WO2023282423A1 - 중간엽 줄기세포, 이로부터 분리된 세포외 소포체, 및 이들의 용도 - Google Patents

중간엽 줄기세포, 이로부터 분리된 세포외 소포체, 및 이들의 용도 Download PDF

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WO2023282423A1
WO2023282423A1 PCT/KR2022/001337 KR2022001337W WO2023282423A1 WO 2023282423 A1 WO2023282423 A1 WO 2023282423A1 KR 2022001337 W KR2022001337 W KR 2022001337W WO 2023282423 A1 WO2023282423 A1 WO 2023282423A1
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stem cells
mesenchymal stem
present
cells
disease
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PCT/KR2022/001337
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조쌍구
임경민
데이엠 아메드 아브달
이수빈
최유진
강근호
김아람
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건국대학교 산학협력단
스템엑소원 주식회사
건국대학교 글로컬산학협력단
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to mesenchymal stem cells, extracellular vesicles isolated therefrom, and uses thereof.
  • the inflammatory response is a biological defense reaction process for repairing and regenerating damage caused by invasion that causes organic changes in cells or tissues of a living body, and this reaction process includes local blood vessels, various tissue cells of body fluids, and immune cells, etc.
  • the inflammatory response normally induced by external invading bacteria is a defense system for protecting the living body, whereas when an abnormally excessive inflammatory response is induced, various diseases appear. These diseases are collectively referred to as inflammatory diseases.
  • the inflammatory diseases are diseases in which various inflammatory mediators secreted from target cells activated by external stimuli amplify and sustain inflammation and threaten the life of the human body, such as acute inflammation, diseases in the bladder such as cystitis, and rheumatoid arthritis. It includes diseases within the joints, skin diseases in the form of psoriasis, and allergic inflammatory diseases such as bronchial asthma.
  • interstitial cystitis is a chronic bladder disease of unknown cause, characterized by symptoms of pain, eg, pelvic pain, and lower urinary tract syndrome (LUTS), eg, increased urinary frequency/urgency.
  • PBS painful bladder syndrome
  • BPS bladder pain syndrome with IC to collectively describe this complex symptom.
  • BPS [(van der Merve et al . European Urology 53(2008) 60-67]
  • IC/BPS IC/PBS/BPS.
  • IC/PBS/BPS IC/PBS/BPS
  • IC significantly affects quality of life, affects travel, family relationships and activities (Slade D et al . Urol 1997; 49 (5A Suppl):10-3), and is also associated with depressive syndromes ( Rothrock NE et al . J Urol 2002; 167: 1763-1767).
  • the IC/PBS/BPS has not been identified as a single etiology, and mainly causes hyperalgesia, chronic bladder pain and urination disorders (Forrest JB et al . Clinical Courier 2006; 24(3):1-8).
  • mesenchymal stem cells are multipotent progenitor cells having the ability to differentiate into mesenchymal tissue lineages. These cells can mediate potential immunomodulatory effects by regulating adaptive and innate immune responses in various cells, emerging as a new alternative for treating autoimmune diseases. It is also known to have immunosuppressive and anti-inflammatory effects (European Registered Patent No. 02298861, US Patent Publication No. 2012-0269774) as well as inhibit T cell activation and proliferation (Li ZJ et al ., PloS ONE 8 (10): 77159, 2013).
  • MSC stem cell therapeutics optimized to have a more powerful effect on inflammation-related diseases have not yet been developed. Therefore, there is an urgent need to develop MSC therapeutics suitable for preventing or treating inflammatory diseases.
  • MSC mesenchymal stem cells
  • An object of the present invention is to provide mesenchymal stem cells effective for the prevention, alleviation, improvement or treatment of various inflammatory diseases including interstitial cystitis.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating inflammatory diseases or autoimmune diseases comprising the mesenchymal stem cells or extracellular vesicles isolated therefrom as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for wound healing comprising the mesenchymal stem cells or extracellular vesicles isolated therefrom as an active ingredient.
  • the present invention provides (A) an increase in the expression level of one or more markers selected from SPP1, PLAU, ITGA6, CENPI and BUB1; and (B) a decrease in the expression level of the PTGS2 marker;
  • mesenchymal stem cells exhibiting one or more characteristics selected from among.
  • the mesenchymal stem cells may have increased expression levels of SPP1, PLAU, ITGA6, CENPI and BUB1 markers.
  • the mesenchymal stem cells are prepared by: (1) culturing pluripotent stem cells isolated from a subject to form an embryoid body (EB); (2) forming spheroids by three-dimensionally culturing the embryoid body in a bioreactor under microgravity; and (3) differentiating the spheroids into mesenchymal stem cells by attaching and culturing the spheroids in a culture vessel coated with an adhesive polymer on the culture surface.
  • EB embryoid body
  • the pluripotent stem cells may be embryonic stem cells (ESC) or induced pluripotent stem cells (iPSC).
  • ESC embryonic stem cells
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • the pluripotent stem cells may be induced pluripotent stem cells.
  • step (1) may be performed by three-dimensionally culturing the pluripotent stem cells in a multi-well culture vessel.
  • step (1) may additionally include inducing cell aggregation through centrifugation during the three-dimensional culture.
  • the microgravity of step (2) may be induced by a microgravity simulation device that cancels the gravitational force applied to the bioreactor by rotating the bioreactor.
  • step (2) may be performed by culturing for 3 to 8 days while rotating the microgravity simulator at 15 to 80 rpm.
  • the step (2) may be performed by rotating the microgravity simulation device while increasing by 5 rpm every day starting from 40 to 60 rpm.
  • the adhesive polymer is hyaluronic acid, alginate, heparin, fucoidan, cellulose, dextran, chitosan ), albumin, fibrin, collagen, and gelatin.
  • the adhesive polymer may be gelatin.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases or autoimmune diseases comprising the mesenchymal stem cells or extracellular vesicles isolated therefrom as an active ingredient. .
  • the inflammatory disease or autoimmune disease is cystitis, rheumatoid arthritis, reactive arthritis, type 1 diabetes, type 2 diabetes, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, idiopathic fibrosing alveolitis, polymyositis , dermatomyositis, localized dermatosclerosis, systemic scleroderma, colitis, inflammatory bowel disease, Sjorgen's syndrome, Raynaud's phenomenon, Bechet's disease, Kawasaki's disease, primary biliary It may be primary biliary sclerosis, primary sclerosing cholangitis, ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) or Crohn's disease.
  • cystitis cystitis, rheumatoid arthritis, reactive arthritis, type 1 diabetes, type 2 diabetes, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, idiopathic fibrosing alveolitis
  • the cystitis may be at least one selected from interstitial cystitis, chronic cystitis, and ketamine-induced cystitis.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for wound healing comprising the mesenchymal stem cells or extracellular vesicles isolated therefrom as an active ingredient.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention exhibit characteristics of increasing the expression level of one or more markers selected from among SPP1, PLAU, ITGA6, CENPI and BUB1 and/or decreasing the expression level of the PTGS2 marker, such that TNF- ⁇ , IL- Since it significantly reduces the amount of inflammatory cytokines such as 6, it is effective in preventing, alleviating, improving or treating various inflammatory diseases.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention or stem cell-derived extracellular vesicles isolated therefrom, are administered to an interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS) animal model, the inner wall of the bladder collapsed during the IC/BPS induction process. Since it restores and alleviates the degree of inflammation, it has excellent therapeutic efficacy for interstitial cystitis/bladder pain syndrome.
  • IC/BPS interstitial cystitis/bladder pain syndrome
  • mesenchymal stem cells of the present invention or the stem cell-derived extracellular vesicles isolated therefrom have excellent wound healing effects, they can be usefully used for wound healing.
  • Figure 1 shows a schematic diagram summarizing the protocol of the present invention for differentiating MSCs from iPSCs.
  • FIG. 2 is a picture showing the morphology of an embryoid body (EB) formed on Aggrewell.
  • Figure 3 is a picture showing the shape (upper part) of spheroids formed through a BAM (Bio Array Matrix) device, which is a microgravity bioreactor, and the staining results (lower part) using OCT4 and DAPI antibodies.
  • BAM Bio Array Matrix
  • Figure 4 is a picture showing the appearance of mesenchymal stem cells derived from spheroids, and it was confirmed that they had a spindle shape after passaging (right).
  • FIG. 5 is a diagram showing the appearance of iMSCs differentiated by the method of the present invention at each passage.
  • Figure 6 is a picture showing the cumulative cell proliferation curve of mesenchymal stem cells differentiated by the method of the present invention, CPD (Cummulative Population Doubling) for each passage (Fig. 6a), doubling time (Fig. 6b), and Log cell number (Fig. 6c), respectively.
  • CPD Cummulative Population Doubling
  • Figure 7 is a picture showing the result of confirming the cell surface marker expression of mesenchymal stem cells differentiated by the method of the present invention by FACS analysis.
  • FIG. 8 is a picture showing the result of confirming that induced pluripotent stem cells lost totipotency and differentiated into cells expressing mesenchymal stem cell markers through the method of the present invention using immunocytochemical staining.
  • Figure 9 is a diagram showing a schematic diagram of an experimental procedure confirming the inflammation control effect of stem cells differentiated by the method of the present invention in inflammation-inducing cells using LPS.
  • FIG. 10 is a picture showing the result of confirming the expression of inflammatory markers through RT-PCR.
  • FIG. 11 is a diagram showing the result of TRAP staining of cells induced by LPS treatment using immunocytochemical staining (left), and the result of counting the TRAP-stained cells (right).
  • Figure 13a is a photograph showing the degree of cell migration over time after treatment of scratched NHDF cells with exosomes isolated from mesenchymal stem cells of the present invention
  • Fig. 13b is a graph showing the degree of cell migration digitized.
  • Figure 14a is the result of network analysis using the database-based String-db tool to find out the Protein-Protein Interaction of each of the upregulated genes contained in the mesenchymal stem cells of the present invention
  • Figure 14b is the network of downregulated genes The figure shows the result of the analysis.
  • 15A to 15D are Venn diagrams generated using functions predicted by performing DAVID analysis on each of the upregulated genes included in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • 16A to 16D are Venn diagrams generated using functions predicted by performing DAVID analysis on each of the down-regulated genes included in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • Figure 17a is a picture confirming the morphology and inflammation level of bladder tissue after administration of mesenchymal stem cells (iMSC) of the present invention in an interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS) induced mouse model.
  • Figure 17a is the results of H&E staining, masson's trichome staining, and toluidine blue staining of the bladder tissue of the IC / BPS mouse model, respectively
  • Figure 17b is a graph showing the degree of fibrosis (%) and mast cell penetration through the staining. it is shown
  • Figure 18 is an interstitial cystitis / bladder pain syndrome (IC / BPS) induced mouse model after administration of the mesenchymal stem cells (iMSC) of the present invention, mRNA was extracted from the bladder tissue, and inflammation-related cytokines (TNF ⁇ , IL6) 18a), urothelial markers (UPK1A, UPK1B, UPK2) (FIG. 186b), and IC/BPS-expressed genes (KLRB1, PSMB9, ITGAL) (FIG. 18c) to be.
  • IC / BPS inflammation-related cytokines
  • SPP1 secreted phosphoprotein 1; Osteopontin
  • PLAU Plasminogen Activator, Urokinase
  • ITGA6 integrated subunit alpha 6
  • CENPI Cyentromere Protein I
  • BUB1 Budding Uninhibited By Benzimidazoles 1 Homolog; an increase in the expression level of one or more markers selected from mitotic checkpoint serine/threonine-protein kinase); and
  • B decrease in the expression level of PTGS2 (Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2, or COX2;) marker; It relates to mesenchymal stem cells having one or more characteristics selected from among.
  • the term “increase in expression amount” or “decrease in expression amount” refers to conventional mesenchymal stem cells, preferably Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells (hWJ-MSC) compared to It means that the expression level of a specific marker expressed by mesenchymal stem cells has significantly increased or decreased to the extent that it can be measured, specifically means that the expression level has increased or decreased by 40% or more, and more specifically means that the expression level has increased or decreased by 50% or more It means, more specifically means an increase or decrease of 60% or more, more specifically means an increase or decrease of 80% or more, and most specifically means an increase or decrease of 100% or more.
  • hWJ-MSC Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells
  • stem cell refers to an undifferentiated cell at a stage before differentiation into each cell constituting a tissue, and has the ability to differentiate into a specific cell under a specific differentiation stimulus (environment).
  • Stem cells unlike differentiated cells in which cell division is suspended, can produce (self-renewal) cells identical to themselves by cell division, and can differentiate into various cells depending on the nature of the stimulus when a differentiation stimulus is applied. , it is characterized by the plasticity of differentiation.
  • meenchymal stem cells refers to stem cells having multipotency capable of differentiating into adipocytes, bone cells, chondrocytes, muscle cells, nerve cells, and cardiomyocytes.
  • Mesenchymal stem cells can be identified through their swirl-shaped morphology and the level of expression of the basic cell surface markers CD73(+), CD105(+), CD34(-), and CD45(-), and they exhibit pluripotency and immune response. It also has a control function.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention have SPP1 at least 3 times, specifically 3.0 to 4.0 times, more specifically 3.50 to 3.50 times, compared to conventional mesenchymal stem cells, preferably general hWJ-MSC (control group). It is possible to up-regulate or increase the expression level by 4.00 fold, more specifically 3.80 to 3.90 fold.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention have at least 1.5-fold, specifically 1.5-2.2-fold, specifically 1.80-fold, compared to conventional mesenchymal stem cells, preferably general hWJ-MSC (control group), with respect to PLAU.
  • the expression level can be up-regulated or increased by 2.10-fold to 2.10-fold, more specifically 1.90- to 2.00-fold.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention have at least 2.1-fold, specifically 2.1-3.0-fold, specifically 2.30-fold, compared to conventional mesenchymal stem cells, preferably general hWJ-MSC (control), for ITGA6.
  • the expression level can be up-regulated or increased by 2.60 fold to 2.60 fold, more specifically 2.40 to 2.50 fold.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention have at least 1.5 times, specifically 1.5 to 2.0 times, specifically 1.60 times, compared to conventional mesenchymal stem cells, preferably general hWJ-MSC (control group), with respect to CENPI.
  • the expression level can be up-regulated or increased by 1.90-fold to 1.90-fold, more specifically 1.70- to 1.80-fold.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention have BUB1 at least 1.4-fold, specifically 1.4-2.1-fold, specifically 1.50-fold, compared to conventional mesenchymal stem cells, preferably general hWJ-MSC (control).
