WO2024101047A1 - 組成物およびその用途 - Google Patents

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WO2024101047A1
WO2024101047A1 PCT/JP2023/036507 JP2023036507W WO2024101047A1 WO 2024101047 A1 WO2024101047 A1 WO 2024101047A1 JP 2023036507 W JP2023036507 W JP 2023036507W WO 2024101047 A1 WO2024101047 A1 WO 2024101047A1
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WO
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mir
composition
cells
disease
extracellular vesicles
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PCT/JP2023/036507
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アマンケルディ エー サリベコフ
小林　修三
孝之 浅原
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医療法人徳洲会
ＳｔｅｍＭｅｄ株式会社
ヒューマンライフコード株式会社
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Definitions

  • the present disclosure relates to compositions and uses thereof.
  • the present disclosure therefore aims to provide a composition comprising extracellular vesicles derived from cells that reduce graft rejection and have physiological activity against at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease.
  • PID peripheral arterial disease
  • PHD cerebral infarction
  • PLD pulmonary hypertension
  • spinal cord ischemia non-occlusive intestinal ischemia
  • ocular ischemic syndrome fibrosis
  • fibrosis fibrosis
  • the composition of the present disclosure is a composition for use in treating at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease, comprising:
  • the composition comprises extracellular vesicles of a regenerative cell population derived from mononuclear cells from a biological sample or a culture thereof.
  • the present disclosure provides a composition for use in treating at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease, comprising:
  • the composition is a composition of the present disclosure.
  • the present disclosure provides a composition for use in promoting the proliferation of vascular endothelial cells, comprising:
  • the composition is a composition of the present disclosure.
  • the present disclosure provides a composition for use in inducing angiogenesis, comprising:
  • the composition is a composition of the present disclosure.
  • the present disclosure provides a composition for use in inhibiting fibrosis, comprising:
  • the composition is a composition of the present disclosure.
  • the present disclosure provides a composition containing extracellular vesicles that reduces transplant rejection and has physiological activity against at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease.
  • PID peripheral arterial disease
  • PHD cerebral infarction
  • PHD pulmonary hypertension
  • spinal cord ischemia non-occlusive intestinal ischemia
  • ocular ischemic syndrome fibrosis
  • fibrosis fibrosis
  • FIG. 1 is a graph showing the particle size, production amount per cell, and average diameter of extracellular vesicles in Example 1.
  • FIG. 2 shows the expression profile of markers in Example 1, electron microscope images showing the lipid bilayer structure of extracellular vesicles, and graphs showing the amount of extracellular vesicles secreted and the amount of extracellular vesicle protein.
  • FIG. 3 is a histogram showing the expression of markers in Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing the proliferation of HUVEC cells in Example 1.
  • FIG. 5 is a photograph and a graph showing the growth area of HUVEC cells in Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the expression levels of miRNAs in Example 1.
  • FIG. 7 is a graph showing the body weight and organ weight of rats in Example 1.
  • FIG. 1 is a graph showing the particle size, production amount per cell, and average diameter of extracellular vesicles in Example 1.
  • FIG. 2 shows the expression profile of markers in Example 1, electron microscope images showing the lipid bi
  • FIG. 8 is a graph showing the percentages of CD3-positive cells, CD4-positive cells, CD8-positive cells, regulatory T cells, and CD11b/c-positive cells in Example 1.
  • FIG. 9 is a graph showing the expression levels of miRNAs in Example 1.
  • FIG. 10 is a graph showing serum pleural effusion levels and BUN levels in Example 1.
  • FIG. 11 is a photograph and a graph showing the degree of fibrosis in Example 1.
  • FIG. 12 shows photographs illustrating the microvessel density in ischemic damaged renal tissue in Example 1, and graphs illustrating the number of CD31-positive microvessels and the results of transcriptome analysis.
  • FIG. 9 is a graph showing the expression levels of miRNAs in Example 1.
  • FIG. 10 is a graph showing serum pleural effusion levels and BUN levels in Example 1.
  • FIG. 11 is a photograph and a graph showing the degree of fibrosis in Example 1.
  • FIG. 12 shows photographs illustrating the microvessel density in ischemic damaged renal tissue in Example 1,
  • FIG. 13 shows photographs indicating the microvessel density in ischemic damaged renal tissue on days 4 and 28 after the onset of R-IRI in Example 1, and a graph indicating the number of CD31-positive microvessels.
  • FIG. 14 is a photograph and a graph showing the results of IVIS measurement in Example 1.
  • FIG. 15 shows graphs and diagrams showing the results of elucidating the mechanism of fibrosis reduction, in which renal fibrosis 4 weeks after the onset of K-IRI was significantly reduced by administration of RACev in Example 1, using various analytical methods.
  • the term "disease” includes at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease, but is not particularly limited as long as it is a disease that can be treated by the composition of the present disclosure.
  • a “biological sample” refers to a sample derived from a living organism, from which cells constituting said living organism can be extracted or isolated.
  • mononuclear cells refers to cells with round nuclei contained in peripheral blood, bone marrow, umbilical cord blood, etc.
  • the mononuclear cells include, for example, lymphocytes, monocytes, macrophages, vascular endothelial progenitor cells, hematopoietic stem cells, etc.
  • the mononuclear cells may further include CD34 and/or CD133 positive cells.
  • extracellular vesicles refer to vesicles having a membrane secreted from a cell.
  • the extracellular vesicles are generally believed to be formed in the endosomes of the cell of origin and then released outside the cell.
  • the extracellular vesicles usually include a lipid bilayer membrane and an inner cavity, and the inner cavity has a structure surrounded by the lipid bilayer membrane.
  • the lipid bilayer membrane also includes lipids derived from the cell membrane of the cell of origin.
  • the inner cavity includes cytoplasm derived from the cell of origin.
  • the extracellular vesicles are classified into, for example, exosomes, microvesicles (MVs), apoptotic bodies, etc., based on their size and/or surface markers.
  • regenerative cell population refers to a cell population containing cells with regenerative function.
  • the regenerative function refers to the function of repairing or improving the function of a tissue, organ, or organ, and any one of these functions may be exhibited.
  • Specific examples of the regenerative function include the proliferation activity of vascular endothelial cells and/or the activity of promoting angiogenesis.
  • the term "cell population” refers to a cell preparation containing desired cells or a composition containing desired cells.
  • the cell population can also be referred to as, for example, a cell preparation or a composition.
  • the proportion of desired cells among all cells (hereinafter also referred to as "purity") can be quantified, for example, as the proportion of cells expressing one or more markers expressed by the desired cells.
  • the purity is, for example, the proportion in living cells.
  • the purity can be measured, for example, by methods such as flow cytometry, immunohistochemistry, and in situ hybridization.
  • the purity of the cell preparation is, for example, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • culture refers to a substance that contains cells obtained by culturing the target cells and/or the medium for said cells.
  • umbilical cord refers to a white tubular tissue that connects the fetus to the placenta.
  • the origin of the "umbilical cord” is not particularly limited, and examples include the umbilical cords of mammals such as mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses, pigs, monkeys, dolphins, and sea lions, preferably the umbilical cords of primate mammals, and more preferably the umbilical cords of humans.
  • umbilical cord blood refers to blood derived from the fetus that is contained in the umbilical cord.
  • miRNA refers to non-coding RNA of about 18 to about 25 bases in length.
  • the miRNA can also be called “microRNA”, “miR”, etc.
  • miRNA precursor refers to a transcript originating from genomic DNA and containing non-coding RNA that includes one or more miRNA sequences.
  • the miRNA precursor can also be called “pri-miRNA” or “pre-miRNA.”
  • the miRNA precursor typically has a hairpin structure and contains the base sequence of a mature miRNA.
  • mir-X refers to a miRNA precursor with number X
  • miR-X refers to the mature form (miRNA) of miRNA with number X.
  • the two miRNAs are indicated using the suffixes "-3p” or "-5p”.
  • the "miR-X” refers to both the -3p and -5p miRNAs.
  • promotion of cell proliferation means that proliferation of target cells is significantly promoted.
  • the target cells are desired cells.
  • the promotion can also be referred to as improvement, enhancement, or increase.
  • the "promotion of cell proliferation” means that proliferation of the target cells is significantly promoted in a group treated with a test substance, compared to a control group not treated with the test substance or a control group treated with a substance that does not have cell proliferation promoting activity. Therefore, in this specification, even if the cell proliferation activity of the control group is reduced compared to the control group at the start of the test, it can be said that "promotion of cell proliferation” has occurred as long as the cell proliferation of the target cells is significantly promoted compared to the control group.
  • the cell proliferation activity can be measured, for example, according to Example 1 described below.
  • promotion of angiogenesis means that the generation or proliferation of blood vessels is significantly promoted.
  • the promotion can also be referred to as improvement, enhancement, or increase.
  • the "promotion of angiogenesis” means that the generation or proliferation of blood vessels is significantly promoted in a group treated with a test substance, compared to a control group not treated with the test substance or a control group treated with a substance that does not have angiogenesis-promoting activity. Therefore, in this specification, even if the amount of blood vessel generation or proliferation is reduced in the control group compared to the control group at the start of the test, it can be said that "promotion of angiogenesis” has occurred as long as the amount of blood vessel generation or proliferation is significantly promoted compared to the control group.
  • the angiogenesis-promoting activity can be measured, for example, according to Example 1 described below.
  • fibrosis suppression means that fibrosis in a subject is significantly suppressed.
  • the suppression can also be referred to as reduction, lowering, suppression, inhibition, or prevention.
  • the "fibrosis suppression” means that fibrosis in the subject is significantly suppressed in a group treated with a test substance, compared to a control group not treated with the test substance or a control group treated with a substance that does not have fibrosis suppression activity. Therefore, in this specification, even if fibrosis is suppressed in the control group compared to the control group at the start of the test, it can be said that "fibrosis suppression” has occurred as long as fibrosis in the subject is significantly suppressed compared to the control group.
  • the fibrosis suppression activity can be measured, for example, in accordance with Example 1 described below.
  • graft rejection or “immune rejection” refers to a host reaction that rejects a graft caused in a host due to differences in major histocompatibility antigens in cell, tissue, organ, or organ transplants.
  • the graft rejection reaction can also be called an "allo-reaction” or “allograft rejection” if it is between the same species.
  • the graft rejection reaction can also be called a “xenograft rejection” if it is between different species.
  • the "graft rejection reaction” can be measured, for example, according to Example 1 described below.
  • suppression of graft rejection or “suppression of immune rejection” means that graft rejection or immune rejection is significantly suppressed.
  • the suppression can also be referred to as reduction, lowering, suppression, inhibition, or prevention.
  • the "suppression of graft rejection” means that the graft rejection is significantly suppressed in a group treated with a test substance, compared to a control group treated with a substance that induces graft rejection.
  • the extracellular vesicles suppress the graft rejection.
  • the "graft rejection" can be measured, for example, according to Example 1 described below.
  • extraction means a state in which a specific component is more concentrated than before extraction. Therefore, the extraction can also be called concentration or enrichment.
  • concentration or enrichment can be carried out, for example, by obtaining at least one concentration step.
  • isolated means that a particular component has been identified and separated and/or recovered from its natural state.
  • the “isolation” can be achieved, for example, by obtaining at least one purification step.
  • positive (+) means that a higher signal is detected by an analytical method such as flow cytometry that utilizes an antigen-antibody reaction, compared to a negative control reaction using negative control cells that do not express the antigen or an antibody that does not react with the antigen.
  • negative (-) means that a signal equal to or less than that detected in a negative control reaction using negative control cells that do not express the antigen or an antibody that does not react with the antigen is detected.
  • treatment refers to therapeutic treatment and/or prophylactic treatment.
  • treatment refers to treating, curing, preventing, suppressing, ameliorating, or ameliorating a disease, pathology, or disorder, or halting, inhibiting, reducing, or delaying the progression of a disease, pathology, or disorder.
  • prevention refers to reducing the likelihood of developing a disease or pathology, or delaying the onset of a disease or pathology.
  • the “treatment” may be, for example, treatment of a patient who develops the target disease, or treatment of an animal model of the target disease.
  • an effective dose means an amount sufficient to provide a therapeutic effect for the disease when administered to a patient with the disease.
  • the term "subject” refers to an animal or a cell, tissue, or organ derived from an animal, and is used to include humans in particular.
  • the animal refers to humans and non-human animals.
  • the non-human animals include mammals such as mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses, pigs, monkeys, dolphins, and sea lions.
  • the present disclosure provides extracellular vesicles derived from cells that reduce graft rejection and have physiological activity against at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease, or a composition comprising the same.
  • PID peripheral arterial disease
  • PHD cerebral infarction
  • PLD pulmonary hypertension
  • spinal cord ischemia non-occlusive intestinal ischemia
  • ocular ischemic syndrome fibrosis
  • fibrosis fibrosis
  • inflammatory disease or a composition comprising the same.
  • the composition of the present disclosure is a composition for use in treating at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease, the composition comprising extracellular vesicles of a regenerative cell population derived from mononuclear cells derived from a biological sample or a culture thereof.
  • composition of the present disclosure which has suppressed graft rejection and is derived from the regenerative cell population, has physiological activity such as vascular endothelial cell proliferation promoting activity, angiogenesis promoting activity, etc., against at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease.
  • PLD peripheral arterial disease
  • PHD cerebral infarction
  • PHD pulmonary hypertension
  • spinal cord ischemia non-occlusive intestinal ischemia
  • ocular ischemic syndrome fibrosis
  • fibrosis fibrosis
  • composition of the present disclosure can be suitably used for treating or improving the prognosis of at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease, for example, as described below.
  • PLD peripheral arterial disease
  • PHD cerebral infarction
  • PHD pulmonary hypertension
  • spinal cord ischemia non-occlusive intestinal ischemia
  • ocular ischemic syndrome fibrosis
  • fibrosis inflammatory disease
  • the regenerative cell population is a cell population induced from monocytes derived from the biological sample.
  • the regenerative cell population includes, for example, cells having regenerative function that can be induced from the monocytes.
  • Examples of the cells having regenerative function include vascular endothelial precursor cells and anti-inflammatory macrophages, and may also include Th2 cells, regulatory T cells (Treg), and the like.
  • the vascular endothelial precursor cells and the anti-inflammatory macrophages have, for example, angiogenesis-promoting activity and anti-inflammatory activity as the regenerative function, and are therefore extremely useful in that they can not only regenerate blood vessels at inflammatory sites such as ulcers, but also suppress inflammation.
  • the regenerative cell population includes one or more types of cells having the regenerative function.
  • the endothelial progenitor cells are cells that have the ability to differentiate into vascular endothelial cells.
  • the endothelial progenitor cells can be identified using cell surface markers such as CD34, CD133, KDR (kinase insert domain receptor, CD309), and CD105.
  • the vascular endothelial precursor cells may be further classified according to the degree of differentiation.
  • the vascular endothelial precursor cells can be further classified into differentiated EPC colony cells and undifferentiated EPC colony cells.
  • the differentiated EPC colony cells mainly contain cells with a diameter of 20 to 50 ⁇ m (CFU-large cell like EC, hereinafter also referred to as "large EPC colony”).
  • the undifferentiated EPC colony cells mainly contain cells with a diameter of 20 ⁇ m or less (CFU-small cell like EC, hereinafter also referred to as "small EPC colony").
  • EPC colonies that appear at an early stage can be said to be EPC colonies at an early differentiation stage with excellent proliferation ability
  • large EPC colonies that appear at a later stage can be said to be EPC colonies at a late differentiation stage with excellent vascular development (neogenesis)
  • the differentiated EPC colony cells have superior regenerative functions such as angiogenesis and repair, for example, compared to the undifferentiated EPC colony cells, so it is preferable that the vascular endothelial precursor cells are differentiated EPC colony forming cells.
  • the anti-inflammatory macrophages are a type of macrophage that secrete anti-inflammatory cytokines (IL-10, IL-4) and the like, and are cells that contribute to angiogenesis or repair.
  • the anti-inflammatory macrophages can be identified using cell surface markers such as CD206, CD163, and CD169.
  • the anti-inflammatory macrophages are preferably M2 macrophages, because they have excellent regenerative functions such as angiogenesis or repair.
  • the proportion of cells having the regenerative function among all cells in the regenerative cell population is not particularly limited, and may be, for example, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more, 40% or more, 45% or more, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the proportion of cells can be calculated, for example, by measuring the proportion of cells positive for the cell surface marker of interest using a cell surface marker having the regenerative function. The measurement can be performed, for example, using a flow cytometry method.
  • the proportion of cells having the regenerative function among all cells in the regenerative cell population is typically increased by 2-fold, preferably 4-fold or more, compared to the proportion of cells having the corresponding regenerative function in mononuclear cells derived from the biological sample.
  • the proportion of the cells with regenerative function among all the cells in the regenerative cell population can be calculated, for example, as the total proportion of CD34-positive cells and CD206-positive cells.
  • the cells having the regenerative function are derived from the monocytes. Therefore, the biological sample used to derive the regenerative cell population may be any biological sample containing the monocytes.
  • the monocytes are abundant in blood and lymph. Therefore, the biological sample may be tissue, organ, and/or organs containing blood vessels and/or lymphatic vessels, or may be blood and/or lymph. Specific examples of the biological sample include bone marrow; blood such as umbilical cord blood and peripheral blood; lymph; and the like.
  • the biological sample may be a biological sample collected from a subject to be administered, treated, or treated with the composition of the present disclosure (hereinafter, collectively referred to as "administration subject"), or may be a biological sample collected from a subject other than the administration subject. From the viewpoint of not being subject to restrictions during preparation, it is desirable to use a biological sample collected from a subject other than the administration subject.
  • the regenerative cell population may be cells derived from a biological sample collected from a subject other than the administration subject (allogeneic cells), or may be cells derived from a biological sample collected from the administration subject (autologous cells).
  • the extracellular vesicles can be suitably prepared using a biological sample collected from a subject other than the administration subject because the graft rejection reaction is suppressed.
  • the extracellular vesicles exert a therapeutic effect without being eliminated, for example, by immune rejection.
  • the extracellular vesicles can be prepared, for example, as an off-the-shelf formulation.
  • the method of preparing the biological sample is not particularly limited and can be set appropriately depending on, for example, the type of the biological sample.
  • the biological sample when the biological sample is bone marrow, the biological sample can be obtained, for example, by performing bone marrow puncture on the subject.
  • the biological sample when the biological sample is peripheral blood, the biological sample can be obtained, for example, by drawing venous blood.
  • the biological sample is umbilical cord blood, the biological sample can be obtained, for example, by isolating the umbilical cord and then drawing the blood in the umbilical cord.
  • the method for isolating mononuclear cells from the biological sample can be carried out in accordance with the method commonly used in this field, for example, by using a cell suspension prepared from the biological sample and a mononuclear cell separation solution such as Ficoll or Percoll to separate the mononuclear cells from other components.
  • a mononuclear cell separation solution such as Ficoll or Percoll
  • the method for inducing the cells having regenerative function from the monocytes derived from the biological sample can be carried out by a known method depending on the type of the cells having regenerative function.
  • the induction method when inducing vascular endothelial progenitor cells from the monocytes, can be carried out by, for example, culturing the monocytes in the presence of SCF, IL-6, FLT3L, TPO, and/or VEGF.
  • the induction method can be carried out by, for example, culturing the monocytes in the presence of IL-10, IL-4, M-CSF, and/or G-CSF.
  • the induction method is preferably a method capable of inducing both the vascular endothelial progenitor cells and the anti-inflammatory macrophages from the monocytes.
  • the induction method described in WO 2014/051154 can be used.
  • the regenerative cell population can induce cells having the regenerative function, including, for example, extracellular vesicles having the angiogenesis promoting activity and the anti-inflammatory activity, it is preferable to culture the mononuclear cells in the presence of factors such as stem cell factor (SCF), interleukin 6 (IL-6), FMS-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L), thrombopoietin (TPO), and/or vascular endothelial growth factor (VEGF).
  • SCF stem cell factor
  • IL-6 interleukin 6
  • FMS-like tyrosine kinase 3 ligand Flt3L
  • TPO thrombopoietin
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the mononuclear cells to be cultured may be a desired cell population obtained by selecting a desired cell population from the mononuclear cells derived from the biological sample, or the mononuclear cells derived from the biological sample themselves may be used.
  • the mononuclear cells to be cultured it is preferable to use mononuclear cells obtained without selecting CD34 and/or CD133 positive cells (unselected mononuclear cells).
  • the regenerative cell population obtained after the culture is a cell population in which the differentiated EPC colony-forming cells are increased (amplified), the anti-inflammatory macrophages are increased (amplified), and further, anti-inflammatory Th2 cells and regulatory T cells are increased (amplified), compared to the case where mononuclear cells selected as CD34 positive cells are used.
  • a cell population enriched in the proportion of cells having the regenerative function can be obtained as the regenerative cell population, and this makes it possible to obtain extracellular vesicles with excellent physiological activity against at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease, such as vascular endothelial cell proliferation promoting activity, angiogenesis promoting activity, fibrosis suppressing activity, graft rejection suppressing activity, and immunosuppressive activity.
  • PID peripheral arterial disease
  • PHD pulmonary hypertension
  • spinal cord ischemia non-occlusive intestinal ischemia
  • ocular ischemic syndrome ocular ischemic syndrome
  • fibrosis inflammatory disease
  • vascular endothelial cell proliferation promoting activity such as vascular endothelial cell proliferation promoting activity, angiogenesis promoting activity, fibrosis suppressing activity,
  • the SCF is a glycoprotein consisting of 248 amino acids and having a molecular weight of about 30,000.
