell per 20,000 seeded cells.
  • FIG. 20(A) almost no SEPC-CFU and DEPC-CFU were formed in the peripheral blood mononuclear cells.
  • culturing under conditions 1 to 6 improved the ability of the peripheral blood mononuclear cell-derived cells to form SEPC-CFU and DEPC-CFU.
  • the ability to form SEPC-CFU and DEPC-CFU is improved in the conditions 1 to 5 as in the condition 6, the peripheral blood mononuclear cells are induced by the conditions 1 to 5. It was also suggested that the cell group obtained from this method can be used as a regenerative cell group.
  • SEPC-CFU and DEPC-CFU were formed to the same extent in the cord blood mononuclear cells.
  • culturing under conditions 1 to 6 improved the ability of the peripheral blood mononuclear cell-derived cells to form SEPC-CFU and DEPC-CFU.
  • the ability to form DEPC-CFU was improved. It was suggested that the cell populations induced by 1 to 6 could also be used as regenerative cell populations.
  • the umbilical cord-derived extracellular vesicles of the present invention have miRNA having angiogenesis-promoting activity, miRNA having anti-apoptotic activity, miRNA having anti-fibrosis activity, miRNA having anti-fibrosis activity, and cell proliferation-promoting activity. Containing miRNA was confirmed.
  • An umbilical cord-derived regenerative cell population was prepared by deriving from human cord blood-derived mononuclear cells or human cord blood-derived CD34-positive progenitor cells.
  • human cord blood-derived mononuclear cells hereinafter, “CBMCs”, manufactured by Takara Bio Inc.
  • CD34 cells human cord blood-derived CD34-positive vascular endothelial progenitor cells
  • CBMCs human cord blood-derived mononuclear cells
  • CD34 cells human cord blood-derived CD34-positive vascular endothelial progenitor cells
  • the CBMCs were seeded in a 10-cm dish (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) at 10 ⁇ 10 7 cells/10 ml/dish, and cultured for 7 days under conditions of 37° C., 5% CO 2 , and a humid environment. After seeding the CD34 cells in a 10 cm dish (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) at 10 ⁇ 10 5 cells/10 ml/dish, the cells were kept at 37° C., 5% CO 2 in a humid environment for 7 days. cultured. This prepared a regenerative cell population (RAC).
  • RAC regenerative cell population
  • the CBMCs or CD34 cells were collected and then suspended in an extracellular vesicle production medium to prepare a cell suspension.
  • the composition of the extracellular vesicle-producing medium was X-vivo 15 (manufactured by Lonza, Cat. No. BE02-054Q) to which 5 (v/v)% exosome-depleted fetal bovine serum was added. After the preparation, the cells were cultured for 48 hours.
  • the culture supernatant (conditioned medium) was collected, and the cells were removed by centrifuging the culture supernatant at 300 xg and 4°C for 10 minutes.
  • the obtained supernatant fraction was centrifuged at 2000 ⁇ g and 12° C. for 20 minutes, and the supernatant fraction was collected to remove apoptotic bodies and microvesicles.
  • the supernatant fraction was filtered through a 0.2 ⁇ m filter (manufactured by Millipore Merck, Cat. No. SLGS033SS) to remove extracellular vesicles with a particle size exceeding 200 nm.
  • the obtained filtrate was centrifuged at 174000 ⁇ g and 4° C. for 110 minutes to precipitate and collect extracellular vesicles (exosomes).
  • each miRNA (miR-17-3p, miR-20b-5p, miR-92a-3p, miR-103a-2-5p, miR-126b-3p, miR-144-5p, miR-144-5p, miR- 148a-3p, miR-181b-3p, miR-200a-3p, miR-205-5p, miR-373-3p, miR-509-3p, miR-633) were calculated. These results are shown in FIG. As statistical processing in the graph, Tukey's multiple comparison test was performed after the Two-way ANOVA test.
  • FIG. 21 is a graph showing the expression level of miRNA.
  • (A) shows the expression level of miRNA with pro-angiogenic activity
  • (B) shows the expression level of miRNA with anti-apoptotic activity
  • (C) shows the miRNA with anti-fibrotic activity
  • (D) shows the expression level of miRNA having anti-inflammatory activity
  • (E) shows the expression level of miRNA having cell proliferation promoting activity.
  • the horizontal axis indicates the type of RNA
  • the vertical axis indicates the relative expression level. As shown in FIG.
  • CB-MNCev has significantly more miRNAs with pro-angiogenic activity (miR-633, miR-126-3p) and miRNAs with anti-apoptotic activity (miR-92a -3p, miR-509-3p, miR-20b-5p, miR-200a-3p), miRNAs with antifibrotic activity (miR-373-3p, miR-200a-3p), miRNAs with anti-inflammatory activity ( miR-144-5p, miR-148a-3p), and miRNAs with cell proliferation promoting activity (miR-103a-2-5p, miR-633, miR-181b-3p, miR-20b-5p, miR-200a- 3p, miR-17-3p, miR-205-5p) were highly expressed.
  • CB-MNCev is capable of suppressing miRNAs with pro-angiogenic activity, miRNAs with anti-apoptotic activity, miRNAs with anti-fibrotic activity, miRNAs with anti-fibrotic activity, and miRNAs with cell proliferation-promoting activity. found to contain
  • each miRNA (miR-10a-3p, miR-17-3p, miR-20b-5p, miR-21-5p, miR-24-2-5p, miR-29a-5p, miR- 29c-3p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-32-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-133a- 3p, miR-133b, miR-199b-5p, miR-210-3p, miR-221-5p, miR-324-5p, miR-363-3p, let-7c-5p). did. These results are shown in FIG. As statistical processing in the graph, Tukey's multiple comparison test was performed after the Two-way ANOVA test.
  • FIG. 22 is a graph showing the expression level of miRNA.
  • (A) shows the expression level of miRNA with pro-angiogenic activity
  • (B) shows the expression level of miRNA with anti-apoptotic activity
  • (C) shows the miRNA with anti-fibrotic activity
  • (D) shows the expression level of miRNA having anti-inflammatory activity
  • (E) shows the expression level of miRNA having cell growth promoting activity.
  • the horizontal axis indicates the type of miRNA, and the vertical axis indicates the relative expression level. As shown in FIG.
  • CB-CD34ev has significantly more angiogenesis-promoting miRNAs (miR-126-3p, miR-210-3p, let-7c-5p, miR-126 -5p, miR-221-5p), miRNAs with anti-apoptotic activity (miR-199b-5p, miR-30e-5p, miR-30e-3p, miR-30c-5p, miR-30b-5p, miR-32 -5p, miR-20b-5p, miR-363-3p), miRNAs with antifibrotic activity (miR-29c-3p, miR-29a-5p, miR-21-5p, miR-133b, miR-133a- 3p), miRNAs with anti-inflammatory activity (miR-21-5p, miR-24-2-5p, miR-10a-3p), and miRNAs with cell proliferation-promoting activity (miR-20b-5p, miR-363- 3p, miR-324-5p, miR-17-3p) were highly expressed.
  • CB-CD34ev is capable of suppressing miRNAs with pro-angiogenic activity, miRNAs with anti-apoptotic activity, miRNAs with anti-fibrosis activity, miRNAs with anti-fibrosis activity, and miRNAs with cell proliferation-promoting activity. found to contain
  • cord blood-derived mononuclear cells or CD34-positive progenitor cells have angiogenesis-promoting activity, inflammation-suppressing activity, and apoptosis-suppressing activity. It was suggested to have vascular endothelial cell proliferation activity and to have anti-fibrosis activity.
  • composition> (Appendix 1) A composition comprising extracellular vesicles of a regenerative cell population or culture thereof derived from mononuclear cells from a biological sample.
  • the extracellular vesicles are miR-15b-5p, miR-29b-3p, miR-29c-3p, miR-92a-2-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-133a-3p , miR-133b, miR-146a-3p, miR-146b-5p, miR-150-5p, miR-181b-3p, miR-195-3p, miR-195-5p, miR-200b-5p, miR-302a -5p, and/or miR-142-3p.
  • the extracellular vesicles are miR-10a-3p, miR-17-3p, miR-20b-5p, miR-21-5p, miR-24-2-5p, miR-29a-5p, miR-30b -5p, miR-30c-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-32-5p, miR-92a-3p, miR-103a-2-5p, miR-144-5p, miR-148a -3p, miR-199b-5p, miR-200a-3p, miR-205-5p, miR-210-3p, miR-221-5p, miR-324-5p, miR-363-3p, miR-373-3p , miR-509-3p, miR-633, and/or let-7c-5p.
  • (Appendix 4) The composition of any one of Appendices 1 to 3, wherein said extracellular vesicles are CD9 and/or CD63 positive.
  • (Appendix 5) The composition according to any one of appendices 1 to 4, wherein the extracellular vesicles have an average diameter of 10 to 500 nm.
  • (Appendix 6) 6.
  • (Appendix 7) 7.
  • (Appendix 8) The composition according to any one of Appendices 1 to 7, which has fibrosis-suppressing activity.
  • (Appendix 9) 9.
  • composition according to any one of Appendices 1 to 8, wherein graft rejection is inhibited. (Appendix 10) 10.
  • the regenerative cell population is induced by culturing the mononuclear cells in the presence of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin, and/or vascular endothelial cell growth factor. 11.
  • the composition according to any one of 1-10. (Appendix 12) 12.
  • Appendix 13 13.
  • Appendix 14 14.
  • the composition of paragraph 13, wherein the vascular endothelial progenitor cells are differentiated EPC colony forming cells.
  • the composition of paragraphs 13 or 14, wherein the anti-inflammatory macrophages are M2 macrophages.
  • Appendix 16 16.
  • composition for use in treating ischemic heart disease comprising: 18.
  • Appendix 19 19. The composition of paragraph 18, wherein said ischemic heart disease is myocardial infarction.
  • composition promoting proliferation of vascular endothelial cells (Appendix 20) A composition for use in promoting proliferation of vascular endothelial cells, 18. A composition, wherein the composition is a composition according to any one of Appendices 1 to 17.
  • ⁇ Angiogenesis-inducing composition> (Appendix 21) A composition for use in inducing angiogenesis, comprising: 18. A composition, wherein the composition is a composition according to any one of Appendices 1 to 17.
  • ⁇ Fibrosis suppressing composition> (Appendix 22) A composition for use in inhibiting fibrosis, comprising: 18. A composition, wherein the composition is a composition according to any one of Appendices 1 to 17.
  • a method of treating a patient with ischemic heart disease comprising: 18.
  • a method of treatment comprising administering a composition according to any one of appendices 1 to 17 to said patient with ischemic heart disease.
  • Appendix 24 24.
  • ⁇ Method for Promoting Proliferation of Vascular Endothelial Cells> (Appendix 25) A method for promoting proliferation of vascular endothelial cells, comprising: A step of promoting proliferation of the vascular endothelial cells by contacting the vascular endothelial cells with a composition, 18. The method, wherein the composition is a composition according to any of Appendixes 1-17.
  • ⁇ Method of inducing angiogenesis> (Appendix 26) A method for inducing angiogenesis, comprising: 18. A method using a composition according to any one of appendices 1-17. (Appendix 27) 27. The method of paragraph 26, wherein said composition is administered to a subject to induce angiogenesis.
  • Subjects for inducing angiogenesis are patients with ischemic heart disease, 29.
  • ⁇ Method for inhibiting fibrosis> (Appendix 29) A method for inhibiting fibrosis, comprising: 18. A method using a composition according to any one of appendices 1-17. (Appendix 30) 30. The method of appendix 29, wherein the composition is administered to a subject whose fibrosis is to be suppressed.
  • the target for suppressing fibrosis is a patient with ischemic heart disease, 31.
  • appendix 29 or 30, wherein the inhibition of fibrosis is inhibition of fibrosis in the heart of the patient with ischemic heart disease.
  • Appendix 32 A composition for use in treating ischemic heart disease, 18. The composition according to any one of Appendices 1 to 17.
  • Appendix 33 A composition for use in promoting proliferation of vascular endothelial cells, 18. The composition according to any one of Appendices 1 to 17.
  • Appendix 34 A composition for use in inducing angiogenesis, 18. The composition according to any one of Appendices 1 to 17.
  • Appendix 35 A composition for use in inhibiting fibrosis, 18. The composition according to any one of Appendices 1 to 17.
  • the extracellular vesicles or composition of the present invention suppresses the graft rejection reaction and is derived from the regenerative cell population. It has physiological activities such as Therefore, the present invention can be suitably used, for example, for treatment of ischemic heart disease or improvement of prognosis. Therefore, the present invention is extremely useful in, for example, the medical field.

