CN108276498B - 一种包含截短cd20分子的嵌合抗原受体、慢病毒载体及应用 - Google Patents

一种包含截短cd20分子的嵌合抗原受体、慢病毒载体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种包含截短CD20分子的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括前导肽、ScFv、铰链区及跨膜区、免疫受体酪氨酸活化基序、IRES和tCD20。还公开了一种慢病毒表达载体，其包含有编码该嵌合抗原受体的核苷酸序列。还公开了可以表达该嵌合抗原受体的免疫细胞。将本发明的包含截短CD20分子的嵌合抗原受体在免疫细胞中表达后，可有效杀伤抗原阳性的肿瘤细胞且对阴性细胞无毒副作用，携带的tCD20既可以做检测CAR表达的标签肽，又可以在杀伤肿瘤细胞后加入清除性抗体，如利妥昔单抗，从而清除CAR‑T细胞，保障临床上使用的安全性。

Description

一种包含截短CD20分子的嵌合抗原受体、慢病毒载体及应用
技术领域
本发明涉及一种包含截短CD20分子的嵌合抗原受体、慢病毒载体及应用，属于基因工程领域中的肿瘤免疫治疗技术。
背景技术
据WHO统计，癌症成为威胁人类健康的第二大杀手。有数据显示，全球每年新发病例将达到1406.8万，每年因癌症死亡的病例将达到820.1万。在继手术、化疗和放疗等技术都无法取得良好的治疗效果的情况下，人们把目光逐渐聚焦到生物治疗领域。
细胞治疗是生物治疗领域的重要分支，嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptors，CAR)T细胞被认为是目前细胞治疗领域的明日之星，因其在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤治疗上的显著疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。
CARs的一大优势是由于它是靶向细胞表面的分子，因此可以不受T细胞受体(Tcell receptor，TCR)识别主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)的限制从而避免肿瘤细胞通过抗原赠予或表达白细胞抗原产生逃逸。基因修饰的T细胞不仅仅是给T细胞上授予一个新的抗原反应，而且可以通过插入基因来增强T细胞的效应。为了克服因TCR识别能力缺乏而导致的肿瘤免疫耐受，T细胞中通过基因修饰的CAR包含编码抗体基本识别区的序列。单链抗体(single chain Fv，ScFv)是由1条单肽链按VL-linker-VH的顺序所组成，大小仅为完整抗体的1/6，是抗体与抗原结合的最小单位。CARs的胞外区就由特异的ScFv组成。
1989年，Gideon Gross等人通过基因工程的方法改造T细胞受体(T-cellreceptor,TcR)基因，用抗体的可变区(V区)对TcR的胞外区进行替换，并成功靶向目标细胞，首次提出CAR的概念并预言此项技术可以在临床应用。时至今日，CAR的研究已经如火如荼，其设计思路大致分为四代；第一代CARs编码抗体为基础的外置受体结构和编码由酪氨酸触发的主要免疫受体如TCRζ和FcRγ等信号传导分子的胞内结构；第二代CARs还包括一个共刺激信号区如CD28或4-1BB；第三代CARs的胞内区则包括两个或两个以上，包括CD27、CD28、4-1BB、ICOS或OX40。而第四代CAR也被称作TRUCKs(卡车)或“装甲”CARs，其结合了第二代CAR-T和高表达抗肿瘤活性的因素，比如细胞因子、共刺激配体或可降解实体瘤胞外基质的酶。
CAR-T细胞中CAR阳性表达率不能直接通过抗体进行检测，需要使用通用抗体或自带标签进行间接测定。通用抗体如IgG的某一片段加上二抗来进行间接标记，这样做的优点是载体上不需要引入其他DNA序列；缺点是容易出现非特异性结合，所以背景较高，另外不是所有CAR都可以用通用抗体进行标记，所以需要购买抗体进行试验，浪费资金和时间。自带标签如His，Myc等虽然容易构建和检测，但是它们属于异源性蛋白，容易引发排斥反应，增加临床使用风险。CD20是在B淋巴细胞表面表达的激活的糖基化磷酸蛋白，蛋白大小为33-35kD，为跨膜4A基因家族(MS4A)的成员之一，有43个氨基酸位于细胞膜外。本发明将截短的人CD20抗原(Truncated CD20，tCD20)肽段插入CAR载体，首要目的是作为自带标签检测CAR的表达情况。tCD20既能够直接用CD20抗体进行检测来标记CAR的表达率，又属于人的蛋白，临床应用时不会因标签本身产生排斥。
尽管CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但一些潜在的风险亦需要考虑。与CAR-T疗法的有效性共存的是它的副作用和细胞毒性。严重的副作用有脱靶效应、肿瘤溶解综合征、细胞因子释放综合征等。这就需要针对CAR-T细胞的安全性进行进一步改进。因此，本发明的次要目的是tCD20可作为CAR-T细胞的“分子开关”来使用。在带有tCD20标签的CAR-T细胞治疗后产生严重毒副性反应时，可以利用临床上目前已经使用的CD20单抗，如利妥昔单抗(rituximab)，通过注射抗体药物清除CAR-T细胞。
发明内容
针对上述现有技术，为解决现有技术中存在的不足，本发明的目的之一在于提供包含截短CD20分子(tCD20)的嵌合抗原受体；本发明的目的之二在于提供表达tCD20的嵌合抗原受体的慢病毒载体；本发明的目的之三在于提供所述tCD20的嵌合抗原受体或所述的慢病毒载体在制备包含tCD20的嵌合抗原受体的免疫细胞中的应用；本发明的目的之四在于提供利用所述包含tCD20的嵌合抗原受体或所述的慢病毒载体制备的表达包含tCD20的嵌合抗原受体的免疫细胞及应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种包含截短CD20分子的嵌合抗原受体，该受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(编码该序列的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示)，其结构包括：如SEQ ID NO.3所示的CD8穿膜信号肽，如SEQ ID NO.4所示的单链抗体Scfv，如SEQ ID NO.5所示的CD8跨膜区，如SEQID NO.6所示的4-1BB共刺激信号区，如SEQ ID NO.7所示的CD3Zeta TCR激活区，如SEQ IDNO.8所示的内部核糖体进入位点区，如SEQ ID NO.9所示的tCD20。
