JP2022512132A - 抗クローディン抗体及びそれらの使用 - Google Patents

抗クローディン抗体及びそれらの使用 Download PDF

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Abstract

本明細書に開示するのは、抗クローディン１８．２抗体及びそれを含む医薬組成物である。いくつかの実施形態では、がんを有する対象を、抗クローディン１８．２抗体で治療する方法及び抗クローディン１８．２抗体による殺細胞効果を誘導する方法もまた本明細書に記載する。【選択図】図３６

Description

相互参照
本出願は、２０１８年１２月７日に出願された特許協力条約出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１１９７９７号の優先権を主張する。当該出願は、参照することにより、すべての目的のため、全体として本明細書に組み込まれる。
胃食道癌及び膵臓癌は、満たされていない医療ニーズが最も高い水準の悪性腫瘍である。胃癌（ＧＣ）は、がん関連死の３番目に多い原因であり、胃癌患者の最大部分は、東アジア、特に韓国、モンゴル、日本、及び中国に分布している。膵臓癌は、先進国においてあらゆるがんの中で最も高い死亡率を示しており、米国と中国の両方で増加すると予想されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示するのは、抗クローディン１８．２抗体及びそれを含む医薬組成物である。ある特定の実施形態では、がんを有する対象を、抗クローディン１８．２抗体で治療する方法及び抗クローディン１８．２抗体による殺細胞効果を誘導する方法もまた本明細書に記載する。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示するのは、半数効果濃度（ＥＣ５０）が、参照抗体１７５Ｄ１０のＥＣ５０より低い抗クローディン１８．２（抗ＣＬＤＮ１８．２）抗体であり、該参照抗体１７５Ｄ１０は、配列番号９８に記載の重鎖（ＨＣ）配列及び配列番号９９に記載の軽鎖（ＬＣ）配列を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示するのは、翻訳後修飾部位に少なくとも１つの突然変異を含む抗クローディン１８．２（抗ＣＬＤＮ１８．２）抗体である。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示するのは、Ｆｃ領域において抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の向上をもたらす少なくとも１つの突然変異を含む抗クローディン１８．２（抗ＣＬＤＮ１８．２）抗体であり、該ＡＤＣＣの向上は、配列番号９８に記載の重鎖（ＨＣ）配列及び配列番号９９に記載の軽鎖（ＬＣ）配列を含む参照抗体１７５Ｄ１０と比較される。いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＥＣ５０は、約５ｎＭ以下である。いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＥＣ５０は、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ、またはそれより低い。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示するのは、ＣＬＤＮ１８．２に対する結合親和性が、参照抗体１７５Ｄ１０の結合親和性と比較して高い抗クローディン１８．２（抗ＣＬＤＮ１８．２）抗体であり、該参照抗体１７５Ｄ１０は、配列番号９８に記載の重鎖（ＨＣ）配列及び配列番号９９に記載の軽鎖（ＬＣ）配列を含む。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、可変重鎖（ＶＨ）領域及び可変軽鎖（ＶＬ）領域を含み、該ＶＨ領域は、以下を含む：ＣＤＲ１配列ＧＦＳＬＴＳＹＸ１ＶＸ２、ここで、Ｘ１は、ＮまたはＧから選択され、Ｘ２は、ＹまたはＨから選択されるもの、ＣＤＲ２配列ＶＩＷＸ３Ｘ４ＧＸ５ＴＸ６ＹＸ７Ｘ８Ｘ９ＬＸ１０Ｓ、ここで、Ｘ３は、ＮまたはＰから選択され、Ｘ４は、ＴまたはＧから選択され、Ｘ５は、ＡまたはＮから選択され、Ｘ６は、ＲまたはＮから選択され、Ｘ７は、Ｎ、Ｑ、またはＥから選択され、Ｘ８は、ＳまたはＩから選択され、Ｘ９は、ＴまたはＡから選択され、Ｘ１０は、ＫまたはＭから選択されるもの、及びＣＤＲ３配列ＤＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０、ここで、Ｘ１１は、ＳまたはＲから選択され、Ｘ１２は、ＡまたはＲから選択され、Ｘ１３は、ＭまたはＬから選択され、Ｘ１４は、ＰまたはＡから選択され、Ｘ１５は、ＡまたはＭから選択され、Ｘ１６は、ＩまたはＤから選択され、Ｘ１７は、ＰまたはＹから選択され、Ｘ１８は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆであり、Ｘ１９は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ａであり、Ｘ２０は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｙであるもの。いくつかの実施形態では、該ＶＨ領域は、ＣＤＲ１配列Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５ＳＦＧＭＨ、ここで、Ｘ２１は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｇであり、Ｘ２２は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆであり、Ｘ２３は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｔであり、Ｘ２４は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆであり、Ｘ２５は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｓであるもの、ＣＤＲ２配列ＹＩＳＳＧＳＸ２６Ｘ２７ＩＹＹＸ２８ＤＸ２９Ｘ３０ＫＧ、ここで、Ｘ２６は、ＳまたはＧから選択され、Ｘ２７は、ＰまたはＳから選択され、Ｘ２８は、ＶまたはＡから選択され、Ｘ２９は、ＫまたはＴから選択され、Ｘ３０は、ＬまたはＶから選択されるもの、及びＣＤＲ３配列ＡＸ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１、ここで、Ｘ３１は、ＧまたはＴから選択され、Ｘ３２は、ＹまたはＳから選択され、Ｘ３３は、ＡまたはＹから選択され、Ｘ３４は、ＶまたはＹから選択され、Ｘ３５は、ＲまたはＹから選択され、Ｘ３６は、ＮまたはＧから選択され、Ｘ３７は、ＡまたはＮから選択され、Ｘ３８は、ＬまたはＡから選択され、Ｘ３９は、ＤまたはＬから選択され、Ｘ４０は、ＹまたはＥから選択され、Ｘ４１は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｙであるものを含む。いくつかの実施形態では、該ＶＨ領域は、配列番号１からなるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列ＶＩＷＮＴＧＡＴＲＹＸ７ＳＸ９ＬＫＳ、及び配列番号３からなるＣＤＲ３配列を含み、ここで、Ｘ７は、Ｎ、Ｑ、またはＥから選択され、Ｘ９は、ＴまたはＡから選択される。いくつかの実施形態では、該ＶＨ領域は、配列番号１３からなるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列ＶＩＷＰＧＧＮＴＮＹＸ７Ｘ８ＡＬＭＳ、及び配列番号１５からなるＣＤＲ３配列を含み、ここで、Ｘ７は、ＮまたはＥから選択され、Ｘ８は、ＳまたはＩから選択される。いくつかの実施形態では、該ＶＨ領域は、配列番号１、７、１０、または１３から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２、４、５、６、８、１１、１４、１６、または１７から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号３、９、１２、または１５から選択されるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、該ＶＨ領域は、配列番号１からなるＣＤＲ１配列、配列番号２、４、５、または６から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号３からなるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、該ＶＨ領域は、配列番号１３からなるＣＤＲ１配列、配列番号１４、１６、または１７から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１５からなるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、該ＶＨ領域は、配列番号７からなるＣＤＲ１配列、配列番号８からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号９からなるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、該ＶＨ領域は、配列番号１０からなるＣＤＲ１配列、配列番号１１からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号１２からなるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、該ＶＬ領域は、配列番号１８、２１、２４～２８、３１～３５、３８、または３９から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１９、２２、２９、または３６から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号２０、２３、３０、または３７から選択されるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、該ＶＬ領域は、配列番号２１または２４～２７から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２２からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号２３からなるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、該ＶＬ領域は、配列番号２８または３１～３４から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２９からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号３０からなるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、該ＶＬ領域は、配列番号３５、３８、または３９から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号３６からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号３７からなるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、該ＶＬ領域は、配列番号１８からなるＣＤＲ１配列、配列番号１９からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号２０からなるＣＤＲ３配列を含む。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、結合断片である。いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、一価のＦａｂ’、二価のＦａｂ２、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ科動物抗体もしくはその結合断片を含む。いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ヒト化抗体もしくはその結合断片、キメラ抗体もしくはその結合断片、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、または二重特異性抗体もしくはその結合断片を含む。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、翻訳後修飾部位に突然変異を含む。いくつかの実施形態では、該突然変異は、ＶＨ領域のアミノ酸位置６０、６１、または６２にあり、該アミノ酸位置は、配列番号４０の６０、６１、または６２位に対応する。いくつかの実施形態では、該突然変異は、配列番号４０のアミノ酸位置６０または６２にある。いくつかの実施形態では、該突然変異は、配列番号５７のアミノ酸位置６０または６１にある。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基Ｎ６０での突然変異は、グルタミンまたはグルタミン酸への突然変異である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基Ｓ６１での突然変異は、イソロイシンへの突然変異である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基Ｔ６２での突然変異は、アラニンへの突然変異である。いくつかの実施形態では、該突然変異は、ＶＬ領域のアミノ酸位置３１または３２にあり、該アミノ酸位置は、配列番号４６、５２、または６０の３１または３２位に対応する。いくつかの実施形態では、該突然変異は、配列番号４６、５２、または６０のアミノ酸位置３１または３２にある。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基Ｎ３１での突然変異は、アスパラギン酸またはグルタミン酸への突然変異である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基Ｓ３２での突然変異は、ロイシン、バリン、またはイソロイシンへの突然変異である。いくつかの実施形態では、該突然変異は、該修飾抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の結合親和性を、参照抗体１７５Ｄ１０と比較して高める。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、キメラ抗体またはその結合断片を含む。いくつかの実施形態では、該キメラ抗体またはその結合断片は、配列番号４０～４３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号４４に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態では、該キメラ抗体またはその結合断片は、配列番号４５に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号４６～５０に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態では、該キメラ抗体またはその結合断片は、配列番号５１に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号５２～５６に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態では、該キメラ抗体またはその結合断片は、配列番号５７～５９に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号６０～６２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態では、該キメラ抗体またはその結合断片は、配列番号６３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＣＨ領域及び配列番号６４に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＣＬ領域を含む。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ヒト化抗体またはその結合断片を含む。いくつかの実施形態では、該ヒト化抗体またはその結合断片は、配列番号６５～６８に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号６９～７３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態では、該ヒト化抗体またはその結合断片は、配列番号７４～７６に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号７７～８０に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態では、該ヒト化抗体またはその結合断片は、配列番号８１～８４に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号８５～８８に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態では、該ヒト化抗体またはその結合断片は、配列番号８９～９２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号９３～９７に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＩｇＭのフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＩｇＧ２のフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＩｇＧ１のフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＦＣ領域に１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、該１つ以上の突然変異は、アミノ酸位置Ｓ２３９、アミノ酸位置Ｉ３３２、アミノ酸位置Ｆ２４３、アミノ酸位置Ｒ２９２、アミノ酸位置Ｙ３００、アミノ酸位置Ｖ３０５、アミノ酸位置Ｐ３９６またはそれらの組み合わせでの突然変異を含む。いくつかの実施形態では、該ＦＣ領域での１つ以上の突然変異は、参照抗体１７５Ｄ１０に対して向上したＡＤＣＣを与える。いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、参照抗体１７５Ｄ１０と比較して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、さらにペイロードにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、該ペイロードは、アウリスタチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、該アウリスタチン誘導体は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態では、該アウリスタチン誘導体は、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である。
いくつかの実施形態では、その薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、約２、約３、または約４である。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、参照抗体１７５Ｄ１０と結合エピトープを共有する。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、マウス及びカニクイザルＣＬＤＮ１８．２タンパク質に対して交差結合活性を有する。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示するのは、ＣＬＤＮ１８．２のアイソフォームに特異的に結合する抗クローディン１８．２（抗ＣＬＤＮ１８．２）抗体である。いくつかの実施形態では、該ＣＬＤＮ１８．２のアイソフォームは、細胞株ＳＮＵ６２０で発現されるアイソフォームである。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示するのは、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体をコードする核酸ポリマーである。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示するのは、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体をコードする核酸ポリマーを含むベクターである。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示するのは、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、及び医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、全身投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、非経口投与用に製剤化される。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示するのは、ＣＬＤＮ１８．２タンパク質の過剰発現を特徴とするがんを有する対象の治療方法であり、該方法は、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体または本明細書に記載の医薬組成物を該対象に投与し、それにより、該対象における該がんを治療することを含む。いくつかの実施形態では、該がんは消化管癌である。いくつかの実施形態では、該消化管癌は胃癌である。いくつかの実施形態では、該消化管癌は膵臓癌である。いくつかの実施形態では、該消化管癌は、食道癌または胆管細胞癌である。いくつかの実施形態では、該がんは、肺癌または卵巣癌である。いくつかの実施形態では、該方法は、さらに、該対象に対して、さらなる治療薬を投与することを含む。いくつかの実施形態では、該さらなる治療薬は、化学療法剤、免疫療法薬、標的治療薬、ホルモン系治療薬、幹細胞系治療薬、または放射線を含む。いくつかの実施形態では、該さらなる治療薬及び該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、同時に投与される。いくつかの実施形態では、該さらなる治療薬及び該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、連続して投与される。いくつかの実施形態では、該さらなる治療薬は、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体に先立って投与される。いくつかの実施形態では、該さらなる治療薬は、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の投与後に投与される。いくつかの実施形態では、該さらなる治療薬及び該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、異なる投与として製剤化される。いくつかの実施形態では、該対象はヒトである。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示するのは、殺細胞効果を誘導する方法であり、該方法は、複数の細胞を、ペイロードを含む抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を内在化するのに十分な時間接触させ、それにより、該殺細胞効果を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を含む。いくつかの実施形態では、該ペイロードは、メイタンシノイド、アウリスタチン、タキソイド、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、アマトキシン、またはそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態では、該ペイロードは、アウリスタチンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、該ペイロードは、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態では、該ペイロードは、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である。いくつかの実施形態では、該細胞はがん細胞である。いくつかの実施形態では、該細胞は、消化管癌に由来する。いくつかの実施形態では、該消化管癌は胃癌である。いくつかの実施形態では、該消化管癌は膵臓癌である。いくつかの実施形態では、該消化管癌は、食道癌または胆管細胞癌である。いくつかの実施形態では、該細胞は、肺癌または卵巣癌に由来する。いくつかの実施形態では、該方法は、インビトロ法である。いくつかの実施形態では、該方法は、インビボ法である。いくつかの実施形態では、該対象はヒトである。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示するのは、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、本明細書に記載のベクター、または本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を含む医薬組成物を含むキットである。
