CN108699524A - 调节t细胞介导性疾病的预防或治疗用药剂学组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过诱导性T细胞共刺激分子配体(Induced T cell co‑stimulator ligand)或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞来诱导CD4+T细胞分化及增殖为调节T细胞且用于预防或治疗调节T细胞介导性疾病的组合物及方法。本发明的诱导性T细胞共刺激分子配体(Induced T cell co‑stimulator ligand)或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞有效地抑制外周血单个核细胞的增殖，并且诱导调节T细胞的可诱导共刺激分子的表达，从而可通过磷酸肌醇3‑激酶‑Akt机制诱导调节T细胞的分化及增殖，因而可有效地预防、治疗或改善调节T细胞介导性疾病。
Description
技术领域
本发明涉及通过诱导性T细胞共刺激分子配体(ICOSL，Induced T cell co-stimulator ligand)或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞诱导CD4+T细胞分化为调节T细胞且用于预防或治疗调节T细胞介导性疾病的组合物及方法。
背景技术
在所有正常个体中最重要的特征之一是对构成自身的抗原物质无害地作出反应，相反地，对非自身(non-self)抗原具有识别非自身抗原并进行反应来可去除的能力。像这样，与自身抗原相关的生物体的无反应称为免疫无反应性(immunologicunresponsiveness)或耐受(tolerance)。自身耐受为通过去除有可能具有自身抗原的特异性受体的淋巴细胞或与自身抗原相接触后自行地反应的功能失活来发生。若在诱导自身耐受或抑制保持中发生问题，则对自身抗原产生免疫反应，并将由此导致的疾病称为自身免疫疾病(autoimmune disease)。作为例示性的自身免疫疾病的一种可例举过敏性疾病(allergic disease)，过敏性疾病是指因免疫体系是异常，对普通人无害的物质仅对特定人产生多种症状的过敏反应的疾病。引起上述过敏性疾病的物质被称为过敏原(allergen)或抗原，花粉、抗生素、药物、灰尘、饮食、冷空气或阳光也可成为诱发过敏的原因。作为上述过敏性疾病的症状有荨麻疹、打喷嚏、发痒、鼻涕、咳嗽、枯草热、眼睛充血、湿疹、皮疹等。代表过敏性疾病有伴随气道狭窄、肺黏液分泌增多、呼吸困难、咳嗽等的过敏性哮喘，除此之外还有特应性皮炎、结膜炎、鼻炎及溃疡性结肠炎等。
像这样，与由各种自身免疫体系的异常发生的疾病相关，对调节T细胞的重要性的研究活跃地进行。20世纪70年代初期，格申(Gershon)通过导入抑制T细胞的概念第一次提出可存在对常规T细胞(conventional T cells)的效应子功能(effector funtion)进行控制及抑制的T细胞以来(R.K.Gershon and K.Kondo,Immunology,1970,18:723-37)，在免疫学的很多领域中进行用于阐明调节T细胞的生物学特性及功能的研究。尤其，1995年，由坂口(Sakaguchi)提出CD25可做为自然发生CD4+调节T细胞的重要的表型标记起到作用以来(S.Sakaguchi etal.,J.Immunol.,1995,155:1151-1164)，在与自身抗原(self-antigen)相关的外周耐受(peripheral tolerance)的诱导中，重点进行与调节T细胞具有的作用和重要性相关的研究。
近年来，T细胞介导性疾病已被认为是代表多种免疫类疾病的疾病，尤其，被视为T细胞产生自身免疫疾病且使自身免疫疾病持续。与自身抗原相关的免疫反应是通过自身反应性T细胞的持续性激活或定期的激活进行，自身反应性T细胞作为直接或间接地在自身免疫疾病中得到确认的特征性的组织伤害及组织破坏的原因受到瞩目。
因此，提出自身免疫疾病及此外的与T细胞介导性疾病相关的很多治疗剂，但是当前仍然需要其他治疗剂，尤其为了利用为治疗剂，需要与其的准确的机制相关的研究。
另一方面，众所周知，间充质干细胞除了具有多潜能性之外，还具有可调节免疫细胞的活性和分化的免疫调节能力，在多种炎症性环境下调节T细胞、B细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等，通过诱导调节T细胞来可抑制免疫反应。但是，与调节性T细胞诱导相关，对具体调节因子或工作机制知之甚少，因而将其利用于自身免疫疾病等的免疫疾病治疗的与具体的机制及有效成分相关的研究处于目前为止不足的状况。
发明内容
本发明人在对间充质干细胞和调节T细胞介导性疾病进行研究中，确认间充质干细胞表面的诱导性T细胞共刺激分子配体(Induced T cell co-stimulator ligand)可诱导使CD4+T细胞分化成调节T细胞，通过上述，生产多的调节T细胞，并可有效地改善T细胞介导性疾病，并完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供包含诱导性T细胞共刺激分子配体(Induced Tcell co-stimulator ligand)或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞的调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用药剂学组合物、使CD4+T细胞分化为调节T细胞的诱导用组合物及方法。
为了实现上述目的，本发明提供包含诱导性T细胞共刺激分子配体(Induced Tcell co-stimulator ligand)或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞的调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用药剂学组合物。
并且，本发明提供使CD4+T细胞分化及增殖为调节T细胞的诱导用组合物，包括诱导性T细胞共刺激分子配体或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞。
并且，本发明提供使CD4+T细胞分化及增殖为调节T细胞的诱导方法，上述使CD4+T细胞分化及增殖为调节T细胞的诱导方法包括在体外(in vitro)用诱导性T细胞共刺激分子配体或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞对CD4+T细胞进行处理的步骤。
本发明的诱导性T细胞共刺激分子配体(Induced T cell co-stimulatorligand)或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞诱导调节T细胞的可诱导共刺激分子的表达，来通过磷酸肌醇3-激酶-Akt(PI3K-Akt)机制不仅可诱导调节T细胞的分化，而且可有效地抑制外周血单个核细胞(PBMC)的增殖，因而可有效地预防、治疗或改善调节T细胞介导性疾病。
附图说明
图1为示出通过流式细胞分析确认人类克隆间充质干细胞(hcMSC)的标记表达的结果的图。虚线表示利用同型对照Ab进行染色的结果，实线表示各个标记的特异性表达。
图2为示出通过羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)阵列确认人类克隆间充质干细胞的体外T细胞抑制活性的结果的图(M；人类克隆间充质干细胞，P：染色有羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯的外周血单个核细胞)。
图3的A部分表示通过第二天、第五天的流式细胞分析确认在调节性T细胞诱导条件下的CD4+T细胞的调节性T细胞分化的结果的图，图3的B部分及图3的C部分为通过FoxP3及CD25表达(B部分)及FoxP3+CD4+CD25+细胞的增加(C部分)确认人类克隆间充质干细胞对CD4+T细胞的调节性T细胞分化产生的影响的结果的图(*，P＝0.017)。
图4为示出通过光学显微镜确认基于人类克隆间充质干细胞和CD4+T细胞共培养的CD4+T细胞的形态的结果(A部分)及比较在浮游性CD4+T细胞及附着性CD4+T细胞中的CD25+、FoxP3+的变化的结果(B部分)的图(蓝盒：浮游性CD4+T细胞，红盒：人类克隆间充质干细胞附着性CD4+T细胞)。
图5为示出对CD4+T细胞和人类克隆间充质干细胞的共培养、transwell培养、浮游性CD4+T细胞、粘结性CD4+T细胞中的CD25+、FoxP3+的变化进行比较的结果的图。
图6为示出对基于CD4+T细胞和人类克隆间充质干细胞的共培养的人类克隆间充质干细胞的诱导性T细胞共刺激分子配体的蛋白质表达的变化(A部分)、信使核糖核酸(mRNA)表达的变化(B部分)进行确认的结果及利用共焦显微镜对诱导性T细胞共刺激分子配体表达进行确认的结果(C)的图(倍率：x200，x400)。
