USO DE UMA MUTEÍNA DE INTERLEUCINA HUMANA-2 (MUTEÍNA DE HIL-2) E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA O TRATAMENTO E/OU PROFILAXIA DE UMA DOENÇA AUTOIMUNE
A presente invenção se refere a um agente para o tratamento e/ou profilaixia de uma doença autoimune, um agente para a formação de células T regulatórias (TReg) em um organismo e vários métodos nos quais os agentes de acordo com a invenção são usados.
Doenças autoimunes são caracterizadas por uma reação excessiva do sistema imune contra o tecido edgóneno. O sistema imune erroneamente reconhece o tecido endógeno como corpos estranhos a serem combatidos. Isto resulta em reações inflamatórias graves, as quais causam danos aos órgãos por elas afetados.
Uma parte importante na distinção entre a estrutura endógena e a exógena é desempenhada por linfócitos T ou células T, que são “treinados” no timo para se fixar somente sobre moléculas de superfície de células endógenas, as chamas moléculas de MHC, e assim tolerar estruturas endógenas. Estes processos são denominados “deleção clonal”. Durante a seleção inicial no timo, somente essas células T, que são capazes de reconhecer moléculas de MHC sobre as membranas de células endógenas sobrevivem, enquanto a ligação, no entanto, não é tão forte a ponto de causar a ativação das células T. As células T que não podem se ligar ou reconhecer moléculas de MHC endógenas são eliminadas. Na deleção clonal que também ocorre no timo, estas células T que são capazes de reconhecer sem erro e ligar fortemente moléculas de MHC endógenas de forma que elas seriam ativadas, o que no fim causaria a destruição de células endógenas, são eliminadas. Este processo é uma das medidas que o sistema imune toma para ser capaz de proteger “a si próprio” e combater o “exógeno”.
Em doenças autoimunes, um grupo das células T se comporta de forma anormal. Além do a defesa ainda em funcionamento contra moléculas e organisPetição 870190116320, de 11/11/2019, pág. 9/14
2/27 mos exógenos, elas agora também atacam a estrutura endógena. Órgãos e tecidos são percebidos como exógenos. Pode haver diversas conseqüências: se estruturas vitais forem afetadas, uma doença autoimune tomará um rumo fatal. O sistema imune direciona sua defesa contra estas estruturas, são acionadas reações celulares e de defesa humorosa, e auto anticorpos são formados, em conseqüência do que os órgãos afetados no decorrer do tempo param de funcionar. Mais comumente, o sistema imune é enfraquecido e o corpo se toma suscetível a todos os tipos de doenças. Sob algumas circunstâncias, o reconhecimento do exógono também é interrompido, e como resultado a dispersão de células de câncer degeneradas não pode mais ser efetivamente prevenida, e os afetados são mais suscetíveis a doenças infecsiosas. No curso da doença, as células do sistema imune destróem as estruturas endógenas, enquanto os mecanismos de reparo do corpo tentam o máximo possível regenerar as partes danificadas dos órgãos. Via de regra, sem tratamento este ataque errôneo do sistema defensivo continua ao longo da vida ou até a destruição completa da estrutura alvo.
Apesar de pesquisas intensivas, as causas exatas de doenças autoimunes ainda são incertas. Hipóteses aceitas são baseadas na assunção de que doenças autoimunes são adquiridas através de uma pré-disposição genética, e.g. devido à presence de certos tipos de moléculas de MHC, em combinação com influências externas. Se tais fatores determinados geneticamente estiverem presentes no copor da pessoa afetada e, além disso, fatores ambientais desfavoráveis tais como estresse grave, infecções, gravidez etc. ocorrerem, isto pode causar os primeiros sintomas de doenças autoimunes.
O sistema imune consiste de várias células que são capazes de combater agentes infecciosos que tenham invadido o corpo. O mecanismo da resposta imune inclui a ativação de células especializadas e a aquisição de funções causadoras, tais como a citotoxicidade de certas células T, que expressam a chama glicoproteína de transmembrana CD8 e que são, portanto descritas como células CD8+ T.
As células T regulatórias (TReg), anteriormente também descritas como células T supressoras, são um subgrupo especializado das células T. Elas têm a função de suprimir a ativação do sistema e imuna e através disso regular a autotolerância do sistema imune. Como resultado, no organismo saudável elas impedem o aparecimento de doenças autoimunes. Diversas populações de TReg tem sido descritas, inclusive as que expressam as proteínas CD4, CD25 e Foxp3 e
3/27 são portanto descritas como células T CD4+CD25+Foxp3+. Além disso, TReg tem sido descritas expressando CD4 e Foxp3, mas não CD25, as chamadas células T CD4+CD25'Foxp3+.
Lan et al. (2005), Regulatory T cells: development, function e role in autoimmunity, Autoimmun. Rev. 4(6), p. 351 a 363, descreve um modelo murino no qual a depleção de células T regulatórias CD4+CD25+ levam ao desenvolvimento espontâneo de doenças autoimunes.
Chatila T.A. (2005), Role of regulatory T cells in human diseases, 116(5), p. 949 a 959, reporta que uma deficiência congênita de células T regulatórias CD4+CD25+ devido a uma mutação no gene que codifica para a proteína Foxp3 contribui para o desenvolvimento de doenças autoimunes.
Há uma revisão a respeito de células T regulatórias no jornal “Nature Immunology”, que foi publicada em março de 2005.
Doenças autoimunes são tratadas de acordo com o órgão afetado. Neste aspecto, o princípio básico da terapia causai é suprimir a atividade do sistema imune através da administração de imunosupressantes, e.g. cortisona. Estas substâncias são caracterizadas por diversos efeitos colaterais e interações sistêmicas, devido aos quais foram realizadas tentativas para desenvolver novas drogas que influenciem especificamente os mecanismos envolvidos no evento da doença. Exemplos disto são natalizumabe e infliximabe. Natalizumabe é um anticorpo monoclonal e inibidor seletivo de lgG4, uma molécula de adesão que é localizada na superfície das células sanguíneas brancas. Natalizumabe inibe a migração de células sanguíneas brancas para o foco da inflamação e é usada para o tratamento de formas especificamente agressivas de esclerose múltipla progressiva em placas. Infliximabe é um anticorpo monoclonal quimérico contra o fator a de necrose de tumor (TNFa), que desempenha um papel importante nas reações inflamatórias autoimunes. Infliximab é usado em artrite reumatóide, doença de Crohn, doença de Bechterew e psoríase.
Em Ehrenstein et al. (2004), Compromised function of regulatory T cells in rheumatoid arthritis e reversal by anti-TNFa therapy, J. Exp. Med., Vol. 200, No. 3, p. 277-285, é reportado que, como um anticorpo monoclonal direcionado contra TNFa, infliximab pode melhorar a terapia de artrite reumatóide.
Uma sugestão similar é feita por Nadkarni et al. (2007), Anti-TNFa therapy induces a distinct regulatory T cell population in patients with rheumatoid arthritis via TGF-β, JEM Vol. 204, p. 33-39.
Bresson et al. (2006) suger o tratamento de diabetes tipo I pela administra4/27 ção combinada de um anticorpo anti- CD3e específico e um peptídeo de proinsulina.
Vandenbark et al. (2008), Therapeutic vaccination with a trivalent T-cell receptor (TOR) peptide vaccine restores deficient FoxP3 expression e TOR recognition in subjects with multiple sclerosis, Immunology Vol. 123, p. 66-78, descreve uma melhora no controle da resposa autoreativa em esclerose múltipla após a vacinação dos pacientes com determinedos peptideos de TOR.
Embora estas substâncias mais novas ajam de forma muito específica, podem ocorrer efeitos colaterais graves, e.g. o aparecimento de leucoencefalopatia multifocal progressiva. Por esta razão, somente três meses após seu primeiro registro nos EUA, natalizumab foi novamente retirada do mercado. Os custos destas novas substâncias ativas são muito altos. Atualmente, 300 mg de natalizumab custa mais de 2.000,00 Euros. 200 mg de infliximabe custa cerca de 1.700,00 Euros.
