JP2015038084A - 自己免疫疾患の治療および／または予防のための薬剤、ならびに制御性ｔ細胞形成のための薬剤 - Google Patents

Abstract

【課題】自己免疫疾患の治療及び／又は予防のための薬剤、生物体における制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒｅｇ）形成のための薬剤、並びに該薬剤の種々の使用方法の提供。
【解決手段】野生型ヒトインターロイキン２（ｈＩＬ−２）のアミノ酸番号に基づいて、第２０位、第８８位及び第１２６位のアミノ酸のうち少なくとも１つが置換されているｈＩＬ−２変異タンパク質又はそのフラグメントの、自己免疫疾患の治療及び／又は予防のための薬剤を製造するための使用。
【選択図】なし

Description

本発明は、自己免疫疾患の治療および／または予防のための薬剤、生物体における制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒｅｇ）形成のための薬剤、ならびに本発明の薬剤の種々の使用方法に関する。

自己免疫疾患は、免疫系が自己の組織に対して過剰反応を示すことを特徴とする。免疫系が自己の組織を排除すべき異物と誤認することにより、激しい炎症反応が起こり、その影響によって臓器が損傷を受ける。

自己と非自己の構造を識別する上で重要な役割を担っているのは、Ｔリンパ球、すなわちＴ細胞である。Ｔ細胞は、自己の細胞表面分子、いわゆるＭＨＣ分子に結合はするが、自己の構造に対して寛容に働くように胸腺で「教育」を受ける。この過程が、「クローン除去」および「クローン選択」と呼ばれるものである。胸腺で行われる第一の選択で、上記のようなＴ細胞、すなわち自己の細胞膜上のＭＨＣ分子を認識する能力を持つＴ細胞のみが生き残る。しかし、その結合は、Ｔ細胞を活性化させるほど強力なものではない。ここで、自己のＭＨＣ分子に対して結合も認識も全くできないＴ細胞は排除される。さらに胸腺で行われるクローン除去において、自己のＭＨＣ分子を「的確」に認識して強力に結合する能力があるＴ細胞は、自体が活性化されて結果的に自己の細胞を破壊する恐れがあるため排除される。以上の過程は、免疫系が「自己」の防御と「非自己」の排除を実現するためにとる手段の１つである。

自己免疫疾患においては、あるＴ細胞の集団が異常な作用を示す。このＴ細胞は、非自己の分子や生物体に対する防御機能を維持しつつ、さらに自己の構造に対しても攻撃を行う。臓器や組織が非自己として認識されているため、様々な影響が生じ得る。生命維持に関与する構造に影響が及んだ場合、自己免疫疾患は命取りになる。そのような構造に対する防御を免疫系が指示すると、細胞性や体液性の防御反応が始まり、自己抗体が形成され、その結果、被害を受けた臓器はやがて機能を失う。最も一般的には、生体の免疫系が弱まり、あらゆる種類の疾患にかかりやすくなる。場合によっては非自己の認識にも混乱をきたし、その結果、変性した癌細胞の拡散を効果的に阻止することができなくなり、患者はより一層感染症にかかりやすくなる。自己免疫疾患の進行の過程において、生体の修復機構は損傷を受けた臓器の再生を可能な限り試みるが、その間も、免疫系の細胞が自己の構造を破壊していく。一般に、治療を行わなければ、防御システムによるこのような誤った攻撃は、生涯を通じて、または標的となった構造が完全に破壊されるまで継続する。

鋭意研究が行われているにもかかわらず、自己免疫疾患のはっきりとした原因はいまだに分かっていない。現在一般に受け入れられている仮説は、遺伝性素因（例えば、特定のＭＨＣ分子型の存在に起因するもの）と外部からの影響とが組み合わさって自己免疫疾患が発症するという仮定に基づいている。このような遺伝的要因を患者が抱えている場合、これに加えて、激しいストレス、感染症、妊娠などの不利な環境要因が生じると、自己免疫疾患を発症する恐れがある。

免疫系は、体内に侵入した感染病原体を排除する能力を持った種々の細胞から構成される。免疫応答のメカニズムは、特殊化細胞の活性化、および特定のＴ細胞（このＴ細胞は、いわゆるＣＤ８膜貫通糖タンパク質を発現することから、ＣＤ８^＋Ｔ細胞と呼ばれる）が有する細胞毒性に代表されるようなエフェクター機能の獲得を含む。

以前はサプレッサーＴ細胞とも呼ばれていた制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒｅｇ）は、Ｔ細胞の中の特殊化したサブグループの１つである。制御性Ｔ細胞は、免疫系の活性化を抑制する機能を有し、それにより免疫系の自己寛容の調節を行う。したがって、健康な生物体においては、制御性Ｔ細胞によって、自己免疫疾患の発症が抑制される。種々のＴ_Ｒｅｇ集団がこれまで報告されており、一例として、タンパク質ＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３を発現することからＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞と呼ばれる細胞集団が挙げられる。さらに、ＣＤ４およびＦｏｘｐ３を発現するが、ＣＤ２５を発現していない、いわゆるＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞と呼ばれるＴ_Ｒｅｇも報告されている。

Ｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｌｅ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．４（６），ｐ．３５１−３６３には、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞の欠如により自己免疫疾患を自然発症するマウスモデルが記載されている。

Ｃｈａｔｉｌａ Ｔ．Ａ．（２００５），Ｒｏｌｅ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ，１１６（５），ｐ．９４９−９５９には、タンパク質Ｆｏｘｐ３をコードする遺伝子の変異によって起こるＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞の先天性欠損が、自己免疫疾患の発症の一因となることが報告されている。

２００５年３月に出版されたジャーナル「Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」には、制御性Ｔ細胞に関する総説が掲載されている。

自己免疫疾患は、被害を受けた臓器に応じて治療が施される。この治療における原因療法の基本原理は、免疫抑制剤（例えばコルチゾン）の投与により免疫系の活性化を抑制することである。免疫抑制剤には、複数の全身性の副作用や相互作用が生じるという特徴があることから、自己免疫疾患のイベントに関与するメカニズムに対して特異的に作用する新薬を開発するために、これまで多くの試みがなされてきた。このような薬としては、ナタリズマブおよびインフリキシマブが例として挙げられる。ナタリズマブは、ＩｇＧ４（白血球の細胞表面に存在する接着分子）のモノクローナル抗体で、ＩｇＧ４の選択的阻害薬である。ナタリズマブは、炎症病巣への白血球の遊走を阻害し、プラーク進行性多発性硬化症の中でも特に進行性の病態の治療に使用される。インフリキシマブは、自己免疫性の炎症反応で重要な役割を担う腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に対するキメラモノクローナル抗体である。インフリキシマブは、関節リウマチ、クローン病、ベヒテレフ病および乾癬に使用される。

Ｅｈｒｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓａｌ ｂｙ ａｎｔｉ−ＴＮＦα ｔｈｅｒａｐｙ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．２００，Ｎｏ．３，ｐ．２７７−２８５において、ＴＮＦαのモノクローナル抗体として、インフリキシマブが関節リウマチの治療を改善できることが報告されている。

同様の示唆が、Ｎａｄｋａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ａｎｔｉ−ＴＮＦα ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｖｉａ ＴＧＦ−β，ＪＥＭ Ｖｏｌ．２０４，ｐ．３３−３９にも見られる。

Ｂｒｅｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）では、抗ＣＤ３ε特異的抗体とプロインスリンペプチドとの併用投与によるＩ型糖尿病の治療が示唆されている。

Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｔｒｉｖａｌｅｎｔ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＣＲ） ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ＦｏｘＰ３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ＴＣＲ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１２３，ｐ．６６−７８には、多発性硬化症患者に特定のＴＣＲペプチドをワクチン接種すると、該疾患における自己反応性反応の制御に改善が見られることが記載されている。

これらの新しい薬剤は、極めて特異的に作用するが、重い副作用（例えば進行性多巣性白質脳症の発症など）が起こる場合がある。こういった理由から、ナタリズマブは、米国での最初の登録からわずか３か月後に、市場から回収された。また、これらの新規活性物質の価格は非常に高く、現在、ナタリズマブ３００ｍｇは、２，０００．００ユーロより高く、インフリキシマブ２００ｍｇは、約１，７００．００ユーロである。

このような背景から、本発明の目的は、当技術分野で見られる欠点を可能な限り回避した、自己免疫疾患の治療および／または予防のための新規の医薬組成物を提供することである。具体的には、十分な忍容性と低毒性とを特徴とする医薬組成物を提供する必要がある。

本発明のさらなる目的は、生物体における制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒｅｇ）形成のための薬剤を提供することである。

これらの課題は、野生型ヒトインターロイキン２（ｈＩＬ−２）のアミノ酸番号に基づいて、第２０位、第８８位および第１２６位のアミノ酸のうち少なくとも１つが置換されているｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのセクションもしくはフラグメントを提供することにより達成される。

本発明者らは、このようなｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントが、意外にも、自己免疫疾患の治療および予防に用いる治療薬としての可能性が高いことを見出した。例えば、本発明者らは、ｈＩＬ−２変異タンパク質が、生物体において、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋およびＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋などの制御性Ｔ細胞の形成を選択的に誘導することを様々な実験で実証することができた。

意外にも、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質の制御性Ｔ細胞に対する作用は、野生型ｈＩＬ−２よりはるかに優れている。これは、高濃度において特に顕著である。

本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質に関しては、ＷＯ９９／６０１２８に、２つの鎖からなるＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒβγ）よりも３つの鎖からなるＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）に強く結合することが記載されている。この度初めて本発明者らによって証明されたように、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質は、ＩＬ−２受容体のαサブユニット（ＣＤ２５）を持たない制御性Ｔ細胞（ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋）の形成を誘導し、また意外にもその作用は野生型ｈＩＬ−２より強い。さらに、このサブポピュレーションは、免疫系の活性化を抑制し、それにより免疫系の自己寛容を調節する働きを担う。その結果、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質は、自己免疫疾患治療のための活性物質として、野生型ｈＩＬ−２より際立って高い効力を示すことになる。

また本発明者らは、ｈＩＬ−２変異タンパク質が、ＣＤ３^＋ＣＤ４⁻ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋およびＣＤ３^＋ＣＤ４⁻ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋などの、自己免疫疾患の抑制に決定的な役割を担うＣＤ８陽性制御性Ｔ細胞の形成を誘導することを実証することができた（データ示さず）。

さらに、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）とは正反対の機能を有するＴ細胞を選択的に活性化するため、野生型ｈＩＬ−２よりも低い毒性プロファイルを示しかつ治療指数が高いというさらなる利点を有する。その結果、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質は、野生型ｈＩＬ−２より、際立って高い忍容性を示す（ＷＯ９９／６０１２８を参照のこと）。

さらに、野生型ｈＩＬ−２とは対照的に、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質は、意外にも、ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞（ナイーブＣＤ８Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８Ｔ細胞、初期分化ＣＤ８Ｔ細胞、および後期分化ＣＤ８Ｔ細胞ともいう）の増殖に対して全く影響を及ぼさない、及ぼしてもわずかに過ぎないことが、細胞傷害性ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋Ｔ細胞に基づいて初めて示された。このことは、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞が自己免疫疾患における慢性的な持続性の炎症過程を引き起こす原因であるとするならば、有利であると言える（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１３，ｐ．１４９，ａｎｄ Ｈａｅｇｅｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ，１８３，ｐ．１６８参照）。従って、野生型ｈＩＬ−２とは対照的に本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞に起因するこのような炎症反応がさらに激化するのを防ぐ。このことも本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質の忍容性が高いという利点を示す。

また、本発明者らによって証明されたように、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質は、免疫細胞の抗原特異的な活性化も刺激する。このことは、ｈＩＬ−２変異タンパク質により疾患特異的な免疫細胞が選択的に賦活されて免疫療法による全身性の作用が抑えられるという利点を有する。その結果、ｈＩＬ−２変異タンパク質の投与が原因で他の疾患が誘発されることも抑制される。

さらに本発明者らは、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質の投与により、自己免疫疾患の発症を抑制できることを、マウスＩ型糖尿病モデルに基づいて示すことができた。