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Abstract

移植片拒絶反応が低減され、かつ生理活性を有する細胞由来の細胞外小胞を提供する。　本発明の組成物は、生体試料由来の単核球から誘導された再生性細胞集団またはその培養物の細胞外小胞を含む。

Description

組成物およびその用途
　本発明は、組成物およびその用途に関する。
　炎症性疾患、虚血性疾患等の様々な疾患において、細胞を用いた治療が試みられている。前記細胞としては、自家細胞が用いられている。しかしながら、自家細胞を用いる場合、患者から細胞を取得後、加工して、前記患者に投与する必要があるため、時間を要し、かつ加工間の処理のばらつきの問題がある。このため、他家細胞による治療も試みられている（特許文献１）。
特表２０１１－５２９９５７号公報
　しかしながら、前記患者に前記他家細胞を移植した場合、前記移植後、前記他家細胞に対する免疫反応（移植片拒絶反応）が惹起され、前記他家細胞が、前記患者から排除され、十分な治療効果が得られないという問題がある。
　そこで、本発明は、移植片拒絶反応が低減され、かつ生理活性を有する細胞由来の細胞外小胞の提供を目的とする。
　前記目的を達成するため、本発明の組成物は、生体試料由来の単核球から誘導された再生性細胞集団またはその培養物の細胞外小胞を含む。
　本発明は、虚血性心疾患の処置に用いるための組成物であって、
前記組成物は、前記本発明の組成物である。
　本発明は、血管内皮細胞の増殖促進に用いるための組成物であって、
前記組成物は、前記本発明の組成物である。
　本発明は、血管新生の誘導に用いるための組成物であって、
前記組成物は、前記本発明の組成物である。
　本発明は、線維化の抑制に用いるための組成物であって、
前記組成物は、前記本発明の組成物である。
　本発明によれば、移植片拒絶反応が低減され、かつ生理活性を有する細胞外小胞を提供できる。
図１は、実施例１における細胞外小胞の粒子径、細胞あたりの産生量および平均径を示すグラフである。 図２は、実施例１におけるＲＡＣ由来の細胞外小胞の構造を示す電子顕微鏡像である。 図３は、実施例１におけるマーカーの発現を示すヒストグラムである。 図４は、実施例１におけるHUVEC細胞の増殖を示すグラフである。 図５は、実施例１におけるHUVEC細胞の成長領域を示す写真およびグラフである。 図６は、実施例１におけるｍｉＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図７は、実施例１におけるエコー図を示す写真と、駆出率および左室内径短縮率を示すグラフである。 図８は、実施例１における僧帽弁逆流の重症度および左室収縮終期容積を示すグラフである。 図９は、実施例１における線維化の程度を示すグラフおよび写真である。 図１０は、実施例１におけるｍｉＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図１１は、実施例１における梗塞心筋組織における血管を示す写真である。 図１２は、実施例１におけるｍｉＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図１３は、実施例１における梗塞心筋組織の蛍光像を示す写真である。 図１４は、実施例１における梗塞心筋組織の発光強度を示す写真およびグラフである。 図１５は、実施例１におけるラットの体重および脾臓の重量を示すグラフである。 図１６は、実施例１におけるＣＤ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、制御性Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の割合を示すグラフである。 図１７は、実施例１におけるＣＤ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、ＴＮＫ、ｉＮＫ、制御性Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の割合を示すグラフである。 図１８は、実施例１におけるｍｉＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図１９は、実施例２における細胞数を示すグラフである。 図２０は、実施例２におけるＥＰＣ－ＣＦＡアッセイの結果を示すグラフである。 図２１は、実施例３における、ｍｉＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図２２は、実施例３における、ｍｉＲＮＡの発現量を示すグラフである。
＜定義＞
　本明細書において、「生体試料」は、生体に由来する試料であり、前記生体を構成する細胞を抽出または単離可能な試料を意味する。
　本明細書において、「単核球」は、末梢血、骨髄または臍帯血等に含まれる円形核を持つ細胞を意味する。前記単核球は、例えば、リンパ球、単球、マクロファージ、血管内皮前駆細胞、造血幹細胞等が含まれる。前記単核球は、さらにＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞を含んでもよい。
　本明細書において、「細胞外小胞」は、細胞から分泌される膜を有する小胞を意味する。前記細胞外小胞は、一般的に、由来する細胞のエンドソーム内で形成された後、前記細胞の外に放出されると考えられている。このため、前記細胞外小胞は、通常、脂質二重膜と、内腔とを含み、前記内腔は、前記脂質二重膜に囲われた構造を有する。また、前記脂質二重膜は、由来する細胞の細胞膜由来の脂質を含む。そして、前記内腔は、由来する細胞由来の細胞質を含む。前記細胞外小胞は、その大きさおよび／または表面マーカーにより、例えば、エクソソーム（exosome）、マイクロベシクル（micro vesicle：MV）、アポトーシス小体等に分類される。
　本明細書において、「再生性細胞集団」は、再生機能を有する細胞を含む細胞集団を意味する。前記再生機能は、組織、器官、または臓器の機能を修復または改善する機能を意味し、いずれか一つの機能を奏すればよい。具体例として、前記再生機能は、血管内皮細胞の増殖活性および／または血管新生促進活性等があげられる。
　本明細書において、「細胞集団」は、所望の細胞を含む細胞調製物または所望の細胞を含む組成物を意味する。このため、本明細書において、前記細胞集団は、例えば、細胞調製物または組成物ということもできる。前記細胞集団において、全細胞に占める所望の細胞の割合（以下、「純度」ともいう）は、例えば、所望の細胞が発現する１以上のマーカー発現する細胞の割合として定量できる。前記純度は、例えば、生細胞中の割合である。前記純度は、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学的手法、インシチュハイブリダイゼーション等の方法により測定できる。
　本明細書において、前記細胞調製物の純度は、例えば、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上である。
　本明細書において、「培養物」は、対象の細胞を培養することにより得られる細胞および／または前記細胞の培地を含む物を意味する。
　本明細書において、「臍帯」は、胎児と胎盤を繋ぐ白色の管状組織を意味する。本発明において、「臍帯」の由来は、特に制限されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、イルカ、アシカ等の哺乳類の臍帯があげられ、好ましくは、霊長類哺乳動物の臍帯であり、より好ましくは、ヒトの臍帯である。
　本明細書において、「臍帯血」は、臍帯に含まれる胎児由来の血液を意味する。
　本明細書において、「ｍｉＲＮＡ」は、約１８～約２５塩基長のノンコーディングＲＮＡを意味する。前記ｍｉＲＮＡは、「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲ」等ということもできる。
　本明細書において、「ｍｉＲＮＡ前駆体」は、ゲノムＤＮＡを起源とし、１つ以上のｍｉＲＮＡ配列を含むノンコーディングのＲＮＡを含む転写物を意味する。前記ｍｉＲＮＡ前駆体は、「ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ」（プリｍｉＲＮＡ）、または「ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ」（プレｍｉＲＮＡ）ということもできる。前記ｍｉＲＮＡ前駆体は、通常、ヘアピン構造を有し、かつ成熟したｍｉＲＮＡの塩基配列を含有する。
　本明細書において、「ｍｉｒ－Ｘ」は、番号ＸのｍｉＲＮＡ前駆体を指し、「ｍｉＲ－Ｘ」は、番号ＸのｍｉＲＮＡの成熟型（ｍｉＲＮＡ）を指す。本明細書において、２つのｍｉＲＮＡが同じｍｉＲＮＡ前駆体の反対のアームを起源とする場合、２つのｍｉＲＮＡは、「－３ｐ」または「－５ｐ」という接尾辞を用いて示す。以下、特に示さない限り、前記「ｍｉＲ－Ｘ」は、ｍｉＲＮＡ前駆体が２つのｍｉＲＮＡを含む場合、－３ｐおよび－５ｐの両者のｍｉＲＮＡを指す。また、本明細書において、２つのｍｉＲＮＡの相対的発現量が公知であり、一方のｍｉＲＮＡの発現量が、他方のｍｉＲＮＡの発現量より低い場合、前記発現量の低いｍｉＲＮＡは、名称の後にアスタリスクを用いて示す。各「ｍｉｒ－Ｘ」および「ｍｉＲ－Ｘ」の塩基配列等の情報は、ｍｉＲＢａｓｅ（http://www.mirbase.org/）を参照できる。
　本明細書において、「細胞の増殖促進」は、対象細胞の増殖が有意に促進されていることを意味する。前記対象細胞は、所望の細胞である。前記促進は、向上、増強、または増加ということもできる。具体例として、前記「細胞の増殖促進」は、被検物質の処理群が、前記被検物質を処理していない対照群または細胞増殖促進活性を有さない物質で処理した対照群と比較して、前記対象細胞の増殖が有意に促進されていることを意味する。このため、本明細書において、前記対照群において、前記対照群の試験開始時と比較して細胞増殖活性が低下していても、前記対照群と比較して、前記対象細胞の細胞増殖が有意に促進されていれば、「細胞の増殖促進」が生じているといえる。前記細胞増殖活性は、例えば、後述の実施例１に準じて測定できる。
　本明細書において、「血管新生促進」は、血管の新生または増生が有意に促進されていることを意味する。前記促進は、向上、増強、または増加ということもできる。具体例として、前記「血管新生促進」は、被検物質の処理群が、前記被検物質を処理していない対照群または血管新生促進活性を有さない物質で処理した対照群と比較して、前記血管の新生または増生が有意に促進されていることを意味する。このため、本明細書において、前記対照群において、前記対照群の試験開始時と比較して血管の新生または増生量が低下していても、前記対照群と比較して、前記血管の新生または増生量が有意に促進されていれば、「血管新生促進」が生じているといえる。前記血管新生促進活性は、例えば、後述の実施例１に準じて測定できる。
　本明細書において、「線維化抑制」は、対象の線維化が有意に抑制されていることを意味する。前記抑制は、低減、低下、抑止、阻害、または防止ということもできる。具体例として、前記「線維化抑制」は、被検物質の処理群が、前記被検物質を処理していない対照群または線維化抑制活性を有さない物質で処理した対照群と比較して、前記対象の線維化が有意に抑制されていることを意味する。このため、本明細書において、前記対照群において、前記対照群の試験開始時と比較して線維化が抑制されていても、前記対照群と比較して、前記対象の線維化が有意に抑制されていれば、「線維化抑制」が生じているといえる。前記線維化抑制活性は、例えば、後述の実施例１に準じて測定できる。
　本明細書において、「移植片拒絶反応」または「免疫拒絶」は、細胞、組織、器官、または臓器の移植において、主要組織適合性抗原の違いに起因して宿主において惹起される移植片を排除する宿主反応を意味する。前記移植片拒絶反応は、同一種間の場合、「アロ反応」または「同種移植片拒絶反応」ということもできる。また、前記移植片拒絶反応は、異種間の場合、「異種移植片拒絶反応」ということもできる。前記「移植片拒絶反応」は、例えば、後述の実施例１に準じて測定できる。
　本明細書において、「移植片拒絶反応の抑制」または「免疫拒絶の抑制」は、移植片拒絶反応または免疫拒絶が有意に抑制されていることを意味する。前記抑制は、低減、低下、抑止、阻害、または防止ということもできる。前記「移植片拒絶反応の抑制」は、被検物質の処理群が、前記移植片拒絶反応を誘導する物質で処理した対照群と比較して、前記移植片拒絶反応が有意に抑制されていることを意味する。具体例として、前記細胞外小胞について、前記移植片拒絶反応を検討する場合、前記細胞外小胞の処理群が、前記細胞外小胞の由来細胞で処理した対照群と比較して、前記移植片拒絶反応が有意に抑制されている場合、前記細胞外小胞は、移植片拒絶反応が抑制されているといえる。前記「移植片拒絶反応」は、例えば、後述の実施例１に準じて測定できる。
　本明細書において、「抽出」は、特定の成分が、抽出前より濃縮された状態を意味する。このため、前記抽出は、濃縮または富化ということもできる。前記「抽出」は、例えば、少なくとも1つの濃縮工程を得ることにより実施できる。
　本明細書において、「単離」は、特定の成分が同定され、かつ分離された状態、および／または自然状態での成分から回収された状態を意味する。前記「単離」は、例えば、少なくとも１つの精製工程を得ることにより実施できる。
　本明細書において、「陽性（＋）」は、抗原抗体反応を利用して検出されるフローサイトメトリー等の解析方法により、前記抗原を発現しない陰性対照細胞または前記抗原と反応しない抗体を用いる陰性対照反応と比較して、高いシグナルが検出されることを意味する。
　本明細書において、「陰性（－）」は、前記抗原を発現しない陰性対照細胞または前記抗原と反応しない抗体を用いる陰性対照反応と比較して、同等またはそれ以下のシグナルが検出されることを意味する。
　本明細書において、「処置」は、治療的処置および／または予防的処置を意味する。本明細書において、「治療」は、疾患、病態、もしくは障害の治療、治癒、防止、抑止、寛解、改善、または、疾患、病態、もしくは障害の進行の停止、抑止、低減、もしくは遅延を意味する。本明細書において、「予防」は、疾患もしくは病態の発症の可能性の低下、または疾患もしくは病態の発症の遅延を意味する。前記「治療」は、例えば、対象疾患を発病する患者に対する治療でもよいし、対象疾患のモデル動物の治療でもよい。
　本明細書において、「有効用量」は、疾患患者に投与した際に、当該疾患の治療効果が得られるのに十分な量を意味する。
　本明細書において、「対象」は、動物または動物由来の細胞、組織もしくは器官を意味し、特にヒトを含む意味で用いられる。前記動物は、ヒトおよび非ヒト動物を意味する。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、イルカ、アシカ等の哺乳類動物があげられる。
　以下、本発明について例をあげて説明するが、本発明は以下の例等に限定されるものではなく、任意に変更して実施できる。また、本発明における各説明は、特に言及がない限り、互いに援用可能である。なお、本明細書において、「～」という表現を用いた場合、その前後の数値または物理値を含む意味で用いる。また、本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」という表現には、「Ａのみ」、「Ｂのみ」、「ＡおよびＢの双方」が含まれる。
＜組成物＞
　ある態様において、本発明は、移植片拒絶反応が低減され、かつ生理活性を有する細胞由来の細胞外小胞またはそれを含む組成物を提供する。本発明の細胞外小胞は、生体試料由来の単核球から誘導された再生性細胞集団またはその培養物の細胞外小胞である。また、本発明の組成物は、生体試料由来の単核球から誘導された再生性細胞集団またはその培養物の細胞外小胞を含む。本発明の細胞外小胞または組成物は、前記移植片拒絶反応が抑制されており、かつ前記再生性細胞集団に由来するため、血管内皮細胞の増殖促進活性、血管新生促進活性等の生理活性を有する。このため、本発明の細胞外小胞または組成物は、例えば、後述のように、虚血性心疾患の治療または予後の改善に好適に使用できる。
