JP2021510081A - 抗体修飾キメラ抗原受容体修飾t細胞及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
cell、CAR−T)治療技術は、間違いなく腫瘍免疫細胞療法の分野での希望の星である。CAR−T技術は、ある抗原分子を認識する抗体可変領域の遺伝子配列と、Tリンパ球免疫受容体の細胞内領域配列とを遺伝子工学技術でスプライスした後、レトロウイルスやレンチウイルスベクター、トランスポゾンやトランスポザーゼシステムを介して、或いは直接にmRNAとしてリンパ球へ形質導入し、且つ融合タンパク質を細胞表面に発現させることにより、Tリンパ球が非MHC制限様式で特定の抗原を認識できるようにし、その腫瘍認識・殺傷能を高めるものである。
一部の臨床試験は比較的に良好な結果が得られた;例えば、GD2に対するCAR−T細胞で高リスク神経芽細胞腫を治療する臨床試験(19例患者)において、8例の患者では、CAR−T細胞を戻した後に腫瘍が完全に退縮し、3例の未退縮患者では、CAR−T細胞を戻した6週間後の観察時点で完全な応答を示し、1名の完全応答患者では、192週目にもCAR−T細胞が検出できた;HER2に対するCAR−T細胞でHER2陽性固形腫瘍を治療する臨床試験(合計で19例、そのうちの骨肉腫が16例)において、4例では無増悪生存状態を12週間〜14ヶ月維持し、そのうちの3例では腫瘍が退縮し、1例では90%以上退縮した。しかしながら、一般的に言えば、固形腫瘍のCAR−T療法は、血液腫瘍に比べて治療効果に大きな差があり、その原因は主に、下記のものを含む:
1、免疫を抑制する微小環境
固形腫瘍組織には、Treg細胞、腫瘍関連線維芽細胞、骨髄由来未熟DC細胞、M2型マクロファージ等、並びにそれらで分泌されるIL−6、IL−10、IDO、VEGF、TGFβ等のサイトカインを含む免疫抑制の微小環境が存在し、これらの細胞及びそれらで分泌されるサイトカインは、直接的な又は間接的な方式でT細胞の機能を抑制できる。放射線療法や化学療法による腫瘍微小環境の破壊、免疫チェックポイント抗体(例えばPD1/PDL1)又は負の免疫調節因子(例えばIDO小分子阻害剤)による関連のシグナル伝達経路の特異的な遮断、関連酵素の阻害剤のエピジェネティックな修飾による免疫微小環境の全体的な調整、正の免疫調節因子(例えばIL−12)の過剰発現、(例えばFAP陽性腫瘍関連線維芽細胞をターゲトとするCAR−Tによる)腫瘍間質細胞の直接標的除去等の策は全て、固形腫瘍の免疫抑制の微小環境に作用し、浸潤したCAR−T細胞の生存能と殺傷効果を高めることができる。
2、適切なCAR−T治療標的の欠乏
固形腫瘍は高度に不均一であり、異なる患者、同じ患者の異なる病巣、および同じ病巣の異なる腫瘍細胞の間ではいずれも高度に相違している。このような高度な不均一性により、標的腫瘍治療は、汎用的で広域的な望ましい標的の欠乏という不利な境地に陥り、固形腫瘍の治療におけるCAR−T細胞の治療効果は制限されてしまう。そこで、CAR−T細胞の殺傷範囲を拡大させるために、ある学者は、異なる腫瘍関連抗原に結合する2種類のscFvを直列に接続し、2つの標的を同時に認識して結合できる新しいCARを構築し、CAR−T細胞の治療効果を効果的に向上させるTanCARの設計概念を提案した。
3、生体内で有効量に到達することの困難さ
T細胞で腫瘍細胞を殺傷するには、クラスター化の必要があり、1つの腫瘍細胞を殺傷するには、いくつかのT細胞の協力が必要であるため、エフェクター細胞が特定の数に到達しなければ、腫瘍細胞を効果的に殺傷することができない。したがって、T細胞は特定の標的の腫瘍細胞に接触すると、急速に増殖し、直接接触と傍分泌経路を介して殺傷機能を増幅することができる。CAR−T細胞は静脈内で投与され、血液腫瘍の場合には、腫瘍細胞と非常に簡単に接触でき、CAR−T細胞の数は急速に増幅し、ひいては過剰に増幅してサイトカインストームを形成するため、治療効果は比較的に良好であるが、固形腫瘍の場合には、血液循環中の腫瘍細胞の数は限られており、CAR−T細胞は刺激を受けるために腫瘍部位に到達する必要があり、有効量に到達することは困難である。
クターを含有するT細胞であって、前記突然変異型Fcフラグメントは、配列番号25に示されるIgG4 Fcフラグメントの17位および79位に相応する位置でのアミノ酸残基がそれぞれEおよびQに突然変異された突然変異型Fcフラグメントであることを特徴とするT細胞を提供する。
一つ又は複数の実施形態において、前記T細胞はキメラ抗原受容体を発現するCAR−T細胞であり、ただし、前記T細胞のゲノムには、前記抗体の発現フレームおよび前記キメラ抗原受容体の発現フレームが組み込まれた。
一つ又は複数の実施形態において、前記キメラ抗原受容体は下記抗原の1種または多種を認識する、標的とする、または特異的に結合するものである:CD19、CD20、CEA、GD2、FR、PSMA、PMEL、CA9、CD171/L1−CAM、IL−13Rα2、MART−1、ERBB2、NY−ESO−1、MAGEファミリータンパク質、BAGEファミリータンパク質、GAGEファミリータンパク質、AFP、MUC1、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL−11Rα、EGP−2、EGP−40、FBP、GD3、PSCA、FSA、PSA、HMGA2、胎児型アセチルコリン受容体、LeY、EpCAM、MSLN、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125、CA15−3、CA19−9、CA72−4、CA242、CA50、CYFRA21−1、SCC、AFU、EBV−VCA、POA、β2−MGおよびPROGRP;好ましくは、CD19、メソテリン、EGFR、ムチンまたはErbB受容体ファミリーを認識する、標的とする、または特異的に結合するキメラ抗原受容体である。
シグナルペプチド、CD28シグナルペプチド、CD4シグナルペプチドおよび軽鎖シグナルペプチドから選ばれるものである;前記抗原認識領域は、標的抗原を認識する、標的とする、または特異的に結合するアミノ酸配列である;前記ヒンジ領域は、CD8の細胞外ヒンジ領域、IgG1 Fc CH2CH3ヒンジ領域、IgDヒンジ領域、CD28の細胞外ヒンジ領域、IgG4 Fc CH2CH3ヒンジ領域およびCD4の細胞外ヒンジ領域から選ばれるもので、好ましくは長さが50個のアミノ酸残基以上、より好ましくは長さが80個のアミノ酸以上のヒンジ領域である;好ましくは、前記ヒンジ領域はCD8αヒンジ領域またはIgG4 Fc CH2CH3ヒンジ領域である;前記膜貫通領域は、CD28膜貫通領域、CD8膜貫通領域、CD3ζ膜貫通領域、CD134膜貫通領域、CD137膜貫通領域、ICOS膜貫通領域およびDAP10膜貫通領域である;好ましくはCD8膜貫通領域またはCD28膜貫通領域である;前記細胞内共刺激シグナル領域は、共刺激シグナル分子の細胞内ドメインであり、CD28、CD134/OX40、CD137/4−1BB、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ、誘導性T細胞共刺激因子およびDNAX活性化タンパク質10の細胞内ドメインから選ばれるもので、好ましくはCD137/4−1BBの細胞内ドメインまたはCD28の細胞内ドメインである;及び/又は前記細胞内シグナル領域は、CD3ζ細胞内シグナル領域またはFcεRIγ細胞内シグナル領域である;好ましくはCD3ζ細胞内シグナル領域である。
のアミノ酸残基に示されるものであってもよく、及び/又はその重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7の144〜263位のアミノ酸残基に示されるものであってもよい;好ましくは、前記一本鎖抗体のアミノ酸配列は、配列番号7の22〜263位のアミノ酸残基に示されるものである。
(1)そのアミノ酸配列は配列番号7の22〜486位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号7に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号8の64〜1458位の塩基配列に示されるもの、または配列番号8に示されるものである、CD19を標的とするキメラ抗原受容体;
(2)そのアミノ酸配列は配列番号9の23〜681位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号9に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号10の67〜2043位の塩基配列に示されるもの、または配列番号10に示されるものであり、或いは、そのアミノ酸配列は配列番号11の21〜679位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号11に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号12の61〜2037位の塩基配列に示されるもの、または配列番号12に示されるものである、メソテリンを標的とするキメラ抗原受容体;
(3)そのアミノ酸配列は配列番号13の23〜580位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号13に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号14の67〜1740位の塩基配列に示されるもの、または配列番号14に示されるものである、ErbBファミリーを標的とする抗原認識領域;
(4)そのアミノ酸配列は配列番号15の23〜678位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号15に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号16の67〜2034位の塩基配列に示されるもの、または配列番号16に示されるものである、ムチンを標的とするキメラ抗原受容体;
(5)そのアミノ酸配列は配列番号17の23〜497位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号17に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号18の67〜1491位の塩基配列に示されるもの、または配列番号18に示されるものである、EGFRを標的とするキメラ抗原受容体。
3、LAG3、CD47、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、B7−H1、B7−1、VSIRおよびCD244;好ましくは、前記リガンドはCD47のリガンドである。
胞の製造方法を提供する:
(1)前記キメラ抗原受容体の発現フレームを前記T細胞のゲノムに導入させるための、トランスポザーゼコード配列を含むベクター、および
(2)前記抗体の発現フレームを前記T細胞のゲノムに組み込むための、トランスポザーゼコード配列を含まないベクター;
好ましくは、質量で、(1)と(2)に記載のベクターの比率は1〜7:1〜7、例えば1〜5:1〜5、好ましくは1〜3:1〜3、より好ましくは1〜2:1〜2、さらに好ましくは1〜2:1である。
用語の「コード配列」は本文において、核酸配列中の、そのタンパク質産物(例えばCAR、一本鎖抗体、ヒンジ領域および膜貫通領域)を直接に決定するアミノ酸配列の部分と定義される。コード配列の境界は通常、mRNA 5’末端のオープンリーディングフレームの上流に近接するリボソーム結合部位(原核細胞の場合)と、mRNA 3’末端のオープンリーディングフレームの下流に近接する転写ターミネーター配列とで決定される。コード配列は、DNA、cDNAおよび組換え核酸配列を含んでもよいが、それらに限定されない。
用語の「Fc」、即ち抗体の結晶化可能フラグメント(fragment crystallizable、Fc)とは、、抗体分子「Y」構造の幹部分末端に位置し、抗体重
鎖定常領域CH2とCH3ドメインのペプチドフラグメントを含み、抗体がエフェクター分子または細胞と相互作用する部位を指す。
用語の「共刺激分子」とは、抗原提示細胞表面に存在し、Th細胞における共刺激分子受容体に結合し、共刺激シグナルを産生する分子を指す。リンパ球の増殖には、抗原の結合だけでなく、共刺激分子のシグナルを受信することも必要とされる。共刺激シグナルのT細胞への伝達は主に、抗原提示細胞表面に発現される共刺激分子CD80、CD86と、T細胞表面のCD28分子の結合によるものである。B細胞の共刺激シグナルの受信は、一般的な病原体成分(例えばLPS)、または補体成分、または活性化された抗原特異的Th細胞表面のCD40Lによるものであってもよい。
用語の「リンカー」またはヒンジとは、異なるタンパク質やポリペプチド同士を連結するポリペプチド断片であり、連結されるタンパク質やポリペプチドにそれぞれの立体配座を保持させ、タンパク質やポリペプチドの機能または活性を維持することを目的とする。例示的なリンカーは、G及び/又はSを含有するリンカー、及び例えばフーリン2Aペプチドを含む。
用語の「特異的結合」とは、抗体または抗原結合断片と、対する抗原との間の反応を指す。ある実施形態において、ある抗原と特異的に結合する抗体(またはある抗原に対して特異性を有する抗体)とは、抗体が約10−5M未満、例えば約10−6M、10−7M、10−8M、10−9Mまたは10−10M未満、或いはそれ以下の親和力(KD)で該抗原と結合する。「特異的に認識する」または「を標的とする」とは、類似の意味を有する。
用語の「薬学的に許容される補助剤」とは、薬理学的に及び/又は生理学的に被験者及び活性成分に適合するビヒクル及び/又は賦形剤を指し、それらは本分野で公知されるもので(例えばレミントン薬科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)、Genn
aro AR編集、第19版、ペンシルベニア州マック出版社(Pennsylvania: Mack Publishing Company)、1995を参照)、且つpH調節剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤を含むが、それらに限定される。例えば、pH調節剤は、リン酸塩緩衝液を含むが、それらに限定されない;界面活性剤は、陽イオン、陰イオンまたは非イオン系界面活性剤、例えばTween−80を含むが、それらに限定されない;イオン強度増強剤は、塩化ナトリウムを含むが、それらに限定されない。
用語の「有効量」とは、被験者において本発明に記載の疾患または病症を治療、予防、軽減及び/又は緩和できる投与量を指す。
用語の「疾患及び/又は病症」とは、本発明に記載の疾患及び/又は病症に関わる前記被験者の身体状態を指す。
用語の「被験者」または「患者」とは、患者、或いは本発明に記載の疾患または病症を治療、予防、軽減及び/又は緩和するために本発明にかかる医薬組成物を受ける他の動物、特に例えばヒト、イヌ、サル、ウシ、ウマのような哺乳動物を指してもよい。
用語の「キメラ抗原受容体」(CAR)とは、腫瘍細胞表面抗原を認識する特異的な分子(例えば抗体)を免疫細胞(例えばT細胞)にアンカーし、免疫細胞が腫瘍抗原またはウイルス抗原を認識して腫瘍細胞またはウイルスに感染された細胞を殺傷できるようにする人工的に改変された受容体である。CARは通常、任意に含まれてもよいシグナルペプチドと、腫瘍細胞膜抗原に結合する一本鎖抗体のようなポリペプチドと、ヒンジ領域と、膜貫通領域と、細胞内シグナル領域と、を順次に含む。通常、腫瘍細胞膜抗原に結合するポリペプチドは、中等の親和力で腫瘍細胞に広範に発現される膜抗原に結合できる。腫瘍細胞膜抗原に結合するポリペプチドは、天然ポリペプチドであっても、人工的に合成されるポリペプチドであってもよい;好ましくは、人工的に合成されるポリペプチドは一本鎖抗体またはFab断片である。