  • the SCF is generated in a soluble form and a membrane-bound form by selective splicing.
  • the SCF used in the culture may be any type of SCF as long as it is useful for culturing a regenerative cell population such as EPC.
  • the soluble type is preferable.
  • the origin of the SCF is not particularly limited, but a recombinant form is preferable because a stable supply is expected, and a human recombinant form is particularly preferable.
  • the human recombinant SCF is commercially available.
  • the concentration of SCF in the medium can be set according to the type of SCF, and is not particularly limited as long as it is useful for culturing a regenerative cell population such as EPC.
  • the concentration of SCF in the medium is, for example, 10 to 1000 ng/ml, preferably 50 to 500 ng/ml, and more preferably about 100 ng/ml.
  • IL-6 is a glycoprotein with a molecular weight of about 21,000 that was isolated as a factor that induces the final differentiation of B cells into antibody-producing cells, and is known to be involved in immune responses, proliferation and differentiation of hematopoietic and nervous system cells, acute phase reactions, and the like.
  • the origin of the IL-6 is not particularly limited, but a recombinant form is preferred because of the expected stable supply, and a human recombinant form is particularly preferred.
  • the human recombinant IL-6 is commercially available.
  • the concentration of IL-6 in the medium varies depending on the type of IL-6 used, but is not particularly limited as long as it is useful for culturing a regenerative cell population such as EPC.
  • the concentration of IL-6 in the medium is, for example, 1 to 500 ng/ml, preferably 5 to 100 ng/ml, and more preferably about 20 ng/ml.
  • the Flt3L is known as a ligand of a receptor tyrosine kinase that plays an important role in controlling early hematopoiesis.
  • the Flt3L is known to be a product of several alternative splicings, and it has been reported that it stimulates the proliferation of hematopoietic stem cells.
  • the Flt3L may be any type of Flt3L as long as it is useful for culturing regenerative cell populations such as EPCs.
  • the origin of the Flt3L is not particularly limited, but since a stable supply is expected, a recombinant form is preferred, and a human recombinant form is particularly preferred.
  • the human recombinant Flt3L is commercially available.
  • the concentration of Flt3L in the medium varies depending on the type of Flt3L used, but is not particularly limited as long as it is useful for culturing regenerative cell populations such as EPCs.
  • the concentration of Flt3L in the medium is, for example, 10 to 1000 ng/ml, preferably 50 to 500 ng/ml, and more preferably about 100 ng/ml.
  • the TPO is a type of hematopoietic cytokine, and is known to act specifically on the process of producing megakaryocytes from hematopoietic stem cells and promote the production of megakaryocytes.
  • the origin of the TPO is not particularly limited, but a recombinant form is preferred because of the expected stable supply, and a human recombinant form is particularly preferred.
  • the human recombinant TPO is commercially available.
  • the concentration of TPO in the medium varies depending on the type of TPO used, but is not particularly limited as long as it is useful for culturing regenerative cell populations such as EPCs.
  • the concentration of TPO in the medium is, for example, 1 to 500 ng/ml, preferably 5 to 100 ng/ml, and more preferably about 20 ng/ml.
  • the VEGF is a growth factor that acts specifically on EPCs and is known to be produced mainly in cells around blood vessels.
  • the VEGF is produced as several types of VEGF proteins with different sizes by selective splicing.
  • the VEGF may be any type of VEGF as long as it is capable of forming a colony of EPCs contained in the regenerative cell population, and is preferably VEGF165.
  • the origin of the VEGF is not particularly limited, but a recombinant form is preferred because of the expected stable supply, and a human recombinant form is particularly preferred.
  • the human recombinant VEGF is commercially available.
  • the concentration of VEGF in the medium varies depending on the type of VEGF used, and is not particularly limited as long as it is useful for culturing a regenerative cell population such as EPCs.
  • the concentration of VEGF in the medium is, for example, about 5 to 500 ng/ml, preferably about 20 to 100 ng/ml, and more preferably about 50 ng/ml.
  • the various factors added to the medium are derived from animals of the same or different species as the animal from which the monocytes are derived, but it is preferable to use factors derived from the same species of animal.
  • a regenerative cell population suitable for allogeneic transplants such as allogeneic transplants and extracellular vesicles derived therefrom can be obtained.
  • monocytes derived from the subject of administration it is also possible to obtain extracellular vesicles suitable for allogeneic transplants.
  • the resulting regenerative cell population and extracellular vesicles derived therefrom can reduce the risk of infection and rejection when administered, etc.
  • the medium used for the culture may be prepared by dissolving the various factors in a basal medium to a predetermined concentration, or by preparing a concentrated solution (stock solution) containing the various factors in advance and diluting it with the desired medium to a predetermined concentration.
  • the medium used for the culture may be prepared by dissolving the various factors required in a commercially available basal medium to a predetermined concentration and then sterilizing it by filtration sterilization or the like, or by aseptically adding and diluting a stock solution sterilized by filtration sterilization or the like to a commercially available basal medium.
  • the filtration sterilization can be performed according to a method commonly used in this field, for example, using a Millipore filter with a pore size of 0.22 ⁇ m or 0.45 ⁇ m.
  • the basal medium may be a basal medium commonly used in the field, for example, a basal medium known as a medium for growing hematopoietic stem cells.
  • the basal medium may be a serum-containing medium or a serum-free medium, i.e., a serum-free medium.
  • a serum-free medium as the medium and/or basal medium
  • cells having the regenerative function can be efficiently induced (amplified) in the culture (induction) of the regenerative cell population from the mononuclear cells.
  • the medium is a serum-free medium.
  • the medium or basal medium include DMEM, MEM, IMDM, etc.
  • the medium contains at least one factor, preferably three or more factors, more preferably all factors selected from the group consisting of SCF, IL-6, FLT3L, TPO, and VEGF. Therefore, the medium used for the culture contains, for example, any of the following: (1) SCF, (2) IL-6, (3) FLT3L, (4) TPO, or (5) VEGF; (6) a combination of SCF and IL-6, (7) a combination of SCF and FLT3L, (8) a combination of SCF and TPO, (9) a combination of SCF and VEGF, (10) a combination of IL-6 and FLT3L, (11) a combination of IL-6 and TPO, (12) a combination of IL-6 and VEGF, (13) a combination of FLT3L and TPO, (14) a combination of FLT3L and VEGF, or (15) a combination of TPO and VEGF; (16) a combination of SCF, IL-6, and FLT3L, (17) a combination of
  • the medium more preferably contains SCF, IL-6, FLT3L, TPO, and VEGF.
  • the medium further preferably contains about 50 ng/mL VEGF, about 100 ng/mL SCF, about 20 ng/mL IL-6, 100 ng/mL FLT3L, and about 20 ng/mL TPO.
  • the mononuclear cells can be cultured using a medium containing the various factors by adding a cell suspension containing the mononuclear cells to the medium containing the various factors.
  • the cell suspension may be a body fluid containing the mononuclear cells (e.g., bone marrow fluid, umbilical cord blood, peripheral blood), etc.
  • the mononuclear cells are not particularly limited in culture conditions, and can be cultured under conditions generally used in the art. As a specific example, the culture conditions include culturing the mononuclear cells under a 5% CO2 atmosphere at 37°C for 7 days or more (e.g., 10 days or more).
  • the concentration (seeding density) of the mononuclear cells in the medium is not particularly limited as long as it allows the culture of a regenerative cell population such as EPC.
  • the concentration (seeding density) of the mononuclear cells in the medium is, for example, about 0.5 to 10 x 105 cells/ml, more preferably about 1 to 5 x 105 cells/ml, and even more preferably about 3 to 4 x 105 cells/ml.
  • the culture of the regenerative cell population may be a culture obtained by inducing the regenerative cell population from the mononuclear cells, or may be a culture obtained by culturing the induced regenerative cell population.
  • the medium and culture conditions for the regenerative cell population are not particularly limited, and the explanation of the medium and culture conditions for the mononuclear cells can be used, for example.
  • the medium for the regenerative cell population can be, for example, a medium obtained by adding serum, preferably human serum, to the basal medium.
  • the origin of the serum may be the same as that of the regenerative cell population or may be different, but it is preferable that they are the same.
  • the serum may contain the extracellular vesicles. For this reason, when adding the serum to the basal medium, it is preferable to use serum from which the extracellular vesicles in the serum have been removed.
  • the serum from which the extracellular vesicles have been removed is commercially available.
  • the concentration of the serum is, for example, 1 to 20 (v/v)%, preferably 1 to 10 (v/v)%.
  • the regenerative cell population can be cultured by adding a cell suspension containing the regenerative cell population to a medium for the regenerative cell population.
  • the culture conditions for the regenerative cell population are not particularly limited, and the regenerative cell population can be cultured under conditions generally used in the art. As a specific example, the culture conditions include culturing the regenerative cell population for 1 to 10 days (e.g., 1 to 2 days) under a 5% CO2 atmosphere at 37°C.
  • the concentration (seeding density) of the regenerative cell population in the medium is not particularly limited as long as the regenerative cell population can be cultured.
  • the concentration (seeding density) of the regenerative cell population in the medium is, for example, about 1 x 10 4 to 1 x 10 7 cells/ml, more preferably about 1 x 10 5 to 1 x 10 6 cells/ml, and even more preferably about 5 x 10 5 cells/ml.
  • the extracellular vesicles are secreted from the cells from which they are derived, as described above.
  • the extracellular vesicles may be isolated or extracted from the regenerative cell population or a culture thereof.
  • the extracellular vesicles When the extracellular vesicles are extracted or isolated from the regenerative cell population, the extracellular vesicles can be isolated or extracted, for example, by disrupting the regenerative cell population to release the extracellular vesicles in the cells of the regenerative cell population, separating a soluble fraction from the resulting suspension, and then subjecting the soluble fraction to an extracellular vesicle isolation or extraction method.
  • the extracellular vesicles isolation or extraction method can be performed in accordance with a method commonly performed in the art, for example, a method using centrifugation, an affinity purification method using a membrane protein derived from the regenerative cell population or the membrane protein present in the membrane of the extracellular vesicles, or filtration using a porous membrane such as a filter.
  • a filter for example, a commercially available membrane filter can be used, and as a specific example, a membrane filter with a pore size of 0.22 ⁇ m (manufactured by Millipore) can be used.
  • the membrane protein of the extracellular vesicles will be described later.
  • the extracellular vesicles can be isolated or extracted using a commercially available kit, and as a specific example, the qEv isolation kit (manufactured by Izon Sciences) can be used.
  • the centrifugation conditions may be any conditions that allow the extracellular vesicles to be precipitated, and specific examples include 10,000 to 300,000 x g or 90,000 to 180,000 x g for 20 to 60 minutes.
  • the temperature during the centrifugation is, for example, 0 to 10°C, preferably 0 to 4°C.
  • the culture is composed of, for example, the regenerative cell population and its medium (conditioned medium or culture supernatant). Therefore, when isolating from the culture, the extracellular vesicles may be isolated or extracted from the regenerative cell population or the conditioned medium, or may be separated from both the regenerative cell population and the conditioned medium.
  • the method for separating the regenerative cell population and the conditioned medium from the culture can be performed in accordance with the method usually performed in the art, for example, by filter filtration, centrifugation, etc.
  • the extracellular vesicles can be isolated or extracted in the same manner as in the case of extracting or isolating from the regenerative cell population described above.
  • the method for isolating or extracting the extracellular vesicles can be performed, for example, by a method using centrifugation, an affinity purification method using a membrane protein derived from the regenerative cell population present in the membrane of the extracellular vesicles or the membrane protein, filtration using a porous membrane such as a filter, etc.
  • the isolation or extraction of the extracellular vesicles may be performed using a commercially available kit, and as a specific example, the qEv isolation kit (Izon Sciences) can be used.
  • the extracellular vesicles are derived from the regenerative cell population, and therefore contain components derived from the regenerative cell population.
  • the extracellular vesicles have, for example, a lipid bilayer membrane and a lumen, and the lumen is surrounded by the lipid bilayer membrane.
  • the lipid bilayer membrane is derived from, for example, a membrane of the regenerative cell population, specifically, a membrane of a cell of the regenerative cell population. Examples of the membrane include a cell membrane; a membrane of an intracellular organelle such as a mitochondria, an endoplasmic reticulum, an endosome, a lysosome, a Golgi apparatus, and the like.
  • the lumen has, for example, a cytoplasm derived from the regenerative cell population, specifically, a cytoplasm derived from a cell of the regenerative cell population. Therefore, the extracellular vesicles contain, for example, miRNA, DNA, and/or proteins derived from the cytoplasm of a cell of the regenerative cell population.
  • the lipid bilayer membrane of the extracellular vesicles contains, for example, membrane components of the cells of the regenerative cell population. Therefore, the extracellular vesicles can be defined, for example, using membrane components present in the regenerative cell population.
  • the membrane components include membrane proteins.
  • the membrane proteins include extracellular vesicle markers such as CD9, CD63, Alix (ALG-2-interacting protein X), and Hsp-70 (Heat Shock Protein 70); cell surface markers of the cells; and the like.
  • the cell surface marker can be appropriately determined depending on the type of the cells.
  • examples of the cell surface markers include CD34, CD133, KDR (kinase insert domain receptor, CD309), CD105, and the like.
  • examples of the cell surface markers include CD206, CD163, CD169, and the like.
  • the lipid bilayer membrane of the extracellular vesicles contains, for example, one or more types of membrane components. The membrane components can be measured, for example, by flow cytometry using an antibody against a molecule of interest.
  • the lumen of the extracellular vesicles contains, for example, the cytoplasm of the cells of the regenerative cell population. Therefore, the extracellular vesicles can be defined, for example, using cytoplasmic components present in the regenerative cell population. Examples of the cytoplasmic components include miRNAs, etc.
  • the miRNA is, for example, miR-15b-5p, miR-29b-3p, miR-29c-3p, miR-92a-2-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-133a-3p, miR-133b, miR-146a-3p, miR-146b-5p, miR-150-5p, miR-181b-3p, miR-195-3p, miR-195-5p, miR-200b-5p, miR-302a-5p, miR-142-3p, miR-10a-3p, miR-17-3p, miR-20b-5p, miR-21-5p, miR -24-2-5p, miR-29a-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-32-5p, miR-92a-3p, miR-103a-2-5p, miR-144-5p, miR-148a-3p, miR-199b-5p, miR-
  • miR-92a-2-5p, miR-133a-3p, miR-133b, miR-146a-3p, miR-200b-5p, miR-302a-5p, and miR-142-3p are assumed to be specific miRNAs in the extracellular vesicles of the regenerative cell population. For this reason, it is preferable that the lumen of the extracellular vesicles contains miR-92a-2-5p, miR-133a-3p, miR-133b, miR-146a-3p, miR-200b-5p, miR-302a-5p, and/or miR-142-3p.
  • the lumen of the extracellular vesicles contains, for example, one or more types of cytoplasmic components.
  • the cytoplasmic components can be measured, for example, by flow cytometry using an antibody against a target molecule.
  • the cytoplasmic components can be measured, for example, using a sequencer.
  • the miRNA preferably includes, for example, miR-15b-5p, miR-29b-3p, miR-92a-2-5p, miR-146a-3p, miR-146b-5p, miR-150-5p, miR-195-3p, miR-195-5p, miR-200b-5p, miR-302a-5p, and/or miR-142-3p.
  • the miRNA may be, for example, miR-10a-3p, miR-17-3p, miR-20b-5p, miR-21-5p, miR-24-2-5p, miR-29a-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-32-5p, miR-92a-3p, miR-1 It is preferable that the miR-144-5p, miR-148a-3p, miR-199b-5p, miR-200a-3p, miR-205-5p, miR-210-3p, miR-221-5p, miR-324-5p, miR-363-3p, miR-373-3p, miR-509-3p, miR-633, and/or let-7c-5p are included.
  • miR-20b-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-32-5p, miR-92a-2-5p, miR-92a-3p, miR-199b-5p, miR-200a-3p, miR-363-3p, and miR-509-3p are generally known to have anti-apoptotic activity.
  • miR-17-3p, miR-20b-5p, miR-103a-2-5p, miR-150-5p, miR-181b-3p, miR-200a-3p, miR-205-5p, miR-302a-5p, miR-324-5p, miR-363-3p, and miR-633 are generally known to have cell proliferation promoting activity.
  • miR-150-5p is generally known to have cell migration promoting activity.
  • miR-21-5p, miR-29a-5p, miR-29b-3p, miR-29c-3p, miR-133a-3p, miR-133b, miR-200a-3p, and miR-373-3p are generally known to have anti-fibrotic activity, in particular, activity of suppressing the expression of TGF- ⁇ .
  • miRNAs miR-15b-5p, miR-29c-3p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-146a-3p, miR-146b-5p, miR-181b-3p, miR-195-3p, miR-195-5p, miR-200b-5p, miR-210-3p, miR-221-5p, miR-633, and let-7c-5p are generally known to have angiogenesis promoting activity.
  • miRNAs miR-10a-3p, miR-21-5p, miR-24-2-5p, miR-142-3p, miR-144-5p, and miR-148a-3p are generally known to have anti-inflammatory activity.
  • the components contained in the lumen may be replaced with components other than the cytoplasm of the regenerative cell population.
  • the lumen is loaded with a desired cargo.
  • the cargo include low molecular weight compounds, proteins or peptides such as antibodies, nucleic acids, etc.
  • the average diameter (weighted average) of the extracellular vesicles is, for example, 1 to 500 nm, preferably 10 to 250 nm, and more preferably 30 to 150 nm.
  • the average diameter can be measured in accordance with Example 1 described below.
  • the average diameter of the extracellular vesicles can be adjusted, for example, by filtering a liquid containing the extracellular vesicles using a filter having a desired pore size.
  • composition of the present disclosure may further contain a pharma- ceutically acceptable carrier.
  • a pharma- ceutically acceptable carrier examples include a suspending agent, solubilizing agent, stabilizer, isotonicity agent, preservative, adsorption inhibitor, surfactant, diluent, medium, pH adjuster, soothing agent, buffer, sulfur-containing reducing agent, antioxidant, etc., for administering the extracellular vesicles, and may be added appropriately within a range that does not interfere with the effects of the present disclosure.
  • compositions of the present disclosure may be used, for example, in vitro or in vivo , and may be used, for example, as research reagents or as pharmaceuticals.
  • the subject of administration of the composition of the present disclosure is not particularly limited.
  • the subject of administration can be, for example, a human or a non-human animal other than a human.
  • the non-human animal can be, for example, a mammal such as a mouse, a rat, a rabbit, a dog, a cat, a cow, a horse, a pig, a monkey, a dolphin, or a sea lion; a bird; a fish; or the like.
  • the subject of administration can be, for example, a cell, a tissue, an organ, or an organ
  • the cell can be, for example, a cell or a cultured cell taken from a living body
  • the tissue, organ, or organ can be, for example, a tissue (living tissue) or an organ taken from a living body.
  • the cell can be, for example, a muscle cell, an iPS cell (induced pluripotent stem cell), a stem cell, or the like.
  • the subject to which the composition is administered can be, for example, a subject diagnosed with or suspected of having a renal disease, etc.
  • the renal disease can be, for example, acute kidney injury, transitional chronic kidney disease, chronic kidney disease, or immunosuppression after kidney transplantation, etc.
  • the subject to which it is administered can be, for example, a subject diagnosed with or suspected of having peripheral arterial disease.
  • the subject to which it is administered can be, for example, a subject diagnosed with or suspected of having cerebral infarction.
  • the subject to which the composition is administered can be, for example, a subject diagnosed with or suspected of having pulmonary hypertension.
  • the subject to which it is administered can be, for example, a subject diagnosed with or suspected of having spinal cord ischemia.
  • the subject to which the composition is administered can be, for example, a subject diagnosed with or suspected of having non-occlusive intestinal ischemia.
  • the subject to which the composition is administered can be, for example, a subject diagnosed with or suspected of having ocular ischemic syndrome.
  • the subject to which the composition is administered may be, for example, a subject diagnosed with or suspected of having fibrosis.
  • the fibrosis include pulmonary fibrosis, myocardial fibrosis, and myelofibrosis.
  • the inflammatory disease include autoimmune disease, inflammatory bowel disease, and inflammatory muscle disease.
  • the subject to which the composition is administered may be, for example, a subject diagnosed with or suspected of having an inflammatory disease.
  • the inflammatory disease include autoimmune diseases, inflammatory bowel diseases, and inflammatory muscle diseases.
  • the autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, polymyositis, Sjogren's syndrome, systemic sclerosis, glomerulonephritis, and vasculitis.
  • the inflammatory bowel diseases include ulcerative colitis and Crohn's disease.
  • the inflammatory muscle diseases include dermatomyositis, polymyositis, necrotizing autoimmune myositis, and (idiopathic) inclusion body myositis.
  • compositions of the present disclosure are not particularly limited, and the administration form, administration time, dosage, etc. can be set appropriately depending on, for example, the type of subject to be administered.
  • composition of the present disclosure can be administered, for example, orally or parenterally, such as intravenously.
  • intravenous administration is preferred, since it can be administered safely and stably, regardless of the skill of the person administering it.
  • the dosage of the composition of the present disclosure is an effective dosage, and specifically, when administered to a subject, it is an amount that can obtain a therapeutic effect (therapeutic effect) for at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease, as compared with a subject not administered.