　前記再生性細胞集団は、前記生体試料由来の単核球から誘導された細胞集団である。前記再生性細胞集団は、例えば、前記単核球から誘導可能な再生機能を有する細胞を含む。前記再生機能を有する細胞は、例えば、血管内皮前駆細胞、抗炎症性マクロファージ等があげられ、この他に、Ｔｈ２細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）等を含んでもよい。前記血管内皮前駆細胞および前記抗炎症性マクロファージは、例えば、前記再生機能として、血管新生促進活性および抗炎症活性を有するため、潰瘍等の炎症部位において、血管を新生させるだけでなく、炎症をも抑えることができる点で極めて有用である。前記再生性細胞集団は、前記再生機能を有する細胞を１種類または複数種類含む。
　前記血管内皮前駆細胞（Endothelial Progenitor Cell：ＥＰＣ）は、血管内皮細胞への分化能を有する細胞である。前記血管内皮前駆細胞は、例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＫＤＲ（Kinase insert domain receptor、ＣＤ３０９）、ＣＤ１０５等の細胞表面マーカーを用いて特定できる。
　前記血管内皮前駆細胞は、分化の程度によってさらに分類されてもよい。この場合、前記血管内皮前駆細胞は、さらに分化型ＥＰＣコロニー細胞および未分化型ＥＰＣコロニー細胞に分類できる。前記分化型ＥＰＣコロニー細胞は、直径２０～５０μｍの細胞を主に含む（CFU-large cell like EC、以下、「大型ＥＰＣコロニー」ともいう）。前記未分化型ＥＰＣコロニー細胞は、直径２０μｍ以下の細胞を主に含む（CFU-small cell like EC、以下、「小型ＥＰＣコロニー」ともいう）。前記血管内皮前駆細胞から血管内皮細胞への分化において、早い段階で出現する小型ＥＰＣコロニーは、増殖能にすぐれた早期分化段階のＥＰＣコロニーといえ、また遅い段階で出現する大型ＥＰＣコロニーは、血管発生（新生）にすぐれた晩期分化段階のＥＰＣコロニーであるといえる（例えば、Masuda H. et al., Circulation Research, 109: 20-37 (2011)を参照）。前記分化型ＥＰＣコロニー細胞は、例えば、前記未分化型ＥＰＣコロニー細胞と比較して、血管新生または修復等の再生機能に優れているため、前記血管内皮前駆細胞は、分化型ＥＰＣコロニー形成細胞であることが好ましい。
　前記抗炎症性マクロファージは、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－１０、ＩＬ－４）等を分泌するマクロファージの一種であり、血管形成または修復に寄与する細胞である。前記抗炎症性マクロファージは、例えば、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＣＤ１６９等の細胞表面マーカーを用いて特定できる。前記抗炎症性マクロファージは、例えば、前記血管新生または修復等の再生機能に優れていることから、Ｍ２マクロファージが好ましい。
　前記再生性細胞集団の全細胞に占める前記再生機能を有する細胞の割合は、特に制限されず、例えば、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上である。前記細胞の割合は、例えば、前記再生機能を有する細胞表面マーカーを利用して、目的の細胞表面マーカー陽性細胞の割合を測定することにより、算出できる。前記測定は、例えば、フローサイトメトリー法を用いて実施できる。
　前記再生性細胞集団の全細胞に占める前記再生機能を有する細胞の割合は、例えば、前記生体試料由来の単核球における対応する再生機能を有する細胞の割合と比較して、通常、２倍、好ましくは、４倍以上に増加している。
　前記再生機能を有する細胞が前記血管内皮前駆細胞および抗炎症性マクロファージの場合、前記再生性細胞集団の全細胞に占める前記再生機能を有する細胞の割合は、例えば、ＣＤ３４陽性細胞の割合と、ＣＤ２０６陽性細胞の割合の合計割合として、算出できる。
　前記再生性細胞集団において、前記再生機能を有する細胞は、前記単核球から誘導される。このため、前記再生性細胞集団の誘導に用いる生体試料は、前記単核球を含む生体試料であればよい。前記単核球は、血液およびリンパ液に豊富に含まれている。したがって、前記生体試料は、血管および／またはリンパ管を含む、組織、器官、および／または臓器でもよいし、血液および／またはリンパ液でもよい。具体例として、前記生体試料は、例えば、骨髄；臍帯血、末梢血等の血液；リンパ液；等があげられる。
　前記生体試料は、本発明の細胞外小胞および／または組成物の投与、治療、または処置対象（以下、あわせて「投与対象」という）から採取された生体試料であってもよいし、投与対象以外の対象から採取された生体試料であってもよい。調製時に制限を受けないとの観点から、投与対象以外から採取された生体試料を用いることが望ましい。なお、前記再生性細胞集団は、後述する実施例において示されているとおり、投与対象以外から採取された生体試料由来の細胞（他家細胞）でもよいし、投与対象から採取された生体試料由来の細胞（自家細胞）であってもよい。本発明において、前記細胞外小胞は、前記移植片拒絶反応が抑制されているため、投与対象以外から採取された生体試料を用いても、好適に調製できる。また、前記細胞外小胞は、例えば、免疫拒絶等により排除されることなく治療効果を奏することが確認されている。このため、前記細胞外小胞は、例えば、オフザシェルフ（off the shelf）製剤として調製できる。
　前記生体試料の調製方法は、特に制限されず、例えば、前記生体試料の種類に応じて適宜設定できる。具体例として、前記生体試料が骨髄の場合、前記生体試料は、例えば、前記対象に対して骨髄穿刺を実施することにより取得できる。前記生体試料が末梢血の場合、前記生体試料は、例えば、静脈血を採血することにより取得できる。前記生体試料が臍帯血の場合、前記生体試料は、例えば、前記臍帯を単離後、前記臍帯中の血液を採取することにより実施できる。
　前記生体試料からの単核球の分離方法は、当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば、前記生体試料から調製した細胞懸濁液と、フィコール、パーコール等の単核球分離溶液とを用い、前記単核球と、他の成分とを分離することにより実施できる。
　前記生体試料由来の単核球から前記再生機能を有する細胞を誘導する方法は、例えば、前記再生機能を有する細胞の種類に応じて、公知の方法により実施できる。具体例として、前記単核球から血管内皮前駆細胞を誘導する場合、前記誘導方法は、例えば、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、および／またはＶＥＧＦの存在下、前記単核球を培養することにより実施できる。また、前記単核球から抗炎症性マクロファージを誘導する場合、前記誘導方法は、例えば、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、Ｍ－ＣＳＦおよび／またはＧ－ＣＳＦの存在下、前記単核球を培養することにより実施できる。
　前記誘導方法は、前記単核球から前記血管内皮前駆細胞および前記抗炎症性マクロファージの両者を誘導できる方法が好ましい。前記誘導方法は、例えば、国際公開第２０１４／０５１１５４号公報に記載の誘導方法を参照できる。
　前記再生性細胞集団は、例えば、前記血管新生促進活性および前記抗炎症活性を有する細胞外小胞を含む、前記再生機能を有する細胞を誘導できることから、前記単核球を、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、および／または血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等の因子の存在下、培養することが好ましい。前記培養は、前記因子を含む培地を用いて実施できる。
　前記培養に供する単核球は、前記生体試料由来の単核球について所望の細胞集団を選別して得られた所望の細胞集団を用いてもよいし、前記生体試料由来の単核球そのものを用いてもよい。前記培養に供する単核球としては、ＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞の選別を行わずに得られた単核球（無選別単核球）を用いることが好ましい。これにより、前記培養後に得られる前記再生性細胞集団は、例えば、ＣＤ３４陽性細胞として選別した単核球を用いた場合と比較して、前記分化型ＥＰＣコロニー形成細胞が増加（増幅）し、前記抗炎症性マクロファージが増加（増幅）し、さらに、抗炎症性のＴｈ２細胞および制御性Ｔ細胞が増加（増幅）した細胞集団ができる。このため、前記無選別単核球を用いることにより、例えば、前記再生性細胞集団として、前記再生機能を有する細胞の割合が富化した細胞集団を得ることができ、これにより、血管内皮細胞の増殖促進活性、血管新生促進活性、線維化の抑制活性、移植片拒絶反応の抑制活性、免疫抑制活性等の生理活性に優れた細胞外小胞を取得できる。
　前記ＳＣＦは、２４８個のアミノ酸からなる分子量約３０，０００の糖タンパク質である。前記ＳＣＦは、選択的スプライシングにより可溶型および膜結合型が生じる。前記培養に用いるＳＣＦは、ＥＰＣ等の再生性細胞集団の培養に有用である限りいずれのタイプのＳＣＦでもよい。好ましくは可溶型である。前記ＳＣＦの由来等は、特に制限されないが、安定した供給が見込まれることから、組換え体が好ましく、特に好ましくは、ヒト組換え体である。前記ヒト組換えＳＣＦは、商業的に入手可能である。前記培地中のＳＣＦの濃度は、前記ＳＣＦのタイプに応じて設定でき、ＥＰＣ等の再生性細胞集団の培養に有用である限り特に制限されない。具体例として、前記ＳＣＦがヒト組換えＳＣＦである場合、前記培地中のＳＣＦの濃度は、例えば、１０～１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５０～５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１００ｎｇ／ｍｌである。
　前記ＩＬ－６は、Ｂ細胞の抗体産生細胞への最終分化を誘導する因子として単離された分子量約２１，０００の糖タンパク質であり、免疫応答、造血系や神経系細胞の増殖分化、急性期反応等に関与することが知られている。前記ＩＬ－６の由来等は、特に制限されないが、安定した供給が見込まれることから、組換え体が好ましく、特に好ましくは、ヒト組換え体である。前記ヒト組換えＩＬ－６は、商業的に入手可能である。前記培地中のＩＬ－６の濃度は、用いるＩＬ－６のタイプによって異なるが、ＥＰＣ等の再生性細胞集団の培養に有用である限り、特に制限されない。具体例として、前記ＩＬ－６がヒト組換えＩＬ－６である場合、前記培地中のＩＬ－６の濃度は、例えば、１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約２０ｎｇ／ｍｌである。
　前記Ｆｌｔ３Ｌは、初期造血制御において重要な役目を担う受容体型チロシンキナーゼのリガンドとして知られている。前記Ｆｌｔ３Ｌは、いくつかの選択的スプライシングによる産物が知られているが、造血系幹細胞の増殖を刺激するという報告がある。前記Ｆｌｔ３Ｌは、ＥＰＣ等の再生性細胞集団の培養に有用である限り、いずれのタイプのＦｌｔ３Ｌであってもよい。前記Ｆｌｔ３Ｌの由来等は、特に制限されないが、安定した供給が見込まれることから、組換え体が好ましく、特に好ましくは、ヒト組換え体である。前記ヒト組換えＦｌｔ３Ｌは、商業的に入手可能である。前記培地中のＦｌｔ３Ｌの濃度は、用いるＦｌｔ３Ｌのタイプによって異なるが、ＥＰＣ等の再生性細胞集団の培養に有用である限り、特に制限されない。具体例として、前記Ｆｌｔ３Ｌがヒト組換えＦｌｔ３Ｌである場合、前記培地中のＦｌｔ３Ｌの濃度は、例えば、１０～１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５０～５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１００ｎｇ／ｍｌである。
　前記ＴＰＯは、造血系サイトカインの一種であり、造血幹細胞から巨核球が作られる過程に特異的に作用し、巨核球の産生を促進することが知られている。前記ＴＰＯの由来等は、特に制限されないが、安定した供給が見込まれることから、組換え体が好ましく、特に好ましくは、ヒト組換え体である。前記ヒト組換えＴＰＯは、商業的に入手可能である。前記培地中のＴＰＯの濃度は、用いるＴＰＯのタイプによって異なるが、ＥＰＣ等の再生性細胞集団の培養に有用である限り、特に制限されない。具体例として、前記ＴＰＯがヒト組換えＴＰＯである場合、前記培地中のＴＰＯの濃度は、例えば、１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約２０ｎｇ／ｍｌである。
　前記ＶＥＧＦは、ＥＰＣに特異的に作用する増殖因子であり、主に血管周囲の細胞で産生されることが知られている。前記ＶＥＧＦは、選択的スプライシングによってサイズの異なる数種類のタイプのＶＥＧＦタンパク質が産生される。前記ＶＥＧＦは、前記再生性細胞集団に含まれるＥＰＣのコロニー形成が可能であれば、いずれのタイプのＶＥＧＦでもよく、好ましくは、ＶＥＧＦ１６５である。前記ＶＥＧＦの由来等は、特に制限されないが、安定した供給が見込まれることから、組換え体が好ましく、特に好ましくは、ヒト組換え体である。前記ヒト組換えＶＥＧＦは、商業的に入手可能である。前記培地中のＶＥＧＦの濃度は、用いるＶＥＧＦのタイプによっても異なり、ＥＰＣ等の再生性細胞集団の培養に有用である限り、特に制限されない。前記ＶＥＧＦがヒト組換えＶＥＧＦ１６５である場合、前記培地中のＶＥＧＦの濃度は、例えば、約５～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約２０～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約５０ｎｇ／ｍｌである。
　前記培地に添加される各種因子は、前記単核球が由来する動物と同種または異種の動物に由来する因子を用いるが、同種の動物に由来する因子を用いることが好ましい。このように前記単核球および各種因子の由来を統一することにより、同種異系移植等の同種移植に好適な再生性細胞集団およびそれに由来する細胞外小胞が得られる。また、前記投与対象由来の単核球を用いることで、同種同系移植に好適な細胞外小胞を得ることも可能である。このように、異種動物由来の成分を一切含有しない環境でＥＰＣ等を含む再生性細胞集団の培養をすることにより、得られる再生性細胞集団およびそれに由来する細胞外小胞は、投与等に際して感染リスクおよび拒絶反応を低減できる。
　前記培養に用いる培地は、前記各種因子を基礎培地で所定の濃度に溶解することにより調製してもよいし、予め前記各種因子を含有する濃縮液（ストック溶液）を調製し、所望の培地で所定の濃度に希釈することによって調製してもよい。前記培養に用いる培地は、市販の基礎培地に必要な各種因子を所定の濃度となるよう溶解した後、濾過滅菌等により滅菌することにより調製してもよいし、濾過滅菌等により滅菌したストック溶液を無菌的に市販の基礎培地に添加および希釈することによって調製してもよい。前記濾過滅菌は、当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば、孔径０.２２μｍまたは０.４５μｍのミリポアフィルター等を用いて実施できる。
　前記基礎培地は、当分野で通常用いられている基礎培地を利用することができ、例えば造血幹細胞の増殖用培地として知られている基礎培地を用いることができる。前記基礎培地は、血清含有培地でもよいし、血清不含培地、すなわち、無血清培地でもよい。前記再生性細胞集団の培養では、前記培地および／または基礎培地として無血清培地を用いることにより、前記単核球から前記再生性細胞集団の培養（誘導）において、前記再生機能を有する細胞を効率よく誘導（増幅）できる。このため、前記培地は、無血清培地とすることが好ましい。前記培地または基礎培地は、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭ等があげられる。
　前記培地は、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、およびＶＥＧＦからなる群より選択された少なくとも１つ以上の因子、好ましくは、３以上の因子、より好ましくは、全ての因子を含有する。このため、前記培養に用いられる前記培地は、例えば、以下のいずれかを含む。