本開示の様々な態様は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本開示の特徴及び利点のより良い理解は、本開示の原理が使用される例示的な実施形態を記載する以下の発明を実施するための形態、及び添付の図面を参照することにより得られるであろう。
ＨＥＫ２９３細胞でのＣＬＤＮ１８．２の人工的な発現を示す。 ヒトＣＬＤＮ１８．２のＤＮＡ配列を示す。 ＣＬＤＮ１８．２ＥＣＬ１のＤＮＡを示す。 ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞での精製抗ＣＬＤＮ１８．２マウス産生抗体の用量依存的結合曲線を示す。抗体は、１７５Ｄ１０と比較して、最も高い最大結合を示した。 ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞での精製抗ＣＬＤＮ１８．２マウス産生抗体の用量依存的結合曲線を示す。抗体は、１７５Ｄ１０と比較して、より高い最大結合を示した。 ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞での精製抗ＣＬＤＮ１８．２マウス産生抗体の用量依存的結合曲線を示す。抗体は、１７５Ｄ１０と比較して、同様のまたはより弱い最大結合を示した。 Ａ～Ｂは、胃癌細胞株ＳＮＵ６０１（Ａ）及びＳＮＵ６２０（Ｂ）に結合する抗体を示す。番号「１」、「２」、「３」、及び「４」は、それぞれ２８２Ａ１２、１７５Ｄ１０、１０１Ｃ６、及びアイソタイプ対照を示す。 Ａ～Ｄは、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株に特異的に結合するキメラ３６４Ｄ１Ａ７及び４１３Ｈ９Ｆ８を示す。Ａ及びＢは、キメラ３６４Ｄ１Ａ７のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１及びＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株に対する結合曲線を示す。Ｃ及びＤは、キメラ４１３Ｈ９Ｆ８のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１及びＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株に対する結合曲線を示す。ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１細胞株は、Ａ及びＣに示す実験に用い、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株は、Ｂ及びＤに示す実験に用いた。キメラ１７５Ｄ１０及び父系抗体は対照の役割を果たす。 Ａ～Ｄは、キメラ２８２Ａ１２Ｆ３バリアントのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株への用量依存的結合を示す。Ａ及びＣは、キメラ抗体（ｘｉ２８２Ａ１２Ｆ３）ならびに変異ＰＴＭ部位を有するキメラ抗体（２８２Ａ１２Ｆ３－ＶＨ－Ｎ６０Ｑ及び２８２Ａ１２Ｆ３－ＶＨ－Ｎ６０Ｅ）のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１細胞株に対する結合曲線を示す。Ｂ及びＤは、キメラ抗体（ｘｉ２８２Ａ１２Ｆ３）ならびに変異ＰＴＭ部位を有するキメラ抗体（２８２Ａ１２Ｆ３－ＶＨ－Ｎ６０Ｑ及び２８２Ａ１２Ｆ３－ＶＨ－Ｎ６０Ｅ）のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株に対する結合曲線を示す。 Ａ～Ｄは、キメラ４１３Ｈ９Ｆ８バリアントのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株への用量依存的結合を示す。Ａ及びＣは、マウス抗体（４１３Ｈ９Ｆ８）、キメラ抗体（ｘｉ４１３Ｈ９Ｆ８）、ならびに変異ＰＴＭ部位を有するキメラ抗体（４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｎ３１Ｅ、４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｌ、及び４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ）のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１細胞株に対する結合曲線を示す。Ｂ及びＤは、マウス抗体（４１３Ｈ９Ｆ８）、キメラ抗体（ｘｉ４１３Ｈ９Ｆ８）、ならびに変異ＰＴＭ部位を有するキメラ抗体（４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｎ３１Ｅ、４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｌ、及び４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ）のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株に対する結合曲線を示す。 Ａ～Ｄは、キメラ３６４Ｄ１Ａ７バリアントのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株への用量依存的結合を示す。Ａ及びＣは、マウス抗体（３６４Ｄ１Ａ７）、キメラ抗体（ｘｉ３６４Ｄ１Ａ７）、ならびに変異ＰＴＭ部位を有するキメラ抗体（３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｎ３１Ｅ、３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｌ、及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ）のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１細胞株に対する結合曲線を示す。Ｂ及びＤは、マウス抗体（３６４Ｄ１Ａ７）、キメラ抗体（ｘｉ３６４Ｄ１Ａ７）、ならびに変異ＰＴＭ部位を有するキメラ抗体（３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｎ３１Ｅ、３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｌ、及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ）のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株に対する結合曲線を示す。 Ａ～Ｂは、キメラ３５７Ｂ８Ｆ８バリアントのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株への用量依存的結合を示す。Ａは、変異ＰＴＭ部位を有するキメラ３５７Ｂ８Ｆ８抗体のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１細胞株に対する結合曲線を示す。Ｂは、変異ＰＴＭ部位を有するキメラ３５７Ｂ８Ｆ８抗体のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株に対する結合曲線を示す。 Ａ～Ｃは、例示的なキメラ抗体バリアントのＳＮＵ６２０がん細胞株に対する結合を示す。変異ＰＴＭ部位を有するキメラ抗体のＳＮＵ６２０胃癌細胞株に対する結合曲線は以下の通りである：図１１Ａ、４１３Ｈ９Ｆ８、図１１Ｂ、２６４Ｄ１Ａ７、及び図１１Ｃ、３５７Ｂ８Ｆ８。 Ａ～Ｄは、キメラ抗体のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株への競合的結合を示す。ｘｉ１７５Ｄ１０（Ａ）、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）（Ｂ）、４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ（Ｃ）、及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ（Ｄ）のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対する結合を、例示的な濃度のｘｉ１７５Ｄ１０、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）、４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ、３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ、またはｈＩｇＧ１とのインキュベーション後に観察した。 Ａ～Ｅは、例示的な抗体による、異なる種のＣＬＤＮ１８．２に対する異種間の結合活性を示す。ｈｚ２８２（Ａ）、ｘｉ１７５Ｄ１０（Ｂ）、４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ（Ｃ）、３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ（Ｄ）、及び３５７Ｂ８Ｆ８－ＶＨ－Ｓ６１Ｉ－ＶＬ－Ｓ３２Ｉ（Ｅ）の結合親和性を、ヒト（中実四角）、マウス（中実丸）、またはカニクイザル（中実三角）のＣＬＤＮ１８．２を発現するＣＨＯ細胞で測定した。ｈＩｇＧ１を陰性対照として設定した。 Ａ～Ｂは、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及びＦｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ）細胞によって誘導されるＣＬＤＮ１８．２特異的ＡＤＣＣ活性を示す。抗ＣＬＤＮ１８．２抗体バリアントのＡＤＣＣ活性を、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１（Ａ）及びＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２（Ｂ）細胞株で測定した。 キメラ抗体バリアントのＮＣＩ－Ｎ８７細胞株に対するＡＤＣＣ活性を示す。ＡＤＣＣ活性は、エフェクター（ＦｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ））：標的細胞比２：１、及びインキュベーション時間１６時間で分析した。二連ウェルからのデータ。 キメラ抗体バリアントのＮＵＧＣ４－１８．２細胞株に対するＡＤＣＣ活性を示す。ＡＤＣＣ活性は、エフェクター（ＰＢＭＣ）：標的細胞比４０：１、及びインキュベーション時間５時間で分析した。二連ウェルでの１ドナー由来のデータ。 キメラ抗体バリアントのＣＨＯ－１８．２細胞株に対するＣＤＣ活性を示す。 ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２に結合するヒト化２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）抗体を示す。ヒト化２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）抗体のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対する結合曲線を示す。 ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２に結合するヒト化２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）抗体を示す。ヒト化２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）抗体のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１細胞に対する結合曲線を示す。 ＳＮＵ６２０胃癌細胞株に結合するヒト化２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）抗体を示す。ヒト化２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）抗体ｈｚ２８２－１～ｈｚ２８２－１０のＳＮＵ６２０胃癌細胞株に対する結合曲線を示す。 ＳＮＵ６２０胃癌細胞株に結合するヒト化２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）抗体を示す。ヒト化２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）抗体ｈｚ２８２－１１～ｈｚ２８２－２０のＳＮＵ６２０胃癌細胞株に対する結合曲線を示す。 ヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ（方法１）のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性を示す。図２０Ａのヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体の全結合曲線は、以下を示す：４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ１、４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ２、及び４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ３。実験は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞で行った。 ヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ（方法１）のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性を示す。図２０Ｂのヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体の全結合曲線は、以下を示す：４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ４、４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ５、及び４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ６。実験は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞で行った。 ヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ（方法１）のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性を示す。図２０Ｃのヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体の全結合曲線は、以下を示す：４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ７、４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ８、及び４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ９。実験は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞で行った。 ヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ（方法１）のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性を示す。図２０Ｄのヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体の全結合曲線は、以下を示す：４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ１０、４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ１１、及び４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ１２。実験は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞で行った。 方法２におけるヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２ＶのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性を示す。図２１Ａのヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体の全結合曲線は、以下を示す：４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ１Ｌ１、４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ１、４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ３Ｌ１、及び４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ４Ｌ１。実験は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞で行った。 方法２におけるヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２ＶのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性を示す。図２１Ｂのヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体の全結合曲線は、以下を示す：４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ１Ｌ２、４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ２、４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ３Ｌ２、及び４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ４Ｌ２。実験は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞で行った。 方法２におけるヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２ＶのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性を示す。図２１Ｃのヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体の全結合曲線は、以下を示す：４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ１Ｌ３、４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ３、４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ３Ｌ３、及び４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ４Ｌ３。実験は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞で行った。 方法２におけるヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２ＶのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性を示す。図２１Ｄのヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体の全結合曲線は、以下を示す：４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ１Ｌ４、４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ４、４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ３Ｌ４、及び４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ４Ｌ４。実験は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞で行った。 ヒト化３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２ＶのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性を示す。図２２Ａのヒト化３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体の全結合曲線は、以下を示す：３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ１Ｌ１、３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ２Ｌ１、３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ３Ｌ１、及び３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ４Ｌ１。実験は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞で行った。 ヒト化３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２ＶのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性を示す。図２２Ｂのヒト化３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体の全結合曲線は、以下を示す：３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ１Ｌ２、３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ２Ｌ２、３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ３Ｌ２、及び３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ４Ｌ２。実験は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞で行った。 ヒト化３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２ＶのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性を示す。図２２Ｃのヒト化３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体の全結合曲線は、以下を示す：３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ１Ｌ３、３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ２Ｌ３、３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ３Ｌ３、及び３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ４Ｌ３。実験は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞で行った。 ヒト化３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２ＶのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性を示す。図２２Ｄのヒト化３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体の全結合曲線は、以下を示す：３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ１Ｌ４、３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ２Ｌ４、３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ３Ｌ４、及び３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ４Ｌ４。