图7为示出对基于CD4+T细胞和人类克隆间充质干细胞的共培养的可诱导共刺激分子蛋白质表达的变化(A部分)及在CD4+细胞中的FoxP3、CD25及可诱导共刺激分子(ICOS)的表达变化(B部分)进行确认的结果的图。
图8的A部分表示通过流式细胞分析、FoxP3+CD4+CD25+T细胞及FoxP3+CD4+可诱导共刺激分子+T细胞对基于处理抗-诱导性T细胞共刺激分子配体Ab(10μg/mL)(α诱导性T细胞共刺激分子配体)或对照组Ab(ConAb)的基于CD4+T细胞和hcMSC的共培养的FoxP3、CD25及可诱导共刺激分子的表达变化进行确认的结果的图(*P＝0.017、**P＝0.049)。
图8的B部分及C部分表示通过流式细胞分析(B部分)、酶联免疫吸附测定(ELISA)分析(C部分)对基于处理抗-诱导性T细胞共刺激分子配体Ab(10μg/mL)(α诱导性T细胞共刺激分子配体(αICOSL))或对照组Ab(ConAb)的基于CD4+T细胞和人类克隆间充质干细胞的共培养的CD4+T细胞的白细胞介素-10(IL-10)的生产进行确认的结果的图(***P＝0.03)。
图9表示通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及流式细胞分析对基于利用对诱导性T细胞共刺激分子配体进行靶化的短发夹核糖核酸(shICOSL)的基因打靶的诱导性T细胞共刺激分子配体的敲低结果(A部分)及基于敲低的调节性T细胞诱导效果的变化(B部分)进行确认的结果的图(*P＝0.008，**P＝0.013)。
图10为通过实时荧光定量聚合酶链式反应(A部分)、免疫印迹(B部分)、流式细胞分析(C部分)，对在导入有表达全长人类诱导性T细胞共刺激分子配体的慢病毒的人类克隆间充质干细胞(hcMSCICOSL)及导入有共载体的间充质干细胞对照组(hcMSCEmp)的诱导性T细胞共刺激分子配体的表达增加进行确认的结果的图。
图11表示利用流式细胞分析及酶联免疫吸附测定对hcMSCICOSL的调节性T细胞诱导增加效果(A部分)进行确认的结果(*P＝0.045、**P＝0.049)及利用流式细胞分析(B部分)及酶联免疫吸附测定(C部分)(***P＝0.034)对基于调节性T细胞的白细胞介素-10的分泌增加效果进行确认的结果的图。
图12表示利用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯标记对从hcMSCICOSL或hcMSCEmp的共培养物分离的CD25+组进行标记，并与激活的外周血单个核细胞一同以1：5或1：10(调节性T细胞：外周血单个核细胞)共培养3天后，通过羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯流式细胞分析仪对外周血单个核细胞的增殖进行分析的结果的图。
图13为示出通过流式细胞分析对基于处理rhICOSL的调节性T细胞分化诱导效果进行确认的结果(A部分)及通过免疫印迹对基于处理rhICOSL的Akt磷酸化效果进行确认的结果(B部分)图。
图14为示出在诱导性T细胞共刺激分子配体介导的调节性T细胞(Treg)分化中，为了确认磷酸肌醇3-激酶-Akt信号通路是否参与，对基于处理PI3K抑制剂LY294002(5μM)及Akt抑制剂GSK690693(1μM)的磷酸肌醇3-激酶-Akt的磷酸化抑制(A部分)及调节性T细胞分化抑制效果(B部分)进行确认的结果的图。
图15为示出利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)及qRT-PCR对非克隆MSC(hncMSC)及人类克隆间充质干细胞1至人类克隆间充质干细胞4的诱导性T细胞共刺激分子配体表达差异进行确认的结果(A部分、B部分)及在混合淋巴细胞反应(mixed lymphocytereaction，MLR)中，在与外周血单个核细胞的共培养(C部分)或调节性T细胞诱导条件(D部分)下，对它们的调节性T细胞细胞诱导能力进行比较的结果的图。
图16为示出对基于处理白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及脂多糖(LPS)的诱导性T细胞共刺激分子配体信使核糖核酸的表达增加(A部分)、基于白细胞介素-1β的基于诱导性T细胞共刺激分子配体信使核糖核酸(mRNA)的时间的表达增加(B部分)、基于白细胞介素-1β的白细胞介素1受体(IL-1R)表达变化(C)进行确认的结果的图。
图17为示出通过实时荧光定量聚合酶链式反应(A部分)、免疫印迹(B部分)及流式细胞分析(C部分)对基于处理白细胞介素-1β的克隆间充质干细胞(hcMSC人类克隆间充质干细胞)及非克隆间充质干细胞(hncMSC)的诱导性T细胞共刺激分子配体诱导效果进行确认的效果的图。
图18为示出对基于处理抗-白细胞介素-1β中性化抗体的阻隔白细胞介素-1β后的诱导性T细胞共刺激分子配体表达的诱导变化进行确认的结果的图(*P＝0.003)。
图19的(A)部分为示出通过流式细胞分析对基于引发白细胞介素-1β的CD4+CD25+FoxP3+或CD4+可诱导共刺激分子+FoxP3+T细胞群的比率进行确认的结果的图(hcMSCIL-1β；白细胞介素-1β引发人类克隆间充质干细胞、hcMSCVeh；未处理白细胞介素-1β的人类克隆间充质干细胞)。
图19的B部分为示出通过处理抗-诱导性T细胞共刺激分子配体中和抗体(α诱导性T细胞共刺激分子配体)对由hcMSCIL-1β及正常人类克隆间充质干细胞诱导的CD25+FoxP3+调节性T细胞减少效果进行确认的结果的图。
图20为示出葡聚糖硫酸钠(DSS)大肠炎模型的制备方法的示意图。
图21为示出在由葡聚糖硫酸钠诱导而成的大肠炎小鼠模型中对基于处理hcMSCICOSL的大肠长度变化进行确认的结果的图。
具体实施方式
本发明提供包含诱导性T细胞共刺激分子配体(Induced T cell co-stimulatorligand)或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞的调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用药剂学组合物。
在本发明中确认了在诱导性T细胞共刺激分子配体(Induced T cell co-stimulator ligand)或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞中，CD4+T细胞分化为调节T细胞及可促进调节T细胞的增殖，并通过上述，确认了可通过抑制炎症性反应或自身免疫性反应，来使用于调节T细胞介导性疾病的预防或治疗。
本发明的“可诱导共刺激分子”还被称为H4或AILIM，众所周知，为作为共刺激分子的CD28的超级家族，并在激活的T细胞中，其表达增加。可诱导共刺激分子还可与众所周知为B7-H2、B7RP-1、B7h、GL50及LICOS的诱导性T细胞共刺激分子配体相结合，来介导细胞之间的信号传导。诱导性T细胞共刺激分子配体为传导T细胞激活信号的共刺激蛋白质，在人类的情况下，由诱导性T细胞共刺激分子配体G基因(Gene ID：23308)进行编码。并且，众所周知，诱导性T细胞共刺激分子配体在B淋巴细胞中丰富地得到表达，尤其，在炎症性条件下，可在间充质干细胞表面表达增加。
在本发明中，上述诱导性T细胞共刺激分子配体可来源于间充质干细胞，“来源于间充质干细胞”是指表达于间充质干细胞表面的诱导性T细胞共刺激分子配体或对其进行分离的形态。因此，本发明的诱导性T细胞共刺激分子配体均可无限制地包含表达于间充质干细胞表面的形态或对其进行重组而合成的分离形态。
本发明的“诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞”是指诱导性T细胞共刺激分子配体的间充质干细胞表面表达与正常对照组比较增加的干细胞，诱导性T细胞共刺激分子配体的表面表达的增加可无限制地利用诱导性T细胞共刺激分子配体的基因导入、表达增加诱导等本领域中公知的基因或蛋白质表达增加方法来实现。在本发明的一例示中将表达全长人类诱导性T细胞共刺激分子配体的基因的慢病毒与病毒包装结构(viralpackaging contructs)一同导入于人类克隆间充质干细胞(human clonal MSC)，来在间充质干细胞中诱导诱导性T细胞共刺激分子配体的表达的增加，并制备了诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞。就诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞而言，对使CD4+T细胞分化为调节T细胞(regulatory T cell；调节性T细胞)的促进能力及促进调节T细胞的增殖的能力优秀，可有效地抑制炎症或自身免疫反应，例如可更有效地抑制大肠炎。