用語の「一本鎖抗体」(scFv)とは、抗体軽鎖可変領域(VL領域)アミノ酸配列と重鎖可変領域(VH領域)アミノ酸配列とがヒンジを介して連結されてなるもので、抗
原結合能を有する抗体断片を指す。ある実施形態において、目的の一本鎖抗体(scFv)は目的の抗体から由来するものである。目的の抗体は、ヒト・マウスキメラ抗体とヒト化抗体を含むヒト抗体であってもよい。抗体は分泌型であっても、膜結合型であってもよい;膜結合型が好ましい。
用語の「作動可能に連結される」または「作動可能に連結する」とは、DNA調節配列(例えばエンハンサー、プロモーター等)が、目的のタンパク質のコード配列の発現を可能にするように該コード配列と連結することを指す。
研究によって示されたように、PD−1アンタゴニスト抗体やCD40アゴニスト抗体などのIgG4 Fcフラグメントは、単球/マクロファージによって容易に認識され貪食されるが、本発明は、該IgG4 Fcフラグメントについて塩基突然変異改変を行うことで、T細胞自身で発現する抗体はADCC応答を引き起こすことなく良好に機能できるようになる。
具体的には、本発明の例示的なIgG4 Fcフラグメントは、配列番号1の269〜497位のアミノ酸残基に示される配列を有するもので、ただし、野生型のIgG4 Fcフラグメント(配列番号25)に比べて、本発明のIgG4 Fcフラグメントは17位でLからEへの突然変異が生じ、79位でNからQへの突然変異が生じた。
本文において、用語の「抗原結合配列」は、抗原と特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片、例えば一本鎖抗体も含むが、腫瘍微小環境で機能するタンパク質のリガンドまたは該タンパク質に結合するその断片も含む。
示されるものである;例示的なCD40一本鎖抗体の重鎖可変領域(VH領域)アミノ酸配列は配列番号1の161〜268位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号2の481〜804位の塩基配列に示されるものである。前記軽鎖可変領域と重鎖可変領域はGSを含有するヒンジ領域によって連結されてもよく、例示的なヒンジ領域の配列は、配列番号1の147〜160位のアミノ酸残基に示されるものである。ある実施形態において、本発明に適用されるCD40一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号1の21〜268位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号2の60〜804位のアミノ酸残基に示されるものである。
本発明において、CAR−T細胞によって発現される抗体は通常、本文に記載の抗原結合配列および前記突然変異型Fcフラグメントを含む。両者は直接に連結してもよく、或いは適切なリンカーを介して互いに結合しても良い。
前記抗原に対する抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域からなる一本鎖抗体であり、または癌細胞表面に発現されるタンパク質のリガンドである。
1〜266位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号4の60〜798位のアミノ酸残基に示されるものである。ある実施形態において、前記突然変異型Fcフラグメントのアミノ酸配列は配列番号3の267〜495位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号2の799〜1485位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、本発明のPD−1抗体のアミノ酸配列は、配列番号3の21〜495位に示されるもの、または配列番号3に示されるものであり、その例示的なコード配列は、配列番号4の60〜1485位の塩基配列に示されるもの、または配列番号4に示されるものである。
本発明は、T細胞で発現できる任意のキメラ抗原受容体に関し、下記抗原の1種または多種に対する、標的とする、または特異的に結合するキメラ抗原受容体を含むが、それらに限定されない:CD19、CD20、CEA、GD2(B4GALNT1、β1,4−アセチル−アミノガラクトシルトランスフェラーゼ1とも呼ばれる)、FR(フラビンレダクターゼ)、PSMA(前立腺特異的膜抗原)、PMEL(プレメラノソームタンパク質)、CA9(炭酸脱水酵素IX)、CD171/L1−CAM、IL−13Rα2、MART−1(ムチン−Aとも呼ばれる)、ERBB2、NY−ESO−1(CTAG1B、癌/精巣抗原1Bとも呼ばれる)、MAGE(黒色腫関連抗原E1)ファミリータンパク質、BAGE(B黒色腫抗原ファミリー)ファミリータンパク質、GAGE(成長ホルモン放出因子)ファミリータンパク質、AFP(α−フェトプロテイン)、MUC1(ムチン1、細胞表面関連)、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL−11Rα、EGP−2、EGP−40、FBP、GD3(ST8SIA1、ST8α−N−アセチル−セラミドα−2、8−シアル酸転移酵素1とも呼ばれる)、PSCA(前立腺幹細胞抗原)、FSA(KIAA1109とも呼ばれる)、PSA(KLK3、カリクレイン関連ペプチダーゼ3とも呼ばれる)、HMGA2、胎児型アセチルコリン受容体、LeY(FUT3とも呼ばれる)、EpCAM、MSLN(メソセリン)、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125(MUC16、ムチン16とも呼ばれる、細胞表面関連)、CA15−3、CA19−9、CA72−4、CA242、CA50、CYFRA21−1、SCC(SERPINB3とも呼ばれる)、AFU(FUCA1とも呼ばれる)、EBV−VCA、POA(VDR、ビタミンD(1,25−ジヒドロビタミンD3)受容体とも呼ばれる)、β2−MG(β−2−ミクログロブリン)およびPROGRP(GRPガストリン放出ペプチド)。
ものであり、その例示的なコード配列は配列番号10の67〜816位の塩基配列に示されるものである。本文において、特に断らない限り、メソテリンとは、膜にアンカーしているメソテリン断片を指す。
gG4 CH2CH3ヒンジ領域と、CD8膜貫通領域若しくはCD28膜貫通領域と、4−1BB若しくはCD28の細胞内ドメインと、およびCD3ζ細胞内シグナル領域と、を順次に含む。好ましくは、本発明のキメラ抗原受容体は:そのアミノ酸配列は配列番号7の22〜486位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号7に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号8の64〜1458位の塩基配列に示されるもの、または配列番号8に示されるものである、CD19を標的とするキメラ抗原受容体;そのアミノ酸配列は配列番号9の23〜681位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号9に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号10の67〜2043位の塩基配列に示されるもの、または配列番号10に示されるものであり、或いは、そのアミノ酸配列は配列番号11の21〜679位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号11に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号12の61〜2037位の塩基配列に示されるもの、または配列番号12に示されるものである、メソテリンを標的とするキメラ抗原受容体;そのアミノ酸配列は配列番号13の23〜580位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号13に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号14の67〜1740位の塩基配列に示されるもの、または配列番号14に示されるものである、ErbBファミリーを標的とする抗原認識領域;そのアミノ酸配列は配列番号15の23〜678位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号15に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号16の67〜2034位の塩基配列に示されるもの、または配列番号16に示されるものである、ムチンを標的とするキメラ抗原受容体;或いは、そのアミノ酸配列は配列番号17の23〜497位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号17に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号18の67〜1491位の塩基配列に示されるもの、または配列番号18に示されるものである、EGFRを標的とするキメラ抗原受容体。
本発明は、本文に記載の抗体のコード配列またはその相補的配列である核酸配列も含む。核酸配列は、DNA形態またはRNA形態であってもよい。DNAは一本鎖または二本鎖であってもよい。
例示的なキメラ抗原受容体のコード配列は、N末端からC末端まで、任意に含まれてもよいシグナルペプチド配列と、抗原認識領域と、CD8αヒンジ領域若しくはIgG4 CH2CH3ヒンジ領域と、CD8膜貫通領域若しくはCD28膜貫通領域と、4−1BB若しくはCD28の細胞内ドメインと、およびCD3ζ細胞内シグナル領域と、を順次に含むキメラ抗原受容体をコードするコード配列。例示的なコード配列は、配列番号8またはその64〜1458位の塩基配列に示されるコード配列、配列番号10またはその67〜2043位の塩基配列に示されるコード配列、配列番号12またはその61〜2037位の塩基配列に示されるコード配列、配列番号14またはその67〜1740位の塩基配列に示されるコード配列、配列番号16またはその67〜2034位の塩基配列に示されるコード配列、および配列番号18またはその67〜1491位の塩基配列に示されるコード配列を含む。
ンキナーゼプロモーターを含む他の構成的プロモーター配列も適用できるが、それらに限定されない。さらに、誘導型プロモーターの適用も考えられる。誘導型プロモーターの適用は、発現が望ましい場合に誘導型プロモーターと作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにし、発現が望ましくない場合に発現をオフにすることのできる分子スイッチを提供する。誘導型プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを含むが、それらに限定されない。
beauty、frog prince、Tn5またはTyトランスポゾンシステムから由来するトランスポザーゼであってもよい。異なるトランスポゾンシステムから由来するトランスポザーゼを適用する場合、前記ベクターにおける5’LTRと3’LTRの配列も相応に該トランスポゾンシステムに適合な配列に変更され、これは当業者によって容易に決定できる。ある実施形態において、5’LTRt3’LTRの間には、相応のプロモーター配列と、CARまたは抗体のコード配列と、ポリアデニル化シグナル配列とを含む本発明のCARまたは抗体の発現フレームがある。
4.7の配列番号4に示されるものである。ある実施形態において、piggybacトランスポザーゼはc−myc核局在化シグナルコード配列を含むトランスポザーゼである。ある実施形態において、piggybacトランスポザーゼのコード配列はCN 201510638974.7の配列番号5に示されるものである。
本発明はさらに、本文に記載の核酸構築物を含む、または本文に記載の抗体及び/又はキメラ抗原受容体を発現する宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、本文に記載のベクターを含む、好ましくは本文に記載のキメラ抗原受容体を発現するベクターと本文に記載の抗体を発現するベクターを含む組成物を提供する。該組成物は、少なくともトランスフェクション用のベクターの提供のために用いられる。
ある。該組成物はさらに適切な試薬を含んでもよく、トランスフェクション用の試薬を含むが、それらに限定されない。
本発明はさらに、本文に記載の抗体、そのコード配列または相補的配列、核酸構築物および宿主細胞の、悪性腫瘍を治療または予防するための薬物の製造における使用を提供する。前記腫瘍は、前記抗体と特異的に結合する抗原に関連する腫瘍を含むが、それらに限定されない。本発明はさらに、悪性腫瘍を治療または予防するための、本文に記載の抗体、そのコード配列または相補的配列、核酸構築物および宿主細胞を含む。
メラ抗原受容体はEGFRを標的する時、前記悪性腫瘍は、癌細胞の表面でEGFRが異常に発現される癌、例えばグリア細胞癌、腎臓癌、腺癌、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、胆管癌、胆嚢癌、食道癌、膵臓癌または前立腺癌であってもよい。抗体がCD40抗体である場合、適切な悪性腫瘍は、CD40によって仲介される悪性腫瘍であり、非小細胞癌、黒色腫、尿路上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性(MSI−およびH)および頭頸部癌などを含むが、それらに限定されない;抗体がPD−1抗体である場合、適切な悪性腫瘍は、PD−1によって仲介される悪性腫瘍であり、黒色腫、結腸癌、前立腺癌、非小細胞肺癌および腎臓細胞癌などの固形腫瘍を含むが、それらに限定されない。抗体がCD47抗体である場合、適切な悪性腫瘍は、癌細胞表面にCD47が発現される任意の腫瘍を含む。
上海Generay Biotech社に下表1に示される各外因性遺伝子(抗体またはCAR)の合成を依頼し、且つそれらの上流にマルチクローニング部位(BglII−XbaI−EcoRI−BamHI)を導入し、それらの下流に制限酵素切断部位(SalI−NheI−HindIII−SpeI)を導入し、それらをEcoR1+SalIで二重酵素切断されたpNB328ベクターまたはpS328ベクターに挿入し(pNB328の構造および配列はCN 201510638974.7を参照し、その全内容は参照により本文に組み込まれる;pNB328に比べて、pS328はトランスポザーゼコード配列が欠けている;キメラ抗原受容体の遺伝子はpNB328ベクターに挿入され、抗体の配列はpS328ベクターに挿入された)、組換えプラスミドを構築した。
*:配列番号19は2Aのヌクレオチド配列を示し、配列番号20はIRESのヌクレオチド配列を示す;前記外因性遺伝子配列のその他の部分の配列は表中の同じ名の外因性遺伝子の配列と同一である;
**:野生型IgG4Fc配列は配列番号25に示され、突然変異型IgG4Fcに比べて、L17E(CTGからGAGへの突然変異)、N79Q(AACからCAGへの突然変異)の突然変異が存在するが、その他の配列は同一である。
フィコール分離法を利用して、患者の血液から末梢血単核細胞(PBMC)を分離して獲得した。PBMCを2〜4時間付着培養したが、付着しなかった浮遊細胞はナイーブT細胞であり、浮遊細胞を15ml遠心チューブに収集し、1200rpmで3分間遠心し、上澄を捨て、生理食塩水を加え、1200rpmで3分間遠心し、生理食塩水を捨て、そしてこのステップを繰り返した。
1.5ml遠心チューブを取り、5×106個の細胞を入れ、1200rpmで3分間遠心し、上澄を捨て、エレクトロポレーションキット(Lonza社より)を取り、エレ