  • the expression level can be up-regulated or increased by 1.90-fold to 1.90-fold, more specifically 1.65- to 1.75-fold.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention have PTGS2 at least 2.0 times higher, specifically 2.0 to 3.0 times, specifically 2.30 times, compared to conventional mesenchymal stem cells, preferably normal hWJ-MSC (control group). It is possible to down-regulate, or reduce the expression level by fold to 2.90-fold, more specifically from 2.50- to 2.70-fold.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention increase the expression level of one or more markers selected from the above SPP1, PLAU, ITGA6, CENPI and BUB1; And / or by having the characteristic of reducing the expression level of the PTGS2 marker, the amount of inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ and IL-6 is significantly reduced, and various inflammatory diseases, preferably cystitis, in particular prevent interstitial cystitis , alleviate, ameliorate, or cure.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention significantly increase cell migration and have excellent wound healing effects.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention may have increased expression levels of SPP1, PLAU, ITGA6, CENPI and BUB1 markers.
  • mesenchymal stem cells of the present invention are prepared by: (1) culturing pluripotent stem cells isolated from a subject to form an embryoid body (EB); (2) forming spheroids by three-dimensionally culturing the embryoid body in a bioreactor under microgravity; and (3) differentiating the spheroids into mesenchymal stem cells by attaching and culturing the spheroids in a culture vessel coated with an adhesive polymer on the culture surface.
  • EB embryoid body
  • the term “pluripotent stem cell” refers to a stem cell that can differentiate into cells constituting endoderm, mesenchyme, and ectoderm as cells in a state in which development is more advanced than that of a fertilized egg.
  • the pluripotent stem cells used in the present invention are embryonic stem cells (ESC), embryonic germ cells, embryonic carcinoma cells, or induced pluripotent stem cells.
  • ESC embryonic stem cells
  • iPSC induced Pluripotent Stem Cell
  • more specifically embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells most specifically induced pluripotent stem cells.
  • induced pluripotent stem cell is one of artificially derived pluripotent stem cells by inserting a specific gene related to an undifferentiated or pluripotent phenotype into a non-pluripotent cell (eg, a somatic cell).
  • induced pluripotent stem cells have the same natural characteristics as embryonic stem cells in that they have stem cell gene and protein expression, chromosome methylation, doubling time, embryoid body formation, teratoma formation, viable chimera formation, hybridization and differentiation. It is considered in the art to have the same phenotype, physiological characteristics and developmental characteristics as pluripotent stem cells of .
  • differentiation of stem cells refers to precursor cells that are formed in the intermediate stage before full differentiation from stem cells to specific cells as well as when complete differentiation is induced from undifferentiated stem cells to specific cells. It also includes the formation of
  • the cell culture medium used in each of the above steps is a mixture for cell growth and proliferation in vitro, including elements essential for cell growth and proliferation, such as sugars, amino acids, various nutrients, and minerals.
  • Components that may be additionally included in the cell culture medium include, for example, glycerin, L-alanine, L-arginine hydrochloride, L-cysteine hydrochloride-monohydrate, L-glutamine, L-histidine hydrochloride-monohydrate, L- Lysine hydrochloride, L-methionine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-valine, L-asparagine-monohydrate, L-aspartic acid, L-cystine 2HCl, L-glutamic acid, L-isoleucine, L -Leucine, L-phenylalanine, L-tryptophan, L-tyrosine disodium salt dihydrate, i-inositol,
  • the cell culture medium may be artificially prepared and used, or a commercially available medium may be purchased and used.
  • Examples of commercially available culture media are Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), Alpha Modification of Eagle's Medium ( ⁇ -MEM), Nutrient Mixture F-12 (F12) and Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture (DMEM/F12). F-12), but is not limited thereto.
  • step (1) may be performed by three-dimensionally culturing the pluripotent stem cells in a multi-well culture vessel.
  • 3-dimensional culture in the present invention is a concept relative to two-dimensional culture, in which the cells to be cultured are floating in the culture medium without being fixed to a substrate. means cultivating Accordingly, the term “three-dimensional culture” is used in the same sense as “suspension culture”. Adhesion-dependent stem cells cause cell aggregation during suspension culture, and cells floating alone that are not included in this aggregation die by inducing apoptosis. do. According to the present invention, by suspension culture of totipotent stem cells in multiple wells having a plurality of wells, totipotent stem cell aggregates having a diameter according to the well size, that is, embryoid bodies (EBs) are formed in proportion to the number of wells. Accordingly, in step (1) of the present invention, standardized embryoid bodies having the same size and shape can be obtained in large quantities.
  • EBs embryoid bodies
  • the multi-well culture vessel may be a microwell plate having a size of 350 ⁇ m ⁇ 350 ⁇ m to 450 ⁇ m ⁇ 450 ⁇ m per well.
  • the suspension culture is 0.5 ⁇ 10 5 to 1.5 ⁇ 10 5 per well in the multi-well culture vessel, preferably 0.7 ⁇ 10 5 to 1.3 ⁇ 10 5 , more preferably More specifically, it can be achieved by dispensing about 0.9 ⁇ 10 5 to 1.1 ⁇ 10 5 cells.
  • the step (1) may further include inducing cell aggregation through centrifugation during the suspension culture.
  • cell aggregation refers to the formation of a three-dimensional structure while self-aggregation of cells cultured in an environment such as a suspension culture in which three-dimensional growth is allowed rather than a monolayer. It means to form a cell cohesive mass.
  • Cell aggregates produced as a result of three-dimensional culture provide an environment similar to in vivo tissues from which stem cells are derived, and may be spherical or non-spherical depending on the size and number of self-assembled cells.
  • the microgravity of step (2) may be induced by a microgravity simulation device that cancels the gravitational force applied to the bioreactor by rotating the bioreactor.
  • microgravity means that gravity does not exist, exists only below a measurable level, or exists only to the extent that no biological or physiological effects due to gravity are observed. means an environment of 1 x 10 6 g or less. Therefore, the term “microgravity” can also be expressed as “zero gravity”.
  • microgravity simulator in the present invention refers to a device that induces a microgravity environment by artificially canceling gravity in a normal gravity environment or an environment in which significant gravity exists.
  • microgravity simulation devices include, for example, a Clinostat, a random positioning machine (RPM), a rotating wall vessel (RWV), and the like, but are not limited thereto, and culture in the bioreactor of the present invention through the addition of an appropriate external force Any device that can offset gravity for a specified amount of time in the environment can be used without limitation.
  • the microgravity simulator is a Clinostat.
  • the clinostat is coupled to a culture vessel such as a bioreactor and rotates while continuously changing direction randomly or according to a directed (input) pattern, constantly changing its three-dimensional posture, causing continuous fluctuations in the direction of gravity. It is a device that cancels gravity.
  • the step (2) may be performed by culturing for 3 to 8 days while rotating the microgravity simulation device at 15 to 80 rpm, preferably 40 to 80 rpm, more preferably 4 to 80 rpm. It can be cultured for 7 days, more preferably for 5 days.
  • the step (2) may be performed by rotating the microgravity simulator while increasing it by 5 rpm every day starting at 40 to 60 rpm. More preferably, it can be cultured for 5 days, starting at 50 rpm and increasing by 5 rpm every day.
  • biological sample culture device refers to a biological sample culture device or system including a culture space for creating a culture environment having biological activity and a series of mechanical devices operating in conjunction therewith. do.
  • spheroids are formed by three-dimensionally culturing the embryoid body produced in step (1) in a bioreactor under micro-gravity.
  • a spheroid refers to a spherical cell aggregate, but does not have to be a perfect sphere geometrically.
  • the spheroids formed through this can be differentiated into mesenchymal stem cells by attaching and culturing the culture vessel coated with an adhesive polymer. .
  • polymer refers to a synthetic or natural polymer compound in which identical or different types of monomers are continuously bonded.
  • polymers include homopolymers (polymers of one type of monomer polymerized) and interpolymers prepared by polymerization of at least two different monomers, and interpolymers include copolymers (polymers of two different types of monomers). polymers) and polymers made from more than two different monomers.
  • adheresive polymer refers to the formation of cross-links through covalent or non-covalent bonds between a culture surface and cells or aggregates thereof (eg, spheroids) so that cells or aggregates thereof do not escape from the bottom or side of the culture vessel. It refers to a natural or artificial polymer that allows culture to proceed without being attached.
  • the adhesive polymer is hyaluronic acid, alginate, heparin, fucoidan, cellulose, dextran, chitosan, albumin ( albumin), fibrin, collagen, and gelatin, and preferably gelatin.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention show clear differences in gene marker expression characteristics compared to conventional mesenchymal stem cell endoplasmic reticulum, in particular, normal hWJ-MSC (control group).
  • control group normal mesenchymal stem cell endoplasmic reticulum
  • the expression level of one or more markers selected from SPP1, PLAU, ITGA6, CENPI and BUB1 was significantly increased in the mesenchymal stem cells of the present invention compared to normal hWJ-MSC (control group), The expression level of the PTGS2 marker is significantly decreased.
  • Another aspect of the present invention relates to a composition for preventing or treating inflammatory diseases or autoimmune diseases comprising the mesenchymal stem cells or extracellular vesicles isolated therefrom as an active ingredient.
  • extracellular vesicle refers to a lipid bilayer structured vesicle with a diameter in the range of 30-1,000 nm that is secreted into the extracellular environment through fusion of the polycystic body and the plasma membrane in various cells.
  • the extracellular vesicles of the present invention may be separated from the mesenchymal stem cell culture medium through a plurality of times of centrifugation.
  • the extracellular vesicles of the present invention have an average diameter of 100 - 250 nm, more specifically 150 - 220 nm, more specifically 180 - 200 nm, more specifically 185 - 195 nm have an average diameter. Extracellular vesicles having a fine diameter in this range are called exosomes.
  • prevention means suppressing the occurrence of a disease or disease in a subject who has never been diagnosed with the disease or disease, but is likely to suffer from such disease or disease.
  • the term “treatment” refers to (a) inhibition of the development of a disease, disorder or symptom; (b) alleviation of the disease, condition or symptom; or (c) eliminating the disease, disorder or condition.
  • the compositions of the present invention serve to suppress, eliminate or alleviate the development of symptoms of various inflammatory or autoimmune diseases caused by excessive or unwanted immune responses by efficiently suppressing T cell-mediated immune activity. Therefore, the composition of the present invention may be a composition for treating these diseases by itself, or may be administered together with other pharmacological ingredients having a therapeutic effect on inflammatory or autoimmune diseases and applied as a therapeutic adjuvant for these diseases. Accordingly, the term “treatment” or “therapeutic agent” in the present specification includes the meaning of "therapeutic aid” or "therapeutic aid”.
  • the term “administration” refers to directly administering a therapeutically effective amount of the composition of the present invention to a subject so that the same amount is formed in the body of the subject, and has the same meaning as “implantation” or “infusion”. .
  • the term "therapeutically effective amount” refers to an amount of the composition contained in an amount sufficient to provide a therapeutic or prophylactic effect to a subject to whom the composition of the present invention is to be administered, and thus “prophylactically effective amount” meaning to include
  • the term “subject” includes, without limitation, human, mouse, rat, guinea pig, dog, cat, horse, cow, pig, monkey, chimpanzee, baboon or rhesus monkey. Specifically, the subject of the present invention is a human.
  • the composition of the present invention has a preventive or therapeutic effect on various inflammatory diseases.
  • Inflammatory diseases to which the pharmaceutical composition of the present invention can be applied are not particularly limited as long as they are known as inflammatory diseases in the art.
  • Autoimmune diseases or inflammatory diseases prevented or treated by the pharmaceutical composition of the present invention are, for example, rheumatoid arthritis, reactive arthritis, type 1 diabetes, type 2 diabetes, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, idiopathic fibrosing alveolitis, polymyositis , dermatomyositis, localized dermatosclerosis, systemic scleroderma, colitis, inflammatory bowel disease, Sjorgen's syndrome, Raynaud's phenomenon, Bechet's disease, Kawasaki's disease, primary biliary including primary biliary sclerosis, primary sclerosing cholangitis, ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) and
  • the cystitis prevented or treated with the pharmaceutical composition of the present invention may be at least one selected from interstitial cystitis, chronic cystitis and ketamine-induced cystitis, preferably interstitial cystitis.
  • the mesenchymal stem cell of the present invention when the mesenchymal stem cell of the present invention, or its culture medium, or the extracellular vesicles isolated therefrom are administered to an anti-inflammatory cell model, the concentrations of TNF- ⁇ and IL-6 are markedly increased. Since the decrease, it was specifically confirmed that the anti-inflammatory treatment effect was excellent.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention are administered to an in vivo interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS) animal model, the bladder inner wall collapsed during the IC/BPS induction process is restored, , the degree of inflammation was alleviated, etc., and it was specifically confirmed that it showed excellent therapeutic efficacy for interstitial cystitis/bladder pain syndrome.
  • IC/BPS interstitial cystitis/bladder pain syndrome
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include the mesenchymal stem cells or extracellular vesicles isolated therefrom alone, or may further include one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or diluents. there is.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may further include, for example, a carrier for oral administration or a carrier for parenteral administration.
  • Carriers for oral administration may include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like.
  • the carrier for parenteral administration may include water, suitable oil, saline, aqueous glucose and glycol, and the like, and may further include a stabilizer and a preservative.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium bisulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, and the like in addition to the above components.
  • a lubricant for example, a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, and the like in addition to the above components.
  • composition of the present invention can be administered to mammals including humans by any method.
  • parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous administration, intramuscular administration, intraarterial administration, intramedullary administration, intrathecal administration, suprachoroidal injection, transdermal administration, subcutaneous administration, intraperitoneal It may be administration, intranasal administration, enteral administration, topical administration, sublingual administration or intrarectal administration, preferably intravenous administration.
  • composition of the present invention may be formulated into a preparation for oral administration or parenteral administration according to the administration route as described above.
  • composition of the present invention may be formulated into powders, granules, tablets, pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions, etc. using a method known in the art.
  • preparations for oral use may be obtained by combining the active ingredient with a solid excipient, which is then milled and, after adding suitable auxiliaries, processed into a mixture of granules to obtain tablets or dragees.
  • excipients examples include sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol, starches including corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch, cellulose, Celluloses including methyl cellulose, sodium carboxymethylcellulose and hydroxypropylmethyl-cellulose, and the like, fillers such as gelatin, polyvinylpyrrolidone, and the like may be included. In addition, cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate may be added as a disintegrant, if desired. Furthermore, the pharmaceutical composition of the present invention may further include an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifier, and a preservative.
  • sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol,
  • preparations for parenteral administration they may be formulated in the form of injections, ointments, creams, lotions, oils, gels, aerosols and nasal inhalations by methods known in the art. These formulations are described in Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour, which is a generally known formula for all pharmaceutical chemistry.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in any one form selected from the group consisting of oral preparations, injections and ointments, more preferably injections.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the mesenchymal stem cells or the extracellular vesicles isolated therefrom in an effective amount, desirable effects of preventing, ameliorating or treating inflammatory diseases can be provided.
  • the term 'effective amount' refers to an amount that exhibits a higher response than that of the negative control group, and preferably refers to an amount sufficient to improve or treat inflammatory diseases, particularly interstitial cystitis.