  • the dosage can be appropriately determined, for example, depending on the age, body weight, symptoms, etc. of the subject.
  • the dosage can be, for example, 10 4 to 10 9 vesicles/kg body weight, 10 4 to 10 8 vesicles/kg body weight, or 10 4 to 10 7 vesicles/kg body weight per administration, preferably 10 4 to 10 8 vesicles/kg body weight, or 10 4 to 10 7 vesicles/kg body weight.
  • composition of the present disclosure may be administered once or multiple times.
  • the multiple times may be, for example, two, three, four, five or more times.
  • the number of administrations may be appropriately determined while confirming the therapeutic effect on the subject.
  • the administration interval may be appropriately determined while confirming the therapeutic effect on the subject, and may be, for example, once a day, once a week, once every two weeks, once a month, once every three months, once every six months, etc.
  • the composition of the present disclosure has suppressed graft rejection and is derived from the regenerative cell population, and therefore has physiological activity such as angiogenesis promoting activity against at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease.
  • PLD peripheral arterial disease
  • PHD cerebral infarction
  • PLD pulmonary hypertension
  • spinal cord ischemia non-occlusive intestinal ischemia
  • ocular ischemic syndrome fibrosis
  • fibrosis fibrosis
  • composition of the present disclosure can be suitably used for treating or improving the prognosis of at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease, for example, as described below.
  • PLD peripheral arterial disease
  • PHD cerebral infarction
  • PHD pulmonary hypertension
  • spinal cord ischemia non-occlusive intestinal ischemia
  • ocular ischemic syndrome fibrosis
  • fibrosis inflammatory disease
  • the present disclosure provides a composition for use in the treatment of at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease, or a method using the same.
  • the present disclosure provides a composition for use in the treatment of at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease, the composition being the composition of the present disclosure.
  • the present disclosure provides a method for treating a patient with at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease, the composition being the composition of the present disclosure.
  • kidney disease examples include kidney disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory diseases.
  • PLD peripheral arterial disease
  • PHD pulmonary hypertension
  • spinal cord ischemia non-occlusive intestinal ischemia
  • ocular ischemic syndrome examples of the diseases.
  • kidney disease examples include acute kidney injury, transitional chronic kidney disease, chronic kidney disease, and immunosuppression after kidney transplantation.
  • fibrosis examples include pulmonary fibrosis, myocardial fibrosis, and myelofibrosis.
  • inflammatory disease examples include autoimmune diseases, inflammatory bowel diseases, and inflammatory muscle diseases.
  • autoimmune disease examples include rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, polymyositis, Sjogren's syndrome, systemic scleroderma, glomerulonephritis, and vasculitis.
  • inflammatory bowel disease examples include ulcerative colitis and Crohn's disease.
  • inflammatory muscle disease examples include dermatomyositis, polymyositis, necrotizing autoimmune myositis, and (idiopathic) inclusion body myositis.
  • the present disclosure provides a composition for use in promoting the proliferation of vascular endothelial cells or a method using the same.
  • the present disclosure provides a composition for use in promoting the proliferation of vascular endothelial cells, the composition being the composition of the present disclosure.
  • the present disclosure also provides a method for promoting the proliferation of vascular endothelial cells, the method comprising the step of promoting the proliferation of the vascular endothelial cells by contacting the vascular endothelial cells with a composition, the composition comprising the composition of the present disclosure.
  • the present disclosure provides a composition for use in inducing angiogenesis or a method using the same.
  • the present disclosure provides a composition for use in inducing angiogenesis, the composition being a composition of the present disclosure.
  • the present disclosure also provides a method for inducing angiogenesis, using a composition of the present disclosure.
  • the extracellular vesicles or composition are administered to a subject in which angiogenesis is to be induced.
  • the subject in which angiogenesis is to be induced may be, for example, a patient with renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), or the like.
  • PAD peripheral arterial disease
  • PHD pulmonary hypertension
  • the induction of angiogenesis can also be referred to as induction of angiogenesis in the kidney, brain, lung, bone marrow, intestine, eye, ischemic muscle, or a site where ischemia-reperfusion injury has occurred (for example, central or peripheral blood vessels) of the patient.
  • the present disclosure provides a composition for use in inhibiting fibrosis or a method using the same.
  • the present disclosure provides a composition for use in inhibiting fibrosis, the composition being the composition of the present disclosure.
  • the present disclosure also provides a method for inhibiting fibrosis, using the composition of the present disclosure.
  • the extracellular vesicles or composition are administered to a subject in which fibrosis is to be inhibited.
  • the subject in which fibrosis is to be inhibited may be, for example, a patient with renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), or the like.
  • PAD peripheral arterial disease
  • PHD pulmonary hypertension
  • the induction of angiogenesis can also be said to be the inhibition of fibrosis in the kidney, brain, lung, bone marrow, intestine, eye, ischemic muscle, or the site where ischemia-reperfusion injury has occurred (for example, central or peripheral blood vessels) of the patient.
  • the present disclosure is a composition for use in treating at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease.
  • PLD peripheral arterial disease
  • PHD pulmonary hypertension
  • spinal cord ischemia non-occlusive intestinal ischemia
  • ocular ischemic syndrome fibrosis
  • fibrosis fibrosis
  • the present disclosure is also a composition for use in promoting the proliferation of vascular endothelial cells.
  • the present disclosure is a composition for use in promoting angiogenesis.
  • the present disclosure is a composition for use in inhibiting fibrosis.
  • composition of the present disclosure has vascular endothelial cell proliferation activity, reduces graft rejection, restores renal function, has antifibrotic activity, and has angiogenesis promotion activity.
  • RACev RAC-derived extracellular vesicles
  • PBMCs Human peripheral blood mononuclear cells
  • PBMNCs Peripheral blood mononuclear cells
  • Histopaque-1077 Sigma-Aldrich, #10771
  • the isolated PBMNCs were washed with phosphate buffered saline (PBS)-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and suspended in serum-free medium (QQ medium) to prepare a cell suspension.
  • PBS phosphate buffered saline
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • QQ medium serum-free medium
  • the CD34 positivity and CD133 positivity of the isolated PBMNCs were 0.23 ⁇ 0.03% and 0.20 ⁇ 0.07%, respectively. Additionally, the number of CD34 positive cells per 100 ml of peripheral blood was (27.8 ⁇ 4.5)x104, and the number of CD133 positive cells was (23.2 ⁇ 6.9)x104.
  • the serum-free medium used for culturing (inducing) the regenerative cell population was prepared by aseptically adding the following factors to the serum-free medium at the specified concentrations: stemline (trademark) II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium (Sigma-Aldrich, Cat No. S0192).
  • rhSCF (Concentration of each factor in QQ medium): 100 ng/ml rhFlt3L (Peprotech, Inc., Cat. No. #300-19): 100 ng/ml rhTPO (Peprotech, Inc., Cat. No. #300-18): 20 ng/ml rhVEGF (Peprotech, Inc., Cat. No. #100-02): 50 ng/ml rhIL-6 (Peprotech, Inc., Cat. No. #200-06): 20 ng/ml Penicillin/Streptomycin (Gibco), Cat. No. 15140122: 100 U/100 ⁇ g/ml) r: recombinant h: human-derived
  • the PBMNCs were seeded on 10 cm dishes (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) at 10 x 107 cells/10 ml/dish and then cultured for 7 days at 37°C, 5% CO2 , and in a humid environment. This resulted in the preparation of a regenerative cell population (RAC). Unless otherwise specified below, the culture conditions were 37°C, 5% CO2 , and in a humid environment.
  • the RAC was collected and centrifuged.
  • the obtained pellet was suspended in an extracellular vesicle production medium to prepare a cell suspension.
  • the composition of the extracellular vesicle production medium was X-vivo 15 medium (Lonza, Cat. No. BE02-054Q) supplemented with 5 (v/v)% exosome-removed fetal bovine serum.
  • the obtained cell suspension was seeded on a 10 cm dish at 2.5 x 10 5 cells/ml/dish (250k) or 5 x 10 5 cells/ml/dish (500k), and then cultured for 48 hours.
  • the culture supernatant (conditioned medium) was collected, and the culture supernatant was centrifuged at 300 ⁇ g and 4°C for 10 minutes to remove cells.
  • the obtained supernatant fraction was then centrifuged at 2000 ⁇ g and 12°C for 20 minutes, and the supernatant fraction was collected to remove apoptotic bodies and microvesicles.
  • the supernatant fraction was filtered through a 0.2 ⁇ m filter (Millipore Merck, Cat. No. SLGS033SS) to remove extracellular vesicles with a particle size of more than 200 nm.
  • the obtained filtrate was then centrifuged at 174,000 ⁇ g and 4°C for 110 minutes to precipitate and collect extracellular vesicles (exosomes).
  • the collected precipitate was suspended in the medium or buffer solution (maximum 3 ⁇ 50 ⁇ l) used in each experiment described below.
  • the number and size of EVs were then measured by nanoparticle tracking analysis using NanoSight500 (Malvern Panalytical) according to the manufacturer's manual.
  • CM-Dil dye (C7000, Thermo Fisher) was added to the filtrate to a concentration of 2 ⁇ mol/l for labeling.
  • the resulting reaction solution was then centrifuged at 174,000 x g and 4°C for 110 minutes, after which the extracellular vesicles were washed with PBS and centrifuged under the same conditions. The same washing and centrifugal separation were performed again.
  • the collected precipitate was then suspended in the medium or buffer solution (maximum 3 x 50 ⁇ l) to be used in each experiment described below.
  • the detector configuration in the software was updated and assigned to the VSSC channel in the WDM.
  • the flow path of the flow cytometer was washed with a cleaning solution (FlowClean) and then passed through water filtered through a 10 ⁇ m filter.
  • extracellular vesicles were measured. Furthermore, the particle diameter of each extracellular vesicle was calculated by comparing the intensity of the obtained side scattered light (SSC) between the latex beads and each extracellular vesicle. Then, the average diameter (weighted average) was calculated based on the obtained particle diameter.
  • SSC side scattered light
  • the particle diameter of each extracellular vesicle was calculated in the same manner, except that a nanoparticle tracking analysis (NTA) device (ZetaView (registered trademark), DKSH) was used instead of the flow cytometer, and the average diameter (weighted average) was calculated. Then, it was confirmed that the average diameter obtained by the flow cytometer and the average diameter obtained by the NTA device were almost the same value.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • the expression of the markers was measured using the flow cytometer after staining the extracellular vesicles with anti-CD9 antibody (PE-labeled, Biolegend, Cat. No. #312106) and anti-CD63 antibody (PE-labeled, Biolegend, Cat. No. #353004). Controls were performed in the same manner, except that control antibodies were used instead of the various antibodies.
  • the amount of extracellular vesicles produced per cell was calculated based on the count in the flow cytometer and the measured volume of the sample liquid.
  • the structure of the lipid membrane and lumen was observed using a scanning electron microscope (JEM-1400, manufactured by JEOL Ltd.).
  • EGM-2 (Lonza) was used as the medium for passage of the HUVEC cells
  • EBM-2 (Lonza) was used as the medium for measuring the proliferation activity of the HUVEC cells.
  • 250k or 500k RAC or MSC-isolated extracellular vesicles (RACev or MSCev) were added to each dish.
  • the dishes were cultured for 2 days under the above culture conditions. After the above culture, each dish was observed using a phase contrast microscope (6-well dish, Falcon). In the obtained phase contrast images, the number of cells per field of view (HPF) was counted, and the ratio of the area occupied by HUVEC cells to the total area was calculated as the growth area.
  • HPF phase contrast microscope
  • HUVEC cells were collected from the dishes, and the division of HUVEC cells was measured using the above-mentioned marker as an indicator using a flow cytometer (FACS Verse, BD Biosciences).
  • the control was performed in the same manner, except that RACev and MSCev were not added.
  • miRNA analysis was performed on RACev and MSCev added during the culture of HUVEC cells. Specifically, miRNA was purified from the RACev and MSCev using miRNA purification kits (miRNeasy mini kit and RNeasy MinElute Cleanup Kit, QIAGEN). A library for sequencing was prepared using the obtained miRNA and a library construction kit (QIAseqTM). The quality of the library was inspected using Agilent Bioanalyze and a DNA chip (High Sensitivity DNA chip, Agilent Technologies). The library was sequenced using a next-generation sequencer (NextSeq 500, Illumina) and decoded as a 76-bp single-end read.
  • miRNA purification kits miRNeasy mini kit and RNeasy MinElute Cleanup Kit, QIAGEN
  • a library for sequencing was prepared using the obtained miRNA and a library construction kit (QIAseqTM). The quality of the library was inspected using Agilent Bioanalyze and a DNA chip (High
  • each miRNA (miR-181b-3p, miR-150-5p, miR-302a-5p, miR-92a-2-5p) were calculated from the obtained sequence data.
  • the relative expression levels were calculated based on the expression levels of each miRNA in HUVEC cells to which extracellular vesicles were not added.
  • control was performed in the same manner, except that extracellular vesicles were not added.
  • extracellular vesicles were not added.
  • Tukey's multiple comparison test was performed for statistical processing in the graphs.
  • Rats were anesthetized with 3-4% sevoflurane (Maruishi Pharmaceutical). Through a midline abdominal incision, the two renal pedicles were brought together and then clamped for 45 min using a microaneurysm clamp (FST). During the ischemic period, the rats were placed on a heating pad at 37°C to maintain body temperature. After clamp removal, renal blood flow was checked for recovery for 1 min, and the abdomen was closed after confirming that the kidney had returned to its original color. Sham-operated rats underwent the same surgical procedure, except that the microaneurysm clamp was not applied.
  • FST microaneurysm clamp
  • a predetermined time (30 minutes, 1 day, and 2 days) after the induction of the ischemia-reperfusion injury.
  • the initial body weight measurement was performed before the induction of the ischemia-reperfusion injury (baseline), and then the body weight was measured once a week for up to 4 weeks after the induction of the injury.
  • the kidneys were collected and their weights were measured 4 days and 4 weeks after the induction.
  • the peripheral blood and kidneys were collected 4 weeks after the induction.
  • the percentages of CD3 positive cells, CD4 positive cells, CD8 positive cells, regulatory T cells, and CD11b/c positive cells in the peripheral blood were measured using a flow cytometer.
  • the control was performed in the same manner except that RACev and MSCev were not administered.
  • the relative expression levels of each miRNA (miR-142-3p) were calculated for the administered RACev and MSCev. Dunn's multiple comparison test was used for statistical processing in the graphs.
  • the original FASTQ files generated by NextSeq were uploaded to the Qiagen GeneGlobe Data Analysis Center (https://geneglobe.qiagen.com) and aligned to miRBase v21 (http://www.mirbase.org). All reads assigned to a specific miR were counted, associated UMIs were tabulated, and unique molecules were counted.
  • the miR UMI count bases were subjected to downstream analysis using StrandNGS 3.4 software (Agilent Technologies). UMI counts were quantified using the trimmed mean M-value (TMM) method.
  • TMM trimmed mean M-value
  • pathway statistical analysis was performed using PathVisio tools on the pathway collection in the Wiki Pathways database to determine pathways taking into account the number of genes contained in the pathway and the number of target genes.
  • Kidney tissues were collected 4-6 days after the onset of R-IRI, and total RNA was isolated using a nucleic acid extraction system according to the manufacturer's instructions. RNA integrity scores were confirmed using an Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).
  • FIG. 1 is a graph showing the particle size, production amount per cell, and average diameter of extracellular vesicles.
  • A shows the results of particle size
  • B shows the results of production amount
  • C shows the results of average diameter.
  • the horizontal axis shows particle size (logarithm)
  • the vertical axis shows the relative number
  • the horizontal axis shows the type of sample
  • the vertical axis shows the number of extracellular vesicles produced.
  • Figure 1C the horizontal axis shows the type of sample, and the vertical axis shows the average diameter.
  • RAC-derived extracellular vesicles were slightly larger than MSC-derived extracellular vesicles (MSCev), with the average diameter of RACev being 145 nm, while that of MSCev was 130 nm. Also, as shown in Figure 1B, RAC produced significantly more extracellular vesicles per cell than MSC.
  • Figure 2 shows the expression profile of markers, electron microscope images showing the lipid bilayer structure of extracellular vesicles, and graphs showing the amount of extracellular vesicles secreted and the amount of extracellular vesicle proteins.
  • Figure 2A shows the results of the EV biomarker expression profile of anti-CD9 and anti-CD63 in RACev
  • Figure 2B shows a transmission electron microscope photograph showing the lipid bilayer structure of extracellular vesicles
  • Figure 2C shows the results of quantifying the amount of extracellular vesicles secreted per million RACs
  • Figure 2D shows the number of all proteins in RACev derived from one million RACs.
  • the horizontal axis shows the expression amount of anti-CD63 or anti-CD9 positive RACev by flow cytometry, and the vertical axis shows the size of IgG control and stained RACev.
  • the horizontal axis shows the type of sample, and the vertical axis shows the amount of extracellular vesicles secreted.
  • the horizontal axis indicates the type of sample, and the vertical axis indicates the number of all proteins in RACev derived from RACs.
  • the presence of extracellular vesicle-specific markers (CD9, CD63) was confirmed.
  • Fig. 2B a lipid bilayer structure was confirmed.
  • RACev extracellular vesicles
  • Figure 3 is a histogram showing the expression of markers.
  • Figure 3A shows the results for RACev
  • Figure 3B shows the results for MSCev.
  • the horizontal axis shows the SSC intensity or the fluorescence intensity of each marker
  • the vertical axis shows the count.
  • the particle size of extracellular vesicles can be measured by flow cytometer by using latex beads with a known particle size.
  • the expression of CD63 and CD9 was confirmed in RACev.
  • Figures 3A and B the expression level of CD63 was higher in RACev compared to MSCev.
  • FIG 4 is a graph showing the proliferation of HUVEC cells.
  • the horizontal axis indicates the type of sample, and the vertical axis indicates the number of cells per field of view (HPF).
  • RACev and MSCev promoted the proliferation of vascular endothelial cells compared to the control.
  • RACev significantly promoted the proliferation of vascular endothelial cells compared to MSCev (MSCev-250K vs. RACev-250K: P>0.001, MSCev-500K vs. RACev-500K: P>0.0001).
  • Figure 5 shows photographs and a graph showing the growth area of HUVEC cells.
  • Figure 5A shows a phase contrast image
  • Figure 5B shows a graph of the growth area.
  • the horizontal axis indicates the type of sample
  • the vertical axis indicates the growth area.
  • RACev and MSCev increased the growth area of vascular endothelial cells compared to the control.
  • RACev significantly increased the growth area of vascular endothelial cells compared to MSCev (MSCev-500K vs. RACev-500K: P > 0.0007).
  • Figure 6 is a graph showing the expression levels of miRNA.
  • the horizontal axis shows the type of miRNA, and the vertical axis shows the relative expression levels.
  • RACev had significantly higher expression levels of miRNA with anti-apoptotic activity (miR-92a-2-5p), miRNA with cell division promoting activity (miR-181b-3p, miR-150-5p, miR-302a-5p), and miRNA with cell migration promoting activity (miR-150-5p).
  • Figure 7 is a graph showing changes in body weight and organ weight (kidney weight) of the subject animals after 4 weeks.
  • Figure 7A is a graph showing changes in body weight of the subject animals after 4 weeks
  • Figure 7B is a graph comparing kidney weights of the subject animals after 4 weeks.
  • the horizontal axis shows elapsed time
  • the vertical axis shows body weight (g).
  • the horizontal axis shows the type of sample
  • the vertical axis shows kidney weight ( ⁇ g).
  • Figure 7A shows that the weight increase after 4 weeks was significantly higher in the RACev-treated group than in the control group.
  • Figure 7B shows that the kidney weight after 4 weeks was increased in the control group and the RACev-treated group compared to the Sham group, and was almost equivalent. As shown in Figures 7A to 7B, no graft rejection was observed due to transplantation of RACev.
  • Statistical significance was determined by two-way analysis of variance with Tukey's multiple comparison test for body weight and one-way analysis of variance with Tukey's multiple comparison test for kidney weight. Results are shown as mean ⁇ SEM.
  • FIG. 8 is a graph showing the percentages of CD3 positive cells, CD4 positive cells, CD8 positive cells, regulatory T cells, and CD11b/c positive cells in peripheral blood.
  • the horizontal axis shows the type of sample, and the vertical axis shows the percentage of each cell.
  • the horizontal axis shows the type of sample, and the vertical axis shows the relative expression level.
  • RACev had significantly higher expression levels of miRNA (miR-142-3p) with immunosuppressive activity (anti-inflammatory properties) compared to MSCev. It is known that miR-142-3p is contained in exosomes released by regulatory T cells (Treg). These results suggest that RACev suppresses graft rejection by delivering miRNA with immunosuppressive activity.
  • FIG 10 is a graph showing serum creatinine (Cr) values and serum BUN values.
  • Figure 10A shows a graph comparing the changes in serum creatinine (Cr) values over time
  • Figure 10B shows a graph comparing the changes in serum BUN values over time.
  • the horizontal axis shows the elapsed time
  • the vertical axis shows the serum creatinine (Cr) value (mg/dL).
  • the horizontal axis shows the elapsed time
  • the vertical axis shows the serum BUN value (mg/dL).