実験は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞で行った。 ヒト化３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２ＶのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性を示す。図２２Ｅのヒト化３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体の全結合曲線は、以下を示す：３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ１Ｌ５、３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ２Ｌ５、３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ３Ｌ５、及び３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ４Ｌ５。実験は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞で行った。 ヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－３２Ｖ及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性を示す。ヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対する全結合曲線を示す。 ヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－３２Ｖ及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性を示す。ヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対する全結合曲線を示す。 ヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－３２Ｖ及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性を示す。ヒト化３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対する全結合曲線を示す。 ｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ）細胞でのヒト化抗体バリアントのＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２胃癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性を示す。ヒト化抗体４１３Ｈ９Ｆ８抗体は、ＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対して、ＦｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ）細胞がＡＤＣＣを誘導する能力について、エフェクター：標的細胞比８：１で分析した。混合した細胞を４時間培養した。 ｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ）細胞でのヒト化抗体バリアントのＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２胃癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性を示す。ヒト化抗体４１３Ｈ９Ｆ８抗体は、ＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対して、ＦｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ）細胞がＡＤＣＣを誘導する能力について、エフェクター：標的細胞比８：１で分析した。混合した細胞を４時間培養した。 ｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ）細胞でのヒト化抗体バリアントのＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２胃癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性を示す。ヒト化抗体３６４Ｄ１Ａ７抗体は、ＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対して、ＦｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ）細胞がＡＤＣＣを誘導する能力について、エフェクター：標的細胞比８：１で分析した。混合した細胞を４時間培養した。 ヒトＰＢＭＣでのヒト化抗体バリアントのＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２胃癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性を示す。ヒト化抗体４１３Ｈ９Ｆ８抗体は、ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対して、ヒトＰＢＭＣがＡＤＣＣを誘導する能力について、エフェクター：標的細胞比４０：１で分析し、細胞を５時間培養した。データは、二連ウェルでの１ドナー由来である。 ヒトＰＢＭＣでのヒト化抗体バリアントのＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２胃癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性を示す。ヒト化抗体４１３Ｈ９Ｆ８抗体は、ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対して、ヒトＰＢＭＣがＡＤＣＣを誘導する能力について、エフェクター：標的細胞比４０：１で分析し、細胞を５時間培養した。データは、二連ウェルでの１ドナー由来である。 ヒトＰＢＭＣでのヒト化抗体バリアントのＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２胃癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性を示す。ヒト化抗体３６４Ｄ１Ａ７抗体は、ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対して、ヒトＰＢＭＣがＡＤＣＣを誘導する能力について、エフェクター：標的細胞比４０：１で分析し、細胞を５時間培養した。データは、二連ウェルでの１ドナー由来である。 Ａ～Ｂは、ヒト化抗体バリアントのＣＨＯ－１８．２細胞株に対するＣＤＣ活性を示す。ヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ（Ａ）及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ（Ｂ）抗体のＣＤＣ活性は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対してヒト血清で測定した。 本試験で使用したＭａｂ－ｍｃ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥの例示的な設計構造を示す。 ＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２細胞の生存を阻害するＣＬＤＮ１８．２特異的ＡＤＣを示す。ＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２細胞の生存は、ＡＤＣ ｘｉ１７５Ｄ１０－ｖｃＭＭＡＥ（ＤＡＲ＝４．０２）、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）－ｖｃＭＭＡＥ（ＤＡＲ＝３．９４）及びｈＩｇＧ１－ｖｃＭＭＡＥ（ＤＡＲ＝３．９１）ならびに裸抗体ｘｉ１７５Ｄ１０ ２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）及びｈＩｇＧ１で５日間処理後に測定した。生存は、ＣＬＤＮ１８．２を発現するＨＥＫ２９３細胞株で測定した。 ＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２細胞の生存を阻害するＣＬＤＮ１８．２特異的ＡＤＣを示す。ＨＥＫ２９３細胞の生存は、ＡＤＣ ｘｉ１７５Ｄ１０－ｖｃＭＭＡＥ（ＤＡＲ＝４．０２）、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）－ｖｃＭＭＡＥ（ＤＡＲ＝３．９４）及びｈＩｇＧ１－ｖｃＭＭＡＥ（ＤＡＲ＝３．９１）ならびに裸抗体ｘｉ１７５Ｄ１０ ２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）及びｈＩｇＧ１で５日間処理後に測定した。生存は、ＣＬＤＮ１８．２を発現するＨＥＫ２９３細胞株で測定した。 ＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２細胞の生存を阻害するＣＬＤＮ１８．２特異的ＡＤＣを示す。ＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２細胞の生存は、ＡＤＣ ｘｉ１７５Ｄ１０－ｖｃＭＭＡＥ（ＤＡＲ＝４．０２）、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）－ｖｃＭＭＡＥ（ＤＡＲ＝３．９４）、及びｈＩｇＧ１－ｖｃＭＭＡＥ（ＤＡＲ＝３．９１）で５日間処理後に測定した。 ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞の生存を阻害するＣＬＤＮ１８．２特異的ＡＤＣを示す。ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞の生存は、ＡＤＣ ｘｉ１７５Ｄ１０－ｖｃＭＭＡＥ（ＤＡＲ＝４．０２）、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）－ｖｃＭＭＡＥ（ＤＡＲ＝３．９４）、及びｈＩｇＧ１－ｖｃＭＭＡＥ（ＤＡＲ＝３．９１）で５日間処理後に測定した。 ＣＬＤＮ１８．２特異的ＡＤＣが阻害するＰＡＮＣ－１－ＣＬＤＮ１８．２細胞の生存を示す。２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）のＰＡＮＣ－１－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対するＡＤＣＣ効果を示す。 ＣＬＤＮ１８．２特異的ＡＤＣが阻害するＰＡＮＣ－１－ＣＬＤＮ１８．２細胞の生存を示す。ＣＬＤＮ１８．２特異的ＡＤＣ、ｘｉ１７５Ｄ１０－ｖｃＭＭＡＥ（ＤＡＲ＝４．０２）、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）－ｖｃＭＭＡＥ（ＤＡＲ＝３．９４）、及びｈＩｇＧ１－ｖｃＭＭＡＥ（ＤＡＲ＝３．９１）で５日間処理した後のＰＡＮＣ－１－ＣＬＤＮ１８．２細胞の生存を示す。 ＦｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ）細胞での４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ２バリアントのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株に対するＡＤＣＣ活性を示す。 ヒトＰＢＭＣでの４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ２及び４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ２バリアントのＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２胃癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性を示す。 Ａ～Ｂは、ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞（Ａ）及びＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２細胞（Ｂ）による抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の内在化を示す。 ヌードマウスのヒト胃癌ＧＡ０００６患者由来異種移植（ＰＤＸ）モデルにおける抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の効果を示す。 Ｎｕ／Ｎｕマウスの膵臓癌のマウス異種移植モデルにおける抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の効果を示す。 Ｎｕ／Ｎｕマウスの膵臓癌のマウス異種移植モデルにおける抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の効果を示す。 Ｎｕ／Ｎｕマウスの膵臓癌のマウス異種移植モデルにおける抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の効果を示す。 Ｎｕ／Ｎｕマウスの膵臓癌のマウス異種移植モデルにおける抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の効果を示す。 Ｎｕ／Ｎｕマウスの膵臓癌のマウス異種移植モデルにおける抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の効果を示す。 ヒト胃癌ＧＡ０００６患者由来異種移植（ＰＤＸ）モデルにおける抗ＣＬＤ１Ｎ８．２抗体と化学療法の組み合わせ効果を示す。
クローディン（ＣＬＤＮ）は、主要なタイトジャンクション構成タンパク質であり、上皮細胞のバリア機能及び極性を調節し、それにより、頂端膜及び細胞基底膜ドメイン間の境界を創出する。現在までに、ＣＬＤＮファミリーの２７のメンバーが、異なる臓器特異的な発現パターンとともに特徴づけられている。クローディンの発現レベルは、多くの場合、ヒト新生物で異常であることが分かっている。ＣＬＤＮファミリーのメンバーの１つであるＣＬＤＮ－１８アイソフォーム２（ＣＬＤＮ１８．２）は、選択的胃系統抗原であり、正常組織でのその発現は、胃粘膜の分化した上皮細胞に限定されている。
該ＣＬＤＮ１８．２タンパク質は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、及びヒトで高度に保存されており、４つの膜貫通ドメイン及び２つの細胞外ドメインからなる。第一の細胞外ドメイン内の５１個のアミノ酸残基のうち約８個は、肺組織特異的ＣＬＤＮ－１８アイソフォーム１（ＣＬＤＮ１８．１）とは異なり、モノクローナル抗体結合のエピトープとして機能し得る。
がんにおいては、ＣＬＤＮ１８．２は、腫瘍の発生及び成長に関与していることが分かっている。実際、ＣＬＤＮ１８．２は、ヒト胃癌細胞及びその転移の表面で提示されることが分かっており（Ｓａｈｉｎ，ｅｔ ａｌ，“Ｃｌａｕｄｉｎ－１８ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ ２ ｉｓ ａ ｐａｎ－ｃａｎｃｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８；１４：７６２４－３４）、その異所性活性化は、膵臓癌で認められた（Ｗｏｌｌ，ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２ ｉｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ＩＭＡＢ３６２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ，”Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０１４；１３４：７３１－７３９、及びＴａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌａｕｄｉｎ－１８ ｉｓ ａｎ ｅａｒｌｙ－ｓｔａｇｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ２０１１；５９：９４２－９５２）。ＣＬＤＮ１８．２の異常活性化は、胆管、食道、卵巣、及び肺癌でも認められ、全生存の不良及びリンパ節転移に関連していた（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌａｕｄｉｎ－１８ ｉｎ ｂｉｌｉａｒｙ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ． Ｉｔｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，”Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ ２０１１；４５９：７３－８０、及びＭｉｃｋｅ，ｅｔ ａｌ．，“Ａｂｅｒｒａｎｔｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｌａｕｄｉｎ ６ ａｎｄ １８．２ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ，”Ｉｎｔ Ｊ ＣＮＣＥＲ ２０１４；１３５：２２０６－２２１４）。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示するのは、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及びその使用である。いくつかの例では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、キメラ抗体である。他の例では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ヒト化抗体である。さらなる例では、本明細書に開示するのは、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を使用する治療方法及び殺細胞効果の誘導方法である。
抗クローディン１８．２抗体
ある特定の実施形態では、本明細書に開示するのは、抗クローディン１８．２（抗ＣＬＤＮ１８．２）抗体である。いくつかの例では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＣＬＤＮ１８．２の細胞外ドメインに結合する。場合によっては、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＣＬＤＮ１８．２の第一の細胞外ドメインに結合する。場合によっては、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、該ＣＬＤＮ１８．２の第一の細胞外ドメイン内の８残基領域、例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子Ｐ５６８５６－２）の残基３２～４１に結合する。いくつかの実施形態では、参照抗ＣＬＤＮ１８．２抗体とは異なる機能特性を有する、及び／またはＣＬＤＮ１８．２のアイソフォームに対する選択性を有する１つ以上の突然変異を翻訳後修飾部位に含む抗ＣＬＤＮ１８．２抗体もまた本明細書に記載する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、半数効果濃度（ＥＣ５０）が、参照抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＥＣ５０より低い。いくつかの例では、該参照抗体は１７５Ｄ１０であり、これは、それぞれ、配列番号９８及び配列番号９９に記載の重鎖（ＨＣ）配列及び軽鎖（ＬＣ）配列を含む。場合によっては、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＥＣ５０は、約５ｎＭ以下である。場合によっては、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＥＣ５０は、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ、またはそれより低い。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、参照抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の結合親和性と比較して、ＣＬＤＮ１８．２への結合親和性が高い。場合によっては、該参照抗体は１７５Ｄ１０であり、これは、それぞれ、配列番号９８及び配列番号９９に記載の重鎖配列及び軽鎖配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、参照抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と比較して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が高い。場合によっては、該参照抗体は１７５Ｄ１０であり、これは、それぞれ、配列番号９８及び配列番号９９に記載の重鎖配列及び軽鎖配列を含む。場合によっては、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、さらに、ＡＤＣＣを高めるＦｃ領域での突然変異を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、翻訳後修飾部位に少なくとも１つの突然変異を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＣＬＤＮ１８．２のアイソフォームに特異的に結合する。場合によっては、該ＣＬＤＮ１８．２のアイソフォームは、細胞株ＳＮＵ６２０で発現されるアイソフォームである。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、可変重鎖（ＶＨ）領域及び可変軽鎖（ＶＬ）領域を含み、該ＶＨ領域は、ＣＤＲ１配列ＧＦＳＬＴＳＹＸ１ＶＸ２、ＣＤＲ２配列ＶＩＷＸ３Ｘ４ＧＸ５ＴＸ６ＹＸ７Ｘ８Ｘ９ＬＸ１０Ｓ、及びＣＤＲ３配列ＤＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０を含み、ここで、Ｘ１は、ＮまたはＧから選択され、Ｘ２は、ＹまたはＨから選択され、Ｘ３は、ＮまたはＰから選択され、Ｘ４は、ＴまたはＧから選択され、Ｘ５は、ＡまたはＮから選択され、Ｘ６は、ＲまたはＮから選択され、Ｘ７は、Ｎ、Ｑ、またはＥから選択され、Ｘ８は、ＳまたはＩから選択され、Ｘ９は、ＴまたはＡから選択され、Ｘ１０は、ＫまたはＭから選択され、Ｘ１１は、ＳまたはＲから選択され、Ｘ１２は、ＡまたはＲから選択され、Ｘ１３は、ＭまたはＬから選択され、Ｘ１４は、ＰまたはＡから選択され、Ｘ１５は、ＡまたはＭから選択され、Ｘ１６は、ＩまたはＤから選択され、Ｘ１７は、ＰまたはＹから選択され、Ｘ１８は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆであり、Ｘ１９は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ａであり、Ｘ２０は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｙである。
いくつかの例では、該ＶＨ領域は、ＣＤＲ１配列Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５ＳＦＧＭＨ、ＣＤＲ２配列ＹＩＳＳＧＳＸ２６Ｘ２７ＩＹＹＸ２８ＤＸ２９Ｘ３０ＫＧ、及びＣＤＲ３配列ＡＸ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１を含み、ここで、Ｘ２１は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｇであり、Ｘ２２は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆであり、Ｘ２３は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｔであり、Ｘ２４は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆであり、Ｘ２５は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｓであり、Ｘ２６は、ＳまたはＧから選択され、Ｘ２７は、ＰまたはＳから選択され、Ｘ２８は、ＶまたはＡから選択され、Ｘ２９は、ＫまたはＴから選択され、Ｘ３０は、ＬまたはＶから選択され、Ｘ３１は、ＧまたはＴから選択され、Ｘ３２は、ＹまたはＳから選択され、Ｘ３３は、ＡまたはＹから選択され、Ｘ３４は、ＶまたはＹから選択され、Ｘ３５は、ＲまたはＹから選択され、Ｘ３６は、ＮまたはＧから選択され、Ｘ３７は、ＡまたはＮから選択され、Ｘ３８は、ＬまたはＡから選択され、Ｘ３９は、ＤまたはＬから選択され、Ｘ４０は、ＹまたはＥから選択され、Ｘ４１は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｙである。