  • the mesenchymal stem cells are 5 X 10 4 to 2 X 10 5 cell/ml, preferably 7.5 X 10 4 to 1.5 X 10 5 cell/ml, more preferably 8 X 10 4 to the total content of the pharmaceutical composition.
  • 1.2 X 10 5 cells/ml may be included.
  • the extracellular vesicles isolated from the mesenchymal stem cells of the present invention are 5x10 8 to 5x10 10 particles/ml, preferably 5x10 9 to 5x10 10 particles/ml, more preferably 1x10 10 to 2x10 10 particles/ml. can be included At this time, if the content of the stem cell-derived extracellular vesicles is less than the lower limit, the cell viability is excellent, but the effect of improving or treating inflammatory diseases may not appear to a desired extent. Conversely, when the concentration exceeds the upper limit, the improvement or treatment effect of inflammatory diseases does not increase as much as the concentration increases, or toxicity may occur.
  • An effective amount of mesenchymal stem cells or extracellular vesicles isolated from the mesenchymal stem cells included in the pharmaceutical composition of the present invention will vary depending on the form in which the composition is formulated.
  • the total effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to the patient in a single dose, or may be administered by a fractionated treatment protocol in which multiple doses are administered over a long period of time.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient according to the severity of the disease.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention will be variously prescribed depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, morbid condition, food, administration time, route of administration, excretion rate and reaction sensitivity.
  • a preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is within the range of 0.001-100 mg/kg for adults.
  • compositions for wound healing comprising the mesenchymal stem cells or extracellular vesicles isolated therefrom as an active ingredient.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention Since the mesenchymal stem cells of the present invention, the extracellular vesicles isolated therefrom, the pharmaceutical composition, and the effective amount have already been described above, the description thereof is omitted to avoid excessive redundancy.
  • Mesenchymal stem cells of the present invention or extracellular vesicles isolated therefrom, remarkably increase cell migration and have excellent wound healing effects, so they can be usefully used for wound healing.
  • Another aspect of the present invention relates to a therapeutic use of the mesenchymal stem cells, or extracellular vesicles isolated therefrom.
  • the therapeutic use may be for the treatment of an inflammatory disease or an autoimmune disease, preferably an inflammatory disease.
  • the inflammatory disease or autoimmune disease is cystitis, rheumatoid arthritis, reactive arthritis, type 1 diabetes, type 2 diabetes, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, idiopathic fibrosing alveolitis, polymyositis, dermatomyositis, localized scleroderma, systemic skin Sclerosis, colitis, inflammatory bowel disease, Sjorgen's syndrome, Raynaud's phenomenon, Bechet's disease, Kawasaki's disease, primary biliary sclerosis, primary sclerosing cholangitis (primary sclerosing cholangitis), ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) or Crohn's disease.
  • cystitis cystitis, rheumatoid arthritis, reactive arthritis, type 1 diabetes, type 2 diabetes, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, idiopathic fibrosing alve
  • the cystitis may be at least one selected from interstitial cystitis, chronic cystitis, and ketamine-induced cystitis.
  • another aspect of the present invention is the step of administering the mesenchymal stem cells, or extracellular vesicles isolated therefrom, to a subject in need; prevention, improvement or prevention of inflammatory diseases or autoimmune diseases, including It is about treatment methods.
  • the “subject” refers to a mammal that is a subject of prevention, improvement, treatment, observation, or experimentation, and is preferably a human or mammal in need of prevention, improvement, and/or treatment of an inflammatory disease or an autoimmune disease.
  • Single colonies were generated by culturing induced pluripotent stem cells (iPSC) in an iPSC medium in which single cells were attached to a 96-well plate coated with Matrigel (354234, Corning, USA) for one week. Each colony generated was passaged in order in Matrigel-coated 24-well dishes and 6-well dishes, and when the cell number increased to about 1 X 10 5 , it was used for spheroid experiments (FIG. 1).
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • iPSCs were seeded on an Aggrewell plate (34460, stemcell, Canada) at 1 X 10 5 , centrifuged at 300 g for 5 minutes to aggregate the cells, and cultured for 24 hours in a 5% CO 2 incubator to obtain embryoid bodies (EB). ) was created. After 24 hours, the generated EB was carefully transferred into a bioreactor (Bioreactor, CelVivo, Denmark), and the bioreactor was rotated for 5 days after being attached to a BAM system (CelVivo, Denmark), a microgravity device. During rotation, it was initially started at 50 rpm and increased by 5 rpm daily (Fig. 1).
  • iPSC-MSC induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells
  • the spheroids grown in the BAM system were transferred to a 6-well culture dish coated with 0.1% gelatin and cultured in a medium supplemented with 10% FBS and 1% P/S in DMEM/F12, and the medium was replaced every 2-3 days.
  • the first passage was named P0, and passage was performed until the cell shape became homogenous.
  • iPSCMSCs prepared from iPSC spheroids were seeded at a concentration of 1 x 10 5 in confocal dishes (101350, SPL, Korea) and then fixed with 4% PFA at 60-70% confluency.
  • the immobilized spheroids and iPSC-MSC were washed with DPBS three times for 5 minutes, and then the surface was permeabilized with 0.3% Triton X-100 so that the antibody could penetrate well. After that, it was washed with water three times for 5 minutes with DPBS.
  • Washed spheroids were incubated at room temperature for 1 hour with 3% BSA/PBS for blocking. After 1 hour, 3% BSA/PSB was removed, and primary antibodies (1:200), Anti-OCT4, Anti-SSEA4, and Anti-PDGFR ⁇ , were added and allowed to react in a refrigerator for 12 hours. After 12 hours, it was taken out to room temperature and washed with DPBS three times for 5 minutes each.
  • iPSC-MSCs were seeded in a 60 mm culture dish at a cell number of 2 x 10 5 , cultured for 5 days, and the medium was replaced once for 5 days.
  • Raw 264.7 cells which are macrophage cells used in an inflammatory cell model, were used.
  • Raw 264.7 cells were grown in ⁇ -MEM (Minimum Essential Medium) medium containing 10% FBS and 1% P/S.
  • ⁇ -MEM Minimum Essential Medium
  • hWJ-MSC control group
  • iPSC-MSC invention
  • a new medium is supplied and cultured for 48 hours.
  • the conditioned medium was collected, filtered using a 0.20 ⁇ m syringe filter, and stored in a refrigerator at 4° C.
  • Raw 264.7 cells were inoculated by dividing the cells into a 6-well culture dish at a cell number of 3.75 X 10 5 per well. After 12 hours, when the cells were attached, the prepared conditioned medium was replaced with 100%. After another 12 hours, as shown in FIG. 9 , all groups including the condition medium group except for the control group were treated with 200 ng/ml of LPS (lipopolysaccharide, Sigma, USA). As a positive control, DEX (Dexamathasone, Peprotech, USA) was treated with 1 uM. After 7 hours, images were recorded, cells were fixed with 4% PFA, and immunocytochemical staining was performed.
  • LPS lipopolysaccharide
  • RNA from Raw264.7 cells was extracted using the Labo Pass Kit, TRIzol (Cosmogenetech, Seoul, Korea) according to the manufacturer's manual. The concentration of total RNA was measured with a Nanodrop (ND1000) spectrophotometer (Nanodrop Technologies Inc., Wilmington DE, USA). cDNA was synthesized using 2 ⁇ g of total RNA and M-MLV reverse transcriptase (Promega) according to the manufacturer's manual. The RT-PCR reaction was analyzed on a 2% agarose gel after completion. The sequences of the primers used are listed in Table 1:
  • the fixed cells were washed twice with PBS.
  • Cell nuclei were infiltrated with 0.3% Triton X-100 for 10 minutes, washed with PBS, and allowed to stand at room temperature for 1 hour with 10% normal goat serum to block non-specific antibody binding.
  • TRAP mouse monoclonal antibody (Santa Cruz, USA) at 4°C for 12 hours, the cells were washed three times with DPBS, and Alexa-488 conjugated goat anti-Alexa-488 conjugated goat antibody as the secondary antibody for 1 hour at room temperature. It was reacted with the mouse antibody at room temperature for 1 hour.
  • new DMEM-F12 media (D8437, Sigma) (including 10% exosome depletion FBS and 1% P/S) was replaced with After 48 hours, the conditioned medium was collected in a 50 ml tube and centrifuged at 300 g for 3 minutes. After centrifugation, it was transferred to a new 50 ml tube (50050, SPL), and then centrifuged at 4° C. at 2,000 g for 10 minutes. After centrifugation, it was transferred to a new 50 ml tube and centrifuged at 10,000 g at 4° C. for 30 minutes.
  • exosomes obtained above were diluted 500 to 2000 times with 0.2 um filtered 1x PBS, and then the size and concentration (particles/ml) of the exosomes were measured using NTA equipment (Zetaview).
  • NHDF cells were plated in a 6-well plate (30006, SPL) at 2.5E +05 cells/well were seeded and incubated to about 100% confluency.
  • dilute Mitomycin C M4287, Sigma-Aldrich
  • SFM serum free medium
  • penicillin streptomycin 1514-163, gibco
  • DMEM high glucose D6429, sigma
  • Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells (ATCC:PCS-500-010) and the iMSC cells of the present invention were provided to LAS (LAS, Gimpo, Korea) in a pellet state RNA was isolated, and after conducting the QC test, Vocano plot data were obtained through Microarray analysis. Through the Vocano plot, it was confirmed that there were 183 up-regulated genes and 322 down-regulated genes.
  • each gene received data predicting the main function (role) of the gene through DAVID analysis. The analyzed data was first analyzed (https://string-db.org/) network using the database-based String-db tool to find out the Protein-Protein Interaction of each gene. The main functions of the genes predicted by the DAVID analysis were found by using the Venn Diagram (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/) to find overlapping gene functions.
  • Interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS) induced mouse model Interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS) induced mouse model
  • mice 8-week-old BALB/cAnNCrlOri female mice were received and allowed to adapt for 2 weeks.
  • a catheter 382412, BD was inserted into the urethra to remove urine from the inside of the bladder, and washed with 50 ul of PBS.
  • 5 mg/ml Protamine sulfate P3369, Sigma
  • LPS 30 ug/ml L4391, Sigma
  • mice After confirming the recovery of the mice on the hot plate, they were bred for one week. This process was repeated 4 times to derive a mouse IC/BPS model.
  • the mouse was anesthetized in the same way, and the lower abdomen was incised, and the iMSC of the present invention was suspended in PBS (10 ul) at a cell number of 1 ⁇ 10 5 and injected into the surface of the bladder. After suturing the lower abdomen and confirming recovery from anesthesia, breeding was performed. After one week, the mouse was anesthetized, and the bladder was removed and used for the experiment. RNA was extracted from some bladders after homogenization, and the morphology and degree of inflammation of some bladders were confirmed through tissue sectioning and staining.
  • RNA pellet was washed with 75% EtoH, centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes, and RNA was resuspended in DEPC.
  • cDNA was synthesized using rTaq Plus 5x PCR master mix (EBT-1319, ELPISBIO), and gene expression was performed using HiPi Real-Time PCR 2x Master Mix (SYBR green, ROX) (EBT-1802, ELPISBIO). The amount was confirmed (7500, Amersham Phamacia Biotech).
  • the spheroids were stained with the pluripotency marker OCT4, they were stained green, and when the nuclei were stained with DAPI, it was confirmed that the nuclei were specifically stained green and blue. It can be seen that OCT4 is expressed in the nucleus, and it can be seen that iPSC-derived spheroids maintain pluripotency (FIG. 3).
  • iPSC-MSC cells were spindle-shaped from P5 and could be passaged until P13 (FIG. 5). After that, the cells made a stock solution and stored in LN 2 . Cell proliferation curves were compared with hWJ-MSC and AD-MSC as control groups. As a result, AD-MSC cells increased until P9 and then decreased, and hWJ-MSC cells proliferated steadily even at P13. iPSC-MSCs had significantly higher CPD and cumulative cell numbers than the control group, and the doubling time was faster than that of the control group (FIG. 6).
  • iPSC-MSCs were positive for anti-CD73 and anti-CD90, and negative for anti-CD34 and anti-CD45, compared to AD-MSC as a control group (FIG. 7).
  • iPSC-MSCs prepared through the BAM system had clear characteristics of mesenchymal stem cells.
  • iPSC-MSC cells were subjected to ICC using the pluripotency markers OCT4 and SSEA4 and the mesenchymal stem cell marker PDGFR ⁇ .
  • OCT4 and SSEA4 pluripotency markers
  • PDGFR ⁇ mesenchymal stem cell marker
  • the experiment was performed according to the schematic diagram of the experimental procedure for confirming the anti-inflammatory effect of stem cells (FIG. 9).
  • the inflammation test in the LPS group in which inflammation was induced by treating Raw 264.7 cells with LPS, giant multinucleated cells could be observed. Multinucleated cells were not observed in the test group (LPS+hWJ-MSC CM) treated with the conditioned medium of -MSC and the test group (LPS+iMSC CM) treated with the conditioned medium of iMSC (FIG. 10).
  • the expression of IL-6 was highest in the LPS group, and the test group treated with the conditioned medium of hWJ-MSC together with LPS treatment (LPS+hWJ- In the test group (LPS+iMSC CM) treated with MSC CM) and iMSC conditioned medium, it was confirmed that the expression of IL-6 was significantly reduced compared to the LPS group (FIG. 10). On the other hand, the expression of IL-6 was significantly lowered in the positive control group (LPS+DEX) treated with DEX along with LPS treatment.
  • the presence or absence of multinucleated cells was confirmed using TRAP antibody for each test group.
  • Multinucleated cells are produced as cells gather during an inflammatory reaction, and the presence or absence of inflammation can be confirmed through the presence or absence of multinucleated cells.
  • the ratio of TRAP-stained cells was very high in the LPS group.
  • the test group LPS + iMSC CM treated with TRAP, there were significantly fewer TRAP positive cells than the LPS group (FIG. 11).
  • the size of the particles of exosomes isolated from iPSC-MSC of the present invention corresponds to about 100 nm, and the exosomes isolated from WJ-MSC It was found that the total number of particles was about 4 times higher than that of moths (FIG. 12).
  • SPP1 secreted phosphoprotein 1; Osteopontin
  • PLAU Plasminogen Activator, Urokinase
  • ITGA6 integrated subunit alpha 6
  • CENPI Cyentromere Genes such as Protein I
  • BUB1 Budding Uninhibited By Benzimidazoles 1 Homolog; Mitotic checkpoint serine/threonine-protein kinase
  • SPP1 increased by approximately 3.0-4.0-fold, specifically 3.50-4.00-fold, more specifically 3.80-3.90-fold compared to the control group (hWJ-MSC), and the expression of PLAU increased by approximately 1.5-2.2 fold. fold, specifically 1.80-2.10-fold, more specifically 1.90-2.00-fold increase in weight, and the expression of ITGA6 was approximately 2.1-3.0-fold, specifically 2.30-2.60-fold, more specifically 2.40-fold fold to 2.50 fold, the expression of CENPI increased approximately 1.5 fold to 2.0 fold, specifically 1.60 fold to 1.90 fold, more specifically 1.70 fold to 1.80 fold, and the expression of BUB1 approximately 1.4 fold. to 2.1 times, specifically 1.50 times to 1.90 times, more specifically 1.65 times to 1.75 times.