Contra este fundamento, o propósito da presente invenção é fornecer uma nova composição farmacêutica para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença autoimune, com a qual as desvantagens devido ao estado da técnica são evitadas o máximo possível. Em particular, deve ser fornecida uma composição farmacêutica que é caracterizada por boa tolerância e baixa toxicidade.
É ainda um objetivo desta invenção fornecer um agente para a formação de células T regulatórias (TReg) em um organismo.
Estes problemas são resolvidos através do fornecimento de uma muteína de interleucina humana 2 (muteína hlL-2) ou uma seção ou fragmento da mesma, que é numerada em conformidade com a hlL-2 do tipo selvagem e tem uma substituição de aminoácido em pelo menos uma das posições 20, 88 ou 126.
Os inventores surpreendentemente descobriram que tal muteína de hlL-2 ou um fragmento da mesma tem um alto potencial terapêutico que pode ser utilizado para o tratamento e profilaxia de doenças autoimunes. Desta forma, por exemplo, eles foram capazes de demonstrar em diversas preparações experimentais que a muteína de hlL-2 seletivamente induz a formação de células T regulatórias tais como CD4+CD25+Foxp3+ e CD4+CD25Foxp3+ em um organismo.
Surpreendentemente, a muteína de hlL-2 de acordo com a invenção exibe notavelmente maior atividade sobre as células T regulatórias do que a hlL-2 do tipo selvagem. Isto fica particularmente evidente em concentrações altas.
Para a muteína de hlL-2, de acordo com a invenção, é divulgado em WO 99/60128 que ela se liga mais fortemente ao receptor de IL-2 de cadeia tripla (IL5/27
2Rc$y) do que ao receptor de IL-2 de cadeia dupla (IL-2RPy). Como os inventores foram, agora, capazes de mostrar pela primeira vez, comparada à hlL2 do tipo selvagem, a muteína de hlL-2 de acordo com a invenção induz, mas surpreendentemente também intensifica, a formação destas células T regulatórias que carecem da subunidade α do receptor de IL-2 (CD25) (CD4+CD25'Foxp3+). Esta subpopulação ainda contribui para a supressão da ativação do sistema imune e por meio disto para a regulação da auto-tolerância do sistema imune. Como resultado, a muteína de hlL-2 de acordo com a invenção exibe consideravelmente potência maior como uma substância ativa para o traamento de doenças autoimunes do que a hlL-2 do tipo selvagem.
Os inventores também foram capazes de demonstrar que uma muteína de hlL-2 induz a formação de células T regulatórias CD8 positivas, tais como CD3+CD4'CD25+Foxp3+ e CD3+CD4CD25’Foxp3+ (dados não mostrados) que desempenham um papel decisivo na supressão de doenças autoimunes.
Além disso, a muteína de hlL-2 de acordo com a invenção tem a vantagem adicional comparada à hlL-2 do tipo selvagem de seletivamente ativar células T em oposição a células assassinas naturais (célulasNK) e como resultado exibe um perfil de toxicidade reduzido e um índice terapêutico aumentado. Em consequência, a muteína de hlL-2 de acordo com a invenção é consideravelmente melhor tolerada do que a hlL-2 do tipo selvagem; veja WO 99/60128.
For a isto, com base nas células T CD3+CD8+CD45RO+ citotóxicas, pôde ser mostrado pela primeira vez que ao contrário da hlL-2 do tipo selvagem, a muteína dehlL-2 de acordo com a invenção surpreendentemente tem nenhum ou somente um leve efeito sobre a profileração de células citotóxicas CD8 positivas que também são descritas como “inofensivas, memória central, diferenciadas desde o início” e células T CD8 “diferenciadas recentemente”. Isto é vantajoso visto que as células T citotóxicas CD8+ são tidas como responsáveis por processos inflamatórios crônicos, persistentes em doenças autoimunes ; cf. Liu et al. (2007), Multiple Sclerosis, 13, p. 149, e Haegele et al. (2007), Neuroimmunol, 183, p. 168). Desta forma, comparada à hlL-2 do tipo selvagem, a muteína de hlL-2 de acordo com a invenção impede uma intensificação posterior desta reação inflamatória causada pelas células T CD8+, o que representa mais uma vantagem de tolerância.
Como os inventores também foram capazes de mostras, a muteína de hlL2 de acordo com a invenção também estimula a atividade específica de antígenos das células imunes. Isto tem a vantagem de que, através da muteína de hlL-2, as
6/27 células imunes a doenças específicas são seletivamente estimuladas e por meio disto o efeito sistêmico do sistema imune é limitado. Como resultado, a indução de outras doenças devido à administração da muteína de hlL-2 também é impedida.
Além disso, com base em um modelo murino de diabetes mellitus do tipo I, os inventores foram capazes de mostrar que o aparecimento de uma doença autoimune pode ser prevenido pelo tratamento com a muteína de hlL-2 conforme a invenção.
O problema subjacente à invenção é, assim, completamente resolvido.
De acordo com a invenção, “tipo selvagem” de interleucina humana 2 (hlL2 wild type) é entendido como um polipeptídeo ou proteína que tem uma seqüência de aminoácidos de 133 aminoácidos que está presente na IL-2 humana natural (sem o peptídeo sinal que consiste de um aminoácido de terminal-N 20). hlL-2 do tipo selvagem pode ser expressa tanto natural como recombinantemente. A seqüência de aminoácidos de hlL-2 do tipo selvagem é descrita em Fujita et al. (1983), PNAS USA 80, p. 7437-7441, com e sem uma metionina de terminal-N adicional, que é necessariamente presente quando a proteína é expressa em E. coli como uma fração intracelular. A seqüência de aminoácidos da hlL-2 do tipo selvagem é divulgada no protocolo de seqüência anexado sob ID DE SEQ N° 1. A seqüência de nucleotídeos do cDNA que codifica para hlL-2 é divulgada no protocolo de seqüência anexado sob ID DE SEQ N° 2.
De acordo com a invenção, uma “muteína” de interleucina humana 2 (muteína de hlL-2) é entendida como um polipeptídeo ou proteína na qual, comparada à hlL-2 do tipo selvagem, foram efetuadas substituições específicas. A identificação das posições onde as substituições foram efetuadas é baseadas nas posições dos aminoácidos na hlL-2 do tipo selvagem,que podem, por exemplo, ser tiradas da ID DE SEQ N° 1. Conseqüentemente, uma alanina (A) é localizada na posição
1, uma prolina (P) na posição 2, uma treonina (T) na posição133, etc. O resíduo de ácido aspártico (D) na posição 20 (“D20”) pode, por exemplo, ser substituído por um resíduo de isoleucina (I) ou uma histidina (H), de forma as muteínas de IL-
2, que são descritas comohlL-2-D20l e hlL-2-D20H, respectivamente, sejam formadas.
É óbvio que a muteína de hlL-2 de acordo com a invenção pode ser substituída em algumas das posições determinadas 20, 88 ou 126, de forma que os mutantes de combinação que são especificamente adequados para o tratamento de uma doença autoimune ou para a indução de células T regulatórias sejam
7/27 formados.
De acordo com a invenção, uma muteína de hlL-2 também inclui um polipeptídeo modificado, por exemplo, uma muteína de hlL-2 glicosilada. Muteínas de hlL-2 glicosiladas são, por exemplo, divulgadas nos pedidos de patente NorteAmericanos 09/310,026 e 10/051,657, que são incorporados nesta invenção por referência.
De acordo com a invenção, uma “seção” ou “fragmento da muteína de hlL2 é entendido como um polipeptídeo no qual, em comparação à muteína de hlL-2, um ou mais aminoácidos estão faltando no terminal-N e /ou -C, mas contudo este exibe atividade biológica suficiente da muteína de hlL-2 para ser usado de acordo com a invenção para o tratamento e/ou profilaxia de doenças autoimunes. Esta atividade é considerada suficiente se a seção ou fragmento exibe pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% e mais preferivelmente pelo menos 95% da atividade da muteína de hlL-2 para a indução de células T regulatórias. A atividade da muteína de hlL-2 pode facilmente ser medida pelos métodos conhecidos por alguém versado na técnica. Tal método é por exemplo divulgado em WO 99/60128, exemplos 3 a 5. Por referência, esta publicação é incorporada à presente divulgação.