クトロポレーション試薬を100ul加え、下表2に示すように異なる組換えプラスミドを加えた。細胞をそれぞれ再懸濁して均一に混合した;混合液をエレクトロポレーションカップに移し、エレクトロポレーターに入れ、所要なプログラムを選択し、電気ショックを与えた;キットのマイクロピペットを用いて、エレクトロポレーションされた細胞懸濁液を培地(2%FBSを含むAIM−V培養液)の入れた6ウェルプレ
ートに移し、均一に混合し、37℃、5%CO2インキュベーターに入れて培養し、6時間後に刺激因子IL−2、抗CD28抗体および相応の抗原(CD19、メソテリン、EGFRまたはムチン)または抗CD3抗体を加え、37℃、5%CO2で3〜4日間培養し、相応のT細胞を獲得した。
2種類の組換えプラスミドを導入した場合、各種の組換えプラスミドの使用量を4ugとした;1種の組換えプラスミドのみを導入した場合,その使用量を6ugとした。
1、CAR−T細胞陽性率のフローサイトメトリーによる検出
実施例2で得られたCAR−T細胞を収集し、それぞれを一部分に1×106個の細胞の量で2つの部分に分け、生理食塩水で2回洗浄し、細胞を100ulの生理食塩水で再懸濁し、1つの部分には1ugのビオチン結合抗原(CD19、メソセリン、EGFRまたはムチン)を加え、もう1つの部分には加えず、4℃で30分間インキュベートした。生理食塩水で2回洗浄し、細胞をもう一回100ulの生理食塩水で再懸濁し、1ulのストレプトマイシン−PE抗体を加え、4℃で30分間インキュベートした。生理食塩水で2回洗浄し、第二抗体のみを加えたものを対照として機器で検出し、結果は下表3に示す。
[1] コーティング液で相応の抗原(CD40、PD1またはCD47)を0.5ug
/ml(5ul+1mlコーティング液)に希釈し、マイクロプレートを100ul/ウェルで4℃で一晩コーティングした。
[2] PBSTで5回、毎回3分間洗浄し、200ul/ウェルで吸水紙で叩いて乾燥させた。
[3]各ウェルにブロッキング液を100ul加え、37℃で1時間インキュベートした。
[4] PBSTで5回、毎回3分間洗浄し、200ul/ウェルで吸水紙で叩いて乾燥させた。
[5]サンプルと標準サンプルを100ul/ウェル加え、重複ウェルと対照ウェルを設け、37℃で1時間インキュベートした。
[6]PBSTで5回、毎回3分間洗浄し、200ul/ウェルで吸水紙で叩いて乾燥させた。
[7]ブロッキング液でIgG F4 HRPを100ul/ウェルで1:30000希釈し、37℃で45分間インキュベートした。
[8]PBSTで5回、毎回3分間洗浄し、200ul/ウェルで吸水紙で叩いて乾燥させた。
[9]発色液TMBを100ul/ウェル加え、37℃で遮光で10〜15分間発色した。
[10] 停止液を50ul/ウェル加えて反応を停止した。
実施例2の方法を採用して、実施例1で構築したプラスミドの組み合わせで、下表5に示される使用量配合(1ug+7ug、2ug+6ug、3ug+5ug、4ug+4ug、5ug+3ug、6ug+2ug、7ug+1ug)に従ってCAR−T細胞を構築した。実施例3に記載の方法を採用して、異なる使用量配合で構築したCAR T細胞の陽性率および抗体分泌量を計測した(方法は実施例3と同じであった)。
96ウェルプレートを2ug/mlのCD19抗原で4℃で一晩コーティングし、PB
Sで3回洗浄し、実施例2で構築したCD19CARとCD19CAR−αCD40 T細胞および対照としてのMock T細胞を1×105個加え、24時間培養した後、細胞上澄を収集した。BD社のCBA Human Th1/Th2サイトカインキットIIにより、これらの3種類のT細胞がCD19抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出し、具体的な手順は以下のようであった:
(1)ヒトIL−2、IL−4、IL−6、IL−10、TNF−α、IFN−γ捕捉磁気ビーズを混合し、渦励振盪で捕捉磁気ビーズを均一に混合し、チューブ毎に均一に混合された磁気ビーズを50ul入れた;
(2)50ulのヒトTh1/Th2サイトカイン標準サンプル(倍加希釈5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、0pg/ml)および50ulの被験サンプル(希釈剤で2倍に希釈されたもの)を加えた;
(3)チューブ毎にヒトTh1/Th2−II−PE検出抗体を50ul加えた;
(4)室温で遮光で3時間インキュベートした;
(5)チューブ毎に洗浄緩衝液を1ml加え、200で5分間遠心し、上澄を捨てた;
(6)チューブ毎に洗浄緩衝液を300ul加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメーターで蛍光値を検出した。
結果は図1に示す。
実施例2で構築して8日目に培養したCD19CAR T細胞、CD19CAR −αCD40 T細胞およびMock T細胞をそれぞれ3×105個の細胞を取り、12ウェルプレートに置いて、いずれも1mlの培養体積で培養した。
2. 白色で非透光性の96ウェルプレートを用意し、3群の細胞からそれぞれ細胞含有培養液を100μL取って、異なるウェルに加えたと共に、細胞非含有培養液を取って、空白対照とした。次に、各ウェルに100μLのCellTiter−Glo試薬を加え、シェーカーで2分間均一に混合し、室温で10分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでLuc蛍光値を読み取った。使用されたCellTiter−Glo発光細胞生存試験(Luminescent Cell Viability Assay)キットはPromega社から購入した。
3. 培養の9、10、11、12、13日目に、毎日12ウェルプレートで培養された細胞からサンプリングし、上記の手順で検出し、蛍光値に基づいて細胞増殖曲線をプロットした。
結果から分かるように、CD19CAR−αCD40 T細胞はCD19CAR T細胞よりも良好な増殖効果を有し、具体的な結果は図2に示す。
実験では、北京Biosafety Biotechnology社より提供され、SPFレベルの動物実験室で飼育された4〜6週齢の平均体重22〜27gの12匹のNSG完全免疫不全マウスが使用された。
ヒトB細胞リンパ腫Raji−luc細胞をインビトロで培養し、対数増殖期にある増殖細胞を取り、遠心して細胞を収集した後、PBS液で再懸濁し、3000gで室温で2分間遠心し、上澄を捨て、もう一回PBS液で再懸濁した後、遠心で細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度を5×107個/mlに調整した。前記Raji−luc細胞をマウスの右側のリブ裏側に0.1ml/匹で皮下接種した。接種後約10日で、腫瘍のサイズをインビボイメージャーで観察することにより、NSG免疫不全マウスを無作為に5つの群に分けることができた。それぞれPBS群、Mock T群、CD19CAR T群、CD19CAR−αCD40−wt T群、CD19CAR−αCD40 T群とし、各群に相応の(実施例2からの)T細胞を1×107個/100ulで注射し、PBS群に100
ulのPBSを投与し、投与経路は尾静脈注射であった。毎日マウスの生存状態を観察し、且つ7〜8日おきにインビボイメージャーでマウス腫瘍の変化を観察した。
結果は図3に示す。
リアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザーにより、実施例2で構築したmesoCAR T細胞およびmesoCAR−αCD40 T細胞のインビトロで腫瘍細胞に対する殺傷効果を検出した。 具体的には、MHCクラスIタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ACEA社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー(RTCA)を用いて、上記の2種類のCAR−T細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった:
(1)ゼロ調整:各ウェルに50μlのDMEMまたは1640培地を加え、機器に入れ、ステップ1を選択し、ゼロを調整した;
(2)標的細胞プレーティング:子宮頸癌細胞Hela、卵巣癌細胞SK−OV−3、胃癌HGC−27(アメリカ菌株保存機関ATCCから購入)を、検出電極を備えたプレートに1ウェルあたり104個の細胞/50μlでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ2を開始し、細胞を培養した;
(3)エフェクター細胞の添加:ターゲット細胞を24時間培養した後、ステップ2を一時停止し、エフェクター細胞を50μl/ウェル加え、エフェクター/ターゲット比を4:1に設定し、Mock T細胞を対照として、ステップ3を開始し、共培養を24時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した;
結果は図4に示すように、CD40抗体を自己発現するmesoCAR−αCD40 T細胞の細胞殺傷機能は、mesoCAR T細胞単独での細胞殺傷機能と実質的に同じであり、抗体の発現はCAR−T機能に影響を与えなかった。
96ウェルプレートを2ug/mlのメソテリン抗原で4℃で一晩コーティングし、PBSで3回洗浄し、実施例2で構築したmeso3CAR T細胞とmesoCAR−αCD40 T細胞および対照としてのMock T細胞を1×105個加え、24時間培養した後、細胞上澄を収集した。BD社のCBA Human Th1/Th2サイトカインキットIIにより、これらの3種類のT細胞がメソテリン抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出し、具体的な手順は以下のようであった:
(1)ヒトIL−2、IL−4、IL−6、IL−10、TNF、IFN−γ捕捉磁気ビーズを混合し、渦励振盪で捕捉磁気ビーズを均一に混合し、チューブ毎に均一に混合された磁気ビーズを50ul入れた;
(2)50ulのヒトTh1/Th2サイトカイン標準サンプル(倍加希釈5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、0pg/ml)および50ulの被験サンプル(希釈剤で2倍に希釈されたもの)を加えた。
(3)チューブ毎にヒトTh1/Th2−II−PE検出抗体を50ul加えた;
(4)室温で遮光で3時間インキュベートした;
(5)チューブ毎に洗浄緩衝液を1ml加え、200で5分間遠心し、上澄を捨てた;
(6)チューブ毎に洗浄緩衝液を300ul加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメーターで蛍光値を検出した;
結果は図5に示すように、CD40抗体を自己発現するmesoCAR−αCD40 T細胞のサイトカイン分泌量は、mesoCAR T細胞単独でのサイトカイン分泌量と有意差がなかった。
実施例2で8日目に培養したmesoCAR、mesoCAR−αCD40 T細胞およびMock T細胞をそれぞれ3×105個取り、12ウェルプレートに置いて、いずれも1mlの培養体積で培養した。
2. 白色で非透光性の96ウェルプレートを用意し、3群の細胞からそれぞれ細胞含有培養液を100μL取って、異なるウェルに加えたと共に、細胞非含有培養液を取って、空白対照とした。次に、各ウェルに100μLのCellTiter−Glo試薬を加え、シェーカーで2分間均一に混合し、室温で10分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでLuc蛍光値を読み取った。使用されたCellTiter−Glo発光細胞生存試験(Luminescent Cell Viability Assay)キットはPromega社から購入した。
3. 培養の9、10、11、12、13日目に、毎日12ウェルプレートで培養された細胞からサンプリングし、上記の手順で検出し、蛍光値に基づいて細胞増殖曲線をプロットした。
結果は図6に示すように、mesoCAR−αCD40 T細胞はmesoCAR T細胞よりも良好な増殖効果を有した。
1:Biosafety Biotechnology社より提供され、SPFレベルの動物実験室で飼育された4〜6週齢の平均体重22〜27gの20匹のNSG完全免疫不全マウスが使用された。
2:ヒト卵巣癌細胞SK−OV−3−lucをインビトロで培養し、対数増殖期にある付着増殖細胞を取り、0.25%トリプシンで消化し、遠心して細胞を収集した後、PBSで再懸濁し、1000rmpで室温で2分間遠心し、上澄を捨て、もう一回PBS液で再懸濁した後、遠心で細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度を5×107個/mlに調整した。
3:OVCAR−3−luc細胞をマウスの右側のリブ裏側に0.1ml/匹で皮下接種した。接種後7日で、蛍光強度をインビボイメージャーで観察し、且つ腫瘍のサイズをノギスで計測することにより、NSG免疫不全マウスを無作為に、それぞれPBS群および実施例2で得られたMock T群、mesoCAR T群、mesoCAR−αCD40−wt T群、mesoCAR−αCD40 T群という5つの群に分けることができた。各群に相応のT細胞を1×107個/100ulで注射し、PBS群に100ulのPBSを投与し、投与経路は尾静脈注射であった。
4:毎日マウスの生存状態を観察し、且つ4日おきにインビボイメージャーでマウス腫瘍の変化を観察した。
結果は図7に示す。
実施例2で8日目に培養したEHCAR−EK−28TIZ T細胞、EHCAR−EK−28TIZ−αCD40 T細胞およびMock T細胞をそれぞれ3×105個取り、12ウェルプレートに置いて、いずれも1mlの培養体積で培養した。白色で非透光性の96ウェルプレートを用意し、3群の細胞からそれぞれ細胞含有培養液を80μL取って、異なるウェルに加えたと共に、80μLの栄養液を元の12ウェルプレートに追加した。次に、96ウェルプレートに80μLのCellTiter−Glo試薬を加え、シェーカーで2分間均一に混合し、室温で10分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでLuc蛍光値を読み取った。使用されたCellTiter−Glo発光細胞生存試験(Luminescent Cell Viability Assay)キットはPromega社から購入した。培養の9、10、11、12、13日目に、毎日1
2ウェルプレートで培養された細胞からサンプリングし、上記の手順で検出し、蛍光値に基づいて細胞増殖曲線をプロットした。
結果は図8に示すように、EHCAR−EK−28TIZ−αCD40 T細胞の増殖速度はEHCAR−EK−28TIZ T細胞よりも有意に早いことから、CD40抗体の発現はCAR−T細胞の増殖を促進できることが分かった。
実施例2で得られた2種類のEHCAR−EK−28TIZおよびEHCAR−EK−28TIZ−αCD40 T細胞を収集し、数をカウントした後、それぞれ1×106個の細胞/チューブで6本の1.5ml EPチューブに入れ、PBSで2回洗浄し、1200rpmで5分間遠心し、上澄を捨てた;そのうち、2本のチューブにはそれぞれ、活性化T細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗CD107α−PEおよび抗CD69−PEが添加され、1本のチューブには、メモリーT細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗CD45RO−PECy5+抗CD197−FITC+抗CD62L−PEが添加され、1本のチューブには、サプレッサーT細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗PD1−PEが添加され、残りの2本のチューブにはそれぞれ、アイソタイプコントロールフローサイトメトリー用抗体であるIgG1−PEおよびIgG1−PE+IgG2a−PECy5+IgG2a−PEが添加され、各抗体(いずれもJackson ImmunoResearchから購入)は2μl添加された;沈殿物を軽くフリックして均一に混合させた;室温で遮光で30分間インキュベートした後、PBSで1回洗浄し、1200rpmで5分間遠心し、上澄を捨て、400μlの生理食塩水を加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