本发明所采用的单链抗体Scfv是除CD20外，可以靶向任意抗原的单链抗体Scfv，如靶向HER-2分子、靶向EGFR分子、靶向CD19分子等，实施例中为靶向HER-2的单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
编码上述包含截短CD20分子的嵌合抗原受体的基因，核苷酸序列SEQ ID NO.1所示。
一种慢病毒表达载体，其包含有编码上述包含截短CD20分子的嵌合抗原受体的核苷酸序列(该序列如SEQ ID NO.1所示)。该重组表达载体的构建方法，为常规方法。
所述包含截短CD20分子的嵌合抗原受体在制备包含截短CD20的嵌合抗原受体的免疫细胞中的应用。
所述慢病毒载体在制备包含截短CD20的嵌合抗原受体的免疫细胞中的应用。
所述免疫细胞可以为T细胞、B淋巴细胞、NK细胞、CIK细胞，优选T细胞。
一种表达包含截短CD20分子的嵌合抗原受体的免疫细胞，为包含有上述慢病毒表达载体的原始细胞，或染色体中整合有编码包含截短CD20分子的嵌合抗原受体的核苷酸序列(该序列如SEQ ID NO.1所示)的原始细胞。所述原始细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。
上述包含截短CD20分子的嵌合抗原受体、基因、慢病毒表达载体、表达包含截短CD20分子的嵌合抗原受体的免疫细胞在治疗肿瘤中的应用，及在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了包含tCD20的嵌合抗原受体，其包括前导肽、ScFv、铰链区及跨膜区、免疫受体酪氨酸活化基序、IRES和tCD20；将该嵌合抗原受体在免疫细胞中表达后，可有效杀伤抗原阳性的肿瘤细胞且对阴性细胞无毒副作用，携带的tCD20既可以做检测CAR表达的标签肽，又可以在杀伤肿瘤细胞后加入清除性抗体，如利妥昔单抗(rituximab)，从而清除CAR-T细胞，保障临床上使用的安全性。
SEQ ID NO.1(序列方向均为5'to3')：
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggagcaggacatccagctgacccagtctcacaaattcctgtccacttcagtaggagacagggtcagcatcacctgcaaggccagtcaggatgtgtataatgctgttgcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaacttctgatttactcggcatcctcccggtacactggagtcccttctcgcttcactggcagtggctctgggccggatttcactttcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttatttctgtcagcaacattttcgtactccattcacgttcggctcggggacaaaattggagatcggcggtggcggttctggtggcggtggctccggcggtggcggttctctagcttctcaggtacaactgcagcagtctggacctgaactgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcctctgggtatcctttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggacagggtttaaagtggatgggctggattaacacctccactggagagtcaacatttgctgatgacttcaagggacggtttgacttctctttggaaacctctgccaacactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaagtgaagacatggctacatatttctgtgcaagatgggaggtttaccacggctacgttccttactggggccaagggaccacggtcaccgtttcctctggatccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgctccctaaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcggctaagcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacagcggccgctatgataatgaattcattgagcctctttgctgccatttctggaatgattctttcaatcatggacatacttaatattaaaatttcccattttttaaaaatggagagtctgaattttattagagctcacacaccatatattaacatatacaactgtgaaccagctaatccctctgagaaaaactccccatctacccaatactgttacagcatacaatctctgttcttgggcattttgtcagtgatgctgatctttgccttcttccaggaacttgtaatagctggcatcgtt。
SEQ ID NO.2：(序列中的“*”是指终止密码子。因为IRES区是不被表达成蛋白序列的，所以要是直接进行序列翻译的话就有很多密码子干扰，但在实际中此段是不进行氨基酸翻译的)
Figure BDA0001561375700000041
Figure BDA0001561375700000051
SEQ ID NO.3：MALPVTALLLPLALLLHAARPEQ。
SEQ ID NO.4：
Figure BDA0001561375700000052
SEQ ID NO.5：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPL SLRPEACRPAAGGAVHTRGL DFACD。
SEQ ID NO.6：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQ TTQEEDGCSCRFPEEEEGGCE。
SEQ ID NO.7：
LRVKFSRSADAPAYKQGQNQ LYNELNLGRREEYDVLDKRR
GRDPEMGGKPRRKNPQEGLY NELQKDKMAEAYSEIGMKGE
RRRGKGHDGLYQGLSTATKD TYDALHMQALPPRG。
IRES DNA序列如SEQ ID NO.8所示：
GCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACA。
SEQ ID NO.9：
MIMNSLSLFAAISGMILSIM DILNIKISHFLKMESLNFIR
AHTPYINIYNCEPANPSEKN SPSTQYCYSIQSLFLGILSV
MLIFAFFQELVIAGIV。
本发明中一些常用的术语说明如下；
CAR：chimeric antigen receptors，嵌合抗原受体。
Lv：Lentivirus，慢病毒载体。
ScFv：single chain Fv，单链抗体。
T：T淋巴细胞。
tCD20：Truncated CD20，截短的CD20分子。
IRES：internal ribosome entry site，内部核糖体进入位点。
HER-2：human epidermalgrowth factor receptor-2，人类表皮生长因子受体2。
anti-HER-2-T：表达抗HER-2分子的嵌合抗原受体T细胞。
TCR：T细胞受体。
附图说明
图1：本发明所述的CAR及tCD20标签多肽示意图(图1A)以及含有myc标签的CAR示意图(图1B)。
图2：本发明所述的含有tCD20标签Lv-antiHER-2CAR载体骨架质粒pHR-anti HER-2CAR示意图(图2A)以及含有myc标签的载体骨架质粒示意图(图2B)。
图3：本发明所述的Lv-antiHER-2CAR病毒滴度检测结果示意图。其中，A是一定数量的病毒感染K562细胞48小时流式细胞仪测定的CAR阳性表达率；B是用病毒滴度检测试剂盒进行qPCR结果示意图。
图4：本发明所述的anti-HER-2CAR-T细胞中anti-HER-2CAR表达结果示意图，其中，A是用myc标签检测的结果，B是用CD20抗体检测的结果。
图5：本发明所述的含有tCD20标签anti-HER-2CAR-T细胞体外不同效靶比下特异性杀伤HER-2+肿瘤细胞结果示意图。
图6：本发明所述的tCD20标签anti-HER-2CAR-T细胞体外效靶比6:1下加入利妥昔单抗，特异性杀伤HER-2+肿瘤细胞结果示意图。
图7：本发明所述的anti-HER-2CAR-T细胞分泌细胞因子IL-2结果示意图。
图8：本发明所述的anti-HER-2CAR-T细胞分泌细胞因子IFN-γ结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1Lv-anti-HER-2CAR慢病毒表达载体的制备
如图1A所示，将CD8穿膜信号肽、anti-HER-2Scfv、CD8跨膜区、4-1BB共刺激信号区、CD3Zeta TCR激活区依序克隆到慢病毒骨架质粒pHR中，得到如图2A所示的含tCD2标签的pHR-antiHER-2CAR质粒(该质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达包含截短CD20分子的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)。如图1B所示，将CD8穿膜信号肽、myc标签、anti-HER-2Scfv、CD8跨膜区、4-1BB共刺激信号区、CD3Zeta TCR激活区依序克隆到慢病毒骨架质粒pHR中，得到如图2B所示的含myc标签的pHR-antiHER-2CAR质粒。
本发明中，antiHER-2CAR-T细胞通过上述构建的慢病毒载体转导T细胞而获得。提取pHR-antiHER-2CAR质粒与包装质粒按一定比例混合，共转染293FT细胞(购自ATCC)，转染48小时后收集含有Lv-anti-HER-2CAR病毒颗粒的上清液，经0.45um滤器过滤后按3:1的比例加入Lenti-X concentrator(TAKARA，cat：631231)，4℃静置30min，4℃1500g离心45min，沉淀用培养基或PBS重悬，分装后于-80℃保存。
实施例2病毒滴度测定
A细胞感染法：24孔中每孔铺1×105个K562细胞，取浓缩后的病毒稀释10倍，分别加入1μL、3μL、10μL、30μL病毒，37℃5％CO2培养48小时，每孔取200μL细胞液做流式检测。每个样品加1μL myc-tag一抗(CST，cat：2276)，室温避光孵育15min，每个样品加入2μL PEanti-mouse Ig light chainλ(Biolegend，cat：407308)二抗，室温避光孵育15min，400g离心5min，沉淀用200μL PBS重悬后上机检测(Millipore guava easyCyte HT)。结果如图3A所示，随着病毒加入量的增加，阳性细胞的比例逐渐增大。当阳性率≤10％，认为病毒颗粒数与细胞数相等，因此病毒浓缩后滴度为9.07％×1×105/1μL×103×10＝9.07×107IU/mL。
B qPCR法：将浓缩后的病毒稀释10倍，使用慢病毒滴度检测试剂盒(ABM，cat:LV900)进行稀释、裂解、加样并检测，结果如图3B所示：蓝色线为STD1、红色为STD2、绿色线为待测样本样本。根据试剂盒给出的公式测得病毒浓缩后滴度为1.4×108IU/mL。
实施例3CAR-T细胞的制备
取50mL新鲜血液，通过淋巴细胞分离液(天津灏洋)进行密度梯度离心来分离单个核细胞。将单个核细胞按1-2×106/mL重悬至X-VIVO 15培养基(Lonza)中，同时添加CD3单抗(Ebioscience,cat:160037)50ng/mL和CD28单抗(Novoprotein,cat:GMP-A063)50ng/mL来激活T淋巴细胞，37℃5％CO2培养48小时。
取2×106的细胞，按照MOI＝5用相同培养基稀释分装的病毒，同时加入终浓度为500U/mL IL-2(泉港)和4ug/mL polybrene(Sigma)，混匀，37℃5％CO2培养6-8小时，300g5min离心换液为新鲜X-VIVO 15培养基(含500U/mL IL-2)。
每2-3天加入新鲜X-VIVO 15培养基(含500U/mL IL-2)，维持细胞密度在1×106/mL左右，扩增10-12天。
实施例4CAR-T细胞中检测CAR阳性T细胞百分比
取加病毒后培养2天的antiHER-2CAR-T细胞和T细胞各5×105，每个样品加1μLmyc-tag每个样品加1μL myc-tag一抗(CST，cat：2276)，室温避光孵育15min，每个样品加入2μL PE anti-mouse Ig light chainλ(Biolegend，cat：407308)二抗，室温避光孵育15min，400g离心5min；另取相同数量样品，每个样品加1μL anti-human CD20(Biolegend，cat：302306)，室温避光孵育15min，400g离心5min，沉淀用200μL PBS重悬后上机检测(Millipore guava easyCyte HT)。结果如图4所示，antiHER-2CAR-T细胞中CAR阳性率为77.6％(myc检测)和65.3％(CD20检测)，说明本发明中的tCD20标签可以指示CAR的阳性率。