De acordo com a invenção é preferível que as subsituições nas posições determinadas não sejam substituições conservadoras através das quais um aminoácido seja trocado por outro com propriedades bioquímicas similares.
Neste aspecto, é preferível que as substituições na posição 20 não sejam uma em que o ácido aspártico (D) é trocado por um ácido glutâmico (E). Preferivelmente, a substituição na posição 88 não é uma em que a asparagina (N) é trocada por uma alanina (A), prolina (P), glycina (G), glutamina (Q), serina (S) ou treonina (T). Além disso, a substituição na posição 126 preferivelmente não é uma em que a glutamine (Q) é trocada por uma alanina (A), prolina (P), glicina (G), asparagina (N), serina (S) ou treonina (T). Estas substituições não alterariam ou só alterariam insignificantemente a atividade biológica da hlL-2 do tipo selvagem.
Além disto, é preferível que nenhuma substituição que introduza sítios para ligação cruzada intermolecular ou ligações de pontes de dissulfeto incorretas sejam efetuadas nas posições determinadas. Portanto, a substituição da muteína de hlL-2 de acordo com a invenção na posição 20 preferivelmente não é uma em que o ácido aspártico (D) is é trocado por uma arginina (R), asparagina (N), ácido aspártico (D), cisteína (C), ácido glutâmico (E), glicina (G), leucina (L), lisina (K),
8/27 fenilalanina (F), prolina (P), treonina (T) ou triptofano (W). A substituição na posição 88, preferivelmente, não é uma em que a asparagina (N) é trocada por ácido aspártico (D), cisteína (C), glutamina (Q), triptofano (W) ou prolina (P). A substituição na posição 126, preferivelmente, não é uma em que a glutamina (Q) é trocada por uma alanina (A), histidina (H), triptofano (W), cisteína (C), glutamina (Q), ácido glutâmico (E) or lisina (K).
A muteína de hlL-2 de acordo com a invenção pode ser preparada por qualquer método adequado conhecido no estado da técnica. Tais métodos compreendem a construção de uma seqüência de DNA que codifica para a muteína de IL de acordo com a invenção e por exemplo inclui a seqüência de nucleotídeos de ID DE SEQ N° 2 e a expressão desta seqüência em um hospedeiro adequado. Este método leva às muteínas de acordo com a invenção em forma recombinante. No entanto, a muteína de acordo com a invenção pode também ser preparada por síntese química ou uma combinação de síntese química e tecnologia de DNA recombinante. A preparação da muteína de acordo com a invenção é descrita detalhadamente em WO 99/60128, modalidades 1 e 2, que são incorporadas à presente divulgação por referência.
Uma muteína de hlL-2 particularmente preferencial de acordo com a invenção, na qual na posição 88 a asparagina (N) é trocada por uma arginina (R) (hlL2-N88R), é disponível para as pessoas versadas na técnica sob o nome BAY504798; veja Shanafelt et al. (2000), A T-cell-selective interleukin 2 mutein exhibits potent antitumor activity e is well tolerated in vivo, Nat. Biotechnol. Vol. 18, p. 1197-1202. A seqüência de aminoácidos de hlL-2-N88R é divulgada no protocolo de seqüência anexado sob a ID DE SEQ N° 3.
As descobertas dos inventores foram especialmente supreendentes porque não foi encontrada nenhuma indicação de tal atividade da muteína de LI-2 no estado da técnica.
Assim, em WO 99/60128, para a muteína hlL-2-N88R, é divulgado que esta pode ativar seletivamente células T em oposição a células assassinas naturais, sendo capaz de reduzir a formação de metástase no pulmão.
Em WO 02/00243, é descrita uma formulação estável, contendo histidina e livre de albumina para a muteína hlL-2-N88R.
Em US 2002/0164300, uma variante glicosilada da muteína hlL-2-N88R é descrita.
O uso da muteína de hlL-2 de acordo com a invenção para o tratamento alvejado e/ ou profilaxia de doenças autoimunes ou para a ativação seletiva de
9/27 células regulatórias em um organismo não é descrito nem considerado óbvio no estado da técnica.
Mesmo para a IL-2 do tipo selvagem humana, não há descobertas correspondents.
Van der Vliet et al. (2007), Effects of the administration of high-dose interleukin-2 on immunoregulatory cell subsets in patients with advanced melanoma e renal cell cancer, Clin. Cancer Res. Vol. 13, p. 2100-2108, reporta que na administração de doses altas de IL-2 sua eficácia terapêutica para o tratamento de tumores é reduzida.
Ahmadzadeh e Rosenberg (2006), IL-2 administration increases CD4+CD25hlFoxp3+ regulatory! cells in cancer patients, Blood, Vol. 107, p. 24092414, propõe melhora da eficácia terapêutica de IL-2 do tipo selvagem humana em pacientes com tumores através da eliminação das células T regulatórias dos pacientes. No entanto, esta abordage mostrou-se não ser promissora; veja Powell et al. (2007), Inability to mediate prolonged reduction of regulatory T cells after transfer of autologous CD25-depleted PBMC e interleukin-2 after lymphodepleting chemotherapy, J. Immunother. Vol. 30, p. 438-447.
Antony e Restifo (2005), CD4+CD25+ T regulatory cells, immunotherapy of cancer, e interleukin-2, J. Immunother. Vol. 28, p. 120-128, de certa forma deduzem IL-2 como um agente imuno-terapêutico e até mesmo reportam que a administração de IL-2 pode induzir autoimunidade.
Knoechel et al. (2005), Sequential development of interleukin 2-dependent effector e regulatory T cells in response to endogenous systemic antigen, JEM Vol. 202, p. 1375-1386, inclinam para a mesma opinião e até mesmo sugerem antagonismo de IL-2, i.e. inibição de mecianismos de IL-2, a fim de tratar a fase inicial de doenças autoimunes.
Portanto, no estado da técnica não há nenhum indício que torne a solução de acordo com a invenção óbvia.
Desta forma, os inventores também descobriram que os efeitos terapêuticos da muteína de hlL-2 podem ser diferentes dependendo da indicação e da concentração usada. Uma alta concentração de hlL-2 pode ser vantajosa para o tratamento de doenças autoimunes, mas contra-indicados na terapia de doenças de tumores.
No uso de acordo com a invenção é preferível que através da substituição na posição 88 uma asparagina seja trocada por uma arginina (hlL-2-N88R), ou por uma glicina (hlL-2-N88G), or por uma isoleucina (hlL-2-N88l), e/ou através da
10/27 substituição na posição 20 um ácido aspártico seja trocado por uma histidina (hlL-2-D20H), ou por uma isoleucina (hlL-2-D20l), ou por uma tirosina (hlL-2-D20Y), ou através da substituição na posição 126 uma glutamina seja trocada por uma leucina (hlL-2-Q126L).
Esta medida tem a vantagem de que uma muteína de hlL-2 de acordo com a invenção que se distingue à medida que especificamente ativa de forma seletiva células T em oposição a células assassinas naturais e portanto exibe um alto potencial terapêutico e baixa toxicidade é usada. Estas propriedades das muteínas de hlL-2 preferenciais de acordo com a invenção são descritas em WO 99/60128, que é incorporado à presente divulgação por referência.
De acordo com a invenção, é preferível que a muteína de hlL-2 ou o fragmento da mesma tenha pelo menos uma substituição de aminoácido adicional em qualquer posição exceto as posições 20, 88 ou 126 de forma que a então muteína de hlL-2 substituída adicional ou o então fragmento ou seção substituída adicional da mesma tenha uma seqüência de aminoácidos que seja pelo menos 80%, preferivelmente 85%, mais preferivelmente 90%, mais preferivelmente 95%, mais preferivelmente 99% idêntica à seqüência de aminoácidos da muteína de hlL-2 ou da seção ou fragmento da mesma, que não é mais substituída em comparação à hlL-2 do tipo selvagem, além de em pelo menos uma das posições 20, 88 ou 126.