実験結果からみれば、フローサイトメトリー検出により、EHCAR−EK−28TIZおよびEHCAR−EK−28TIZ−αCD40 T細胞の老化表現型PD1の発現量は殆ど同様である(図9A);EHCAR−EK−28TIZ−αCD40 T細胞の活性化表現型CD69とCD107αの発現量は、EHCAR−EK−28TIZ細胞よりも高い(図9Bおよび9C);同時に、CD62L(L−セレクチン)はセントラルメモリーT細胞のマーカーであり、CD197はエフェクターメモリーT細胞のマーカーであり、EHCAR−EK−28TIZ−αCD40 T細胞におけるエフェクターT細胞の割合は、EHCAR−EK−28TIZ細胞およびMock−T細胞よりも有意に高かった(図9D)。これらの結果から、CD40抗体の発現はCAR−T細胞の活性化を促進し、その免疫殺傷機能を増強できることが分かった。
MHCクラスIタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ACEA社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー(RTCA)を用いて、実施例2得られた2種類のEHCAR−EK−28TIZ T細胞とEHCAR−EK−28TIZ−αCD40 T細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった:
(1)ゼロ調整:各ウェルに50μlのDMEMまたは1640培地を加え、機器に入れ、ステップ1を選択し、ゼロを調整した;
(2)標的細胞プレーティング:ヒト肝癌細胞HCCLM3、ヒト肺変性癌細胞Calu−6およびヒト非小細胞肺癌H23(アメリカ菌株保存機関ATCCから購入)を、検出電極を備えたプレートに1ウェルあたり104個の細胞/50μlでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ2を開始し、細胞を培養した;
(3)エフェクター細胞の添加:ターゲット細胞を24時間培養した後、ステップ2を
一時停止し、エフェクター細胞を50μl/ウェル加え、エフェクター/ターゲット比を4:1に設定し、pNB328空ベクターが導入されたMock T細胞を対照として、ステップ3を開始し、共培養を24時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した;
結果は図10に示す。CD40抗体を自己発現するEHCAR−EK−28TIZ−αCD40 T細胞の多種の腫瘍細胞に対する殺傷効果は、EHCAR−EK−28TIZ
T細胞および対照T細胞よりも有意に高かった。
96ウェルプレートを5ug/mlのEGFR抗原で4℃で一晩コーティングし、PBSで3回洗浄し、実施例2で得られたEHCAR−EK−28TIZとEHCAR−EK−28TIZ−αCD40 T細胞および対照としての(pNB328空ベクターが導入された)Mock T細胞を1×105個(100ul体積)加え、24時間培養した後、細胞上澄を収集した。これらの3種類のT細胞がEGFR抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出した。
結果は図11に示すように、EHCAR−EK−28TIZ−αCD40のIL−2およびIFN−γ分泌量はEHCAR−EK−28TIZ T細胞およびMock−Tよりも有意に高いことから、CD40アゴニスト抗体の自己発現はCAR−T細胞からのサイトカインの分泌を促進できることが分かった。
4〜6週齢のNSGマウスを20匹購入し、1群につき4匹で、5つの群に平均に分け、肝癌細胞株HCCLM3−LUCを1×107個/匹で接種し、腫瘍形成後10日で、それぞれPBS、実施例2で得られたMock−T、EHCAR−EK−28TIZ T細胞、EHCAR−EK−28TIZ−αCD40 T細胞、およびEHCAR−EK−28TIZ−αCD40−wt T細胞を尾静脈注射し、各群に相応のT細胞を1×107個/100ulで注射し、PBS群に100ulのPBSを投与した。マウス生体内の腫瘍蛍光の変化を観察して記録した。
結果から分かるように、PBS、Mock−T、EHCAR−EK−28TIZ−αCD40−wt T細胞は腫瘍モデルに治療効果を有しないが、EHCAR−EK−28TIZ T細胞、EHCAR−EK−28TIZ−αCD40 T細胞は抗腫瘍効果を有し、EHCAR−EK−28TIZ−αCD40 T細胞の効果は有意に高かった。具体的には図12に示す。
実施例2で8日目に培養したMuc1CAR T細胞、Muc1CAR−αCD40 T細胞およびMock T細胞の数をカウントし、それぞれ3×105個の細胞を取り、12ウェルプレートに置いて、いずれも1mlの培養体積で培養した。白色で非透光性の96ウェルプレートを用意し、3群の細胞からそれぞれ細胞含有培養液を80μL取って、異なるウェルに加えたと共に、80μLの栄養液を元の12ウェルプレートに追加した。次に、96ウェルプレートに80μLのCellTiter−Glo試薬を加え、シェーカーで2分間均一に混合し、室温で10分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでLuc蛍光値を読み取った。使用されたCellTiter−Glo発光細胞生存試験(Luminescent Cell Viability Assay)キットはPromega社から購入した。培養の9、10、11、12、13日目に、毎日12ウェルプレートで培養された細胞からサンプリングし、上記の手順で検出し、蛍光値に基づいて細胞増殖曲線をプロットした。
結果は図13に示すように、Muc1CAR−αCD40 T細胞の増殖速度はMuc1CAR T細胞よりも有意に早いことから、CD40抗体の発現はCAR−T細胞の増殖を促進できることが分かった。
実施例2で得られた2種類のMuc1CAR T細胞およびMuc1CAR−αCD40 T細胞を収集し、数をカウントした後、それぞれ1×106個の細胞/チューブで7本の1.5ml EPチューブに入れ、PBSで2回洗浄し、1200rpmで5分間遠心し、上澄を捨てた;そのうち、1本のチューブには、活性化T細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗CD25−PEが添加され、1本のチューブには、メモリーT細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗CD45RO−PECy5+抗CD197−FITC+抗CD62L−PEが添加され、2本のチューブにはそれぞれ、サプレッサーT細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗PD1−PEおよび抗LAG3−Alexa Fluor 647が添加され、残りの3本のチューブにはそれぞれ、アイソタイプコントロールフローサイトメトリー用抗体であるIgG1−PE、IgG1−PE+IgG2a−PECy5+IgG2a−PEおよびIgG1 Alexa Fluor 647が添加され、各抗体(いずれもJackson ImmunoResearchから購入)は2μl添加された;沈殿物を軽くフリックして均一に混合させた;室温で遮光で30分間インキュベートした後、PBSで1回洗浄し、1200rpmで5分間遠心し、上澄を捨て、400μlの生理食塩水を加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
実験結果からみれば、フローサイトメトリー検出により、Muc1CAR−αCD40
T細胞の老化表現型PD1およびLAG3の発現量はいずれもMuc1CAR T細胞よりも低く、活性化表現型CD25の発現量はMuc1CAR T細胞よりも高い(図14A);同時に、CD62L(L−セレクチン)はセントラルメモリーT細胞のマーカーであり、CD197はエフェクターメモリーT細胞のマーカーであり、Muc1CAR−αCD40 T細胞におけるエフェクターT細胞の割合は、Muc1CAR T細胞およびMock−T細胞よりも有意に高かった(図14B)。これらの結果から、CD40抗体の発現はCAR−T細胞の活性化を促進し、その免疫殺傷機能を増強できることが分かった。
MHCクラスIタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ACEA社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー(RTCA)を用いて、実施例2得られた2種類のMuc1CAR T細胞とMuc1CAR−αCD40 T細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった:
(1)ゼロ調整:各ウェルに50μlのDMEMまたは1640培地を加え、機器に入れ、ステップ1を選択し、ゼロを調整した;
(2)標的細胞プレーティング:ヒト肝癌細胞HCCLM3およびヒト非小細胞肺癌H23(アメリカ菌株保存機関ATCCから購入)を、検出電極を備えたプレートに1ウェルあたり104個の細胞/50μlでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ2を開始し、細胞を培養した;
(3)エフェクター細胞の添加:ターゲット細胞を24時間培養した後、ステップ2を一時停止し、エフェクター細胞を50μl/ウェル加え、エフェクター/ターゲット比を4:1に設定し、pNB328空ベクターが導入されたMock T細胞を対照として、ステップ3を開始し、共培養を24時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した。
結果は図15に示す。CD40抗体を自己発現するMuc1CAR−αCD40
T細胞の多種の腫瘍細胞に対する殺傷効果は、Muc1CAR T細胞および対照T細
胞よりも有意に高かった。
96ウェルプレートを5ug/mlのMuc1抗原で4℃で一晩コーティングし、PBSで3回洗浄し、実施例2で得られたMuc1CAR T細胞とMuc1CAR−αCD40 T細胞および対照としての(pNB328空ベクターが導入された)Mock T細胞を1×105個(100ul体積)加え、24時間培養した後、細胞上澄を収集した。これらの3種類のT細胞がMuc1抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出した。
結果は図16に示すように、Muc1CAR−αCD40 T細胞のIL−2、TNFαおよびIFN−γ分泌量はMuc1CAR T細胞およびMock−Tよりも有意に高いことから、CD40アゴニスト抗体の自己発現はCAR−T細胞からのサイトカインの分泌を促進できることが分かった。
4〜6週齢のNSGマウスを20匹購入し、1群につき4匹で、5つの群に平均に分け、肝癌細胞株HCCLM3−LUCを1×107個/匹で接種し、腫瘍形成後10日で、それぞれPBS、実施例2で構築したMock−T、Muc1CAR−T、Muc1CAR−αCD40 T細胞、およびMuc1CAR−αCD40−wt T細胞を尾静脈注射し、各群に相応のT細胞を1×107個/100ulで注射し、PBS群に100ulのPBSを投与し、マウス生体内の腫瘍蛍光の変化を観察して記録した。
結果から分かるように、PBS、Mock−T、Muc1CAR−αCD40−wt T細胞は腫瘍モデルに治療効果を有しないが、Muc1CAR−TおよびMuc1CAR−αCD40 T細胞は抗腫瘍効果を有し、Muc1CAR−αCD40 T細胞の効果は有意に高かった。具体的には図17に示す。
MHCクラスIタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、DELFIA EuTDA細胞傷害性試験によってCAR−T細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった:
(1)Raji細胞を遠心で収集し、PBSで1回洗浄した;
(2)遠心で細胞沈殿物を収集し、1640培地で細胞を再懸濁し、数をカウントし、細胞密度を1×106/mlに調整した;
(3)上記の細胞を2〜4ml取り、5ulの蛍光強化リガンドを加え、37℃、5%CO2インキュベーターに20分間置いた;
(4)PBSで細胞を3〜5回洗浄した;
(5)遠心で細胞沈殿物を収集し、1640培地で細胞を再懸濁し、数をカウントし、細胞密度を5×104/mlに調整し、細胞懸濁液を100ul取って96ウェルプレートに加えた;
(6)実施例2で構築したMock T細胞、CD19CAR T細胞およびCD19CAR−antiPD1 T細胞をカウントし、異なるエフェクター/ターゲット比4:1で、細胞懸濁液を100ul取って相応に上記Raji細胞に加え、且つ高対照群(腫瘍細胞+リシスバッファーによる溶解)、低対照群(腫瘍細胞のみを含む)、空白対照群(培地のみを含む)を設置した;
(7)37℃、5%CO2インキュベーターに20分間置いて、3時間共培養した;
(8)20ulの培養上澄を96ウェル空白プレートに移した;
(9)ユーロピウム溶液を200ul加えた;
(10)室温で振とうで15分間均一に混合した;
(11)マイクロプレートリーダーで時間分解蛍光検出により数値を読み取った;
結果は図18に示すように、CD19CAR T細胞およびCD19CAR−antiPD1 T細胞は、腫瘍細胞に対して強い殺傷効果を有し、且つ殺傷効果は同等であった。
1、実施例2で構築した懸濁のMock T細胞、CD19CAR T細胞およびCD19CAR−antiPD1 T細胞を収集し、PBSで2回洗浄し、1200rpmで5分間遠心し、アイソタイプコントロール抗体IgG1−PE、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗CD69−PE、抗KLRG1−PE、抗PD1−PE;アイソタイプコントロール抗体IgG1−PC5、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗CD107−PC5;アイソタイプコントロール抗体IgG1 FITC、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗CD62L−FITC;アイソタイプコントロール抗体IgG1−PC5、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗CD45RO−PC5;アイソタイプコントロール抗体IgG1−PE、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗CCR7−PEをそれぞれ2ul加えた。沈殿物を軽くフリックして均一に混合させ、室温で遮光で30分間インキュベートした後、PBSで1回洗浄し、400μlのPBSを加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
結果は図19(1枚目と2枚目の図)に示すように、CD19CAR−antiPD1
T細胞が分泌するPD−1一本鎖抗体は、T細胞表面のPD−1タンパク質を良好にブロックことができ、且つCD19CAR T細胞およびCD19CAR−antiPD1