  • the body weight (BW) of the rats was measured before onset and every week after onset. Four weeks after onset, the BW of the RACev transplant group was increased compared to the control group (RACev: 333 ⁇ 6 g, control: 315 ⁇ 5.5 g, P ⁇ 0.0053).
  • Figure 11 is a photograph and a graph showing the degree of fibrosis.
  • Figure 11A is a fluorescent micrograph showing the degree of fibrosis in each part
  • Figure 11B is a graph comparing the fibrosis area in the cortex
  • Figure 11C is a graph comparing the fibrosis area in the medulla
  • Figure 11D shows the expression level of miRNA with anti-fibrotic activity
  • Figure 11E shows the expression level of miRNA with anti-inflammatory activity
  • Figure 11F shows the expression level of fibrosis-promoting genes.
  • the horizontal axis shows the type of sample
  • the vertical axis shows the fibrosis area (%).
  • the horizontal axis shows the type of sample, and the vertical axis shows the fibrosis area (%).
  • the horizontal axis shows the type of RNA, and the vertical axis shows the relative expression level.
  • the horizontal axis shows the type of gene, and the vertical axis shows the Log ratio (RACev vs. Control).
  • FIGs 11A-C Masson's trichrome staining demonstrated that renal fibrosis levels were preserved in the treatment group compared with the control group in both the cortex and medulla regions (P ⁇ 0.04 in the cortex, treated vs. control; P ⁇ 0.01 in the medulla, treated vs. control).
  • FIG. 12 shows photographs showing microvessel density in ischemia-damaged renal tissue and a graph showing the number of CD31-positive microvessels.
  • FIG. 12A shows blood vessels in ischemia-damaged renal tissue
  • FIG. 12B shows a graph comparing blood vessel density in the cortex
  • FIG. 12C shows a graph comparing blood vessel density in the medulla
  • FIG. 12D shows a graph showing the expression level of miRNA.
  • the horizontal axis indicates the type of sample
  • the vertical axis indicates the microvessel density (/mm 2 ).
  • the horizontal axis indicates the type of miRNA, and the vertical axis indicates the relative expression level.
  • FIG. 12A to FIG. 12C it was shown that the microvessel density was enhanced in ischemia-damaged renal tissue in the RACev-treated group (P ⁇ 0.003, treated group vs. control group), indicating the strong angiogenic properties of RACev.
  • FIG. 13 is a photograph showing the microvessel density of ischemic damaged kidney tissue on days 6 and 28 after R-IRI onset, and a graph showing the number of CD31-positive microvessels.
  • FIG. 13A shows blood vessels in ischemic damaged kidney tissue
  • FIG. 13B is a graph comparing blood vessel density in the cortex
  • FIG. 13C is a graph comparing blood vessel density in the medulla
  • FIG. 13D is a graph showing genes related to angiogenesis.
  • the horizontal axis indicates the type of sample
  • the vertical axis indicates the microvessel density (/mm 2 ).
  • the horizontal axis indicates the type of gene
  • the vertical axis indicates the Log ratio (RACev vs.
  • FIG. 13A and 13B show that the microvessel density of ischemic injured kidney tissue was beneficially enhanced in the RACev transplantation group compared with the control group (P ⁇ 0.005 at day 6, P ⁇ 0.003 for RAC vs control at day 28), indicating the strong vascular protective and angiogenic properties of RACev. Furthermore, transcriptomic analysis showed that RACev therapy significantly upregulated angiogenesis-related genes in ischemic kidney tissue compared with the control group ( Figure 13D). Taken together, RACev delivered angiogenic enzymes and vascular protective miRs to promote angiogenesis and protect against hypoxia-induced renal vascular network damage at the site of ischemic injury.
  • FIG. 14 is a photograph showing the results of IVIS measurement. As a result of IVIS measurement, it was confirmed that labeled RACev accumulates in the damaged kidneys of the transplant group. The above EV tracking analysis showed that RACev selectively accumulates in the liver.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • inflammatory cell subsets of peripheral blood mononuclear cells undergo phenotypic change towards pro-regenerative cells, including angiogenic endothelial progenitor cells, M2 macrophages, and regulatory T cells.
  • RACev significantly reduced serum creatinine and blood urinary nitrogen on day 3 compared with the control group.
  • the treatment group had less fibrosis in the cortical and medullary regions than the control group (P ⁇ 0.04 and P ⁇ 0.01).
  • CD31 staining confirmed increased capillary density in the treatment group compared with the control group (P ⁇ 0.003).
  • Figure 15 shows the results of elucidating the mechanism of fibrosis reduction, in which renal fibrosis is significantly reduced 4 weeks after the onset of K-IRI by administration of RACev, using various analytical methods.
  • Figures 15A and 15B show the expression levels of miRNA
  • Figure 15C shows the results of cluster analysis of the most highly related pathway regulation in the control group
  • Figure 15D shows the results of network analysis of the relationship between genes in the downstream mechanism of the control group
  • Figure 15E shows the results of network analysis of the relationship between genes in the downstream mechanism of the treatment group.
  • RNA sequencing and data analysis revealed that RACev contains several important anti-inflammatory miRs, such as miR-10a-3p, miR-21-5p, miR-24-2-5p, and miR24-3p, which can control excessive inflammation and initiate regeneration (Fig. 15A).
  • RACev has anti-apoptosis and cell proliferation miRs (Fig. 15B).
  • pathway analysis showed that renal tissue fibrosis was initiated by the hypoxia pathway (P ⁇ 2.19e-02) (Fig.
  • composition> (Appendix 1) 1. A composition for use in treating at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease, comprising: The composition comprises extracellular vesicles of a regenerative cell population derived from mononuclear cells derived from a biological sample or a culture thereof. (Appendix 2) 2.
  • composition of claim 1, wherein the extracellular vesicles comprise miR-15b-5p, miR-29b-3p, miR-29c-3p, miR-92a-2-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-133a-3p, miR-133b, miR-146a-3p, miR-146b-5p, miR-150-5p, miR-181b-3p, miR-195-3p, miR-195-5p, miR-200b-5p, miR-302a-5p, and/or miR-142-3p.
  • the extracellular vesicles contain miR-10a-3p, miR-17-3p, miR-20b-5p, miR-21-5p, miR-24-2-5p, miR-29a-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-32-5p, miR-92a-3p, miR-103a-2-5p, miR- 3.
  • composition of claim 1 or 2 comprising miR-144-5p, miR-148a-3p, miR-199b-5p, miR-200a-3p, miR-205-5p, miR-210-3p, miR-221-5p, miR-324-5p, miR-363-3p, miR-373-3p, miR-509-3p, miR-633, and/or let-7c-5p.
  • Appendix 4 The composition of any one of claims 1 to 3, wherein the extracellular vesicles are CD9 and/or CD63 positive.
  • composition of any one of claims 1 to 4 wherein the average diameter of the extracellular vesicles is 10 to 500 nm.
  • (Appendix 6) A composition described in any of appendix 1 to 5, having vascular endothelial cell proliferation-promoting activity.
  • (Appendix 7) A composition described in any one of appendix 1 to 6, having angiogenesis promoting activity.
  • (Appendix 8) A composition described in any one of appendix 1 to 7, having fibrosis-suppressing activity.
  • (Appendix 9) 9. The composition according to any one of claims 1 to 8, wherein transplant rejection is suppressed.
  • (Appendix 10) The composition of any of claims 1 to 9, wherein the extracellular vesicles are extracellular vesicles extracted or isolated from the regenerative cell population or a culture thereof. (Appendix 11) 11.
  • stem cell factor interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin, and/or vascular endothelial growth factor.
  • Appendix 12 12.
  • Appendix 13 13.
  • the composition of any of claims 1 to 12, wherein the regenerative cell population comprises endothelial progenitor cells, anti-inflammatory macrophages, and regulatory T cells.
  • compositions for treating at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease (Appendix 18)
  • a composition for use in the therapeutic or prophylactic treatment of at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease comprising:
  • the composition is a composition according to any one of claims 1 to 17.
  • composition of claim 18, wherein the renal disease is acute kidney injury, transitional chronic kidney disease, chronic kidney disease, or immunosuppression after renal transplantation.
  • a pharmaceutical product for renal disease comprising the composition according to any one of appendices 1 to 17, for therapeutic or prophylactic treatment of at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease.
  • composition for promoting proliferation of vascular endothelial cells (Appendix 21) A composition for use in promoting the proliferation of vascular endothelial cells, comprising: The composition is a composition according to any one of claims 1 to 17.
  • ⁇ Angiogenesis-inducing composition> (Appendix 22) A composition for use in inducing angiogenesis, comprising: The composition is a composition according to any one of claims 1 to 17.
  • ⁇ Fibrosis-inhibiting composition> (Appendix 23) A composition for use in inhibiting fibrosis, comprising: The composition is a composition according to any one of claims 1 to 17. Methods for Treating Renal Disease (Appendix 24) 1.
  • a method for treating a patient suffering from at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease comprising: A method of treatment comprising administering to a patient with renal disease a composition described in any one of claims 1 to 17. (Appendix 25) 25.
  • a method for promoting proliferation of vascular endothelial cells comprising: The method includes a step of promoting proliferation of the vascular endothelial cells by contacting the vascular endothelial cells with a composition, The composition is a composition described in any one of claims 1 to 17.
  • Method for inducing angiogenesis (Appendix 27) A method for inducing angiogenesis, comprising: A method of using a composition according to any one of claims 1 to 17. (Appendix 28) 28. The method of claim 27, wherein the composition is administered to a subject to induce angiogenesis.
  • the subject in whom angiogenesis is induced is a patient suffering from at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease;
  • the method according to claim 28 or 29, wherein the induction of angiogenesis is induction of angiogenesis in the kidney, brain, lung, bone marrow, intestine, eye, ischemic muscle, or a site where ischemia-reperfusion injury occurs in the disease patient.
  • Appendix 30 A method for inhibiting fibrosis, comprising: A method of using a composition according to any one of claims 1 to 17. (Appendix 31) The method of claim 30, wherein the composition is administered to a subject in whom fibrosis is to be inhibited.
  • the subject for whom fibrosis is to be suppressed is a patient suffering from at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease;
  • the method according to claim 30 or 31, wherein the inhibition of fibrosis is inhibition of fibrosis in the kidney, brain, lung, bone marrow, intestine, eye, ischemic muscle, or a site where ischemia-reperfusion injury occurs in the disease patient.
  • a composition for use in the therapeutic or prophylactic treatment of at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease comprising: The composition is a composition according to any one of claims 1 to 17.
  • a composition for use in promoting the proliferation of vascular endothelial cells The composition is a composition according to any one of claims 1 to 17.
  • (Appendix 36) A composition for use in inhibiting fibrosis, The composition is a composition according to any one of claims 1 to 17.
  • the composition of the present disclosure has suppressed graft rejection and is derived from the regenerative cell population, and therefore has physiological activities such as vascular endothelial cell proliferation promoting activity and angiogenesis promoting activity. Therefore, the present disclosure can be suitably used for treating or improving the prognosis of at least one of renal disease, peripheral arterial disease (PAD), cerebral infarction, pulmonary hypertension (PHD), spinal cord ischemia, non-occlusive intestinal ischemia, ocular ischemic syndrome, fibrosis, and inflammatory disease. Therefore, the present disclosure is extremely useful, for example, in the medical field.