Esta medida tem a vantagem de que estruturas primárias alternativas são fornecidas, as quais são em alguns casos mais fáceis de sintetizar do que a muteína de hlL-2, que além de em pelo menos uma das posições 20, 88 ou 126 corresponde de forma diversa à hlL-2 do tipo selvagem. Para obter um polipeptídeo com a atividade biológica da muteína de hlL-2 ou da seção da mesma, e portanto uma droga para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença autoimune, não é absolutamente necessário fornecer um polipeptídeo que tenha uma seqüência de aminoácidos100% idêntica à seqüência de aminoácidos da muteína de hlL-2 ou seção da mesma de acordo com a invenção. Pelo contrário, é suficiente se identidade adequadamente alta estiver presente, enquanto perdas de atividade moderada necessárias forem toleráveis, mas de preferência pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% da atividade for retida. As identidades determinadas são baseadas em uma seção da muteína de hlL-2 de acordo com a invenção com >10 aminoácidos. O grau de homologia pode facilmente ser determinado por métodos conhecidos por pessoas versadas na técnica, por exemplo uma análise BLAST, ou uso de módulo de MegAlign do programa Lasergene da DNAStar Inc.
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De acordo com a invenção é ainda preferível que a substituição de aminoácido adicional em qualquer posição exceto as posições 20, 88 ou 126 seja uma substituição de aminoácido conservadora.
Esta medida tem a vantagem de que variantes adicionais da muteína de hlL-2 de acordo com a invenção que exibem atividade suficientemente alta para o tratamento e/ou profilaxia de doenças autoimunes ou para a indução de células T regulatórias em um organismo são fornecidas. É conhecido para pessoas versadas na técnica que as substituições conservadoras não tem nenhum efeito ou efeito mínimo sobre a estrutura secundária ou terciária da muteína. Tais substituições conservadoras incluem as descritas por Dayhoff em The Atlas of Protein Sequence e Structure. Vol. 5, Natl. Biomedical Research. Por exemplo, aminoácidos que pertencem a um dos grupos a seguir podem ser trocados um pelo outro, i.e. constituem uma troca conservadora:
- Alanina (A), prolina (P), glicina (G), asparagina (N), serina (S), treonina (T);
- Cisteína (C), serina (S), tirosina (Y), treonina (T);
- Valina (V), isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), alanina (A), fenilalanina (F);
- Lisina (K), arginina (R), histidina (H);
- Fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W), histidina (H); e
- Ácido aspártico (D), ácido aspártico (E).
O agente de acordo com a invenção para a indução da formação de células T regulatórias em um organismo é preferivelmente uma composição farmacêutica que contém um transportador farmaceuticamente aceitável.
Esta medida tem a vantagem de que o agente já fornecido em uma forma que permite a administração direta ao organismo, de preferência a uma pessoa.
Transportadores farmaceutircamente aceitáveis são de modo abrangente descritos no estão da técnica; veja Row et al. (2006), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5a edição, Pharmaceutical Press e American Pharmacists’ Association; Bauer et al. (1999), Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart. Uma formulação especificamente preferencial é a divulgada em WO 02/00243, que por referência é um componente da presente divulgação. Esta formulação é livre de albumina e a estabilização da muteína de hlL-2 ou seção da mesma é efetuada com histidina. Preferivelmente, a droga finalizada tem os seguintes componentes nas seguintes concentrações: muteína de hlL-2 ou uma seção da mesma = 0,1-5 mg/ml; histidina = 0,08-1,6
12/27 wt.%; NaCI = 0-0,9 wt.%; sacarose = 1- 10 wt.%; glicina = 0-0.3 wt.%, e tem um valor de pH de cerca de 5 a 6,5.
De acordo com uma modalidade específica, a composição farmacêutica também contém um imunosupressante.
Por conta da potência especial da muteína de hlL-2 de acordo com a invenção, a composição farmacêutica já pode ser usada como uma monopreparação para o tratamento e/ou profilaxia de doenças autoimunes. Tal monopreparação contém a muteína de hlL-2 de acordo com a invenção como a única substância ativa. Neste contexto, transportadores farmaceuticamente aceitáveis, solventes (tampões, água, etc.), aditivos etc. não são substâncias ativas.
Esta medida tem a vantagem de que o índice terapêutico da droga de acordo com a invenção é aumentado ainda pela inclusão de um imunosupressante padrão.
Preferivelmente, o imunosupressante é selecionado de um grupo que consiste de glucocorticóide, incluindo decortina, prednisol; azatioprina; ciclosporina A; micofenolato mofetil; tacrolimus; globulina de linfócito anti-T, anticorpos anti-CD3, incluindo muromonabe; anticorpos anti-CD25, incluindo basiliximabe e daclizumabe; anticorpos anti-TNF-α, incluindo infliximabe e adalimumabe; azatioprina; metotrexato; ciclosporina; sirolimus; everolimus; fingolimode; CelICept; myfortic e ciclofosfamido.
Esta medida tem a vantagem de que um imunosupressante que tem atividade demonstravelmente terapêutica em doenças autoimunes e é suficientemente disponível no estado da técnica é usado.
Além disso, é preferível que a doença autoimune seja selecionada de um grupo que consiste de: diabetes mellitus do tipo I, artrite reumatóide, esclerose múltipla, gastrite crônica, doença de Crohn, doença de Basedow, doença de Bechterew, psoríase, miastenia grave, hepatite autoimune, APECED, síndrome de Chrug-Strauss, colite ulcerativa, glomerulonefrite, síndrome de Guillain-Barré, tireoidite de Hashimoto, esclerose de líquen, lupus eritematoso sistêmico, PANDAS, febre reumática, sarcoidose, síndrome de Sjõrgren, síndrome de StiffMan, escleroderma, granulomatose de Wegener, vitiligo, enteropatia autoimune, síndrome de Goodpasture, dermatomiosite, polimiosite, alergia autoimune, asma e reação autoimune após transplantes de órgãos.
Esta medida tem a vantagem de que uma droga que pode ser usada para o tratamento e/ou profilaxia das doenças autoimunes mais importantes é fornecida.
Um outro assunto da presente invenção se refere a uma composição far13/27 macêutica para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença autoimune, que contém a muteína de hlL-2 de acordo com a invenção ou um fragmento da mesma.
As propriedades, vantagens e definições descritas em relação ao uso de acordo com a invenção da mesma forma se aplicam para a composição farmacêutica de acordo com a invenção.
Um outro assunto da presente invenção se refere a um agente para a formação de células T regulatórias (TReg) em um organismo, que contem a muteína de hlL-2 de acordo com a invenção ou um fragmento da mesma.
As vantagens, propriedades e definições do uso de acordo com a invenção da mesma forma se aplicam para o agente de acordo com a invenção.
Outros assuntos da presente invenção são métodos para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença autoimune em um organismo e para a formação de células T regulatórias (TReg) em um organismo, em que cada uma compreende as seguintes etapas: (a) fornecimento de uma muteína de interleucina humana 2 (hlL-2 mutein) ou de um fragmento da mesma, (b) administração da muteína de hlL-2 ou da seção da mesma a um organismo, e (c) se necessário repetição das etapas (a) e (b), onde a muteína hlL-2 ou a seção da mesma é a muteína de hlL-2 de acordo com a invenção ou uma seção da mesma.
O organismo é preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um organismo humano.
As propriedades, vantagens e definições descritas com relação ao uso de acordo com a invenção da mesma forma se aplicam para os métodos supramencionados de acordo com a invenção para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença autoimune em um organismo e para a formação de células T regulatórias (TReg) em um organismo.