（１）ＳＣＦ、（２）ＩＬ－６、（３）ＦＬＴ３Ｌ、（４）ＴＰＯ、または（５）ＶＥＧＦ；
（６）ＳＣＦとＩＬ－６との組合せ、（７）ＳＣＦとＦＬＴ３Ｌとの組合せ、（８）ＳＣＦとＴＰＯとの組合せ、（９）ＳＣＦとＶＥＧＦとの組合せ、（１０）ＩＬ－６とＦＬＴ３Ｌとの組合せ、（１１）ＩＬ－６とＴＰＯとの組合せ、（１２）ＩＬ－６とＶＥＧＦとの組合せ、（１３）ＦＬＴ３ＬとＴＰＯとの組合せ、（１４）ＦＬＴ３ＬとＶＥＧＦとの組合せ、または（１５）ＴＰＯとＶＥＧＦとの組合せ；
（１６）ＳＣＦ、ＩＬ－６、およびＦＬＴ３Ｌの組合せ、（１７）ＳＣＦ、ＩＬ－６、およびＴＰＯの組合せ、（１８）ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、およびＴＰＯの組合せ、（１９）ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、およびＶＥＧＦの組合せ、（２０）ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、およびＴＰＯの組合せ、または（２１）ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、およびＶＥＧＦの組合せ；
（２２）ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、およびＴＰＯの組合せ、（２３）ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、およびＶＥＧＦの組合せ、または（２４）ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯおよびＶＥＧＦの組合せ；
（２５）ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯおよびＶＥＧＦの組合せ
　前記培地は、より好ましくは、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、およびＶＥＧＦを含む。前記培地は、さらに好ましくは、約５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６、１００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３Ｌ、および約２０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯを含む。
　前記各種因子を含有する培地を用いた、前記単核球の培養は、前記単核球を含有する細胞懸濁液を、前記各種因子を含有する培地に添加することにより実施できる。前記細胞懸濁液としては、前記単核球を含有する体液（例えば、骨髄液、臍帯血、末梢血）等を用いてもよい。前記単核球の培養条件は、特に制限されず、通常、当分野で実施される条件で実施することができる。具体例として、前記培養条件は、例えば、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で７日間以上（例えば、１０日間以上）培養される。前記単核球の培地中の濃度（播種密度）は、ＥＰＣ等の再生性細胞集団の培養を可能とする限り、特に制限されない。前記単核球の培地中の濃度（播種密度）は、例えば、約０．５～１０×１０５細胞／ｍｌ、より好ましくは、約１～５×１０５細胞／ｍｌ、さらに好ましくは、約３～４×１０５細胞／ｍｌである。
　前記再生性細胞集団の培養物は、前記単核球から前記再生性細胞集団の誘導において得られる培養物でもよいし、誘導された再生性細胞集団を培養することにより得られる培養物でもよい。
　前記再生性細胞集団の培地および培養条件は、特に制限されず、例えば、前記単核球の培地および培養条件の説明を援用できる。具体例として、前記再生性細胞集団の培地は、例えば、前記基礎培地に血清、好ましくは、ヒト由来血清を添加した培地を用いることができる。前記血清の由来は、前記再生性細胞集団の由来と同じでもよいし、異なってもよいが、同じことが好ましい。前記血清には、前記細胞外小胞が含まれている場合がある。このため、前記基礎培地に前記血清を添加する場合、前記血清中の細胞外小胞が除去された血清を用いることが好ましい。前記細胞外小胞が除去された血清は、商業的に入手可能である。前記血清の濃度は、例えば、１～２０（ｖ／ｖ）％、好ましくは、１～１０（ｖ／ｖ）％である。
　前記再生性細胞集団の培養は、前記再生性細胞集団を含有する細胞懸濁液を、前記再生性細胞集団の培地に添加することにより実施できる。前記再生性細胞集団の培養条件は、特に制限されず、通常、当分野で実施される条件で実施することができる。具体例として、前記培養条件は、例えば、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１～１０日間（例えば、１～２日間）培養される。前記再生性細胞集団の培地中の濃度（播種密度）は、前記再生性細胞集団の培養を可能とする限り、特に制限されない。前記再生性細胞集団の培地中の濃度（播種密度）は、例えば、約１×１０４～１×１０７細胞／ｍｌであり、より好ましくは、約１×１０５～１×１０６細胞／ｍｌであり、さらに好ましくは、約５×１０５細胞／ｍｌである。
前記細胞外小胞は、前述のように、由来する細胞から分泌される。このため、前記細胞外小胞は、前記再生性細胞集団またはその培養物から単離または抽出されてもよい。
　前記再生性細胞集団から抽出または単離する場合、前記細胞外小胞は、例えば、前記再生性細胞集団を破砕し、前記再生性細胞集団の細胞内の細胞外小胞を放出させた後、得られた懸濁液から可溶画分を分離後、前記可溶画分に対して、細胞外小胞の単離または抽出方法を実施することにより、単離または抽出できる。前記細胞外小胞の単離または抽出方法は、当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば、遠心分離を用いた方法、前記細胞外小胞の膜に存在する、再生性細胞集団由来の膜タンパク質、または前記膜タンパク質を用いたアフィニティー精製方法、フィルター等の多孔質膜を用いたろ過等により実施できる。前記フィルターとしては、例えば、市販のメンブレンフィルターが利用でき、具体例として、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルター（Millipore社製）を利用できる。前記細胞外小胞の膜タンパク質は、後述する。前記細胞外小胞の単離または抽出は、市販のキットを用いてもよく、具体例として、qEv isolation kit（Izon Sciences社製）を使用できる。
　前記遠心分離により前記細胞外小胞を単離または抽出する場合、前記遠心分離の条件は、前記細胞外小胞を沈殿可能な条件であればよく、具体例として、１００００～３０００００×ｇまたは９００００～１８００００×ｇで、２０～６０分間があげられる。前記遠心分離時の温度は、例えば、０～１０℃、好ましくは、０～４℃である。
　前記培養物は、例えば、前記再生性細胞集団およびその培地（条件培地または培養上清）から構成される。このため、前記培養物から単離する場合、前記細胞外小胞は、前記再生性細胞集団または前記条件培地から単離または抽出してもよいし、前記再生性細胞集団および前記条件培地の両者から分離してもよい。前記培養物から、前記再生性細胞集団と、前記条件培地とを分離する方法は、当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば、フィルターろ過、遠心分離等により実施できる。そして、前記再生性細胞集団を含む場合、前記細胞外小胞は、前述の前記再生性細胞集団から抽出または単離する場合と同様にして、単離または抽出できる。前記条件培地を用いる場合、前記細胞外小胞の単離または抽出方法は、例えば、遠心分離を用いた方法、前記細胞外小胞の膜に存在する再生性細胞集団由来の膜タンパク質、または前記膜タンパク質を用いたアフィニティー精製方法、フィルター等の多孔質膜を用いたろ過等により実施できる。前記細胞外小胞の単離または抽出は、市販のキットを用いてもよく、具体例として、qEv isolation kit（Izon Sciences社製）を使用できる。
　前記細胞外小胞は、前記再生性細胞集団に由来するため、前記細胞外小胞は、前記再生性細胞集団に由来する成分を含有する。前記細胞外小胞は、例えば、脂質二重膜と内腔とを有し、前記内腔は、前記脂質二重膜に囲われている。前記細胞外小胞において、前記脂質二重膜は、例えば、前記再生性細胞集団の膜、具体的には、前記再生性細胞集団の細胞の膜に由来する。前記膜は、例えば、細胞膜；ミトコンドリア、小胞体、エンドソーム、リソソーム、ゴルジ体等の細胞内小器官の膜；等があげられる。前記細胞外小胞において、前記内腔は、例えば、前記再生性細胞集団に由来する細胞質、具体的には、前記再生性細胞集団の細胞に由来する細胞質を有する。このため、前記細胞外小胞は、例えば、前記再生性細胞集団の細胞の細胞質に由来するｍｉＲＮＡ、ＤＮＡ、および／またはタンパク質を含む。
　前記細胞外小胞の脂質二重膜は、例えば、前記再生性細胞集団の細胞の膜成分を含む。このため、前記細胞外小胞は、例えば、前記再生性細胞集団に存在する膜成分を用いて規定できる。前記膜成分は、例えば、膜タンパク質等があげられる。前記膜タンパク質は、例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、Ａｌｉｘ（ALG-2-interacting protein X）、Ｈｓｐ－７０（Heat Shock Protein 70）等の細胞外小胞マーカー；前記細胞の細胞表面マーカー；等があげられる。前記細胞表面マーカーは、前記細胞の種類に応じて適宜決定できる。前記再生性細胞集団が前記ＥＰＣを含む場合、前記細胞表面マーカーは、例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＫＤＲ（Kinase insert domain receptor、ＣＤ３０９）、ＣＤ１０５等があげられる。前記再生性細胞集団が前記抗炎症性マクロファージを含む場合、前記細胞表面マーカーは、例えば、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＣＤ１６９等があげられる。前記細胞外小胞の脂質二重膜は、例えば、１種類または複数種類の膜成分を含む。前記膜成分は、例えば、対象の分子に対する抗体等を用いて、フローサイトメトリー法により測定できる。
　前記細胞外小胞の内腔は、例えば、前記再生性細胞集団の細胞の細胞質を含む。このため、前記細胞外小胞は、例えば、前記再生性細胞集団に存在する細胞質の成分を用いて規定できる。前記細胞質の成分は、例えば、ｍｉＲＮＡ等があげられる。前記ｍｉＲＮＡは、例えば、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３７３－３ｐ、ｍｉＲ－５０９－３ｐ、ｍｉＲ－６３３、およびｌｅｔ－７ｃ－５ｐ等があげられる。前記ｍｉＲＮＡの中で、特に、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、およびｍｉＲ－１４２－３ｐは、前記再生性細胞集団の細胞外小胞における特異的なｍｉＲＮＡと想定される。このため、前記細胞外小胞の内腔は、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、および／またはｍｉＲ－１４２－３ｐを含むことが好ましい。前記細胞外小胞の内腔は、例えば、１種類または複数種類の細胞質の成分を含む。前記細胞質の成分は、例えば、対象の分子に対する抗体等を用いて、フローサイトメトリー法により測定できる。また、前記細胞質の成分が核酸分子の場合、前記細胞質の成分は、例えば、シーケンサー等を用いて測定できる。前記ｍｉＲＮＡは、末梢血由来の再生性細胞集団の場合、例えば、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、および／またはｍｉＲ－１４２－３ｐを含むことが好ましい。また、前記ｍｉＲＮＡは、臍帯血由来の再生性細胞集団の場合、例えば、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３７３－３ｐ、ｍｉＲ－５０９－３ｐ、ｍｉＲ－６３３、および／またはｌｅｔ－７ｃ－５ｐを含むこと好ましい。
　前記ｍｉＲＮＡにおいて、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、およびｍｉＲ－５０９－３ｐ、は、一般的に、抗アポトーシス活性を有することが知られている。前記ｍｉＲＮＡにおいて、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、およびｍｉＲ－６３３は、一般的に、細胞増殖促進活性を有することが知られている。前記ｍｉＲＮＡにおいて、ｍｉＲ－１５０－５ｐは、一般的に、細胞遊走促進活性を有することが知られている。前記ｍｉＲＮＡにおいて、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、およびｍｉＲ－３７３－３ｐは、一般的に、抗線維化活性、特に、ＴＧＦ－βの発現抑制活性を有することが知られている。前記ｍｉＲＮＡにおいて、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－６３３、およびｌｅｔ－７ｃ－５ｐは、一般的に、血管新生促進活性を有することが知られている。前記ｍｉＲＮＡにおいて、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４４－５ｐ、およびｍｉＲ－１４８ａ－３ｐは、一般的に、抗炎症活性を有することが知られている。
　前記細胞外小胞において、前記内腔に含まれる成分は、前記再生性細胞集団の細胞質以外の成分に置き換えてもよい。この場合、前記内腔は、所望のカーゴ（Cargo）を搭載する。前記カーゴは、例えば、低分子化合物、抗体等のタンパク質またはペプチド、核酸等があげられる。
　前記細胞外小胞の平均径（加重平均）は、例えば、１～５００ｎｍ、好ましくは、１０～２５０ｎｍ、より好ましくは、３０～１５０ｎｍである。前記平均径は、後述の実施例１に準じて測定できる。また、前記細胞外小胞の平均径は、例えば、前記細胞外小胞を含む液体を、所望の孔径を有するフィルター等を用いてろ過することにより、調整できる。
　本発明の細胞外小胞または組成物は、さらに、薬学的に許容される担体を含んでもよい。前記担体は、前記細胞外小胞を投与するための懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、媒体、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等があげられ、本発明の効果を妨げない範囲で適切に添加することができる。
　本発明の細胞外小胞または組成物は、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで用いてもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで用いてもよい。本発明の細胞外小胞または組成物は、例えば、研究用試薬として使用することもでき、医薬品として使用することもできる。
　本発明の細胞外小胞または組成物の投与対象は、特に制限されない。本発明の細胞外小胞または組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、ヒト、またはヒトを除く非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物としては、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、イルカ、アシカ等の哺乳類；鳥類；魚類；等があげられる。前記本発明の細胞外小胞または組成物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、細胞、組織、器官、または臓器等があげられ、前記細胞は、例えば、生体から採取した細胞、培養細胞等があげられ、前記組織、器官、または臓器は、例えば、生体から採取した組織（生体組織）または器官等があげられる。前記細胞は、例えば、筋細胞、iPS細胞（induced pluripotent stem cells）、幹細胞等があげられる。