  • PID peripheral arterial disease
  • PHD cerebral infarction
  • PHD pulmonary hypertension
  • spinal cord ischemia non-occlusive intestinal ischemia
  • ocular ischemic syndrome fibrosis
  • fibrosis fibrosis

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Abstract

移植片拒絶反応が低減され、かつ腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患に対する生理活性を有する細胞由来の細胞外小胞を提供する。 本開示の組成物は、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の処置に用いる組成物であって、前記組成物が、生体試料由来の単核球から誘導された再生性細胞集団またはその培養物の細胞外小胞を含む。

Description

組成物およびその用途
　本開示は、組成物およびその用途に関する。
　炎症性疾患、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）等の様々な疾患において、細胞を用いた治療が試みられている。前記細胞としては、自家細胞が用いられている。しかしながら、自家細胞を用いる場合、患者から細胞を取得後、加工して、前記患者に投与する必要があるため、時間を要し、かつ加工間の処理のばらつきの問題がある。このため、他家細胞による治療も試みられている（特許文献１）。
特表２０１１－５２９９５７号公報
　しかしながら、前記患者に前記他家細胞を移植した場合、前記移植後、前記他家細胞に対する免疫反応（移植片拒絶反応）が惹起され、前記他家細胞が、前記患者から排除され、十分な治療効果が得られないという問題がある。
　そこで、本開示は、移植片拒絶反応が低減され、かつ腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患に対する生理活性を有する細胞由来の細胞外小胞を含む組成物の提供を目的とする。
　前記目的を達成するため、本開示の組成物は、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の処置に用いる組成物であって、
前記組成物が、生体試料由来の単核球から誘導された再生性細胞集団またはその培養物の細胞外小胞を含む。
　本開示は、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の処置に用いるための組成物であって、
前記組成物は、前記本開示の組成物である。
　本開示は、血管内皮細胞の増殖促進に用いるための組成物であって、
前記組成物は、前記本開示の組成物である。
　本開示は、血管新生の誘導に用いるための組成物であって、
前記組成物は、前記本開示の組成物である。
　本開示は、線維化の抑制に用いるための組成物であって、
前記組成物は、前記本開示の組成物である。
　本開示によれば、移植片拒絶反応が低減され、かつ、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患に対する生理活性を有する細胞外小胞を含む組成物を提供できる。
図１は、実施例１における実施例１における細胞外小胞の粒子径、細胞あたりの産生量および平均径を示すグラフである。 図２は、実施例１におけるマーカーの発現プロファイル、細胞外小胞の脂質二重層構造を示す電子顕微鏡画像、および細胞外小胞の分泌量並びに細胞外小胞タンパク質量を示すグラフである。 図３は、実施例１におけるマーカーの発現を示すヒストグラムである。 図４は、実施例１におけるHUVEC細胞の増殖を示すグラフである。 図５は、実施例１におけるHUVEC細胞の成長領域を示す写真およびグラフである。 図６は、実施例１におけるｍｉＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図７は、実施例１におけるラットの体重および臓器の重量を示すグラフである。 図８は、実施例１におけるＣＤ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、制御性Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の割合を示すグラフである。 図９は、実施例１におけるｍｉＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図１０は、実施例１における血清フレアチニン値、およびＢＵＮ値を示すグラフである。 図１１は、実施例１における線維化の程度を示す写真およびグラフである。 図１２は、実施例１における虚血損傷腎組織における微小血管密度を示す写真、並びにＣＤ３１陽性微小血管数及びトランスクリプトーム解析の結果を示すグラフである。 図１３は、実施例１における、Ｒ－ＩＲＩ発症後４日目と２８日目における虚血損傷腎組織の微小血管密度を示す写真およびＣＤ３１陽性微小血管の数を示すグラフである。 図１４は、実施例１におけるＩＶＩＳ測定の結果を示す写真およびグラフである。 図１５は、実施例１におけるＲＡＣｅｖの投与によりＫ－ＩＲＩ発症後４週間の腎線維症が顕著に減少する線維症減少の機序解明を、様々な解析方法を用いて行った結果を示すグラフ及び図である。
＜定義＞
　本開示において「疾患」という場合、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つが含まれるが、例えば、本開示の組成物により処置できる疾患であれば、特に限定されない。
　本明細書において、「生体試料」は、生体に由来する試料であり、前記生体を構成する細胞を抽出または単離可能な試料を意味する。
　本明細書において、「単核球」は、末梢血、骨髄または臍帯血等に含まれる円形核を持つ細胞を意味する。前記単核球は、例えば、リンパ球、単球、マクロファージ、血管内皮前駆細胞、造血幹細胞等が含まれる。前記単核球は、さらにＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞を含んでもよい。
　本明細書において、「細胞外小胞」は、細胞から分泌される膜を有する小胞を意味する。前記細胞外小胞は、一般的に、由来する細胞のエンドソーム内で形成された後、前記細胞の外に放出されると考えられている。このため、前記細胞外小胞は、通常、脂質二重膜と、内腔とを含み、前記内腔は、前記脂質二重膜に囲われた構造を有する。また、前記脂質二重膜は、由来する細胞の細胞膜由来の脂質を含む。そして、前記内腔は、由来する細胞由来の細胞質を含む。前記細胞外小胞は、その大きさおよび／または表面マーカーにより、例えば、エクソソーム（exosome）、マイクロベシクル（micro vesicle：MV）、アポトーシス小体等に分類される。
　本明細書において、「再生性細胞集団」は、再生機能を有する細胞を含む細胞集団を意味する。前記再生機能は、組織、器官、または臓器の機能を修復または改善する機能を意味し、いずれか一つの機能を奏すればよい。具体例として、前記再生機能は、血管内皮細胞の増殖活性および／または血管新生促進活性等があげられる。
　本明細書において、「細胞集団」は、所望の細胞を含む細胞調製物または所望の細胞を含む組成物を意味する。このため、本明細書において、前記細胞集団は、例えば、細胞調製物または組成物ということもできる。前記細胞集団において、全細胞に占める所望の細胞の割合（以下、「純度」ともいう）は、例えば、所望の細胞が発現する１以上のマーカー発現する細胞の割合として定量できる。前記純度は、例えば、生細胞中の割合である。前記純度は、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学的手法、インシチュハイブリダイゼーション等の方法により測定できる。
　本明細書において、前記細胞調製物の純度は、例えば、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上である。
　本明細書において、「培養物」は、対象の細胞を培養することにより得られる細胞および／または前記細胞の培地を含む物を意味する。
　本明細書において、「臍帯」は、胎児と胎盤を繋ぐ白色の管状組織を意味する。本開示において、「臍帯」の由来は、特に制限されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、イルカ、アシカ等の哺乳類の臍帯があげられ、好ましくは、霊長類哺乳動物の臍帯であり、より好ましくは、ヒトの臍帯である。
　本明細書において、「臍帯血」は、臍帯に含まれる胎児由来の血液を意味する。
　本明細書において、「ｍｉＲＮＡ」は、約１８～約２５塩基長のノンコーディングＲＮＡを意味する。前記ｍｉＲＮＡは、「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲ」等ということもできる。
　本明細書において、「ｍｉＲＮＡ前駆体」は、ゲノムＤＮＡを起源とし、１つ以上のｍｉＲＮＡ配列を含むノンコーディングのＲＮＡを含む転写物を意味する。前記ｍｉＲＮＡ前駆体は、「ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ」（プリｍｉＲＮＡ）、または「ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ」（プレｍｉＲＮＡ）ということもできる。前記ｍｉＲＮＡ前駆体は、通常、ヘアピン構造を有し、かつ成熟したｍｉＲＮＡの塩基配列を含有する。
　本明細書において、「ｍｉｒ－Ｘ」は、番号ＸのｍｉＲＮＡ前駆体を指し、「ｍｉＲ－Ｘ」は、番号ＸのｍｉＲＮＡの成熟型（ｍｉＲＮＡ）を指す。本明細書において、２つのｍｉＲＮＡが同じｍｉＲＮＡ前駆体の反対のアームを起源とする場合、２つのｍｉＲＮＡは、「－３ｐ」または「－５ｐ」という接尾辞を用いて示す。以下、特に示さない限り、前記「ｍｉＲ－Ｘ」は、ｍｉＲＮＡ前駆体が２つのｍｉＲＮＡを含む場合、－３ｐおよび－５ｐの両者のｍｉＲＮＡを指す。また、本明細書において、２つのｍｉＲＮＡの相対的発現量が公知であり、一方のｍｉＲＮＡの発現量が、他方のｍｉＲＮＡの発現量より低い場合、前記発現量の低いｍｉＲＮＡは、名称の後にアスタリスクを用いて示す。各「ｍｉｒ－Ｘ」および「ｍｉＲ－Ｘ」の塩基配列等の情報は、ｍｉＲＢａｓｅ（http://www.mirbase.org/）を参照できる。
　本明細書において、「細胞の増殖促進」は、対象細胞の増殖が有意に促進されていることを意味する。前記対象細胞は、所望の細胞である。前記促進は、向上、増強、または増加ということもできる。具体例として、前記「細胞の増殖促進」は、被検物質の処理群が、前記被検物質を処理していない対照群または細胞増殖促進活性を有さない物質で処理した対照群と比較して、前記対象細胞の増殖が有意に促進されていることを意味する。このため、本明細書において、前記対照群において、前記対照群の試験開始時と比較して細胞増殖活性が低下していても、前記対照群と比較して、前記対象細胞の細胞増殖が有意に促進されていれば、「細胞の増殖促進」が生じているといえる。前記細胞増殖活性は、例えば、後述の実施例１に準じて測定できる。
　本明細書において、「血管新生促進」は、血管の新生または増生が有意に促進されていることを意味する。前記促進は、向上、増強、または増加ということもできる。具体例として、前記「血管新生促進」は、被検物質の処理群が、前記被検物質を処理していない対照群または血管新生促進活性を有さない物質で処理した対照群と比較して、前記血管の新生または増生が有意に促進されていることを意味する。このため、本明細書において、前記対照群において、前記対照群の試験開始時と比較して血管の新生または増生量が低下していても、前記対照群と比較して、前記血管の新生または増生量が有意に促進されていれば、「血管新生促進」が生じているといえる。前記血管新生促進活性は、例えば、後述の実施例１に準じて測定できる。
　本明細書において、「線維化抑制」は、対象の線維化が有意に抑制されていることを意味する。前記抑制は、低減、低下、抑止、阻害、または防止ということもできる。具体例として、前記「線維化抑制」は、被検物質の処理群が、前記被検物質を処理していない対照群または線維化抑制活性を有さない物質で処理した対照群と比較して、前記対象の線維化が有意に抑制されていることを意味する。このため、本明細書において、前記対照群において、前記対照群の試験開始時と比較して線維化が抑制されていても、前記対照群と比較して、前記対象の線維化が有意に抑制されていれば、「線維化抑制」が生じているといえる。前記線維化抑制活性は、例えば、後述の実施例１に準じて測定できる。
　本明細書において、「移植片拒絶反応」または「免疫拒絶」は、細胞、組織、器官、または臓器の移植において、主要組織適合性抗原の違いに起因して宿主において惹起される移植片を排除する宿主反応を意味する。前記移植片拒絶反応は、同一種間の場合、「アロ反応」または「同種移植片拒絶反応」ということもできる。また、前記移植片拒絶反応は、異種間の場合、「異種移植片拒絶反応」ということもできる。前記「移植片拒絶反応」は、例えば、後述の実施例１に準じて測定できる。
　本明細書において、「移植片拒絶反応の抑制」または「免疫拒絶の抑制」は、移植片拒絶反応または免疫拒絶が有意に抑制されていることを意味する。前記抑制は、低減、低下、抑止、阻害、または防止ということもできる。前記「移植片拒絶反応の抑制」は、被検物質の処理群が、前記移植片拒絶反応を誘導する物質で処理した対照群と比較して、前記移植片拒絶反応が有意に抑制されていることを意味する。具体例として、前記細胞外小胞について、前記移植片拒絶反応を検討する場合、前記細胞外小胞の処理群が、前記細胞外小胞の由来細胞で処理した対照群と比較して、前記移植片拒絶反応が有意に抑制されている場合、前記細胞外小胞は、移植片拒絶反応が抑制されているといえる。前記「移植片拒絶反応」は、例えば、後述の実施例１に準じて測定できる。
　本明細書において、「抽出」は、特定の成分が、抽出前より濃縮された状態を意味する。このため、前記抽出は、濃縮または富化ということもできる。前記「抽出」は、例えば、少なくとも1つの濃縮工程を得ることにより実施できる。
　本明細書において、「単離」は、特定の成分が同定され、かつ分離された状態、および／または自然状態での成分から回収された状態を意味する。前記「単離」は、例えば、少なくとも１つの精製工程を得ることにより実施できる。
　本明細書において、「陽性（＋）」は、抗原抗体反応を利用して検出されるフローサイトメトリー等の解析方法により、前記抗原を発現しない陰性対照細胞または前記抗原と反応しない抗体を用いる陰性対照反応と比較して、高いシグナルが検出されることを意味する。
　本明細書において、「陰性（－）」は、前記抗原を発現しない陰性対照細胞または前記抗原と反応しない抗体を用いる陰性対照反応と比較して、同等またはそれ以下のシグナルが検出されることを意味する。
　本明細書において、「処置」は、治療的処置および／または予防的処置を意味する。本明細書において、「治療」は、疾患、病態、もしくは障害の治療、治癒、防止、抑止、寛解、改善、または、疾患、病態、もしくは障害の進行の停止、抑止、低減、もしくは遅延を意味する。本明細書において、「予防」は、疾患もしくは病態の発症の可能性の低下、または疾患もしくは病態の発症の遅延を意味する。前記「治療」は、例えば、対象疾患を発病する患者に対する治療でもよいし、対象疾患のモデル動物の治療でもよい。
　本明細書において、「有効用量」は、疾患患者に投与した際に、当該疾患の治療効果が得られるのに十分な量を意味する。
　本明細書において、「対象」は、動物または動物由来の細胞、組織もしくは器官を意味し、特にヒトを含む意味で用いられる。前記動物は、ヒトおよび非ヒト動物を意味する。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、イルカ、アシカ等の哺乳類動物があげられる。
　以下、本開示について例をあげて説明するが、本開示は以下の例等に限定されるものではなく、任意に変更して実施できる。また、本開示における各説明は、特に言及がない限り、互いに援用可能である。なお、本明細書において、「～」という表現を用いた場合、その前後の数値または物理値を含む意味で用いる。また、本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」という表現には、「Ａのみ」、「Ｂのみ」、「ＡおよびＢの双方」が含まれる。
＜組成物＞
　ある態様において、本開示は、移植片拒絶反応が低減され、かつ腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患に対する生理活性を有する細胞由来の細胞外小胞またはそれを含む組成物を提供する。本開示の組成物は、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の処置に用いる組成物であって、前記組成物が、生体試料由来の単核球から誘導された再生性細胞集団またはその培養物の細胞外小胞を含む。本開示の組成物は、前記移植片拒絶反応が抑制されており、かつ前記再生性細胞集団に由来するため、血管内皮細胞の増殖促進活性、血管新生促進活性等の腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患に対する生理活性を有する。このため、本開示の組成物は、例えば、後述のように、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の治療または予後の改善に好適に使用できる。
　前記再生性細胞集団は、前記生体試料由来の単核球から誘導された細胞集団である。前記再生性細胞集団は、例えば、前記単核球から誘導可能な再生機能を有する細胞を含む。前記再生機能を有する細胞は、例えば、血管内皮前駆細胞、抗炎症性マクロファージ等があげられ、この他に、Ｔｈ２細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）等を含んでもよい。前記血管内皮前駆細胞および前記抗炎症性マクロファージは、例えば、前記再生機能として、血管新生促進活性および抗炎症活性を有するため、潰瘍等の炎症部位において、血管を新生させるだけでなく、炎症をも抑えることができる点で極めて有用である。前記再生性細胞集団は、前記再生機能を有する細胞を１種類または複数種類含む。
　前記血管内皮前駆細胞（Endothelial Progenitor Cell：ＥＰＣ）は、血管内皮細胞への分化能を有する細胞である。前記血管内皮前駆細胞は、例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＫＤＲ（Kinase insert domain receptor、ＣＤ３０９）、ＣＤ１０５等の細胞表面マーカーを用いて特定できる。
　前記血管内皮前駆細胞は、分化の程度によってさらに分類されてもよい。この場合、前記血管内皮前駆細胞は、さらに分化型ＥＰＣコロニー細胞および未分化型ＥＰＣコロニー細胞に分類できる。前記分化型ＥＰＣコロニー細胞は、直径２０～５０μｍの細胞を主に含む（CFU-large cell like EC、以下、「大型ＥＰＣコロニー」ともいう）。前記未分化型ＥＰＣコロニー細胞は、直径２０μｍ以下の細胞を主に含む（CFU-small cell like EC、以下、「小型ＥＰＣコロニー」ともいう）。前記血管内皮前駆細胞から血管内皮細胞への分化において、早い段階で出現する小型ＥＰＣコロニーは、増殖能にすぐれた早期分化段階のＥＰＣコロニーといえ、また遅い段階で出現する大型ＥＰＣコロニーは、血管発生（新生）にすぐれた晩期分化段階のＥＰＣコロニーであるといえる（例えば、Masuda H. et al., Circulation Research, 109: 20-37 (2011)を参照）。前記分化型ＥＰＣコロニー細胞は、例えば、前記未分化型ＥＰＣコロニー細胞と比較して、血管新生または修復等の再生機能に優れているため、前記血管内皮前駆細胞は、分化型ＥＰＣコロニー形成細胞であることが好ましい。
　前記抗炎症性マクロファージは、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－１０、ＩＬ－４）等を分泌するマクロファージの一種であり、血管形成または修復に寄与する細胞である。前記抗炎症性マクロファージは、例えば、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＣＤ１６９等の細胞表面マーカーを用いて特定できる。前記抗炎症性マクロファージは、例えば、前記血管新生または修復等の再生機能に優れていることから、Ｍ２マクロファージが好ましい。
　前記再生性細胞集団の全細胞に占める前記再生機能を有する細胞の割合は、特に制限されず、例えば、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上である。前記細胞の割合は、例えば、前記再生機能を有する細胞表面マーカーを利用して、目的の細胞表面マーカー陽性細胞の割合を測定することにより、算出できる。前記測定は、例えば、フローサイトメトリー法を用いて実施できる。
　前記再生性細胞集団の全細胞に占める前記再生機能を有する細胞の割合は、例えば、前記生体試料由来の単核球における対応する再生機能を有する細胞の割合と比較して、通常、２倍、好ましくは、４倍以上に増加している。
　前記再生機能を有する細胞が前記血管内皮前駆細胞および抗炎症性マクロファージの場合、前記再生性細胞集団の全細胞に占める前記再生機能を有する細胞の割合は、例えば、ＣＤ３４陽性細胞の割合と、ＣＤ２０６陽性細胞の割合の合計割合として、算出できる。
　前記再生性細胞集団において、前記再生機能を有する細胞は、前記単核球から誘導される。このため、前記再生性細胞集団の誘導に用いる生体試料は、前記単核球を含む生体試料であればよい。前記単核球は、血液およびリンパ液に豊富に含まれている。したがって、前記生体試料は、血管および／またはリンパ管を含む、組織、器官、および／または臓器でもよいし、血液および／またはリンパ液でもよい。具体例として、前記生体試料は、例えば、骨髄；臍帯血、末梢血等の血液；リンパ液；等があげられる。
　前記生体試料は、本開示の組成物の投与、治療、または処置対象（以下、あわせて「投与対象」という）から採取された生体試料であってもよいし、投与対象以外の対象から採取された生体試料であってもよい。調製時に制限を受けないとの観点から、投与対象以外から採取された生体試料を用いることが望ましい。なお、前記再生性細胞集団は、後述する実施例において示されているとおり、投与対象以外から採取された生体試料由来の細胞（他家細胞）でもよいし、投与対象から採取された生体試料由来の細胞（自家細胞）であってもよい。本開示において、前記細胞外小胞は、前記移植片拒絶反応が抑制されているため、投与対象以外から採取された生体試料を用いても、好適に調製できる。また、前記細胞外小胞は、例えば、免疫拒絶等により排除されることなく治療効果を奏することが確認されている。このため、前記細胞外小胞は、例えば、オフザシェルフ（off the shelf）製剤として調製できる。
　前記生体試料の調製方法は、特に制限されず、例えば、前記生体試料の種類に応じて適宜設定できる。具体例として、前記生体試料が骨髄の場合、前記生体試料は、例えば、前記対象に対して骨髄穿刺を実施することにより取得できる。前記生体試料が末梢血の場合、前記生体試料は、例えば、静脈血を採血することにより取得できる。前記生体試料が臍帯血の場合、前記生体試料は、例えば、前記臍帯を単離後、前記臍帯中の血液を採取することにより実施できる。
　前記生体試料からの単核球の分離方法は、当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば、前記生体試料から調製した細胞懸濁液と、フィコール、パーコール等の単核球分離溶液とを用い、前記単核球と、他の成分とを分離することにより実施できる。
　前記生体試料由来の単核球から前記再生機能を有する細胞を誘導する方法は、例えば、前記再生機能を有する細胞の種類に応じて、公知の方法により実施できる。具体例として、前記単核球から血管内皮前駆細胞を誘導する場合、前記誘導方法は、例えば、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、および／またはＶＥＧＦの存在下、前記単核球を培養することにより実施できる。また、前記単核球から抗炎症性マクロファージを誘導する場合、前記誘導方法は、例えば、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、Ｍ－ＣＳＦおよび／またはＧ－ＣＳＦの存在下、前記単核球を培養することにより実施できる。
　前記誘導方法は、前記単核球から前記血管内皮前駆細胞および前記抗炎症性マクロファージの両者を誘導できる方法が好ましい。前記誘導方法は、例えば、国際公開第２０１４／０５１１５４号公報に記載の誘導方法を参照できる。
　前記再生性細胞集団は、例えば、前記血管新生促進活性および前記抗炎症活性を有する細胞外小胞を含む、前記再生機能を有する細胞を誘導できることから、前記単核球を、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、および／または血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等の因子の存在下、培養することが好ましい。前記培養は、前記因子を含む培地を用いて実施できる。
　前記培養に供する単核球は、前記生体試料由来の単核球について所望の細胞集団を選別して得られた所望の細胞集団を用いてもよいし、前記生体試料由来の単核球そのものを用いてもよい。前記培養に供する単核球としては、ＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞の選別を行わずに得られた単核球（無選別単核球）を用いることが好ましい。これにより、前記培養後に得られる前記再生性細胞集団は、例えば、ＣＤ３４陽性細胞として選別した単核球を用いた場合と比較して、前記分化型ＥＰＣコロニー形成細胞が増加（増幅）し、前記抗炎症性マクロファージが増加（増幅）し、さらに、抗炎症性のＴｈ２細胞および制御性Ｔ細胞が増加（増幅）した細胞集団ができる。このため、前記無選別単核球を用いることにより、例えば、前記再生性細胞集団として、前記再生機能を有する細胞の割合が富化した細胞集団を得ることができ、これにより、血管内皮細胞の増殖促進活性、血管新生促進活性、線維化の抑制活性、移植片拒絶反応の抑制活性、免疫抑制活性等の腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患に対する生理活性に優れた細胞外小胞を取得できる。