并且，在本发明中，优选地，干细胞为克隆间充质干细胞(clona l MSC)。在本发明中，通过实施例11确认了在使用上述克隆间充质干细胞的情况下，可诱导比人类非克隆间充质干细胞(hncMSC，huma n non clonal MSC)显著优秀的诱导性T细胞共刺激分子配体的表达。可通过在本领域中公知的获取方法取得单克隆干细胞，优选地，可根据在Song SU,etal.(2008)(Variations of clonal marrow stem cell l ines established from humanbone marrow in surface epitopes,differ entiation potential,gene expression,and cytokine secretion.Stem cell s and development 17(3):451-461.)中公开的层分离培养获取方法分离，上述文献作为参照并入本发明。单克隆干细胞中诱导性T细胞共刺激分子配体的表达比人类非克隆间充质干细胞增加，调节T细胞的分化诱导效果也比人类非克隆间充质干细胞优秀，从而可更有效地利用于炎症性或自身免疫性疾病的治疗。
在本发明中，间充质干细胞可以为来源于选自脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜及胎盘组成的组中的一种以上的间充质干细胞(mesenchymal stem cell)，尤其优选地，可以为来源于骨髓的间充质干细胞。本发明的间充质干细胞可作为无限制地不仅包含干细胞，而且包含其的培养物的概念来理解。
本发明的诱导性T细胞共刺激分子配体的特征可在于，表达于间充质干细胞的表面，并使T细胞的可诱导共刺激分子(Induced T cell co-stimulator)表达增加。可诱导共刺激分子在T细胞激活期间表达于T细胞的表面，在本发明中通过人类克隆间充质干细胞和CD4+T细胞的共培养确认了CD25+FoxP3+调节T细胞(Tregs)呈现更高的可诱导共刺激分子的表达。
并且，本发明的诱导性T细胞共刺激分子配体的特征可在于，激活磷酸肌醇3-激酶-Akt信号通路，通过诱导性T细胞共刺激分子配体和T细胞上的可诱导共刺激分子的结合，在调节性T细胞中，促进Akt的磷酸化，并激活磷酸肌醇3-激酶-Akt信号通路。
在本发明的另一实施方式中，提供调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞利用选自白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-1(IL-1)及脂多糖(lipopolysaccharide)组成的组中的一种以上进行处理。
优选地，选自上述白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-2、白细胞介素-1及脂多糖(lipopolysaccharide)组成的组中的一种以上为白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、脂多糖，最优选地，白细胞介素-1β在间充质干细胞进行处理，从而可执行引发干细胞的作用。更具体地，若对间充质干细胞处理选自由白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α及脂多糖(lipopolysaccharide)组成的组中的一种以上，则可诱导在间充质干细胞中，诱导性T细胞共刺激分子配体的表达的增加，并通过上述制备诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞，从而可强力地促进调节T细胞(调节性T细胞)分化及增殖。并且，所制备的诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞通过调节T细胞(调节性T细胞)分化及增殖促进效果可作为调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用干细胞治疗剂利用。
因此，本发明能够以在个别区室包含选自间充质干细胞、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-2、白细胞介素-1及脂多糖(lipopolysaccharide)组成的组中的一种以上的试剂盒的形态提供，优选为白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、脂多糖，最优选为白细胞介素-1β，并对间充质干细胞预处理选自由白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α及脂多糖(lipopolysaccharide)组成的组中的一种以上，最优选地，预处理白细胞介素-1β，从而在间充质干细胞中诱导诱导性T细胞共刺激分子配体的过表达，并通过上述可制备包含诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞的调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用组合物。
在本发明中“调节T细胞介导性疾病”是指由调节T细胞的异常或缺乏诱导的疾病，具体地，特征可在于，为炎症性疾病或自身免疫性疾病。
在本发明的一实施方式中，其特征可在于，上述炎症性疾病为选自由狼疮、干燥综合征、风湿性关节炎、纤维肌炎、硬皮症、强直性脊柱炎、白塞氏病、口疮性口炎、吉兰-巴雷(Guilain-Barre)综合征、斑秃、皮肌炎、克罗恩病、大肠炎、结节性多动脉炎、复发性多软骨炎及自身免疫性血小板减少症组成的组中的一种以上。
并且，在本发明的一实施方式中，其特征可在于，上述自身免疫性疾病为选自由风湿性关节炎、全身性硬皮病、基于胰脏细胞抗体儿童胰岛素依赖性糖尿病、斑秃、牛皮癣、天疱疮、哮喘、口疮性口炎、慢性甲状腺炎、一部分后天性再生障碍性贫血、原发性肝硬化、溃疡性大肠炎、白塞氏病、克罗恩病、矽肺、石棉肺、IgA肾病、链球菌感染后肾小球肾炎、干燥综合征、吉兰-巴雷综合征、皮肌炎、多发性肌炎、多发性硬化症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性脑脊髓炎、重症肌无力、格雷夫氏甲状腺功能亢进症、结节性多发性动脉炎、强直性脊柱炎、纤维肌痛、颞动脉炎、威尔逊氏病、范可尼综合征、多发性骨髓瘤及全身性红斑狼疮组成的组中的一种以上。
本发明的组合物可包含药学上可接受的载体和/或添加剂等。例如，可包括无菌水、生理盐水、缓冲液、惯用的缓冲剂(磷酸、柠檬酸盐、其他有机酸等)、稳定剂、盐、抗氧化剂、表面活性剂、助悬剂等渗剂或保鲜剂。并且，生物聚合物等的有机物，羟基磷灰石(hydroxyapatite)的无机物，具体地，可利用胶原基质、聚乳酸聚合物或共聚物、聚乙二醇聚合物或共聚物及其化学衍生物以及它们的混合组合物，但并不限于此。作为上述稳定剂，例如，可使用葡聚糖40、甲基纤维素、明胶、亚硫酸钠、偏硫酸钠等。作为抗氧化剂，例如，可使用异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、α-生育酚、生育酚乙酸酯、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯或乙二胺四钠乙酸(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等螯合剂。作为上述悬浮剂，例如，可使用甲基纤维素、聚山梨醇酯80、羟乙基纤维素、阿拉伯橡胶、黄蓍胶末、羧甲基纤维素钠、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯等。作为等渗剂，例如可使用D-甘露糖醇，山梨糖醇等。作为上述保鲜剂，例如，可使用对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，山梨酸，苯酚，甲酚，氯甲酚等。
包含像这样制备的基于本发明的诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞、其的培养物或诱导性T细胞共刺激分子配体的药剂学制剂可利用本领域中通常使用的给药方法移植及能够以与使用于其他用途的其他干细胞一同或与这种干细胞的混合物的形态给药，具体地，可直接生着或移植于需要治疗的患者的疾病部位或可直接移植或注入于腹腔，但并不限定于此。并且，上述给药均可以为利用导管的非外科性给药及切开疾病部位后注入或移植等外科性给药方法，但是利用导管的非外科性给药方法更适合。并且，根据通常的方法以非口服性地，例如，除了直接给药到病变之外，还可进行基于血管内注入的移植。上述干细胞的1次给药量为1.0×104至1.0×1010细胞/kg体重，具体地，为1.0×105至1.0×109细胞/kg体重，更具体地，可将1.0×106至1.0×108细胞/kg体重分1次或数次给药。但是，有效成分的实际给药量需要理解为根据所要治疗的疾病、疾病的严重程度、给药途径、患者的体重、年龄及性别等的多种相关因子确定，因此，上述给药量在任何方面并不限定本发明的范围。