いくつかの実施形態では、該ＶＨ領域は、表１から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む。
Figure 2022512132000002
いくつかの例では、該ＶＨ領域は、配列番号１からなるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列ＶＩＷＮＴＧＡＴＲＹＸ７ＳＸ９ＬＫＳ、及び配列番号３からなるＣＤＲ３配列を含み、ここで、Ｘ７は、Ｎ、Ｑ、またはＥから選択され、Ｘ９は、ＴまたはＡから選択される。
いくつかの例では、該ＶＨ領域は、配列番号１３からなるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列ＶＩＷＰＧＧＮＴＮＹＸ７Ｘ８ＡＬＭＳ、及び配列番号１５からなるＣＤＲ３配列を含み、ここで、Ｘ７は、ＮまたはＥから選択され、Ｘ８は、ＳまたはＩから選択される。
いくつかの例では、該ＶＨ領域は、配列番号１、７、１０、または１３から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２、４、５、６、８、１１、１４、１６、または１７から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号３、９、１２、または１５から選択されるＣＤＲ３配列を含む。
いくつかの例では、該ＶＨ領域は、配列番号１からなるＣＤＲ１配列、配列番号２、４、５、または６から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号３からなるＣＤＲ３配列を含む。
いくつかの例では、該ＶＨ領域は、配列番号１３からなるＣＤＲ１配列、配列番号１４、１６、または１７から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１５からなるＣＤＲ３配列を含む。
いくつかの例では、該ＶＨ領域は、配列番号７からなるＣＤＲ１配列、配列番号８からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号９からなるＣＤＲ３配列を含む。
いくつかの例では、該ＶＨ領域は、配列番号１０からなるＣＤＲ１配列、配列番号１１からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号１２からなるＣＤＲ３配列を含む。
いくつかの実施形態では、該ＶＬ領域は、表２から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む。
Figure 2022512132000003
Figure 2022512132000004
いくつかの例では、該ＶＬ領域は、配列番号１８、２１、２４～２８、３１～３５、３８、または３９から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１９、２２、２９、または３６から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号２０、２３、３０、または３７から選択されるＣＤＲ３配列を含む。
いくつかの例では、該ＶＬ領域は、配列番号２１または２４～２７から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２２からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号２３からなるＣＤＲ３配列を含む。
いくつかの例では、該ＶＬ領域は、配列番号２８または３１～３４から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２９からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号３０からなるＣＤＲ３配列を含む。
いくつかの例では、該ＶＬ領域は、配列番号３５、３８、または３９から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号３６からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号３７からなるＣＤＲ３配列を含む。
いくつかの例では、該ＶＬ領域は、配列番号１８からなるＣＤＲ１配列、配列番号１９からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号２０からなるＣＤＲ３配列を含む。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＣＤＲ１配列ＧＦＳＬＴＳＹＸ１ＶＸ２、ＣＤＲ２配列ＶＩＷＸ３Ｘ４ＧＸ５ＴＸ６ＹＸ７Ｘ８Ｘ９ＬＸ１０Ｓ、及びＣＤＲ３配列ＤＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０を含むＶＨ領域を含み、ここで、Ｘ１は、ＮまたはＧから選択され、Ｘ２は、ＹまたはＨから選択され、Ｘ３は、ＮまたはＰから選択され、Ｘ４は、ＴまたはＧから選択され、Ｘ５は、ＡまたはＮから選択され、Ｘ６は、ＲまたはＮから選択され、Ｘ７は、Ｎ、Ｑ、またはＥから選択され、Ｘ８は、ＳまたはＩから選択され、Ｘ９は、ＴまたはＡから選択され、Ｘ１０は、ＫまたはＭから選択され、Ｘ１１は、ＳまたはＲから選択され、Ｘ１２は、ＡまたはＲから選択され、Ｘ１３は、ＭまたはＬから選択され、Ｘ１４は、ＰまたはＡから選択され、Ｘ１５は、ＡまたはＭから選択され、Ｘ１６は、ＩまたはＤから選択され、Ｘ１７は、ＰまたはＹから選択され、Ｘ１８は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆであり、Ｘ１９は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ａであり、Ｘ２０は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｙであり、かつ、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、配列番号１８、３５、３８、または３９から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１９または３６から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号２０または３７から選択されるＣＤＲ３配列を含むＶＬ領域を含む。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＣＤＲ１配列Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５ＳＦＧＭＨ、ＣＤＲ２配列ＹＩＳＳＧＳＸ２６Ｘ２７ＩＹＹＸ２８ＤＸ２９Ｘ３０ＫＧ、及びＣＤＲ３配列ＡＸ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１を含むＶＨ領域を含み、ここで、Ｘ２１は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｇであり、Ｘ２２は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆであり、Ｘ２３は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｔであり、Ｘ２４は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆであり、Ｘ２５は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｓであり、Ｘ２６は、ＳまたはＧから選択され、Ｘ２７は、ＰまたはＳから選択され、Ｘ２８は、ＶまたはＡから選択され、Ｘ２９は、ＫまたはＴから選択され、Ｘ３０は、ＬまたはＶから選択され、Ｘ３１は、ＧまたはＴから選択され、Ｘ３２は、ＹまたはＳから選択され、Ｘ３３は、ＡまたはＹから選択され、Ｘ３４は、ＶまたはＹから選択され、Ｘ３５は、ＲまたはＹから選択され、Ｘ３６は、ＮまたはＧから選択され、Ｘ３７は、ＡまたはＮから選択され、Ｘ３８は、ＬまたはＡから選択され、Ｘ３９は、ＤまたはＬから選択され、Ｘ４０は、ＹまたはＥから選択され、Ｘ４１は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｙであり、かつ、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、配列番号２１、２４～２８、または３１～３４から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２２または２９から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号２３または３０から選択されるＣＤＲ３配列を含むＶＬ領域を含む。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、配列番号１からなるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列ＶＩＷＮＴＧＡＴＲＹＸ７ＳＸ９ＬＫＳ、及び配列番号３からなるＣＤＲ３配列を含むＶＨ領域を含み、ここで、Ｘ７は、Ｎ、Ｑ、またはＥから選択され、Ｘ９は、ＴまたはＡから選択され、かつ、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、配列番号１８からなるＣＤＲ１配列、配列番号１９からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号２０からなるＣＤＲ３配列を含むＶＬ領域を含む。
いくつかの例では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、配列番号１３からなるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列ＶＩＷＰＧＧＮＴＮＹＸ７Ｘ８ＡＬＭＳ、及び配列番号１５からなるＣＤＲ３配列を含むＶＨ領域を含み、ここで、Ｘ７は、ＮまたはＥから選択され、Ｘ８は、ＳまたはＩから選択され、かつ、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、配列番号３５、３８、または３９から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号３６からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号３７からなるＣＤＲ３配列を含むＶＬ領域を含む。
いくつかの例では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、配列番号１、７、１０、または１３から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２、４、５、６、８、１１、１４、１６、または１７から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号３、９、１２、または１５から選択されるＣＤＲ３配列を含むＶＨ領域を含み、かつ、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、配列番号１８、２１、２４～２８、３１～３５、３８、または３９から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１９、２２、２９、または３６から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号２０、２３、３０、または３７から選択されるＣＤＲ３配列を含むＶＬ領域を含む。
いくつかの例では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、配列番号１からなるＣＤＲ１配列、配列番号２、４、５、または６から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号３からなるＣＤＲ３配列を含むＶＨ領域、ならびに配列番号１８からなるＣＤＲ１配列、配列番号１９からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号２０からなるＣＤＲ３配列を含むＶＬ領域を含む。
いくつかの例では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、配列番号１３からなるＣＤＲ１配列、配列番号１４、１６、または１７から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１５からなるＣＤＲ３配列を含むＶＨ領域、ならびに配列番号３５、３８、または３９から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号３６からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号３７からなるＣＤＲ３配列を含むＶＬ領域を含む。
いくつかの例では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、配列番号７からなるＣＤＲ１配列、配列番号８からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号９からなるＣＤＲ３配列を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２１または２４～２７から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２２からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号２３からなるＣＤＲ３配列を含むＶＬ領域を含む。
いくつかの例では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、配列番号１０からなるＣＤＲ１配列、配列番号１１からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号１２からなるＣＤＲ３配列を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２８または３１～３４から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２９からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号３０からなるＣＤＲ３配列を含むＶＬ領域を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、完全長抗体またはその結合断片である。場合によっては、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、キメラ抗体またはその結合断片である。他の場合では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ヒト化抗体またはその結合断片である。さらなる場合では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、モノクローナル抗体またはその結合断片である。
いくつかの例では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、一価のＦａｂ’、二価のＦａｂ２、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ科動物抗体もしくはその結合断片を含む。
いくつかの例では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、二重特異性抗体またはその結合断片である。例示的な二重特異性抗体の構成としては、ノブと穴（ＫｉＨ）、Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｒｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＡＲＴ－Ｉｇ）、Ｔｒｉｏｍａｂクアドローマ、二重特異性モノクローナル抗体（ＢｉＭＡｂ、ＢｓｍＡｂ、ＢｓＡｂ、ｂｓＭａｂ、ＢＳ－Ｍａｂ、もしくはＢｉ－ＭＡｂ）、Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｂｙ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＢＥＡＴ）、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢｉＴＥ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ／Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｏｎ Ｆａｂ（ＤＡＦ）、ＦｉｎｏｍＡｂ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ－（Ｆａｂ）融合、Ｄｏｃｋ－ａＮｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）、Ａｄａｐｔｉｒ（以前はＳＣＯＲＰＩＯＮ）、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、Ｄｕａｌ－ａｆｆｉｎｉｔｙ－ＲｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＡＲＴ）、ナノボディ、トリプルボディ、タンデムｓｃＦｖ（ｔａＦｖ）、トリプルヘッド、タンデムｄＡｂ／ＶＨＨ、トリプルｄＡｂ／ＶＨＨ、または四価ｄＡｂ／ＶＨＨが挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，“Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ＭＡＢＳ ９（２）：１８２－２１２（２０１７）の図２に示される二重特異性抗体の構成を含む二重特異性抗体またはその結合断片である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、翻訳後修飾部位に突然変異を含む。いくつかの例では、該突然変異は、該ＶＨ領域内にある。他の例では、該突然変異は、該ＶＬ領域内にある。さらなる例では、２つ以上の突然変異が、該ＶＨ領域内にあるか、該ＶＬ領域内にあるか、またはそれらの組み合わせにある。
いくつかの例では、該突然変異は、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＶＨ領域のアミノ酸位置６０、６１、または６２にあり、該アミノ酸位置は、配列番号４０の６０、６１、または６２位に対応する。いくつかの例では、該突然変異は、配列番号４０の６０または６１位に対応するアミノ酸位置６０または６１にある。いくつかの例では、該突然変異は、配列番号４０の６０または６２位に対応するアミノ酸位置６０または６２にある。場合によっては、該突然変異は、配列番号４０のアミノ酸位置６０（Ｎ６０）または６１（Ｓ６１）にある。場合によっては、該突然変異は、配列番号４０のアミノ酸位置６０（Ｎ６０）または６２（Ｔ６２）にある。場合によっては、該突然変異は、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の結合親和性を、参照抗体１７５Ｄ１０と比較して高める。
いくつかの例では、該突然変異は、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＶＨ領域のアミノ酸位置６０、６１、または６２にあり、該アミノ酸位置は、配列番号５７の６０、６１、または６２位に対応する。いくつかの例では、該突然変異は、配列番号５７の６０または６１位に対応するアミノ酸位置６０または６１にある。いくつかの例では、該突然変異は、配列番号５７の６０または６２位に対応するアミノ酸位置６０または６２にある。場合によっては、該突然変異は、配列番号５７のアミノ酸位置６０（Ｎ６０）または６１（Ｓ６１）にある。場合によっては、該突然変異は、配列番号５７のアミノ酸位置６０（Ｎ６０）または６２（Ｔ６２）にある。場合によっては、該突然変異は、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の結合親和性を、参照抗体１７５Ｄ１０と比較して高める。
いくつかの例では、該アミノ酸残基Ｎ６０は、極性アミノ酸または酸性アミノ酸に変異している。いくつかの例では、該アミノ酸残基Ｎ６０は、セリン、スレオニン、アスパラギン、またはグルタミンから選択される極性アミノ酸に変異している。いくつかの例では、該アミノ酸残基Ｎ６０は、アスパラギン酸またはグルタミン酸から選択される酸性アミノ酸に変異している。場合によっては、該アミノ酸残基Ｎ６０は、グルタミンに変異している。場合によっては、該アミノ酸残基Ｎ６０は、グルタミン酸に変異している。
いくつかの例では、該アミノ酸残基Ｓ６１は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、及びバリンから任意に選択される非極性残基に変異している。場合によっては、該アミノ酸残基Ｓ６１は、イソロイシンに変異している。
いくつかの例では、該アミノ酸残基Ｔ６２は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、及びバリンから任意に選択される非極性残基に変異している。場合によっては、該アミノ酸残基Ｔ６２は、アラニンに変異している。
いくつかの例では、該突然変異は、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＶＬ領域のアミノ酸位置３１または３２にあり、該アミノ酸位置は、配列番号４６の３１または３２位に対応する。場合によっては、該突然変異は、配列番号４６のアミノ酸位置３１（Ｎ３１）または３２（Ｓ３２）にある。場合によっては、該突然変異は、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の結合親和性を、参照抗体１７５Ｄ１０と比較して高める。
いくつかの例では、該突然変異は、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＶＬ領域のアミノ酸位置３１または３２にあり、該アミノ酸位置は、配列番号５２の３１または３２位に対応する。場合によっては、該突然変異は、配列番号５２のアミノ酸位置３１（Ｎ３１）または３２（Ｓ３２）にある。場合によっては、該突然変異は、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の結合親和性を、参照抗体１７５Ｄ１０と比較して高める。
いくつかの例では、該突然変異は、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＶＬ領域のアミノ酸位置３１または３２にあり、該アミノ酸位置は、配列番号６０の３１または３２位に対応する。場合によっては、該突然変異は、配列番号６０のアミノ酸位置３１（Ｎ３１）または３２（Ｓ３２）にある。場合によっては、該突然変異は、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の結合親和性を、参照抗体１７５Ｄ１０と比較して高める。
場合によっては、該アミノ酸残基Ｎ３１は、酸性アミノ酸に変異している。場合によっては、該アミノ酸残基Ｎ３１は、アスパラギン酸またはグルタミン酸に変異している。場合によっては、該アミノ酸残基Ｎ３１は、アスパラギン酸に変異している。場合によっては、該アミノ酸残基Ｎ３１は、グルタミン酸に変異している。
場合によっては、該アミノ酸残基Ｓ３２は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、及びバリンから任意に選択される非極性残基に変異している。場合によっては、該アミノ酸残基Ｓ３２は、ロイシン、バリン、またはイソロイシンに変異している。場合によっては、該アミノ酸残基Ｓ３２は、ロイシンに変異している。場合によっては、該アミノ酸残基Ｓ３２は、バリンに変異している。場合によっては、該アミノ酸残基Ｓ３２は、イソロイシンに変異している。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＶＨ領域のアミノ酸位置６０、６１、または６２に突然変異を含み、該アミノ酸位置は、配列番号５７の６０、６１、または６２位に対応し、かつ、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＶＬ領域のアミノ酸位置３１または３２に突然変異を含み、該アミノ酸位置は、配列番号６０の３１または３２位に対応する。いくつかの例では、該突然変異は、配列番号５７の６０または６１位に対応するアミノ酸位置６０または６１にある。いくつかの例では、該突然変異は、配列番号５７の６０または６２位に対応するアミノ酸位置６０または６２にある。場合によっては、該突然変異は、配列番号５７のアミノ酸位置６０（Ｎ６０）または６１（Ｓ６１）にある。場合によっては、該突然変異は、配列番号５７のアミノ酸位置６０（Ｎ６０）または６２（Ｔ６２）にある。場合によっては、該突然変異は、配列番号６０のアミノ酸位置３１（Ｎ３１）または３２（Ｓ３２）にある。場合によっては、該突然変異は、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の結合親和性を、参照抗体１７５Ｄ１０と比較して高める。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、キメラ抗体またはその結合断片である。いくつかの例では、該キメラ抗体またはその結合断片は、配列番号４０～４３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号４４に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む。場合によっては、該キメラ抗体またはその結合断片は、配列番号４５に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号４６～５０に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む。場合によっては、該キメラ抗体またはその結合断片は、配列番号５１に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号５２～５６に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む。場合によっては、該キメラ抗体またはその結合断片は、配列番号５７～５９に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号６０～６２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む。