　前記ＳＣＦは、２４８個のアミノ酸からなる分子量約３０，０００の糖タンパク質である。前記ＳＣＦは、選択的スプライシングにより可溶型および膜結合型が生じる。前記培養に用いるＳＣＦは、ＥＰＣ等の再生性細胞集団の培養に有用である限りいずれのタイプのＳＣＦでもよい。好ましくは可溶型である。前記ＳＣＦの由来等は、特に制限されないが、安定した供給が見込まれることから、組換え体が好ましく、特に好ましくは、ヒト組換え体である。前記ヒト組換えＳＣＦは、商業的に入手可能である。前記培地中のＳＣＦの濃度は、前記ＳＣＦのタイプに応じて設定でき、ＥＰＣ等の再生性細胞集団の培養に有用である限り特に制限されない。具体例として、前記ＳＣＦがヒト組換えＳＣＦである場合、前記培地中のＳＣＦの濃度は、例えば、１０～１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５０～５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１００ｎｇ／ｍｌである。
　前記ＩＬ－６は、Ｂ細胞の抗体産生細胞への最終分化を誘導する因子として単離された分子量約２１，０００の糖タンパク質であり、免疫応答、造血系や神経系細胞の増殖分化、急性期反応等に関与することが知られている。前記ＩＬ－６の由来等は、特に制限されないが、安定した供給が見込まれることから、組換え体が好ましく、特に好ましくは、ヒト組換え体である。前記ヒト組換えＩＬ－６は、商業的に入手可能である。前記培地中のＩＬ－６の濃度は、用いるＩＬ－６のタイプによって異なるが、ＥＰＣ等の再生性細胞集団の培養に有用である限り、特に制限されない。具体例として、前記ＩＬ－６がヒト組換えＩＬ－６である場合、前記培地中のＩＬ－６の濃度は、例えば、１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約２０ｎｇ／ｍｌである。
　前記Ｆｌｔ３Ｌは、初期造血制御において重要な役目を担う受容体型チロシンキナーゼのリガンドとして知られている。前記Ｆｌｔ３Ｌは、いくつかの選択的スプライシングによる産物が知られているが、造血系幹細胞の増殖を刺激するという報告がある。前記Ｆｌｔ３Ｌは、ＥＰＣ等の再生性細胞集団の培養に有用である限り、いずれのタイプのＦｌｔ３Ｌであってもよい。前記Ｆｌｔ３Ｌの由来等は、特に制限されないが、安定した供給が見込まれることから、組換え体が好ましく、特に好ましくは、ヒト組換え体である。前記ヒト組換えＦｌｔ３Ｌは、商業的に入手可能である。前記培地中のＦｌｔ３Ｌの濃度は、用いるＦｌｔ３Ｌのタイプによって異なるが、ＥＰＣ等の再生性細胞集団の培養に有用である限り、特に制限されない。具体例として、前記Ｆｌｔ３Ｌがヒト組換えＦｌｔ３Ｌである場合、前記培地中のＦｌｔ３Ｌの濃度は、例えば、１０～１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５０～５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１００ｎｇ／ｍｌである。
　前記ＴＰＯは、造血系サイトカインの一種であり、造血幹細胞から巨核球が作られる過程に特異的に作用し、巨核球の産生を促進することが知られている。前記ＴＰＯの由来等は、特に制限されないが、安定した供給が見込まれることから、組換え体が好ましく、特に好ましくは、ヒト組換え体である。前記ヒト組換えＴＰＯは、商業的に入手可能である。前記培地中のＴＰＯの濃度は、用いるＴＰＯのタイプによって異なるが、ＥＰＣ等の再生性細胞集団の培養に有用である限り、特に制限されない。具体例として、前記ＴＰＯがヒト組換えＴＰＯである場合、前記培地中のＴＰＯの濃度は、例えば、１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約２０ｎｇ／ｍｌである。
　前記ＶＥＧＦは、ＥＰＣに特異的に作用する増殖因子であり、主に血管周囲の細胞で産生されることが知られている。前記ＶＥＧＦは、選択的スプライシングによってサイズの異なる数種類のタイプのＶＥＧＦタンパク質が産生される。前記ＶＥＧＦは、前記再生性細胞集団に含まれるＥＰＣのコロニー形成が可能であれば、いずれのタイプのＶＥＧＦでもよく、好ましくは、ＶＥＧＦ１６５である。前記ＶＥＧＦの由来等は、特に制限されないが、安定した供給が見込まれることから、組換え体が好ましく、特に好ましくは、ヒト組換え体である。前記ヒト組換えＶＥＧＦは、商業的に入手可能である。前記培地中のＶＥＧＦの濃度は、用いるＶＥＧＦのタイプによっても異なり、ＥＰＣ等の再生性細胞集団の培養に有用である限り、特に制限されない。前記ＶＥＧＦがヒト組換えＶＥＧＦ１６５である場合、前記培地中のＶＥＧＦの濃度は、例えば、約５～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約２０～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約５０ｎｇ／ｍｌである。
　前記培地に添加される各種因子は、前記単核球が由来する動物と同種または異種の動物に由来する因子を用いるが、同種の動物に由来する因子を用いることが好ましい。このように前記単核球および各種因子の由来を統一することにより、同種異系移植等の同種移植に好適な再生性細胞集団およびそれに由来する細胞外小胞が得られる。また、前記投与対象由来の単核球を用いることで、同種同系移植に好適な細胞外小胞を得ることも可能である。このように、異種動物由来の成分を一切含有しない環境でＥＰＣ等を含む再生性細胞集団の培養をすることにより、得られる再生性細胞集団およびそれに由来する細胞外小胞は、投与等に際して感染リスクおよび拒絶反応を低減できる。
　前記培養に用いる培地は、前記各種因子を基礎培地で所定の濃度に溶解することにより調製してもよいし、予め前記各種因子を含有する濃縮液（ストック溶液）を調製し、所望の培地で所定の濃度に希釈することによって調製してもよい。前記培養に用いる培地は、市販の基礎培地に必要な各種因子を所定の濃度となるよう溶解した後、濾過滅菌等により滅菌することにより調製してもよいし、濾過滅菌等により滅菌したストック溶液を無菌的に市販の基礎培地に添加および希釈することによって調製してもよい。前記濾過滅菌は、当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば、孔径０.２２μｍまたは０.４５μｍのミリポアフィルター等を用いて実施できる。
　前記基礎培地は、当分野で通常用いられている基礎培地を利用することができ、例えば造血幹細胞の増殖用培地として知られている基礎培地を用いることができる。前記基礎培地は、血清含有培地でもよいし、血清不含培地、すなわち、無血清培地でもよい。前記再生性細胞集団の培養では、前記培地および／または基礎培地として無血清培地を用いることにより、前記単核球から前記再生性細胞集団の培養（誘導）において、前記再生機能を有する細胞を効率よく誘導（増幅）できる。このため、前記培地は、無血清培地とすることが好ましい。前記培地または基礎培地は、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭ等があげられる。
　前記培地は、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、およびＶＥＧＦからなる群より選択された少なくとも１つ以上の因子、好ましくは、３以上の因子、より好ましくは、全ての因子を含有する。このため、前記培養に用いられる前記培地は、例えば、以下のいずれかを含む。
（１）ＳＣＦ、（２）ＩＬ－６、（３）ＦＬＴ３Ｌ、（４）ＴＰＯ、または（５）ＶＥＧＦ；
（６）ＳＣＦとＩＬ－６との組合せ、（７）ＳＣＦとＦＬＴ３Ｌとの組合せ、（８）ＳＣＦとＴＰＯとの組合せ、（９）ＳＣＦとＶＥＧＦとの組合せ、（１０）ＩＬ－６とＦＬＴ３Ｌとの組合せ、（１１）ＩＬ－６とＴＰＯとの組合せ、（１２）ＩＬ－６とＶＥＧＦとの組合せ、（１３）ＦＬＴ３ＬとＴＰＯとの組合せ、（１４）ＦＬＴ３ＬとＶＥＧＦとの組合せ、または（１５）ＴＰＯとＶＥＧＦとの組合せ；
（１６）ＳＣＦ、ＩＬ－６、およびＦＬＴ３Ｌの組合せ、（１７）ＳＣＦ、ＩＬ－６、およびＴＰＯの組合せ、（１８）ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、およびＴＰＯの組合せ、（１９）ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、およびＶＥＧＦの組合せ、（２０）ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、およびＴＰＯの組合せ、または（２１）ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、およびＶＥＧＦの組合せ；
（２２）ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、およびＴＰＯの組合せ、（２３）ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、およびＶＥＧＦの組合せ、または（２４）ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯおよびＶＥＧＦの組合せ；
（２５）ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯおよびＶＥＧＦの組合せ
　前記培地は、より好ましくは、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、およびＶＥＧＦを含む。前記培地は、さらに好ましくは、約５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６、１００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３Ｌ、および約２０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯを含む。
　前記各種因子を含有する培地を用いた、前記単核球の培養は、前記単核球を含有する細胞懸濁液を、前記各種因子を含有する培地に添加することにより実施できる。前記細胞懸濁液としては、前記単核球を含有する体液（例えば、骨髄液、臍帯血、末梢血）等を用いてもよい。前記単核球の培養条件は、特に制限されず、通常、当分野で実施される条件で実施することができる。具体例として、前記培養条件は、例えば、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で７日間以上（例えば、１０日間以上）培養される。前記単核球の培地中の濃度（播種密度）は、ＥＰＣ等の再生性細胞集団の培養を可能とする限り、特に制限されない。前記単核球の培地中の濃度（播種密度）は、例えば、約０．５～１０×１０５細胞／ｍｌ、より好ましくは、約１～５×１０５細胞／ｍｌ、さらに好ましくは、約３～４×１０５細胞／ｍｌである。
　前記再生性細胞集団の培養物は、前記単核球から前記再生性細胞集団の誘導において得られる培養物でもよいし、誘導された再生性細胞集団を培養することにより得られる培養物でもよい。
　前記再生性細胞集団の培地および培養条件は、特に制限されず、例えば、前記単核球の培地および培養条件の説明を援用できる。具体例として、前記再生性細胞集団の培地は、例えば、前記基礎培地に血清、好ましくは、ヒト由来血清を添加した培地を用いることができる。前記血清の由来は、前記再生性細胞集団の由来と同じでもよいし、異なってもよいが、同じことが好ましい。前記血清には、前記細胞外小胞が含まれている場合がある。このため、前記基礎培地に前記血清を添加する場合、前記血清中の細胞外小胞が除去された血清を用いることが好ましい。前記細胞外小胞が除去された血清は、商業的に入手可能である。前記血清の濃度は、例えば、１～２０（ｖ／ｖ）％、好ましくは、１～１０（ｖ／ｖ）％である。
　前記再生性細胞集団の培養は、前記再生性細胞集団を含有する細胞懸濁液を、前記再生性細胞集団の培地に添加することにより実施できる。前記再生性細胞集団の培養条件は、特に制限されず、通常、当分野で実施される条件で実施することができる。具体例として、前記培養条件は、例えば、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１～１０日間（例えば、１～２日間）培養される。前記再生性細胞集団の培地中の濃度（播種密度）は、前記再生性細胞集団の培養を可能とする限り、特に制限されない。前記再生性細胞集団の培地中の濃度（播種密度）は、例えば、約１×１０４～１×１０７細胞／ｍｌであり、より好ましくは、約１×１０５～１×１０６細胞／ｍｌであり、さらに好ましくは、約５×１０５細胞／ｍｌである。
前記細胞外小胞は、前述のように、由来する細胞から分泌される。このため、前記細胞外小胞は、前記再生性細胞集団またはその培養物から単離または抽出されてもよい。
　前記再生性細胞集団から抽出または単離する場合、前記細胞外小胞は、例えば、前記再生性細胞集団を破砕し、前記再生性細胞集団の細胞内の細胞外小胞を放出させた後、得られた懸濁液から可溶画分を分離後、前記可溶画分に対して、細胞外小胞の単離または抽出方法を実施することにより、単離または抽出できる。前記細胞外小胞の単離または抽出方法は、当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば、遠心分離を用いた方法、前記細胞外小胞の膜に存在する、再生性細胞集団由来の膜タンパク質、または前記膜タンパク質を用いたアフィニティー精製方法、フィルター等の多孔質膜を用いたろ過等により実施できる。前記フィルターとしては、例えば、市販のメンブレンフィルターが利用でき、具体例として、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルター（Millipore社製）を利用できる。前記細胞外小胞の膜タンパク質は、後述する。前記細胞外小胞の単離または抽出は、市販のキットを用いてもよく、具体例として、qEv isolation kit（Izon Sciences社製）を使用できる。
　前記遠心分離により前記細胞外小胞を単離または抽出する場合、前記遠心分離の条件は、前記細胞外小胞を沈殿可能な条件であればよく、具体例として、１００００～３０００００×ｇまたは９００００～１８００００×ｇで、２０～６０分間があげられる。前記遠心分離時の温度は、例えば、０～１０℃、好ましくは、０～４℃である。
　前記培養物は、例えば、前記再生性細胞集団およびその培地（条件培地または培養上清）から構成される。このため、前記培養物から単離する場合、前記細胞外小胞は、前記再生性細胞集団または前記条件培地から単離または抽出してもよいし、前記再生性細胞集団および前記条件培地の両者から分離してもよい。前記培養物から、前記再生性細胞集団と、前記条件培地とを分離する方法は、当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば、フィルターろ過、遠心分離等により実施できる。そして、前記再生性細胞集団を含む場合、前記細胞外小胞は、前述の前記再生性細胞集団から抽出または単離する場合と同様にして、単離または抽出できる。前記条件培地を用いる場合、前記細胞外小胞の単離または抽出方法は、例えば、遠心分離を用いた方法、前記細胞外小胞の膜に存在する再生性細胞集団由来の膜タンパク質、または前記膜タンパク質を用いたアフィニティー精製方法、フィルター等の多孔質膜を用いたろ過等により実施できる。前記細胞外小胞の単離または抽出は、市販のキットを用いてもよく、具体例として、qEv isolation kit（Izon Sciences社製）を使用できる。
　前記細胞外小胞は、前記再生性細胞集団に由来するため、前記細胞外小胞は、前記再生性細胞集団に由来する成分を含有する。前記細胞外小胞は、例えば、脂質二重膜と内腔とを有し、前記内腔は、前記脂質二重膜に囲われている。前記細胞外小胞において、前記脂質二重膜は、例えば、前記再生性細胞集団の膜、具体的には、前記再生性細胞集団の細胞の膜に由来する。前記膜は、例えば、細胞膜；ミトコンドリア、小胞体、エンドソーム、リソソーム、ゴルジ体等の細胞内小器官の膜；等があげられる。前記細胞外小胞において、前記内腔は、例えば、前記再生性細胞集団に由来する細胞質、具体的には、前記再生性細胞集団の細胞に由来する細胞質を有する。このため、前記細胞外小胞は、例えば、前記再生性細胞集団の細胞の細胞質に由来するｍｉＲＮＡ、ＤＮＡ、および／またはタンパク質を含む。
　前記細胞外小胞の脂質二重膜は、例えば、前記再生性細胞集団の細胞の膜成分を含む。このため、前記細胞外小胞は、例えば、前記再生性細胞集団に存在する膜成分を用いて規定できる。前記膜成分は、例えば、膜タンパク質等があげられる。前記膜タンパク質は、例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、Ａｌｉｘ（ALG-2-interacting protein X）、Ｈｓｐ－７０（Heat Shock Protein 70）等の細胞外小胞マーカー；前記細胞の細胞表面マーカー；等があげられる。前記細胞表面マーカーは、前記細胞の種類に応じて適宜決定できる。前記再生性細胞集団が前記ＥＰＣを含む場合、前記細胞表面マーカーは、例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＫＤＲ（Kinase insert domain receptor、ＣＤ３０９）、ＣＤ１０５等があげられる。前記再生性細胞集団が前記抗炎症性マクロファージを含む場合、前記細胞表面マーカーは、例えば、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＣＤ１６９等があげられる。前記細胞外小胞の脂質二重膜は、例えば、１種類または複数種類の膜成分を含む。前記膜成分は、例えば、対象の分子に対する抗体等を用いて、フローサイトメトリー法により測定できる。
　前記細胞外小胞の内腔は、例えば、前記再生性細胞集団の細胞の細胞質を含む。このため、前記細胞外小胞は、例えば、前記再生性細胞集団に存在する細胞質の成分を用いて規定できる。前記細胞質の成分は、例えば、ｍｉＲＮＡ等があげられる。前記ｍｉＲＮＡは、例えば、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３７３－３ｐ、ｍｉＲ－５０９－３ｐ、ｍｉＲ－６３３、およびｌｅｔ－７ｃ－５ｐ等があげられる。前記ｍｉＲＮＡの中で、特に、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、およびｍｉＲ－１４２－３ｐは、前記再生性細胞集団の細胞外小胞における特異的なｍｉＲＮＡと想定される。このため、前記細胞外小胞の内腔は、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、および／またはｍｉＲ－１４２－３ｐを含むことが好ましい。前記細胞外小胞の内腔は、例えば、１種類または複数種類の細胞質の成分を含む。前記細胞質の成分は、例えば、対象の分子に対する抗体等を用いて、フローサイトメトリー法により測定できる。また、前記細胞質の成分が核酸分子の場合、前記細胞質の成分は、例えば、シーケンサー等を用いて測定できる。前記ｍｉＲＮＡは、末梢血由来の再生性細胞集団の場合、例えば、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、および／またはｍｉＲ－１４２－３ｐを含むことが好ましい。また、前記ｍｉＲＮＡは、臍帯血由来の再生性細胞集団の場合、例えば、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３７３－３ｐ、ｍｉＲ－５０９－３ｐ、ｍｉＲ－６３３、および／またはｌｅｔ－７ｃ－５ｐを含むこと好ましい。
　前記ｍｉＲＮＡにおいて、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、およびｍｉＲ－５０９－３ｐ、は、一般的に、抗アポトーシス活性を有することが知られている。前記ｍｉＲＮＡにおいて、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、およびｍｉＲ－６３３は、一般的に、細胞増殖促進活性を有することが知られている。前記ｍｉＲＮＡにおいて、ｍｉＲ－１５０－５ｐは、一般的に、細胞遊走促進活性を有することが知られている。前記ｍｉＲＮＡにおいて、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、およびｍｉＲ－３７３－３ｐは、一般的に、抗線維化活性、特に、ＴＧＦ－βの発現抑制活性を有することが知られている。前記ｍｉＲＮＡにおいて、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－６３３、およびｌｅｔ－７ｃ－５ｐは、一般的に、血管新生促進活性を有することが知られている。前記ｍｉＲＮＡにおいて、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４４－５ｐ、およびｍｉＲ－１４８ａ－３ｐは、一般的に、抗炎症活性を有することが知られている。
　前記細胞外小胞において、前記内腔に含まれる成分は、前記再生性細胞集団の細胞質以外の成分に置き換えてもよい。この場合、前記内腔は、所望のカーゴ（Cargo）を搭載する。前記カーゴは、例えば、低分子化合物、抗体等のタンパク質またはペプチド、核酸等があげられる。
　前記細胞外小胞の平均径（加重平均）は、例えば、１～５００ｎｍ、好ましくは、１０～２５０ｎｍ、より好ましくは、３０～１５０ｎｍである。前記平均径は、後述の実施例１に準じて測定できる。また、前記細胞外小胞の平均径は、例えば、前記細胞外小胞を含む液体を、所望の孔径を有するフィルター等を用いてろ過することにより、調整できる。
　本開示の組成物は、さらに、薬学的に許容される担体を含んでもよい。前記担体は、前記細胞外小胞を投与するための懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、媒体、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等があげられ、本開示の効果を妨げない範囲で適切に添加することができる。
　本開示の組成物は、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで用いてもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで用いてもよい。本開示の組成物は、例えば、研究用試薬として使用することもでき、医薬品として使用することもできる。
　本開示の組成物の投与対象は、特に制限されない。本開示の組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、ヒト、またはヒトを除く非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物としては、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、イルカ、アシカ等の哺乳類；鳥類；魚類；等があげられる。前記本開示の組成物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、細胞、組織、器官、または臓器等があげられ、前記細胞は、例えば、生体から採取した細胞、培養細胞等があげられ、前記組織、器官、または臓器は、例えば、生体から採取した組織（生体組織）または器官等があげられる。前記細胞は、例えば、筋細胞、iPS細胞（induced pluripotent stem cells）、幹細胞等があげられる。
　本開示の組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、腎疾患と診断された対象または疑いがある対象等があげられる。前記腎疾患は、例えば、急性腎障害、移行期慢性腎臓病 、慢性腎臓病、または腎移植後の免疫抑制等があげられる。
　本開示の組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、末梢動脈疾患と診断された対象または疑いがある対象等があげられる。
　本開示の組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、脳梗塞と診断された対象または疑いがある対象等があげられる。
　本開示の組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、肺高血圧症と診断された対象または疑いがある対象等があげられる。
　本開示の組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、脊髄虚血症と診断された対象または疑いがある対象等があげられる。
　本開示の組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、非閉塞性腸管虚血症と診断された対象または疑いがある対象等があげられる。
　本開示の組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、眼虚血症候群と診断された対象または疑いがある対象等があげられる。
　本開示の組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、線維症群と診断された対象または疑いがある対象等があげられる。前記線維症は、例えば、肺線維症、心筋線維症、骨髄線維症等があげられる。前記炎症性疾患は、例えば、自己免疫性疾患、炎症性腸疾患、炎症性筋疾患等があげられる。
　本開示の組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、炎症性疾患と診断された対象または疑いがある対象等があげられる。前記炎症性疾患は、例えば、自己免疫性疾患、炎症性腸疾患、炎症性筋疾患等があげられる。前記自己免疫性疾患は、例えば、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、多発性筋炎、シェーグレン症候群、全身性強皮症、糸球体腎炎、血管炎等があげられる。前記炎症性腸疾患は、例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病等があげられる。前記炎症性筋疾患は、例えば、皮膚筋炎、多発筋炎、壊死性自己免疫性筋炎、（特発性）封入体筋炎等があげられる。
　本開示の組成物の使用条件（投与条件）は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類等に応じて、投与形態、投与時期、投与量等を適宜設定できる。
　本開示の組成物の投与方法は、例えば、経口投与、または静脈内投与等の非経口投与が例示されるが、例えば、投与者の技術によらず、安全におよび安定的に投与できることから、静脈内投与が好ましい。
　本開示の組成物の投与量は、有効用量であり、具体例として、対象に投与した場合に、投与していない対象と比較して腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患に対して前記疾患の治療効果（治療効果）を得ることができる量である。具体的には、前記投与量は、例えば、被験者の年齢、体重、症状等によって適宜決定することができる。具体例として、前記投与量は、例えば、細胞外小胞の個数として、１回の投与当たり１０４～１０９個／ｋｇ体重、１０４～１０８個／ｋｇ体重、１０４～１０７個／ｋｇ体重があげられ、好ましくは、１０４～１０８個／ｋｇ体重、１０４～１０７個／ｋｇ体重である。
　本開示の組成物の投与回数は、１または複数回である。前記複数回は、例えば、２回、３回、４回、５回またはそれ以上である。前記投与回数は、対象の治療効果を確認しながら、適宜決定されてもよい。前記複数回投与する場合、投与間隔は、対象の治療効果を確認しながら、適宜決定でき、例えば、１日１回、１週１回、２週１回、１ヶ月１回、３ヶ月１回、６か月１回等があげられる。