従って、本発明の基礎をなす課題は完全に達成される。

添付の図面は下記の通りである。

健康な被験者において、プロロイキンの用量以下の濃度でも、ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒにより誘導される制御性のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞の増加量は、プロロイキンによる増加量を上回ることを示す。 健康な被験者において、プロロイキンの用量以下の濃度でも、ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒにより誘導される制御性のＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞の増加量は、プロロイキンによる増加量を上回ることを示す。 メラノーマ患者において、プロロイキンの用量以下の濃度でも、ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒにより誘導される制御性のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞の増加量は、プロロイキンによる増加量を上回ることを示す。 メラノーマ患者において、プロロイキンの用量以下の濃度でも、ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒにより誘導される制御性のＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞の増加量は、プロロイキンによる増加量を上回ることを示す。 多発性硬化症患者において、プロロイキンの用量以下の濃度でも、ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒにより誘導される制御性のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞の増加量は、プロロイキンによる増加量を上回ることを示す。 多発性硬化症患者において、プロロイキンの用量以下の濃度でも、ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒにより誘導される制御性のＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞の増加量は、プロロイキンによる増加量を上回ることを示す。 多発性硬化症患者において、プロロイキンの用量以上の濃度でも、ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒにより誘導される細胞傷害性ＣＦＳＥｌｏｗ／ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋Ｔ細胞の増加量は、プロロイキンによる増加量を下回ることを示す。 健康な被験者において、プロロイキンの用量以上の濃度でも、ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒにより誘導される細胞傷害性ＣＦＳＥｌｏｗ／ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋Ｔ細胞の増加量は、プロロイキンによる増加量を下回ることを示す。 マウスＩ型糖尿病モデルにおいて、ｈＩＬ−２−Ｎ８８ＲによるＣＤ４^＋細胞中のＦｏｘＰ３^＋細胞のパーセンテージの増加は、野生型ｈＩＬ−２による増加より大きいことを示す（Ａ）。さらに、ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒによって誘導されるＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３^＋細胞は、ＣＤ２５発現量も野生型ｈＩＬ−２の場合より高い（Ｂ）。 マウスＩ型糖尿病モデルにおいて、ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒは野生型ｈＩＬ−２とは対照的に糖尿病の発症を抑制することを示す。

本発明において、ヒト「野生型」インターロイキン２（野生型ｈＩＬ−２）とは、１３３個のアミノ酸からなる天然ヒトＩＬ−２のアミノ酸配列（Ｎ末端の２０アミノ酸からなるシグナルペプチドは含まない）を有するポリペプチドまたはタンパク質を意味する。野生型ｈＩＬ−２は、天然でも発現するが、組換えにより発現させることもできる。野生型ｈＩＬ−２のアミノ酸配列として、Ｎ末端のメチオニン（大腸菌体内で細胞内画分として発現させたタンパク質には必ず存在する）が付加された配列およびそれが付加されていない配列のいずれもが、Ｆｕｊｉｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８３），ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８０，ｐ．７４３７−７４４１に記載されている。野生型ｈＩＬ−２のアミノ酸配列を、添付の配列表の配列番号１に開示する。ｈＩＬ−２をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、添付の配列表の配列番号２に開示する。

本発明において、ヒトインターロイキン２の「変異タンパク質」（ｈＩＬ−２変異タンパク質）とは、野生型ｈＩＬ−２において特定の置換を施したポリペプチドまたはタンパク質を意味する。置換を施した位置の識別は、野生型ｈＩＬ−２のアミノ酸番号に基づき、例えば配列番号１における番号に基づいてもよい。この場合、第１位はアラニン（Ａ）、第２位はプロリン（Ｐ）、第１３３位はトレオニン（Ｔ）となる。第２０位のアスパラギン酸残基（Ｄ）（「Ｄ２０」）は、例えばイソロイシン残基（Ｉ）またはヒスチジン（Ｈ）に置換することが可能で、それによってそれぞれｈＩＬ−２−Ｄ２０ＩまたはｈＩＬ−２−Ｄ２０Ｈとして表記されるＩＬ−２変異タンパク質が形成される。

当然のことながら、自己免疫疾患の治療または制御性Ｔ細胞の誘導に特に適した組み合わせ変異体を形成するために、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質において、先に述べた第２０位、第８８位および第１２６位のうち複数箇所のアミノ酸を置換してもよい。

本発明において、ｈＩＬ−２変異タンパク質は、修飾されたポリペプチド、例えば糖化ｈＩＬ−２変異タンパク質も包含する。糖化ｈＩＬ−２変異タンパク質としては、例えば米国特許出願０９／３１０，０２６および１０／０５１，６５７に開示されているものが挙げられ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

本発明において、ｈＩＬ−２変異タンパク質の「セクション」または「フラグメント」は、ｈＩＬ−２変異タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端において１以上のアミノ酸が欠失しているポリペプチドを意味するが、自己免疫疾患の治療および／または予防のために用いられる本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質の生物活性を十分に示すものである。前記セクションまたはフラグメントの制御性Ｔ細胞の誘導活性が、ｈＩＬ−２変異タンパク質の活性の、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である場合、その生物活性は十分であるとみなされる。このｈＩＬ−２変異タンパク質の活性は、当業者に公知の方法により容易に測定できる。そのような方法は、例えばＷＯ９９／６０１２８の実施例３〜５に開示されている。この文献は参照により、本発明に組み込まれる。

本発明において、上述したアミノ酸番号における置換は、あるアミノ酸が生化学的に同等の特性を有する別のアミノ酸に置換されるような保存的置換でないことが好ましい。

この点から、第２０位の置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からグルタミン酸（Ｅ）への置換でないことが好ましい。第８８位の置換は、アスパラギン（Ｎ）からアラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）への置換でないことが好ましい。さらに、第１２６位の置換は、グルタミン（Ｑ）からアラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）への置換でないことが好ましい。このような置換では、野生型ｈＩＬ−２の生物活性は全く変化しないか、変化したとしてもごくわずかにすぎない。

さらに、上述したアミノ酸番号において、分子間の架橋結合または不適切なジスルフィド架橋結合が形成される場を提供するような置換を施さないことが好ましい。従って、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質において、第２０位の置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からアルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、トレオニン（Ｔ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換でないことが好ましい。第８８位の置換は、アスパラギン（Ｎ）からアスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、トリプトファン（Ｗ）またはプロリン（Ｐ）への置換でないことが好ましい。さらに、第１２６位の置換は、グルタミン（Ｑ）からアラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）またはリジン（Ｋ）への置換でないことが好ましい。

本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質は、当技術分野において公知の適切な方法であればいずれの方法によっても製造できる。そのような方法は、本発明のＩＬ変異タンパク質をコードするＤＮＡ配列（例えば配列番号２のヌクレオチド配列が挙げられる）を構築すること、および該配列を適切な宿主において発現させることを含み、それにより本発明の変異タンパク質を組換体として得ることができる。しかし、本発明の変異タンパク質は、化学合成、または化学合成と組換えＤＮＡ技術との組み合わせにより製造することもできる。本発明の変異タンパク質の製造については、ＷＯ９９／６０１２８の実施例１および２に詳細に記載されており、これらは参照により本発明に組み込まれる。

本発明の特に好ましいｈＩＬ−２変異タンパク質として、第８８位のアスパラギン（Ｎ）がアルギニン（Ｒ）に置換された変異タンパク質（ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒ）が挙げられ、当業者は、ＢＡＹ５０−４７９８として入手することができる（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ａ Ｔ−ｃｅｌｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｍｕｔｅｉｎ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｓ ｗｅｌｌ ｔｏｌｅｒａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．１８，ｐ．１１９７−１２０２を参照のこと）。ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒのアミノ酸配列を、添付の配列表の配列番号３に開示する。