　本発明の細胞外小胞または組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、虚血性心疾患と診断された対象または疑いがある対象等があげられる。前記虚血性心疾患は、例えば、心筋梗塞、末梢動脈疾患、心筋虚血再灌流障害、重症下肢虚血等があげられる。
　本発明の細胞外小胞または組成物の使用条件（投与条件）は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類等に応じて、投与形態、投与時期、投与量等を適宜設定できる。
　本発明の細胞外小胞または組成物の投与方法は、例えば、経口投与、または静脈内投与等の非経口投与が例示されるが、例えば、投与者の技術によらず、安全におよび安定的に投与できることから、静脈内投与が好ましい。
　本発明の細胞外小胞または組成物の投与量は、有効用量であり、具体例として、対象に投与した場合に、投与していない対象と比較して疾患に対して虚血性心疾患の治療効果（治療効果）を得ることができる量である。具体的には、前記投与量は、例えば、被験者の年齢、体重、症状等によって適宜決定することができる。具体例として、前記投与量は、例えば、細胞外小胞の個数として、１回の投与当たり１０４～１０９個／ｋｇ体重、１０４～１０８個／ｋｇ体重、１０４～１０７個／ｋｇ体重があげられ、好ましくは、１０４～１０８個／ｋｇ体重、１０４～１０７個／ｋｇ体重である。
　本発明の細胞外小胞または組成物の投与回数は、１または複数回である。前記複数回は、例えば、２回、３回、４回、５回またはそれ以上である。前記投与回数は、対象の治療効果を確認しながら、適宜決定されてもよい。前記複数回投与する場合、投与間隔は、対象の治療効果を確認しながら、適宜決定でき、例えば、１日１回、１週１回、２週１回、１ヶ月１回、３ヶ月１回、６か月１回等があげられる。
　本発明の細胞外小胞または組成物は、前述のように、前記移植片拒絶反応が抑制されており、かつ前記再生性細胞集団に由来するため、血管新生促進活性等の生理活性を有する。このため、本発明の細胞外小胞または組成物は、例えば、後述のように、虚血性心疾患の治療または予後の改善に好適に使用できる。
＜細胞外小胞または組成物の用途＞
　別の態様において、本発明は、虚血性心疾患の処置に用いるための組成物またはそれを用いた方法を提供する。この場合、本発明は、虚血性心疾患の処置に用いるための組成物であって、前記組成物は、前記本発明の細胞外小胞または組成物である。また、本発明は、虚血性心疾患患者の処置方法であって、前記虚血性心疾患患者に、前記本発明の細胞外小胞または組成物を投与する。
　前記虚血性疾患は、例えば、心筋梗塞、末梢動脈疾患、心筋虚血再灌流障害、重症下肢虚血等があげられる。
　別の態様において、本発明は、血管内皮細胞の増殖促進に用いるための組成物またはそれを用いた方法を提供する。この場合、本発明は、血管内皮細胞の増殖促進に用いるための組成物であって、前記組成物は、前記本発明の細胞外小胞または組成物である。また、本発明は、血管内皮細胞の増殖促進方法であって、前記血管内皮細胞と、組成物とを接触させることにより、前記血管内皮細胞の増殖を促進する工程を含み、前記組成物は、本発明の細胞外小胞または組成物を含む。
　別の態様において、本発明は、血管新生の誘導に用いるための組成物またはそれを用いた方法を提供する。この場合、本発明は、血管新生の誘導に用いるための組成物であって、前記組成物は、前記本発明の細胞外小胞または組成物である。また、本発明は、血管新生の誘導方法であって、本発明の細胞外小胞または組成物を使用する。
　本発明の血管新生の誘導方法は、例えば、血管新生を誘導する対象に、前記細胞外小胞または組成物を投与する。前記血管新生を誘導する対象は、例えば、虚血性心疾患等の患者があげられる。この場合、前記血管新生の誘導は、前記患者の心臓、または虚血再灌流傷害が生じている部位（例えば、中枢または末梢血管）における血管新生の誘導ということもできる。
　別の態様において、本発明は、線維化の抑制に用いるための組成物またはそれを用いた方法を提供する。この場合、本発明は、線維化の抑制に用いるための組成物であって、前記組成物は、前記本発明の細胞外小胞または組成物である。また、本発明は、線維化の抑制方法であって、本発明の細胞外小胞または組成物を使用する。
　本発明の線維化の抑制方法は、例えば、線維化を抑制する対象に、前記細胞外小胞または組成物を投与する。前記線維化を抑制する対象は、例えば、虚血性心疾患等の患者があげられる。この場合、前記血管新生の誘導は、前記患者の心臓、または虚血再灌流傷害が生じている部位（例えば、中枢または末梢血管）における線維化の抑制ということもできる。
＜細胞外小胞または組成物の使用＞
　本発明は、虚血性心疾患の治療に用いるための、細胞外小胞または組成物である。また、本発明は、血管内皮細胞の増殖促進に用いるための、細胞外小胞または組成物である。本発明は、血管新生の促進に用いるための、細胞外小胞または組成物である。本発明は、線維化抑制に用いるための、細胞外小胞または組成物である。
　以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。なお、特に示さない限り、市販の試薬およびキット等は、そのプロトコルに従い使用した。
［実施例１］
　本発明の細胞外小胞が、血管内皮細胞増殖活性を有すること、血管新生促進活性を有すること、線維化抑制活性を有すること、および移植片拒絶反応が低減されていることを確認した。
（１）再生性細胞集団の調製
　再生性細胞集団は、ヒト末梢血単核球から誘導することにより調製した。まず、２０～５５歳の健康なボランティアから、５０ｍｌシリンジに装着されたヘパリン化翼状針を用いて末梢血を２０～１００ｍｌ採取した。前記採取に先立ち、各健常者へのインフォームドコンセントを行なった。また、前記採取は、東海大学医学部医学調査委員会の承認の下で行い、得られた末梢血サンプルの取り扱いは、ヒトサンプルに対する生物学的ガイドラインに沿って行った。また、以下に示す動物実験は、実験動物の取扱いガイドライン（National Research Council）に従い、東海大学医学部の動物実験委員会の承認を得て実施した。
　末梢血からの末梢血単核球（PBMNC）の単離は、Asahara et al., Science, 275: 964-7 (1997)およびAmankeldi et.al., PLoSONE, (2019), 14(3):e0205477に記載の方法にしたがって、Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, #10771)を用いた密度勾配遠心法により行った。単離されたPBMNCをリン酸緩衝液（PBS）－エチレンジアミン四酢酸（EDTA）で洗浄後、後述の無血清培地（QQ培地）中に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。単離されたPBMNCにおいてCD34陽性率は0.23±0.03%、CD133陽性率は0.20±0.07%であった。また、末梢血100mlあたりのCD34陽性細胞数は(27.8±4.5)x104、CD133陽性細胞数は(23.2±6.9)x104であった。
　再生性細胞集団の培養（誘導）に用いる無血清培地（以下、「QQ培地」または「QQcm」ともいう)は、stemline（商標） II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium（Sigma-Aldrich, Cat No. S0192）に、下記の各因子を所定の濃度となるように無血清培地に無菌的に添加した。
（ＱＱ培地中の各因子の濃度）
ｒｈＳＣＦ（Peprotech, Inc.社製、Cat. No. #300-07）：１００ｎｇ／ｍｌ
ｒｈＦｌｔ３Ｌ（Peprotech, Inc.社製、Cat. No. #300-19）：１００ｎｇ／ｍｌ
ｒｈＴＰＯ（Peprotech, Inc.社製、Cat. No. #300-18）：２０ｎｇ／ｍｌ
ｒｈＶＥＧＦ（Peprotech, Inc.社製、Cat. No. #100-02）：５０ｎｇ／ｍｌ
ｒｈＩＬ－６（Peprotech, Inc.社製、Cat. No. #200-06）：２０ｎｇ／ｍｌ
ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco社製）、Cat. No. 15140122：１００Ｕ／１００μｇ／ｍｌ）
ｒ：組換え体
ｈ：ヒト由来
　前記PBMNCについて、１０ｃｍディッシュ（住友ベークライト社製）に、１０×１０７細胞／１０ｍｌ／ディッシュとなるように、播種後、３７℃、５％ＣＯ２、湿潤環境の条件で、７日間培養した。これにより、再生性細胞集団（RAC）を調製した。なお、以下、特に言及しない場合、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２、湿潤環境の条件で実施した。
（２）細胞外小胞の調製
　前記培養後、前記RACを回収後、遠心した。得られたペレットを細胞外小胞産生培地に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。前記細胞外小胞産生培地の組成は、エクソソーム除去済のウシ胎仔血清を５（ｖ／ｖ）％添加した、X-vivo 15培地（Lonza社製、Cat. No.BE02-054Q）とした。得られた細胞懸濁液を、１０ｃｍディッシュに、２．５×１０５細胞／ｍｌ／ディッシュ（２５０ｋ）、または５×１０５細胞／ｍｌ／ディッシュ（５００ｋ）となるように播種後、４８時間培養した。
前記培養後、培養上清（条件培地）を回収後、前記培養上清を３００×ｇ、４℃の条件で１０分間遠心することにより、細胞を除去した。つぎに、得られた上清画分を、２０００×ｇ、１２℃の条件で２０分間遠心後、上清画分を回収することにより、アポトーシス小体およびマイクロベシクルを除去した。前記上清画分を０．２μｍのフィルター（Millipore Merck社製、Cat. No.SLGS033SS)でろ過することにより、粒子径が２００ｎｍを超える細胞外小胞を除去した。そして、得られたろ液について、１７４０００×ｇ、４℃の条件で、１１０分間遠心することにより、細胞外小胞（エクソソーム）を沈殿させ、回収した。回収した沈殿は、後述の各実験において使用する培地または緩衝液（最大３×５０μｌ）で懸濁した。なお、細胞外小胞を標識化する場合、前記０．２μｍのフィルターろ過後、ろ液に対して、２μｍｏｌ／ｌとなるようにCM-Dil dye（C7000、Thermo Fisher社製）を添加して、標識した。そして、得られた反応液について、１７４０００×ｇ、４℃の条件で、１１０分間遠心後、細胞外小胞をＰＢＳで洗浄し、同条件での遠心を実施した。同様の洗浄および遠視を再度実施した。そして、回収した沈殿は、後述の各実験において使用する培地または緩衝液（最大３×５０μｌ）で懸濁した。
（３）細胞外小胞の特性
　前記実施例１（２）で調製した細胞外小胞について、その平均径、細胞あたりの産生量、およびマーカーの発現と、脂質膜および内腔の構造とを検討した。具体的には、平均径、細胞あたりの産生量、およびマーカーの発現は、フローサイトメトリー法により測定した。フローサイトメーターは、３レーザ（405nm、488nm、および638nm）を搭載するDxFlex Flow Cytometry(Beckman Coulter社製)について、以下の構成の変更を行なった上で使用した。405/10 VSSC フィルターは、WDM中のV450チャンネルに移動した。そして、ソフトウェア（CytExpert software）における検出器の構成を更新し、WDM内のVSSCチャネルに割り当てを行なった。また、各データの取得前に、前記フローサイトメーターの流路は、洗浄液（FlowClean）で洗浄後、１０μｍフィルターでろ過した水を通過させた。
　また、サイズの異なるラテックスビーズ（１００ｎｍまたは２００ｎｍ）を用いて、前記フローサイトメーター（DxFlex FACS machine、Beckman Coulter社製)を校正後、細胞外小胞について測定を実施した。さらに、得られた側方散乱光（ＳＳＣ）の強度について、前記ラテックスビーズの強度と、各細胞外小胞の強度とを比較することにより、各細胞外小胞の粒子径を算出した。そして、得られた粒子径に基づき、平均径（加重平均）を算出した。また、前記フローサイトメーターに代えて、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）装置（ZetaView（登録商標）、DKSH社製）を用いた以外は同様にして、各細胞外小胞の粒子径を算出し、平均径（加重平均）を算出した。そして、前記フローサイトメーターにより得られる平均径と、ＮＴＡ装置で得られる平均径とがほぼ同じ値となることを確認した。
　前記マーカーの発現は、前記細胞外小胞について、抗CD9抗体（PE標識、Biolegend 社製、Cat. No. #312106）または抗CD63抗体（PE標識、Biolegend 社製、Cat. No. #353004) と、抗Alix抗体（Alexa 594標識、Biolegend 社製、Cat. No. #634504）および抗Hsp-70抗体（Alexa 488標識、Biolegend 社製、Cat. No. #648003）とを用いて染色後、前記フローサイトメーターを用いて測定した。コントロールは、各種抗体に代えて、コントロール抗体を用いた以外は同様にして実施した。
　前記細胞あたりの産生量は、前記フローサイトメーターにおけるカウントおよび測定したサンプル液量に基づき、２．５×１０５細胞あたりの細胞外小胞の産生量（細胞外小胞の数）を算出した。
　前記脂質膜および内腔の構造は、走査型電子顕微鏡（JEM-1400、日本電子株式会社製）を用いて観察した。
　参考例は、前記ＲＡＣに代えて、ヒト由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ、Lonza社製、Cat. No.BE02-054Q）を用いた以外は同様にして実施した。これらの結果を、図１～図３に示す。なお、グラフ中の統計処理は、マン－ホイットニー検定を用いて実施した。
　図１は、細胞外小胞の粒子径、細胞あたりの産生量および平均径を示すグラフである。図１において、（Ａ）は、粒子径の結果、（Ｂ）は、産生量の結果、（Ｃ）は、平均径の結果を示す。図１（Ａ）において、横軸は、粒子径（対数）を示し、縦軸は、相対的な数を示す。図１（Ｂ）において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、細胞外小胞の産生数を示す。図１（Ｃ）において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、平均径を示す。図１（Ａ）および（Ｃ）に示すように、RAC由来の細胞外小胞（RACev）は、MSC由来の細胞外小胞（MSCev）と比較して若干大きく、RACevの平均径は、１４５ｎｍであるのに対して、MSCevは、１３０ｎｍであった。また、図１（Ｂ）に示すように、ＲＡＣは、ＭＳＣと比較して、細胞あたりの細胞外小胞の産生量が有意に多かった。
　つぎに、図２は、ＲＡＣ由来の細胞外小胞の構造を示す電子顕微鏡像である。図２に示すようにRACevは、脂質二重膜構造と内腔とを有し、前記内腔が、前記脂質二重膜に囲われており、MSCev等の細胞外小胞と同様の構造を有することが確認できた。
　つぎに、図３は、マーカーの発現を示すヒストグラムである。図３において、（Ａ）は、RACevの結果、（Ｂ）は、MSCevの結果を示す。図３（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、ＳＳＣの強度または各マーカーの蛍光強度を示し、縦軸は、カウントを示す。図３（Ａ）の左図に示すように、粒子径が既知のラテックスビーズを用いることにより、フローサイトメーターにより、細胞外小胞の粒子径を測定できることがわかった。また、図３（Ａ）の中央図および右図に示すように、RACevでは、ＣＤ６３およびＣＤ９の発現が確認された。また、図３（Ａ）および（Ｂ）に示すように、RACevは、MSCevと比較して、ＣＤ６３の発現量が高かった。なお、図３（Ａ）には示していないが、RACevでは、AlixおよびＨＳＰ７０の発現も確認された。これらの結果から、RACevは、エクソソームマーカーを発現しており、かつＣＤ９およびＡｌｉｘの発現で、MSCevと区別できることがわかった。