　本開示の組成物は、前述のように、前記移植片拒絶反応が抑制されており、かつ前記再生性細胞集団に由来するため、血管新生促進活性等の腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患に対する生理活性を有する。このため、本開示の組成物は、例えば、後述のように、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の治療または予後の改善に好適に使用できる。
＜細胞外小胞または組成物の用途＞
　別の態様において、本開示は、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の処置に用いるための組成物またはそれを用いた方法を提供する。この場合、本開示は、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の処置に用いるための組成物であって、前記組成物は、前記本開示の組成物である。また、本開示は、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患患者の処置方法であって、前記疾患患者に、前記本開示の組成物を投与する。
　前記疾患は、例えば、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患等があげられる。前記腎疾患は、例えば、急性腎障害、移行期慢性腎臓病 、慢性腎臓病、または腎移植後の免疫抑制等があげられる。前記線維症は、例えば、肺線維症、心筋線維症、骨髄線維症等があげられる。前記炎症性疾患は、例えば、自己免疫性疾患、炎症性腸疾患、炎症性筋疾患等があげられる。前記自己免疫性疾患は、例えば、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、多発性筋炎、シェーグレン症候群、全身性強皮症、糸球体腎炎、血管炎等があげられる。前記炎症性腸疾患は、例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病等があげられる。前記炎症性筋疾患は、例えば、皮膚筋炎、多発筋炎、壊死性自己免疫性筋炎、（特発性）封入体筋炎等があげられる。
　別の態様において、本開示は、血管内皮細胞の増殖促進に用いるための組成物またはそれを用いた方法を提供する。この場合、本開示は、血管内皮細胞の増殖促進に用いるための組成物であって、前記組成物は、前記本開示の組成物である。また、本開示は、血管内皮細胞の増殖促進方法であって、前記血管内皮細胞と、組成物とを接触させることにより、前記血管内皮細胞の増殖を促進する工程を含み、前記組成物は、本開示の組成物を含む。
　別の態様において、本開示は、血管新生の誘導に用いるための組成物またはそれを用いた方法を提供する。この場合、本開示は、血管新生の誘導に用いるための組成物であって、前記組成物は、前記本開示の組成物である。また、本開示は、血管新生の誘導方法であって、本開示の組成物を使用する。
　本開示の血管新生の誘導方法は、例えば、血管新生を誘導する対象に、前記細胞外小胞または組成物を投与する。前記血管新生を誘導する対象は、例えば、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）等の患者があげられる。この場合、前記血管新生の誘導は、前記患者の腎臓、脳、肺、骨髄、腸、眼、虚血筋、または虚血再灌流傷害が生じている部位（例えば、中枢または末梢血管）における血管新生の誘導ということもできる。
　別の態様において、本開示は、線維化の抑制に用いるための組成物またはそれを用いた方法を提供する。この場合、本開示は、線維化の抑制に用いるための組成物であって、前記組成物は、前記本開示の組成物である。また、本開示は、線維化の抑制方法であって、本開示の組成物を使用する。
　本開示の線維化の抑制方法は、例えば、線維化を抑制する対象に、前記細胞外小胞または組成物を投与する。前記線維化を抑制する対象は、例えば、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）等の患者があげられる。この場合、前記血管新生の誘導は、前記患者の腎臓、脳、肺、骨髄、腸、眼、虚血筋、または虚血再灌流傷害が生じている部位（例えば、中枢または末梢血管）における線維化の抑制ということもできる。
＜細胞外小胞または組成物の使用＞
　本開示は、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の治療に用いるための、組成物である。また、本開示は、血管内皮細胞の増殖促進に用いるための、組成物である。本開示は、血管新生の促進に用いるための、組成物である。本開示は、線維化抑制に用いるための、組成物である。
　以下、実施例を用いて本開示を詳細に説明するが、本開示は実施例に記載された態様に限定されるものではない。なお、特に示さない限り、市販の試薬およびキット等は、そのプロトコルに従い使用した。
［実施例１］
　本開示の組成物が、血管内皮細胞増殖活性を有すること、移植片拒絶反応が低減されていること、腎機能を回復すること、線維化抑制活性を有すること、および血管新生促進活性を有することを確認した。また、腎臓虚血再灌流障害（ＩＲＩ）を対象に、ＲＡＣ由来の細胞外小胞（ＲＡＣｅｖ）の治療効果を、溶媒投与群と比較して評価した。
（１）細胞培養
　ヒト末梢血単核細胞（PBMC）は、倫理委員会（CS-00201623）に従い、書面でのインフォームドコンセントを得た後、健康なヒトボランティアから単離した。末梢血（３０ｍＬ）は、バキュテナー（ＢＤ社製）を用いて採血した。
　末梢血からの末梢血単核球（PBMNC）の単離は、Asahara et al., Science, 275: 964-7 (1997)およびAmankeldi et.al., PLoSONE, (2019), 14(3):e0205477に記載の方法にしたがって、Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, #10771)を用いた密度勾配遠心法により行った。単離されたPBMNCをリン酸緩衝液（PBS）－エチレンジアミン四酢酸（EDTA）で洗浄後、後述の無血清培地（QQ培地）中に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。単離されたPBMNCにおいてCD34陽性率は0.23±0.03%、CD133陽性率は0.20±0.07%であった。また、末梢血100mlあたりのCD34陽性細胞数は(27.8±4.5)x104、CD133陽性細胞数は(23.2±6.9)x104であった。
　再生性細胞集団の培養（誘導）に用いる無血清培地（以下、「QQ培地」または「QQcm」ともいう)は、stemline（商標） II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium（Sigma-Aldrich, Cat No. S0192）に、下記の各因子を所定の濃度となるように無血清培地に無菌的に添加した。
（ＱＱ培地中の各因子の濃度）
ｒｈＳＣＦ（Peprotech, Inc.社製、Cat. No. #300-07）：１００ｎｇ／ｍｌ
ｒｈＦｌｔ３Ｌ（Peprotech, Inc.社製、Cat. No. #300-19）：１００ｎｇ／ｍｌ
ｒｈＴＰＯ（Peprotech, Inc.社製、Cat. No. #300-18）：２０ｎｇ／ｍｌ
ｒｈＶＥＧＦ（Peprotech, Inc.社製、Cat. No. #100-02）：５０ｎｇ／ｍｌ
ｒｈＩＬ－６（Peprotech, Inc.社製、Cat. No. #200-06）：２０ｎｇ／ｍｌ
ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco社製）、Cat. No. 15140122：１００Ｕ／１００μｇ／ｍｌ）
ｒ：組換え体
ｈ：ヒト由来
　前記PBMNCについて、１０ｃｍディッシュ（住友ベークライト社製）に、１０×１０７細胞／１０ｍｌ／ディッシュとなるように、播種後、３７℃、５％ＣＯ２、湿潤環境の条件で、７日間培養した。これにより、再生性細胞集団（RAC）を調製した。なお、以下、特に言及しない場合、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２、湿潤環境の条件で実施した。
（２）細胞外小胞の調製
　前記培養後、前記RACを回収後、遠心した。得られたペレットを細胞外小胞産生培地に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。前記細胞外小胞産生培地の組成は、エクソソーム除去済のウシ胎仔血清を５（ｖ／ｖ）％添加した、X-vivo 15培地（Lonza社製、Cat. No.BE02-054Q）とした。得られた細胞懸濁液を、１０ｃｍディッシュに、２．５×１０５細胞／ｍｌ／ディッシュ（２５０ｋ）、または５×１０５細胞／ｍｌ／ディッシュ（５００ｋ）となるように播種後、４８時間培養した。
　前記培養後、培養上清（条件培地）を回収後、前記培養上清を３００×ｇ、４℃の条件で１０分間遠心することにより、細胞を除去した。つぎに、得られた上清画分を、２０００×ｇ、１２℃の条件で２０分間遠心後、上清画分を回収することにより、アポトーシス小体およびマイクロベシクルを除去した。前記上清画分を０．２μｍのフィルター（Millipore Merck社製、Cat. No.SLGS033SS)でろ過することにより、粒子径が２００ｎｍを超える細胞外小胞を除去した。そして、得られたろ液について、１７４０００×ｇ、４℃の条件で、１１０分間遠心することにより、細胞外小胞（エクソソーム）を沈殿させ、回収した。回収した沈殿は、後述の各実験において使用する培地または緩衝液（最大３×５０μｌ）で懸濁した。その後、製造元のマニュアルに従い、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ５００（マルバーン・パナリティカル）を用いたナノ粒子追跡分析により、ＥＶｓの数とサイズを測定した。
　なお、細胞外小胞を標識化する場合、前記０．２μｍのフィルターろ過後、ろ液に対して、２μｍｏｌ／ｌとなるようにCM-Dil dye（C7000、Thermo Fisher社製）を添加して、標識した。そして、得られた反応液について、１７４０００×ｇ、４℃の条件で、１１０分間遠心後、細胞外小胞をＰＢＳで洗浄し、同条件での遠心を実施した。同様の洗浄および遠視を再度実施した。そして、回収した沈殿は、後述の各実験において使用する培地または緩衝液（最大３×５０μｌ）で懸濁した。
　標識された細胞外小胞、および対照液（生理食塩水）を、２４Ｇ血管カテーテルを用いて、Ｒ－ＩＲＩ発症の１日後に尾静脈から注入した。細胞外小胞注入の３時間後、対象動物を安楽死させ、腎臓、脾臓、肺、心臓などの臓器を摘出し、さらなる細胞外小胞の追跡解析を行った。IVIS Lumina III (Perkin Elmer社製) を用いて、損傷部位における細胞外小胞の絞扼を解析した。ＤｉＩ色素の励起波長フィルターを５２０ｎｍに、発光波長フィルターは５７０ｎｍに設定した。
（３）実験に用いた動物
　すべての動物実験は、湘南ヘルスイノベーションパーク（承認番号AU-00030960）のAAALAC International規格に準拠して実施された。体重１５０～２５０ｇの雄のLewisラット（６～１０週齢）は、オリエンタル酵母工業（株）を通して、Charles River Laboratories社から購入した。なお、実験に使用した動物は標準的な条件（２０±２℃、相対湿度５０～６０％、１２時間／１２時間明暗サイクル）で維持した。また、実験に使用した動物は、水と餌を自由に摂取することができるようにした。
（４）細胞外小胞の特性評価
　前記「（２）細胞外小胞の調製」で調製した細胞外小胞について、その平均径、細胞あたりの産生量、およびマーカーの発現と、脂質膜および内腔の構造とを検討した。具体的には、平均径、細胞あたりの産生量、およびマーカーの発現は、フローサイトメトリー法により測定した。フローサイトメーターは、３レーザ（405nm、488nm、および638nm）を搭載するDxFlex Flow Cytometry(Beckman Coulter社製)について、以下の構成の変更を行なった上で使用した。405/10 VSSCフィルターは、WDM中のV450チャンネルに移動した。そして、ソフトウェア（CytExpert software）における検出器の構成を更新し、WDM内のVSSCチャネルに割り当てを行なった。また、各データの取得前に、前記フローサイトメーターの流路は、洗浄液（FlowClean）で洗浄後、１０μｍフィルターでろ過した水を通過させた。
　また、サイズの異なるラテックスビーズ（１００ｎｍまたは２００ｎｍ）を用いて、前記フローサイトメーター（DxFlex FACS machine、Beckman Coulter社製)を校正後、細胞外小胞について測定を実施した。さらに、得られた側方散乱光（ＳＳＣ）の強度について、前記ラテックスビーズの強度と、各細胞外小胞の強度とを比較することにより、各細胞外小胞の粒子径を算出した。そして、得られた粒子径に基づき、平均径（加重平均）を算出した。また、前記フローサイトメーターに代えて、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）装置（ZetaView（登録商標）、DKSH社製）を用いた以外は同様にして、各細胞外小胞の粒子径を算出し、平均径（加重平均）を算出した。そして、前記フローサイトメーターにより得られる平均径と、ＮＴＡ装置で得られる平均径とがほぼ同じ値となることを確認した。
　前記マーカーの発現は、前記細胞外小胞について、抗CD9抗体（PE標識、Biolegend社製、Cat. No. #312106）、抗CD63抗体（PE標識、Biolegend社製、Cat. No. #353004) 、とを用いて染色後、前記フローサイトメーターを用いて測定した。コントロールは、各種抗体に代えて、コントロール抗体を用いた以外は同様にして実施した。
　前記細胞あたりの産生量は、前記フローサイトメーターにおけるカウントおよび測定したサンプル液量に基づき、２．５×１０５細胞あたりの細胞外小胞の産生量（細胞外小胞の数）を算出した。
　前記脂質膜および内腔の構造は、走査型電子顕微鏡（JEM-1400、日本電子株式会社製）を用いて観察した。
　参考例は、前記ＲＡＣに代えて、ヒト由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ、Lonza社製、Cat. No.BE02-054Q）を用いた以外は同様にして実施した。これらの結果を、図１～図４に示す。なお、グラフ中の統計処理は、マン－ホイットニー検定を用いて実施した。
（５）血管内皮細胞の増殖促進
　RACevの血管内皮細胞の増殖促進活性は、ヒト胎児由来血管内皮細胞（HUVEC、Lonza社製、Cat. No.C2517A, Batch #. 18TL061650）を用いて検討した。具体的には、３～４回継代培養されたHUVECを回収後、Cytopainter dye（abcam社製、Cat. No. #ab176735）を添加して、３７℃、１０～３０分間インキュベートすることにより、HUVEC細胞を標識した。前記標識後、遠心および洗浄を２回繰り返した。得られたHUVEC細胞について、３．５ｃｍディッシュに５×１０４細胞／２ｍｌ／ディッシュとなるように播種した。前記HUVEC細胞の継代用培地は、EGM-2（Lonza社製）を用い、HUVEC細胞の増殖活性の測定用培地は、EBM-2（Lonza社製）を用いた。ついで、２５０ｋもしくは５００ｋのRACまたはMSCから単離した細胞外小胞（RACevまたはMSCev）を各ディッシュに添加した。そして、前記培養条件で、２日間培養した。前記培養後、各ディッシュについて、位相差顕微鏡（6-well dish、Falcon社製）を用いて観察した。得られた位相差像において、一視野あたり（ＨＰＦ）の細胞数をカウントし、さらに、全領域に対してHUVEC細胞が占める領域の割合を、成長領域として算出した。
　また、前記培養後、ディッシュからHUVEC細胞を回収し、フローサイトメーター（FACS Verse、BD Biosciences社製）を用いて、HUVEC細胞の分裂を、前記標識を指標に測定した。また、コントロールは、RACevおよびMSCevを添加しなかった以外は同様にして実施した。
（６）ライブラリー調製、シーケンシング、バイオインフォマティクス分析
　さらに、HUVEC細胞の培養時に添加したRACevおよびMSCevについて、miRNAの分析を行なった。具体的には、前記RACevおよびMSCevについて、miRNA精製キット（miRNeasy mini kitおよびRNeasy MinElute Cleanup Kit、QIAGEN社製）を用いて、miRNAを精製した。得られたmiRNAとライブラリ構築キット（QIAseq（商標））とを用い、シークエンス用ライブラリを調製した。前記ライブラリの品質検査は、Agilent BioanalyzeおよびDNAチップ（High Sensitivity DNA chip、Agilent Technologies社製）を用いて実施した。前記ライブラリのシーケンスは、次世代シーケンサー（NextSeq 500、Illumina社製）を用い、７６ｂｐのシングルエンドリードとして解読した。そして、得られたシーケンスデータから、各ｍｉＲＮＡ（miR-181b-3p、miR-150-5p、miR-302a-5p、miR-92a-2-5p）の発現量を算出した。細胞外小胞を添加していないHUVEC細胞における各ｍｉＲＮＡの発現量を基準として、相対的な発現量を算出した。
　コントロールは、細胞外小胞を添加しなかった以外は同様にして実施した。なお、グラフ中の統計処理としては、Two-way ANOVA検定後に、テューキーの多重比較検定を実施した。
（７）腎臓虚血再灌流障害の誘発
　ラットは、３－４％セボフルラン（丸石製薬社製）で麻酔した。腹部正中切開により、２つの腎茎を結集させ、次に微小動脈瘤クランプ（F.S.T.社製）を用いて、４５分間固定した。虚血期間中は、ラットを３７℃の温熱パッドの上に置くことで、体温を維持した。クランプ除去後、腎臓の血流が回復しているかを１分間検査し、腎臓が元の色に戻ったことを確認してから、腹部を閉じた。偽手術をされたラットは、微小動脈瘤クランプを適用しないことを除いて、同一の外科的処置を受けた。
（８）移植片拒絶反応の確認
　腎臓虚血再灌流障害（Ｋ－ＩＲＩ）発症の１日後に、２４Ｇ血管カテーテル（テルモ社製）を用いて、治療群にはRACev（１×１０６　再生関連細胞由来の細胞外小胞）を移植し、対照群にはＰＢＳを移植した。前記移植は、前述と同様に尾静脈から行った。各実験終了後、セボフルラン５％を過量投与することにより動物を安楽死させ、安楽死したことを確認した後、腎臓、肺、脾臓、肝臓などの重要臓器を摘出した。
　具体的には、５００ｋのRACまたはMSCから単離した細胞外小胞（RACevまたはMSCev）をＰＢＳで希釈し、得られた希釈液を、前記虚血再灌流傷害の誘導後の所定時間（３０分後、１日後および２日後）に尾静脈から投与した。そして、前記虚血再灌流傷害の誘導前（ベースライン）に初回の体重測定を実施し、その後、前記傷害の誘導後４週間まで週１回体重を測定した。また、前記誘導後４日および４週間において、腎臓を回収し、その重量を測定した。さらに、前記誘導後４週間において、末梢血および腎臓を回収した。そして、前記末梢血について、ＣＤ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、制御性Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の割合を、フローサイトメーターを用いて測定した。コントロールは、RACevおよびMSCevを投与しなかった以外は同様にして実施した。また、投与したRACevおよびMSCevについて、各ｍｉＲＮＡ（miR-142-3p）の相対的な発現量を算出した。なお、グラフ中の統計処理としては、Dunn's多重比較検定を実施した。
（９）免疫組織化学的解析
　全身灌流は、ヘパリン化ＰＢＳ（1000 U/500 mL）溶液で行い、腎臓は４％パラホルムアルデヒド（Cat #163-20145、富士フイルム社製）で一晩固定し、パラフィンに包埋して、2.５～３ｍｍ厚の切片に切り出した。切片をＰＡＳ（Periodic acid-Schiff）染色およびマッソントリクローム染色して、線維化の大きさを決定した。微小血管の密度を分析するために、切片を抗ＣＤ３１（１：１００）抗体とDABで培養した。すべての組織写真は、オールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ８００（キーエンス社製）を使用して、顕微鏡倍率２００倍で撮影した。組織学的データは、Keyence Analyzer（キーエンス社製）を用いて、１切片あたり３～５か所の高倍率視野で評価した。
　NextSeqで生成したオリジナルのFASTQファイルをQiagen GeneGlobe Data Analysis Center (https://geneglobe.qiagen.com) にアップロードし、miRBase v21 (http://www.mirbase.org) にアライメントを行った。特定のｍｉＲに割り当てられたすべてのリードを数え、関連するＵＭＩを集計し、特有の分子を数えた。ｍｉＲ　ＵＭＩカウントの基盤は、StrandNGS 3.4、ソフトウェア(Agilent Technologies社製)を用いて、ダウンストリーム解析にかけられた。ＵＭＩカウントは、trimmed mean M-value（ＴＭＭ）法を用いて、定量化された。発現量の異なるｍｉＲの標的遺伝子を決定するために、PITA miRBase version 18、microRNA.org miRBase version 18、TargetScan version 6.0の情報をすべて統合した。
　次に、標的遺伝子の生物学的機能を決定するために、遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析およびパスウェイ統計解析を行った。パスウェイ統計解析は、パスウェイに含まれる遺伝子数と標的遺伝子数を考慮したパスウェイを決定するために、Wiki Pathwaysデータベースのパスウェイコレクションを対象に、PathVisioツール、PathVisioツールを用いて行った。
　Ｒ－ＩＲＩ発症後４－６日目に腎臓組織を採取し、核酸抽出システムを用いて、製造元の指示に従って全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡの完全性スコアは、Agilent Bioanalyzer（アジレント・テクノロジー社、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンタクララ）で確認した。
（１０）統計解析
　すべての数値は、平均値±ＳＥＭで示した。マン・ホットニーのＵ検定は、２つおよび３つのノンパラメトリック群に使用され、その後、Ｄｕｎｎの多重比較検定が行われた。また、一元配置分散分析は、３つのパラメトリック群に適用され、Ｄｕｎｎの多重比較検定、またはＴｕｋｅｙの多重比較検定に従った。異なる時点におけるグループ間の多重比較には、二元配置分散分析を適用し、Ｔｕｋｅｙの事後検定を行った。差次的発現するｍｉＲは、fold change≧２の絶対値の閾値を使用して決定された。すべての統計解析は、GraphPad Prism 9.1 (GraphPad Prism Software社製)を用いて実施した。統計的有意性は、Ｐ＜０．０５とした。
［結果］
（１）細胞外小胞の特性評価
　図１は、細胞外小胞の粒子径、細胞あたりの産生量および平均径を示すグラフである。図１において、Ａは、粒子径の結果、Ｂは、産生量の結果、Ｃは、平均径の結果を示す。図１Ａにおいて、横軸は、粒子径（対数）を示し、縦軸は、相対的な数を示す。図１Ｂにおいて、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、細胞外小胞の産生数を示す。図１Ｃにおいて、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、平均径を示す。図１ＡおよびＣに示すように、RAC由来の細胞外小胞（RACev）は、MSC由来の細胞外小胞（MSCev）と比較して若干大きく、RACevの平均径は、１４５ｎｍであるのに対して、MSCevは、１３０ｎｍであった。また、図１Ｂに示すように、ＲＡＣは、ＭＳＣと比較して、細胞あたりの細胞外小胞の産生量が有意に多かった。
　図２は、マーカーの発現プロファイル、細胞外小胞の脂質二重層構造を示す電子顕微鏡画像、および細胞外小胞の分泌量並びに細胞外小胞タンパク質量を示すグラフである。図２Ａは、ＲＡＣｅｖにおける抗ＣＤ９および抗ＣＤ６３のＥＶバイオマーカー発現プロファイルの結果、図２Ｂは、細胞外小胞の脂質二重層構造を示す透過型電子顕微鏡の写真、図２Ｃは、１００万個のＲＡＣあたりの細胞外小胞の分泌量を定量化した結果、図２Ｄは、１００万個のＲＡＣ由来のＲＡＣｅｖ中のすべてのタンパク質の数を示す。図２Ａにおいて、横軸は、フローサイトメトリーによる抗ＣＤ６３又は抗ＣＤ９陽性ＲＡＣｅｖの発現量を示し、縦軸は、ＩｇＧコントロール及び染色したＲＡＣｅｖのサイズを示す。図２Ｃにおいて、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、細胞外小胞の分泌量を示す。図２Ｄにおいて、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、ＲＡＣｓ由来のＲＡＣｅｖ中のすべてのタンパク質の数を示す、図２Ａに示すように、細胞外小胞特異的マーカー（ＣＤ９、ＣＤ６３）の存在が確認された。また、図２Ｂに示すように、脂質二重層構造が確認された。さらに、図２ＣおよびＤに示すように、１００万個のＲＡＣから得られた細胞外小胞（ＲＡＣｅｖ）の平均数およびＲＡＣｅｖ中のすべてのタンパク質の数は、それぞれ２．８９×１０９±４．７×１０８および１２８±２１．５であった。また、ＲＡＣｅｖのサイズは、１５４．５±６．７ｎｍであった。
　つぎに、図３は、マーカーの発現を示すヒストグラムである。図３Ａは、RACevの結果、図３Ｂは、MSCevの結果を示す。図３Ａおよび図３Ｂにおいて、横軸は、ＳＳＣの強度または各マーカーの蛍光強度を示し、縦軸は、カウントを示す。図３Ａの左図に示すように、粒子径が既知のラテックスビーズを用いることにより、フローサイトメーターにより、細胞外小胞の粒子径を測定できることがわかった。また、図３Ａの中央図および右図に示すように、RACevでは、ＣＤ６３およびＣＤ９の発現が確認された。また、図３ＡおよびＢに示すように、RACevは、MSCevと比較して、ＣＤ６３の発現量が高かった。
　これらの結果から、RACevは、MISEV2018（Thery C et.al., 2018, J.Extracell Vesicles 7:1535750）に合致するため、細胞外小胞であることがわかった。
（２）血管内皮細胞の増殖促進活性
　図４は、HUVEC細胞の増殖を示すグラフである。図４において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、一視野（ＨＰＦ）あたりの細胞数を示す。図４に示すように、RACevおよびMSCevは、コントロールと比較して、血管内皮細胞の増殖を促進した。また、図４に示すように、RACevは、MSCevと比較して、有意に血管内皮細胞の増殖を促進した（MSCev-250K vs. RACev-250K：P >0.001、MSCev-500K vs. RACev-500K： P>0.0001）。