当技術分野においては、ＩＬ−２変異タンパク質の上記した活性を示唆するものが何ら存在しないことから、本発明者らの発見は特に驚くべきものである。

例えば、ＷＯ９９／６０１２８には、変異タンパク質ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒは、ＮＫ細胞とは正反対の機能を有するＴ細胞を選択的に活性化することができ、肺の転移形成を抑制する能力があることが記載されている。

ＷＯ０２／００２４３には、アルブミンを含まずヒスチジンを含む、変異タンパク質ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒの安定な製剤が記載されている。

米国特許出願公開公報２００２／０１６４３００には、変異タンパク質ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒの糖化変異体が記載されている。

しかし、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質を、本発明の目的である自己免疫疾患の治療および／または予防のために使用すること、および生物体において制御性Ｔ細胞を選択的に活性化するために使用することについては、当技術分野においてこれまで報告されておらず、自明のことともされていない。

ヒト野生型ＩＬ−２に関してさえも、これと同様の発見はこれまでなされていない。

Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．１３，ｐ．２１００−２１０８には、高用量のＩＬ−２を投与すると、腫瘍治療におけるＩＬ−２の治療効果が低減することが報告されている。

Ａｈｍａｄｚａｄｅｈ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２００６），ＩＬ−２ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉＦｏｘｐ３^＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．１０７，ｐ．２４０９−２４１４では、腫瘍患者から制御性Ｔ細胞を除去することによりヒト野生型ＩＬ−２の治療効果を向上させることが提案されている。しかし、この方法には期待できないことが後に判明した（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｉｎａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｍｅｄｉａｔｅ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ＣＤ２５−ｄｅｐｌｅｔｅｄ ＰＢＭＣ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ａｆｔｅｒ ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｖｏｌ．３０，ｐ．４３８−４４７を参照のこと）。

Ａｎｔｏｎｙ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ（２００５），ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ，ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｖｏｌ．２８，ｐ．１２０−１２８では、ＩＬ−２の免疫治療薬としての評価はむしろ低く、ＩＬ−２の投与により自己免疫が誘導される恐れがあるとさえ報告されている。

Ｋｎｏｅｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ，ＪＥＭ Ｖｏｌ．２０２，ｐ．１３７５−１３８６でも、同様の見解が示されており、初期段階の自己免疫疾患の治療のためにＩＬ−２拮抗作用（すなわちＩＬ−２メカニズムの阻害）を用いることさえ示唆されている。

従って、当技術分野において、本発明の解決法が自明であると示唆するものは存在しない。

以上のことから、さらに本発明者らは、ｈＩＬ−２変異タンパク質の治療効果が、適用する疾患や使用する濃度に応じて異なる可能性を見出した。高濃度のｈＩＬ−２は、自己免疫疾患の治療には有利でも、腫瘍疾患の治療においては禁忌である可能性がある。

本発明の使用において、第８８位の置換により、アスパラギンがアルギニンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒ）、グリシンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｇ）、またはイソロイシンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｉ）こと、および／または第２０位の置換により、アスパラギン酸がヒスチジンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｄ２０Ｈ）、イソロイシンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｄ２０Ｉ）、またはチロシンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｄ２０Ｙ）こと、または第１２６位の置換により、グルタミンがロイシンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｑ１２６Ｌ）ことが好ましい。

この場合、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質として、ＮＫ細胞とは正反対の機能を有するＴ細胞を特に選択的に活性化するような、治療薬としての可能性が高く毒性が低いものを用いることになり、有利である。本発明の好ましいｈＩＬ−２変異タンパク質のこのような特性は、ＷＯ９９／６０１２８に記載されており、この文献は参照により本発明に組み込まれる。

本発明において、ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメント（ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのセクションもしくはフラグメントとは、野生型ｈＩＬ−２において第２０位、第８８位および第１２６位のアミノ酸のうち少なくとも１つは置換されているが、それ以外には置換が施されていないものをいう）において、第２０位、第８８位、第１２６位のいずれでもない任意の位置におけるアミノ酸のうち少なくとも１つがさらに置換されており、このさらなる置換が施されたｈＩＬ−２変異タンパク質、またはさらなる置換が施されたｈＩＬ−２変異タンパク質のセクションもしくはフラグメントのアミノ酸配列が、元のｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのセクションもしくはフラグメントのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９９％の相同性を有することが好ましい。

この場合、第２０位、第８８位および第１２６位のアミノ酸のうち少なくとも１つは変異しているがそれ以外は野生型ｈＩＬ−２と同一の配列を有するｈＩＬ−２変異タンパク質より、場合によっては容易に合成できる別の一次構造が提供されるという利点を有する。ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのセクションの生物活性を有するポリペプチドを得るために、ひいては自己免疫疾患の治療および／または予防のための薬剤を得るために、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのセクションのアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供することは必ずしも必要ではない。正確に言えば、必然的に生じる多少の活性低下が許容範囲であるなら、適度な相同性があれば事足りる。とは言え、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのセクションの生物活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％が保持されていることが好ましい。上述した相同性は、１０以上のアミノ酸を有する、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質のセクションを基準にする。相同性の程度は、例えばＢＬＡＳＴ分析などの、当業者に公知の方法により容易に求めることが可能であり、またＤＮＡＳｔａｒ社のＬａｓｅｒｇｅｎｅプログラムのＭｅｇＡｌｉｇｎモジュールを使用して求めることもできる。

本発明において、第２０位、第８８位、第１２６位のいずれでもない任意の位置におけるさらなるアミノ酸の置換は、アミノ酸の保存的置換であることがさらに好ましい。

この場合、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質のさらなる変異体として、自己免疫疾患の治療および／または予防、または生物体における制御性Ｔ細胞の誘導において十分に高い効果を示すものが提供されることになり、有利である。当業者には公知であるが、保存的置換においては、変異タンパク質の二次構造や三次構造に対する影響は全くないか、あっても最小限に抑えられる。このような保存的置換としては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｉｎ “Ｔｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｖｏｌ．５”，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈに記載のものが挙げられる。例えば、下記の個々のグループに属するアミノ酸同士は交換可能である、すなわち保存的交換を成立させる。
− アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
− システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、トレオニン（Ｔ）；
− バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）；
− リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）；
− フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）；および
− アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）。

生物体における制御性Ｔ細胞の形成誘導のための本発明の薬剤は、好ましくは、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。