并且，本发明提供调节T细胞介导性疾病的预防或治疗方法，上述调节T细胞介导性疾病的预防或治疗方法包括将诱导性T细胞共刺激分子配体(Induced T cell co-stimulator ligand)或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞给药到个体的步骤。
优选地，上述个体为包括人类的哺乳类，均包括作为需要调节T细胞介导性疾病治疗的患者调节T细胞介导性疾病治疗中的患者、接受过调节T细胞介导性疾病治疗的患者、需要接受调节T细胞介导性疾病治疗的患者，还可包括为了治疗调节T细胞介导性疾病施行外科手术的患者。
并且，本发明的诱导性T细胞共刺激分子配体(Induced T cellco-stimulatorligand)或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞可与除此之外的现有的用于治疗调节T细胞介导性疾病的药物或治疗方法并用而处理。在并用处理本发明的诱导性T细胞共刺激分子配体(Induced T cell co-stimulator ligand)或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞情况下，这是可与用于治疗调节T细胞介导性疾病的其他药物或治疗方法同时或依次处理。
并且，作为本发明的一实施方式，提供使CD4+T细胞分化及增殖为调节T细胞的诱导用组合物，上述使CD4+T细胞分化及增殖为调节T细胞的诱导用组合物包含诱导性T细胞共刺激分子配体(Induced T cell co-stimulator ligand)或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞。
上述“分化及增殖诱导”是指通过间充质干细胞表面的诱导性T细胞共刺激分子配体和CD4+T细胞的直接接触，促进CD4+T细胞分化为调节T细胞，并促进由诱导性T细胞共刺激分子配体(Induced T cellco-stimulator ligand)或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞分化诱导的调节T细胞的增殖。
上述组合物作为进一步促进在间充质干细胞中的诱导性T细胞共刺激分子配体的表达的目的，其组合物的特征在于，可以为选自由白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-2、白细胞介素-1及脂多糖(lipopolysaccharide)组成的组中的一种以上，优选为白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、脂多糖，最优选为还包含白细胞介素-1β，选自上述白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α及脂多糖组成的组中的一种以上为在间充质干细胞表面以促进诱导性T细胞共刺激分子配体的过表达的方式引发干细胞的物质。
并且，作为本发明的另一实施方式，本发明提供使CD4+T细胞分化诱导为调节T细胞的方法，上述使CD4+T细胞分化诱导为调节T细胞的方法包括在体外对CD4+T细胞处理诱导性T细胞共刺激分子配体或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞的步骤。
在上述方法中，特征可在于，诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞利用选自由白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-2、白细胞介素-1及脂多糖(lipopolysaccharide)组成的组中的一种以上进行预处理，优选地，利用白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α及脂多糖进行预处理，最优选地，利用白细胞介素-1β进行预处理，诱导性T细胞共刺激分子配体或诱导性T细胞共刺激分子配体的表达得到增加的干细胞通过与CD4+T细胞的直接接触，诱导CD4+T细胞的可诱导共刺激分子的表达的增加，并可促进向调节T细胞的分化及已分化的调节T细胞的增殖。
在本方法中，上述处理均可包括在涂敷有诱导性T细胞共刺激分子配体的孔中培养CD4+T细胞或对CD4+T细胞和诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞进行共培养。
以上在本说明书中所记载的数值应解释成在不另外明示的情况下还包括等同范围。
以下，为了便于理解提出优选的制备例、实施例及制剂例。但是，以下制备例、实施例及制剂例只是为了进一步容易理解本发明而提供，本发明的内容不被制备例、实施例及制剂例限定。
实施例1.人类克隆间充质干细胞(hcMSC)的特性分析
从健康男性志愿者获得人骨髓，并且根据仁荷大学医院的伦理委员会的私印(IRB#10-51)进行实验。利用根据以前的文献(Song SU,et al.(2008),Variations ofclonal marrow stem cell lines established from human bone marrow in surfaceepitopes,differentiation potential,gene expression,and cytokinesecretion.Stem cells and development 17(3):451-461.)的层分离培养法分离了人类克隆间充质干细胞，在补充有1％青霉素/链霉素的低葡萄糖DMEM培养基中培养全部人类克隆间充质干细胞，并通过与所分离的人类克隆间充质干细胞相关的流式细胞分析，确认了多种细胞表面标记。适用于上述分析的抗体如下：抗-CD29(Serotec,Kidlington,UK)、抗-CD44(Serotec)、抗-CD105(Serotec)、抗-CD34(BD Biosciences,San Diego,CA,USA)、抗-CD45(BD Biosciences)、抗-CD90(BD Biosciences)、抗-CD73(BDBiosciences)、抗-HLAclass I(BD Biosciences)、抗-HLA DR(BDBiosciences)、抗-CD80(eBiosciences,SanDiego,CA,USA)、抗-CD86(SouthernBiotech,Birmingham,AL,USA)及抗-Oct4(CellSignaling Technology,Danvers,MA,USA)。利用流式细胞分析仪(FACS Calibur；BDBiosciences)分析细胞，利用同型匹配的对照组抗体(Isotype matched controlantibody)作为对照组。在图1示出利用流式细胞分析确认人类克隆间充质干细胞的表面标记表达的结果。
如图1所示，确认了与CD29、CD44、C73、CD90、CD105、Oct-4及HLA class I相关的阳性、与CD34、CD45及人类白细胞DR抗原(HLA-DR)相关的阴性表达，并还对共刺激因子CD80、CD86确认了阴性表达。
利用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯阵列确认了人类克隆间充质干细胞的体外外周血单个核细胞活性。对利用人类克隆间充质干细胞和聚羟基脂肪酸酯(PHA)进行处理的外周血单个核细胞进行共培养，更具体地，利用1uM的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯染色1x106外周血单个核细胞，在1x105或1x106的人类克隆间充质干细胞存在下或不存在下，利用1ug/ml的聚羟基脂肪酸酯刺激了染色的外周血单个核细胞。聚羟基脂肪酸酯刺激72小时后，收获外周血单个核细胞，并利用流式细胞分析仪进行分析，在图2示出其结果。
如图2所示，在利用聚羟基脂肪酸酯处理与激活外周血单个核细胞共培养hMSC的情况下，这是抑制外周血单个核细胞的增殖。
实施例2.人类克隆间充质干细胞的调节性T细胞分化诱导确认
从健康的捐献者获得外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclearcell)，并通过ficoll-hypaque密度梯度离心进行了分离。利用CD4+T细胞分离试剂盒微珠(CD4+T cell Isolation Kit MicroBeads)(Miltenyi Biotech,Bisley,Surrey,UK)从外周血单个核细胞获取CD4+T细胞。
首先，为了确认调节性T细胞分化，在补充有10％的胎牛血清(FBS)、2mM的L-谷氨酰胺、100U/mL的青霉素的含有RPMI 1640的完全培养基中培养了CD4+T细胞。在4℃温度下，利用1ug/ml的抗-CD3单克隆抗体将24孔板涂敷了一夜。并且，利用作为用于调节性T细胞分化的条件的抗-CD3(anti-CD3)、抗-CD28(anti-CD28)、白细胞介素-2、转化生长因子-b1(TGF-b1)及atRA刺激了纯化的CD4+T细胞。为了确认调节性T细胞分化，第二天及第五天确认了FoxP3及CD25的表达。为了确认调节性T细胞诱导与人类克隆间充质干细胞之间的相关性，与人类克隆间充质干细胞共培养或人类克隆间充质干细胞独立仅培养CD4+T细胞，并通过培养第一天至第三天的FoxP3及CD25的表达分析及FoxP3+CD4+CD25+细胞的增加确认其结果，并在图3示出其结果。