　これらの結果から、RACevは、MISEV2018（Thery C et.al., 2018, J.Extracell Vesicles 7:1535750）に合致するため、細胞外小胞であることがわかった。
（４）血管内皮細胞の増殖促進活性
　RACevの血管内皮細胞の増殖促進活性は、ヒト胎児由来血管内皮細胞（HUVEC、Lonza社製、Cat. No.C2517A, Batch #. 18TL061650）を用いて検討した。具体的には、３～４回継代培養されたHUVECを回収後、Cytopainter dye（abcam社製、Cat. No. #ab176735）を添加して、３７℃、１０～３０分間インキュベートすることにより、HUVEC細胞を標識した。前記標識後、遠心および洗浄を２回繰り返した。得られたHUVEC細胞について、３．５ｃｍディッシュに５×１０４細胞／２ｍｌ／ディッシュとなるように播種した。前記HUVEC細胞の継代用培地は、EGM-2（Lonza社製）を用い、HUVEC細胞の増殖活性の測定用培地は、EBM-2（Lonza社製）を用いた。ついで、２５０ｋもしくは５００ｋのRACまたはMSCから単離した細胞外小胞（RACevまたはMSCev）を各ディッシュに添加した。そして、前記培養条件で、２日間培養した。前記培養後、各ディッシュについて、位相差顕微鏡（6-well dish、Falcon社製）を用いて観察した。得られた位相差像において、一視野あたり（ＨＰＦ）の細胞数をカウントし、さらに、全領域に対してHUVEC細胞が占める領域の割合を、成長領域として算出した。
　また、前記培養後、ディッシュからHUVEC細胞を回収し、フローサイトメーター（FACS Verse、BD Biosciences社製）を用いて、HUVEC細胞の分裂を、前記標識を指標に測定した。また、コントロールは、RACevおよびMSCevを添加しなかった以外は同様にして実施した。
　さらに、HUVEC細胞の培養時に添加したRACevおよびMSCevについて、miRNAの分析を行なった。具体的には、前記RACevおよびMSCevについて、miRNA精製キット（miRNeasy mini kitおよびRNeasy MinElute Cleanup Kit、QIAGEN社製）を用いて、miRNAを精製した。得られたmiRNAとライブラリー構築キット（QIAseq（商標） miRNA Library Kit、Qiagen社製、Cat. No. #331505）とを用い、シークエンス用ライブラリを調製した。前記ライブラリの品質検査は、Agilent BioanalyzeおよびDNAチップ（High Sensitivity DNA chip、Agilent Technologies社製）を用いて実施した。前記ライブラリーのシーケンスは、次世代シーケンサー（NextSeq 500、Illumina社製）を用い、７６ｂｐ（ｂｐ）のシングルエンドリードとして解読した。そして、得られたシーケンスデータから、各ｍｉＲＮＡ（miR-181b-3p、miR-150-5p、miR-302a-5p、miR-92a-2-5p）の発現量を算出した。細胞外小胞を添加していないHUVEC細胞における各ｍｉＲＮＡの発現量を基準として、相対的な発現量を算出した。
　これらの結果を図４～図６に示す。コントロールは、細胞外小胞を添加しなかった以外は同様にして実施した。なお、グラフ中の統計処理としては、Two-way ANOVA検定後に、テューキーの多重比較検定を実施した。
　図４は、HUVEC細胞の増殖を示すグラフである。図４において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、一視野（ＨＰＦ）あたりの細胞数を示す。図４に示すように、RACevおよびMSCevは、コントロールと比較して、血管内皮細胞の増殖を促進した。また、図４に示すように、RACevは、MSCevと比較して、有意に血管内皮細胞の増殖を促進した（MSCev-250K vs. RACev-250K：P >0.001、MSCev-500K vs. RACev-500K： P>0.0001）。
　つぎに、図５は、HUVEC細胞の成長領域を示す写真およびグラフである。図５において、（Ａ）は、位相差像を示し、（Ｂ）は、成長領域のグラフを示す。図５（Ｂ）において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、成長領域を示す。図５（Ａ）および（Ｂ）に示すように、RACevおよびMSCevは、コントロールと比較して、血管内皮細胞の成長領域が増加していた。また、図５（Ａ）および（Ｂ）に示すように、RACevは、MSCevと比較して、有意に血管内皮細胞の成長領域が増加した（MSCev-500K vs. RACev-500K：P >0.0007）。なお、図示していないが、標識化したRACevを用いて経時的にHUVEC細胞の増殖を観察したところ、HUVEC細胞がRACevを取り込むと、HUVEC細胞がＳ期に進むことが観察された。また、RACevによる血管内細胞の増殖促進活性は、第８世代まで維持されること、すなわち、８回の分裂の間維持されることが確認された。
　つぎに、図６は、ｍｉＲＮＡの発現量を示すグラフである。図６において、横軸は、ｍｉＲＮＡの種類を示し、縦軸は、相対的発現量を示す。図６に示すように、RACevは、MSCevと比較して、有意に、抗アポトーシス活性を有するｍｉＲＮＡ（miR-92a-2-5p）、細胞分裂促進活性を有するｍｉＲＮＡ（miR-181b-3p、miR-150-5p、miR-302a-5p）、および細胞遊走促進活性を有するｍｉＲＮＡ（miR-150-5p）の発現量が高かった。これらの結果から、RACevは、抗アポトーシス活性を有するｍｉＲＮＡおよび細胞分裂促進活性を有するｍｉＲＮＡを運搬することにより、血管内皮細胞の増殖促進活性を示すことが分かった。
（５）虚血性心疾患の改善
　虚血性心疾患においては、血管内皮細胞の増殖により、血管新生が生じると、予後が改善する。そこで、RACevが、虚血性心疾患の改善に寄与することを、ラット心筋梗塞モデルを確認した。具体的には、Lewisラット（雄、６～１０週齢、体重１５０～２５０ｇ、日本チャールズリバー社より購入）に対して挿管後、３～４％のセボフルラン（丸石製薬株式会社製）を１５ｍｌ／ｋｇで６５～７０分間吸入させることにより、麻酔下においた。左側開胸術後、左前下行枝（left anterior descending artery：ＬＡＤ）について３０分間虚血状態とした後に、再還流させることにより、虚血再灌流傷害を誘導した。前記誘導後、速やかに胸郭を閉じた。つぎに、５００ｋのRACまたはMSCから単離した細胞外小胞（RACevまたはMSCev）をＰＢＳで希釈し、得られた希釈液を、前記虚血再灌流傷害の誘導後の所定時間（３０分後、１日後および２日後）に尾静脈から投与した。
　虚血性心疾患の程度については、心エコー検査によって評価した。具体的には、３．５ＭＨｚのプローブを備える心エコー検査装置（アロカ社製）を用いて、左室拡張末期径（ＬＶＤＤ）と、左室収縮末期径（ＬＶＤＳ）と、僧帽弁逆流症（ＭＲ）の重症度と、Ｅ波とＡ波の高さと、左心房および上行大動脈の大きさとを測定した。前記測定は、前記虚血再灌流傷害の誘導前（ベースライン）に初回を実施し、その後、前記傷害の誘導後４週間まで週１回実施した。前記僧帽弁逆流の重症度は、下記基準により評価した。また、左室内径短縮率（％ＦＳ）は、Teichholz法により算出した（Salybekov et. al., PLoSONE, (2018), 13(11):e0203244.）。具体的には、左室内径短縮率は、下記式（１）により算出した。また、これらの測定値を用いて、駆出率および左室収縮終期容積（ＬＶＥＳＶ）を算出した。コントロールは、RACevおよびMSCevを投与しなかった以外は同様にして算出した。これらの結果を、図７～図８に示す。なお、グラフ中の統計処理としては、Two-way ANOVA検定後に、テューキーの多重比較検定を実施した。
 
　　％ＦＳ＝（ＬＶＤＤ－ＬＶＤＳ）／ＬＶＤＤ×１００　　　・・・（１）
（重症度の評価）
スコア３（重度）：左心房壁に到達する逆流
スコア２（中程度）：左心房の２／３に達する逆流
スコア１（軽度・軽微）：左心房の１／３に達する逆流
　図７は、エコー図を示す写真と、駆出率および左室内径短縮率を示すグラフである。図７において、（Ａ）は、コントロールの結果、（Ｂ）は、MSCevの結果、（Ｃ）は、RACevの結果、（Ｄ）は、駆出率の結果、（Ｅ）は、左室内径短縮率の結果を示す。図７（Ａ）～（Ｃ）において、長い矢印は、ＬＶＤＤの例を示し、短い矢印は、ＬＶＤＳの例を示す。また、図７（Ｄ）において、横軸は、前記虚血再灌流傷害の誘導前後の時期を示し、縦軸は、駆出率を示す。図７（Ｅ）において、横軸は、前記虚血再灌流傷害の誘導前後の時期を示し、縦軸は、左室内径短縮率を示す。図７（Ａ）～（Ｅ）に示すように、RACevは、コントロールおよびMSCevと比較して、駆出率が改善し、かつ左室内径短縮率が有意に改善した。
　つぎに、図８は、僧帽弁逆流の重症度および左室収縮終期容積を示すグラフである。図８において、（Ａ）は、僧帽弁逆流の重症度の結果、（Ｂ）は、左室収縮終期容積の結果を示す。図８（Ａ）において、横軸は、前記虚血再灌流傷害の誘導前後の時期を示し、縦軸は、僧帽弁逆流の重症度を示す。また、図８（Ｂ）において、横軸は、前記虚血再灌流傷害の誘導前後の時期を示し、縦軸は、左室収縮終期容積を示す。図８（Ａ）に示すように、RACevは、コントロールおよびMSCevと比較して、僧帽弁逆流の重症度を改善し、かつ前記虚血再灌流傷害の４週後には、通常のレベルに戻った。また、図８（Ｂ）に示すように、RACevは、コントロールおよびMSCevと比較して、左室収縮終期容積を改善した。これは、RACevは僧帽弁逆流の重症度を改善したことによる推定される。
　これらの結果から、RACevが、心臓における虚血再灌流傷害を改善できることがわかった。
（６）虚血性心疾患における線維化の抑制
　前記虚血再灌流傷害による虚血性心疾患においては、線維化が生じる。そこで、RACevの投与により、線維化が抑制されるかを確認した。前記実施例１（５）の虚血再灌流傷害誘導４週後に、前記ラットから心臓を採取した。前記心臓に対して、１０００Ｕ／ｍｌのヘパリン含有ＰＢＳを用いて還流後、４％パラホルムアルデヒド（富士フイルム社製、Cat. No. #163-20145）で終夜（約８時間）固定した。前記固定後、前記心臓をパラフィンに包埋し、３～４μｍの厚みのパラフィン包埋切片を調製した。前記切片について、ピクロシリウスレッドで染色後、一視野における間質線維化の占める割合（％）を決定した（Salybekov AA et.al., 2019, PLoS One 14: e0205477を参照）。コントロールは、RACevおよびMSCevを投与しなかった以外は同様にして実施した。また、HUVEC細胞の培養時に添加したRACevおよびMSCevについて、前記実施例１（４）と同様にして、各ｍｉＲＮＡ（miR-133a-3p、miR-133b、miR-29c-3p、miR-29b-3p）の相対的な発現量を算出した。これらの結果を、図９～図１０に示す。なお、グラフ中の統計処理としては、Dunn's多重比較検定を実施した。
　図９は、線維化の程度を示すグラフおよび写真である。図９において、（Ａ）は、間質線維化の大きさを示し、（Ｂ）は、各サンプルの代表例を示す。図９（Ｂ）の写真において、濃いグレーの領域が、線維化の生じている領域を示す。図９（Ａ）において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、間質線維化の大きさを示す。図９（Ａ）～（Ｂ）に示すように、RACevおよびMSCevは、コントロールと比較して、線維化の程度を有意に抑制した。
　つぎに、図１０は、ｍｉＲＮＡの発現量を示すグラフである。図１０において、横軸は、ｍｉＲＮＡの種類を示し、縦軸は、相対的発現量を示す。図１０に示すように、RACevは、MSCevと比較して、有意に、線維化抑制活性を有するｍｉＲＮＡの発現量が高かった。これらの結果から、RACevは、線維化抑制活性を有するｍｉＲＮＡを運搬することにより、線維化の抑制活性を示すことが分かった。
（７）細胞外小胞の血管新生促進活性
　前記RACevの投与により、血管新生が促進するかを確認した。前記実施例１（６）で調製したパラフィン包埋切片について、アビジンおよびストレプトアビジン複合体でブロッキング後、１００倍希釈したIsolectin B4-FITC（Invitrogen社製）および２００倍希釈したαSMA-Cy3（Sigma社製）を用いて染色した。これにより、梗塞心筋の組織における微小血管および小動脈を染色した。得られた切片について、蛍光顕微鏡（FSX100、Olympus社製、HPF 20xで使用）または共焦点顕微鏡検査（LSM880、Carl Zeiss社製）を用いて観察した。また、得られた顕微鏡像から血管の密度を算出した。コントロールは、RACevおよびMSCevを投与しなかった以外は同様にして実施した。また、HUVEC細胞の培養時に添加したRACevおよびMSCevについて、前記実施例１（４）と同様にして、各ｍｉＲＮＡ（miR-126-3p、m miR-195-3p、miR-29c-3p、miR-126-5p、miR-15b-5p、miR-195-5p、miR-200b-5p、miR-146a-3p、miR-146-5p）の相対的な発現量を算出した。これらの結果を、図１１～図１２に示す。なお、グラフ中の統計処理としては、Dunn's多重比較検定を実施した。
　図１１は、梗塞心筋組織における血管を示す写真およびグラフである。図１１において、（Ａ）は、梗塞心筋組織における血管を示し、（Ｂ）は、血管の密度を示す。図１１（Ｂ）において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、梗塞心筋組織における血管の密度を示す。図１１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、RACevは、コントロールおよびMSCevと比較して、血管の密度が有意に増加した。
　つぎに、図１２は、ｍｉＲＮＡの発現量を示すグラフである。図１２において、横軸は、ｍｉＲＮＡの種類を示し、縦軸は、相対的発現量を示す。図１２に示すように、RACevは、MSCevと比較して、血管新生促進活性を有するｍｉＲＮＡの発現量が有意に高かった。これらの結果から、RACevは、血管新生促進活性を有するｍｉＲＮＡを運搬することにより、血管新生促進活性を示すことが分かった。
（８）細胞外小胞の炎症部位への指向性
　RACevが虚血再灌流傷害の改善に寄与していることから、RACevは、in vivoにおいて、虚血再灌流で生じる炎症部位に集積していると推定される。そこで、RACevのHUVEC細胞への取り込み時間を検討した。具体的には、前記実施例１（２）で調製した標識化RACevについて、予めHUVEC細胞を播種したディッシュに添加し、経時的に標識を検出することによりRACevを検出した。この結果、添加後３～４時間において、HUVEC細胞内に取り込まれることがわかった。
　前記実施例１（５）と同様に、虚血再灌流傷害を誘導し、前記誘導後、速やかに胸郭を閉じた。つぎに、５００ｋのRACまたはMSCから単離した細胞外小胞（RACevまたはMSCev）をＰＢＳで希釈し、得られた希釈液を、前記虚血再灌流傷害の誘導後すぐに尾静脈から投与した。前記投与から３．５時間後に、前記ラットから心臓を回収した。そして、前記心臓の梗塞心筋組織に、RACevが集積しているかを、蛍光イメージングシステム（IVIS Lumina III、Perkin Elmer社製）を用いて測定した。励起波長は、520nmとし、発光波長は、570nmとした。得られた測定値から、単位面積あたりの輝度値を算出した。また、回収した心臓から厚さ６μｍの凍結切片を作成し、得られた凍結切片について、核染色後、共焦点顕微鏡（LSM880、Carl Zeiss社製）を用いて観察した。コントロールは、RACevまたはMSCevを投与しなかった以外は同様にして実施した。これらの結果を、図１３～図１４に示す。なお、グラフ中の統計処理は、マンーホイットニー検定を用いて実施した。