  • CENPI As a receptor for laminin in epithelial cells, it plays an important structural role in the hemidesmosome, CENPI is involved in the response of gonads to follicle-stimulating hormone, and BUB1 is known to play an important role in mitotic spindle checkpoints and chromosome aggregation.
  • PTGS2 Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2, or COX2;
  • COX2 Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2, or COX2;
  • the difference in expression of the PTGS2 gene in the volcano plot is as follows.
  • the expression of PTGS2 decreased by approximately 2.0 to 3.0 times, specifically 2.30 to 2.90 times, and more specifically 2.50 to 2.70 times compared to the control group (hWJ-MSC).
  • hWJ-MSC control group
  • the iMSCs of the present invention have differentiated efficacy from the conventional hWJ-MSCs due to the difference in gene expression.
  • Interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS) induced mouse model Interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS) induced mouse model
  • the group treated with iMSC of the present invention showed a significant decrease in the degree of fibrosis (%) and penetration of mast cells by about 50%. Compared to, it can be seen that it is more effective in preventing, improving or treating inflammation.
  • iMSCs of the present invention can be usefully used for the treatment of bladder pain syndrome (BPS) such as interstitial cystitis (IC).
  • BPS bladder pain syndrome
  • IC interstitial cystitis

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Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포, 이로부터 분리된 세포외 소포체, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 중간엽 줄기세포는 SPP1, PLAU, ITGA6, CENPI 및 BUB1 중에서 선택되는 1종 이상의 마커의 발현량의 증가 및/또는 PTGS2 마커의 발현량의 감소 특성을 나타냄으로써, TNF-α, IL-6 등의 염증성 사이토카인의 양을 현저히 감소시키므로, 다양한 염증 질환의 예방, 완화, 개선 또는 치료에 효과적이다. 특히, 본 발명의 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 줄기세포 유래 세포외 소포체는 간질성 방광염/방광통증 증후군(IC/BPS) 동물모델에 투여하는 경우, IC/BPS 유도 과정에서 무너진 방광 내벽을 회복시키고, 염증 정도를 완화시키므로, 간질성 방광염/방광통증 증후군에 대하여 우수한 치료 효능이 있다. 또한, 본 발명의 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 줄기세포 유래 세포외 소포체는 상처 치유 효과가 우수하므로, 상처치유용으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

중간엽 줄기세포, 이로부터 분리된 세포외 소포체, 및 이들의 용도
본 발명은 중간엽 줄기세포, 이로부터 분리된 세포외 소포체, 및 이들의 용도에 관한 것이다.
일반적으로 염증반응은 생체의 세포나 조직에 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 및 재생하기 위한 생체방어 반응과정이고, 이 반응과정에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포 및 면역세포 등이 작용한다. 정상적으로 외부 침입균에 의하여 유도되는 염증반응은 생체를 보호하기 위한 방어 시스템인 반면, 비정상적으로 과도한 염증반응이 유도되면 다양한 질환들이 나타나게 되는데, 이러한 질환들을 염증질환이라 총한다. 상기 염증질환은 외부자극에 의하여 활성화된 표적세포로부터 분비되는 다양한 염증 매개물질이 염증을 증폭 및 지속시켜 인체의 생명을 위협하는 질환으로서 급성염증, 방광염과 같은 방광 내에서의 질환, 류마티스관절염과 같은 관절 내에서의 질환, 건선 등의 형태로 나타나는 피부질환 및 기관지 천식 등의 알러지성 염증질환 등을 포함한다.
특히, 간질성 방광염(IC)은 통증, 예를 들면 골반통의 증후, 및 하부 요로 증후군(LUTS), 예를 들면 증가된 빈뇨/절박뇨를 특징으로 하는, 원인이 밝혀지지 않은 만성 방광 질환이다. 보다 최근의 용어는 이 복합 증후를 집합적으로 개시하기 위해 IC와 함께 통증성 방광 증후군(PBS)([MacDiarmid SA et al. Rev Urol 2007; 9(1): 9-16]) 또는 방광 통증 증후군(BPS)([(van der Merve et al. European Urology 53(2008) 60-67])를 포함하는 것으로, 즉 IC/BPS 또는 IC/PBS/BPS로 변화되고 있다.
IC/PBS/BPS의 유병률은 임상적으로 확인된 질병을 갖는 100,000명의 여성당 67 내지 230명으로 다양하며, 흔히 자궁내막염, 재발성 요로 감염, 과민성 방광 또는 외음부 통증으로 잘못 진단되거나 저진단되기 때문에 이 수치는 아마도 더 높을 것이다(Forrest J B et al. Clinical Courier 2006; 24(3):1-8). IC는 삶의 질에 상당한 영향을 미치고, 여행, 가족관계 및 활동에 영향을 미치고(Slade D et al. Urol 1997; 49 (5A Suppl):10-3), 또한 우울성 증후군과 관련되어 있다(Rothrock N E et al. J Urol 2002; 167: 1763-1767).
상기 IC/PBS/BPS는 단일한 병인이 확인되지 않았고, 주로 통각과민, 만성 방광 통증 및 배뇨 장애를 일으킨다(Forrest J B et al. Clinical Courier 2006; 24(3):1-8).
한편, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 중간엽 조직 계통으로 분화하는 능력을 가진 다분화능 전구세포이다. 이 세포는 다양한 세포에서 적응 및 선천성 면역 반응을 조절하여 잠재적인 면역 조절 효과를 매개할 수 있어, 자가면역 질환을 치료하기 위한 새로운 대안으로 떠오르고 있다. 또한 면역억제 및 항염증 효과(유럽등록특허 제02298861호, 미국공개특허 제2012-0269774호)를 가질 뿐만 아니라 T 세포의 활성화 및 증식을 억제하는 것으로 알려져 있다(Li ZJ et al., PloS ONE 8(10): 77159, 2013).
그러나, 종래에는 MSC의 일반적인 항염증 효과에 대해서만 공지되어 있을 뿐, 염증 관련 질환에 대하여 더욱 강력한 효과를 갖도록 최적화된 MSC 줄기세포 치료제는 아직까지 개발이 미진한 실정이다. 따라서 염증성 질환의 예방 또는 치료에 적합한 MSC 치료제 개발이 절실히 요구된다.
이에 본 발명자들은 염증 관련 질환에 대하여 더욱 강력한 효과를 갖도록 최적화된 MSC 줄기세포에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 중간엽 줄기세포(MSC)에서 SPP1, PLAU, ITGA6, CENPI 및 BUB1 중에서 선택되는 1종 이상의 마커의 발현량의 증가하고, PTGS2 마커의 발현량의 감소하면 간질성 방광염을 포함한 다양한 염증 질환의 예방, 완화, 개선 또는 치료에 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 간질성 방광염을 포함한 다양한 염증 질환의 예방, 완화, 개선 또는 치료에 효과적인 중간엽 줄기세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증 질환 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 상처치유용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (A) SPP1, PLAU, ITGA6, CENPI 및 BUB1 중에서 선택되는 1종 이상의 마커의 발현량의 증가; 및 (B) PTGS2 마커의 발현량의 감소; 중에서 선택되는 1종 이상의 특성을 나타내는 중간엽 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 중간엽 줄기세포는 SPP1, PLAU, ITGA6, CENPI 및 BUB1 마커의 발현량이 증가하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 중간엽 줄기세포는 (1) 대상체로부터 분리된 전분화능 줄기세포를 배양하여 배아체(Embryoid Body, EB)를 형성하는 단계; (2) 상기 배아체를 미세중력(microgravity) 하의 생물반응기(bioreactor)에서 3차원 배양하여 스페로이드(spheroid)를 형성하는 단계; 및 (3) 상기 스페로이드를 배양 표면에 점착성 고분자가 코팅된 배양 용기에서 부착 배양하여 중간엽 줄기세포로 분화시키는 단계;를 포함하는 방법으로 제작된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 전분화능 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell, ESC) 또는 유도만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell, iPSC)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 전분화능 줄기세포는 유도만능 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 단계 (1)은 상기 전분화능 줄기세포를 다중 웰(multi-well) 배양 용기에서 3차원 배양함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 단계 (1)은 상기 3차원 배양 시 원심 분리를 통해 세포 응집을 유도하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 단계 (2)의 미세중력은 상기 생물반응기를 회전시킴으로써 상기 생물반응기에 가해지는 중력을 상쇄시키는 미세중력 모사장치에 의해 유도될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 단계 (2)는 상기 미세중력 모사장치를 15 내지 80rpm으로 회전시키면서 3 - 8일 간 배양함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 단계 (2)는 상기 미세중력 모사장치를 40 내지 60rpm에서 시작하여 매일 5rpm씩 증가시키면서 회전시킴으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 점착성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 알긴산(alginate), 헤파린(heparin), 후코이단(fucoidan), 셀룰로스(cellulose), 덱스트란(dextran), 키토산(chitosan), 알부민(albumin), 피브린(fibrin), 콜라겐(collagen) 및 젤라틴(gelatin) 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 점착성 고분자는 젤라틴일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 염증 질환 또는 자가면역 질환은 방광염, 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 다발성경화증, 특발성섬유성폐포염, 다발성근염, 피부근염, 국한피부경화증, 전신피부경화증, 대장염, 염증성 장질환, 조르젠신드롬(Sjorgen's syndrome), 레이노현상(Raynaud's phenomenon), 베쳇병(Bechet's disease), 가와사키병(Kawasaki's disease), 원발성담즙성경화증(primary biliary sclerosis), 원발성경화성담관염(primary sclerosing cholangitis), 궤양성대장염(ulcerative olitis), 이식편대숙주병(Graft-versus-host disease, GVHD) 또는 크론병(Crohn's disease)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 방광염은 간질성 방광염(Interstitial Cystitis), 만성 방광염 및 케타민 유발 방광염 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 상처치유용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 중간엽 줄기세포는 SPP1, PLAU, ITGA6, CENPI 및 BUB1 중에서 선택되는 1종 이상의 마커의 발현량의 증가 및/또는 PTGS2 마커의 발현량의 감소 특성을 나타냄으로써, TNF-α, IL-6 등의 염증성 사이토카인의 양을 현저히 감소시키므로, 다양한 염증 질환의 예방, 완화, 개선 또는 치료에 효과적이다.
특히, 본 발명의 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 줄기세포 유래 세포외 소포체는 간질성 방광염/방광통증 증후군(IC/BPS) 동물모델에 투여하는 경우, IC/BPS 유도 과정에서 무너진 방광 내벽을 회복시키고, 염증 정도를 완화시키므로, 간질성 방광염/방광통증 증후군에 대하여 우수한 치료 효능이 있다.
또한, 본 발명의 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 줄기세포 유래 세포외 소포체는 상처 치유 효과가 우수하므로, 상처치유용으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 iPSC로부터 MSC를 분화시키는 본 발명의 프로토콜을 요약한 모식도를 나타낸다.
도 2는 Aggrewell 상에서 형성된 배아체(EB)의 형태를 보여주는 그림이다.
도 3은 미세중력 생물배양기인 BAM(Bio Array Matrix) 장치를 통해서 형성된 스페로이드의 형태(상단)와 OCT4 및 DAPI 항체를 이용한 염색 결과(하단)를 보여주는 그림이다.
도 4는 스페로이드에서 유래한 중간엽 줄기세포의 외형을 보여주는 그림으로, 계대 후 방추(spindle) 형태를 띔을 확인하였다(우측).
도 5는 본 발명의 방법으로 분화된 iMSC의 각 계대에서의 외형을 보여주는 그림이다.
도 6은 본 발명의 방법으로 분화된 중간엽 줄기세포의 누적 세포 증식 곡선을 보여주는 그림으로, 각 계대별 CPD(Cummulative Population Doubling)(도 6a), 2배수 시간(Doubling time)(도 6b), 및 Log 세포 수(도 6c)를 각각 나타낸다.
도 7은 본 발명의 방법으로 분화된 중간엽 줄기세포의 세포 표면 마커 발현을 FACS 분석으로 확인한 결과를 보여주는 그림이다.
도 8은 면역세포화학 염색을 이용하여 본 발명의 방법을 통해 유도만능 줄기세포가 전능성을 상실하고 중간엽 줄기세포의 마커를 발현하는 세포로 분화되었음을 확인한 결과를 보여주는 그림이다.
도 9는 LPS를 이용한 염증 유도 세포에서 본 발명의 방법으로 분화된 줄기세포의 염증제어 효과를 확인한 실험 절차의 모식도를 보여주는 그림이다.
도 10은 RT-PCR을 통해 염증 마커의 발현을 확인한 결과를 보여주는 그림이다.
도 11은 면역세포화학 염색을 이용하여 LPS 처리에 의해 염증이 유도된 세포를 TRAP 염색한 결과(좌측), 및 상기 TRAP으로 염색된 세포를 계수한 결과(우측)를 보여주는 그림이다.
도 12는 본 발명의 중간엽 줄기세포에서 분리한 엑소좀의 크기(좌측) 및 농도(우측)를 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 13a는 본 발명의 중간엽 줄기세포에서 분리한 엑소좀을 Scrach한 NHDF 세포에 처리한 후 시간 경과에 따른 세포 이동 정도를 보여주는 사진이고, 도 13b는 상기 세포 이동 정도를 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 14a는 본 발명의 중간엽 줄기세포에 함유된 각각의 상향 조절 유전자들의 Protein-Protein Interaction을 알기 위해 데이터베이스 기반인 String-db tool을 이용하여 네트워트 분석한 결과이고, 도 14b는 하향 조절 유전자들을 네트워크 분석한 결과를 보여주는 그림이다.
도 15a 내지 도 15d는 본 발명의 중간엽 줄기세포에 포함된 각각의 상향 조절 유전자들에 대하여 각각 DAVID 분석을 수행하여 예측되는 기능들을 이용하여 생성한 벤다이어그램이다.
도 16a 내지 도 16d는 본 발명의 중간엽 줄기세포에 포함된 각각의 하향 조절 유전자들에 대하여 각각 DAVID 분석을 수행하여 예측되는 기능들을 이용하여 생성한 벤다이어그램이다.