Um outro assunto da presente invenção se refere a um método para a formação de células T regulatórias (TReg) in vitro, que compreende as seguintes etapas: (a) fornecimento de uma muteína de interleucina humana-2 (muteína de hlL-2) ou de um fragmento da mesma, (b) contato da muteína de hlL-2 ou do fragmento da mesma com células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMCs), e (c) se necessário repetição das etapas (a) e (b), onde a muteína de hlL-2 ou o fragmento da mesma é a muteína de hlL-2 de acordo com a invenção ou um fragmento da mesma.
O contato da hlL-2 ou dos fragmentos da mesma com as PBMCs pode ser efetuado em qualquer meio adequado para a culura das PBMCs.
14/27
As propriedades, vantagens e definições descritas em relação ao uso de acordo com a invenção da mesma forma se aplicam ao método supramencionado de acordo com a invenção para a formação de células T regulatórias (TReg) in vitro.
Um outro assunto da presente invençção se refere a um método para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença autoimune em um organismo, que compreende as seguintes etapas: (a) fornecimento de uma muteína de interleucina humana -2 (muteína de hlL-2) ou de um fragmento da mesma, (b) contato da muteína de hlL-2 ou do fragmento da mesma com células sanguíneas mononucleares (PBMCs) derivadas de um primeiro organismo, (c) incubação da muteína de hlL-2 ou do fragmento da mesma com as PBMCs, para obter uma população de células que contenha células T regulatórias (TReg), e (d) introdução da população de células em um segundo organismo, onde a muteína de hlL-2 ou o fragmento da mesma seja a muteína de hlL-2 de acordo com a invenção ou um fragmento da mesma.
O primeiro organismo e o segundo organismo preferivelmente têm o grupo sanguíneo idêntico, sendo especificamente preferível que o primeiro e o segundo organismo sejam organismos ou indivíduos idênticos.
Aqui é vantajoso que na introdução ou reinfusão da população de células nenhuma reação imune indesejada contra as células ocorra e o método seja, portanto, especificamente baixo em efeitos colaterais.
As propriedades, vantagens e definições descritas com relação ao uso de acordo com a invenção da mesma forma se aplicam ao método supramencionado de acordo com a invenção para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença autoimune em um organismo.
É óbvio que as características indicadas acima e as que ainda serão explicadas abaixo são usáveis não somente na combinação específica mencionada, mas também em outras combinações ou sozinhas, sem fugir do escopo da presente invenção.
Abaixo, a invenção é explicada mais detalhadamente com base em exemplos práticos, que são puramente de natureza exemplificativa e não restringem o escopo da invenção. Nestes, é feita referência às figuras em anexo, que representam o seguinte:
Fig. 1 mostra que a hlL-2-N88R em indivíduos saudáveis em dosagem igual ou inferior em comparação à proleucina induz um aumento maior nas células T regulatórias CD4+CD25+Foxp3+;
15/27
Fig. 2 mostra que a hlL-2-N88R em indivíduos saudáveis em dosagem igual ou inferior em comparação à proleucina induz um aumento maior nas células T regulatórias CD4+CD25Foxp3+;
Fig. 3 mostra que a hlL-2-N88R em pacientes com melanoma em dosagem igual ou inferior em comparação à proleucina induz um aumento maior nas células T regulatórias CD4+CD25+Foxp3+;
Fig. 4 mostra que a hlL-2-N88R em pacientes com melanoma em dosagem igual ou inferor em comparação à proleucina induz um aumento maior nas células T regulatórias CD4+CD25‘Foxp3+;
Fig. 5 mostra que a hlL-2-N88R em pacientes com esclerose múltipla em dosagem igual ou inferior em comparação à proleucina induz um aumento maior nas células T regulatórias CD4+CD25+Foxp3+;
Fig. 6 mostra que a hlL-2-N88R em pacientes com esclerose múltipla em dosagem igual ou inferior em comparação à proleucina induz um aumento maior nas células T regulatórias CD4+CD25Foxp3+;
Fig. 7 mostra que a hlL-2-N88R em pacientes com esclerose múltipla em dosagem igual ou superior em comparação à proleucina induz um aumento menor nas células T CD3+CD8+CD45RO+ com CFSE baixocitotóxicas;
Fig. 8 mostra que a hlL-2-N88R em indivíduos saudáveis em dosagem igual ou superior em comparação à proleucina induz um aumento menor nas células T CD3+CD8+CD45RO+ com CFSE baixo citotóxicas;
Fig. 9 mostra que a hlL-2-N88R no modelo de diabetes tipo I de rato em comparação à hlL-2 do tipo selvagem causa um aumento de percentagem maior em células FoxP3+ dentro das células CD4+ (A). Além disso, estas células CD4+FoxP3+ exibem expressão maior de CD25 (B).
Fig. 10 mostra que no modelo de diabetes tipo I de rato, ao contrário à hlL-2 do tipo selvagem, a hlL-2-N88R impede o desenvolvimento de diabetes.
Modalidades
1. Material e Métodos
1.1 Separação de PBMCs de todo o sangue para uso in vitro
Células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMCs) de indivíduos saudáveis, pacientes com melanoma ou pacientes com esclerose múltipla (MS) são separadas do sangue através do meio de separação de linfócitos (Histopaque, Sigma Aldrich). Para isto, dois tubos de sangue (7 ou 10 ml) do mesmo indivíduo ou paciente são transferidos para um tubo esterilizado de 50 ml e preenchido até 30 ml com RPMI 1640 (InVitrogen, # 14190-69). Em seguida, 30
16/27 ml do sangue diluído são dispostos sobre 15 ml de uma solução gradiente de densidade (densidade = 1.077; Histopaque, Sigma Aldrich, # 10771).
Após centrifugação em 400 g para 40 min a 20°C sem travagem, dois “anéis de células sanguíneas brancas” são coletados e transferidos para um tubo esterilizado de 50 ml e lavado duas vezes com salino tamponado por fosfato (PBS; InVitrogen # 14190-169). No caso de contaminação com células sanguíneas vermelhas, é realizada uma lise de RBC (“células sanguíneas vermelhas”); 2 ml de lise de RBC são adicinados ao pélete de células e a incubação é realizada por 2 minutos com mistura suave em temperatura ambiente, seguida de um procedimento de lavagem com um grande volume de meio completo (RPMI 1640 com 10% de soro fetal de bezerro)
O número de leucócitos vivos é determinado pela exclusão de corante usando azul de tripan (InVitrogen # 15250-061) e um hemocitometro (FisherBioblock A2759B).
1.2 Marcação de CFSE
Após a contagem, as células são lavadas duas vezes em PBS e ressuspensas em PBS em uma concentração de 1 x 106 células/ml. CFSE (InVitrogen # C1157) é adicionado em uma concentração final de 0,5 μΜ. Após incubação de 10 minutos no escuro a 37°C, as células marcadas com CFSE são lavadas três vezes com meio fresco completo a 4°C e ressuspensas em meio completo em uma concentração de 1 x 106 células/ml para galvanização.
1.3 Estimulação das PBMCs in vitro
As PBMCs ou permanecem não estimuladas ou são estimuladas com hlL-2 do tipo selvagem (proleucina) ou hlL-2-N88R (BAY 50-4798; Lot #PR312C008) com ou sem um reservatório de peptídeos sintéticos, que são derivados das proteínas especificas de melanoma gp100, TRP-2, MART-1 e tirosinase ou da proteína MOG específica para esclerose múltipla (MS), cada peptídeo sendo adicionado em uma concentração final de 2,5 μΜ (peptídeo de melanoma) ou 30 pg/ml (peptídeo de esclerose múltipla).