いくつかの実施形態では、キメラ抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域は、表３に示される。下線が引かれた領域は、それぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３配列を示す。
Figure 2022512132000005
Figure 2022512132000006
Figure 2022512132000007
場合によっては、該キメラ抗体またはその結合断片は、さらに、配列番号６３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＣＨ領域及び配列番号６４に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＣＬ領域を含む。場合によっては、該キメラ抗体またはその結合断片は、表４に記載のＣＨ領域及びＣＬ領域を含む。
Figure 2022512132000008
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ヒト化抗体またはその結合断片である。いくつかの例では、該ヒト化抗体またはその結合断片は、配列番号６５～６８に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号６９～７３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む。いくつかの例では、該ヒト化抗体またはその結合断片は、配列番号７４～７６に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号７７～８０に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む。いくつかの例では、該ヒト化抗体またはその結合断片は、配列番号８１～８４に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号８５～８８に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む。いくつかの例では、該ヒト化抗体またはその結合断片は、配列番号８９～９２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号９３～９７に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む。
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域は、表５に示される。下線が引かれた領域は、それぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３配列を示す。
Figure 2022512132000009
Figure 2022512132000010
Figure 2022512132000011
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、表６に示すＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
Figure 2022512132000012
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、表７に示すＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
Figure 2022512132000013
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、表８に示すＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
Figure 2022512132000014
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、表９に示すＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
Figure 2022512132000015

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）、ＩｇＡ、またはＩｇＥから選択されるフレームワーク領域を含む。場合によっては、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＩｇＭのフレームワークを含む。場合によっては、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のフレームワークを含む。場合によっては、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＩｇＧ１のフレームワークを含む。場合によっては、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＩｇＧ２のフレームワークを含む。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、フレームワーク領域、例えば、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジ領域、またはそれらの組み合わせに１つ以上の突然変異を含む。場合によっては、該１つ以上の突然変異は、Ｆｃ受容体相互作用を調節し、例えば、ＡＤＣＣ及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）等のＦｃエフェクター機能を高める。場合によっては、該１つ以上の突然変異は、該抗体を安定化させ、及び／または該抗体の半減期を延長する。さらなる場合では、該１つ以上の突然変異は、グリコシル化を調節する。
いくつかの実施形態では、該Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体相互作用を調節し、例えば、ＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣ等のエフェクター機能を高める１つ以上の突然変異を含む。かかる場合には、変異した場合にエフェクター機能を調節する例示的な残基としては、Ｓ２３９、Ｆ２４３、Ｒ２９２、Ｙ３００、Ｖ３０５、Ｐ３９６、Ｋ３２６、Ａ３３０、Ｉ３３２、またはＥ３３３が挙げられる。ここで、該残基の位置は、ＩｇＧ１に対応し、該残基の付番は、Ｋａｂａｔの付番（ＥＵ ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ １９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）に従う。いくつかの例では、該１つ以上の突然変異は、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｐ３９６Ｌ、Ｋ３２６Ｗ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、またはそれらの組み合わせを含む。場合によっては、該１つ以上の突然変異は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、またはそれらの組み合わせを含む。場合によっては、該１つ以上の突然変異は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｐ３９６Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、またはそれらの組み合わせを含む。場合によっては、該１つ以上の突然変異は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、またはそれらの組み合わせを含む。場合によっては、該１つ以上の突然変異は、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３３３Ｓ、またはそれらの組み合わせを含む。場合によっては、該変異は、Ｅ３３３Ａを含む。
場合によっては、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、参照抗体１７５Ｄ１０と結合エピトープを共有する。
場合によっては、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、マウス及びカニクイザルＣＬＤＮ１８．２タンパク質に対して交差結合活性を有する。
抗体産生
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、産生動物に抗原組成物を注射することによる標準的な方法で産生される。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい。タンパク質全体、または該タンパク質の大部分を使用する場合、抗体は、該産生動物に、該タンパク質及び適切なアジュバント（例えば、フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、水中油エマルション等）で免疫付与することによって産生され得る。小さいペプチドを使用する場合、該ペプチドを大きな分子とコンジュゲートさせ、免疫賦活コンジュゲートを作製することが有利である。かかる使用のための市販の一般的に使用されているコンジュゲートタンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が挙げられる。特定のエピトープに対する抗体を産生するために、完全な配列に由来するペプチドを使用することができる。別の方法として、タンパク質標的の比較的短いペプチド部分に対する抗体を産生するためには、ポリペプチドが卵白アルブミン、ＢＳＡまたはＫＬＨ等の担体タンパク質に結合されている場合に優れた免疫応答が誘発され得る。
ポリクローナルまたはモノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ヒト免疫グロブリンを産生するように遺伝子組み換えされた動物から産生することができる。トランスジェニック動物は、当該動物の自然抗体を産生しない「ノックアウト」動物を最初に産生し、ヒト抗体遺伝子座で該動物を安定して形質転換することによって（例えば、ヒト人工染色体を使用することによって）産生することができる。かかる場合には、ヒトの抗体だけが該動物によって作製される。かかる動物を産生し、それから抗体を得るための技術は、参照することにより完全に本明細書に組み込まれる米国特許第６，１６２，９６３号及び第６，１５０，５８４号に記載されている。かかる抗体は、ヒト異種抗体と呼ばれることがある。
別の方法として、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ヒト可変領域を含むファージライブラリから産生することができる。参照することにより完全に本明細書に組み込まれる米国特許第６，１７４，７０８号を参照されたい。
本明細書に開示する実施形態のいずれかのいくつかの態様では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ハイブリドーマによって産生される。
モノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の場合、ハイブリドーマは、接種された動物の脾臓由来の細胞等の、刺激を受けた免疫細胞を単離することによって形成され得る。これらの細胞を次に、細胞培養で無制限に複製することが可能な骨髄腫細胞や形質転換細胞等の不死化細胞に融合し、それにより、不死の免疫グロブリン分泌細胞株を産生することができる。使用される不死の細胞株は、ある特定の栄養素の利用に必要な酵素が不足しているように選択することができる。多くのかかる細胞株（骨髄腫等）は当業者に既知であり、例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはヒポキサンチン－グアニンホスホリボキシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を含む。これらの不足により、例えば、ヒポキサンチンアミノプテリンチミジン培地（ＨＡＴ）上で増殖するそれらの能力による融合細胞の選択が可能になる。
さらに、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、遺伝子工学によって産生される可能性がある。
本明細書に開示する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ヒトにおいて望ましくない免疫応答、例えば、アナフィラキシーショックを誘発する傾向が低下している可能性があり、また、抗体治療薬または造影剤の反復投与を妨げる免疫応答（例えば、ヒト抗マウス抗体「ＨＡＭＡ」応答）をプライミングする傾向が低下している可能性もある。かかる抗ＣＬＤＮ１８．２抗体としては、ヒト化、キメラ、または異種ヒト抗ＣＬＤＮ１８．２抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
キメラ抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、主にヒトドメインを有する抗体を産生するため、例えば、マウス（または他の動物由来）ハイブリドーマクローンから得られたマウス可変軽鎖及び重鎖領域（ＶＫ及びＶＨ）をヒト定常軽鎖及び重鎖領域と組み合わせることによる組み換え手段によって作製することができる。かかるキメラ抗体の産生は、当技術分野では周知であり、標準的な手段によって達成され得る（例えば、参照することにより完全に本明細書に組み込まれる米国特許第５，６２４，６５９号に記載されている）。
非ヒト（例えば、げっ歯類または霊長類）抗体に適用される「ヒト化」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むハイブリッド免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらの断片である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、該ヒト化抗体は、該レシピエント抗体にも取り込まれたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練及び最適化し、人体に導入された際の免疫原性を最小限に抑えるために行われる。いくつかの例では、該ヒト化抗体は、少なくとも１つの、通常は２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、該ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、該ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。該ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分（Ｆｃ）、通常はヒト免疫グロブリンのものを含み得る。
ヒト化抗体は、ヒト様免疫グロブリンドメインを含むように改変することができ、動物由来抗体の相補性決定領域のみを組み込むことができる。これは、モノクローナル抗原結合単位またはモノクローナル抗体の可変領域の超可変ループの配列を注意深く調べ、それらをヒト抗原結合単位またはヒト抗体鎖の構造に適合させることによって達成することができる。例えば、参照することにより完全に本明細書に組み込まれる米国特許第６，１８７，２８７号を参照されたい。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野で周知である。「ヒト化」抗体は、配列の少なくとも一部がその最初の形態から変更されて、よりヒト免疫グロブリンのような状態にされた抗体である。いくつかの型では、重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖の定常（Ｃ）領域がヒト配列で置き換えられる。これは、可変（Ｖ）領域及び異種免疫グロブリンＣ領域を含む融合ポリペプチドであり得る。いくつかの型では、該相補性決定領域（ＣＤＲ）は、非ヒト抗体配列を含み、該Ｖフレームワーク領域もまたヒト配列に変わっている。例えば、ＥＰ０３２９４００を参照されたい。いくつかの型では、Ｖ領域は、ヒト及びマウスのＶ領域のコンセンサス配列を設計し、コンセンサス配列間で異なるＣＤＲ外の残基を変えることによってヒト化される。
原則として、ヒト化抗体のフレームワーク配列は、ＣＤＲグラフティングの鋳型の役割を果たす。しかしながら、かかるフレームワークへの直接のＣＤＲ置換は、抗原に対する結合親和性の重大な損失につながり得ることが示されている。Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２６０６、Ｔｅｍｐｅｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：２６６、及びＳｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７：２１７。ヒト抗体（ＨｕＡｂ）の元のマウス抗体（ｍｕＡｂ）に対する相同性が高いほど、ヒトフレームワークが、親和性を低下させ得るマウスＣＤＲへの歪みを導入しにくくなる。抗体配列データベースに対する配列相同性検索を基にすると、ＨｕＡｂ ＩＣ４は、ｍｕＭ４ＴＳ．２２に対してフレームワーク相同性が良好であるが、高度の相同性を示す他のＨｕＡｂ、特に、ヒトサブグループＩのカッパＬ鎖またはヒトサブグループＩＩＩのＨ鎖も同様に適する。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７）。ＥＮＣＡＤ（Ｌｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５）等の様々なコンピュータプログラムが、該Ｖ領域の理想的な配列を予測するために利用可能である。本発明は、従って、異なる可変（Ｖ）領域を有するＨｕＡｂを包含する。適切なＶ領域配列を特定し、これらの配列を最適化することは、当業者の技術の範囲内である。免疫原性が低下した抗体を得る方法は、米国特許第５，２７０，２０２号及びＥＰ６９９，７５５にも記載されている。
ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、該親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製され得る。三次元免疫グロブリンモデルは当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配座構造を例示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このように、標的抗原（複数可）に対する親和性の増加等の所望の抗体の特徴が達成されるように、ＦＲ残基が該コンセンサス及び移入配列から選択され、組み合わせられ得る。
対象の抗原結合単位のヒト化のプロセスは、以下のようになり得る。最良適合生殖細胞系列アクセプターの重鎖及び軽鎖可変領域は、グラフティング用のヒト抗体生殖細胞系列の相同性、標準構造及び物理的特性に基づいて選択される。ｍＶＨ／ＶＬ対グラフトｈＶＨ／ＶＬのコンピュータモデリングが行われ、プロトタイプのヒト化抗体配列が生成される。モデリングでフレームワークの逆突然変異の必要性が指示された場合、指示されたＦＷの変更を有する第二のバリアントが生成される。選択された生殖細胞系列フレームワーク及びマウスＣＤＲをコードするＤＮＡ断片が合成される。合成されたＤＮＡ断片は、ＩｇＧ発現ベクターにサブクローニングされ、配列はＤＮＡシーケンシングによって確認される。該ヒト化抗体は２９３Ｆ等の細胞で発現され、該タンパク質は、例えば、ＭＤＭ食作用アッセイ及び抗原結合アッセイで試験される。ヒト化抗原結合単位は、例えば、該標的抗原を発現する細胞のＦＡＣＳによって、抗原結合親和性において親抗原結合単位と比較される。該親和性が親抗原結合単位よりも２倍以上低い場合、２回目のヒト化バリアントを生成して上記のように試験することができる。
上記のように、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、「一価」または「多価」のいずれかであり得る。前者は抗原結合単位ごとに１つの結合部位を有するが、後者は同じまたは異なる種類の複数の抗原に結合することが可能な複数の結合部位を含む。結合部位の数に応じて、抗原結合単位は、二価（２つの抗原結合部位を有する）、三価（３つの抗原結合部位を有する）、四価（４つの抗原結合部位を有する）等であり得る。
多価抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、それらの結合特異性に基づいてさらに分類され得る。「単一特異性」抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、同じ種類の１つ以上の抗原に結合することが可能な分子である。「多重特異性」抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する分子である。かかる分子は、通常２つの異なる抗原のみに結合する（すなわち、二重特異性抗ＣＬＤＮ１８．２抗体）が、三重特異性抗体等のさらなる特異性を有する抗体は、本明細書で使用される場合、この表現によって包含される。本開示はさらに、多重特異性抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を提供する。多重特異性抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に結合することが可能な多価分子であり、例えば、それぞれ２つ及び３つの異なる抗原に対して結合特異性を示す二重特異性及び三重特異性分子である。
ポリヌクレオチド及びベクター
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のいずれかをコードする単離された核酸を提供する。別の実施形態では、本開示は、本明細書に開示する任意の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体をコードする核酸配列を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の軽鎖ＣＤＲ及び重鎖ＣＤＲをコードする単離された核酸を提供する。
対象の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、組み換えＤＮＡ技術、合成化学技術、またはそれらの組み合わせによって調製され得る。例えば、軽鎖ＣＤＲ及び重鎖ＣＤＲを含めた抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の所望の成分をコードする配列は、通常、当技術分野で既知の標準的な分子技術を使用して発現ベクターにクローン化されて組み立てられる。これらの配列は、所望のタンパク質配列をコードする他のベクターから組み立てられる場合もあれば、それぞれの鋳型核酸を使用してＰＣＲで産生された断片から組み立てられる場合もあり、所望の配列をコードする合成オリゴヌクレオチドの集合によって組み立てられる場合もある。発現系は、目的の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を含む発現ベクターで適切な細胞をトランスフェクトすることによって創出され得る。