この場合、前記薬剤が生物体に、好ましくはヒトに直接投与できる形態で既に提供されており、有利である。

前記薬学的に許容される担体は、当技術分野において広く記載されているものである（Ｒｏｗ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ’ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｌｅｈｒｂｕｃｈ ｄｅｒ ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｂＨ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔを参照のこと）。特に好ましい製剤として、ＷＯ０２／００２４３に記載のものが挙げられ、この文献は、参照により本発明に組み込まれる。この製剤は、アルブミンを含まず、製剤中のｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのセクションがヒスチジンにより安定化されている。最終的な薬剤は、ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのセクションを０．１〜５ｍｇ／ｍｌ；ヒスチジンを０．０８〜１．６重量％；ＮａＣｌを０〜０．９重量％；ショ糖を１〜１０重量％；グリシンを０〜０．３重量％含有し、かつｐＨが約５〜６．５であることが好ましい。

特定の一実施形態において、前記医薬組成物はさらに免疫抑制剤を含む。

本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質が特別の効能を有することから、前記医薬組成物は、このまま単剤としても、自己免疫疾患の治療および／または予防に使用できる。そのような単剤は、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質を唯一の活性物質として含む。この場合、薬学的に許容される担体、溶媒（緩衝剤、水など）、添加剤などは活性物質ではない。

上記実施形態は、一般的な免疫抑制剤を配合することにより、本発明の薬剤の治療指数がさらに向上するという利点を有する。

前記免疫抑制剤は、デコルチン、プレドニゾール（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ）を含むグルココルチコイド；アザチオプリン；シクロスポリンＡ；ミコフェノール酸モフェチル；タクロリムス；抗Ｔリンパ球グロブリン、例えばムロモナブを含む抗ＣＤ３抗体；バシリキシマブおよびダクリズマブを含む抗ＣＤ２５抗体；インフリキシマブおよびアダリムマブを含む抗ＴＮＦ−α抗体；アザチオプリン；メトトレキサート；シクロスポリン；シロリムス；エベロリムス；フィンゴリモド；セルセプト；マイフォーティック；およびシクロホスファミドからなる群より選ばれることが好ましい。

このような一般的な免疫抑制剤を配合することは、自己免疫疾患に対する効果が明白でありかつ当技術分野において十分に入手可能な免疫抑制剤が使用されるという点で有利である。

さらに、前記自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症、慢性胃炎、クローン病、バセドウ病、ベヒテレフ病、乾癬、重症筋無力症、自己免疫性肝炎、自己免疫性多腺性内分泌不全症（ＡＰＥＣＥＤ）、チャーグ・ストラウス症候群、潰瘍性大腸炎、糸球体腎炎、ギラン・バレー症候群、橋本病、硬化性苔癬、全身性エリテマトーデス、小児自己免疫性溶連菌関連性精神神経障害（ＰＡＮＤＡＳ）、リウマチ熱、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、白斑、自己免疫性腸症、グッドパスチャー症候群、皮膚筋炎、多発性筋炎、自己免疫性アレルギー疾患、喘息および臓器移植後の自己免疫反応からなる群より選ばれることが好ましい。

前記自己免疫疾患が前記の群より選ばれることは、最も重要な自己免疫疾患の治療および／または予防に使用できる薬剤が提供されるという点で有利である。

本発明のさらなる主題は、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントを含む、自己免疫疾患の治療および／または予防のための医薬組成物に関する。

本発明の使用に関して記載した特性、利点および定義は、本発明の医薬組成物にも同様に適用される。

本発明のさらなる主題は、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントを含む、生物体における制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒｅｇ）形成のための薬剤に関する。

本発明の使用に関して記載した利点、特性および定義は、本発明の薬剤にも同様に適用される。

本発明のさらなる主題は、生物体における自己免疫疾患の治療および／または予防のための方法、ならびに生物体における制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒｅｇ）の形成方法に関し、これらの方法はそれぞれ、
（ａ）ヒトインターロイキン２変異タンパク質（ｈＩＬ−２変異タンパク質）またはそのフラグメントを準備する工程、
（ｂ）前記ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのセクションを生物体へ投与する工程、および
（ｃ）必要に応じて、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返し行う工程
を含み、
前記ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのセクションは、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのセクションである。

前記生物体としては、哺乳動物が好ましく、より好ましくはヒトである。

本発明の使用に関して記載した特性、利点および定義は、上述した本発明の方法、すなわち生物体における自己免疫疾患の治療および／または予防のための方法、ならびに生物体における制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒｅｇ）の形成方法にも同様に適用される。

本発明のさらなる主題は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒｅｇ）の形成方法に関し、該方法は、
（ａ）ヒトインターロイキン２変異タンパク質（ｈＩＬ−２変異タンパク質）またはそのフラグメントを準備する工程、
（ｂ）前記ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントを末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に接触させる工程、および
（ｃ）必要に応じて、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返し行う工程
を含み、
前記ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントは、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントである。

ｈＩＬ−２またはそのフラグメントのＰＢＭＣへの接触は、ＰＢＭＣの培養に適した任意の培地中で行うことができる。

本発明の使用に関して記載した特性、利点および定義は、上述した本発明の方法、すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏにおける制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒｅｇ）の形成方法にも同様に適用される。

本発明のさらなる主題は、生物体における自己免疫疾患の治療および／または予防のための方法に関し、該方法は、
（ａ）ヒトインターロイキン２変異タンパク質（ｈＩＬ−２変異タンパク質）またはそのフラグメントを準備する工程、
（ｂ）前記ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントを第１の生物体由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に接触させる工程、
（ｃ）前記ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントを前記ＰＢＭＣとインキュベートして、制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒｅｇ）を含む細胞集団を得る工程、および
（ｄ）前記細胞集団を第２の生物体へ導入する工程
を含み、
前記ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントは、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントである。

前記第１の生物体と前記第２の生物体は同一の血液型を有することが好ましく、前記第１の生物体と前記第２の生物体は同一の生物体または個体であることが特に好ましい。

この場合、前記細胞集団の導入または自家移植に際し、これらの細胞に対する望ましくない免疫反応が起こらないため、前記方法における副作用の発生率が特に低くなるという利点がある。

本発明の使用に関して記載した特性、利点および定義は、上述した本発明の方法、すなわち生物体における自己免疫疾患の治療および／または予防のための方法にも同様に適用される。

当然のことながら、上述した特徴および以下に説明する特徴については、明記した特定の組み合わせだけでなく、本発明の範囲から逸脱しない限りは、他の組み合わせまたは単独でも利用可能である。

以下、実用的な実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は、単に例示目的であり、本発明の範囲を限定するものではない。実施例においては、添付の図面を参照する。