도 17a는 간질성 방광염/방광통증 증후군(IC/BPS) 유도 마우스 모델에서 본 발명의 중간엽 줄기세포(iMSC) 투여 후 방광 조직의 형태 및 염증 정도를 확인한 그림이다. 도 17a는 IC/BPS 마우스 모델의 방광 조직을 각각 H&E 염색, masson’s trichome 염색 및 toluidine blue 염색한 결과이고, 도 17b는 상기 염색을 통해 Fibrosis 정도(%)와 Mast cell의 침투를 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 18은 간질성 방광염/방광통증 증후군(IC/BPS) 유도 마우스 모델에서 본 발명의 중간엽 줄기세포(iMSC) 투여 후 추출된 방광 조직에서 mRNA를 추출하여, 염증 관련 사이토카인(TNFα, IL6)의 발현량(도 18a), 요로상피 마커(UPK1A, UPK1B, UPK2)의 발현량(도 186b) 및 IC/BPS에서 발현되는 유전자(KLRB1, PSMB9, ITGAL)의 발현량(도 18c)을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 (A) SPP1(secreted phosphoprotein 1; Osteopontin), PLAU(Plasminogen Activator, Urokinase), ITGA6(integrin subunit alpha 6), CENPI(Centromere Protein I) 및 BUB1(Budding Uninhibited By Benzimidazoles 1 Homolog; Mitotic checkpoint serine/threonine-protein kinase) 중에서 선택되는 1종 이상의 마커의 발현량의 증가; 및 (B) PTGS2(Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2, or COX2;) 마커의 발현량의 감소; 중에서 선택되는 1종 이상의 특성을 갖는 중간엽 줄기세포에 관한 것이다.
본 발명에서의 용어, “발현량의 증가” 또는 “발현량의 감소”는 종래의 중간엽 줄기세포, 바람직하게는 일반 왓튼 젤리(Wharton’s Jelly) 유래 중간엽 줄기세포(hWJ-MSC)와 비교하여 중간엽 줄기세포가 발현하는 특정 마커의 발현량이 측정 가능할 정도로 유의하게 증가 또는 감소한 것을 의미하며, 구체적으로는 발현량이 40% 이상 증가 또는 감소한 것을 의미하고, 보다 구체적으로는 50% 이상 증가 또는 감소한 것을 의미하며, 보다 구체적으로는 60% 이상 증가 또는 감소한 것을 의미하며, 보다 더 구체적으로는 80% 이상 증가 또는 감소한 것을 의미하고, 가장 구체적으로는 100% 이상 증가 또는 감소한 것을 의미한다.
본 발명에서의 용어, “줄기세포(stem cell)”는 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포로서, 특정 분화 자극(환경) 하에서 특정 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지는 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있고, 분화 자극이 가해지면 자극의 성격에 따라 다양한 세포로 분화될 수 있는, 분화의 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
본 발명에서의 용어, “중간엽 줄기세포”는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포로의 분화가 가능한 다분화능(multipotency)을 가진 줄기세포를 의미한다. 중간엽 줄기세포는 소용돌이 모양의 형태와 기본적인 세포표면 표식자 CD73(+), CD105(+), CD34(-), CD45(-)의 발현 정도를 통하여 식별될 수 있으며, 다분화능과 함께 면역 반응을 조절하는 기능도 가진다.
본 발명의 중간엽 줄기세포는 SPP1에 대하여 종래의 중간엽 줄기세포, 바람직하게는 일반 hWJ-MSC(대조군)에 비해 적어도 3배 이상, 구체적으로는 3.0 내지 4.0배, 더욱 구체적으로는 3.50배 내지 4.00배, 더욱 구체적으로는 3.80 배 내지 3.90배 중량으로 발현량을 상향 조절, 또는 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 PLAU에 대하여 종래의 중간엽 줄기세포, 바람직하게는 일반 hWJ-MSC(대조군)에 비해 적어도 1.5배 이상, 구체적으로는 1.5배 내지 2.2배, 구체적으로는 1.80배 내지 2.10배, 더욱 구체적으로는 1.90배 내지 2.00배 중량으로 발현량을 상향 조절, 또는 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 ITGA6에 대하여 종래의 중간엽 줄기세포, 바람직하게는 일반 hWJ-MSC(대조군)에 비해 적어도 2.1배 이상, 구체적으로는 2.1배 내지 3.0배, 구체적으로는 2.30배 내지 2.60배, 더욱 구체적으로는 2.40배 내지 2.50배 중량으로 발현량을 상향 조절, 또는 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 CENPI에 대하여 종래의 중간엽 줄기세포, 바람직하게는 일반 hWJ-MSC(대조군)에 비해 적어도 1.5배 이상, 구체적으로는 1.5배 내지 2.0배, 구체적으로는 1.60배 내지 1.90배, 더욱 구체적으로는 1.70배 내지 1.80배 중량으로 발현량을 상향 조절, 또는 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 BUB1에 대하여 종래의 중간엽 줄기세포, 바람직하게는 일반 hWJ-MSC(대조군)에 비해 적어도 1.4배 이상, 구체적으로는 1.4배 내지 2.1배, 구체적으로는 1.50배 내지 1.90배, 더욱 구체적으로는 1.65 배 내지 1.75배 중량으로 발현량을 상향 조절, 또는 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 PTGS2에 대하여 종래의 중간엽 줄기세포, 바람직하게는 일반 hWJ-MSC(대조군)에 비해 적어도 2.0배 이상, 구체적으로는 2.0배 내지 3.0배, 구체적으로는 2.30배 내지 2.90배, 더욱 구체적으로는 2.50배 내지 2.70배 중량으로 발현량을 하향 조절, 또는 감소시킬 수 있다.
본 발명의 중간엽 줄기세포는 상기 SPP1, PLAU, ITGA6, CENPI 및 BUB1 중에서 선택되는 1종 이상의 마커의 발현량의 증가; 및/또는 상기 PTGS2 마커의 발현량의 감소 특성을 가짐으로써, TNF-α, IL-6 등의 염증성 사이토카인의 양을 현저히 감소시키고, 다양한 염증 질환, 바람직하게는 방광염, 특히 간질성 방광염을 예방, 완화, 개선 또는 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 세포의 이동(migration)을 현저히 증가시키며, 상처 치유 효과가 매우 우수하다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 SPP1, PLAU, ITGA6, CENPI 및 BUB1 마커의 발현량이 증가하는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 (1) 대상체로부터 분리된 전분화능 줄기세포를 배양하여 배아체(Embryoid Body, EB)를 형성하는 단계; (2) 상기 배아체를 미세중력(microgravity) 하의 생물반응기(bioreactor)에서 3차원 배양하여 스페로이드(spheroid)를 형성하는 단계; 및 (3) 상기 스페로이드를 배양 표면에 점착성 고분자가 코팅된 배양 용기에서 부착 배양하여 중간엽 줄기세포로 분화시키는 단계;를 포함하는 방법으로 제작된 것일 수 있다.
본 발명에서의 용어, “전능성 줄기세포(pluripotent stem cell)”는 수정란보다 발생이 진행된 상태의 세포로서 내배엽, 중간엽 및 외배엽을 구성하는 세포로 모두 분화할 수 있는 줄기세포를 의미한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 전능성 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell, ESC), 배아생식세포(Embryonic Germ Cell), 배아종양세포(Embryonic Carcinoma Cell) 또는 유도만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell, iPSC)이며, 보다 구체적으로는 배아줄기세포 또는 유도만능 줄기세포이며, 가장 구체적으로는 유도만능 줄기세포이다.
본 발명에서의 용어, “유도만능 줄기세포”는 비-전분화능 세포(예를 들면, 체세포)에 미분화 또는 전분화능 표현형과 관련된 특정 유전자를 삽입하여 인공적으로 유래된 전분화능 줄기세포의 하나이다. 유도만능 줄기세포는 줄기세포 유전자 및 단백질 발현, 염색체 메틸화, 배가시간(doubling time), 배아체 형성, 테라토마 형성, 생존성 키메라 형성, 교잡성 및 분화성을 가진다는 점에서 배아줄기세포와 같은 천연의 전분화능 줄기세포와 동일한 표현형, 생리학적 특성 및 발생학적 특성을 가지는 것으로 당업계에서 간주되고 있다.
본 발명에서의 용어, “줄기세포의 분화”는 미분화 상태의 줄기세포에서 특정세포로 완전히 분화가 유도된 경우뿐만 아니라 줄기세포에서 특정세포로 완전 분화되기 전 중간 단계에서 형성되는 전구체(precursor) 세포의 형성도 포함하는 것이다.
일 구현예에서, 상기의 각 단계에서 사용되는 세포 배양액은 당, 아미노산, 각종 영양물질, 무기질 등과 같이 세포의 성장 및 증식에 필수적인 요소를 포함하는, 인 비트로에서 세포 성장 및 증식을 위한 혼합물이다. 세포 배양용 배지에 추가적으로 포함될 수 있는 성분은 예를 들어 글리세린, L-알라닌, L-아르기닌 하이드로클로라이드, L-시스테인 하이드로클로라이드-모노하이드레이트, L-글루타민, L-히스티딘 하이드로클로라이드-모노하이드레이트, L-리신 하이드로클로라이드, L-메티오닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-발린, L-아스파라긴-모노하이드레이트, L-아스파르트산, L-시스틴 2HCl, L-글루탐산, L-이소류신, L-류신, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-티로신 디소듐염 디하이드레이트, i-이노시톨, 티아민 하이드로클로라이드, 나이아신아미드, 피리독신 하이드로클로라이드, 바이오틴, D-판토텐산칼슘, 엽산, 리보플라빈, 비타민 B12, 염화나트륨(NaCl), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 염화칼륨(KCl), 염화칼슘(CaCl2), 인산수소나트륨 모노하이드레이트(NaH2PO4-H2O), 황산동 펜타하이드레이트(CuSO4-5H2O), 황산제이철 헵타하이드레이트(FeSO4-7H2O), 염화마그네슘(무수), 황산마그네슘(MgSO4), 인산수소이나트륨(Na2HPO4), 황산아연 헵타하이드레이트(ZnSO4-7H2O), D-글루코즈(덱스트로즈), 소듐 피루베이트, 히포크산틴 Na, 리놀렌산, 리포산, 푸트레신 2HCl 및 티미딘을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기의 세포 배양용 배지는 인위적으로 제조하여 사용하거나, 혹은 상업적으로 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 상업적으로 시판되고 있는 배양용 배지의 예는 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), α-MEM(Alpha Modification of Eagle's Medium), F12(Nutrient Mixture F-12) 및 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (1)은 상기 전분화능 줄기세포를 다중 웰(multi-well) 배양 용기에서 3차원 배양함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에서의 용어, “3차원 배양(3-dimensional culture)”은 2차원 배양에 상대되는 개념으로, 배양대상 세포를 기질(substrate) 등에 고정시키지 않은 채로 배양액 내에서 부유(floating)하는 상태로 배양하는 것을 말한다. 이에, 용어“3차원 배양”은“부유배양(suspension culture)”과 동일한 의미로 사용된다. 부착(adhesion) 의존성인 줄기세포는 부유배양 시에 세포 응집을 일으키며, 이러한 응집에 포함되지 못하고 홀로 부유하는 세포는 세포사(apoptosis)를 유발하여 사멸하게 되므로 세포는 그 부착 특성에 맞는 환경이 조성되어야 한다. 본 발명에 따르면, 복수의 웰을 가지는 다중 웰에서 전능성 줄기세포를 부유배양 함으로써 웰 크기에 따른 직경의 전능성 줄기세포 응집체, 즉 배아체(Embryoid Body, EB)가 웰 수에 비례하여 형성된다. 이에, 본 발명의 단계 (1)에서는 동일한 크기와 모양을 가지는 규격화된 배아체를 대량으로 수득할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 다중 웰(multi-well) 배양 용기는 웰 당 350μm×350 μm 내지 450μm×450 μm의 크기를 가지는 마이크로웰 플레이트일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 부유배양은 상기 다중 웰(multi-well) 배양 용기 내 웰 당 0.5×105 내지 1.5×105개, 바람직하게는 0.7×105 내지 1.3×105개, 더욱 바람직하게는 약 0.9×105 내지 1.1×105개의 세포를 분주함으로써 이루어질 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (1)은 상기 부유배양 시 원심분리를 통해 세포 응집을 유도하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서의 용어, “세포 응집(aggregation)”은 단일층(monolayer)이 아닌 3차원적 성장이 허용된 부유 배양 등의 환경에서 배양된 세포가 자가 조립(self aggregation)을 하면서 3차원 구조의 세포 응집 덩어리를 형성하는 것을 의미한다. 3차원 배양의 결과로 만들어진 세포 응집체는 줄기세포가 유래한 생체 내 조직과 유사한 환경을 제공하며, 크기 및 자가 조립된 세포의 수에 따라 구형(sphere)일 수도 있고 구형 이외의 형태일 수도 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (2)의 미세중력은 상기 생물반응기를 회전시킴으로써 상기 생물반응기에 가해지는 중력을 상쇄시키는 미세중력 모사장치에 의해 유도될 수 있다.
본 발명에서의 용어, “미세중력(microgravity)”은 중력이 존재하지 않거나, 측정 가능 수준 미만으로만 존재하거나, 또는 중력으로 인한 생물학적, 생리학적 영향이 관측되지 않는 정도로만 존재하는 것을 의미하며, 구체적으로는 1 x 106 g 이하의 환경을 의미한다. 따라서 용어“미세중력”은“무중력”으로도 표현될 수 있다.
본 발명에서의 용어, “미세중력 모사장치(microgravity simulator)는 정상 중력 환경 또는 유의한 중력이 존재하는 환경 내에서 인위적으로 중력을 상쇄시킴으로서 미세중력 환경을 유도하는 장치를 의미한다. 이러한 미세중력 모사장치에는 예를 들어 클리노스탯(Clinostat), RPM(Random positioning machine), RWV(Rotating wall vessel) 등이 있으나, 이에 제한되지 않고 적절한 외력의 부가를 통해 본 발명의 생물반응기 내의 배양환경에서 지정된 시간만큼 중력을 상쇄시킬 수 있는 장치라면 제한 없이 사용될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 미세중력 모사장치는 클리노스탯(Clinostat)이다. 클리노스탯은 생물반응기와 같은 배양 용기에 결합되어 무작위적으로 혹은 지시(입력)된 패턴에 따라 계속적으로 방향을 바꾸면서 회전하여 끊임없이 3차원 자세를 바꿈으로써 중력 방향의 계속적인 변동을 야기, 이를 통해 중력을 상쇄시키는 장치이다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (2)는 상기 미세중력 모사장치를 15 내지 80 rpm, 바람직하게는 40 내지 80 rpm으로 회전시키면서 3 내지 8일간 배양함으로써 수행될 수 있고, 보다 바람직하게는 4 내지 7일간, 더욱 바람직하게는 5일간 배양할 수 있다.
바람직하게는, 상기 단계 (2)는 상기 미세중력 모사장치를 40 내지 60 rpm에서 시작하여 매일 5rpm씩 증가시키면서 회전시킴으로써 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는 50 rpm에서 시작하여 매일 5 rpm씩 증가시키면서 5일간 배양할 수 있다.