既存の抗体の軽鎖または重鎖の様々な領域に対応するヌクレオチド配列は、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、及びＤＮＡシーケンシングが挙げられるがこれらに限定されない従来の技術を使用して容易に取得及び配列決定することができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、抗体ヌクレオチド配列の好ましい供給源の役割を果たす。数々のモノクローナル抗体を産生する膨大な数のハイブリドーマ細胞は、公的リポジトリから得てもよいし、私的なリポジトリから得てもよい。最大の寄託機関はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ａｔｃｃ．ｏｒｇ）であり、これは特徴がはっきりしたハイブリドーマ細胞株の多様なコレクションを提供する。別の方法として、抗体ヌクレオチドは、免疫付与または非免疫付与げっ歯類またはヒトから得ることができ、脾臓及び末梢血リンパ球等の器官を形成することができる。抗体ヌクレオチドの抽出及び合成に適用可能な特定の技術は、Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ８６：３８３３－３８３７、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６０：１２５０－１２５５、Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：５７２８－５７３２、及び米国特許第５，９６９，１０８号に記載されている。
抗ＣＬＤＮ１８．２抗体をコードするポリヌクレオチドもまた、例えば、相同非ヒト配列の代わりに、ヒト重鎖及び軽鎖定常領域のコード配列を置換することによって修飾することができる。そのようにして、元の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の結合特異性を保持するキメラ抗体が調製される。
本開示で具体化されるポリヌクレオチドは、例示されたポリペプチドの機能的同等物をコードするもの及びその断片を含むことも理解される。機能的に同等のポリペプチドとしては、それによってコードされるポリペプチドの特性を高める、減少させる、またはそれに対して大きな影響を及ぼさないものが挙げられる。機能的同等物は、保存的アミノ酸置換を有するポリペプチド、融合物を含む類似体、及び突然変異体であり得る。
遺伝暗号の縮退のために、抗原結合単位のコード配列のヌクレオチド、ならびに本発明のポリヌクレオチド及びベクターの構築に適した配列にはかなりの変動があり得る。配列バリアントは、修飾ＤＮＡまたはアミノ酸配列を有する場合もあれば、１つ以上の置換、欠失、または付加を有する場合もあり、その正味の効果は、所望の抗原結合活性を保持することである。例えば、コードされたアミノ酸を変更しないか、または保存的な変化をもたらす様々な置換を該コード領域で行うことができる。これらの置換は、本発明に包含される。保存的アミノ酸置換としては、以下の群内の置換が挙げられる：グリシンとアラニン、バリンとイソロイシンとロイシン、アスパラギン酸とグルタミン酸、アスパラギンとグルタミン、セリンとスレオニン、リジンとアルギニン、及びフェニルアラニンとチロシン。保存的置換は、産生されるポリペプチドに含まれる１つ以上のアミノ酸残基を効果的に変化させるが、該置換は、得られる産生されるべき抗原結合単位の抗原結合活性を妨害するものとは予想されない。コードされたアミノ酸残基を変更しないヌクレオチド置換は、異なる系での遺伝子発現を最適化するのに有用である。適切な置換は当業者に知られており、例えば、発現系における好ましいコドン使用頻度を反映するために行われる。
所望の場合、該組み換えポリヌクレオチドは、発現の検出及び遺伝子産物の精製を容易にする異種配列を含んでもよい。かかる配列の例は当技術分野で既知であり、β－ガラクトシダーゼ、β－ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びそれらの誘導体等のレポータータンパク質をコードするものを含む。精製を容易にする他の異種配列は、Ｍｙｃ、ＨＡ（インフルエンザウイルス血球凝集素由来）、Ｈｉｓ－６、ＦＬＡＧ、または免疫グロブリンのＦｃ部分、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のエピトープをコードし得る。
本明細書に開示するポリヌクレオチドは、上記の様々な化学的に機能的な部分にコンジュゲートすることができる。一般に使用される部分としては、検出可能なシグナルを産生することが可能な標識、シグナルペプチド、免疫学的反応性を高める薬剤、固体支持体への結合を促進する薬剤、ワクチン担体、生体応答修飾因子、常磁性標識及び薬物が挙げられる。該部分は、ポリヌクレオチドに、組み換え的に共有結合される場合もあれば、当技術分野で既知の他の手段によって共有結合される場合もある。
本明細書に開示するポリヌクレオチドは、さらなる配列、例えば、同じ転写単位内のさらなるコード配列、制御要素、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、及びポリアデニル化部位、同じまたは異なるプロモーターの制御下のさらなる転写単位、宿主細胞のクローニング、発現、及び形質転換を可能にする配列、ならびに本発明の実施形態を提供するのに望ましい可能性がある任意の構築物を含むことができる。
本明細書に開示するポリヌクレオチドは、化学合成、組み換えクローニング法、ＰＣＲ、またはそれらの任意の組み合わせを使用して得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は当技術分野で周知であり、本明細書で詳細に説明する必要はない。当業者は、本明細書に提供する配列データを使用し、ＤＮＡ合成装置を使用することによって、または商業サービスに発注することによって、所望のポリヌクレオチドを得ることができる。
所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入することができ、これを次に複製及び増幅のために適切な宿主細胞に導入することができる。従って、上記のポリヌクレオチドの１つ以上を含む様々なベクターが本明細書で企図される。本明細書に開示する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体をコードする少なくとも１つのベクターを含む発現ベクターの選択可能なライブラリもまた提供する。
ベクターは一般に、抗原結合単位を発現するために必要な転写または翻訳調節配列を含む。適切な転写または翻訳調節配列としては、複製起点、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー結合領域、転写開始部位、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、ならびに転写及び翻訳の終結部位が挙げられるが、これらに限定されない。
プロモーターの選択は、ベクターが導入される宿主細胞に大きく依存する。かかる調節配列が宿主細胞系と適合するという条件で、所望の軽鎖または重鎖遺伝子に通常関連するプロモーターを利用することも可能である。細胞特異的または組織特異的プロモーターを使用してもよい。極めて多様な組織特異的プロモーターがその分野の技術者によって特徴づけられ、使用されている。選択的動物細胞で作動する例示的なプロモーターとしては、肝細胞特異的プロモーター及び心筋特異的プロモーターが挙げられる。レシピエントの細胞型の選択に応じて、当業者には、本発明の発現ベクターの構築に適用可能な他の適切な細胞特異的または組織特異的プロモーターが分かるであろう。
既知の分子クローニングまたは遺伝子工学技術を使用して、適切な転写調節配列、エンハンサー、ターミネーター、または当技術分野で既知の任意の他の遺伝要素を、作動可能な関係で、任意にさらに、本発明に従って発現される無傷の選択可能な融合遺伝子とともに組み込むことができる。上記の要素に加えて、該ベクターは、選択可能なマーカー（例えば、該ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子）を含み得るが、かかるマーカー遺伝子は、該宿主細胞にともに導入される別のポリヌクレオチド配列でもたらすことができる。
本明細書に記載のポリヌクレオチド及びベクターには、いくつかの特定の用途がある。それらは、例えば、抗原結合単位の産生のための発現系において有用である。かかるポリヌクレオチドは、所望のポリヌクレオチドの増幅をもたらすためのプライマーとして有用である。さらに、ポリヌクレオチドは、ワクチン、診断薬、及び薬物を含めた医薬組成物にも有用である。
該宿主細胞は、とりわけ、対象のポリヌクレオチド、ベクターのリポジトリとして使用される場合もあれば、所望の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体をそれらの抗原結合特異性に基づいて産生及びスクリーニングするための媒体として使用される場合もある。
従って、本開示は、所望の抗原と免疫反応性である抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を識別する方法を提供する。かかる方法は、以下のステップを含み得る：（ａ）抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の遺伝的に多様なライブラリを調製するステップ。該ライブラリは、少なくとも１つの対象の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を含む。（ｂ）該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のライブラリを所望の抗原と接触させるステップ。（ｃ）抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と該抗原間の特異的結合を検出し、それにより、所望の抗原と免疫反応性である抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を識別するステップ。
所望の抗原に特異的に結合する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の能力は、当技術分野で確立された様々な手順によって調べることができる。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｇｈｅｒａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２６：６１－６８を参照されたい。通常、所望の結合特異性を示す抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、イムノアッセイによって、例えば、標識抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を、固体支持体または基材に固定化された抗原と反応させることによって、直接検出することができる。一般に、抗原を付着させる基材は、イムノアッセイでの非特異的結合のレベルが低い材料で製造される。例示的な固体支持体は、以下のタイプの材料のうちの１つ以上から作製される：プラスチックポリマー、ガラス、セルロース、ニトロセルロース、半導体材料、及び金属。いくつかの例では、該基材は、ペトリ皿、クロマトグラフィービーズ、磁気ビーズ等である。
かかる固相アッセイでは、未反応の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、洗浄により除去される。しかしながら、液相アッセイでは、未反応の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ろ過またはクロマトグラフィー等の他の分離技術によって除去される。該抗原を標識抗ＣＬＤＮ１８．２抗体に結合させた後、結合した標識の量が特定される。この技術の変形は、競合アッセイであり、この場合、該抗原は、元の結合分子と飽和するまで結合される。該対象の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の集団が複合体に導入されると、より高い結合親和性を示すものだけが競合することができるため、該抗原に結合したまま残る。
別の方法として、所与の抗原への特異的結合は、細胞選別によって評価することができ、これは、選別する細胞上に所望の抗原を提示し、次に、検出可能な薬剤に結合された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体で該標的細胞を標識し、続いて細胞選別機にて、標識された細胞を未標識のものから分離することを含む。精巧な細胞分離法は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）である。細い流れで１列縦隊にて移動する細胞は、レーザービームに通され、蛍光標識された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体が結合した各細胞の蛍光がその後測定される。
溶出した抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のその後の分析には、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を描写するためのタンパク質シーケンシングが含まれ得る。推定アミノ酸配列に基づいて、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体をコードするｃＤＮＡは、その後、ＰＣＲ、ライブラリスクリーニング、既存の核酸データベースでの相同性検索、またはそれらの任意の組み合わせを含めた組み換えクローニング法によって得ることができる。一般に使用されるデータベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ、及びＨＴＧＳが挙げられるが、これらに限定されない。
抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のライブラリがファージまたは細菌粒子上で提示される場合、選択は、好ましくは、アフィニティークロマトグラフィーを使用して行われる。該方法は通常、ファージ抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のライブラリを抗原でコーティングされたプレート、カラムのマトリックス、細胞またはビオチン化抗原に溶液中で結合させた後、捕捉することにより進める。該固相に結合したファージまたは細菌は洗浄され、次に可溶性ハプテン、酸またはアルカリによって溶出される。別の方法として、増加する濃度の抗原を使用して、親和性マトリックスから抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を解離させることができる。該抗原に対する親和性または結合力が非常に高いある特定の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の場合、ＷＯ９２／０１０４７に記載の通り、効率的な溶出には高ｐＨまたは穏やかな還元溶液が必要になる場合がある。
選択の効率は、洗浄過程での解離速度を含めたいくつかの要因の組み合わせ、及び単一のファージまたは細菌上で複数の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体が同時に固体支持体上の抗原に結合することができるかどうかに依存する可能性がある。例えば、解離速度が速い（及び結合親和性が弱い）抗体は、短時間の洗浄、多価提示及び固体支持体での抗原の高コーティング密度の使用によって保持され得る。逆に、解離速度が遅い（及び結合親和性が良好な）抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の選択は、長時間の洗浄、一価ファージ、及び抗原の低コーティング密度を使用することが有利であり得る。
所望の場合、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のライブラリを、関連のない抗原に対して予め選択を行い、望ましくない抗体を対抗選択することができる。該ライブラリを、例えば、抗イディオタイプ抗体を単離するために、関連抗原に対して予め選択を行ってもよい。
宿主細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のいずれか１つを発現する宿主細胞を提供する。対象の宿主細胞は、通常、本明細書に開示する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のいずれか１つをコードする核酸を含む。
本発明は、上記のポリヌクレオチド、ベクター、または該ベクターのライブラリでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。該ベクターは、エレクトロポレーション、微粒子銃、リポフェクション、感染（該ベクターが感染因子に結合されている場合）、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストラン、または他の物質を使用したトランスフェクションを含めたいくつかの適切な手段のいずれかによって適切な原核細胞または真核細胞に導入され得る。ベクターを導入するための手段の選択は、多くの場合、宿主細胞の特徴に依存する。
ほとんどの動物細胞では、上記の方法のいずれかがベクター送達に適する。好ましい動物細胞は、外因的に導入された遺伝子産物を、例えばミリグラムレベルで大量に発現することが可能な脊椎動物細胞、好ましくは、哺乳類細胞である。好ましい細胞の非限定的な例は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、及びＣＨＯ細胞である。
適切な宿主細胞に導入されると、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の発現は、当技術分野で既知の任意の核酸またはタンパク質アッセイを使用して特定することができる。例えば、軽鎖ＣＤＲもしくは重鎖ＣＤＲの転写されたｍＲＮＡ、または抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の存在は、従来のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロット分析）、増幅手段（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）、ＳＡＧＥ（米国特許第５，６９５，９３７号）、及びアレイベース技術（例えば、米国特許第５，４０５，７８３号、第５，４１２，０８７号及び第５，４４５，９３４号参照）によって、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体をコードするポリヌクレオチドの任意の領域に相補的なプローブを用いて検出及び／または定量化され得る。
該ベクターの発現は、発現された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を調べることによっても特定され得る。タンパク質分析のための様々な技術が当技術分野で利用可能である。それらとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫放射定量測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量測定法、インサイチュイムノアッセイ（例えば、金コロイド、酵素または放射性標識を使用）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ、及びＳＤＳ－ＰＡＧＥが挙げられるが、これらに限定されない。
ペイロード
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、さらにペイロードにコンジュゲートされる。いくつかの例では、該ペイロードは、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体に直接コンジュゲートされる。他の例では、該ペイロードは、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体にリンカーを介して間接的にコンジュゲートされる。場合によっては、該ペイロードは、小分子、タンパク質もしくはその機能的断片、ペプチド、または核酸ポリマーを含む。
場合によっては、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体にコンジュゲートされるペイロードの数（例えば、薬物対抗体比またはＤＡＲ）は、約１：１、すなわち、１つの抗ＣＬＤＮ１８．２抗体に対して１つのペイロードである。場合によっては、該ペイロード対該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の比は、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１である。場合によっては、該ペイロード対該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の比は、約２：１である。場合によっては、該ペイロード対該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の比は、約３：１である。場合によっては、該ペイロード対該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の比は、約４：１である。場合によっては、該ペイロード対該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の比は、約６：１である。場合によっては、該ペイロード対該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の比は、約８：１である。場合によっては、該ペイロード対該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の比は、約１２：１である。
いくつかの実施形態では、該ペイロードは、小分子である。いくつかの例では、該小分子は、細胞毒性ペイロードである。例示的な細胞毒性ペイロードとしては、微小管破壊剤、ＤＮＡ修飾剤、またはＡｋｔ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、該ペイロードは、微小管破壊剤を含む。例示的な微小管破壊剤としては、２－メトキシエストラジオール、アウリスタチン、カルコン、コルヒチン、コンブレタスタチン、クリプトフィシン、ジクチオスタチン、ディスコデルモリド、ドラスタイン（ｄｏｌａｓｔａｉｎ）、エリュテロビン、エポチロン、ハリコンドリン、ラウリマリド、メイタンシン、ノスカピノイド、パクリタキセル、ペロルシド、ホモプシン、ポドフィロトキシン、リゾキシン、スポンギスタチン、タキサン、ツブリシン、ビンカアルカロイド、ビノレルビン、またはそれらの誘導体もしくは類似体が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、該ツブリシンは、ツブリシン類似体または誘導体、例えば、米国特許第８５８０８２０号及び第８９８０８３３号ならびに米国公開第２０１３０２１７６３８号、第２０１３０２２４２２８号、及び第２０１４００３６３４５４号に記載のものである。
いくつかの実施形態では、該メイタンシンは、メイタンシノイドである。いくつかの実施形態では、該メイタンシノイドは、ＤＭ１、ＤＭ４、またはアンサミトシンである。いくつかの実施形態では、該メイタンシノイドは、ＤＭ１である。いくつかの実施形態では、該メイタンシノイドは、ＤＭ４である。いくつかの実施形態では、該メイタンシノイドは、アンサミトシンである。いくつかの実施形態では、該メイタンシノイドは、メイタンシノイド誘導体または類似体、例えば、米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号、第７２７６４９７号、及び第６７１６８２１号または米国公開第２０１３０２９９００号及び第ＵＳ２０１３０３２３２６８号に記載のものである。
いくつかの実施形態では、該ペイロードは、ドラスタチン、またはその誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、該ドラスタチンは、ドラスタチン１０もしくはドラスタチン１５、またはそれらの誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施形態では、該ドラスタチン１０類似体は、アウリスタチン、ソブリドチン、シンプロスタチン１、またはシンプロスタチン３である。いくつかの実施形態では、該ドラスタチン１５類似体は、セマドチンまたはタシドチンである。
いくつかの実施形態では、該ドラスタチン１０類似体は、アウリスタチンまたはアウリスタチン誘導体である。いくつかの実施形態では、該アウリスタチンまたはアウリスタチン誘導体は、アウリスタチンＥ（ＡＥ）、アウリスタチンＦ（ＡＦ）、アウリスタチンＥ５－ベンゾイル吉草酸エステル（ＡＥＶＢ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、またはモノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、アウリスタチンＰＥ、またはアウリスタチンＰＹＥである。いくつかの実施形態では、該アウリスタチン誘導体は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態では、該アウリスタチン誘導体は、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である。いくつかの実施形態では、該アウリスタチンは、アウリスタチン誘導体または類似体、例えば、米国特許第６８８４８６９号、第７６５９２４１号、第７４９８２９８号、第７９６４５６６号、第７７５０１１６号、第８２８８３５２号、第８７０３７１４号、及び第８８７１７２０号に記載のものである。