实施例5antiHER-CAR-T细胞对肿瘤细胞株的体外杀伤试验
MCF-7和SKBR-3均为乳腺癌细胞株，MCF-7细胞表面不表达HER-2分子，而SKBR3细胞表面表达HER-2分子。将两种细胞分别接种于xCELLigence RTCA S16细胞增殖板(ACEA)中，每孔1×105，将板放到已安置在细胞培养箱(37℃5％CO2)中的RTCA Station上，培养24h，按E:T＝1:1、3:1、6:1、10:1分别接种培养9天的antiHER-2CAR-T细胞和T细胞，每组3个复孔。将板放回RTCA Station上，培养24小时，每孔吸取100μL上清液-80℃保存备用。结果如图5所示，antiHER-2CAR-T细胞对SKBR3细胞有特异性杀伤，效靶比为1:1/3:1/6:1/10:1时特异性杀伤比均值为41.5％、57.5％、68.5％、78.5％，杀伤率随效靶比的增加而升高。两组配对t检验P<0.05，具有显著差异。
实施例6rituximab对含tCD20标签的antiHER-2CAR-T细胞杀伤的影响
将SKBR-3细胞分别接种于96孔板中，接种于xCELLigence RTCA S16细胞增殖板(ACEA)中，每孔1×105，将板放到已安置在细胞培养箱(37℃5％CO2)中的RTCA Station上，培养24h，按E:T＝6:1分别接种培养9天的含tCD20标签的antiHER-2CAR-T细胞、含myc标签的antiHER-2CAR-T细胞细胞、含tCD20标签的antiHER-2CAR-T细胞+50ug/ml rituximab、含myc标签的antiHER-2CAR-T细胞+50ug/ml rituximab，每组3个复孔。将板放回RTCAStation上，培养24小时，每孔吸取100μL上清液-80℃保存备用。结果如图6所示，加入rituximab与否对含有myc标签的CAR-T细胞的杀伤几乎没有影响，但是加入rituximab后tCD20标签的antiHER-2CAR-T细胞的杀伤效率明显降低。
实施例7ELISA法检测antiHER-2CAR-T细胞培养上清中分泌因子含量
取体外杀伤试验所留上清液，按说明书操作(human IL-2ELISA KIT,Biolegendcat:431804；human IFN-γELISA KIT,Biolegend cat:430104)。
1:200稀释包被抗体后铺板，100μL/孔，4℃孵育过夜。洗板3次。
加入封闭液200μL/孔，室温封闭1小时，洗板3次。
稀释标准品和待测样本，每孔加100μL，室温孵育2小时，洗板3次。
100μL/孔加入稀释后的检测抗体，室温孵育1小时，洗板3次。
100μL/孔加入稀释后的HRP，室温孵育30min，洗板4次。
100μL/孔加入配好的显色液，室温孵育30min，100μL/孔加入终止液终止反应。450nm测定各孔吸光度。
结果如图7和图8所示，antiHER-2CAR-T细胞刺激后分泌大量IL-2和IFN-γ细胞因子来杀伤细胞，与T细胞组间差异显著。IFN-γ的浓度与效靶比呈正相关。也从侧面证实antiHER-2CAR-T细胞是具有特异性的杀伤。
＊＊＊＊＊
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。
序列表
<110> 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司
<120> 一种包含截短CD20分子的嵌合抗原受体、慢病毒载体及应用
<141> 2018-01-29
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2367
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggagcagg acatccagct gacccagtct cacaaattcc tgtccacttc agtaggagac 120
agggtcagca tcacctgcaa ggccagtcag gatgtgtata atgctgttgc ctggtatcaa 180
cagaaaccag gacaatctcc taaacttctg atttactcgg catcctcccg gtacactgga 240
gtcccttctc gcttcactgg cagtggctct gggccggatt tcactttcac catcagcagt 300
gtgcaggctg aagacctggc agtttatttc tgtcagcaac attttcgtac tccattcacg 360
ttcggctcgg ggacaaaatt ggagatcggc ggtggcggtt ctggtggcgg tggctccggc 420
ggtggcggtt ctctagcttc tcaggtacaa ctgcagcagt ctggacctga actgaagaag 480
cctggagaga cagtcaagat ctcctgcaag gcctctgggt atcctttcac aaactatgga 540
atgaactggg tgaagcaggc tccaggacag ggtttaaagt ggatgggctg gattaacacc 600
tccactggag agtcaacatt tgctgatgac ttcaagggac ggtttgactt ctctttggaa 660
acctctgcca acactgccta tttgcagatc aacaacctca aaagtgaaga catggctaca 720
tatttctgtg caagatggga ggtttaccac ggctacgttc cttactgggg ccaagggacc 780
acggtcaccg tttcctctgg atccaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ctccctaaaa 1020
cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 1080
actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 1140