如图3所示，确认了在调节性T细胞诱导条件下，逐渐地确认了FoxP3+CD25+调节性T细胞(A部分)，并且，可诱导与人类克隆间充质干细胞的共培养显著地更多的FoxP3+CD25+调节性T细胞(B部分)，还可增加来源于CD4+T细胞的FoxP3+CD25+群(C部分)。通过这种结果确认了人类克隆间充质干细胞可强力的诱导调节性T细胞。
实施例3.人类克隆间充质干细胞的接触依赖性诱导效果的确认
对人类克隆间充质干细胞和CD4+T细胞进行共培养，并利用光学显微镜(x400)确认这些细胞的形状，根据存在形态分为附着或漂浮形态，并通过流式细胞分析法比较了这些CD25及FoxP3表达量。
如图4所示，在光学显微镜上确认CD4+T细胞以附着或漂浮形态存在(A部分)，一部分CD4+T细胞附着在人类克隆间充质干细胞，如上所述的附着CD4+T细胞表达了更多的CD25和FoxP3。相反地，一部分CD4+T细胞在培养培养基中以漂浮的状态存在，这种漂浮细胞表达了比附着细胞更少的量的CD25及FoxP3(B部分)。
为了还检验细胞的附着与否对间充质干细胞介导的调节性T细胞的诱导是否产生影响，将transwell阵列进行了2天。为了transwell阵列，在下部腔室中培养CD4+T细胞，在上部腔室中培养人类克隆间充质干细胞，并确认在这种培养方法中可否呈现基于人类克隆间充质干细胞的调节性T细胞诱导效果，并在图5示出其结果。
如图5所示，在通过transwell阵列分离培养CD4+T细胞和人类克隆间充质干细胞的情况下，人类克隆间充质干细胞对CD4+T细胞的CD25+及FoxP3的表达不产生影响。
这种结果呈现，人类克隆间充质干细胞介导的调节性T细胞诱导需要细胞之间的接触，并且人类克隆间充质干细胞和T细胞之间的直接相互作用在CD4+T细胞中用于调节性T细胞的分化的信号传导中可起重要的作用。
实施例4.人类克隆间充质干细胞上的诱导性T细胞共刺激分子配体表达和调节性T细胞诱导相关性的确认
由于人类克隆间充质干细胞和T细胞的直接相互作用诱导调节性T细胞分化，因而预计人类克隆间充质干细胞上的诱导性T细胞共刺激分子配体的表达在信号传导中起重要作用，并进行了用于确认其的实验。在调节性T细胞诱导条件下，将人类克隆间充质干细胞和CD4+调节性T细胞共培养2天，利用流式细胞分析确认在人类克隆间充质干细胞下的诱导性T细胞共刺激分子配体蛋白质的表达，并且共培养24小时后，通过实时荧光定量聚合酶链式反应确认了信使核糖核酸的表达，去除非附着CD4+T细胞后，通过免疫荧光染色且通过共焦显微镜确认了人类克隆间充质干细胞上的诱导性T细胞共刺激分子配体的表达。利用EasyBlue核糖核酸分离试剂(EasyBlue RNA isolation reage nt)(Intron,Biotechnology,Sungnam,Korea)测定人类克隆间充质干细胞的总核糖核酸(RNA)，从2ug的总核糖核酸合成了cDNA。并通过AccuPower PCR premix(柏业公司(Bioneer))进行了逆转录-聚合酶链式反应。将扩增的聚合酶链式反应(PCR)产物在包含SybrSafe的1％琼脂糖凝胶上电泳，并使用荧光图像分析仪分析。利用以下引物进行聚合酶链式反应：白细胞介素-10(正向5′-ATCCAAGACAACACTACTAA-3′及逆向5′-TAAATATCCTCAAAGTTCC-3′)、白细胞介素-1(正向5′-GCTGAGTGCTGCAAAGTACC-3′及逆向5′-TGAGGAGGGA-CTTGTGACTG-3′)、白细胞介素1受体(IL-1R)(正向5′-ATTGATGTTCGTCCCTGT CC-3′及逆向5′-CCTCCACCTTAGCAGGAACA-3′)及磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(正向5′-CCACTGGCGTCTTCACCAC-3′及逆向5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′)。
为了确认诱导性T细胞共刺激分子配体信使核糖核酸，利用TaqMan probes(AssayID:Hs00323621_m1；Applied Biosystems,Foster city,CA,USA)及TaqMan Universal PCRMaster Mix(Applied Biosystems)进行了实时荧光定量聚合酶链式反应。信使核糖核酸水平针对18s rRNA(Hs03928985_g1))进行标准化，并在图6表示其结果。
如图6所示，通过流式细胞分析确认了诱导性T细胞共刺激分子配体在调节性T细胞分化条件下与人类克隆间充质干细胞进行共培养的情况下显著地向上调节(A部分)。并且，与流式细胞分析结果相同地，还在实时荧光定量聚合酶链式反应结果中确认了在共培养期间人类克隆间充质干细胞的诱导性T细胞共刺激分子配体信使核糖核酸表达增加(B部分)。还根据免疫荧光染色，相同地呈现人类克隆间充质干细胞共培养物中的诱导性T细胞共刺激分子配体的表达的增加(C部分)。
这种结果，呈现在调节性T细胞诱导条件下，人类克隆间充质干细胞上的诱导性T细胞共刺激分子配体的表达增加。
实施例5.通过与人类克隆间充质干细胞的共培养的T细胞可诱导共刺激分子的表达增加的确认
众所周知，在T细胞激活期间T细胞的可诱导共刺激分子向上调节，并且众所周知，别藻蓝蛋白的诱导性T细胞共刺激分子配体的表达可通过调节性T细胞诱导促进，抑制T细胞的反应。为了确认人类克隆间充质干细胞是否对T细胞的可诱导共刺激分子表达产生影响，在调节性T细胞分化条件下，对人类克隆间充质干细胞和CD4+T细胞进行48小时的共培养，并在图7示出在人类克隆间充质干细胞存在下，通过5次独立实验确认的CD4+T细胞的可诱导共刺激分子的诱导。
如图7所示，示出可诱导共刺激分子在CD4+T细胞和人类克隆间充质干细胞的共培养条件下进一步增加(A部分)，有趣的是，在人类克隆间充质干细胞存在的情况下，CD25+FoxP3+调节性T细胞表达了更高的可诱导共刺激分子(B部分)。这些结果呈现人类克隆间充质干细胞诱导为使CD4+T细胞呈现更高的可诱导共刺激分子表达及FoxP3+调节性T细胞表型。
实施例6.可诱导共刺激分子-诱导性T细胞共刺激分子配体的信号传导通路的确认
为了直接检测调节性T细胞诱导和诱导性T细胞共刺激分子配体的相互作用，阻隔了诱导性T细胞共刺激分子配体的功能，并确认了基于此的变化。为了阻隔T细胞共刺激分子的功能，进行了与诱导性T细胞共刺激分子配体相关的中和抗体处理及基因打靶试验。
更具体地，为了阻隔诱导性T细胞共刺激分子配体的功能，在共培养的人类克隆间充质干细胞和CD4+T细胞中以10μg/mL的量添加了抗-诱导性T细胞共刺激分子配体中性化抗体。
利用异硫氰酸荧光素(FITC)或别藻蓝蛋白(APC，allophycocyanin)接合的CD25、别藻蓝蛋白及PE接合的可诱导共刺激分子、异硫氰酸荧光素接合的CD4(eBiosciences)以暗环境在4℃温度下，对细胞表面进行了20分钟的染色。进行2天的共培养，并通过流式细胞分析确认了FoxP3+CD25+及FoxP3+ICOS+群的比率。
另一方面，因为可诱导的共刺激分子-诱导性T细胞共刺激分子配体的相互作用对于白细胞介素-10的产生重要，并且调节性T细胞表达可诱导共刺激分子促进白细胞介素-10的产生，所以通过流式细胞仪分析仪及酶联免疫吸附测定分析了基于由hsMSC诱导的调节性T细胞的白细胞介素-10的生产。在白细胞介素-10的生产中，利用PMA(40ng/mL；Sigma)及离子霉素(1μg/mL；西格玛公司(Sigma))将细胞再刺激5小时后进行确认，为了结束刺激追加了莫能菌素(monensin)(4μM；西格玛公司)。
在图8示出，在如上述的人类克隆间充质干细胞介导调节性T细胞诱导中，通过中和抗体处理的基于阻隔诱导性T细胞共刺激分子配体的功能的结果。
如图8所示，与诱导性T细胞共刺激分子配体相关的中和抗体处理(α诱导性T细胞共刺激分子配体)显著减少CD25+FoxP3+调节性T细胞群，由此，确认了在调节性T细胞组中可诱导共刺激分子表达也减少(A部分)。另一方面，人类克隆间充质干细胞显著地增加调节性T细胞的白细胞介素-10的生产，相反地，根据诱导性T细胞共刺激分子配体的中和抗体处理白细胞介素-10的生产减少(B部分、C部分)。