１． 材料および方法
１．１ ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用するＰＢＭＣの全血からの分離
健康な被験者、メラノーマ患者または多発性硬化症患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、リンパ球分離溶液（ヒストパック、シグマ・アルドリッチ社製）を用いて血液から分離する。そのために、同一の被験者または患者から採取したチューブ２本分の血液（７ｍｌまたは１０ｍｌ）を、５０ｍｌの滅菌チューブに移し、ＲＰＭＩ １６４０（インビトロジェン社製、＃１４１９０−６９）を加えて全量を３０ｍｌにする。次いで、この希釈した血液３０ｍｌを、１５ｍｌの密度勾配溶液（密度＝１．０７７；ヒストパック、シグマ・アルドリッチ社製、＃１０７７１）に重層する。

２０℃にて、４００ｇで４０分間ブレーキなしで遠心分離を行い、生じた２つの「白血球リング」を採取して、５０ｍｌの滅菌チューブに移し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；インビトロジェン社製、＃１４１９０−１６９）で２回洗浄する。赤血球が混入している場合には、以下のようなＲＢＣ（「赤血球」）溶解を行う。得られた細胞ペレットに２ｍｌのＲＢＣ溶解液を加え、これを穏やかに混和しながら、室温で２分間インキュベートした後、大量の完全培地（１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ １６４０）で洗浄する。

白血球の生細胞数は、トリパンブルー（インビトロジェン社製、＃１５２５０−０６１）で染色されない細胞を血球計数器（ＦｉｓｈｅｒＢｉｏｂｌｏｃｋ社製、Ａ２７５９Ｂ）で計数して求める。

１．２ ＣＦＳＥ標識
計数後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳに再懸濁する。これにＣＦＳＥ（インビトロジェン社製、＃Ｃ１１５７）を終濃度０．５μＭで添加し、暗所で３７℃、１０分間のインキュベーションを行う。その後、ＣＦＳＥで標識された細胞を４℃の新しい完全培地で３回洗浄し、１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度になるように完全培地に再懸濁してプレートに播種する。

１．３ ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＰＢＭＣの刺激
ＰＢＭＣに対する処理は、刺激を加えないか、または合成ペプチドプール添加もしくは非添加で、野生型ｈＩＬ−２（プロロイキン）もしくはｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒ（ＢＡＹ ５０−４７９８；ロット＃ＰＲ３１２Ｃ００８）によって刺激を加える。合成ペプチドプールは、メラノーマに特異的なタンパク質である、ｇｐ１００、ＴＲＰ−２、ＭＡＲＴ−１およびチロシナーゼ、または多発性硬化症（ＭＳ）に特異的なタンパク質ＭＯＧから構成されている。これらのペプチドをそれぞれ、終濃度２．５μＭ（メラノーマペプチド）または３０μｇ／ｍｌ（ＭＳペプチド）で添加する。

刺激物質およびペプチドの添加は、以下の２３種類の条件で行う。

次いで、上記の細胞を、ＣＯ_２濃度５％の環境下、３７℃で６日間培養した。

１．４ ＦＣ５００フローサイトメーターによる増殖アッセイおよび表現型解析
細胞表面分子に対する蛍光標識抗体で細胞を染色することにより、リンパ球の特定のサブグループの増殖を調べることができる（記憶マーカーおよび活性化マーカーについては表２を参照のこと）。刺激物質の存在下で行う６日間の培養の前後に、蛍光色素（ＰＥ：フィコエリトリン、ＥＣＤ：ＰＥ−テキサスレッド、ＡＰＣ：アロフィコシアニン、ＰＣ７：ＰＥ−Ｃｙ７）で標識した抗体を用いて免疫染色を行う。

６日目に染色を行うが、下表の最初の２つ（１および１ｉｓｏ）ではＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテート サクシニミジルエステル）で標識していない細胞を使用し、それ以外ではＣＦＳＥで標識した細胞を使用する。

ＣＤ２５−ＰＥ、Ｆｏｘｐ３−ＡＰＣおよびラットＩｇＧ２ａ−ＡＰＣはｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製である。ＣＤ２５−ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣおよびＣＤ４５ＲＯ−ＡＰＣはＢＤバイオサイエンス社から購入した。他の抗体はすべてベックマン・コールター社（フランス）製である。

１．５ マウスＩ型糖尿病モデル
１２週齢のＮＯＤ（「非肥満型糖尿病」）マウスに、ｈＩＬ−２変異タンパク質または野生型ｈＩＬ−２を毎日投与する。ネガティブコントロールのマウスには、生理食塩水を同様に投与した。各投与群は３〜５匹のマウスで構成されていた。０〜１５日目は、ｈＩＬ−２変異タンパク質または野生型ｈＩＬ−２を、５Ｋまたは２５Ｋユニットの用量でマウスに投与した。１７日目以降、５Ｋユニット投与群においては、用量を１００Ｋユニット（＝６．１１２μｇ）に増量した。２５Ｋユニット投与群の投与は、変更することなくそのまま行った。３１日目に最後の投与を行った。これらの実験と平行して、０日目から３１日目まで２５Ｋユニットの固定用量で投与を行った。糖尿病の判定は、尿中のグルコース量をモニターすることにより行った。１７日目および３０日目にマウスから採血し、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体および抗ＦｏｘＰ３抗体による染色により血液サンプルをＦＡＣＳで分析して、ＣＤ４^＋Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３^＋細胞のパーセンテージ、およびＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３^＋細胞上のＣＤ２５の発現量を示す蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）を求めた。

２． 結果
２．１ ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒによる制御性Ｔ細胞の誘導
本発明の変異タンパク質の効果を調べるのに適したｉｎ ｖｉｔｒｏの系として、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いた。ＰＢＭＣは、Ｔ細胞（〜７５％；ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞）、ならびにＢ細胞およびＮＫ細胞（〜２５％；陽性）を含むことから、免疫系を十分に表す細胞集団を構成していると言える。

健康な被験者６名のＰＢＭＣ（１０^６ｃｅｌｌ／ｍｌ）を、１０^−１１〜１０^−６Ｍの野生型ＩＬ−２（プロロイキン）またはＩＬ−２−Ｎ８８Ｒ［ＢＡＹ ５０−４７９８、ロット＃ＰＲ３１２Ｃ００８（「ＢＡＹ＃Ｃ００８」）］で刺激した。また、ポジティブコントロールとして、非特異的マイトジェンであるフィトヘマグルチニン５μｇ／ｍｌで刺激したもの（「ＰＨＡ」）を用意し、それとは別に培地のみを加えたもの（「Ｍｅｄ」）も用意した。刺激開始後０日目および６日目に、ＣＤ３^＋リンパ球中の制御性ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞の含有量を測定した。結果を図１および下表３に示す。