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag 1200
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1260
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1320
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1380
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1440
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgcg gctaagcccc tctccctccc 1500
ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata 1560
tgttattttc caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg 1620
tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt 1680
tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag 1740
cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc 1800
cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga 1860
tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg 1920
cccagaaggt accccattgt atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat 1980
gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc 2040
tttgaaaaac acgatgataa tatggccaca gcggccgcta tgataatgaa ttcattgagc 2100
ctctttgctg ccatttctgg aatgattctt tcaatcatgg acatacttaa tattaaaatt 2160
tcccattttt taaaaatgga gagtctgaat tttattagag ctcacacacc atatattaac 2220
atatacaact gtgaaccagc taatccctct gagaaaaact ccccatctac ccaatactgt 2280
tacagcatac aatctctgtt cttgggcatt ttgtcagtga tgctgatctt tgccttcttc 2340
caggaacttg taatagctgg catcgtt 2367
<210> 2
<211> 778
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser His Lys
20 25 30
Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala
35 40 45
Ser Gln Asp Val Tyr Asn Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Phe
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln
100 105 110
Gln His Phe Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Ala Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
145 150 155 160
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe
165 170 175
Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
180 185 190
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Ser Thr Gly Glu Ser Thr Phe Ala
195 200 205
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Asp Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn
210 215 220
Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Met Ala Thr
225 230 235 240
Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Glu Val Tyr His Gly Tyr Val Pro Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Thr Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
275 280 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290 295 300
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
305 310 315 320
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
325 330 335
Cys Ser Leu Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340 345 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355 360 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370 375 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