본 발명에서의 용어, “생물반응기(bioreactor)”는 생물학적인 활성을 가지는 배양 환경을 조성하기 위한 배양 공간과, 이와 연동되어 작동하는 일련의 기계 장치를 포함하는 생물학적 시료의 배양 장치 또는 시스템을 의미한다.
상기 단계 (2)에서는 단계 (1)에서 생성된 배아체를 미세중력(micro-gravity) 하의 생물반응기에서 3차원 배양을 함으로써 스페로이드를 형성한다. 스페로이드(spheroid)는 구형의 세포 응집체를 의미하나, 기하학적으로 완전한 구형일 필요는 없다.
상기 단계 (1) 및 단계 (2)에서 2차례에 걸친 3차원 부유배양을 진행한 뒤, 이를 통해 형성된 스페로이드를 점착성 고분자가 코팅된 배양 용기에 부착 배양함으로써 중간엽 줄기세포로 분화시킬 수 있다.
본 발명에서의 용어, “고분자”는 동일하거나 상이한 종류의 단량체가 연속적으로 결합된 합성 또는 천연 중합체 화합물을 지칭한다. 따라서, 고분자에는 단독 중합체(한 종류의 단량체가 중합화된 중합체)와 적어도 2종의 상이한 단량체의 중합에 의해 제조된 혼성중합체를 포함되며, 혼성중합체에는 공중합체(2종의 상이한 단량체로부터 제조된 중합체)와 2종 초과의 상이한 단량체로부터 제조된 중합체를 모두 포함한다.
본 발명에서의 용어, “점착성 고분자”는 배양 표면과 세포 또는 그 응집체(예를 들어 스페로이드) 간의 공유 또는 비공유 결합을 통한 가교를 형성하여 세포 또는 그 응집체가 배양 용기의 바닥 또는 측면에서 이탈하지 않고 부착된 채 배양이 진행될 수 있도록 하는 천연 또는 인공 고분자를 의미한다.
일 구현예에 있어서, 상기 점착성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 알긴산(alginate), 헤파린(heparin), 후코이단(fucoidan), 셀룰로스(cellulose), 덱스트란(dextran), 키토산(chitosan), 알부민(albumin), 피브린(fibrin), 콜라겐(collagen) 및 젤라틴(gelatin) 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 젤라틴일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 종래의 중간엽 줄기세포 소포체, 특히 일반 hWJ-MSC(대조군)와 비교하여 유전자 마커 발현 특성에 있어서 명확한 차이를 보인다. 하기 실시예에서 보는 바와 같이, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 일반 hWJ-MSC(대조군)에 비해 SPP1, PLAU, ITGA6, CENPI 및 BUB1 중에서 선택되는 1종 이상의 마커의 발현량이 유의적으로 증가하고, 상기 PTGS2 마커의 발현량이 유의적으로 감소한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증 질환 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 중간엽 줄기세포에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명에서의 용어, “세포외 소포체(extracellular vesicle)"는 다양한 세포에서 다낭체와 원형질막의 융합을 통해 세포 밖 환경으로 분비되는 30-1,000 nm 범위 직경의 지질 이중막 구조의 소낭을 의미한다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 세포외 소포체는 상기 중간엽 줄기세포의 배양액으로부터 복수 회의 원심분리를 통해 분리된 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 세포외 소포체는 100 - 250 nm의 평균 직경을 가지며, 보다 구체적으로는 150 - 220 nm, 더욱 구체적으로는 180 - 200 nm, 더욱 구체적으로는 185 - 195 nm의 평균 직경을 가진다. 이러한 범위의 미세 직경을 가지는 세포외 소포체를 엑소좀(exosome)이라 한다.
본 발명에서의 용어, “예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 발명에서의 용어, “치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 T 세포 매개 면역활성을 효율적으로 억제함으로써 과도하거나 원치 않는 면역반응을 원인으로 하는 다양한 염증 또는 자가면역 질환의 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 염증 또는 자가면역 질환에 대한 치료효과를 가지는 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.
본 발명에서의 용어, “투여”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말하며, “이식”또는“주입”과 동일한 의미를 가진다.
본 발명에서의 용어, “치료적 유효량”은 본 발명의 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.
본 발명에서의 용어, “대상체”는 제한 없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 다양한 염증 질환에 대하여 예방 또는 치료 효과가 있다. 본 발명의 약학 조성물을 적용할 수 있는 염증 질환은 당 업계에 염증 질환으로 공지된 것이면 되고 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 약학 조성물로 예방 또는 치료되는 자가면역 질환 또는 염증성 질환은 예를 들어 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 다발성경화증, 특발성섬유성폐포염, 다발성근염, 피부근염, 국한피부경화증, 전신피부경화증, 대장염, 염증성 장질환, 조르젠신드롬(Sjorgen's syndrome), 레이노현상(Raynaud's phenomenon), 베쳇병(Bechet's disease), 가와사키병(Kawasaki's disease), 원발성담즙성경화증(primary biliary sclerosis), 원발성경화성담관염(primary sclerosing cholangitis), 궤양성대장염(ulcerative olitis), 이식편대숙주병(Graft-versus-host disease, GVHD) 및 크론병(Crohn's disease)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 방광염일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물로 예방 또는 치료되는 방광염은 간질성 방광염(Interstitial Cystitis), 만성 방광염 및 케타민 유발 방광염 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 간질성 방광염일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 항염증 세포 모델에 본 발명의 중간엽 줄기세포, 또는 이의 배양액, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체를 투여하는 경우, TNF-α, IL-6의 농도가 현저하게 감소하므로, 항염증 치료 효과가 우수한 것을 구체적으로 확인하였다.
또한 본 발명의 일 실시예에서는, in vivo 간질성 방광염/방광통증 증후군(IC/BPS) 동물모델에 본 발명의 중간엽 줄기세포를 투여하는 경우, IC/BPS 유도 과정에서 무너진 방광 내벽이 회복되고, 염증 정도가 완화되는 등, 간질성 방광염/방광통증 증후군에 대하여 우수한 치료 효능을 보임을 구체적으로 확인하였다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 상기 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체를 단독으로 포함하거나, 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 골수 내 투여, 경막내 투여, 맥락막위공간 주입(suprachoroidal injection), 경피 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 비강내 투여, 장관 투여, 국소 투여, 설하 투여 또는 직장내 투여일 수 있고, 바람직하게는 정맥내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당 업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 연고제, 크림제, 로션제, 오일제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 약학 조성물은 경구제, 주사제 및 연고제로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 형태로 제조되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 주사제일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체를 유효량으로 포함할 때 바람직한 염증 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과를 제공할 수 있다. 본 명세서에서, '유효량'이라 함은 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 염증 질환, 특히 간질성 방광염을 개선 또는 치료하기에 충분한 양을 말한다.
상기 중간엽 줄기세포는 약학 조성물 총 함량에 대하여 5 X 104 내지 2 X 105 cell/ml, 바람직하게는 7.5 X 104 내지 1.5 X 105 cell/ml, 더욱 바람직하게는 8 X 104 내지 1.2 X 105 cell/ml로 포함될 수 있다. 이때, 상기 중간엽 줄기세포의 함량이 상기 하한치 미만이면, 세포 생존율은 우수하나 염증 질환 개선 또는 치료 효과가 원하는 정도로 나타나지 않을 수 있다. 반대로 상기 상한치를 초과하는 경우 농도가 증가하는 만큼 염증 질환 개선 또는 치료 효과가 증가하지 않거나 독성이 있을 수 있다. 한편, 인 비트로 실험 결과, 본 발명의 중간엽 줄기세포의 농도가 상기 범위인 경우에는 염증 질환 개선 또는 치료에 대하여 유의적인 효과가 나타나면서도 세포독성 등의 부작용이 나타나지 않았다.
또한, 본 발명의 중간엽 줄기세포로부터 분리된 세포외 소포체는 5x108 내지 5x1010 particles/ml, 바람직하게는 5x109 내지 5x1010 particles/ml, 더욱 바람직하게는 1x1010 내지 2x1010 particles/ml로 포함될 수 있다. 이때, 상기 줄기세포 유래 세포외 소포체의 함량이 상기 하한치 미만이면, 세포 생존율은 우수하나 염증 질환 개선 또는 치료 효과가 원하는 정도로 나타나지 않을 수 있다. 반대로 상기 상한치를 초과하는 경우 농도가 증가하는 만큼 염증 질환 개선 또는 치료 효과가 증가하지 않거나 독성이 있을 수 있다. 한편, 인 비트로 실험 결과, 본 발명의 줄기세포 유래 세포외 소포체의 농도가 상기 범위인 경우에는 염증 질환 개선 또는 치료에 대하여 유의적인 효과가 나타나면서도 세포독성 등의 부작용이 나타나지 않았다.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체의 유효량은 조성물이 제제화되는 형태 등에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 상처치유용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 중간엽 줄기세포, 이로부터 분리된 세포외 소포체, 약학 조성물 및 유효량에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상처를 생성한 세포 모델에 본 발명의 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체를 투여하는 경우, 세포 이동이 현저히 증가하는 것을 구체적으로 확인하였다(도 13a 및 도 13b).
본 발명의 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체는 세포의 이동(migration)을 현저히 증가시키며, 상처치유 효과가 우수하므로, 상처치유용으로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체의 치료 용도(for use in therapy)에 관한 것이다.
본 발명의 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
상기 치료 용도는 염증 질환 또는 자가면역 질환, 바람직하게는 염증 질환의 치료 용도일 수 있다.
상기 염증 질환 또는 자가면역 질환은 방광염, 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 다발성경화증, 특발성섬유성폐포염, 다발성근염, 피부근염, 국한피부경화증, 전신피부경화증, 대장염, 염증성 장질환, 조르젠신드롬(Sjorgen's syndrome), 레이노현상(Raynaud's phenomenon), 베쳇병(Bechet's disease), 가와사키병(Kawasaki's disease), 원발성담즙성경화증(primary biliary sclerosis), 원발성경화성담관염(primary sclerosing cholangitis), 궤양성대장염(ulcerative olitis), 이식편대숙주병(Graft-versus-host disease, GVHD) 또는 크론병(Crohn's disease)일 수 있다.
상기 방광염은 간질성 방광염(Interstitial Cystitis), 만성 방광염 및 케타민 유발 방광염 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 단계;를 포함하는 염증 질환 또는 자가면역 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
상기 “대상체(subject)”는 예방, 개선, 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 염증 질환 또는 자가면역 질환의 예방, 개선 및/또는 치료를 필요로 하는 인간 또는 포유동물일 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하겠으나, 다음 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실험방법
단일 콜로니 배양
유도만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell, iPSC)를 마트리젤(354234, corning, 미국)이 코팅된 96 웰-플레이트에 단일 세포로 부착시킨 iPSC 배지에서 일주일간 배양하여 단일 콜로니를 생성하였다. 생성된 각 콜로니는 마트리젤이 코팅된 24 웰 디쉬, 6 웰 디쉬에 순서대로 계대 후 1 X 105 정도로 세포수가 늘어나면 스페로이드(spheroid) 실험에 사용하였다(도 1).
BAM 시스템을 이용한 스페로이드 생성
iPSC를 Aggrewell 플레이트(34460, stemcell, 캐나다)에 1 X 105 정도로 씨딩한 다음 300g로 5분간 원심분리하여 세포를 응집시킨 후, 5% CO2 배양기 하에서 24시간 배양하여 배아체(Embryoid Body, EB)를 생성하였다. 24시간 후 생성된 EB는 생물반응기(Bioreactor, CelVivo, Denmark) 안으로 조심스럽게 옮기고 생물반응기를 미세 중력장치인 BAM 시스템(CelVivo, Denmark)에 장착하여 5일간 회전하였다. 회전 시 처음에는 50 rpm으로 시작하여 매일 5 rpm씩 증가시켰다(도 1).
유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPSC-MSC) 생성
BAM 시스템에서 키운 스페로이드를 0.1% 젤라틴 코팅된 6-웰 배양접시로 옮기고 DMEM/F12에 10% FBS와 1% P/S를 첨가한 배지에서 배양하고 2-3일 마다 배지를 교체하였다. 코팅된 바닥에 붙은 스페로이드로부터 세포가 나와서, 70~80% 컨플루언시가 되면 Tryple을 사용하여 계대하였다. 첫 계대를 P0로 명명하고, 세포 모양이 균질화(homogenous)될 때까지 계대하였다.
면역세포화학(ICC) 염색을 이용한 만능성 및 중간엽 줄기 세포 확인
iPSC 단계에서 생성된 스페로이드는 생물반응기에서 일부 꺼내고 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정하였다. iPSC의 스페로이드에서 만들어진 iPSCMSC는 공초점 디쉬(101350, SPL, 한국)에 1 x 105의 농도로 씨딩 후 60~70% 컨플루언시에서 4% PFA로 고정하였다. 고정된 스페로이드 및 iPSC-MSC는 DPBS로 5분 간 3회 수세 후, 항체가 잘 투과할 수 있도록 0.3% Triton X-100으로 표면을 투과화하였다. 그 후 DPBS로 5분간 3회 수세하였다. 수세된 스페로이드는 블로킹을 위해 3% BSA/PBS로 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 1시간 후 3% BSA/PSB를 제거한 후 1차 항체(1:200)인 Anti-OCT4, Anti-SSEA4, Anti-PDGFRβ를 넣고 냉장고에서 12시간 동안 반응시켰다. 12시간 후 실온으로 꺼내고, DPBS 로 5분씩 3회 수세하였다.
수세 후 2차 항체(1:200)인 고트 항-마우스 488과 함께 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 1시간 후 2차 항체를 제거하고 핵을 염색하는 DAPI 또는 Topro3로 20분간 염색 후 DPBS로 5분씩 3회 수세하였다. 수세된 시료는 Antifade Mounting Medium(H-1000, VECTOR LABORATORY, 영국)을 사용하여 형광의 소실을 방지하였다.
iPSC-MSC 계대 및 세포 증식 곡선
iPSC-MSC 의 모양이 균질화된 계대부터 세포 형태를 기록하고 세포수를 계산하여 증식곡선을 그렸다. P5부터 iPSC-MSC를 60mm 배양접시에 2 x 105의 세포수로 씨딩 후 5일간 배양하고 5일 동안 1회 배지를 교체하였다. 세포 증식은 3가지의 증식곡선으로 나타내었다. 먼저, 세포성장률(Cummulative Population Doubling level: CPD)의 세포 수는“CPD = log(나중 세포 수/처음 세포 수)/log(2)”로 계산하였다. 다음으로 세포가 두 배로 증식하는 시간인 Doubling time은 “Doubling Time = 배양일수 x log(2)/(log(나중 세포 수)-log(처음 세포 수))”로 계산하였다. 세 째, 계대시 세포 수를 계산하여 log를 취한 값인 세포 수는 “cell number= log (세포 수)”로 계산하였다. 계산된 수치는 선 그래프로 나타내었으며, 대조군으로 AD-MSC(간엽 줄기세포) 및 hWJ-MSC(탯줄 유래 중간엽 줄기세포)를 사용하였다.