并且，通过对诱导性T细胞共刺激分子配体进行靶化的短发夹核糖核酸(shICOSL)表达慢病毒感染，来使人类克隆间充质干细胞的诱导性T细胞共刺激分子配体敲低后，针对于基于此的调节性T细胞群确认了Foxp3、可诱导共刺激分子、CD25的表达变化。为了慢病毒短发夹核糖核酸(shRNA，short-hairpin RNA)-介导的基因敲低从圣克鲁斯公司(Santacruz)(美国加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司(Santa cruzbiotechnology,Santa cruz,CA,USA))购买诱导性T细胞共刺激分子配体病毒并使用。为了短发夹核糖核酸的转染，将1×105人类克隆间充质干细胞接种于24-孔板上，次日，针对于附着人类克隆间充质干细胞，利用对照组(shCon)或诱导性T细胞共刺激分子配体短发夹核糖核酸慢病毒粒子(shICOSL)添加凝聚胺(5μg/mL，圣克鲁斯公司)或不添加凝聚胺，感染24小时。通过实时荧光定量聚合酶链式反应分析确认诱导性T细胞共刺激分子配体的敲低，感染的人类克隆间充质干细胞以后在调节性T细胞诱导条件下使用于与CD4+T细胞的共培养，并在图9示出敲低结果及基于敲低的调节性T细胞诱导效果的变化。
如图9所示，诱导性T细胞共刺激分子配体由短发夹核糖核酸处理有效地敲低(A部分)，并且确认了通过这种敲低人类克隆间充质干细胞的调节性T细胞诱导在诱导性T细胞共刺激分子配体敲低组中减少(B部分)。
这种结果显示诱导性T细胞共刺激分子配体对人类克隆间充质干细胞介导的调节性T细胞诱导起到必须的作用。
实施例7.基于人类克隆间充质干细胞的诱导性T细胞共刺激分子配体和表达的调节性T细胞群的诱导
7.1.诱导性T细胞共刺激分子配体过表达诱导的确认
在间充质干细胞介导的T细胞诱导中，在人类克隆间充质干细胞中，诱导诱导性T细胞共刺激分子配体的过表达，并确认了基于此的效果。为了与可诱导共刺激分子的过表达，与病毒包装结构一同将表达全长人类诱导性T细胞共刺激分子配体基因的慢病毒导入于人类克隆间充质干细胞。更具体地说，将全长人类诱导性T细胞共刺激分子配体基因表达载体亚克隆到C端(C-terminal)标记有mGFP pLenti载体。为了进行cDNA的定量化，将其转化到competent E.coli中，并为了确认诱导性T细胞共刺激分子配体的插入对作为结果物的克隆进行序列分析。利用包装试剂盒(packaging kit)(Origene)将诱导性T细胞共刺激分子配体表达载体转化于293FT细胞。为了生产慢病毒，将2.5×106的293FT细胞接种于100-mm培养皿，两天后，收获包含病毒的培养上清液，并使用于人类克隆间充质干细胞的感染。hcMCSs感染后，为了确认诱导性T细胞共刺激分子配体过表达水平进行实时荧光定量聚合酶链式反应、免疫印迹、流式细胞分析，并在图10示出其结果。
如图10所示，确认了导入有表达全长人类诱导性T细胞共刺激分子配体的慢病毒的人类克隆间充质干细胞(hcMSCICOSL)与导入有共载体的间充质干细胞对照组(hcMSCEmp)相比，诱导性T细胞共刺激分子配体的信使核糖核酸及蛋白质表达均增加(A部分、B部分)。并且，通过与诱导性T细胞共刺激分子配体融合的慢病毒载体表达GFP表达，还对诱导性T细胞共刺激分子配体的诱导进行确认，结果，在hcMSCICOSL中GFP增加，从而确认了有效地诱导诱导性T细胞共刺激分子配体的过表达。
7.2.在hcMSCICOSL中的调节性T细胞诱导增加的确认
在上述7.1中确认了在人类克隆间充质干细胞中诱导性T细胞共刺激分子配体过表达，因而，通过流式细胞分析及酶联免疫吸附测定确认在hcMSCICOSL中的调节性T细胞诱导增加与否，并在图11示出其结果。
如图11所示，hcMSCICOSL与导入有共载体的对照组相比诱导更多的CD25+FoxP3+调节性T细胞，并由hcMSCICOSL诱导的调节性T细胞表达了更多的可诱导共刺激分子(A部分)。并且通过流式细胞分析及酶联免疫吸附测定分析确认了hcMSCICOSL进一步促进基于调节性T细胞的作为效应物抗-炎症性细胞因子的白细胞介素-10的生产及分泌。这种结果呈现诱导性T细胞共刺激分子配体对间充质干细胞-介导的调节性T细胞诱导执行重要的作用，这是示出如下结果，即，间充质干细胞的诱导性T细胞共刺激分子配体起到作为有效的调节性T细胞诱导剂的作用。
实施例8.人类克隆间充质干细胞得到诱导的调节性T细胞的外周血单个核细胞增殖抑制效果的确认
确认了人类克隆间充质干细胞在调节性T细胞诱导条件下可诱导成使CD4+T细胞呈现表达CD25、FoxP3、可诱导共刺激分子及白细胞介素-10的调节性T细胞表型。另一方面，众所周知，调节性T细胞在体外及体内(in vivo)均具有淋巴细胞抑制活性，因而确认了调节性T细胞可否抑制激活淋巴细胞的增殖。
在调节性T细胞诱导条件下，将从外周血单个核细胞分离的CD4+T细胞与hcMSCEmp或hcMSCICOSL进行了2天的共培养。之后，从CD4+T细胞分离了包含调节性T细胞群的CD25+细胞。在利用10uM的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯预加热的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在最终浓度107cells/mL下对外周血单个核细胞进行了标记。利用1μg/mL的抗-CD3mAb(eBiosciences)及3μg/mL的抗-CD28mAb(eBiosciences)对利用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯进行标记的外周血单个核细胞刺激3天，并且将从CD4+T细胞和hcMSCICOSL或hcMSCEmp的共培养物分离的CD25+群与进行羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯标记且激活的外周血单个核细胞一同以1：5或1：10(调节性T细胞：外周血单个核细胞)进行了3天的共培养。通过羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯稀释评价流式细胞分析仪对外周血单个核细胞的增殖进行分析，并在图12示出其结果。
如图12所示，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯分析结果呈现在无调节性T细胞的条件下，激活外周血单个核细胞为约80％，在和调节性T细胞共培养的情况下，其dividing PBMC以细胞数依赖性地减少，从而确认了由调节性T细胞呈现免疫抑制效果。另一方面，在hcMSCICOSL诱导得到的调节性T细胞及hcMSCEmp诱导得到的调节性T细胞之间未呈现与外周血单个核细胞相关的显著的功能性差异。
实施例9.基于诱导性T细胞共刺激分子配体-可诱导共刺激分子相互作用的磷酸肌醇3-激酶-Akt信号通路的激活的确认
众所周知，磷酸肌醇3-激酶-Akt信号传导通路对T细胞的增殖、移动、分化及细胞因子生产等T细胞的功能执行重要的作用。为了还确认诱导性T细胞共刺激分子配体的生理学功能，从信号传导观点上确认了基于调节性T细胞分化期间的诱导性T细胞共刺激分子配体-可诱导共刺激分子的相互作用的分子信号调节。
为此，在调节性T细胞诱导条件下，对CD4+T细胞将作为重组人类诱导性T细胞共刺激分子配体的rhICOSL(5μg/mL)(R&D research,Minneapolis,MN,USA)处理2天，并通过流式细胞分析对它们的CD25、可诱导共刺激分子、FoxP3的表达进行了分析。全部实验独立地进行5次。具体地，为了给药rhICOSL(R&D research,Minneapolis,MN,USA)，在37℃温度下，利用5μg/mL的rhICOSL将孔涂敷4小时。以1×106cells/mL的方式将分离的CD4+T细胞追加于各孔，并与1ng/mL的白细胞介素-2(eBiosciences)、5ng/mL的转化生长因子(TGF-α)(R&Dresearch,Minneapolis,MN,USA)及0.1μM的全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid)(atRA；PHASigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)一同利用3μg/mL的抗-CD28mAb(eBiosciences)刺激了2天至5天。人类克隆间充质干细胞2和CD4+T细胞以1：10(hcMSCs：T细胞)的比率进行了2天的共培养。2天后，利用含有0.05mM的EDTA的冷磷酸盐缓冲液将人类克隆间充质干细胞清洗3次，并从人类克隆间充质干细胞分离了淋巴细胞。之后，对人类克隆间充质干细胞进行胰蛋白酶化，并利用磷酸盐缓冲液-乙二胺四乙酸(PBS-EDTA)清洗2次，为了诱导性T细胞共刺激分子配体表达分析添加PE-接合的诱导性T细胞共刺激分子配体抗体(BioLegend)来进行了染色。通过免疫印迹确认基于处理rhICOSL的Akt是否磷酸化，并在图13示出其结果。
如图13所示，与非处理对照组相比，与人类克隆间充质干细胞和处理结果类似地，与CD4+T细胞相关的rhICOSL的处理也促进了FoxP3+ICOS+调节性T细胞诱导(A部分)。rhICOSL的处理使Akt磷酸化显著增加(B部分)。这种结果示出，诱导性T细胞共刺激分子配体在调节性T细胞诱导期间对磷酸肌醇3-激酶-Akt信号通路进行激活。
实施例10.通过磷酸肌醇3-激酶-Akt信号通路的调节性T细胞分化调节的确认