420 425 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450 455 460
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
465 470 475 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ala Pro
485 490 495
Leu Pro Pro Pro Pro Leu Thr Leu Leu Ala Glu Ala Ala Trp Asn Lys
500 505 510
Ala Gly Val Arg Leu Ser Ile Cys Tyr Phe Pro Pro Tyr Cys Arg Leu
515 520 525
Leu Ala Met Gly Pro Gly Asn Leu Ala Leu Ser Ser Arg Ala Phe Leu
530 535 540
Gly Val Phe Pro Leu Ser Pro Lys Glu Cys Lys Val Cys Met Ser Arg
545 550 555 560
Lys Gln Phe Leu Trp Lys Leu Leu Glu Asp Lys Gln Arg Leu Arg Pro
565 570 575
Phe Ala Gly Ser Gly Thr Pro His Leu Ala Thr Gly Ala Ser Ala Ala
580 585 590
Lys Ser His Val Tyr Lys Ile His Leu Gln Arg Arg His Asn Pro Ser
595 600 605
Ala Thr Leu Val Gly Leu Trp Lys Glu Ser Asn Gly Ser Pro Gln Ala
610 615 620
Tyr Ser Thr Arg Gly Arg Met Pro Arg Arg Tyr Pro Ile Val Trp Asp
625 630 635 640
Leu Ile Trp Gly Leu Gly Ala His Ala Leu His Val Phe Ser Arg Gly
645 650 655
Lys Asn Val Ala Pro Arg Thr Thr Gly Thr Trp Phe Ser Phe Glu Lys
660 665 670
His Asp Asp Asn Met Ala Thr Ala Ala Ala Met Ile Met Asn Ser Leu
675 680 685
Ser Leu Phe Ala Ala Ile Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile
690 695 700
Leu Asn Ile Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe
705 710 715 720
Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala
725 730 735
Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile
740 745 750
Gln Ser Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe
755 760 765
Phe Gln Glu Leu Val Ile Ala Gly Ile Val
770 775
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln
20
<210> 4
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Tyr Asn Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln His Phe Arg Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ala Ser Gln Val Gln Leu
115 120 125
Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile
130 135 140
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp
145 150 155 160
Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn
165 170 175
Thr Ser Thr Gly Glu Ser Thr Phe Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe
180 185 190
Asp Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn
195 200 205
Asn Leu Lys Ser Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Glu
210 215 220
Val Tyr His Gly Tyr Val Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 5
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 6
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
35 40
<210> 7
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
1 5 10 15
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
20 25 30
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
35 40 45
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg Gly
<210> 8
<211> 585
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60
gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120
ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180
gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240
aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300
tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360
acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420
aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540
gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccaca 585
<210> 9
<211> 96
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile Ser Gly Met Ile
1 5 10 15
Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser His Phe Leu Lys
20 25 30
Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile
35 40 45
Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr
50 55 60
Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser Val
65 70 75 80
Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile Ala Gly Ile Val
85 90 95

Claims (11)

1.一种包含截短CD20分子的嵌合抗原受体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述的包含截短CD20分子的嵌合抗原受体的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。
3.一种慢病毒表达载体，其特征在于：其包含有编码权利要求1所述的包含截短CD20分子的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的慢病毒表达载体，其特征在于：包含有权利要求2所述的包含截短CD20分子的嵌合抗原受体的基因。
5.权利要求1所述的包含截短CD20分子的嵌合抗原受体在制备包含截短CD20的嵌合抗原受体的免疫细胞中的应用。
6.权利要求3或4所述的慢病毒载体在制备包含截短CD20的嵌合抗原受体的免疫细胞中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述免疫细胞为T细胞、B淋巴细胞、NK细胞、CIK细胞。
8.一种表达包含截短CD20分子的嵌合抗原受体的免疫细胞，其特征在于：为包含有权利要求3或4所述的慢病毒表达载体的原始细胞，或染色体中整合有编码权利要求1所述的包含截短CD20分子的嵌合抗原受体的核苷酸序列或权利要求2所述的包含截短CD20分子的嵌合抗原受体的基因的原始细胞。
9.权利要求1所述的包含截短CD20分子的嵌合抗原受体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
10.权利要求2所述的基因或权利要求3或4所述的慢病毒载体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
11.权利要求8所述的表达包含截短CD20分子的嵌合抗原受体的免疫细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN112079934B (zh) * 2019-12-17 2021-01-29 合源生物科技(天津)有限公司 一种靶向cd19的嵌合抗原受体及其用途
CN112111014A (zh) * 2020-09-22 2020-12-22 廖文强 一种抗氧化嵌合型抗原受体和免疫细胞
CN112661816B (zh) * 2021-01-13 2022-10-11 江西省人民医院 用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原及试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105330750A (zh) * 2015-11-20 2016-02-17 上海细胞治疗研究院 一种快速中止car-t细胞杀伤作用的分子刹车及其用途
CN107523547A (zh) * 2016-06-20 2017-12-29 上海细胞治疗研究院 一种高效稳定表达抑制性抗体的car‑t细胞及其用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105330750A (zh) * 2015-11-20 2016-02-17 上海细胞治疗研究院 一种快速中止car-t细胞杀伤作用的分子刹车及其用途
CN107523547A (zh) * 2016-06-20 2017-12-29 上海细胞治疗研究院 一种高效稳定表达抑制性抗体的car‑t细胞及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CART技术及其临床应用;朱昕赟等;《临床血液学杂志》;20151231;第28卷(第5期);第428-431页 *
treatment of CD-20 directed chimeric antigen receptor-modified T cells in patients with relapsed or refractory B-cell non-hodgkin lymphoma:an early phase IIa trial report;Wen-ying zhang等;《Signal transduction and targeted therapy》;20160311;第16002页 *

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