　図１３は、梗塞心筋組織の蛍光像を示す写真である。図１３において、上段は、コントロールの結果、中段は、MSCevの結果、下段は、RACevの結果を示す。また、図１３において、左列は、標識化細胞外小胞（RACevまたはMSCev）の検出結果、中列は、標識化細胞外小胞（RACevまたはMSCev）および核の検出結果、右列は、これらのマージ結果を示す。図１３に示すように、RACevおよびMSCevは、梗塞心筋組織への集積が見られた。また、RACevは、MSCevと比較して、より多くの集積しており、かつ図中の矢印で示すように、心筋細胞の核内に取り込みが観察された。
　つぎに、図１４は、梗塞心筋組織の発光強度を示す写真およびグラフである。図１４において、（Ａ）は、梗塞心筋組織の発光強度を示す写真であり、（Ｂ）は、単位面積あたりの発光強度を示すグラフである。図１４（Ａ）～（Ｂ）に示すように、RACevは、MSCevと比較して、より多くの細胞外小胞の梗塞心筋組織への集積が観察された。以上のことから、RACevは、炎症組織への集積に優れていることが確認された。
（９）移植片拒絶反応の抑制
　前記RACevの投与後に、移植片拒絶反応が生じていないことを確認した。前記実施例１（５）と同様に、虚血再灌流傷害を誘導した。前記誘導後、速やかに胸郭を閉じた。つぎに、５００ｋのRACまたはMSCから単離した細胞外小胞（RACevまたはMSCev）をＰＢＳで希釈し、得られた希釈液を、前記虚血再灌流傷害の誘導後の所定時間（３０分後、１日後および２日後）に尾静脈から投与した。そして、前記虚血再灌流傷害の誘導前（ベースライン）に初回の体重測定を実施し、その後、前記傷害の誘導後４週間まで週１回体重を測定した。また、前記誘導後４日および４週間において、脾臓を回収し、その重量を測定した。さらに、前記誘導後４週間において、末梢血および脾臓を回収した。そして、前記末梢血について、ＣＤ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、制御性Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の割合を、フローサイトメーターを用いて測定した。また、前記脾臓について、脾臓における移植片拒絶反応のマーカーであるＣＤ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、ＴＮＫ、ｉＮＫおよび抗原提示細胞と、制御性Ｔ細胞との割合を、フローサイトメーターを用いて測定した。コントロールは、RACevおよびMSCevを投与しなかった以外は同様にして実施した。また、投与したRACevおよびMSCevについて、前記実施例１（４）と同様にして、各ｍｉＲＮＡ（miR-142-3p）の相対的な発現量を算出したこれらの結果を図１５～図１８に示す。なお、グラフ中の統計処理としては、Dunn's多重比較検定を実施した。
　図１５は、ラットの体重および脾臓の重量を示すグラフである。図１５において、（Ａ）は、ラットの体重の結果、（Ｂ）は、脾臓の重量の結果を示す。図１５（Ａ）において、横軸は、虚血再灌流誘導時を基準とした測定時を示し、縦軸は、ラットの体重を示す。図１５（Ｂ）において、横軸は、虚血再灌流誘導時（IR-injury）を基準とした測定時を示し、縦軸は、脾臓の重量を示す。図１５（Ａ）および（Ｂ）に示すように、RACev、MSCevおよびコントロールの間に差はなく、移植片拒絶反応は観察されなかった。
　つぎに、図１６は、ＣＤ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、制御性Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の割合を示すグラフである。図１６において、横軸はサンプルの種類を示し、縦軸は、各細胞の割合を示す。図１６に示すように、RACev、MSCevおよびコントロールの間に差はなく、移植片拒絶反応は観察されなかった。
　つぎに、図１７は、ＣＤ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、ＴＮＫ、ｉＮＫ、制御性Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の割合を示すグラフである。図１７において、横軸はサンプルの種類を示し、縦軸は、各細胞の割合を示す。図１７に示すように、RACev、MSCevおよびコントロールの間に差はなく、移植片拒絶反応は観察されなかった。
　つぎに、図１８は、ｍｉＲＮＡの発現量を示すグラフである。図１８において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、相対的発現量を示す。図１８に示すように、RACevは、MSCevと比較して、免疫抑制活性（抗炎症性）を有するｍｉＲＮＡ（miR-142-3p）の発現量が有意に高かった。なお、miR-142-3pは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が放出するエクソソームに含まれていることが知られている。これらの結果から、RACevは、免疫抑制活性を有するｍｉＲＮＡを運搬することにより、移植片拒絶反応を抑制していることが示唆された。
　以上のことから、再生性細胞集団の細胞外小胞、すなわち、本発明の細胞外小胞が、血管内皮細胞増殖活性を有すること、血管新生促進活性を有すること、線維化抑制活性を有すること、および移植片拒絶反応が低減されていることがわかった。
［実施例２］
　末梢血単核球または臍帯血単核球を、各種因子で培養することにより、再生性細胞集団を誘導できることを確認した。
（１）再生性細胞集団の調製
　末梢血単核球は、前記実施例１（１）と同様にして調製した。また、前記末梢血に代えて、臍帯血を用いた以外は同様にして、臍帯血単核球を調製した。
　つぎに、前記末梢血単核球および臍帯血単核球について、前記無血清培地および各因子として、下記条件１～６を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、再生性細胞集団（RAC）を調製した。なお、前記末梢血単核球および下記条件６の組合せが、前記実施例１（１）の培養条件に対応する。前記培養後、得られた再生性細胞集団の細胞数をカウントした。そして、播種細胞数を基準として、細胞数の相対比を算出した。また、コントロールは、前記末梢血単核球および臍帯血単核球とした。これらの結果を図１９に示す。
（ＱＱ培地の種類および各因子の濃度）
・条件１：ＳＳ３Ｇ
　無血清培地：StemSpan SFEM（Stemcell Technologies社製）
　各因子：
　　ｒｈＳＣＦ：１００ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＦｌｔ３Ｌ：１００ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＴＰＯ：２０ｎｇ／ｍｌ
・条件２：ＳＳ５Ｇ
　無血清培地：StemSpan SFEM
　各因子：
　　ｒｈＳＣＦ：１００ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＦｌｔ３Ｌ：１００ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＴＰＯ：２０ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＶＥＧＦ：５０ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＩＬ－６：２０ｎｇ／ｍｌ
・条件３：ＳＣ３Ｇ
　無血清培地：StemCell
　各因子：
　　ｒｈＳＣＦ：１００ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＦｌｔ３Ｌ：１００ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＴＰＯ：２０ｎｇ／ｍｌ
・条件４：ＳＣ５Ｇ
　無血清培地：StemCell
　各因子：
　　ｒｈＳＣＦ：１００ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＦｌｔ３Ｌ：１００ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＴＰＯ：２０ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＶＥＧＦ：５０ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＩＬ－６：２０ｎｇ／ｍｌ
・条件５：ＳＣ３Ｇ
　無血清培地：Stemline（SIGMA社製）
　各因子：
　　ｒｈＳＣＦ：１００ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＦｌｔ３Ｌ：１００ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＴＰＯ：２０ｎｇ／ｍｌ
・条件６：ＳＬ５Ｇ
　無血清培地：Stemline
　各因子：
　　ｒｈＳＣＦ：１００ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＦｌｔ３Ｌ：１００ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＴＰＯ：２０ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＶＥＧＦ：５０ｎｇ／ｍｌ
　　ｒｈＩＬ－６：２０ｎｇ／ｍｌ
　図１９は、細胞数を示すグラフである。図１９において、（Ａ）は、末梢血単核球を用いた結果を示し、（Ｂ）は、臍帯血単核球を用いた結果を示す。図１９（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、前記条件を示し、縦軸は、細胞数の相対比を示す。図１９（Ａ）に示すように、前記末梢血単核球を用いた場合、いずれの条件でも細胞数が減少した。また、いずれの培地を用いた場合も、５因子を用いることにより、３因子を用いる場合と比較して、細胞数が増加した。また、図１９（Ｂ）に示すように、前記臍帯血単核球を用いた場合、いずれの条件でも細胞数が減少した。また、前記無血清培地として、StemSpan SFEMを用いた場合、他の培地を用いる場合として、細胞数が増加した。
（２）ＥＰＣコロニー形成アッセイ
　再生性細胞集団の血管形成能を調べるため、EPCコロニー形成アッセイ（ＥＰＣ－ＣＦＡ）により接着性EPCコロニーを定量した。EPC-CFAは、Masuda H. et al., Circulation research, 109: 20-37 (2011)に記載の方法に準じて行った。具体的には、35mm Primaria（商標）dish（BD Falcon社製）を用いて、半固形培地中で、各細胞を１６～１８日間培養した。前記半固形培地の組成は、下記表１とした。前記培養後、位相差光学顕微鏡（Eclipse TE300、Nikon社製）を用いて、ディッシュあたりの接着性コロニー数をgridded scoring dish (Stem Cell Tec社製)を用いて測定した。未分化型EPCコロニー（SEPC-CFU (primitive EPC colony forming unit)）と分化型EPCコロニー（DEPC-CFU (definitive EPC colony forming unit)）とを別々にカウントした。コントロール（pre）は、前記再生性細胞集団に代えて、前記末梢血単核球または前記臍帯血単核球を用いた以外は同様にして実施した。これらの結果を図２０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図２０は、ＥＰＣ－ＣＦＡアッセイの結果を示すグラフである。図２０において、（Ａ）は、末梢血単核球を用いた結果を示し、（Ｂ）は、臍帯血単核球を用いた結果を示す。図２０（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、前記条件を示し、縦軸は、播種細胞２００００個あたりの各ＥＰＣ細胞のコロニー数を示す。図２０（Ａ）に示すように、前記末梢血単核球においては、SEPC-CFUおよびDEPC-CFUもほとんど形成されなかった。これに対して、前記条件１～６で培養することにより、前記末梢血単核球由来細胞は、SEPC-CFUおよびDEPC-CFUの形成能が向上した。また、前記条件１～５においても、前記条件６と同様にSEPC-CFUおよびDEPC-CFUの形成能が向上していることから、前記末梢血単核球に対して、条件１～５により誘導した細胞群についても、再生性細胞集団として利用可能であることが示唆された。
　つぎに、図２０（Ｂ）に示すように、前記臍帯血単核球においては、SEPC-CFUおよびDEPC-CFUが同程度形成された。これに対して、前記条件１～６で培養することにより、前記末梢血単核球由来細胞は、SEPC-CFUおよびDEPC-CFUの形成能が向上した。また、前記条件１～５においても、前記末梢血単核球および前記条件６の組合せと同様にDEPC-CFUの形成能が向上していることから、前記臍帯血単核球に対して、条件１～６により誘導した細胞群についても、再生性細胞集団として利用可能であることが示唆された。
　以上のことから、前記末梢血単核球または前記臍帯血単核球を、各種因子で培養することにより、ＥＰＣコロニー細胞を含む再生性細胞集団を誘導できることがわかった。
［実施例３］
　本発明の臍帯由来の細胞外小胞が、血管新生促進活性を有するｍｉＲＮＡ、抗アポトーシス活性を有するｍｉＲＮＡ、抗線維化活性を有するｍｉＲＮＡ、抗線維化活性を有するｍｉＲＮＡ、および細胞増殖促進活性を有するｍｉＲＮＡを含むことを確認した。
（１）臍帯由来の再生性細胞集団の調製
　臍帯由来の再生性細胞集団は、ヒト臍帯血由来単核細胞、またはヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性前駆細胞から誘導することにより調製した。まず、ヒト臍帯血由来単核細胞（以下、「ＣＢＭＣｓ」、タカラバイオ株式会社社製）およびヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性血管内皮前駆細胞（以下、「ＣＤ３４細胞」、タカラバイオ株式会社社製）を、ＱＱ培地を用いて培養した。ＱＱ培地による培養は、実施例１（１）に記載の方法を用いて行った。
　前記ＣＢＭＣｓについて、１０ｃｍディッシュ（住友ベークライト社製）に、１０×１０７細胞／１０ｍｌ／ディッシュとなるように、播種後、３７℃、５％ＣＯ２、湿潤環境の条件で、７日間培養した。また、前記ＣＤ３４細胞について、１０ｃｍディッシュ（住友ベークライト社製）に、１０×１０５細胞／１０ｍｌ／ディッシュとなるように、播種後、３７℃、５％ＣＯ２、湿潤環境の条件で、７日間培養した。これにより、再生性細胞集団（RAC）を調製した。
（２）臍帯由来の細胞外小胞の調製
　前記培養後、前記ＣＢＭＣｓまたはＣＤ３４細胞を回収後、細胞外小胞産生培地に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。前記細胞外小胞産生培地の組成は、エクソソーム除去済のウシ胎仔血清を５（ｖ／ｖ）％を添加した、X-vivo 15（Lonza社製、Cat. No.BE02-054Q）とした。前記調製後、48時間培養した。
　前記培養後、培養上清（条件培地）を回収後、前記培養上清を３００×ｇ、４℃の条件で１０分間遠心することにより、細胞を除去した。つぎに、得られた上清画分を、２０００×ｇ、１２℃の条件で２０分間遠心後、上清画分を回収することにより、アポトーシス小体およびマイクロベシクルを除去した。前記上清画分を０．２μｍのフィルター（Millipore Merck社製、Cat. No.SLGS033SS)でろ過することにより、粒子径が２００ｎｍを超える細胞外小胞を除去した。そして、得られたろ液について、１７４０００×ｇ、４℃の条件で、１１０分間遠心することにより、細胞外小胞（エクソソーム）を沈殿させ、回収した。
（３）臍帯血由来単核細胞の細胞外小胞のｍｉＲＮＡ
　臍帯血由来の単核細胞の細胞外小胞（CB-MNCev）、およびMSC由来の細胞外小胞MSCevについて、miRNAの分析を行なった。具体的には、実施例１（４）と同様の方法で行った。得られたシーケンスデータから、各ｍｉＲＮＡ（miR-17-3p、miR-20b-5p、miR-92a-3p、miR-103a-2-5p、miR-126b-3p、miR-144-5p、miR-148a-3p、miR-181b-3p、miR-200a-3p、miR-205-5p、miR-373-3p、miR-509-3p、miR-633）の相対的な発現量を算出した。これらの結果を、図２１に示す。なお、グラフ中の統計処理としては、Two-way ANOVA検定後に、テューキーの多重比較検定を実施した。