いくつかの実施形態では、該ペイロードは、ＤＮＡ修飾剤を含む。いくつかの実施形態では、該ＤＮＡ修飾剤は、ＤＮＡ開裂剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ転写阻害剤、またはＤＮＡ架橋剤を含む。いくつかの例では、該ＤＮＡ開裂剤は、ブレオマイシンＡ２、カリケアマイシン、またはそれらの誘導体もしくは類似体を含む。いくつかの例では、該ＤＮＡ挿入剤は、ドキソルビシン、エピルビシン、ＰＮＵ－１５９６８２、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、オリゴマイシンＣ、ダウノルビシン、バルルビシン、トポテカン、またはそれらの誘導体もしくは類似体を含む。いくつかの例では、該ＤＮＡ転写阻害剤は、ダクチノマイシンを含む。いくつかの例では、該ＤＮＡ架橋剤はマイトマイシンＣを含む。
いくつかの実施形態では、該ＤＮＡ修飾剤は、アムサクリン、アントラサイクリン、カンプトテシン、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、エンジイン、エトポシド、インドリノベンゾジアゼピン、ネトロプシン、テニポシド、またはそれらの誘導体もしくは類似体を含む。
いくつかの実施形態では、該アントラサイクリンは、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、ネモルビシン、ピキサントロン、サバルビシン、またはバルルビシンである。
いくつかの実施形態では、該カンプトテシンの類似体は、トポテカン、イリノテカン、シラテカン、コシテカン、エキサテカン、ラルトテカン、ジャイマテカン、ベロテカン、ルビテカン、またはＳＮ－３８である。
いくつかの実施形態では、該デュオカルマイシンは、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、またはＣＣ－１０６５である。いくつかの実施形態では、該エンジインは、カリケアマイシン、エスペラミシン、またはダイネミシンＡである。
いくつかの実施形態では、該ピロロベンゾジアゼピンは、アントラマイシン、アベイマイシン、チカマイシン、ＤＣ－８１、マゼトラマイシン、ネオトラマイシンＡ、ネオトラマイシンＢ、ポロトラマイシン、プロトラカルシン、シバノミシン（ＤＣ－１０２）、シビロマイシン、またはトマイマイシンである。いくつかの実施形態では、該ピロロベンゾジアゼピンは、トマイマイシン誘導体、例えば、米国特許第８４０４６７８号及び第８１６３７３６号に記載されているものである。いくつかの実施形態では、該ピロロベンゾジアゼピンは、例えば、米国特許第８４２６４０２号、第８８０２６６７号、第８８０９３２０号、第６５６２８０６号、第６６０８１９２号、第７７０４９２４号、第７０６７５１１号、第ＵＳ７６１２０６２号、第７２４４７２４号、第７５２８１２６号、第７０４９３１１号、第８６３３１８５号、第８５０１９３４号、及び第８６９７６８８号ならびに米国公開第ＵＳ２０１４０２９４８６８号に記載のものである。
いくつかの実施形態では、該ピロロベンゾジアゼピンは、ピロロベンゾジアゼピンダイマーである。いくつかの実施形態では、該ＰＢＤダイマーは、対称性ダイマーである。対称性ＰＢＤダイマーの例としては、ＳＪＧ－１３６（ＳＧ－２０００）、ＺＣ－４２３（ＳＧ２２８５）、ＳＪＧ－７２０、ＳＪＧ－７３８、ＺＣ－２０７（ＳＧ２２０２）、及びＤＳＢ－１２０が挙げられるが、これらに限定されない（表２）。いくつかの実施形態では、該ＰＢＤダイマーは、非対称性ダイマーである。非対称性ＰＢＤダイマーの例としては、ＳＪＧ－１３６誘導体、例えば、米国特許第８６９７６８８号及び第９２４２０１３号ならびに米国公開第２０１４０２８６９７０号に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、該ペイロードは、Ａｋｔ阻害剤を含む。場合によっては、該Ａｋｔ阻害剤はイパタセルチブ（ＧＤＣ－００６８）またはその誘導体を含む。
いくつかの実施形態では、該ペイロードは、ポリメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、ａ－アマニチン、及びポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤が挙げられるがこれらに限定されないポリメラーゼ阻害剤を含む。例示的なＰＡＲＰ阻害剤としては、イニパリブ（ＢＳＩ２０１）、タラゾパリブ（ＢＭＮ－６７３）、オラパリブ（ＡＺＤ－２２８１）、オラパリブ、ルカパリブ（ＡＧ０１４６９９、ＰＦ－０１３６７３３８）、ベリパリブ（ＡＢＴ－８８８）、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ４８２７、ＢＧＢ－２９０、または３－アミノベンズアミドが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、該ペイロードは、検出可能な部分を含む。例示的な検出可能な部分としては、蛍光色素、酵素、基質、化学発光部分、特異的結合部分、例えば、ストレプトアビジン、アビジン、もしくはビオチン、または放射性同位体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、該ペイロードは、免疫調節薬を含む。有用な免疫調節薬としては、腫瘍に対するホルモン作用を遮断する抗ホルモン剤、及びサイトカイン産生を抑制する、自己抗原発現を下方制御する、またはＭＨＣ抗原をマスクする免疫抑制剤が挙げられる。例示的な抗ホルモン剤としては、抗エストロゲン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダゾール類、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン、ならびに抗アンドロゲン剤、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン、ならびに抗副腎剤が挙げられる。実例となる免疫抑制剤としては、２－アミノ－６－アリール－５－置換ピリミジン、アザチオプリン、シクロホスファミド、ブロモクリプチン、ダナゾール、ダプソン、グルタルアルデヒド、ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体、シクロスポリンＡ、ステロイド、例えば、グルココルチコステロイド、ストレプトキナーゼ、またはラパマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、該ペイロードは、免疫変調成分を含む。例示的な免疫変調成分としては、ガンシクロビル、エタネルセプト、タクロリムス、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキストレート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘｔｒａｔｅ）、グルココルチコイド及びその類似体、キサンチン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、造血因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（例えば、ＴＮＦα）、インターロイキン（例えば、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、及びＩＬ－２１）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、インターフェロン（例えば、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－ベータ、インターフェロン－ガンマ）、「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞成長因子、エリスロポエチン及びトロンボポエチン、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、該ペイロードは、免疫毒素を含む。免疫毒素としては、リシン、放射性核種、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、緑膿菌外毒素Ａ、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖、真菌毒素、例えば、レストリクトシン及びホスホリパーゼ酵素が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｔｏｘｉｎｓ，”Ｏｌｓｎｅｓ ａｎｄ Ｐｉｈｌ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．１５：３５５－３８１（１９８１）、及び“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，”ｅｄｓ．Ｂａｌｄｗｉｎ ａｎｄ Ｂｙｅｒｓ，ｐｐ．１５９－１７９， ２２４－２６６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照されたい。
いくつかの例では、該ペイロードは、核酸ポリマーを含む。かかる場合には、該核酸ポリマーは、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。他の例では、該核酸ポリマーは、例えば、細胞毒性タンパク質もしくはペプチド、またはアポトーシス誘発タンパク質もしくはペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。例示的な細胞毒性タンパク質またはペプチドとしては、細菌の細胞毒素、例えば、アルファ－孔形成毒素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来細胞溶解素Ａ）、ベータ－孔形成毒素（例えば、α溶血素、ＰＶＬ、すなわち、ｐａｎｔｏｎ Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ、アエロリシン、クロストリジウムイプシロン毒素、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓエンテロトキシン）、二成分毒素（炭疽毒素、浮腫毒素、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｃ２毒素、Ｃ ｓｐｉｒｏｆｏｍｅ毒素、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｉｏｔａ毒素、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細胞致死毒素（Ａ及びＢ））、プリオン、パラスポリン、コレステロール依存性細胞溶解素（例えば、ニューモリシン）、小膜孔形成毒素（例えば、グラミシジンＡ）、シアノトキシン（例えば、ミクロシスチン、ノジュラリン）、血液毒、神経毒素（例えば、ボツリヌス神経毒素）、細胞毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素Ａ、破傷風毒素、または免疫毒素（イダルビシン、リシンＡ、ＣＲＭ９、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ＤＴ）が挙げられる。例示的なアポトーシス誘発タンパク質またはペプチドとしては、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子－１（Ａｐａｆ－１）、チトクローム－ｃ、カスパーゼイニシエータータンパク質（ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０）、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、ｐ５３、ｐ７３、ｐ６３、Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、グランザイムＢ、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、及びＰ２１活性化キナーゼ２（ＰＡＫ２）が挙げられる。さらなる例では、該核酸ポリマーは、核酸デコイを含む。いくつかの例では、該核酸デコイは、タンパク質結合核酸の模倣体、例えば、ＲＮＡベースのタンパク質結合模倣体である。例示的な核酸デコイとしては、転写促進領域（ＴＡＲ）デコイ及びＲｅｖ応答配列（ＲＲＥ）デコイが挙げられる。
場合によっては、該ペイロードはアプタマーである。アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドまたはペプチド低分子である。例示的な核酸アプタマーとしては、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、または１つ以上の非天然ヌクレオチドを含むＲＮＡ及び／またはＤＮＡアプタマーであるＸＮＡアプタマーが挙げられる。例示的な核酸アプタマーとしては、ＡＲＣ１９４９９（Ａｒｃｈｅｍｉｘ Ｃｏｒｐ．）、ＲＥＧ１（Ｒｅｇａｄｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＡＲＣ１９０５（Ｏｐｈｔｈｏｔｅｃｈ）が挙げられる。
本明細書に記載の実施形態による核酸は、任意に、天然に存在する核酸、または１つ以上のヌクレオチド類似体を含むか、そうでなければ天然に存在する核酸の構造とは異なる構造を有する。例えば、２’－修飾には、ハロ、アルコキシ、及びアリルオキシ基が含まれる。いくつかの実施形態では、２’－ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮから選択される基で置き換えられ、ここで、Ｒは、Ｃ１－Ｃ６アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。修飾された結合の例としては、ホスホロチオエート及び５’－Ｎ－ホスホルアミダイト結合が挙げられる。
様々な異なるヌクレオチド類似体、修飾された骨格、または天然に存在しないヌクレオシド間結合を有する核酸が、本明細書に記載の実施形態に従って利用される。場合によっては、核酸は、天然のヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）または修飾ヌクレオシドを含む。修飾ヌクレオチドの例としては、塩基修飾ヌクレオシド（例えば、アラシチジン、イノシン、イソグアノシン、ネブラリン、プソイドウリジン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノプリン、２－チオチミジン、３－デアザ－５－アザシチジン、２’－デオキシウリジン、３－ニトロピロール、４－メチルインドール、４－チオウリジン、４－チオチミジン、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、２－チオウリジン、５－ブロモシチジン、５－ヨードウリジン、イノシン、６－アザウリジン、６－クロロプリン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－アザアデノシン、８－アジドアデノシン、ベンズイミダゾール、Ｍ１－メチルアデノシン、ピロロ－ピリミジン、２－アミノ－６－クロロプリン、３－メチルアデノシン、５－プロピニルシチジン、５－プロピニルウリジン、５－ブロモウリジン、５－フルオロウリジン、５－メチルシチジン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、及び２－チオシチジン）、化学的または生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、修飾された糖（例えば、２’－フルオロリボース、２’－アミノリボース、２’－アジドリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、Ｌ－エナンチオマーヌクレオシドアラビノース、及びヘキソース）、修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’－Ｎ－ホスホルアミダイト結合）、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。核酸の化学合成のための天然及び修飾ヌクレオチドモノマーは、容易に入手可能である。場合によっては、かかる修飾を含む核酸は、天然に存在するヌクレオチドのみからなる核酸と比較して、改善された特性を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸修飾を利用して、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ等）による消化が減少及び／または防止される。例えば、核酸の構造は、一方または両方の鎖の３’末端にヌクレオチド類似体を含めることによって消化を減少させることで安定化され得る。
異なるヌクレオチド修飾及び／または骨格構造は、核酸の様々な位置に存在してもよい。かかる修飾としては、モルフォリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホルアミダイト、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
コンジュゲーションの化学
いくつかの例では、該ペイロードは、ネイティブライゲーションによって本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体にコンジュゲートされる。いくつかの例では、該コンジュゲーションは、以下に記載のものである：Ｄａｗｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４，２６６，７７６－７７９、Ｄａｗｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｔｈｉｏｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，４３２５－４３２９、Ｈａｃｋｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ：Ｅｘｐａｎｄｅｄ ｓｃｏｐｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９９， ９６， １００６８－１００７３、またはＷｕ，ｅｔ ａｌ．“Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｆｒｅｅ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ，”Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００６， ４５， ４１１６－４１２５。いくつかの例では、該コンジュゲーションは、米国特許第８，９３６，９１０号に記載のものである。
いくつかの例では、該ペイロードは、「トレースレス」カップリング技術（Ｐｈｉｌｏｃｈｅｍ）を利用する部位特異的方法によって、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体にコンジュゲートされる。いくつかの例では、該「トレースレス」カップリング技術は、結合部分のＮ末端１，２－アミノチオール基を利用し、これを、その後アルデヒド基を含むポリ核酸分子とコンジュゲートする（Ｃａｓｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇｓ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｏｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ＪＡＣＳ １３４（１３）：５８８７－５８９２（２０１２）参照）。
いくつかの例では、該ペイロードは、該結合部分に組み込まれた非天然アミノ酸を利用する部位特異的方法によって、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体にコンジュゲートされる。いくつかの例では、該非天然アミノ酸は、ｐ－アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）を含む。いくつかの例では、ｐＡｃＰｈｅのケト基は、アルコキシ－アミン誘導コンジュゲート部分に選択的に結合され、オキシム結合を形成する（Ａｘｕｐ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，”ＰＮＡＳ １０９（４０）：１６１０１－１６１０６（２０１２）参照）。
いくつかの例では、該ペイロードは、酵素触媒プロセスを利用する部位特異的方法によって、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体にコンジュゲートされる。いくつかの例では、該部位特異的方法は、ＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術（Ｒｅｄｗｏｏｄ）を利用する。いくつかの例では、該ＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術は、アルデヒドタグの存在下での酸化プロセスによるホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によるシステインからのホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基の生成、及びそれに続くＦＧｌｙのアルキルヒドライン（ａｌｋｙｌｈｙｄｒａｉｎｅ）官能化ポリ核酸分子へのヒドラジノ－ピクテ－スペングラー（ＨＩＰＳ）ライゲーションを介したコンジュゲーションを含む。（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｔａｇ，”ＰＮＡＳ １０６（９）：３０００－３００５ （２００９）、Ａｇａｒｗａｌ，ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｐｉｃｔｅｔ－Ｓｐｅｎｇｌｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”ＰＮＡＳ １１０（１）：４６－５１（２０１３）参照）。
いくつかの例では、該酵素触媒プロセスは微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）を含む。場合によっては、該ペイロードは、微生物のトランスグルタミナーゼ触媒プロセスを利用して該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体にコンジュゲートされる。いくつかの例では、該ｍＴＧは、認識配列内のグルタミンのアミド側鎖と官能化ポリ核酸分子の一級アミンとの間の共有結合の形成を触媒する。いくつかの例では、ｍＴＧは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓから産生される（Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｍａｔｔｅｒｓ：ｓｉｔｅ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０（２）１６１－１６７（２０１３）参照）。
いくつかの例では、該ペイロードは、本明細書に記載の抗ＣＤ３８抗体、抗ＩＣＡＭ１抗体、または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗ＣＤ３８／ＩＣＡＭ１抗体）に、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１４０３１７号に記載の方法により、配列特異的トランスペプチダーゼを利用してコンジュゲートされる。
いくつかの例では、該ペイロードは、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体に、米国特許公開第２０１５／０１０５５３９号及び第２０１５／０１０５５４０号に記載の方法によりコンジュゲートされる。
リンカー
いくつかの例では、上記のリンカーは、分岐もしくは非分岐モノマーの長鎖、及び／または二次元もしくは三次元のモノマーの架橋ネットワークからなる天然または合成ポリマーを含む。いくつかの例では、該リンカーは、多糖類、リグニン、ゴム、またはポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）を含む。
いくつかの例では、該リンカーとしては、アルファ－，オメガ－ジヒドロキシルポリエチレングリコール、生分解性ラクトン系ポリマー、例えば、ポリアクリル酸、ポリラクチド酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリシアノアクリレート、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ、ＰＥＴＧ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＥ）、ポリテトラメチレングリコール（ＰＴＧ）、またはポリウレタン及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される、混合物とは、ブロックコポリマーに関してだけでなく、同じ化合物の中での異なるポリマーの使用も指す。場合によっては、ブロックコポリマーは、ポリマーの少なくとも１つのセクションが別のポリマーのモノマーから構築されるポリマーである。いくつかの例では、該リンカーは、ポリアルキレンオキシドを含む。いくつかの例では、該リンカーは、ＰＥＧを含む。いくつかの例では、該リンカーは、ポリエチレンイミド（ＰＥＩ）またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む。