T細胞はいずれも、インビトロで顕著な殺傷活性を有すると共に、メモリーTの形成も促進でき、活性化標識CD69はMock T細胞よりも有意に高かったが、除去標識LAG3はMock T細胞よりも有意に低かった。
2、24ウェルプレートを5ug/mlのCD19抗原で4℃で一晩コーティングし、PBSで3回洗浄し、Mock T細胞、CD19CAR T細胞またはCD19CAR−antiPD1 T細胞を3×105個加え、24時間培養した後、細胞上澄を収集した。BDTMCBA Human Th1/Th2サイトカインキットIIにより、CD19CAR T細胞およびCD19CAR−antiPD1 T細胞がCD19抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出した:
(1)ヒトIL−2、IL−4、IL−6、IL−10、TNF−α、IFN−γ捕捉磁気ビーズを混合し、渦励振盪で捕捉磁気ビーズを均一に混合し、チューブ毎に50ulの混合磁気ビーズを入れた;
(2)50ulのヒトTh1/Th2サイトカイン標準サンプル(倍加希釈5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、0pg/ml)および50ulの被験サンプル(希釈剤で2倍に希釈されたもの)を加えた;
(3)チューブ毎にヒトTh1/Th2−II−PE検出抗体を50ul加えた;
(4)室温で遮光で3時間インキュベートした;
(5)チューブ毎に洗浄緩衝液を1ml加え、200で5分間遠心し、上澄を捨てた;
(6)チューブ毎に洗浄緩衝液を300ul加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメーターで蛍光値を検出した;
結果は図19(3枚目の図)に示すように、CD19CAR T細胞およびCD19CAR−antiPD1 T細胞が分泌したIL−2、TNF−αおよびIFN−γはMock T細胞に比べて大幅に向上したが、3種類の細胞が分泌したIL−4、IL−6およびIL−10は有意差がなかった。
3、CD19CAR T細胞およびCD19CAR−antiPD1 T細胞を1×1
06個収集し、それぞれ1.5ml EPチューブに入れ、PBSで2回洗浄し、1200rpmで5分間遠心し、α−CD3CD4CD8抗体を2ul加え、室温で遮光で30分間インキュベートし、PBSで1回洗浄し、400ulのPBSを加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
結果は図19(4枚目の図)に示すように、CD19CAR T細胞、CD19CAR−antiPD1 T細胞およびMock TにおけるCD3+CD4+、CD3+CD8+細胞が占める百分率は有意差がなかった。
実験では、北京Biosafety Biotechnology社より提供され、SPFレベルの動物実験室で飼育された4〜6週齢の平均体重22〜27gの12匹のNSG完全免疫不全マウスが使用された。
結果は図20に示す。
リアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザーにより、実施例2で構築したmeso3CAR T細胞およびmesoCAR−antiPD1 T細胞のインビトロで腫瘍細胞に対する殺傷効果を検出した。
具体的には、MHCクラスIタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ACEA社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー(RTCA)を用いて、上記の2種類のCAR−T細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった:
(1)ゼロ調整:各ウェルに50μlのDMEMまたは1640培地を加え、機器に入れ、ステップ1を選択し、ゼロを調整した;
(2)標的細胞プレーティング:子宮頸癌細胞Hela、卵巣癌細胞SK−OV−3、胃癌HGC−27(いずれもアメリカ菌株保存機関ATCCから購入)を、検出電極を備えたプレートに1ウェルあたり104個の細胞/50μlでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ2を開始し、細胞を培養した;
(3)エフェクター細胞の添加:ターゲット細胞を24時間培養した後、ステップ2を一時停止し、エフェクター細胞を50μl/ウェル加え、エフェクター/ターゲット比を4:1に設定し、プラスミドが導入されないMock T細胞を対照として、ステップ3を開始し、共培養を24時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した。
結果は図21に示すように、PD1抗体を自己発現するmesoCAR−antiPD1 T細胞の細胞殺傷機能は、meso3CAR T細胞単独での細胞殺傷機能と実質的に同じであり、抗体の発現はCAR−T機能に影響を与えなかった。
96ウェルプレートを2ug/mlのメソテリン抗原で4℃で一晩コーティングし、PBSで3回洗浄し、実施例2で構築したmeso3CARとmesoCAR−antiPD1 T細胞および対照としてのMock T細胞をそれぞれ1×105個加え、24時間培養した後、細胞上澄を収集した。BDTMCBA Human Th1/Th2サイトカインキットIIにより、これらの3種類のT細胞がメソテリン抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出し、具体的な手順は以下のようであった:
(1)ヒトIL−2、IL−4、IL−6、IL−10、TNF−α、IFN−γ捕捉磁気ビーズを混合し、渦励振盪で捕捉磁気ビーズを均一に混合し、チューブ毎に均一に混合された磁気ビーズを50ul入れた;
(2)50ulのヒトTh1/Th2サイトカイン標準サンプル(倍加希釈5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、0pg/ml)および50ulの被験サンプル(希釈剤で2倍に希釈されたもの)を加えた;
(3)チューブ毎にヒトTh1/Th2−II−PE検出抗体を50ul加えた;
(4)室温で遮光で3時間インキュベートした;
(5)チューブ毎に洗浄緩衝液を1ml加え、200で5分間遠心し、上澄を捨てた;
(6)チューブ毎に洗浄緩衝液を300ul加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメーターで蛍光値を検出した。
結果は図22に示すように、PD1抗体を自己発現するmesoCAR−antiPD1 T細胞のサイトカイン分泌量は、meso3CAR T細胞単独でのサイトカイン分泌量と有意差がなかった。
1、Biosafety Biotechnology社より提供され、SPFレベルの動物実験室で飼育された4〜6週齢の平均体重22〜27gの25匹のNSG完全免疫不全マウスが使用された。
2、ヒト卵巣癌細胞SK−OV−3−lucをインビトロで培養し、対数増殖期にある付着増殖細胞を取り、0.25%トリプシンで消化し、遠心して細胞を収集した後、PBSで再懸濁し、1000rmpで室温で2分間遠心し、上澄を捨て、もう一回PBS液で再懸濁した後、遠心で細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度を5×107個/mlに調整した。
3、SK−OV−3−luc細胞をマウスの右側のリブ裏側に0.1ml/匹で皮下接種した。接種後7日で、蛍光強度をインビボイメージャーで観察することにより、NSG免疫不全マウスを無作為に5つの群に分けることができた。各群に相応のT細胞を1×107個/100ulで注射し、PBS群に100ulのPBSを投与し、投与経路は尾静脈注射であった。
4、毎日マウスの生存状態を観察し、且つ4日おきにインビボイメージャーでマウス腫瘍の変化を観察した。
結果は図23に示すように、SK−OV−3卵巣癌マウス異種移植片モデルにおいて、MesoCAR−antiPD1 T細胞はMeso3CAR T細胞よりも有意に良好な治療効果を有したが、Meso3CAR−wt−antiPD1 T細胞は効果をあまり有しなかった。
実施例2で8日目に培養したEHCAR−EK−28TIZ T細胞、EHCAR−E
K−28TIZ−antiPD1 T細胞およびMock T細胞をそれぞれ3×105個取り、12ウェルプレートに置いて、いずれも1mlの培養体積で培養した。白色で非透光性の96ウェルプレートを用意し、3群の細胞からそれぞれ細胞含有培養液を80μL取って、異なるウェルに加えたと共に、80μLの栄養液を元の12ウェルプレートに追加した。次に、96ウェルプレートに80μLのCellTiter−Glo試薬を加え、シェーカーで2分間均一に混合し、室温で10分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでLuc蛍光値を読み取った。使用されたCellTiter−Glo発光細胞生存試験(Luminescent Cell Viability Assay)キットはPromega社から購入した。培養の9、10、11、12、13日目に、毎日12ウェルプレートで培養された細胞からサンプリングし、上記の手順で検出し、蛍光値に基づいて細胞増殖曲線をプロットした。
結果は図24に示すように、EHCAR−EK−28TIZ−antiPD1 T細胞の増殖速度はEHCAR−EK−28TIZ T細胞よりも有意に早いことから、PD1抗体の発現はCAR−T細胞の増殖を促進できることが分かった。
実施例2で得られた2種類のEHCAR−EK−28TIZ T細胞およびEHCAR−EK−28TIZ−antiPD1 T細胞を収集し、数をカウントした後、それぞれ1×106個の細胞/チューブで6本の1.5ml EPチューブに入れ、PBSで2回洗浄し、1200rpmで5分間遠心し、上澄を捨てた;そのうち、2本のチューブにはそれぞれ、活性化T細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗CD107α−PEおよび抗CD69−PEが添加され、1本のチューブには、メモリーT細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗CD45RO−PECy5+抗CD197−FITC+抗CD62L−PEが添加され、1本のチューブには、サプレッサーT細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗PD1−PEが添加され、残りの2本のチューブにはそれぞれ、アイソタイプコントロールフローサイトメトリー用抗体であるIgG1−PEおよびIgG1−PE+IgG2a−PECy5+IgG2a−PEが添加され、各抗体(いずれもJackson ImmunoResearchから購入)は2μl添加された;沈殿物を軽くフリックして均一に混合させた;室温で遮光で30分間インキュベートした後、PBSで一回洗浄し、1200rpmで5分間遠心し、上澄を捨て、400μlの生理食塩水を加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
実験結果からみれば、フローサイトメトリー検出により、EHCAR−EK−28TIZ−antiPD1 T細胞の老化表現型PD1の発現量は、EHCAR−EK−28TIZよりも有意に低い(図25A);EHCAR−EK−28TIZ−antiPD1 T細胞の活性化表現型CD69とCD107αの発現量は、EHCAR−EK−28TIZ細胞よりも高い(図25Bおよび25C);同時に、CD62L(L−セレクチン)はセントラルメモリーT細胞のマーカーであり、CD197はエフェクターメモリーT細胞のマーカーであり、EHCAR−EK−28TIZ−antiPD1 T細胞におけるエフェクターT細胞の割合は、EHCAR−EK−28TIZ細胞およびMock−T細胞よりも有意に高かった(図25D)。これらの結果から、PD1抗体の発現はCAR−T細胞の除去を阻害し、CAR−T細胞の活性化を促進し、その免疫殺傷機能を増強できることが分かった。
MHCクラスIタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ACEA社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー(RTCA)を用いて、実施例2得られた2種類のEHCAR−EK−28TIZ T細胞とEHCAR−EK−28
TIZ−antiPD1 T細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった:
(1)ゼロ調整:各ウェルに50μlのDMEMまたは1640培地を加え、機器に入れ、ステップ1を選択し、ゼロを調整した;
(2)標的細胞プレーティング:ヒト肝癌細胞HCCLM3、ヒト肝癌細胞Hep3Bおよびヒト非小細胞肺癌H23(アメリカ菌株保存機関ATCCから購入)を、検出電極を備えたプレートに1ウェルあたり104個の細胞/50μlでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ2を開始し、細胞を培養した;
(3)エフェクター細胞の添加:ターゲット細胞を24時間培養した後、ステップ2を一時停止し、エフェクター細胞を50μl/ウェル加え、エフェクター/ターゲット比を4:1に設定し、pNB328空ベクターが導入されたMock T細胞を対照として、ステップ3を開始し、共培養を24時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した;
結果は図26に示す。PD1抗体を自己発現するEHCAR−EK−28TIZ−antiPD1 T細胞の多種の腫瘍細胞に対する殺傷効果は、EHCAR−EK−28TIZ T細胞および対照T細胞よりも有意に高かった。
96ウェルプレートを5ug/mlのEGFR抗原で4℃で一晩コーティングし、PBSで3回洗浄し、実施例2で得られたEHCAR−EK−28TIZ T細胞とEHCAR−EK−28TIZ−antiPD1 T細胞および対照としての(pNB328空ベクターが導入された)Mock T細胞を1×105個(100ul体積)加え、24時間培養した後、細胞上澄を収集した。これらの3種類のT細胞がEGFR抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出した、
結果は図27に示すように、EHCAR−EK−28TIZ−antiPD1 T細胞のIL−2およびIFN−γ分泌量はEHCAR−EK−28TIZ T細胞およびMock−Tよりも有意に高いことから、PD1抗体の自己発現はCAR−T細胞からのサイトカインの分泌を促進できることが分かった。
T細胞のインビボ抗腫瘍効果
4〜6週齢のNSGマウスを20匹購入し、1群につき4匹で、5つの群に平均に分け、肝癌細胞株HCCLM3−LUCを1×107個/匹で接種し、腫瘍形成後10日で、PBS、Mock−T、EHCAR−EK−28TIZ T細胞、EHCAR−EK−28TIZ−antiPD1−wt T細胞、およびEHCAR−EK−28TIZ−antiPD1 T細胞を尾静脈注射し、各群に相応のT細胞を1×107個/100ulで注射し、PBS群に100ulのPBSを投与し、マウス生体内の腫瘍蛍光の変化を観察して記録した。
実施例2で得られたMock T細胞、Muc1CAR T細胞およびMuc1CAR−antiPD1 T細胞のゲノムDNAを(キット法で)抽出し、実験手順については、キットに添付されている取扱説明書を参照し、Mock T細胞、Muc1CAR T細胞およびMuc1CAR−antiPD1 T細胞のDNA濃度を測定し、リアルタイム蛍光定量PCRでMuc1CARゲノムの発現レベルを検出し、反応プログラムは、50℃、2min→95℃、10min→95℃、15s→60℃、1min、40サイクルであった。得られたMuc1CARゲノムのCT値およびアクチンのCT値から、相応の計算式により、絶対コピー数含有量を算出した。