Estimulator e peptídeo são adicionados sob as seguintes 23 condições: ___________________________________________________________
Condição |
Estimulador |
Concentração Final |
|
1 |
hlL-2-N88R (BAY 50-4798; #PR312C008) |
10-11M |
sem peptídeos |
2 |
hlL-2-N88R |
10-11 M |
peptídeos |
17/27
|
(BAY 50-4798; #PR312C008) |
|
|
3 |
hlL-2-N88R (BAY 50-4798; #PR312C008) |
10-9 Μ |
sem peptídeos |
4 |
hlL-2-N88R (BAY 50-4798; #PR312C008) |
ΙΟ-9 Μ |
peptídeos |
5 |
hlL-2-N88R (BAY 50-4798; #PR312C008) |
10-8 Μ |
sem peptídeos |
6 |
hll_-2-N88R (BAY 50-4798; #PR312C008) |
10-β Μ |
peptídeos |
7 |
hlL-2-N88R (BAY 50-4798; #PR312C008) |
10-7 Μ |
sem peptídeos |
8 |
hlL-2-N88R (BAY 50-4798; #PR312C008) |
ΙΟ-7 Μ |
peptídeos |
9 |
hlL-2-N88R (BAY 50-4798; #PR312C008) |
10-6 Μ |
sem peptídeos |
10 |
hlL-2-N88R (BAY 50-4798; #PR312C008) |
10-6 Μ |
peptídeos |
11 |
hlL-2 wild type (proleucina) |
10-11 Μ |
sem peptídeos |
12 |
hlL-2 wild type (proleucina) |
10-11 Μ |
peptídeos |
13 |
hlL-2 wild type (proleucina) |
ΙΟ-9 Μ |
sem peptídeos |
14 |
hlL-2 wild type (proleucina) |
10-9 Μ |
peptídeos |
15 |
hlL-2 wild type
(proleucina) |
10-8 Μ |
sem peptídeos |
16 |
hlL-2 wild type (proleucina) |
10-8 μ |
peptídeos |
17 |
hlL-2 wild type
(proleucina) |
10-7 Μ |
sem peptídeos |
18 |
hlL-2 wild type (proleucina) |
10-7 Μ |
peptídeos |
19 |
hlL-2 wild type (proleucina) |
10-6 Μ |
sem peptídeos |
20 |
hlL-2 wild type (proleucina) |
ΙΟ-6 Μ |
peptídeos |
21 |
PHA |
5 pg/ml |
|
22 |
não estimulado |
|
|
18/27
23 |
peptídeo somente |
|
peptídeos |
Tabela 1: Condições para estimulação de PBMCs
Em seguida as células foram cultivadas por seis dias a 37°C em uma atmosfera com 5% de teor de CO2.
1.4 Análise de Proliferação e Fenotipia no Citômetro de Fluxo FC500
O corante das células com anticorpos marcados com fluorescência para moléculas de superfície de células torna possível estudar a proliferação de um subgrupo especifico de linfócitos (marcadores de memória e ativação, veja a Tab. 2). O imunocorante com anticorpos marcados com fluorescência (PE: phycoerythrin, ECD: PE-Texas Red, APC: aloficocianina, PC7: PE-Cy7) é realizado antes e depois de seis dias de cultura com os estimuladores.
No sexto dia, os primeiros dois corantes (1 e 1iso) são realizados com células não marcadas com CFSE (CFSE: éster de carboxifluoresceína diacetato sucinimidil); os outros corantes são realizados em células marcadas com CFSE.
PE |
ECD |
APC |
PC7 |
CD25 |
CD45 |
Foxp3 |
CD4 |
CD25 |
CD45 |
lgG2a de rato |
CD4 |
CD127 |
CD45 |
CD25 |
CD4 |
CD3 |
CD45 |
CD25 |
CD8 |
CD16 |
|
CD56 |
CD3 |
CCR7 |
CD3 |
CD45RA |
CD4 |
CCR7 |
CD3 |
CD45RA |
CD8 |
CD8 |
CD3 |
CD45RO |
CD4 |
CD25 |
CD3 |
Foxp3 |
CD4 |
CD25 |
CD3 |
lgG2a de rato |
CD4 |
CD8 |
CD3 |
CD25 |
CD4 |
CCR7 |
CD3 |
CD45RA |
CD4 |
CD8 |
CD3 |
CD45RO |
CD4 |
Tabela 2: Esquema de corantes para PBMCS
CD25-PE, Foxp3-APC e rat lgG2a-APC são provenientes da eBiosciences;
CD25-APC, CD45RA-APC e CD45RO-APC foram adquiridos da BD Biosciences.
Todos os outros anticorpos são da Beckman-Coulter, França.
1.5 Modelo de Diabetes Tipo I de Rato
Camundongos diabéticos não-obesos de 12 semanas são tratados diariamente com muteína de hlL-2 ou hll_-2 do tipo selvagem. Animais de controle negativo foram analogicamente tratados com solução salina fisiológica (salino).
19/27
Os grupos de tratamento consistiram de 3 a 5 animais. Do dia 0 ao 15, uma quantidade de unidades de 5K ou 25K de muteína de hlL-2 ou hlL-2 do tipo selvagem foi adimistrada aos ratos. A partir do dia 17, nos grupos de tratamento com unidades de 5K, a quantidade foi aumentada para unidades de 1OOkg (= 6,112 pg). O tratamento dois animais com unidades de 25K foi mantido inalterado. A última dosagem foi realizada no dia 31. Em uma experiência paralela, o tratamento foi realizado do dia 0 ao dia 31 com uma dose fixa de unidades de 25K. A diabetes foi detetectada através do monitoramento dos níveis de glicose na urina. Foram tiradas amostras de sangue dos camundongos nos dias 17 e 30. As amostras foram analisadas no FACS usando corante anti-CD4, anti-CD25 e antiFoxP3 e a percentagem de células FoxP3+ entre as células T CD4+ e a intensidade de fluorescência média (MFI) da expressão de CD25 nas células CD4+FoxP3+ foi então determinada.
2. Resultados
2.1 Indução de Células T Regulatórias por hlL-2-N88R
Como sistema in-vitro adequado para testar o efeito das muteínas de acordo com a invenção, foram usadas células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMCs). As PBMCs consistem de células T (~ 75 % CD4- e CD8-positiva) e células B e NK (~ 25 % positiva) e assim constituem uma população de células que representa bem o sistema imune.
PBMCs de seis indivíduos saudáveis (106 cells/ml) foram estimuladas com IL-2 do tipo selvagem (proleucina) ou IL-2-N88R [BAY 50-4798, Lot #PR312C008 (“BAY#C008”)] em concentrações situadas entrei O'11 e 10‘6 M, ou no controle positivo com a fitohemaglutinina mitógena não especifica (“PHA”) em uma concentracao de 5 pg/ml ou com meio de cultura somente (“Med”). No dia 0 e no sexto dia após a estimulação, foi determinado o teor das células T CD4+CD25+Foxp3+ regulatórias dentro dos linfócitos CD3+. O resultado é mostrado na Fig. 1 e na Tabela 3 a seguir.____________________________________________
Condições |
Valor médio |
S.D. (desvio padrão) |
dia 0 |
|
diaO |
1,367 |
2,060 |
|
|
Med |
0,683 |
0,741 |
NL-2-N88R (BAY#C008) ##1C008) |
10-11M |
1,483 |
1,017 |
10-9M |
1,783 |
1,153 |
10-8 M |
3,267 |
1,596 |
10-7M |
6,483 |
2,642 |
IO-6 M |
5,200 |
2,375 |
|
10‘11M |
2,183 |
1,030 |
CO
20/27
|
hlL-2 do tipo selvagem (proleucina) |
10-θΜ |
3,067 |
1,255 |
10-8 M |
3,600 |
1,330 |
10-7M |
4,600 |
1,992 |
10-6M |
4,967 |
2,199 |
PHA |
5 pg/ml |
1,400 |
1,081 |
peptídeo somente |
|
1,340 |
0,680 |
Tabela 3: Percentagem de células T CD3+CD4+CD25+Foxp3+ após estimulação; valores médios de seis sujeitos saudáveis; S.D.: desvio padrão.
A partir deste experimento compreende-se que hlL-2-N88R em concentrações de 10’7 M e 10‘6 M causa indução marcada da subpopulação das 5 células T regulatórias CD4+CD25+Foxp3+. A indução aqui é notavelmente maior do que com a estimulação das PBMCs pela hlL-2 do tipo selvagem.