유세포 (FACS) 분석을 이용한 면역표현형 검사
배양 중인 세포를 TrypLE™ Express(10624013, gibco, 미국)를 이용하여 떼어내고, 1,500 rpm으로 5분간 원심분리 후 상층액을 제거한 다음 FACS 완충액(2% FBS가 포함된 D-PBS)로 부유한 다음, 마우스 항-CD34, 마우스 항-CD45, 마우스 항-CD73, 쉽 항-CD90 로 1차 반응하였다. 이들 1차 항체는 1:500으로 희석하고 세포에 200μl씩 첨가하한 뒤 4 ℃에서 30분간 배양하였다. 다음으로 D-PBS로 세척 후 1,500 rpm으로 5분간 원심분리 후 상층액을 제거 후 1:500으로 희석된 2차 항체인 래빗 항-마우스 488 또는 동키 항-쉽 PE를 200μl씩 첨가하고 4℃에서 20분간 배양하였다. 이후, 염색된 세포는 FACS 완충액 500μL에 부유하여 유세포 분석기(FACS Calibur; Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)로 유세포 분석을 수행하였고, Cell Quest pro software를 이용하여 분석하였다.
항염증 세포 모델
본 발명의 iPSC-MSC의 항염증 능력을 평가하기 위해, 염증 세포 모델에 사용하는 Macrophage 세포인 Raw 264.7 세포를 이용하였다. Raw 264.7 세포는 10% FBS 및 1% P/S가 함유된 α-MEM(Minimum Essential Medium) 배지에서 키웠다. 먼저, 배양 용기에서 hWJ-MSC(대조군) 또는 iPSC-MSC(본 발명)를 배양 후, 50% 차게 되면 새로운 배지를 공급 후 48시간 배양한다. 48시간 후, 컨디션 배지를 모은 후, 0.20㎛ 주사기 필터를 이용하여 여과 후 4 ℃ 냉장고에 보관하였다.
Raw 264.7 세포는 세포를 well 당 3.75 X 105 의 세포 수로 6 well 배양 접시에 나눠서 접종하였다. 12시간 후 세포가 부착되면 준비된 컨디션 배지 100%로 교체하였다. 다시 12시간 후 도 9에 나타낸 바와 같이 대조군을 제외하고 컨디션 배지 군을 포함한 모든 군에 LPS(lipopolysaccharide, Sigma, 미국)를 200 ng/㎖ 로 처리하였다. 양성 대조군으로 DEX(Dexamathasone, Peprotech, 미국)를 1 uM로 처리하였다. 7시간 뒤에 이미지 기록하고 PFA 4%로 세포를 고정 후, 면역세포화학 염색을 실시하였다.
총 RNA 분리, RT-PCR
Labo Pass Kit, TRIzol(Cosmogenetech, Seoul, Korea)을 사용하여 제조자의 매뉴얼에 따라 Raw264.7 세포의 총 RNA를 추출하였다. 전체 RNA의 농도는 Nanodrop (ND1000) 분광 광도계(Nanodrop Technologies Inc., Wilmington DE, USA)로 측정하였다. 총 RNA 2μg 및 M-MLV 역전사효소(Promega)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 cDNA을 합성하였다. RT-PCR 반응은 끝난 후 2% 아가로스 젤에서 분석하였다. 사용된 프라이머의 서열은 표 1에 나열하였다:
유전자 정방향 역방향
IL-6 GTC CTT CCT ACC CCA ATT TCC A TAA CGC ACT AGG TTT GCC GA
GAPDH CTC ACT CAA GAT TGT CAG CA GTC ATC ATA CTT GGC AGG TT
면역세포화학 염색
상기 고정된 세포는 2회 PBS로 세척하였다. 0.3 % Triton X-100을 사용하여 10 분간 세포의 핵내로 침투를 실시하고 PBS로 세척한 뒤, 비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 10% 정상 염소 혈청과 함께 1 시간 동안 실온에서 정치하였다. 세포를 1차 항체인 TRAP mouse monoclonal항체 (Santa cruz. 미국)로 4 ℃에서 12시간 동안 반응시킨 뒤, 세포를 DPBS로 3회 세척하고 실온에서 1 시간 동안 2차 항체로 Alexa-488 접합 염소 항 마우스 항체와 함께 실온에서 1시간 반응시켰다. 1시간 후 DPBS로 정치하고 세포핵은 염색하기 위해서 ToPro 3(Thermo Fisher Scientific, 미국) 로 15분간 실온에서 반응시켰다. 15분 후 DPBS로 3회 수세 후 Antifade 마운팅 용액(H-1000, VECTOR LABORATORY, 영국)을 이용하여 마운팅하였다.
엑소좀의 분리 및 NTA 분석
본 발명에 따른 iMSC를 5,000 cells/cm2로 씨딩하고, 배양한 후 70~80% 정도 차게 되면 새로운 DMEM-F12 media(D8437, Sigma) (exosome depletion FBS 10%와 P/S 1%가 포함) 로 교체하였다. 48시간 후 컨디션 배지를 50 ml 튜브에 모은 후 300g에서 3분간 원심분리하였다. 원심분리한 뒤 새로운 50 ml 튜브 (50050, SPL)로 옮긴 뒤, 4 ℃에서 2,000g로, 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 새로운 50 ml 튜브로 옮긴 뒤, 4 ℃에서 10,000g로, 30분간 원심분리하였다. 원심분리 후 새로운 50 ml 튜브에 옮겼다. Ultracentrifuge tube(344058, Beckman)에 32~36 ml의 컨디션 배지를 옮긴 뒤, 4 ℃에서 32,000 rpm(187,000g, Beckman, SW 32Ti rotor)으로 2시간 원심분리하였다. 원심분리 후 Ultra centrifuge tube 1개에 200 ul의 0.2 um filtered(S6534-FMOSK, ,Sartorious) 1X PBS(10010-031, gibco)로 엑소좀을 수집하였다.
상기에서 수득한 엑소좀을 각각 0.2 um filtered 1x PBS로 500배 내지 2000배 희석한 후 NTA장비(Zetaview)를 이용하여 엑소좀의 크기 및 농도(particles/ml)를 측정하였다.
상처 치유능 분석
대조군의 세포외 소포체(Cont EV)와 본 발명의 중간엽 줄기세포 유래 세포외 소포체(iMSC EV)의 NHDF 세포에 대한 migration 효과를 확인하기 위해, 6well plate(30006, SPL)에 NHDF 세포를 2.5E+05 cells/well로 씨딩하고 약 100%의 confluency가 되도록 incubation하였다. 세포의 confluency가 차면 DMEM high glucose(D6429,sigma)에 1% penicillin streptomycin(1514-163, gibco)를 넣은 SFM(Serum free medium)에 Mitomycin C(M4287, Sigma-Aldrich)를 10 ug/ml로 희석한 후 1 ml/well로 처리하였다. 2시간 동안 incubation하고, DPBS로 wash 한 후 1000 ul pipet tip을 이용하여 well에 세로로 세포를 긁었다. DPBS로 wash하여 cell debris를 제거하고 DMEM high SFM에 각 세포외 소포체를 1E+09particles/well로 처리하였다. 상기 처리 후 0, 12, 24, 48시간마다 일정한 위치에 사진을 찍어 세포의 이동 정도를 확인하였다. Migration 정도의 분석은 TScratch software를 이용하여 비교하였다.
RNA 시퀀스 분석
탯줄 유래 중간엽 줄기세포(Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells; UC-MSC) (ATCC :PCS-500-010)와 본 발명의 iMSC 세포를 pellet 상태로 엘에스에이(LAS, 김포, 한국)에 제공하여 RNA를 분리하고, QC test 실시 후 Microarray 분석을 통한 Vocano plot 자료를 받았다. 상기 Vocano plot을 통해, 상향 조절 유전자가 183개, 하향 조절 유전자가 322개임을 확인하였다. 또한, 각각의 유전자들을 DAVID 분석을 통해 유전자의 주요 기능(역할)을 예측하는 자료를 받았다. 분석된 자료는 먼저 각각의 유전자들의 Protein-Protein Interaction을 알기 위해 데이터베이스 기반인 String-db tool을 이용하여 (https://string-db.org/)를 network를 분석한 것이다. 상기 DAVID 분석으로 예측된 유전자의 주요 기능은 Venn Diagram (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)을 이용하여 서로 겹쳐진 유전자의 기능을 찾았다.
간질성 방광염/방광통증 증후군(IC/BPS) 유도 마우스 모델
8주령의 BALB/cAnNCrlOri Female mouse를 받아 2주간 적응 기간을 두었다. 알팍산과 럼푼을 4:1 비율로 섞고 90 ul/Mouse로 복강주사하여 Mouse를 마취하였다. 요도에 카테터(382412, BD)를 삽입하여 방광 내부의 오줌을 제거하고 PBS 50 ul를 넣어 wash하였다. 5 mg/ml Protamine sulfate(P3369, Sigma)를 주입하고 30분 후에 PBS로 wash하였다. LPS 30 ug/ml(L4391, Sigma)를 주입하고 PBS로 wash하였다. hot plate에서 마우스의 회복을 확인하고 일주일간 사육하였다. 이 과정을 4회 반복하여 mouse IC/BPS model을 유도하였다. 실험 5주차에는 Mouse를 동일한 방법으로 마취 후 하복부를 절개하여 방광의 표면에 본 발명의 iMSC를 1×105 세포수로 PBS(10 ul)에 현탁하여 주입하였다. 하복부를 봉합하고 마취에서 회복되는 것을 확인한 후 사육하였다. 일주일 후 Mouse를 마취한 후 방광을 적출하여 실험에 사용하였다. 일부 방광은 homogenization 후 RNA를 추출하였고, 일부는 조직 section 및 염색을 통해 방광의 형태 및 염증 정도를 확인하였다.
qPCR
추출된 방광을 균질화한 후 Labozol reagent(CMRZ001, 코스모진텍)에 재현탁하였다. 클로로포름(C2432,Sigma)을 labozol과 5:1 비율로 섞고 볼텍싱하였다. 13,000rpm, 15분 원심분리하여 RNA가 녹아있는 상층액을 천천히 새로운 튜브에 옮기고 동량의 2-propanol(64605-0380, junsei, 1:1)을 넣었다. 상층액과 2-propanol 이 있는 튜브를 1~2회 inverting 후 13,000rpm, 15분 원심분리하였다. RNA pellet을 75% EtoH로 wash 후 13,000rpm, 10분 원심분리하고, DEPC에 RNA를 재현탁하였다. RNA는 rTaq Plus 5x PCR master mix(EBT-1319, ELPISBIO)를 이용하여 cDNA를 합성하였고, HiPi Real-Time PCR 2x Master Mix(SYBR green, ROX)(EBT-1802, ELPISBIO)을 이용하여 유전자의 발현량을 확인하였다(7500, Amersham Phamacia Biotech).
실험결과
BAM 시스템을 이용한 스페로이드 생성
Aggrewell 플레이트에 올려진 iPSC는 24시간 후 모양과 크기가 균질한 둥근 EB를 형성함을 확인하였다(도 2).
면역세포화학 염색을 통한 스페로이드의 만능성 세포 확인
스페로이드를 만능성 마커인 OCT4로 염색을 하였을 때, 녹색으로 염색이 되었으며, 핵을 염색하는 DAPI로 염색하였을 때, 특이적으로 핵 부위에 녹색과 파란색으로 염색이 됨을 확인할 수 있었다. OCT4가 핵에서 발현됨을 알 수 있으며 iPSC에서 유래한 스페로이드가 만능성을 유지함을 알 수 있었다(도 3).
iPSC-MSC 생성
0.1% 젤라틴으로 코팅된 배양접시에서 스페로이드(검은색 화살표)가 바닥에 부착되었으며, 세포가 돌출하여 나오는 것(흰색 화살표)을 관찰할 수 있었다. 시간이 지날수록 돌출 세포가 증가하였으며 70~80% 컨플루언시에서 계대하였다. 계대를 진행할수록 세포 모양이 방추형(흰색 점선 화살표)으로 균질화되었다(도 4).
iPSC-MSC 계대 및 세포 증식 곡선
iPSC-MSC는 P5부터 세포가 방추형태를 띄며 P13까지 계대할 수 있었다(도 5). 그 후 세포는 저장액을 만들어 LN2에 저장하였다. 세포 증식 곡선은 대조군인 hWJ-MSC, AD-MSC와 비교하였으며, 그 결과 AD-MSC는 P9까지 세포 수가 늘어나다가 이후 감소하며, hWJ-MSC는 P13에서도 꾸준히 세포가 증식하였다. iPSC-MSC는 대조군보다 CPD 및 누적 세포 수가 월등히 높으며, 2배수 시간도 대조군보다 빨랐다(도 6).
유세포 분석(FACS)을 이용한 면역표현형 검사
FACS 분석결과 대조군인 AD-MSC와 비교하여 iPSC-MSC가 항-CD73, 항-CD90에 대해 양성이고 항-CD34, 항-CD45는 음성임을 확인하였다(도 7). 이를 통해, BAM 시스템을 통해 만들어진 iPSC-MSC가 중간엽 줄기세포의 명확한 특성을 가짐을 알 수 있었다.
면역세포화학 염색을 통한 iPSC-MSC의 중간엽 줄기 세포 확인
iPSC-MSC 세포를 만능성 마커인 OCT4, SSEA4와 중간엽 줄기세포 마커인 PDGFRβ를 이용하여 ICC를 진행하였다. iPSC-MSC에서는 녹색으로 염색된 OCT4, SSEA4 마커에서는 녹색으로 염색된 세포가 적었으며, 녹색 PDFGRβ 마커에서는 녹색으로 염색된 세포가 많이 분포하였다(도 8). 이를 통해 iPSC-MSC가 전분화능을 상실하면서 중간엽 줄기세포로 전환되었음을 알 수 있었다.
항염증 세포 모델
줄기 세포의 염증제어 효과를 확인하기 위한 실험 절차의 모식도에 따라 실험을 수행하였다(도 9). 염증 실험결과, Raw 264.7 세포에 LPS를 처리하여 염증을 유발한 LPS 군에서는 거대한 다핵 세포를 관찰할 수 있었으며, LPS 처리와 함께 DEX를 처리한 양성 대조군(LPS+DEX), LPS 처리와 함께 각각 hWJ-MSC의 컨디션 배지를 처리한 시험군(LPS+hWJ-MSC CM) 및 iMSC의 컨디션 배지를 처리한 시험군(LPS+iMSC CM)에서는 다핵 세포를 관찰할 수 없었다(도 10). 또한, 각각의 실험군에 대하여 RT-PCR을 수행한 결과, IL-6의 발현이 LPS 군에서 가장 높게 나타났고, LPS 처리와 함께 각각 hWJ-MSC의 컨디션 배지를 처리한 시험군(LPS+hWJ-MSC CM) 및 iMSC의 컨디션 배지를 처리한 시험군(LPS+iMSC CM)에서는 LPS 군보다 IL-6의 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다(도 10). 한편, LPS 처리와 함께 DEX를 처리한 양성 대조군(LPS+DEX)에서 IL-6의 발현이 현저히 낮게 나타났다.