結果からみれば、PBトランスポザーゼシステムを介して、Muc1CARゲノムはT細胞のゲノムに組み込まれており、具体的には下表8に示す:
1、実施例2で得られた懸濁のMock T細胞、Muc1CAR T細胞、およびpNB328−Muc1CARとpS328−m279Vプラスミドが導入されたMuc1CAR−antiPD1 T細胞を収集し、PBSで2回洗浄し、1200rpmで5分間遠心し、アイソタイプコントロール抗体IgG1−PE、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗CD25−PE、抗LAG3−PE、抗PD1−PE;アイソタイプコントロール抗体IgG1−PC5、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗CD107−PC5;アイソタイプコントロール抗体IgG1 FITC、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗CD62L−FITC;アイソタイプコントロール抗体IgG1−PC5、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗CD45RO−PC5;アイソタイプコントロール抗体IgG1−PE、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗CCR7−PEをそれぞれ2ul加え、沈殿物を軽くフリックして均一に混合させ、室温で遮光で30分間インキュベートした後、PBSで1回洗浄し、400μlのPBSを加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
結果からみれば、Muc1CAR−antiPD1 T細胞が分泌するPD−1一本鎖抗体は、T細胞表面のPD−1タンパク質を良好にブロックことができ、且つMuc1CAR T細胞およびMuc1CAR−antiPD1 T細胞はいずれも、インビトロで顕著な殺傷活性を有すると共に、メモリーTの形成も促進でき、活性化標識CD25はMock T細胞よりも有意に高かったが、Muc1CAR−antiPD1 T細胞の除去標識LAG3はMock T細胞およびMuc1CAR T細胞よりも有意に低く、具体的には図29A、29Bに示す。
2、実施例2で得られたMuc1CAR T細胞、およびpNB328−Muc1CA
RとpS328−m279Vプラスミドが導入されたMuc1CAR−antiPD1 T細胞を1×106個収集し、それぞれ1.5ml EPチューブに入れ、PBSで2回洗浄し、1200rpmで5分間遠心し、α−CD3CD4CD8抗体を2ul加え、室温で遮光で30分間インキュベートし、PBSで1回洗浄し、400ulのPBSを加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
結果からみれば、Muc1CAR T細胞、Muc1CAR−antiPD1 T細胞およびMock TにおけるCD3+CD4+、CD3+CD8+細胞が占める百分率は有意差がなく、具体的には図29Cに示す。
3、24ウェルプレートを5ug/mlのMuc1抗原で4℃で一晩コーティングし、PBSで3回洗浄し、実施例2で得られたMock T細胞、Muc1CAR T細胞、およびpNB328−Muc1CARとpS328−m279Vプラスミドが導入されたMuc1CAR−antiPD1 T細胞を3×105個加え、24時間培養した後、細胞上澄を収集した。BDTMCBA Human Th1/Th2サイトカインキットIIにより、Muc1CAR T細胞およびMuc1CAR−antiPD1 T細胞がMuc1抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出した:
(1)ヒトIL−2、IL−4、IL−6、IL−10、TNF−α、IFN−γ捕捉磁気ビーズを混合し、渦励振盪で捕捉磁気ビーズを均一に混合し、チューブ毎に均一に混合された磁気ビーズを50ul入れた;
(2)50ulのヒトTh1/Th2サイトカイン標準サンプル(倍加希釈5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、0pg/ml)および50ulの被験サンプル(希釈剤で2倍に希釈されたもの)を加えた;
(3)チューブ毎にヒトTh1/Th2−II−PE検出抗体を50ul加えた;
(4)室温で遮光で3時間インキュベートした;
(5)チューブ毎に洗浄緩衝液を1ml加え、200gで5分間遠心し、上澄を捨てた;
(6)チューブ毎に洗浄緩衝液を300ul加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメーターで蛍光値を検出した。
結果からみれば、Muc1CAR T細胞およびMuc1CAR−antiPD1 T細胞が分泌したIL−2、TNF−αおよびIFN−γはMock T細胞に比べて大幅に向上したが、3種類の細胞が分泌したIL−4、IL−6およびIL−10は有意差がなく、具体的には図29Dに示す。
MHCクラスIタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、リアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー(RTCA)を用いて、細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった:
(1)ゼロ調整:各ウェルに50μlのDMEMまたは1640培地を加え、機器に入れ、ステップ1を選択し、ゼロを調整した;
(2)標的細胞プレーティング:子宮頸癌細胞Hela、肝癌細胞HCC−LM3、肺癌細胞A549(アメリカ菌株保存機関ATCCから購入)を、検出電極を備えたプレートに1ウェルあたり104個の細胞/50μlでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ2を開始し、細胞を培養した;
(3)エフェクター細胞の添加:ターゲット細胞を24時間培養した後、ステップ2を一時停止し、エフェクター細胞(実施例2で得られたMock T細胞、Muc1CAR
T細胞、およびpNB328−Muc1CARとpS328−m279Vプラスミドが導入されたMuc1CAR−antiPD1 T細胞)を50μl/ウェル加え、エフェクター/ターゲット比を4:1に設定し、プラスミドが導入されないMock T細胞を対照として、ステップ3を開始し、共培養を24時間継続した後、細胞増殖曲線を観察し
た。
結果から分かるように、PD−1抗体を発現するMuc1CAR T細胞は3種類の腫瘍細胞に対する殺傷はいずれも、Muc1CAR T細胞よりも優れた。具体的には図30に示す。
ステップ1:北京Vitalstar Biotechnology社より提供され、SPFレベルの動物実験室で飼育された4〜6週齢の平均体重22〜27gの15匹のNSG完全免疫不全マウスが使用された。
ステップ2:ヒト子宮頸癌細胞Helaをインビトロで培養し、対数増殖期にある付着増殖細胞を取り、0.25%トリプシンで消化し、遠心して細胞を収集した後、PBSで再懸濁し、3000gで室温で2分間遠心し、上澄を捨て、もう一回PBS液で再懸濁した後、遠心で細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度を5×107個/mlに調整した。
ステップ3:Hela−luc細胞をマウスの右側のリブ裏側に0.1ml/匹で皮下接種した。接種後約10日で、腫瘍のサイズをインビボイメージャーで観察することにより、NSG免疫不全マウスを、1群につき5匹で、、無作為に4つの群に分け、それぞれPBSおよび実施例2で得られたMock T細胞、Muc1CAR T細胞、pNB328−Muc1CARとpS328−m279V−wtが導入されたMuc1CAR−antiPD1−wt T細胞、およびpNB328−Muc1CARとpS328−m279Vプラスミドが導入されたMuc1CAR−antiPD1 T細胞(1×107個/匹)、PBS群に100ulのPBSを投与した。投与経路は尾静脈注射であった。
ステップ4:毎日マウスの生存状態を観察し、且つ10日おきにインビボイメージャーでマウス腫瘍の変化を観察した。
結果は図31に示す。
実施例2で構築したMock T細胞、EGFR−CAR T細胞およびαCD47−EGFR−CAR T細胞を収集し、BD社のフローサイトメトリー用抗体であるマウス抗ヒトCD47−FITCでCD47の発現を検出し、フローサイトメトリー方法は実施例3と同様であった。
結果は図32に示すように、αCD47−EGFR−CAR Tが分泌したCD47抗体は細胞自体のCD47発現をブロックできた。
肺癌細胞株H23、卵巣癌細胞株SKOV3、膵癌細胞株ASPC−1という3種類のEGFR陽性細胞をターゲット細胞として選択し、ACEA社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー(RTCA)を用いて、実施例2で得られたMock T細胞、EGFR−CAR T細胞およびαCD47−EGFR−CAR T細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった:
(1)ゼロ調整:各ウェルに50μlのDMEMまたは1640培地を加え、機器に入れ、ステップ1を選択し、ゼロを調整した;
(2)標的細胞プレーティング:肺癌細胞株H23、卵巣癌細胞株SKOV3、膵癌細胞株ASPC−1(アメリカ菌株保存機関ATCCから購入)を、検出電極を備えたプレートに1ウェルあたり104個の細胞/50μlでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ2を開始し、細胞を培養した;
(3)エフェクター細胞の添加:ターゲット細胞を24時間培養した後、ステップ2を一時停止し、エフェクター細胞を50μl/ウェル加え、エフェクター/ターゲット比を4:1に設定し、pNB328空ベクターが導入されたMock T細胞を対照として、
ステップ3を開始し、共培養を24時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した。
結果は図33に示す。EGFR−CAR T細胞およびαCD47−EGFR−CAR
T細胞のインビトロ殺傷活性はMock T細胞よりも有意に高く、且つCD47抗体の自己発現はCAR−T細胞の殺傷機能に影響を与えなかった。
実施例2で得られたαCD47−EGFR−CAR T細胞の培養上澄を、肺癌細胞株H23、卵巣癌細胞株SKOV3、膵癌細胞株ASPC−1のそれぞれと共培養し、24時間後に腫瘍細胞を収集し、αCD47−EGFR−CAR T細胞上澄と共培養されないものを対照として、CD47の発現を検出した。フローサイトメトリー検出方法は実施例3と同様であった。
結果は図34に示すように、αCD47−EGFR−CAR T細胞上澄におけるCD47抗体は腫瘍細胞表面のCD47をブロックできた。
1. マクロファージの分離と培養:フィコール密度勾配遠心分離法で末梢血単核細胞(PBMC)を分離し、37℃、5%CO2インキュベーターで4時間付着培養し、付着しなかった細胞を予熱した培地で洗い流し、AIM−V培地およびrhGM−CSF(最終濃度1000U/ml)を添加した。2日間おきに半分の量で液体を取替え、7日間培養し、付着細胞としてマクロファージを得た。
2. 腫瘍細胞に対するマクロファージの貪食作用:腫瘍細胞をHoechst染料で青色に染色し、マクロファージをCM−Dilで赤色に染色し、具体的な染色方法は染料の取扱説明書を参照した。染色された2種類の細胞を混合し、2つの部分に分け、1つの部分には実施例2で構築したEGFR−CAR T細胞の培養上澄を対照として加え、もう1つの部分には実施例2で構築したαCD47−EGFR−CAR T細胞の培養上澄を加え、共焦点顕微鏡で貪食作用を観察し、且つカウントで貪食効率を統計した。
結果は図35に示すように、αCD47−EGFR−CAR T細胞の培養上澄が加えられた群では、そのマクロファージの貪食作用が対照群よりも有意に高かった。
4〜6週齢のNSGマウスを20匹購入し、1群につき4匹で、5つの群に平均に分け、肺癌細胞株H23を1×107個の細胞/匹で接種し、腫瘍形成後10日で、それぞれPBSおよび実施例2で得られたMock−T細胞、EGFR−CAR T細胞、wt−αCD47−EGFR−CAR T細胞、およびαCD47−EGFR−CAR T細胞を尾静脈注射し、各群に相応のT細胞を1×107個/100ulで注射し、PBS群に100ulのPBSを投与し、腫瘍サイズを観察して記録した。結果から分かるように、PBS、Mock T細胞、wt−αCD47−EGFR−CAR T細胞は腫瘍モデルに治療効果を有しないが、EGFR−CAR T細胞およびαCD47−EGFR−CAR T細胞はいずれも良好な抗腫瘍効果を有し、且つαCD47−EGFR−CAR T細胞の効果がより優れた。具体的には図36に示す。
実施例2で構築したMock T細胞、Meso3CAR T細胞およびαCD47−Meso3CAR T細胞を収集し、BD社のフローサイトメトリー用抗体であるFITC−マウス抗ヒトCD47でPD1の発現を検出し、フローサイトメトリー方法は実施例3と同様であった。
結果は図37に示すように、αCD47−Meso3CAR Tが分泌したCD47抗
体は細胞表面のCD47発現をブロックできた。
胃癌細胞株Hgc27、卵巣癌細胞株SKOV3、膵癌細胞株ASPC−1という3種類のEGFR陽性細胞をターゲット細胞として選択し、ACEA社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー(RTCA)を用いて、実施例2で得られたMock、Meso3CARおよびαCD47−Meso3CAR T細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった:
(1)ゼロ調整:各ウェルに50μlのDMEMまたは1640培地を加え、機器に入れ、ステップ1を選択し、ゼロを調整した;
(2)標的細胞プレーティング:胃癌細胞株Hgc27、卵巣癌細胞株SKOV3、膵癌細胞株ASPC−1(アメリカ菌株保存機関ATCCから購入)を、検出電極を備えたプレートに1ウェルあたり104個の細胞/50μlでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ2を開始し、細胞を培養した;
(3)エフェクター細胞の添加:ターゲット細胞を24時間培養した後、ステップ2を一時停止し、エフェクター細胞を50μl/ウェル加え、エフェクター/ターゲット比を4:1に設定し、pNB328空ベクターが導入されたMock T細胞を対照として、ステップ3を開始し、共培養を24時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した。
結果は図38に示す。Meso3CARおよびαCD47−Meso3CAR T細胞のインビトロ殺傷活性はMock T細胞よりも有意に高く、且つCD47抗体の発現はCAR−T細胞の殺傷機能に影響を与えなかった。
実施例2で得られたαCD47−Meso3CAR T細胞の培養上澄を、胃癌細胞株Hgc27、卵巣癌細胞株SKOV3、膵癌細胞株ASPC−1のそれぞれと共培養し、24時間後に腫瘍細胞を収集し、αCD47−Meso3CAR T細胞上澄と共培養されないものを対照として、CD47の発現を検出した。フローサイトメトリー検出方法は上記と同様であった。
結果は図39に示すように、αCD47−Meso3CAR T細胞上澄におけるCD47抗体は腫瘍細胞表面のCD47をブロックできた。