　つぎに、図５は、HUVEC細胞の成長領域を示す写真およびグラフである。図５Ａは、位相差像を示し、図５Ｂは、成長領域のグラフを示す。図５Ｂにおいて、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、成長領域を示す。図５Ａおよび図５Ｂに示すように、RACevおよびMSCevは、コントロールと比較して、血管内皮細胞の成長領域が増加していた。また、図５Ａおよび図５Ｂに示すように、RACevは、MSCevと比較して、有意に血管内皮細胞の成長領域が増加した（MSCev-500K vs. RACev-500K：P >0.0007）。なお、図示していないが、標識化したRACevを用いて経時的にHUVEC細胞の増殖を観察したところ、HUVEC細胞がRACevを取り込むと、HUVEC細胞がＳ期に進むことが観察された。また、RACevによる血管内細胞の増殖促進活性は、第８世代まで維持されること、すなわち、８回の分裂の間維持されることが確認された。
　つぎに、図６は、ｍｉＲＮＡの発現量を示すグラフである。図６において、横軸は、ｍｉＲＮＡの種類を示し、縦軸は、相対的発現量を示す。図６に示すように、RACevは、MSCevと比較して、有意に、抗アポトーシス活性を有するｍｉＲＮＡ（miR-92a-2-5p）、細胞分裂促進活性を有するｍｉＲＮＡ（miR-181b-3p、miR-150-5p、miR-302a-5p）、および細胞遊走促進活性を有するｍｉＲＮＡ（miR-150-5p）の発現量が高かった。これらの結果から、RACevは、抗アポトーシス活性を有するｍｉＲＮＡおよび細胞分裂促進活性を有するｍｉＲＮＡを運搬することにより、血管内皮細胞の増殖促進活性を示すことが分かった。
（３）移植片拒絶反応の抑制
　図７は、４週間後の対象動物の体重および臓器重量（腎臓重量）における変化を示したグラフである。図７Ａは、４週間後の対象動物の体重の変化を示したグラフ、図７Ｂは、４週間後の対象動物の腎臓重量を比較したグラフを示す。図７Ａにおいて、横軸は、経過時間を示し、縦軸は、体重（ｇ）を示す。図７Ｂにおいて、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、腎臓の重量（μｇ）を示す。図７Ａにおいて、４週間後の体重増加は、ＲＡＣｅｖ処理群が対照群より有意に増加したことが示された。図７Ｂにおいて、４週間後の腎臓重量は、Ｓｈａｍ群と比較し、対照群およびＲＡＣｅｖ処理群が増大し、これらはほぼ同等であることが示された。図７Ａ～図７Ｂに示すように、ＲＡＣｅｖの移植による移植片拒絶反応は観察されなかった。なお、統計的有意性は、体重についてはＴｕｋｅｙの多重比較検定による二元配置分散分析により、腎臓重量についてはＴｕｋｅｙの多重比較検定による一元配置分散分析により決定した。結果は、平均値±ＳＥＭで示している。
　つぎに、図８は、末梢血における、ＣＤ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、制御性Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の割合を示すグラフである。図８において、横軸はサンプルの種類を示し、縦軸は、各細胞の割合を示す。図９において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、相対的発現量を示す。
　図８に示すように、末梢血及び腎臓の双方において、RACev、MSCevおよびコントロールの間に差はなく、移植片拒絶反応は観察されなかった。
　また、図９に示すように、RACevは、MSCevと比較して、免疫抑制活性（抗炎症性）を有するｍｉＲＮＡ（miR-142-3p）の発現量が有意に高かった。なお、miR-142-3pは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が放出するエクソソームに含まれていることが知られている。これらの結果から、RACevは、免疫抑制活性を有するｍｉＲＮＡを運搬することにより、移植片拒絶反応を抑制していることが示唆された。
　以上、図７～９のとおり、移植片拒絶反応が確認されなかったことから、本開示の組成物は、免疫抑制効果を有することが分かった。また、末梢血と腎臓の免疫細胞の特性が明らかになった。
（４）ＲＡＣｅｖ移植による腎機能の改善
　図１０は、血清クレアチニン（Ｃｒ）値、および血清ＢＵＮ値を示すグラフである。図１０Ａは、血清クレアチニン（Ｃｒ）値の経時変化を比較したグラフ、図１０Ｂは、血清ＢＵＮ値の経時変化を比較したグラフを示す。図１０Ａにおいて、横軸は、経過時間を示し、縦軸は、血清クレアチニン（Ｃｒ）の値（ｍｇ/ｄＬ）を示す。図１０Ｂにおいて、横軸は、経過時間を示し、縦軸は、血清ＢＡＮの値（ｍｇ/ｄＬ）を示す。
　急性肝機能障害（Ｒ－ＡＫＩ）発症後１日目に、１×１０６細胞由来ＥＶを尾静脈より注入し、臨床治療方針に基づいて治療時間を調整した。図１０Ａにおいて、Ｋ－ＩＲＩ発症後３日目の血清クレアチニン（Ｃｒ）値は、ＥＶ処理群では対照群と比較して有意に減少した（Ｐ＜０．００７，処理群ｖｓ．対照群）。図１０Ｂにおいて、血清ＢＵＮ値も同様に、対照群に比べ、RACev群で顕著に減少した（Ｐ＜０．００７，処理群ｖｓ．対照群）。図１０Ａおよび図１０Ｂに示すように、ＲＡＣｅｖの移植に腎機能の改善を観察した。なお、統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による二元配置分散分析により決定した。結果は、平均値±ＳＥＭで示している。
　ラットの体重（ＢＷ）は、発症前と、発症後１週間ごとに測定した。発症４週間後、ＲＡＣｅｖ移植群のＢＷは、対照群に比べ増加した（ＲＡＣｅｖ；３３３±６ｇ、対照；３１５±５．５ｇ、Ｐ＜０．００５３）。
（５）線維化の改善
　図１１は、線維化の程度を示す写真およびグラフである。図１１Ａは、各部における線維化の程度を示す蛍光顕微鏡写真、図１１Ｂは、皮質における線維化面積を比較したグラフ、図１１Ｃは、髄質における線維化面積を比較したグラフ、図１１Ｄは、抗線維化活性を有するｍｉＲＮＡの発現量を示し、図１１Ｅは、抗炎症活性を有するｍｉＲＮＡの発現量を示し、図１１Ｆは、線維化促進遺伝子の発現量を示す。図１１Ｂにおいて、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、線維化面積（％）を示す。図１１Ｃにおいて、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、線維化面積（％）を示す。図１１ＤおよびＥにおいて、横軸は、ＲＮＡの種類を示し、縦軸は、相対的発現量を示す。図１１Ｆにおいて、横軸は、遺伝子の種類を示し、縦軸は、Log比（RACev対Control）を示す。図１１Ａ～図１１Ｃに示すように、マッソントリクローム染色は、皮質および髄質のいずれの領域においても、対照群よりも治療群で腎臓の線維化レベルが保たれていることを示した（皮質領域ではＰ＜０．０４，処理群ｖｓ．対照群、髄質領域ではＰ＜０．０１，処理群ｖｓ．対照群）。また、図１１Ｄおよび図１１Ｅに示すように、このＲＡＣｅｖの抗線維化効果は、虚血組織への抗線維化活性および抗炎症活性を有するｍｉＲＮＡを運搬することと相まって、過剰な炎症および瘢痕形成から有益に保護された。さらに、図１１Ｆに示すように、遺伝子発現解析から、ＲＡＣｅｖ治療群では対照群と比較して、Ｒ－ＩＲＩ発症後6日目に、線維化促進遺伝子（ＮＧＦＲ、ＦＧＦ２、ＣＳＦＬＲ、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＴＧＦｂ１など）の大部分が、顕著に発現低下していることが明らかになった。以上のように、ＲＡＣｅｖ移植は、抗線維化活性および抗炎症活性を有するｍｉＲＮＡを運搬することにより、腎機能パラメーターを増大させた。なお、統計的有意性は、Ｄｕｎｎの多重比較検定による一元配置分散分析により決定した。結果は、平均±ＳＥＭ（各群ｎ＝８－１０）として示される。
（６）細胞外小胞の血管新生促進活性
　図１２は、虚血損傷腎組織における微小血管密度を示す写真およびＣＤ３１陽性微小血管の数を示すグラフである。図１２Ａは、虚血損傷腎組織における血管を示し、図１２Ｂは、皮質における血管の密度を比較したグラフ、図１２Ｃは、髄質における血管の密度を比較したグラフ、図１２Ｄは、ｍｉＲＮＡの発現量を示すグラフである。図１２Ｂおよび図１２Ｃにおいて、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、微小血管密度（/ｍｍ２）を示す。図１２Ｄにおいて、横軸は、ｍｉＲＮＡの種類を示し、縦軸は、相対的発現量を示す。図１２Ａ～図１２Ｃにおいて、ＲＡＣｅｖ処理群では虚血損傷腎組織において微小血管密度が増強したことが示され（Ｐ＜０．００３，処理群ｖｓ．対照群）、ＲＡＣｅｖの強い血管新生特性が示された。図１２Ｄにおいて、トランスクリプトーム解析により、血管新生に関与する主要な血管新生ｍｉＲＮＡ、いわゆるａｎｇｉｏｍｉＲは、ＲＡＣｅｖにおいて、より高度に上方制御されていることが明らかになった。なお、統計的有意性は、Ｄｕｎｎの多重比較検定による一元配置分散分析により決定した。結果は、平均値±ＳＥＭで示している（各群ｎ＝８－１０）。
　図１３は、Ｒ－ＩＲＩ発症後6日目と２８日目における虚血損傷腎組織の微小血管密度を示す写真およびＣＤ３１陽性微小血管の数を示すグラフである。図１３Ａは、虚血損傷腎組織における血管を示し、図１３Ｂは、皮質における血管の密度を比較したグラフ、図１３Ｃは、髄質における血管の密度を比較したグラフ、図１３Ｄは、血管新生に関連する遺伝子を示すグラフである。図１３ＢおよびＣにおいて、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、微小血管密度（/ｍｍ２）を示す。図１３Ｄにおいて、横軸は、遺伝子の種類を示し、縦軸は、Log比（RACev対Control）を示す。毛細血管密度は、Ｒ－ＩＲＩ発症後6日目と２８日目の急性期に評価し、その血管組織保護効果と血管新生効果を検証した。図１３Ａおよび図１３Ｂは、虚血傷害を受けた腎臓組織の微小血管密度が、対照群と比較して、ＲＡＣｅｖ移植群で有益に増強したことを示しており（６日目ではＰ＜０．００５、ＲＡＣ群と対照群、２８日目ではＰ＜０．００３）、ＲＡＣｅｖの強力な血管保護および血管新生特性を示している。さらに、トランスクリプトーム解析によると、RACev療法は、対照群と比較して、虚血腎組織において血管新生関連遺伝子を有意に上方制御した（図１３Ｄ）。以上のことから、ＲＡＣｅｖは、虚血傷害の現場で、血管新生を促進するとともに、低酸素誘導腎血管網の損傷を保護するために、血管新生酵素と血管保護ｍｉＲを送達していることが示された。
（７）損傷した腎臓への選択的なＲＡＣｅｖの蓄積
　図１４は、ＩＶＩＳ測定の結果を示す写真である。ＩＶＩＳ測定の結果、標識されたＲＡＣｅｖは、移植群の損傷した腎臓に集積することが確認された。以上のＥＶ追跡解析により、ＲＡＣｅｖが肝臓に選択的に集積することが示された。
　なお、最も発現量の多い５００遺伝子を用いて、細胞タイプアノテーション解析を行い、ネフロンのどの部位／細胞で高発現しているかを同定した。その結果、最も発現量の多いネフロン領域のトップ１０は、近位尿細管上皮細胞セグメント１および２、遠位尿細管細胞タイプ１および２、腎尿細管上皮細胞であった。この結果は、標識ＲＡＣｅｖのほとんどが皮質と髄質の間に蓄積しているというＩＶＩＳの結果を証明するものである。一方、移植されたＲＡＣｅｖの一部は腎臓にも捕捉された。以上のＥＶ追跡解析により、虚血誘発腎組織において、ＲＡＣｅｖが集積していることが示された。
　血管新生条件下において、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の炎症性細胞サブセットは、血管新生内皮前駆細胞、Ｍ２マクロファージ、制御性Ｔ細胞などの再生促進細胞へと表現型を変化させる。注目すべきは、ＲＡＣｅｖの全身注射により、３日目の血清クレアチニンと血中尿中窒素が対照群より有意に減少したことである。組織学的には、治療群は対照群よりも皮質および髄質領域の線維化が少なかった（Ｐ＜０．０４およびＰ＜０．０１）。ＣＤ３１染色では、対照群と比較して治療群で毛細血管密度が増加したことが確認された（Ｐ＜０．００３）。これらの有益な効果は、血管新生、抗線維症、抗炎症、抗アポトーシスのｍｉＲの有意な発現と結びついていた。Ｉｎ　ｖｉｖｏの生物発光分析では、ＩＲで損傷した腎臓に、ＲＡＣｅｖが優先的に集積することが示された。結論として、ＲＡＣｅｖの全身移植は、組織の線維化、抗炎症、血管新生、および虚血組織への抗アポトーシスｍｉＲの送達からの保護を介して、腎機能を改善する。
（８）虚血損傷後の上皮間葉転換、炎症、低酸素に対するＲＡＣｅｖの制御的役割
　図１５は、ＲＡＣｅｖの投与によりＫ－ＩＲＩ発症後４週間の腎線維症が顕著に減少する線維症減少の機序解明を、様々な解析方法を用いて行った結果を示すグラフ及び図である。図１５Ａおよび図１５Ｂは、ｍｉＲＮＡの発現量を示し、図１５Ｃは、対照群において最も関連性の高いパスウェイ調節のクラスター解析結果を示し、図１５Ｄは、対照群のダウンストリーム機構における遺伝子間の関係についてのネットワーク解析の結果を示し、図１５Ｅは、処理群のダウンストリーム機構における遺伝子間の関係についてのネットワーク解析の結果を示す。図１５Ａおよび図１５Ｂにおいて、横軸は、ＲＮＡの種類を示し、縦軸は、相対的発現量を示す。まず、small non codding RNA sequencingとデータ解析から、ＲＡＣｅｖには、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ２４－３ｐのような重要な抗炎症ｍｉＲがいくつか含まれており、過剰な炎症から制御し、再生を開始することが明らかになった（図１５Ａ）。さらに、ＲＡＣｅｖは、抗アポトーシスと細胞増殖のｍｉＲを持つ（図１５Ｂ）。一方、対照群では、パスウェイ解析により、腎組織の線維化が低酸素経路（Ｐ＜２．１９ｅ－０２）により開始され（図１５Ｃ、図１５Ｄ）、余剰の炎症経路、例えばＩＬ－６－ＪＡＫ２－ＳＴＡＴ３（Ｐ＜１．４３ｅ－０３）、ＮＦ－ｋＢを介したＴＮＦａシグナル（Ｐ＜１．５１ｅ－０３）、ＩＮＦｇ応答（Ｐ＜２．１９ｅ－０２）のような余剰の炎症経路のアップレギュレーションは、初期の上皮間葉転換経路（Ｐ＜３．７５ｅ－１１）を開始する（図１５Ｃ、図１５Ｄ）。処理群では、パスウェイ解析により、ＲＡＣｅｖは再生関連経路を強化したことが示された（図１５Ｅ）。
　以上、実施形態および実施例を参照して本開示を説明したが、本開示は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本開示の構成や詳細には、本開示のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更を行うことが可能である。
　この出願は、２０２２年１１月１１日に出願された日本出願特願２０２１－１８１３０１を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
＜付記＞
　上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
＜組成物＞
（付記１）
腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の処置に用いる組成物であって、
前記組成物が、生体試料由来の単核球から誘導された再生性細胞集団またはその培養物の細胞外小胞を含む、組成物。
（付記２）
前記細胞外小胞は、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、および／またはｍｉＲ－１４２－３ｐを含む、付記１に記載の組成物。
（付記３）
さらに、前記細胞外小胞は、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３７３－３ｐ、ｍｉＲ－５０９－３ｐ、ｍｉＲ－６３３、および／またはｌｅｔ－７ｃ－５ｐを含む付記１または２に記載の組成物。
（付記４）
前記細胞外小胞は、ＣＤ９および／またはＣＤ６３陽性である、付記１から３のいずれかに記載の組成物。
（付記５）
前記細胞外小胞の平均径は、１０～５００ｎｍである、付記１から４のいずれかに記載の組成物。
（付記６）
血管内皮細胞の増殖促進活性を有する、付記１から５のいずれかに記載の組成物。
（付記７）
血管新生促進活性を有する、付記１から６のいずれかに記載の組成物。
（付記８）
線維化抑制活性を有する、付記１から７のいずれかに記載の組成物。
（付記９）
移植片拒絶反応が抑制された、付記１から８のいずれかに記載の組成物。
（付記１０）
前記細胞外小胞は、前記再生性細胞集団またはその培養物から、抽出または単離された細胞外小胞である、付記１から９のいずれかに記載の組成物。
（付記１１）
前記再生性細胞集団は、前記単核球を、幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン、および／または血管内皮細胞増殖因子の存在下、培養することで誘導される、付記１から１０のいずれかに記載の組成物。
（付記１２）
前記再生性細胞集団は、ＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞の選別を行うことなく誘導される、付記１から１１のいずれかに記載の組成物。
（付記１３）
前記再生性細胞集団は、血管内皮前駆細胞、抗炎症性マクロファージ、および制御性Ｔ細胞を含む、付記１から１２のいずれかに記載の組成物。
（付記１４）
前記血管内皮前駆細胞は、分化型ＥＰＣコロニー形成細胞である、付記１３に記載の組成物。
（付記１５）
前記抗炎症性マクロファージは、Ｍ２マクロファージである、付記１３または１４に記載の組成物。
（付記１６）
前記生体試料は、血液および骨髄の少なくとも一方である、付記１から１５のいずれかに記載の組成物。
（付記１７）
前記生体試料は、末梢血および臍帯血の少なくとも一方である、付記１から１６のいずれかに記載の組成物。
＜腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の処置組成物＞
（付記１８）
腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の治療的処置又は予防的処置に用いるための組成物であって、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物である、組成物。
（付記１９）
前記腎疾患は、急性腎障害、移行期慢性腎臓病 、慢性腎臓病、または腎移植後の免疫抑制である、付記１８に記載の組成物。
（付記２０）
付記１から１７のいずれか一項に記載の組成物を含む、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の治療的処置又は予防的処置に用いる腎疾患用医薬品。
＜血管内皮細胞の増殖促進組成物＞
（付記２１）
血管内皮細胞の増殖促進に用いるための組成物であって、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物である、組成物。
＜血管新生誘導組成物＞
（付記２２）
血管新生の誘導に用いるための組成物であって、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物である、組成物。
＜線維化抑制組成物＞
（付記２３）
線維化の抑制に用いるための組成物であって、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物である、組成物。
＜腎疾患の処置方法＞
（付記２４）
腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患患者の処置方法であって、
前記腎疾患患者に、付記１から１７のいずれかに記載の組成物を投与する、処置方法。
（付記２５）
前記腎疾患は、急性腎障害、移行期慢性腎臓病 、慢性腎臓病、または腎移植後の免疫抑制である、付記２４に記載の処置方法。
＜血管内皮細胞の増殖促進方法＞
（付記２６）
血管内皮細胞の増殖促進方法であって、
前記血管内皮細胞と、組成物とを接触させることにより、前記血管内皮細胞の増殖を促進する工程を含み、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物である、方法。
＜血管新生の誘導方法＞
（付記２７）
血管新生の誘導方法であって、
付記１から１７のいずれかに記載の組成物を使用する、方法。
（付記２８）
血管新生を誘導する対象に、前記組成物を投与する、付記２７に記載の方法。
（付記２９）
血管新生を誘導する対象は、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患患者であり、
前記血管新生の誘導は、前記疾患患者の腎臓、脳、肺、骨髄、腸、眼、虚血筋、または虚血再灌流傷害が生じている部位における血管新生の誘導である、付記２８または２９に記載の方法。
＜線維化抑制方法＞
（付記３０）
線維化の抑制方法であって、
付記１から１７のいずれかに記載の組成物を使用する、方法。
（付記３１）
線維化を抑制する対象に、前記組成物を投与する、付記３０に記載の方法。
（付記３２）
線維化を抑制する対象は、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患患者であり、
前記線維化の抑制は、前記疾患患者の腎臓、脳、肺、骨髄、腸、眼、虚血筋、または虚血再灌流傷害が生じている部位における線維化の抑制である、付記３０または３１に記載の方法。
＜使用＞
（付記３３）
腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の治療的処置又は予防的処置のために用いるための組成物であって、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物である、組成物。
（付記３４）
血管内皮細胞の増殖促進に使用するための組成物であり、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物。
（付記３５）
血管新生の誘導に使用するための組成物であり、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物。
（付記３６）
線維化の抑制に使用するための組成物であり、
前記組成物は、付記１から１７のいずれかに記載の組成物。
　以上のように、本開示の組成物は、前記移植片拒絶反応が抑制されており、かつ前記再生性細胞集団に由来するため、血管内皮細胞の増殖促進活性、血管新生促進活性等の生理活性を有する。このため、本開示は、例えば、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の治療または予後の改善に好適に使用できる。したがって、本開示は、例えば、医薬分野等において極めて有用である。

 

Claims (23)

  1. 腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の処置に用いる組成物であって、
    前記組成物が、生体試料由来の単核球から誘導された再生性細胞集団またはその培養物の細胞外小胞を含む、組成物。
  2. 前記細胞外小胞は、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、および／またはｍｉＲ－１４２－３ｐを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. さらに、前記細胞外小胞は、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３７３－３ｐ、ｍｉＲ－５０９－３ｐ、ｍｉＲ－６３３、および／またはｌｅｔ－７ｃ－５ｐを含む請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記細胞外小胞は、ＣＤ９および／またはＣＤ６３陽性である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記細胞外小胞の平均径は、１０～５００ｎｍである、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 血管内皮細胞の増殖促進活性を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 血管新生促進活性を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 線維化抑制活性を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 移植片拒絶反応が抑制された、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記細胞外小胞は、前記再生性細胞集団またはその培養物から、抽出または単離された細胞外小胞である、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記再生性細胞集団は、前記単核球を、幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン、および／または血管内皮細胞増殖因子の存在下、培養することで誘導される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記再生性細胞集団は、ＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞の選別を行うことなく誘導される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記再生性細胞集団は、血管内皮前駆細胞、抗炎症性マクロファージ、及び制御性Ｔ細胞を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記血管内皮前駆細胞は、分化型ＥＰＣコロニー形成細胞である、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記抗炎症性マクロファージは、Ｍ２マクロファージである、請求項１３または１４記載の組成物。
  16. 前記生体試料は、血液および骨髄の少なくとも一方である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記生体試料は、末梢血および臍帯血の少なくとも一方である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の治療的処置又は予防的処置のために用いるための組成物であって、
    前記組成物は、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物である、組成物。
  19. 前記腎疾患は、急性腎障害、移行期慢性腎臓病 、慢性腎臓病、または腎移植後の免疫抑制である、請求項１８に記載の組成物。
  20. 請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物を含む、腎疾患、末梢動脈疾患（PAD）、脳梗塞、肺高血圧症（PHD）、脊髄虚血症、非閉塞性腸管虚血症、眼虚血症候群、線維症、および炎症性疾患の少なくとも一つの疾患の治療的処置又は予防的処置に用いる腎疾患用医薬品。
  21. 血管内皮細胞の増殖促進に用いるための組成物であって、
    前記組成物は、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物である、組成物。
  22. 血管新生の誘導に用いるための組成物であって、
    前記組成物は、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物である、組成物。
  23. 線維化の抑制に用いるための組成物であって、
    前記組成物は、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物である、組成物。

     
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