　図２１は、ｍｉＲＮＡの発現量を示すグラフである。図２１において、（Ａ）は、血管新生促進活性のｍｉＲＮＡの発現量を示し、（Ｂ）は、抗アポトーシス活性を有するｍｉＲＮＡの発現量を示し、（Ｃ）は、抗線維化活性を有するｍｉＲＮＡの発現量を示し、（Ｄ）は、抗炎症活性を有するｍｉＲＮＡの発現量を示し、（Ｅ）は、細胞増殖促進活性を有するｍｉＲＮＡの発現量を示す。図２１において、横軸は、ＲＮＡの種類を示し、縦軸は、相対的発現量を示す。図２１に示すように、CB-MNCevは、MSCevと比較して、有意に、血管新生促進活性を有するｍｉＲＮＡ（miR-633、miR-126-3p）、抗アポトーシス活性を有するｍｉＲＮＡ（miR-92a-3p、miR-509-3p、miR-20b-5p、miR-200a-3p）、抗線維化活性を有するｍｉＲＮＡ（miR-373-3p、miR-200a-3p）、抗炎症活性を有するｍｉＲＮＡ（miR-144-5p、miR-148a-3p）、および細胞増殖促進活性を有するｍｉＲＮＡ（miR-103a-2-5p、miR-633、miR-181b-3p、miR-20b-5p、miR-200a-3p、miR-17-3p、miR-205-5p）の発現量が高かった。これらの結果から、CB-MNCevは、血管新生促進活性を有するｍｉＲＮＡ、抗アポトーシス活性を有するｍｉＲＮＡ、抗線維化活性を有するｍｉＲＮＡ、抗線維化活性を有するｍｉＲＮＡ、および細胞増殖促進活性を有するｍｉＲＮＡを含むことがわかった。
（４）臍帯血由来ＣＤ３４陽性血管内皮前駆細胞の細胞外小胞のｍｉＲＮＡ
　つぎに、臍帯血由来のＣＤ３４陽性血管内皮前駆細胞の細胞外小胞(CB-CD34ev)、およびMSC由来の細胞外小胞MSCevについて、、miRNAの分析を行なった。具体的には、実施例１（４）と同様の方法で行った。得られたシーケンスデータから、各ｍｉＲＮＡ（miR-10a-3p、miR-17-3p、miR-20b-5p、miR-21-5p、miR-24-2-5p、miR-29a-5p、miR-29c-3p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-32-5p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-133a-3p、miR-133b、miR-199b-5p、miR-210-3p、miR-221-5p、miR-324-5p、miR-363-3p、let-7c-5p）の相対的な発現量を算出した。これらの結果を、図２２に示す。なお、グラフ中の統計処理としては、Two-way ANOVA検定後に、テューキーの多重比較検定を実施した。
　図２２は、ｍｉＲＮＡの発現量を示すグラフである。図２２において、（Ａ）は、血管新生促進活性のｍｉＲＮＡの発現量を示し、（Ｂ）は、抗アポトーシス活性を有するｍｉＲＮＡの発現量を示し、（Ｃ）は、抗線維化活性を有するｍｉＲＮＡの発現量を示し、（Ｄ）は、抗炎症活性を有するｍｉＲＮＡの発現量を示し、（Ｅ）は、細胞増殖促進活性を有するｍｉＲＮＡの発現量を示す。横軸は、ｍｉＲＮＡの種類を示し、縦軸は、相対的発現量を示す。図２２に示すように、CB-CD34evは、MSCevと比較して、有意に、血管新生促進活性を有するｍｉＲＮＡ（miR-126-3p、miR-210-3p、let-7c-5p、miR-126-5p、miR-221-5p）、抗アポトーシス活性を有するｍｉＲＮＡ（miR-199b-5p、miR-30e-5p、miR-30e-3p、miR-30c-5p、miR-30b-5p、miR-32-5p、miR-20b-5p、miR-363-3p）、抗線維症活性を有するｍｉＲＮＡ（miR-29c-3p、miR-29a-5p、miR-21-5p、miR-133b、miR-133a-3p）、抗炎症活性を有するｍｉＲＮＡ（miR-21-5p、miR-24-2-5p、miR-10a-3p）、および細胞増殖促進活性を有するｍｉＲＮＡ（miR-20b-5p、miR-363-3p、miR-324-5p、miR-17-3p）の発現量が高かった。これらの結果から、CB-CD34evは、血管新生促進活性を有するｍｉＲＮＡ、抗アポトーシス活性を有するｍｉＲＮＡ、抗線維化活性を有するｍｉＲＮＡ、抗線維化活性を有するｍｉＲＮＡ、および細胞増殖促進活性を有するｍｉＲＮＡを含むことがわかった。
　以上のことから、前記臍帯血由来の単核球またはＣＤ３４陽性前駆細胞を、各種因子で培養することにより、血管新生促進活性を有すること、炎症抑制活性を有すること、アポトーシス抑制活性を有すること、血管内皮細胞増殖活性を有すること、および線維化抑制活性を有することが示唆された。
　以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
　この出願は、２０２1年５月１３日に出願された日本出願特願２０２１－８１４２６を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
＜付記＞
　上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
＜組成物＞
（付記１）
生体試料由来の単核球から誘導された再生性細胞集団またはその培養物の細胞外小胞を含む、組成物。
（付記２）
前記細胞外小胞は、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、および／またはｍｉＲ－１４２－３ｐを含む、付記１に記載の組成物。
（付記３）
さらに、前記細胞外小胞は、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３７３－３ｐ、ｍｉＲ－５０９－３ｐ、ｍｉＲ－６３３、および／またはｌｅｔ－７ｃ－５ｐを含む付記１または２に記載の組成物。
（付記４）
前記細胞外小胞は、ＣＤ９および／またはＣＤ６３陽性である、付記１から３のいずれかに記載の組成物。
（付記５）
前記細胞外小胞の平均径は、１０～５００ｎｍである、付記１から４のいずれかに記載の組成物。
（付記６）
血管内皮細胞の増殖促進活性を有する、付記１から５のいずれかに記載の組成物。
（付記７）
血管新生促進活性を有する、付記１から６のいずれかに記載の組成物。
（付記８）
線維化抑制活性を有する、付記１から７のいずれかに記載の組成物。
（付記９）
移植片拒絶反応が抑制された、付記１から８のいずれかに記載の組成物。
（付記１０）
前記細胞外小胞は、前記再生性細胞集団またはその培養物から、抽出または単離された細胞外小胞である、付記１から９のいずれかに記載の組成物。
（付記１１）
前記再生性細胞集団は、前記単核球を、幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン、および／または血管内皮細胞増殖因子の存在下、培養することで誘導される、付記１から１０のいずれかに記載の組成物。
（付記１２）
前記再生性細胞集団は、ＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞の選別を行うことなく誘導される、付記１から１１のいずれかに記載の組成物。
（付記１３）
前記再生性細胞集団は、血管内皮前駆細胞および抗炎症性マクロファージを含む、付記１から１２のいずれかに記載の組成物。
（付記１４）
前記血管内皮前駆細胞は、分化型ＥＰＣコロニー形成細胞である、付記１３に記載の組成物。
（付記１５）
抗炎症性マクロファージは、Ｍ２マクロファージである、付記１３または１４に記載の組成物。
（付記１６）
前記生体試料は、血液および骨髄の少なくとも一方である、付記１から１５のいずれかに記載の組成物。
（付記１７）
前記生体試料は、末梢血および臍帯血の少なくとも一方である、付記１から１６のいずれかに記載の組成物。
＜虚血性心疾患の処置組成物＞
（付記１８）
虚血性心疾患の処置に用いるための組成物であって、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物である、組成物。
（付記１９）
前記虚血性心疾患は、心筋梗塞である、付記１８に記載の組成物。
＜血管内皮細胞の増殖促進組成物＞
（付記２０）
血管内皮細胞の増殖促進に用いるための組成物であって、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物である、組成物。
＜血管新生誘導組成物＞
（付記２１）
血管新生の誘導に用いるための組成物であって、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物である、組成物。
＜線維化抑制組成物＞
（付記２２）
線維化の抑制に用いるための組成物であって、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物である、組成物。
＜虚血性心疾患の処置方法＞
（付記２３）
虚血性心疾患患者の処置方法であって、
前記虚血性心疾患患者に、付記１から１７のいずれかに記載の組成物を投与する、処置方法。
（付記２４）
前記虚血性心疾患は、心筋梗塞、末梢動脈疾患、心筋虚血再灌流障害、または重症下肢虚血である、付記２３に記載の処置方法。
＜血管内皮細胞の増殖促進方法＞
（付記２５）
血管内皮細胞の増殖促進方法であって、
前記血管内皮細胞と、組成物とを接触させることにより、前記血管内皮細胞の増殖を促進する工程を含み、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物である、方法。
＜血管新生の誘導方法＞
（付記２６）
血管新生の誘導方法であって、
付記１から１７のいずれかに記載の組成物を使用する、方法。
（付記２７）
血管新生を誘導する対象に、前記組成物を投与する、付記２６に記載の方法。
（付記２８）
血管新生を誘導する対象は、虚血性心疾患患者であり、
前記血管新生の誘導は、前記虚血性心疾患患者の心臓における血管新生の誘導である、付記２７または２８に記載の方法。
＜線維化抑制方法＞
（付記２９）
線維化の抑制方法であって、
付記１から１７のいずれかに記載の組成物を使用する、方法。
（付記３０）
線維化を抑制する対象に、前記組成物を投与する、付記２９に記載の方法。
（付記３１）
線維化を抑制する対象は、虚血性心疾患患者であり、
前記線維化の抑制は、前記虚血性心疾患患者の心臓における線維化の抑制である、付記２９または３０に記載の方法。
＜使用＞
（付記３２）
虚血性心疾患の処置に使用するための組成物であり、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物。
（付記３３）
血管内皮細胞の増殖促進に使用するための組成物であり、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物。
（付記３４）
血管新生の誘導に使用するための組成物であり、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物。
（付記３５）
線維化の抑制に使用するための組成物であり、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物。
　以上のように、本発明の細胞外小胞または組成物、前記移植片拒絶反応が抑制されており、かつ前記再生性細胞集団に由来するため、血管内皮細胞の増殖促進活性、血管新生促進活性等の生理活性を有する。このため、本発明は、例えば、虚血性心疾患の治療または予後の改善に好適に使用できる。したがって、本発明は、例えば、医薬分野等において極めて有用である。

 

Claims (22)

  1. 生体試料由来の単核球から誘導された再生性細胞集団またはその培養物の細胞外小胞を含む、組成物。
  2. 前記細胞外小胞は、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、および／またはｍｉＲ－１４２－３ｐを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. さらに、前記細胞外小胞は、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３７３－３ｐ、ｍｉＲ－５０９－３ｐ、ｍｉＲ－６３３、および／またはｌｅｔ－７ｃ－５ｐを含む請求項２に記載の組成物。
  4. 前記細胞外小胞は、ＣＤ９および／またはＣＤ６３陽性である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記細胞外小胞の平均径は、１０～５００ｎｍである、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 血管内皮細胞の増殖促進活性を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 血管新生促進活性を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 線維化抑制活性を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 移植片拒絶反応が抑制された、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記細胞外小胞は、前記再生性細胞集団またはその培養物から、抽出または単離された細胞外小胞である、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記再生性細胞集団は、前記単核球を、幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン、および／または血管内皮細胞増殖因子の存在下、培養することで誘導される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記再生性細胞集団は、ＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞の選別を行うことなく誘導される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記再生性細胞集団は、血管内皮前駆細胞および抗炎症性マクロファージを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記血管内皮前駆細胞は、分化型ＥＰＣコロニー形成細胞である、請求項１３に記載の組成物。
  15. 抗炎症性マクロファージは、Ｍ２マクロファージである、請求項１２または１４に記載の組成物。
  16. 前記生体試料は、血液および骨髄の少なくとも一方である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記生体試料は、末梢血および臍帯血の少なくとも一方である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 虚血性心疾患の処置に用いるための組成物であって、
    前記組成物は、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物である、組成物。
  19. 前記虚血性心疾患は、心筋梗塞、末梢動脈疾患、心筋虚血再灌流障害、または重症下肢虚血である、請求項１８に記載の組成物。
  20. 血管内皮細胞の増殖促進に用いるための組成物であって、
    前記組成物は、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物である、組成物。
  21. 血管新生の誘導に用いるための組成物であって、
    前記組成物は、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物である、組成物。
  22. 線維化の抑制に用いるための組成物であって、
    前記組成物は、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物である、組成物。

     
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