为了确认在诱导性T细胞共刺激分子配体介导的调节性T细胞分化中，磷酸肌醇3-激酶-Akt信号通路是否参与，处理磷酸肌醇3-激酶(PI3K，phosphatidylinositide 3-kinases)抑制剂LY294002或AKt抑制剂GSK690693，并确认了基于此的效果。以1μM的浓度使用Akt抑制剂GSK690693(Calbiochem,San Diego,CA,USA)，并以5-10μM的浓度使用LY294002(Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA)。
更具体地，利用LY294002(5μM)及GSK690693(1μM)对CD4+T细胞进行30分钟的预处理，并确认外因性rhICOSL的处理是否诱导Akt的磷酸化及磷酸肌醇3-激酶-Akt抑制剂在调节性T细胞诱导条件下，在1小时以内对rhICOSL诱导得到的Akt磷酸化是否抑制，并确认了总Akt。并且，在rhICOSL诱导得到的调节性T细胞诱导中，针对于磷酸肌醇3-激酶-Akt抑制的影响，将LY294002(5μM)或GSK690693(1μM)处理2天后，通过基于rhICOSL处理得到的CD4+T细胞的培养的CD25、可诱导共刺激分子、FoxP3的表达，进行分析，并在图14示出其结果。
如图14所示，Y294002及GSK690693的处理均显著减少Akt的磷酸化(A部分)。同时，确认了rhICOSL或人类克隆间充质干细胞诱导得到的调节性T细胞由这些抑制剂的处理减少(B部分)。这种结果示出磷酸肌醇3-激酶-Akt信号传导通路参与诱导性T细胞共刺激分子配体调节得到的调节性T细胞诱导。相反地，基于磷酸肌醇3-激酶-Akt通路的抑制的在正常状态下的调节性T细胞群的减少在正常调节性T细胞诱导期间呈现信号传导通路的功能性的重要性(B部分)。这种结果呈现诱导性T细胞共刺激分子配体-可诱导共刺激分子-磷酸肌醇3-激酶-Akt信号传导轴可参与人类克隆间充质干细胞-介导的调节性T细胞诱导调节。
实施例11.间充质干细胞克隆之间的诱导性T细胞共刺激分子配体表达和与调节性T细胞诱导的相关性确认
众所周知，不同的间充质干细胞克隆呈现互不相同的功能性特性，因此确认了根据人类克隆间充质干细胞用于诱导人类调节性T细胞的诱导性T细胞共刺激分子配体的表达程度不同与否。共利用6个hMSC株，通过实时荧光定量聚合酶链式反应，确认了在来源于一个授予人的5个克隆人类克隆间充质干细胞(人类克隆间充质干细胞1-5)及在一个非克隆人类克隆间充质干细胞(hncMSC)中，诱导性T细胞共刺激分子配体的基本表达。并且，为了确认人类克隆间充质干细胞的调节性T细胞诱导活性，针对于人类克隆间充质干细胞1及人类克隆间充质干细胞4细胞株的调节性T细胞诱导能力，在混合淋巴细胞反应(mixedlymphocyte reaction，MLR)中，在与外周血单个核细胞的共培养或在调节性T细胞诱导条件下，在人类非克隆间充质干细胞、人类克隆间充质干细胞1及人类克隆间充质干细胞4中，通过比较CD25、FoxP3的表达进行了确认。在图15示出其结果。
如图15所示，确认了在人类克隆间充质干细胞4中呈现最高的诱导性T细胞共刺激分子配体信使核糖核酸表达，与人类非克隆间充质干细胞进行比较，大部分的人类克隆间充质干细胞呈现了更高的诱导性T细胞共刺激分子配体表达(A部分、B部分)。尤其，人类克隆间充质干细胞4在MLR条件(C部分)及调节性T细胞诱导条件(D部分)中均呈现CD25及FoxP3的表达最高。
通过上述确认了人类克隆间充质干细胞4为对调节性T细胞的诱导最有效地细胞株。并且，呈现细胞株的诱导性T细胞共刺激分子配体信使核糖核酸表达的增加越高，就呈现越高的调节性T细胞诱导效果。这种结果，示出诱导性T细胞共刺激分子配体的表达能力与用于诱导调节性T细胞的人类克隆间充质干细胞能力有相关关系，并呈现细胞株的诱导性T细胞共刺激分子配体的诱导性越高，调节性T细胞的诱导能力就越高。
实施例12.基于白细胞介素-1β的在人类克隆间充质干细胞中的诱导性T细胞共刺激分子配体诱导的确认
众所周知，间充质干细胞的免疫抑制活性可由多种引发及适当刺激左右。并确认了在人类克隆间充质干细胞中的诱导性T细胞共刺激分子配体的表达与调节性T细胞诱导相关，因而，预计在使诱导性T细胞共刺激分子配体的表达增加的情况下，增加更多的调节性T细胞，人类克隆间充质干细胞的免疫抑制功能可得到增强。为了确认上述，先进行用于确认可诱导诱导性T细胞共刺激分子配体的表达的促炎性细胞因子的实验。首先，为了找到适当的引发因子在人类克隆间充质干细胞中将白细胞介素-1β(10ng/mL)、肿瘤坏死因子-α(10ng/mL)、脂多糖(2μg/mL)分别处理24小时后，通过实时荧光定量聚合酶链式反应，在1小时、3小时后确认了诱导性T细胞共刺激分子配体的表达。并且，为了确认根据白细胞介素-1β处理，在人类克隆间充质干细胞中的白细胞介素1受体的表达是否变化，将白细胞介素-1β处理24小时后，同时确认在人类克隆间充质干细胞中的白细胞介素1受体的表达，并在图16示出其结果。
如图16所示，在白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、脂多糖处理组中均确认诱导性T细胞共刺激分子配体的信使核糖核酸水平增加(A部分、B部分)，其中白细胞介素-1β呈现了最强力的效果。众所周知，白细胞介素-1β通过与作为其的受体的白细胞介素1受体1(IL-1R1)的结合，调节细胞性反应，并在人类克隆间充质干细胞表达白细胞介素1受体1。确认了如逆转录-聚合酶链式反应结果，正常人类克隆间充质干细胞表达白细胞介素1受体1的信使核糖核酸。并且，白细胞介素-1β(10ng/ml)的处理使诱导性T细胞共刺激分子配体的信使核糖核酸及时显著增加，但是未改变白细胞介素1受体1的信使核糖核酸的表达。
实施例13.克隆间充质干细胞的白细胞介素-1β诱导效果的确认
与人类非克隆间充质干细胞进行比较，确认了人类克隆间充质干细胞4的诱导性T细胞共刺激分子配体的表达诱导效果更优秀，因而进行了用于确认基于白细胞介素-1β处理的克隆(clonal)及非克隆间充质干细胞的诱导性T细胞共刺激分子配体诱导效果差异的实验。具体地，利用白细胞介素-1β(10ng/ml)对人类非克隆间充质干细胞及人类克隆间充质干细胞4进行24小时的处理，并通过实时荧光定量聚合酶链式反应，根据时间分析诱导性T细胞共刺激分子配体的信使核糖核酸表达，通过免疫印迹及流式细胞分析，确认了诱导性T细胞共刺激分子配体的蛋白质表达变化。以5次的独立实验的代表值示出流式细胞分析，并在图17示出其结果。
如图17所示，实时荧光定量聚合酶链式反应结果示出白细胞介素-1β-刺激的诱导性T细胞共刺激分子配体的诱导在人类克隆间充质干细胞及人类非克隆间充质干细胞中，在6小时及24小时中不同地呈现(A部分)。两个间充质干细胞之间的基于白细胞介素-1β的诱导性T细胞共刺激分子配体的差异还在免疫印迹及流式细胞分析结果中相同地呈现(B部分、C部分)。
为了确认基于如上述的克隆、非克隆间充质干细胞的种类的诱导性T细胞共刺激分子配体诱导效果的差异是否由白细胞介素-1β呈现，通过处理作为白细胞介素-1β中和抗体的抗-白细胞介素-1β抗体(10μg/mL)，来阻隔白细胞介素-1β功能，并确认基于此的诱导性T细胞共刺激分子配体诱导效果的变化，并在图18示出其结果。
如图18所示，抗-白细胞介素-1β中和抗体的处理阻隔白细胞介素-1β的功能，其结果，呈现由白细胞介素-1β诱导的诱导性T细胞共刺激分子配体表达减少。
这种结果示出白细胞介素-1β为在人类克隆间充质干细胞中诱导诱导性T细胞共刺激分子配体的强力的引发因子。
实施例14.基于处理白细胞介素-1β的调节性T细胞诱导增加效果的确认
为了检验利用白细胞介素-1β引发的人类克隆间充质干细胞是否进一步增加调节性T细胞诱导活性，将利用白细胞介素-1β对人类克隆间充质干细胞进行24小时的处理来取得的hcMSCIL-1β在调节性T细胞分化条件下，与CD4+T细胞进行2天的共培养，并通过流式细胞分析确认了基于此的CD4+CD25+FoxP3+或CD4+可诱导共刺激分子+FoxP3+T细胞群的比率。并且，处理抗-诱导性T细胞共刺激分子配体中和抗体(5ug/ml)后，对hcMSCIL-1β和CD4+T细胞进行共培养，并确认可诱导共刺激分子的中和抑制可否抑制白细胞介素-1β引发的基于人类克隆间充质干细胞的调节性T细胞诱导，并在图19示出其结果。
如图19所示，与作为未处理白细胞介素-1β的人类克隆间充质干细胞的hcMSCVeh相比，利用白细胞介素-1β引发的hcMSC(hcMSCIL-1β)生产更多的CD25+FoxP3+调节性T细胞(A部分)。并且，示出通过抗-诱导性T细胞共刺激分子配体中和抗体的处理使由hcMSCIL-1β及正常人类克隆间充质干细胞诱导的CD25+FoxP3+调节性T细胞均减少(B部分)。这种结果为如下结果，即，呈现利用白细胞介素-1β引发的人类克隆间充质干细胞表达诱导性T细胞共刺激分子配体，并通过磷酸肌醇3-激酶-Akt信号传导通路的激活，促进调节性T细胞分化。
实施例15.基于人类克隆间充质干细胞的DDS诱导大肠炎的缓解