면역세포화학 염색을 통한 다핵세포의 유무 확인
상기 항염증 세포 모델 시험 후, 각각의 시험군에 대하여 TRAP 항체를 이용한 다핵세포의 유무를 확인하였다. 다핵 세포는 염증 반응이 진행될 때 세포가 모이면서 생성되는 것으로, 다핵 세포의 존재 여부를 통해 염증의 유무를 확인할 수 있다. 실험 결과, LPS 군에서는 TRAP 으로 염색된 세포(TRAP Positive)의 비율이 매우 높았고, LPS 처리와 함께 각각 hWJ-MSC의 컨디션 배지를 처리한 시험군(LPS+hWJ-MSC CM) 및 iMSC의 컨디션 배지를 처리한 시험군(LPS+iMSC CM)에서는 상기 LPS 군에 비하여 TRAP positive 세포가 현저히 적었다(도 11).
엑소좀의 분리 및 NTA 분석
NTA 장비를 이용하여 엑소좀의 크기 및 농도(particles/ml)를 측정한 결과, 본 발명의 iPSC-MSC에서 분리한 엑소좀의 particle의 크기는 약 100 nm에 해당하고 WJ-MSC에서 분리한 엑소좀에 비하여 전체 particles의 수가 약 4배 정도 많은 것으로 나타났다(도 12).
상처 치유능 분석
상기 본 발명의 iPSC-MSC에서 분리한 엑소좀을 Scratch 된 정상 인간 섬유아세포(NHDF, Normal human dermal fibroblast)에 넣고, 48시간 동안 관찰하였을 때 48시간 후 대조군인 PBS군에서는 50% 정도 상처가 치유되었으나, 본 발명의 iPSC-MSC에서 분리한 엑소좀을 처리한 시험군(Exosome)에서는 90% 이상 상처가 치유된 것을 확인할 수 있었다(도 13a 및 도 13b). 이러한 결과로부터, 본 발명의 iPSC-MSC에서 분리한 엑소좀의 상처 치유능이 대조군인 PBS에 비해 현저히 높은 것을 알 수 있다.
RNA 시퀀스 분석
RNA 시퀀스 데이터를 이용하여 Vocano plot을 그린 결과, 상위 조절 유전자 183개, 하위 조절 유전자 322개를 찾을 수 있었다. 이들을 이용하여 각각 String data 및 Venn Diagram으로 나타내었다.
먼저 상위 조절 유전자 183를 이용한 string data에서, 발현이 증가한 마커(Up-regulated Genes)인 SPP1(secreted phosphoprotein 1; Osteopontin), PLAU(Plasminogen Activator, Urokinase), ITGA6(integrin subunit alpha 6), CENPI(Centromere Protein I), BUB1(Budding Uninhibited By Benzimidazoles 1 Homolog; Mitotic checkpoint serine/threonine-protein kinase) 등의 유전자가 인터렉션이 많이 되어있는 것으로 나타났다(도 14a). 이들 유전자의 volcano plot의 발현 차이는 다음과 같다. SPP1의 발현은 대조군(hWJ-MSC) 대비 대략 3.0 배 내지 4.0배, 구체적으로는 3.50배 내지 4.00배, 더욱 구체적으로는 3.80 배 내지 3.90배 중량으로 증가하였고, PLAU의 발현은 대략 1.5배 내지 2.2배, 구체적으로는 1.80배 내지 2.10배, 더욱 구체적으로는 1.90배 내지 2.00배 중량으로 증가하였으며, ITGA6의 발현은 대략 2.1배 내지 3.0배, 구체적으로는 2.30배 내지 2.60배, 더욱 구체적으로는 2.40배 내지 2.50배 중량으로 증가하였고, CENPI의 발현은 대략 1.5배 내지 2.0배, 구체적으로는 1.60배 내지 1.90배, 더욱 구체적으로는 1.70배 내지 1.80배 중량으로 증가하였으며, BUB1의 발현은 대략 1.4배 내지 2.1배, 구체적으로는 1.50배 내지 1.90배, 더욱 구체적으로는 1.65 배 내지 1.75배 중량으로 증가하였다. 상기 발현이 증가한 마커들(Up-regulated Genes)을 이용한 vocano plat data의 GOTERM을 이용하여 venn Diagram으로 나타낸 결과, Positive RNA 중합 프로모터에 의한 전사조절 관련 유전자와, 세포 부착 및 증식 관련 유전자에 ITGA6 유전자가 겹치는 것을 확인할 수 있었다(도 15a). SSP1은 뼈 분화 마커로 사용하는 것으로 뼈 분화가 촉진함을 볼 수 있고, PLAU는 소변에서 분리한 효소로 응고된 혈액이나 섬유소에 의해 차단된 정맥로의 혈류 회복에 치료제로 사용할 수 있으며, ITGA6는 상피세포에서 laminin에 대한 수용체로 hemidesmosome에서 중요한 구조적 역할을 하고, CENPI는 난포자극호르몬에 대한 생식선 조직의 반응에 관여하며, BUB1은 유사분열 방추 체크포인트 및 염색체 응집의 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
다음으로 하위 유전자 322를 이용한 string data에서, 발현이 감소한 마커(Down-regulated Gene)인 PTGS2(Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2, or COX2;)가 인터렉션이 많이 되어 있는 것으로 나타났다(도 14b). 상기 PTGS2 유전자의 volcano plot의 발현 차이는 다음과 같다. PTGS2의 발현은 대조군(hWJ-MSC) 대비 대략 2.0배 내지 3.0배, 구체적으로는 2.30배 내지 2.90배, 더욱 구체적으로는 2.50배 내지 2.70배 중량으로 감소하였다. 상기 발현이 감소한 마커를 이용한 vocano plat data의 GOTERM을 이용하여 venn Diagram으로 나타낸 결과, 음성 세포 증식 조절 관련 유전자와 LPS 반응 및 염증 관련 유전자에 PTGS2가 겹치는 것을 확인할 수 있었다(도 16a). PTGS2은 염증 반응 동안 prostaglandin의 생성을 담당하는 효소이다.
상기 상향 조절 유전자 5개와 하향 조절 유전자 1개의 상대적 발현량의 차이를 수치화하여 하기 표 2에 나타내었다.
유전자 hWJ-MSC iMSC
SPP1 1 3.81
PLAU 1 2.00
ITGA6 1 2.59
CENPI 1 1.76
BUB1 1 1.62
PTGS2 1 -2.65
상기 표 2를 살펴보면, 상기 5개의 상향 조절 유전자들은 hWJ-MSC에 비해 본 발명의 iMSC에서 현저히 발현이 증가하고, 상기 1개의 하향 조절 유전자는 hWJ-MSC에 비해 본 발명의 iMSC에서 현저히 발현이 감소한 것을 확인할 수 있다.
이러한 결과로부터 본 발명의 iMSC가 종래 hWJ-MSC와 차별화된 효능을 가지는 것이 상기의 유전자 발현의 차이로 인한 것임을 유추할 수 있다.
간질성 방광염/방광통증 증후군(IC/BPS) 유도 마우스 모델
Mouse의 방광 조직을 section하여 H&E 염색을 한 결과 IC/BPS 유도 mouse에서는 방광 내벽이 무너져 있는 것을 확인하였으며, iMSC 및 hWJ-MSC를 처리한 그룹에서는 방광 내벽이 회복된 것을 확인하였다. 추가로 masson’s trichome 염색과 toluidine blue 염색을 통해 Fibrosis 정도(%)와 Mast cell의 침투를 확인하였으며 iMSC, hWJ-MSC를 처리한 그룹에서 염증 정도가 완화된 것을 확인하였다(도 17a, 도 17b). 특히, 본 발명의 iMSC를 처리한 그룹이 hWJ-MSC를 처리한 그룹에 비해 Fibrosis 정도(%)와 Mast cell의 침투가 약 50% 수준으로 현저히 감소하는 것으로 나타나, 본 발명의 iMSC가 hWJ-MSC와 비교하여 염증의 예방, 개선 또는 치료에 더욱 효과적임을 알 수 있다.
qPCR
IC/BPS 유도 mouse의 방광 조직에서 mRNA를 추출하여 염증 관련 사이토카인(IL6, TNF-alpha), 본 발명의 iMSC를 처리한 군에서 발현도가 낮아진 것을 확인하였다(도 18a). 또한, 요로 상피(Urothelial) 마커(UPK1A, UPK1B, UPK2)의 발현을 확인한 결과, 본 발명의 iMSC를 처리한 군에서 발현도가 높아진 것을 확인하였다(도 18b). 마지막으로 본 발명자들의 선행연구에서 발굴한 IC/BPS 마커(KLRB1, PSMB9, ITGAL)가 본 발명의 iMSC를 처리한 군에서 낮게 발현되는 것을 확인하였다(도 18c)(한국 공개특허공보 제10-2331138호 참조).
상기 실험 결과들로부터, 본 발명의 iMSC가 간질성 방광염(IC) 등의 방광 통증 증후군(BPS)의 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 유추할 수 있다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims (18)

  1. 아래 (A) 및 (B) 중에서 선택되는 1종 이상의 특성을 나타내는 중간엽 줄기세포:
    (A) SPP1, PLAU, ITGA6, CENPI 및 BUB1 중에서 선택되는 1종 이상의 마커의 발현량의 증가; 및
    (B) PTGS2 마커의 발현량의 감소.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는,
    SPP1, PLAU, ITGA6, CENPI 및 BUB1 마커의 발현량이 증가하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는,
    (1) 대상체로부터 분리된 전분화능 줄기세포를 배양하여 배아체(Embryoid Body, EB)를 형성하는 단계;
    (2) 상기 배아체를 미세중력(microgravity) 하의 생물반응기(bioreactor)에서 3차원 배양하여 스페로이드(spheroid)를 형성하는 단계; 및
    (3) 상기 스페로이드를 배양 표면에 점착성 고분자가 코팅된 배양 용기에서 부착 배양하여 중간엽 줄기세포로 분화시키는 단계;를 포함하는 방법으로 제작된 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 전분화능 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell, ESC) 또는 유도만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell, iPSC)인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 전분화능 줄기세포는 유도만능 줄기세포인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 단계 (1)은 상기 전분화능 줄기세포를 다중 웰(multi-well) 배양 용기에서 3차원 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 단계 (1)은 상기 3차원 배양 시 원심 분리를 통해 세포 응집을 유도하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 단계 (2)의 미세중력은 상기 생물반응기를 회전시킴으로써 상기 생물반응기에 가해지는 중력을 상쇄시키는 미세중력 모사장치에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 단계 (2)는 상기 미세중력 모사장치를 15 내지 80 rpm으로 회전시키면서 3 내지 8일 간 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 단계 (2)는 상기 미세중력 모사장치를 40 내지 60 rpm에서 시작하여 매일 3 내지 7 rpm씩 증가시키면서 회전시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
  11. 제3항에 있어서,
    상기 점착성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 알긴산(alginate), 헤파린(heparin), 후코이단(fucoidan), 셀룰로스(cellulose), 덱스트란(dextran), 키토산(chitosan), 알부민(albumin), 피브린(fibrin), 콜라겐(collagen) 및 젤라틴(gelatin) 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 점착성 고분자는 젤라틴인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
  13. 제1항의 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 염증 질환 또는 자가면역 질환은 방광염, 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 다발성경화증, 특발성섬유성폐포염, 다발성근염, 피부근염, 국한피부경화증, 전신피부경화증, 대장염, 염증성 장질환, 조르젠신드롬(Sjorgen's syndrome), 레이노현상(Raynaud's phenomenon), 베쳇병(Bechet's disease), 가와사키병(Kawasaki's disease), 원발성담즙성경화증(primary biliary sclerosis), 원발성경화성담관염(primary sclerosing cholangitis), 궤양성대장염(ulcerative olitis), 이식편대숙주병(Graft-versus-host disease, GVHD) 또는 크론병(Crohn's disease)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 방광염은 간질성 방광염(Interstitial Cystitis), 만성 방광염 및 케타민 유발 방광염 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  16. 제1항의 중간엽 줄기세포, 또는 이로부터 분리된 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 상처치유용 약학 조성물.
  17. 제1항의 중간엽 줄기세포의 염증 질환 또는 자가면역 질환 치료 용도.
  18. 제1항의 중간엽 줄기세포를 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 염증 질환 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료 방법.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110127111A (ko) * 2008-08-04 2011-11-24 셀레릭스 에스에이 중간엽 줄기 세포의 용도
KR20160108190A (ko) * 2015-03-04 2016-09-19 메디포스트(주) 증식력 및 분화능이 개선된 간엽줄기세포를 포함하는 폐질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110127111A (ko) * 2008-08-04 2011-11-24 셀레릭스 에스에이 중간엽 줄기 세포의 용도
KR20160108190A (ko) * 2015-03-04 2016-09-19 메디포스트(주) 증식력 및 분화능이 개선된 간엽줄기세포를 포함하는 폐질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABDAL DAYEM AHMED, KIM KYEONGSEOK, LEE SOO BIN, KIM ARAM, CHO SSANG-GOO: "Application of Adult and Pluripotent Stem Cells in Interstitial Cystitis/Bladder Pain Syndrome Therapy: Methods and Perspectives", JOURNAL OF CLINICAL MEDICINE, vol. 9, no. 3, 12 March 2020 (2020-03-12), pages 766, XP093022752, DOI: 10.3390/jcm9030766 *
KIM BUM SOO; CHUN SO YOUNG; LEE EUN HYE; CHUNG JAE-WOOK; LEE JUN NYUNG; HA YUN-SOK; CHOI JAE YOUNG; SONG PHIL HYUN; KWON TAE GYUN;: "Efficacy of combination therapy with pentosan polysulfate sodium and adipose tissue-derived stem cells for the management of interstitial cystitis in a rat model", STEM CELL RESEARCH, ELSEVIER, NL, vol. 45, 21 April 2020 (2020-04-21), NL , XP086164993, ISSN: 1873-5061, DOI: 10.1016/j.scr.2020.101801 *
ZHANG SHICHANG; LIU PING; CHEN LI; WANG YINGJIE; WANG ZHENGGUO; ZHANG BO: "The effects of spheroid formation of adipose-derived stem cells in a microgravity bioreactor on stemness properties and therapeutic potential", BIOMATERIALS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 41, 1 December 2014 (2014-12-01), AMSTERDAM, NL , pages 15 - 25, XP029116876, ISSN: 0142-9612, DOI: 10.1016/j.biomaterials.2014.11.019 *

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