Em uma segunda preparação, o aumento na subpopulação das células T regulatórias CD4+CD25’Foxp3+ após estimulação com hlL-2-N88R em comparação à hlL-2 do tipo selvagem foi estudado. O resultado é mostrado na Fig. 2 e na 10 Tabela 4 a seguir._____________________________________________________________
Condições |
Valor Médio |
S.D. (desvio padrão) |
diaO |
|
diaO |
0,317 |
0,402 |
dia 6 |
|
Med |
0,133 |
0,151 |
hlL-2-N88R
(BAY#C008)
#1C008) |
10-11M |
0,200 |
0,141 |
10-9M |
0,320 |
0,179 |
10-8 M |
0,517 |
0,354 |
IO-7 M |
0,917 |
0,601 |
10-6 M |
5,250 |
3,141 |
hlL-2 do tipo selvagem (proleucina) |
10-11M |
1,000 |
1,864 |
10-9 M |
0,717 |
0,293 |
10-8 M |
1,000 |
0,429 |
10-7M |
1,433 |
0,403 |
10-6M |
2,533 |
0,903 |
PHA |
5 pg/ml |
0,700 |
1,715 |
peptídeo somente |
|
0,160 |
0,089 |
Tabela 4: Percentagem de células T CD3+CD4+CD25'Foxp3+ T após estimulação; valores médios de seis indivíduos saudáveis
Aqui também é visto que a estimulação com hlL-2-N88R causa um aumento notável na subpopulação das células T regulatórias CD4+CD25’Foxp3+, que em 15 concentrações de 10‘6 M é notavelmente maior do que com estimulação com hlL2 do tipo selvagem.
2.2 hlL-2-N88R Induz Células T Regulatórias em Pacientes com Melanoma
21/27
Em seguida, foi investigado se a muteína de hlL-2 de acordo com a invenção N88R também estimula a atividade especifica de antígenos de células imunes. Para isto, PBMCs (106 cells/ml) de três pacientes com melanoma foram estimuladas com hlL-2-N88R (BAY 50-4798, Lot #PR312C008) ou hlL-2 do tipo 5 selvagem (proleucina) em concentrações situadas entrei O'11 e 10'6 M, na presença ou ausência de um reservatório de peptídeos relacionados à melanoma, com 5 pg/ml PHA ou com meio de cultura somente. Em seguida, as subpopulações das células T regulatórias CD4+CD25+Foxp3+ e CD4+CD25'Foxp3+, respectivamente, foram determinadas. O resultado é mostrado na Fig. 3 e Tabela 5 e Fig. 4 e 10 Tabela 6 respectivamente._______________________________________________
Condições |
Valor Médio |
S.D. (desvio padrão) |
diaO |
|
diaO |
2,800 |
2,052 |
dia 6 |
|
Med |
1,133 |
0,839 |
°O CÉ o oo o oo o
CXJ >-
S- |
10’11M |
1,833 |
1,185 |
10-11 M+Pept |
2,467 |
0,666 |
10-9 M |
3,000 |
1,015 |
IO-9 M+Pept |
3,033 |
0,379 |
10-« M |
3,600 |
0,819 |
10-« M+Pept |
5,567 |
2,499 |
10-7M |
6,100 |
0,458 |
10’7 M+Pept |
6,233 |
0,058 |
10-6 M |
7,533 |
2,413 |
10-6 M+Pept |
8,533 |
3,225 |
hlL-2 do tipo selvagem (proleucina) |
10’11M |
2,767 |
0,751 |
10-11 M+Pept |
2,500 |
0,985 |
IO-9 M |
3,333 |
0,802 |
10-9 M+Pept |
3,433 |
1,102 |
IO-8 M |
4,133 |
0,862 |
10-« M+Pept |
3,633 |
1,002 |
10-7M |
4,367 |
1,201 |
10-7 M+Pept |
4,300 |
0,755 |
10-θΜ |
6,667 |
1,405 |
IO-6 M+Pept |
5,600 |
1,323 |
PHA |
5 pg/ml |
1,400 |
0,346 |
peptideo somente |
|
1,667 |
1,060 |
Tabela 5: Percentagem de células T CD3+CD4+CD25+Foxp3+ após estimulação; valores médios de três pacientes com melanoma.
22/27
Condições |
Valor Médio |
S.D. (desvio padrão) |
diaO |
|
dia 0 |
0,567 |
0,643 |
dia 6 |
|
Med |
0,133 |
0,231 |
hlL-2-N88R
(BAY#C008) |
10’11M |
0,267 |
0,462 |
10'11 M+Pept |
0,333 |
0,252 |
10-9 M |
0,300 |
0,265 |
IO-9 M+Pept |
0,500 |
0,300 |
10-8 M |
0,500 |
0,265 |
10·8 M+Pept |
0,800 |
0,700 |
10-7M |
0,900 |
0,436 |
10’7 M+Pept |
0,677 |
0,306 |
10-6 m |
4,100 |
1,682 |
IO·6 M+Pept |
3,200 |
1,646 |
hlL-2 do tipo selvagem (proleucina) |
10-11 M |
0,267 |
0,208 |
10-11 M+Pept |
0,200 |
0,100 |
10-9 M |
0,967 |
0,603 |
10-9 M+Pept |
0,967 |
0,451 |
10-8 M |
1,633 |
1,002 |
10-8 M+Pept |
1,400 |
0,624 |
10-7 M |
1,400 |
0,656 |
10-7 M+Pept |
1,533 |
0,702 |
10-θ M |
2,733 |
1,861 |
IO-6 M+Pept |
2,600 |
1,473 |
PHA |
5 pg/ml |
0,000 |
0,000 |
peptídeo somente |
|
0,200 |
0,100 |
Tabela 6: Percentagem de células T CD3+CD4+CD25 Foxp3+ após estimulação; valores médios de três pacientes com melanoma
Aqui foi descoberto que a administração de hlL-2-88R também causa um aumento notável nas células T regulatórias em pacientes com melanoma. No caso da subpopulacao CD4+CD25+Foxp3+ em concentrações de 10’7 M e 10’6 M, e na subpopulação CD4+CD25'Foxp3+ em uma concentração de 10‘6 M, este aumento é notavelmente maior do que com a estimulação com concentrações correspondentes da IL-2 do tipo selvagem (proleucina).
2.3 hlL-2-N88R Induz Células T Regulatórias em Pacientes com Esclerose Múltipla
Em seguida, foi investigado se a muteína de hlL-2 de acordo com a invenção N88R também estimula a atividade específica de antígenos de células imunes. Para isto, PBMCs (106 cells/ml) de dois pacientes com esclerose múltipla 15 foram estimuladas com hlL-2-N88R (BAY 50-4798, Lot #PR312C008) ou hlL-2 do
23/27 tipo selvagem (proleucina) em concentrações situadas entrei O’11 e 10'6 M, na presença ou ausência de um peptídeo relacionado à esclerose múltipla, com 5 pg/ml PHA ou com meio de cultura somente. Em seguida, as subpopulações das células T regulatórias CD4+CD25+Foxp3+e CD4+CD25’Foxp3+, respecti5 vamente, foram determinadas. O resultado é mostrado na Fig. 5 e Tabela 7 e Fig.
e Tabela 8 respectivamente.
Condições |
Valor Médio |
S.D. (desvio padrão) |
diaO |
|
diaO |
0,95 |
0,21 |
dia 6 |
|
Med |
3,55 |
1,91 |
°° OÉ o CO o co o
— ço. |
10-11 M |
3,8 |
0,99 |
10-11 M+Pept |
4,2 |
2,40 |
10-9 M |
6,1 |
2,40 |
IO-9 M+Pept |
9,05 |
5,02 |
10-8 M |
9,75 |
2,19 |
IO-8 M+Pept |
11,15 |
3,32 |
10-7 M |
11,95 |
5,30 |
10-7 M+Pept |
9,9 |
1,70 |
10-6 m |
7,9 |
1,41 |
IO-6 M+Pept |
9,3 |
1,41 |
hlL-2 do tipo selvagem (proleucina) |
10-11M |
6,3 |
2,55 |
10-11 M+Pept |
8,8 |
4,10 |
10-9M |
8,25 |
0,49 |
IO-9 M+Pept |
8,45 |
1,20 |
10-8 M |
8,15 |
2,47 |
IO-8 M+Pept |
9,55 |
3,04 |
10-7M |
8,8 |
3,39 |
IO’7 M+Pept |
8,8 |
3,25 |
10-6 M |
9,45 |
0,78 |
IO-6 M+Pept |
7,6 |
1,84 |
PHA |
5 pg/ml |
5,5 |
3,68 |
peptídeo somente |
|
3,95 |
2,19 |
Tabela 7: Percentagem de células T CD3+CD4+CD25+Foxp3+ após estimulação; valores médios de dois pacientes com esclerose múltipla.