1、マクロファージの分離と培養:フィコール密度勾配遠心分離法で末梢血単核細胞(PBMC)を分離し、37℃、5%CO2インキュベーターで4時間付着培養し、付着しなかった細胞を予熱した培地で洗い流し、AIM−V培地およびrhGM−CSF(最終濃度1000U/ml)を添加した。2日間おきに半分の量で液体を取替え、7日間培養し、付着細胞としてマクロファージを得た。
2、腫瘍細胞に対するマクロファージの貪食作用:腫瘍細胞をHoechst染料で青色に染色し、マクロファージをCM−Dilで赤色に染色し、具体的な染色方法は染料の取扱説明書を参照した。染色された2種類の細胞を混合し、2つの部分に分け、1つの部分には実施例2で構築したMeso3CAR T細胞の培養上澄を対照として加え、もう1つの部分には実施例2で構築したαCD47−Meso3CAR T細胞の培養上澄を加え、共焦点顕微鏡で貪食作用を観察し、且つカウントで貪食効率を統計した。
結果からみれば、αCD47−Meso3CAR T細胞の培養上澄が加えられた群では、そのマクロファージの貪食作用が対照群よりも有意に高かった。統計結果は図40に示す。
4〜6週齢のNSGマウスを20匹購入し、1群につき4匹で、5つの群に平均に分け、肺癌細胞株H23を1×107個/匹で接種し、腫瘍形成後10日で、それぞれPBSおよび実施例2で得られたMock、Meso3CAR、wt−αCD47−Meso3CAR、αCD47−Meso3CAR T細胞を(1×107個/匹で)尾静脈注射し、PBS群に100ulのPBSを投与し、腫瘍サイズを観察して記録した。
結果から分かるように、PBS、Mock、wt−αCD47−Meso3CAR T細胞は腫瘍モデルに治療効果を有しないが、αCD47−Meso3CAR T細胞は良好な抗腫瘍効果を有した。
具体的には図41に示す。
Claims (28)
- 任意に含まれてもよいシグナルペプチドと、抗原結合配列と、突然変異型Fcフラグメントとを含む抗体を発現する、或いは前記抗体のコード配列またはその発現ベクターを含有するT細胞であって、前記突然変異型Fcフラグメントは、配列番号25に示されるIgG4 Fcフラグメントの17位および79位に相応する位置でのアミノ酸残基がそれぞれEおよびQに突然変異された突然変異型Fcフラグメントである;
好ましくは、前記突然変異型Fcフラグメントは突然変異型IgG4 Fcフラグメントであり、そのアミノ酸配列は配列番号1の269〜497位のアミノ酸残基に示されるものが好ましく、そのコード配列は配列番号2の805〜1491位の塩基配列に示されるものが好ましい;
好ましくは、前記T細胞のゲノムには、前記抗体の発現フレームが組み込まれた;
ことを特徴とする、T細胞。 - 前記シグナルペプチドは軽鎖シグナルペプチドであり、そのアミノ酸配列は配列番号1の1〜20位のアミノ酸配列に示されるものが好ましく、そのコード配列は配列番号2の1〜60位の塩基配列に示されるものが好ましい;及び/又は
前記抗原結合配列は、抗原と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片(例えば一本鎖抗体)から由来するものであり、或いは腫瘍微小環境で機能するタンパク質のリガンドまたは該タンパク質に結合するその断片から由来するものである;好ましくは、前記抗体はアゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体である;好ましくは、前記アゴニスト抗体は、下記抗原に対する抗体から選ばれるものである:CD28、CD137、CD134、CD40、CD40L、ICOS、HVEM、CD2、CD27、CD30、GITR、LIGHT、DR3、SLAM、CD226、CD80およびCD86;好ましくは、前記アンタゴニスト抗体は、下記抗原に対する抗体から選ばれるものである:PD−1、CTLA4、PDL1、PDL2、PDL3、TIM3、LAG3、CD47、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、B7−H1、B7−1、VSIRおよびCD244;好ましくは、前記リガンドはCD47のリガンドである;
ことを特徴とする、請求項1に記載のT細胞。 - 前記アゴニスト抗体はCD40一本鎖抗体である;好ましくは、前記CD40一本鎖抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号1の21〜146位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び/又は前記CD40一本鎖抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号1の161〜268位のアミノ酸残基に示されるものである;好ましくは、前記CD40一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号1の21〜268位のアミノ酸残基に示されるものである;
前記アンタゴニスト抗体はPD−1一本鎖抗体である;好ましくは、前記PD−1一本鎖抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号3の21〜131位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び/又は前記PD−1一本鎖抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号3の147〜266位のアミノ酸残基に示されるものである;好ましくは、前記PD−1一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号3の21〜266位のアミノ酸残基に示されるものである;
前記CD47リガンドのアミノ酸配列は配列番号5の21〜138位のアミノ酸残基に示されるものである;
ことを特徴とする、請求項2に記載のT細胞。 - 前記CD40一本鎖抗体の軽鎖可変領域のコード配列は配列番号2の60〜438位の塩基配列に示されるものであり、及び/或その重鎖可変領域のコード配列は配列番号2の481〜804位の塩基配列に示されるものである;好ましくは、前記CD40一本鎖抗体のコード配列は配列番号2の60〜804位のアミノ酸残基に示されるものである;
前記PD−1一本鎖抗体の軽鎖可変領域のコード配列は配列番号4の60〜393位の塩基配列に示されるものであり、及び/或その重鎖可変領域のコード配列は配列番号4の439〜798位の塩基配列に示されるものである;好ましくは、前記PD−1一本鎖抗体のコード配列は配列番号2の60〜798位のアミノ酸残基に示されるものである;
前記CD47リガンドのコード配列は配列番号6の60〜414位の塩基配列に示されるものである;
ことを特徴とする、請求項3に記載のT細胞。 - 前記抗体はCD40抗体、PD−1抗体またはCD47抗体である;
ただし、前記CD40抗体のアミノ酸配列は配列番号1の21〜497位に示されるもの、または配列番号1に示されるものであり、前記PD−1抗体のアミノ酸配列は配列番号3の21〜495位に示されるもの、または配列番号3に示されるものであり、前記CD47抗体のアミノ酸配列は配列番号5の21〜367位に示されるもの、または配列番号5に示されるものである;或いは
ただし、前記抗体のコード配列は配列番号2の60〜1491位の塩基配列に示されるもの、または配列番号2に示されるものであり;或いは、配列番号4の60〜1485位の塩基配列に示されるもの、または配列番号4に示されるものであり;或いは、配列番号6の60〜1104位の塩基配列に示されるもの、または配列番号6に示されるものである;
ことを特徴とする、請求項1に記載のT細胞。 - 前記T細胞はキメラ抗原受容体を発現するCAR−T細胞であり、ただし、前記T細胞のゲノムには、前記抗体の発現フレームおよび前記キメラ抗原受容体の発現フレームが組み込まれたことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載のT細胞。
- 前記キメラ抗原受容体は下記抗原の1種または多種を認識する、標的とする、または特異的に結合するものである:CD19、CD20、CEA、GD2、FR、PSMA、PMEL、CA9、CD171/L1−CAM、IL−13Rα2、MART−1、ERBB2、NY−ESO−1、MAGEファミリータンパク質、BAGEファミリータンパク質、GAGEファミリータンパク質、AFP、MUC1、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL−11Rα、EGP−2、EGP−40、FBP、GD3、PSCA、FSA、PSA、HMGA2、胎児型アセチルコリン受容体、LeY、EpCAM、MSLN、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125、CA15−3、CA19−9、CA72−4、CA242、CA50、CYFRA21−1、SCC、AFU、EBV−VCA、POA、β2−MGおよびPROGRP;好ましくは、CD19、メソテリン、EGFR、ムチンまたはErbB受容体ファミリーを認識する、標的とする、または特異的に結合するキメラ抗原受容体であることを特徴とする、請求項6に記載のT細胞。
- 前記キメラ抗原受容体は、任意に含まれてもよいシグナルペプチド配列と、抗原認識領域と、ヒンジ領域と、膜貫通領域と、細胞内共刺激シグナル領域と、細胞内シグナル領域とを含む;ただし、
前記シグナルペプチドは、CD8シグナルペプチド、CD28シグナルペプチド、CD4シグナルペプチドおよび軽鎖シグナルペプチドから選ばれるものである;
前記抗原認識領域は、標的抗原を認識する、標的とする、または特異的に結合するアミノ酸配列である;
前記ヒンジ領域は、CD8の細胞外ヒンジ領域、IgG1 Fc CH2CH3ヒンジ領域、IgDヒンジ領域、CD28の細胞外ヒンジ領域、IgG4 Fc CH2CH3ヒンジ領域およびCD4の細胞外ヒンジ領域から選ばれるもので、好ましくは長さが50
個のアミノ酸残基以上、より好ましくは長さが80個のアミノ酸以上のヒンジ領域である;好ましくは、前記ヒンジ領域はCD8αヒンジ領域またはIgG4 Fc CH2CH3ヒンジ領域である;
前記膜貫通領域は、CD28膜貫通領域、CD8膜貫通領域、CD3ζ膜貫通領域、CD134膜貫通領域、CD137膜貫通領域、ICOS膜貫通領域およびDAP10膜貫通領域である;好ましくはCD8膜貫通領域またはCD28膜貫通領域である;
前記細胞内共刺激シグナル領域は、共刺激シグナル分子の細胞内ドメインであり、CD28、CD134/OX40、CD137/4−1BB、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ、誘導性T細胞共刺激因子およびDNAX活性化タンパク質10の細胞内ドメインから選ばれるもので、好ましくはCD137/4−1BBの細胞内ドメインまたはCD28の細胞内ドメインである;及び/又は
前記細胞内シグナル領域は、CD3ζ細胞内シグナル領域またはFcεRIγ細胞内シグナル領域である;好ましくはCD3ζ細胞内シグナル領域である;
ことを特徴とする、請求項7に記載のT細胞。 - 前記シグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号7の1〜21位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号9の1〜22位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号11の1〜20位のアミノ酸残基に示されるものである;
前記抗原認識領域は、CD19、メソテリン、EGFRまたはムチンを認識する、標的とする、または特異的に結合する一本鎖抗体であり、或いはErbB受容体ファミリーを認識する、標的とする、または特異的に結合するアミノ酸配列からなるものである;
前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号7の264〜308位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号9の273〜500位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号17の264〜318位のアミノ酸残基に示されるものである;
前記膜貫通領域のアミノ酸配列は、配列番号7の309〜332位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号9の501〜528位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号17の319〜344位のアミノ酸残基に示されるものである;
前記細胞内共刺激シグナル領域のアミノ酸配列は、配列番号7の333〜374位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号9の529〜569位のアミノ酸残基に示されるものである;及び/又は
前記細胞内シグナル領域のアミノ酸配列は、配列番号7の375〜486位のアミノ酸残基に示されるものである;
ことを特徴とする、請求項8に記載のT細胞。 - 前記シグナルペプチドのコード配列は、配列番号8の1〜63位の塩基配列に示されるもの、または配列番号10の1〜66位の塩基配列に示されるもの、または配列番号12の1〜60位の塩基配列に示されるものである;
前記ヒンジ領域のコード配列は、配列番号8の790〜924位の塩基配列に示されるもの、または配列番号10の817〜1500位の塩基配列に示されるもの、または配列番号18の790〜954位の塩基配列に示されるものである;
前記膜貫通領域のコード配列は、配列番号8の925〜996位の塩基配列に示されるもの、または配列番号10の1501〜1584位の塩基配列に示されるもの、または配列番号18の955〜1032位の塩基配列に示されるものである;
前記細胞内共刺激シグナル領域のコード配列は、配列番号8の997〜1122位の塩基配列に示されるもの、または配列番号10の1585〜1707位の塩基配列に示されるものである;及び/又は
前記細胞内シグナル領域のコード配列は、配列番号8の1123〜1458位の塩基配列に示されるものである;
ことを特徴とする、請求項9に記載のT細胞。 - 前記CD19を認識する、標的とする、または特異的に結合する一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7の22〜128位のアミノ酸残基に示されるものであってもよく、及び/又はその重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7の144〜263位のアミノ酸残基に示されるものであってもよい;好ましくは、前記一本鎖抗体のアミノ酸配列は、配列番号7の22〜263位のアミノ酸残基に示されるものである;
前記メソテリン抗原を認識する、標的とする、または特異的に結合する一本鎖抗体は、メソテリンの領域IまたはIIIに対する一本鎖抗体であり、好ましくはメソテリン領域IIIに対する一本鎖抗体である;好ましくは、メソテリン領域IIIに対する一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号9の23〜146位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び/又はメソテリン領域IIIに対する一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号9の162〜272位のアミノ酸残基に示されるものである;好ましくは、前記メソテリン抗原を認識する、標的とする、または特異的に結合する一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号9の23〜272位のアミノ酸残基に示されるものである;