この実験から、ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒは、１０^−７Ｍおよび１０^−６Ｍの濃度で制御性Ｔ細胞ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋のサブポピュレーションを顕著に誘導することが分かる。これらの濃度における誘導量は、野生型ｈＩＬ−２でＰＢＭＣを刺激した場合の誘導量を顕著に上回っている。

次の実験では、野生型ｈＩＬ−２刺激と比較して、ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒ刺激後の制御性Ｔ細胞ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋のサブポピュレーションの増加量を検討した。結果を図２および下表４に示す。

この実験でもまた、ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒ刺激によって、制御性Ｔ細胞ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋のサブポピュレーションが顕著に増加しており、１０^−６Ｍの濃度における増加量は、野生型ｈＩＬ−２刺激による増加量を大幅に上回っていることが分かる。

２．２ ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒはメラノーマ患者において制御性Ｔ細胞を誘導する
次に、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質であるｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒが、免疫細胞の抗原特異的な活性化も刺激するかどうか調べた。そのために、メラノーマ患者３名のＰＢＭＣ（１０^６ｃｅｌｌ／ｍｌ）を、メラノーマ関連ペプチドプールの存在下または非存在下において、１０^−１１〜１０^−６ＭのｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒ（ＢＡＹ ５０−４７９８、ロット＃ＰＲ３１２Ｃ００８）または野生型ｈＩＬ−２（プロロイキン）で刺激した。また、５μｇ／ｍｌ ＰＨＡで刺激したもの、および培地のみを加えたものも用意した。次いで、制御性Ｔ細胞ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋およびＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋のサブポピュレーション量をそれぞれ求めた。それぞれの結果を、図３および表５ならびに図４および表６に示す。

注：Peptはペプチドを表す。

この実験から、ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒで処理することにより、メラノーマ患者においても制御性Ｔ細胞が顕著に増加することが明らかになった。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋のサブポピュレーションの場合には１０^−７Ｍおよび１０^−６Ｍの濃度における増加量が、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋のサブポピュレーションの場合には１０^−６Ｍの濃度における増加量が、同じ濃度の野生型ＩＬ−２（プロロイキン）刺激による増加量を大幅に上回っている。

２．３ ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒは多発性硬化症患者において制御性Ｔ細胞を誘導する
次に、本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質であるｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒが、免疫細胞の抗原特異的な活性化も刺激するかどうか調べた。そのために、多発性硬化症患者２名のＰＢＭＣ（１０^６ｃｅｌｌ／ｍｌ）を、多発性硬化症関連ペプチドの存在下または非存在下において、１０^−１１〜１０^−６ＭのｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒ（ＢＡＹ ５０−４７９８、ロット＃ＰＲ３１２Ｃ００８）または野生型ｈＩＬ−２（プロロイキン）で刺激した。また、５μｇ／ｍｌ ＰＨＡで刺激したもの、および培地のみを加えたものも用意した。次いで、制御性Ｔ細胞ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋およびＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋のサブポピュレーション量をそれぞれ求めた。それぞれの結果を、図５および表７ならびに図６および表８に示す。

ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒで処理することにより、多発性硬化症患者においても制御性Ｔ細胞が顕著に増加することが明らかになった。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋のサブポピュレーションの場合には１０^−８Ｍおよび１０^−７Ｍの濃度における増加量が、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋のサブポピュレーションの場合には１０^−６Ｍの濃度における増加量が、同じ濃度の野生型ＩＬ−２（プロロイキン）刺激による増加量を大幅に上回っている。

２．４ 多発性硬化症患者および健康な被験者においてｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒは細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖をほとんど誘導しない
さらに、細胞傷害性ＣＤ８^＋セントラルメモリーＴ細胞の賦活化実験を行った。そのために、健康な被験者または多発性硬化症患者のＰＢＭＣに対して、２．３と同様の処理を行った。ＣＦＳＥｌｏｗ／ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋Ｔ細胞のパーセンテージを分析により求めた。結果を、図７および表９ならびに図８および表１０に示す。

野生型ｈＩＬ−２とは対照的に、多発性硬化症患者においても、健康な被験者においても、ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒに起因するセントラルメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖はわずかであり、これは検討したすべての供試濃度において共通している。

２．５ ｈＩＬ−２変異タンパク質の投与は動物モデルにおいてＩ型糖尿病の発症を抑制する
ＮＯＤマウスにｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒを投与した場合のＣＤ４^＋細胞中のＦｏｘＰ３^＋細胞のパーセンテージの増加は、野生型ｈＩＬ−２を投与した場合よりも大きい（図９（Ａ））。さらに、このＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３^＋陽性細胞は、ＣＤ２５の発現量も野生型ｈＩＬ−２を投与した場合より高い（図９（Ｂ））。図１０に示す通り、マウスＩ型糖尿病モデルにｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒを投与すると、野生型ｈＩＬ−２とは対照的に、投与群のすべてのマウスの糖尿病の発症が抑制される。

３． 結論
本発明者らが行った実験により、制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒｅｇ）を誘導する能力を有する本発明のｈＩＬ−２変異タンパク質およびそのセクションは、自己免疫疾患の治療および／または予防、または生物体におけるＴ_Ｒｅｇの誘導およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＴ_Ｒｅｇの形成に適した物質であることが明確に示された。このことは、本発明者らにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏのみならずｉｎ ｖｉｖｏでも実証されている。

Claims (26)