24/27
Condições |
Valor Médio |
S.D. (desvio padrão) |
diaO |
|
diaO |
0,35 |
0,35 |
dia 6 |
|
Med |
0,14 |
0,14 |
hlL-2-N88R
(BAY#C008) |
10-11 M |
0,28 |
0,28 |
10-11 M+Pept |
0,14 |
0,14 |
10-9M |
0,07 |
0,07 |
10-9 M+Pept |
0,07 |
0,07 |
10-8 M |
0,28 |
0,28 |
10-8 M+Pept |
0,00 |
0,00 |
10’7M |
0,14 |
0,14 |
10‘7 M+Pept |
0,14 |
0,14 |
10-6 m |
4,10 |
4,10 |
IO-6 M+Pept |
2,90 |
2,90 |
hlL-2 do tipo selvagem (proleucina) |
10-11 M |
0,00 |
0,00 |
10-11 M+Pept |
0,07 |
0,07 |
IO-9 M |
0,07 |
0,07 |
10-9 M+Pept |
0,00 |
0,00 |
10-8 M |
0,14 |
0,14 |
IO-8 M+Pept |
0,14 |
0,14 |
10-7 M |
0,28 |
0,28 |
10-7 M+Pept |
0,21 |
0,21 |
10-6 M |
0,07 |
0,07 |
IO-6 M+Pept |
0,85 |
0,85 |
PHA |
5 pg/ml |
0,07 |
0,07 |
peptídeo somente |
|
0,07 |
0,07 |
Tabela 8: Percentagem de células T CD3+CD4+CD25'Foxp3+ após estimulação; valores médios de dois pacientes com esclerose múltipla
Foi descoberto que a administração de hlL-2-N88R também causa um au5 mento notável nas células T em pacientes com esclerose múltipla. No caso da subpopulação CD4+CD25+Foxp3+ em concentrações de 10'8 M e 10'7 M, e na subpopulação CD4+CD25’Foxp3+ em uma concentração de 10’6 M, este aumento é notavelmente maior do que com a estimulação com concentrações correspondentes de hlL-2 do tipo selvagem (proleucina).
2.4 hlL-2-N88R Induz somente Proliferação Mínima de células T CD8+
Citotóxicas em Pacientes com Esclerose Múltipla e em Indivíduos Saudáveis
Além disso, foi estudada a estimulação de células T de memória central CD8+ citotóxicas. Para isto, PBMCs de individíduos saudáveis ou pacientes com esclerose múltipla foram tratadas conforme descrito em 2.3. Foi analisada a 15 percentagem de células T CD3+CD8+CD45RO+ com CFSE baixo. O resultado é
25/27 mostrado na Fig. 7 e Tabela 9 e Fig. 8 e Tabela 10.
Condições |
Valor Médio |
S.D. (desvio padrão) |
diaO |
|
dia 0 |
2,45 |
1,06 |
dia 6 |
|
Med |
0,95 |
0,21 |
hlL-2-N88R
(BAY#C008) |
10-11M |
1,3 |
0,57 |
10-11 M+Pept |
1,2 |
1,13 |
10-θΜ |
3,55 |
2,47 |
10'9 M+Pept |
0,5 |
0,14 |
10-θΜ |
3,3 |
1,41 |
10-θ M+Pept |
1,2 |
0,71 |
10-7 Μ |
10,5 |
7,50 |
107 M+Pept |
9,1 |
0,71 |
10-θΜ |
22,9 |
9,76 |
10-θ M+Pept |
1 |
0,28 |
hlL-2 do tipo selvagem (proleucina) |
10-11 Μ |
5,2 |
7,35 |
10-H M+Pept |
3,1 |
0,28 |
10-9 Μ |
14,3 |
15,56 |
10-9 M+Pept |
19,45 |
2,90 |
10-θΜ |
36,5 |
1,98 |
10-θ M+Pept |
41,85 |
2,47 |
10-7 Μ |
54,8 |
8,49 |
107 M+Pept |
54,85 |
12,94 |
10-θΜ |
58,05 |
1,06 |
10-θ M+Pept |
98,2 |
0,85 |
PHA |
5 pg/ml |
0,55 |
0,07 |
peptídeo somente |
|
2,45 |
1,06 |
Tabela 9: Percentagem de células T CD3+CD8+CD45RO+ com CFSE baixo após estimulação; valores médios de dois pacientes com esclerose múltipla.
26/27
Condições |
Valor Médio |
S.D. (desvio padrão) |
dia 6 |
|
Med |
0,23 |
0.23 |
hlL-2-N88R
(BAY#C008) |
10’11M |
0,27 |
0,06 |
10-11 M+Pept |
1,73 |
2,23 |
10-9M |
0,43 |
0,23 |
Kl·9 M+Pept |
0,80 |
0,72 |
10-8 M |
2,13 |
1,86 |
IO-8 M+Pept |
2,07 |
1,17 |
10’7M |
3,83 |
4,02 |
10’7 M+Pept |
5,77 |
6,30 |
10-θΜ |
17,43 |
17,31 |
10·6 M+Pept |
17,87 |
12,97 |
hlL-2 do tipo selvagem (proleucina) |
10’11M |
1,53 |
123 |
10-11 M+Pept |
2,37 |
2,57 |
10-9M |
18,20 |
23,35 |
10-9 M+Pept |
16,93 |
10,96 |
IO-8 M |
43,30 |
36,72 |
IO-8 M+Pept |
37,80 |
20,80 |
10’7M |
38,53 |
25,53 |
10-7 M+Pept |
32,37 |
20,90 |
10-6 M |
37,93 |
27,66 |
IO-6 M+Pept |
30,83 |
21,51 |
PHA |
5 pg/ml |
96,07 |
1,79 |
peptideo somente |
|
1,83 |
1,59 |
Tabela 10: Percentagem de células T CD3+CD8+CD45RO+ com CFSE baixo após estimulação; valores médios de três indivíduos saudáveis
Ao contrario da hlL-2 do tipo selvagem, em pacientes com esclerose múlti5 pia e também em indivíduos saudáveis, a hlL-2-N88R causa somente uma leve proliferação de células T CD8+ de memória central, em todas as concentrações estudadas.
2.5 O tratamento com Muteína de hlL-2 Impede o Desenvolvimento de Diabetes Tipo I no Modelo Animal
Em comparação à hlL-2 do tipo selvagem, o tratamento de camundongos diabéticos não obesos (NOD) com hlL-2-N88R causa um aumento de percentagem maior em células FoxP3+ dentro das células CD4+ (Fig. 9 (A)). Além disso, estas células positivas CD4+FoxP3+ exibem expressão maior de CD25 (Fig. 9 (B)). A Fig. 10 mostra que, ao contrário da hlL-2 do tipo selvagem, o tratamento com hlL-2-N88R no modelo de diabetes tipo I de rato impede o desenvolvimento da diabestes em todos os camundongos no grupo de tratamento.
27/27
3. Conclusão
As experiências realizadas pelos inventores mostram claramente que devido ao seu potencial para a indução de células T regulatórias (TReg) as muteínas de hll_-2 de acordo com a invenção e seções da mesma são substân5 cias adequadas para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença autoimune ou para a indução de TReg em um organismo e para a formação de TReg in vitro. Isto é demonstrado pelos inventores não somente in vitro, mas também in vivo.