前記ErbB受容体ファミリーを認識する、標的とする、または特異的に結合する抗原認識領域は、天然のT1Eとヘリン(Herin)の融合タンパク質を含む;ただし、T1Eはヒトトランスフォーミング成長因子α(TGFα)N末端の7個のアミノ酸と、上皮成長因子(EGF)C末端の48個のアミノ酸からなるものであり、好ましくは、T1Eのアミノ酸配列は配列番号13の23〜77位のアミノ酸残基に示されるものである;前記ヘリンは、ハースタチン(Herstatin)の8番目のイントロンによってコードされる79個のアミノ酸であり、好ましくは、前記ヘリンのアミノ酸配列は配列番号13の93〜171位のアミノ酸残基に示されるものである;好ましくは、前記抗原認識領域は配列番号13の23〜171位のアミノ酸残基に示されるものである;
前記ムチン抗原を認識する、標的とする、または特異的に結合する一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と重鎖可変領域のアミノ酸配列は、Muc1の膜近傍末端のアミノ酸配列に対する抗体から由来するものであり、好ましくは、該Muc1の膜近傍末端のアミノ酸配列は配列番号24に示されるものである;好ましくは、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号15の23〜133位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び/又は重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号15の149〜269位のアミノ酸残基に示されるものである;好ましくは、前記一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号15の23〜269位のアミノ酸残基に示されるものである;
前記EGFRを認識する、標的とする、または特異的に結合する抗原認識領域は、EGFR特異的抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域からなる一本鎖抗体である;好ましくは、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号17の23〜129位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び/又は重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号17の145〜263位のアミノ酸残基に示されるものである;好ましくは、前記一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号17の23〜263位のアミノ酸残基に示されるものである;
ことを特徴とする、請求項9〜10のいずれか一項に記載のT細胞。 - 前記キメラ抗原受容体はN末端からC末端まで、任意に含まれてもよいシグナルペプチド配列と、抗原認識領域と、CD8αヒンジ領域若しくはIgG4 CH2CH3ヒンジ領域と、CD8膜貫通領域若しくはCD28膜貫通領域と、4−1BB若しくはCD28の細胞内ドメインと、およびCD3ζ細胞内シグナル領域と、を順次に含む;
好ましくは、前記キメラ抗原受容体は下記のものから選ばれるものである;
ことを特徴とする、請求項11に記載のT細胞。
(1)そのアミノ酸配列は配列番号7の22〜486位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号7に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号8の64〜1458位の塩基配列に示されるもの、または配列番号8に示されるものである、CD19を標的とするキメラ抗原受容体;
(2)そのアミノ酸配列は配列番号9の23〜681位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号9に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号10
の67〜2043位の塩基配列に示されるもの、または配列番号10に示されるものであり、或いは、そのアミノ酸配列は配列番号11の21〜679位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号11に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号12の61〜2037位の塩基配列に示されるもの、または配列番号12に示されるものである、メソテリンを標的とするキメラ抗原受容体;
(3)そのアミノ酸配列は配列番号13の23〜580位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号13に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号14の67〜1740位の塩基配列に示されるもの、または配列番号14に示されるものである、ErbBファミリーを標的とする抗原認識領域;
(4)そのアミノ酸配列は配列番号15の23〜678位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号15に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号16の67〜2034位の塩基配列に示されるもの、または配列番号16に示されるものである、ムチンを標的とするキメラ抗原受容体;
(5)そのアミノ酸配列は配列番号17の23〜497位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号17に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号18の67〜1491位の塩基配列に示されるもの、または配列番号18に示されるものである、EGFRを標的とするキメラ抗原受容体。 - 任意に含まれてもよいシグナルペプチドと、抗原結合配列と、突然変異型Fcフラグメントとを含む抗体であって、前記突然変異型Fcフラグメントは、配列番号25に示されるIgG4 Fcフラグメントの17位および79位に相応する位置でのアミノ酸残基がそれぞれEおよびQに突然変異された突然変異型Fcフラグメントである;
好ましくは、前記突然変異型Fcフラグメントは突然変異型IgG4 Fcフラグメントであり、そのアミノ酸配列は配列番号1の269〜497位のアミノ酸残基に示されるものが好ましく、そのコード配列は配列番号2の805〜1491位の塩基配列に示されるものが好ましい;
ことを特徴とする、抗体。 - 前記シグナルペプチドは軽鎖シグナルペプチドであり、そのアミノ酸配列は配列番号1の1〜20位のアミノ酸配列に示されるものが好ましく、そのコード配列は配列番号2の1〜60位の塩基配列に示されるものが好ましい;及び/又は
前記抗原結合配列は、抗原と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片(例えば一本鎖抗体)から由来するものであり、或いは腫瘍微小環境で機能するタンパク質のリガンドまたは該タンパク質に結合するその断片から由来するものである;好ましくは、前記抗体はアゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体である;好ましくは、前記アゴニスト抗体は、下記抗原に対する抗体から選ばれるものである:CD28、CD137、CD134、CD40、CD40L、ICOS、HVEM、CD2、CD27、CD30、GITR、LIGHT、DR3、SLAM、CD226、CD80およびCD86;好ましくは、前記アンタゴニスト抗体は、下記抗原に対する抗体から選ばれるものである:PD−1、CTLA4、PDL1、PDL2、PDL3、TIM3、LAG3、CD47、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、B7−H1、B7−1、VSIRおよびCD244;好ましくは、前記リガンドはCD47のリガンドである;
ことを特徴とする、請求項13に記載の抗体。 - 前記アゴニスト抗体はCD40一本鎖抗体である;好ましくは、前記CD40一本鎖抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号1の21〜146位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び/又は前記CD40一本鎖抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号1の161〜268位のアミノ酸残基に示されるものである;好ましくは、前記CD40一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号1の21〜268位のアミノ酸残基に示されるものである; 前記アンタゴニスト抗体はPD−1一本鎖抗体である;好ましくは、前記PD
−1一本鎖抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号3の21〜131位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び/又は前記PD−1一本鎖抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号3の147〜266位のアミノ酸残基に示されるものである;好ましくは、前記PD−1一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号3の21〜266位のアミノ酸残基に示されるものである;
前記CD47リガンドのアミノ酸配列は配列番号5の21〜138位のアミノ酸残基に示されるものである;
ことを特徴とする、請求項14に記載の抗体。 - 前記CD40一本鎖抗体の軽鎖可変領域のコード配列は配列番号2の60〜438位の塩基配列に示されるものであり、及び/或その重鎖可変領域のコード配列は配列番号2の481〜804位の塩基配列に示されるものである;好ましくは、前記CD40一本鎖抗体のコード配列は配列番号2の60〜804位のアミノ酸残基に示されるものである;
前記PD−1一本鎖抗体の軽鎖可変領域のコード配列は配列番号4の60〜393位の塩基配列に示されるものであり、及び/或その重鎖可変領域のコード配列は配列番号4の439〜798位の塩基配列に示されるものである;好ましくは、前記PD−1一本鎖抗体のコード配列は配列番号2の60〜798位のアミノ酸残基に示されるものである;
前記CD47リガンドのコード配列は配列番号6の60〜414位の塩基配列に示されるものである;
ことを特徴とする、請求項15に記載の抗体。 - 前記抗体はCD40抗体、PD−1抗体またはCD47抗体である;
ただし、前記CD40抗体のアミノ酸配列は配列番号1の21〜497位に示されるもの、または配列番号1に示されるものであり、前記PD−1抗体のアミノ酸配列は配列番号3の21〜495位に示されるもの、または配列番号3に示されるものであり、前記CD47抗体のアミノ酸配列は配列番号5の21〜367位に示されるもの、または配列番号5に示されるものである;或いは
ただし、前記抗体のコード配列は配列番号2の60〜1491位の塩基配列に示されるもの、または配列番号2に示されるものであり;或いは、配列番号4の60〜1485位の塩基配列に示されるもの、または配列番号4に示されるものであり;或いは、配列番号6の60〜1104位の塩基配列に示されるもの、または配列番号6に示されるものである;
ことを特徴とする、請求項14に記載の抗体。 - 請求項13〜17のいずれか一項に記載の抗体のコード配列またはその相補的配列から選ばれる核酸配列。
- 請求項18に記載の核酸配列を含む核酸構築物;
好ましくは、前記核酸構築物は発現フレームまたはベクターである。 - 前記核酸構築物は、発現ベクター、または前記発現フレームを宿主細胞ゲノムに挿入させるための組み込みベクターである;
好ましくは、前記組み込みベクターは、5LTRと3鋳LTRの間に、作動可能に連結されるプロモーターと、請求項13〜17のいずれか一項に記載の抗体のコード配列と、ポリアデニル化シグナル配列とを含み、且つトランスポザーゼコード配列を含まない組み込みベクターである;
ことを特徴とする、請求項19に記載の核酸構築物。 - 請求項20に記載のベクターと、任意のトランスフェクション試薬とを含む組成物であって、
好ましくは、前記組成物は、請求項20に記載の組み込みベクターと、キメラ抗原受容体の発現フレームを宿主細胞ゲノムに挿入させるための組み込みベクターとを含む;好ましくは、前記キメラ抗原受容体は請求項6〜12のいずれか一項に限定されるものである;
ことを特徴とする、組成物。 - 組成物におけるキメラ抗原受容体の発現フレームを宿主細胞ゲノムに挿入させるための組み込みベクターと、請求項20に記載の組み込みベクターの質量比は1〜7:1〜7、例えば1〜5:1〜5、好ましくは1〜3:1〜3、より好ましくは1〜2:1〜2、さらに好ましくは1〜2:1であることを特徴とする、請求項21に記載の組成物。
- 請求項20に記載のベクターと、任意のトランスフェクション試薬とを含むキットであって、
好ましくは、前記キットは、請求項20に記載の組み込みベクターと、キメラ抗原受容体の発現フレームを宿主細胞ゲノムに挿入させるための組み込みベクターとを含む;好ましくは、前記キメラ抗原受容体は請求項6〜12のいずれか一項に限定されるものである;
好ましくは、前記キットは請求項21または22に記載の組成物を含む;
ことを特徴とする、キット。 - 請求項1〜12のいずれか一項に記載のT細胞或いは前記T細胞およびそれが発現する本文に記載の抗体を含む医薬組成物。
- 請求項18に記載の核酸配列または請求項19〜20のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む宿主細胞。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のT細胞、請求項13〜17のいずれか一項に記載の抗体、請求項18に記載の核酸配列、請求項19〜20のいずれか一項に記載の核酸構築物および請求項25に記載の宿主細胞の、悪性腫瘍を治療または予防するための薬物の製造における使用。
- 前記悪性腫瘍は、急性Bリンパ球性白血病、慢性Bリンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫から選ばれるものであり;或いはメソセリン、少なくとも1つのEGFRファミリーメンバータンパク質、Muc1抗原、EGFR及び/又はCD47を癌細胞表面で異常発現する悪性腫瘍であり;或いはCD40またはPD1によって仲介される悪性腫瘍であることを特徴とする、請求項26に記載の使用。
- 下記のベクターで前記T細胞をトランスフェクトする工程を含むことを特徴とする、請求項6〜12のいずれか一項に記載のT細胞の製造方法。
(1)前記キメラ抗原受容体の発現フレームを前記T細胞のゲノムに導入させるための、トランスポザーゼコード配列を含むベクター、および
(2)前記抗体の発現フレームを前記T細胞のゲノムに組み込むための、トランスポザーゼコード配列を含まないベクター;
好ましくは、質量で、(1)と(2)に記載のベクターの比率は1〜7:1〜7、例えば1〜5:1〜5、好ましくは1〜3:1〜3、より好ましくは1〜2:1〜2、さらに好ましくは1〜2:1である。
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