1. 野生型ヒトインターロイキン２（ｈＩＬ−２）のアミノ酸番号に基づいて、第２０位、第８８位および第１２６位のアミノ酸のうち少なくとも１つが置換されているｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントの、自己免疫疾患の治療および／または予防のための薬剤を製造するための使用。
2. 第８８位の置換により、アスパラギンがアルギニンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒ）、グリシンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｇ）、またはイソロイシンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｉ）ことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
3. 第２０位の置換により、アスパラギン酸がヒスチジンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｄ２０Ｈ）、イソロイシンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｄ２０Ｉ）、またはチロシンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｄ２０Ｙ）ことを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
4. 第１２６位の置換により、グルタミンがロイシンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｑ１２６Ｌ）ことを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の使用。
5. ｈＩＬ−２変異タンパク質、すなわち野生型ｈＩＬ−２において第２０位、第８８位および第１２６位のアミノ酸のうち少なくとも１つは置換されているがそれ以外には置換が施されていない変異タンパク質、またはそのフラグメントにおいて、第２０位、第８８位、第１２６位のいずれでもない任意の位置におけるアミノ酸のうち少なくとも１つがさらに置換されており、このさらなる置換が施されたｈＩＬ−２変異タンパク質、またはさらなる置換が施されたｈＩＬ−２変異タンパク質のセクションのアミノ酸配列が、元のｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのセクションのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９９％の相同性を有することを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の使用。
6. 第２０位、第８８位、第１２６位のいずれでもない任意の位置における少なくとも１つのさらなる置換が、アミノ酸の保存的置換であることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
7. 前記薬剤が、免疫抑制剤をさらに含むことを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の使用。
8. 前記免疫抑制剤が、デコルチン、プレドニゾール（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ）を含むグルココルチコイド；アザチオプリン；シクロスポリンＡ；ミコフェノール酸モフェチル；タクロリムス；抗Ｔリンパ球グロブリン、例えばムロモナブを含む抗ＣＤ３抗体；バシリキシマブおよびダクリズマブを含む抗ＣＤ２５抗体；インフリキシマブおよびアダリムマブを含む抗ＴＮＦ−α抗体；アザチオプリン；メトトレキサート；シクロスポリン；シロリムス；エベロリムス；フィンゴリモド；セルセプト；マイフォーティック；およびシクロホスファミドからなる群より選ばれることを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の使用。
9. 前記自己免疫疾患が、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症、慢性胃炎、クローン病、バセドウ病、ベヒテレフ病、乾癬、重症筋無力症、自己免疫性肝炎、自己免疫性多腺性内分泌不全症（ＡＰＥＣＥＤ）、チャーグ・ストラウス症候群、潰瘍性大腸炎、糸球体腎炎、ギラン・バレー症候群、橋本病、硬化性苔癬、全身性エリテマトーデス、小児自己免疫性溶連菌関連性精神神経障害（ＰＡＮＤＡＳ）、リウマチ熱、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、白斑、自己免疫性腸症、グッドパスチャー症候群、皮膚筋炎、多発性筋炎、自己免疫性アレルギー疾患、喘息および臓器移植後の自己免疫反応からなる群より選ばれることを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の使用。
10. 前記薬剤が、薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の使用。
11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用におけるｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントを含むことを特徴とする、自己免疫疾患の治療および／または予防のための医薬組成物。
12. 野生型ヒトインターロイキン２（ｈＩＬ−２）のアミノ酸番号に基づいて、第２０位、第８８位および第１２６位のアミノ酸のうち少なくとも１つが置換されているｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのセクションの、生物体における制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒｅｇ）形成のための薬剤を製造するための使用。
13. 第８８位の置換により、アスパラギンがアルギニンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｒ）、グリシンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｇ）、またはイソロイシンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｎ８８Ｉ）ことを特徴とする、請求項１２に記載の使用。
14. 第２０位の置換により、アスパラギン酸がヒスチジンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｄ２０Ｈ）、イソロイシンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｄ２０Ｉ）、またはチロシンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｄ２０Ｙ）ことを特徴とする、請求項１２または１３に記載の使用。
15. 第１２６位の置換により、グルタミンがロイシンに置換されている（ｈＩＬ−２−Ｑ１２６Ｌ）ことを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の使用。
16. ｈＩＬ−２変異タンパク質、すなわち野生型ｈＩＬ−２において第２０位、第８８位および第１２６位のアミノ酸のうち少なくとも１つは置換されているがそれ以外には置換が施されていない変異タンパク質、またはそのフラグメントにおいて、第２０位、第８８位、第１２６位のいずれでもない任意の位置におけるアミノ酸のうち少なくとも１つがさらに置換されており、このさらなる置換が施されたｈＩＬ−２変異タンパク質、またはさらなる置換が施されたｈＩＬ−２変異タンパク質のセクションのアミノ酸配列が、元のｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのセクションのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９９％の相同性を有することを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の使用。
17. 第２０位、第８８位、第１２６位のいずれでもない任意の位置における少なくとも１つのさらなる置換が、アミノ酸の保存的置換であることを特徴とする、請求項１６に記載の使用。
18. 前記薬剤が、医薬組成物であって、薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の使用。
19. 前記医薬組成物が、免疫抑制剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１８に記載の使用。
20. 前記免疫抑制剤が、デコルチン、プレドニゾール（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ）を含むグルココルチコイド；アザチオプリン；シクロスポリンＡ；ミコフェノール酸モフェチル；タクロリムス；抗Ｔリンパ球グロブリン、例えばムロモナブを含む抗ＣＤ３抗体；バシリキシマブおよびダクリズマブを含む抗ＣＤ２５抗体；インフリキシマブおよびアダリムマブを含む抗ＴＮＦ−α抗体；アザチオプリン；メトトレキサート；シクロスポリン；シロリムス；エベロリムス；フィンゴリモド；セルセプト；マイフォーティック；およびシクロホスファミドからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
21. 請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の使用におけるｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントを含むことを特徴とする、生物体における制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒｅｇ）形成のための薬剤。
22. （ａ）ヒトインターロイキン２変異タンパク質（ｈＩＬ−２変異タンパク質）またはそのフラグメントを準備する工程、
    （ｂ）前記ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントを生物体へ投与する工程、および
    （ｃ）必要に応じて、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返し行う工程
    を含む、生物体における自己免疫疾患の治療および／または予防のための方法であって、
    前記ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントが、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用におけるｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのセクションであることを特徴とする方法。
23. （ａ）ヒトインターロイキン２変異タンパク質（ｈＩＬ−２変異タンパク質）またはそのフラグメントを準備する工程、
    （ｂ）前記ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントを生物体へ投与する工程、および
    （ｃ）必要に応じて、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返し行う工程
    を含む、生物体における制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒｅｇ）の形成方法であって、
    前記ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントが、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の使用におけるｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントであることを特徴とする方法。
24. （ａ）ヒトインターロイキン２変異タンパク質（ｈＩＬ−２変異タンパク質）またはそのフラグメントを準備する工程、
    （ｂ）前記ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントを末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に接触させる工程、および
    （ｃ）必要に応じて、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返し行う工程
    を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒｅｇ）の形成方法であって、
    前記ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントが、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の使用におけるｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのセクションであることを特徴とする方法。
25. （ａ）ヒトインターロイキン２変異タンパク質（ｈＩＬ−２変異タンパク質）またはそのフラグメントを準備する工程、
    （ｂ）前記ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントを第１の生物体由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に接触させる工程、
    （ｃ）前記ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントを前記ＰＢＭＣとインキュベートして、制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒｅｇ）を含む細胞集団を得る工程、および
    （ｄ）前記細胞集団を第２の生物体へ導入する工程
    を含む、生物体における自己免疫疾患の治療および／または予防のための方法であって、
    前記ｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントが、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用におけるｈＩＬ−２変異タンパク質またはそのフラグメントであることを特徴とする方法。
26. 前記第１の生物体と前記第２の生物体が同一の生物体であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。

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