15.1.DDS大肠炎诱导动物模型的制备及实验方法
由通过上述实施例确认了在人类克隆间充质干细胞的免疫抑制能力中的人类诱导性T细胞共刺激分子配体的功能性作用，因而为了确认实际这种处理在T细胞介导疾病的治疗中可否呈现效果，确认了在作为T细胞介导疾病中的一种的大肠炎模型中基于给药间充质干细胞的对免疫抑制效果产生的影响。
为了诱发急性大肠炎，在食饮水中稀释4％的葡聚糖硫酸钠，来给药到Balb/c雌性小鼠0天至7天，第八天更换正常的食饮水。将Balb/c小鼠分为4组进行实验，并在图20示出这种大肠炎动物模型诱导协议。在葡聚糖硫酸钠给药24小时之前，通过诱导性T细胞共刺激分子配体表达慢病毒转导hcMSC。利用磷酸盐缓冲液清洗转导的人类克隆间充质干细胞，在磷酸盐缓冲液中，以5×105cells/head/200μl的密度进行重悬浮。第一天及第三天通过尾部静脉注射hcMSCs(5×105cells，200μl磷酸盐缓冲液)，并且第十天牺牲小鼠。Balb/c小鼠分为如下实验组：对照组(Con，4只小鼠)、经磷酸盐缓冲液处理的大肠炎组(磷酸盐缓冲液+葡聚糖硫酸钠，6只小鼠)、hcMSCICOSL-注入的大肠炎组(hcMSCICOSL+葡聚糖硫酸钠，6只小鼠)。
15.2.基于DDS诱导的大肠炎的人类克隆间充质干细胞的影响
在诱导DDS的大肠炎小鼠模型中，每天确认大肠炎严重度，并利用粪便浓度、是否存在血液、是否体重减少评价大肠炎严重度。从小鼠去除整个大肠，并利用间接炎症标记确认了大肠的长度。为了分析大肠内小鼠的调节性T细胞，与别藻蓝蛋白-接合的抗-CD25、异硫氰酸荧光素(FITC)-接合的抗-CD4及PE-接合的抗-FoxP3抗体(赛默飞世尔公司(eBioscience))一同培养了从肠系膜的(mesenteric)淋巴结分离的细胞。为了体外实验，从脾脏和淋巴结分离CD4+T细胞，通过流式细胞分析确认了已分离的细胞的纯度。利用1μg/ml的板附着抗-CD3mAb及3μg/ml的可溶的(soluble)抗-CD28mAb激活CD4+T细胞，并在第一天及第二天进行分析，在图21示出其结果。
如图21所示，与仅磷酸盐缓冲液处理的大肠炎组相比，注入hcMSCICOSL的小鼠大肠的收缩减少。并且，在注入hcMSCICOSL的小鼠中体重的损失也减少。这种结果示出hcMSCICOSL在大肠炎小鼠中均可示出有效地大肠炎缓解及治疗效果。
对如上述的结果进行综合，可知可诱导共刺激分子-ICOSL的相互作用对基于间充质干细胞的人类调节性T细胞诱导起到重要的作用。在炎症性条件下，hcMSC可将诱导性T细胞共刺激分子配体诱导于它们的表面，这是可通过基于调节性T细胞上的可诱导共刺激分子的表达的磷酸肌醇3-激酶-Akt信号传导通路的激活，来促进调节性T细胞的诱导。白细胞介素-1β为基于在人类克隆间充质干细胞中向上调节的诱导性T细胞共刺激分子配体的可促进人类调节性T细胞的强力的引发因子。通过这种结果可明确理解人类克隆间充质干细胞的免疫抑制机制，并可有效地使用于开发用于难治性免疫疾病的靶治疗的进一步有效的干细胞治疗剂。
制剂例1.医药品的制备
1.1.散剂的制备
诱导性T细胞共刺激分子配体100mg
乳糖100mg
滑石10mg
混合上述成分并填充于气密袋来制备散剂。
1.2.片剂的制备
诱导性T细胞共刺激分子配体100mg
玉米淀粉100mg
乳糖100mg
硬脂酸镁2mg
混合上述成分后，按照常规的片剂的制备方法打锭而制备片剂。
1.3.胶囊剂的制备
诱导性T细胞共刺激分子配体100mg
玉米淀粉100mg
乳糖100mg
硬脂酸镁2mg
根据常规的胶囊剂的制备方法混合上述成分，填充于明胶胶囊来制备了胶囊剂。
1.4.注射剂的制备
诱导性T细胞共刺激分子配体100mg
注射用灭菌蒸馏水适量
pH调节剂适量
根据通常的注射剂的制备方法，以每1安瓿(2ml)含有上述成分的方式进行制备。
1.5.液剂的制备
诱导性T细胞共刺激分子配体100mg
白糖20g
异构化糖20g
柠檬香适量
加入纯化水使总体积成为1000ml。根据常规的液剂制备方法混合上述成分后，填充于褐色瓶并灭菌以制备液剂。
Claims (16)
1.一种调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，包含诱导性T细胞共刺激分子配体或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上述诱导性T细胞共刺激分子配体来源于间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，在间充质干细胞表面表达上述诱导性T细胞共刺激分子配体。
4.根据权利要求1所述的调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上述干细胞为克隆干细胞。
5.根据权利要求1所述的调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上述干细胞为来源于骨髓的间充质干细胞。
6.根据权利要求1所述的调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上述诱导性T细胞共刺激分子配体使T细胞的可诱导共刺激分子表达增加。
7.根据权利要求1所述的调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上述诱导性T细胞共刺激分子配体激活磷酸肌醇3-激酶-Akt信号通路。
8.根据权利要求1所述的调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上述间充质干细胞为利用选自于由白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-2、白细胞介素-1及脂多糖组成的组中的一种以上进行处理的间充质干细胞。
9.根据权利要求1所述的调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上述调节T细胞介导性疾病为炎症性疾病或自身免疫性疾病。
10.根据权利要求9所述的调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上述炎症性疾病选自于由狼疮、干燥综合征、风湿性关节炎、纤维肌炎、硬皮症、强直性脊柱炎、白塞氏病、口疮性口炎、吉兰-巴雷综合征、斑秃、皮肌炎、克罗恩病、大肠炎、结节性多动脉炎、复发性多软骨炎及自身免疫性血小板减少症组成的组中的一种以上。
11.根据权利要求9所述的调节T细胞介导性疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上述自身免疫性疾病为由风湿性关节炎、全身性硬皮病、基于胰脏细胞抗体儿童胰岛素依赖性糖尿病、斑秃、牛皮癣、天疱疮、哮喘、口疮性口炎、慢性甲状腺炎、一部分后天性再生障碍性贫血、原发性肝硬化、溃疡性大肠炎、白塞氏病、克罗恩病、矽肺、石棉肺、IgA肾病、链球菌感染后肾小球肾炎、干燥综合征、吉兰-巴雷综合征、皮肌炎、多发性肌炎、多发性硬化症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性脑脊髓炎、重症肌无力、格雷夫氏甲状腺功能亢进症、结节性多发性动脉炎、强直性脊柱炎、纤维肌痛、颞动脉炎、威尔逊氏病、范可尼综合征、多发性骨髓瘤及全身性红斑狼疮组成的组中的一种以上。
12.一种使CD4+T细胞分化及增殖为调节T细胞的诱导用组合物，其特征在于，包含诱导性T细胞共刺激分子配体或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞。
13.根据权利要求12所述的使CD4+T细胞分化及增殖为调节T细胞的诱导用组合物，其特征在于，包含选自于由白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-2、白细胞介素-1及脂多糖组成的组中的一种以上。
14.一种使CD4+T细胞分化及增殖为调节T细胞的诱导方法，其特征在于，包括在体外用诱导性T细胞共刺激分子配体或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞对CD4+T细胞进行处理的步骤。
15.根据权利要求14所述的使CD4+T细胞分化及增殖为调节T细胞的诱导方法，其特征在于，上述诱导性T细胞共刺激分子配体的表达得到增加的干细胞为利用选自于由白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-2、白细胞介素-1及脂多糖组成的组中的一种以上进行预处理的干细胞。
16.一种调节T细胞介导性疾病的预防或治疗方法，其特征在于，包括向受试者给予诱导性T细胞共刺激分子配体或诱导性T细胞共刺激分子配体过表达间充质干细胞的步骤。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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