場合によっては、該ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）は、多分散または単分散化合物である。いくつかの例では、多分散材料は、平均重量（重量平均）サイズ及び分散度によって特徴づけられる異なる分子量の該材料の分散分布を含む。いくつかの例では、該単分散ＰＥＧは、１つのサイズの分子を含む。いくつかの実施形態では、該リンカーは、多分散または単分散のポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）であり、示される分子量は、該ポリアルキレンオキシド、例えば、ＰＥＧ分子の分子量の平均を表す。
いくつかの実施形態では、該リンカーは、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）を含み、該ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）の分子量は、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または１００，０００Ｄａである。
いくつかの実施形態では、該ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）は、個別のＰＥＧ（ｄｉｓｃｒｅｔｅ ＰＥＧ）であり、該個別のＰＥＧは、２つ以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含むポリマーＰＥＧである。いくつかの例では、個別のＰＥＧ（ｄＰＥＧ）は、繰り返しエチレンオキシド単位を２～６０、２～５０、または２～４８個含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４２、４８、５０、またはそれを超える繰り返しエチレンオキシド単位を含む。いくつかの例では、ｄＰＥＧは、約２個以上の繰り返しエチレンオキシド単位を含む。場合によっては、ｄＰＥＧは、純粋な（例えば、約９５％、９８％、９９％、または９９．５％）出発物質から、段階的に単一分子量の化合物として合成される。場合によっては、ｄＰＥＧは平均分子量ではなく、特定の分子量を有する。場合によっては、本明細書に記載のｄＰＥＧは、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，ＬＭＤ製のｄＰＥＧである。
いくつかの例では、該リンカーは、任意に繰り返しエチレンオキシド単位を２～６０、２～５０、または２～４８個含む個別のＰＥＧである。場合によっては、該リンカーは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４２、４８、５０、またはそれを超える繰り返しエチレンオキシド単位を含むｄＰＥＧを含む。場合によっては、該リンカーは、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，ＬＭＤ製のｄＰＥＧである。
いくつかの実施形態では、該リンカーは、ポリペプチドリンカーである。いくつかの例では、該ポリペプチドリンカーは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれを超えるアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、該ポリペプチドリンカーは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、またはそれを超えるアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、該ポリペプチドリンカーは、多くとも２、３、４、５、６、７、８、またはそれより少ないアミノ酸残基を含む。場合によっては、該ポリペプチドリンカーは、開裂可能なポリペプチドリンカーである（例えば、酵素的または化学的に）。場合によっては、該ポリペプチドリンカーは、非開裂可能なポリペプチドリンカーである。いくつかの例では、該ポリペプチドリンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ、またはＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙを含む。いくつかの例では、該ポリペプチドリンカーは、ペプチド、例えば：Ｖａｌ－Ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ、またはＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙを含む。場合によっては、該ポリペプチドリンカーは、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、またはＬ－及びＤ－アミノ酸の両方の混合物を含む。
いくつかの例では、該リンカーは、ホモ二官能リンカーを含む。例示的なホモ二官能リンカーとしては、Ｌｏｍａｎｔ試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）ＤＳＰ、３’３’－ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ジスクシンイミジルタータレート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタータレート（スルホＤＳＴ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）、ジメチルアジプイミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメルイミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ）、ジメチル－３，３’－ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、１，４－ジ－３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ハロゲン化アリール含有化合物（ＤＦＤＮＢ）、例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンまたは１，３－ジフルオロ－４，６－ジニトロベンゼン、４，４’－ジフルオロ－３，３’－ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）、ビス－［β－（４－アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ－トルイジン、３，３’－ジメチルベンジジン、ベンジジン、α，α’－ｐ－ジアミノジフェニル、ジヨード－ｐ－キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’－エチレン－ビス（ヨードアセトアミド）、またはＮ，Ｎ’－ヘキサメチレン－ビス（ヨードアセトアミド）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、該リンカーは、ヘテロ二官能リンカーを含む。例示的なヘテロ二官能リンカーとしては、アミン反応性及びスルフヒドリル架橋剤、例えば、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＬＣ－ｓＰＤＰ）、水溶性長鎖Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（スルホ－ＬＣ－ｓＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル－６－［α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ－ＬＣ－ｓＭＰＴ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ｓＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＭＢ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ｓＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ－ｓＩＡＢ）、スクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ｓＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ－ｓＭＰＢ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＧＭＢ）、スクシンイミジル６－（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＸ）、スクシンイミジル６－［６－（（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ］ヘキサノエート（ｓＩＡＸＸ）、スクシンイミジル４－（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＩＡＣ）、スクシンイミジル６－（（（（４－ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン－１－カルボニル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＣＸ）、ｐ－ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）、カルボニル反応性及びスルフヒドリル反応性架橋剤、例えば、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシル－ヒドラジド－８（Ｍ２Ｃ２Ｈ）、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）、アミン反応性及び光反応性架橋剤、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（ＮＨｓ－ＡｓＡ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（スルホ－ＮＨｓ－ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル－（４－アジドサリチルアミド）ヘキサノエート（スルホ－ＮＨｓ－ＬＣ－ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル－２－（ｐ－アジドサリチルアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡｓＤ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドベンゾエート（ＨｓＡＢ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドベンゾエート（スルホ－ＨｓＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル－６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（スルホ－ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ－５－アジド－２－ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ－ＮＯｓ）、スルホスクシンイミジル－２－（ｍ－アジド－ｏ－ニトロベンズアミド）－エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＮＤ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（４－アジドフェニル）１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＤＰ）、Ｎ－スルホスクシンイミジル（４－アジドフェニル）－１，３’－ジチオプロピオネート（スルホ－ｓＡＤＰ）、スルホスクシンイミジル４－（ｐ－アジドフェニル）ブチレート（スルホ－ｓＡＰＢ）、スルホスクシンイミジル２－（７－アジド－４－メチルクマリン－３－アセトアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＥＤ）、スルホスクシンイミジル７－アジド－４－メチルクマリン－３－アセテート（スルホ－ｓＡＭＣＡ）、ｐ－ニトロフェニルジアゾピルベート（ｐＮＰＤＰ）、ｐ－ニトロフェニル－２－ジアゾ－３，３，３－トリフルオロプロピオネート（ＰＮＰ－ＤＴＰ）、スルフヒドリル反応性及び光反応性架橋剤、例えば、１－（ｐ－アジドサリチルアミド）－４－（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ－［４－（ｐ－アジドサリチルアミド）ブチル］－３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン－４－ヨードアセトアミド、ベンゾフェノン－４－マレイミド、カルボニル反応性及び光反応性架橋剤、例えば、ｐ－アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）、カルボキシレート反応性及び光反応性架橋剤、例えば、４－（ｐ－アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡｓＢＡ）、ならびにアルギニン反応性及び光反応性架橋剤、例えば、ｐ－アジドフェニルグリオキサール（ＡＰＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、該リンカーは、安息香酸基またはその誘導体を含む。いくつかの例では、該安息香酸基またはその誘導体は、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）を含む。いくつかの例では、該安息香酸基またはその誘導体は、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含む。
いくつかの実施形態では、該リンカーは、マレイミド基、ペプチド部分、及び／または安息香酸基のうちの１つ以上を、任意の組み合わせで含む。いくつかの実施形態では、該リンカーは、マレイミド基、ペプチド部分、及び／または安息香酸基の組み合わせを含む。いくつかの例では、該マレイミド基は、マレイミドカプロイル（ｍｃ）である。いくつかの例では、該ペプチド基は、ｖａｌ－ｃｉｔである。いくつかの例では、該安息香酸基は、ＰＡＢＡである。いくつかの例では、該リンカーは、ｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ基を含む。場合によっては、該リンカーは、ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。さらなる場合では、該リンカーは、ｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。
いくつかの実施形態では、該リンカーは、自壊性リンカーまたは自己消去リンカーである。場合によっては、該リンカーは、自壊性リンカーである。他の場合では、該リンカーは、自己消去リンカー（例えば、環化自己消去リンカー）である。いくつかの例では、該リンカーは、米国特許第９，０８９，６１４号またはＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５０３８４２６号に記載のリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、該リンカーは、樹状タイプのリンカーである。いくつかの例では、該樹状タイプのリンカーは、分岐多官能リンカー部分を含む。いくつかの例では、該樹状タイプのリンカーは、ＰＡＭＡＭデンドリマーを含む。
いくつかの実施形態では、該リンカーは、トレースレスリンカーまたは、開裂後に抗体またはペイロードにリンカー部分（例えば、原子またはリンカー基）を残さないリンカーである。例示的なトレースレスリンカーとしては、ゲルマニウムリンカー、ケイ素リンカー、硫黄リンカー、セレンリンカー、窒素リンカー、リンリンカー、ホウ素リンカー、クロムリンカー、またはフェニルヒドラジドリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、該リンカーは、Ｈｅｊｅｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ａｒｙｌ－ｔｒｉａｚｅｎｅ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ＤＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ １１（１５）：２４９３－２４９７（２０１３）に記載のトレースレスアリール－トリアゼンリンカーである。いくつかの例では、該リンカーは、Ｂｌａｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：２６０７－２０２４（２００２）に記載のトレースレスリンカーである。場合によっては、リンカーは、米国特許第６，８２１，７８３号に記載のトレースレスリンカーである。
使用方法
ある特定の実施形態では、本明細書に開示するのは、ＣＬＤＮ１８．２タンパク質の過剰発現を特徴とするがんを有する対象の治療方法である。場合によっては、該方法は、該対象に対して、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、または抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を含む医薬組成物を投与し、該対象における該がんを治療することを含む。場合によっては、該がんは消化管癌である。例示的な消化管癌としては、食道、胆嚢及び胆道、肝臓、膵臓、胃、小腸、大腸、結腸、直腸、及び／または肛門の癌が挙げられる。
いくつかの例では、該消化管癌は、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（または胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌である。場合によっては、該胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（または胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌は、胃の腺癌、胃リンパ腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、カルチノイド腫瘍、扁平上皮癌、小細胞癌、または平滑筋肉腫を含む。
いくつかの例では、該消化管癌は、膵臓癌である。場合によっては、該膵臓癌は、外分泌腫瘍、例えば、膵臓の腺癌、腺房細胞癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、もしくは粘液性嚢胞腺癌、または、膵内分泌腫瘍（ＰＮＥＴ）（膵島細胞腫瘍としても知られる）、例えば、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、インスリノーマ、ソマトスタチノーマ、ビポーマ、もしくは非機能性膵島細胞腫瘍を含む。
いくつかの例では、該消化管癌は、食道癌である。場合によっては、該食道癌は、食道の腺癌、扁平上皮癌、または小細胞癌を含む。
いくつかの例では、該消化管癌は、胆管細胞癌である。
いくつかの例では、該がんは、肺癌である。場合によっては、該肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、例えば、肺腺癌、扁平上皮癌、もしくは大細胞癌、または小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含む。
いくつかの例では、該がんは、卵巣癌である。場合によっては、該卵巣癌は、上皮性卵巣腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣間質腫瘍、または原発性腹膜癌を含む。
いくつかの実施形態では、該方法は、さらに、該対象に対して、さらなる治療薬を投与することを含む。いくつかの例では、該さらなる治療薬は、化学療法剤、免疫療法薬、標的治療薬、ホルモン系治療薬、または幹細胞系治療薬を含む。
いくつかの例では、該さらなる治療薬は、化学療法剤を含む。例示的な化学療法剤としては、アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、ダカルバジン、もしくはニトロソウレア、アントラサイクリン、例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、もしくはバルビシン、細胞骨格破壊因子、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、もしくはタキソテール、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、例えば、ボリノスタットもしくはロミデプシン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、イリノテカンもしくはトポテカン、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、エトポシド、テニポシド、もしくはタフルポシド、キナーゼ阻害剤、例えば、ボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、もしくはビスモデギブ、ヌクレオチド類似体及び前駆体類似体、例えば、アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メルカプトプリン、メトトレキサート、もしくはチオグアニン、白金系薬剤、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、もしくはオキサリプラチン、レチノイド、例えば、トレチノイン、アリトレチノイン、もしくはベキサロテン、またはビンカアルカロイド及び誘導体、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、もしくはビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの例では、該さらなる治療薬は、免疫療法薬を含む。いくつかの例では、該免疫療法は、養子細胞療法である。例示的な養子細胞療法としては、Ａｄａｐｔｉｍｍｕｎｅ製ＡＦＰ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ－Ａ１０ ＴＣＲ、またはＮＹ－ＥＳＯ－ＴＣＲ、Ｕｎｕｍ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製ＡＣＴＲ０８７／リツキシマブ、Ｊｕｎｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法、抗ＣＤ１９「ａｒｍｏｒｅｄ」ＣＡＲ－Ｔ細胞療法、ＪＣＡＲ０１４、ＪＣＡＲ０１８、ＪＣＡＲ０２０、ＪＣＡＲ０２３、ＪＣＡＲ０２４、もしくはＪＴＣＲ０１６、Ｃｅｌｇｅｎｅ／Ｊｕｎｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製ＪＣＡＲ０１７、Ｉｎｔｒｅｘｏｎ製抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法、Ｋｉｔｅ Ｐｈａｒｍａ製抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法、ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ、ＫＩＴＥ－７１８、ＫＩＴＥ－４３９、もしくはＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｔ細胞受容体療法、Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製抗ＣＥＡ ＣＡＲ－Ｔ療法、ＴＮＫ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製抗ＰＳＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法、Ａｔａｒａ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製ＡＴＡ５２０、Ａｕｒｏｒａ ＢｉｏＰｈａｒｍａ製ＡＵ１０１及びＡＵ１０５、Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｃａ製ｂａｌｔａｌｅｕｃｅｌ－Ｔ（ＣＭＤ－００３）、ｂｌｕｅｂｉｒｄ ｂｉｏ製ｂｂ２１２１、Ｂｅｌｌｉｃｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製ＢＰＸ－５０１、ＢＰＸ－６０１、もしくはＢＰＸ－７０１、Ｋｉｒｏｍｉｃ製ＢＳＫ０１、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｒｅ製ＩＭＣｇｐ１００、Ｊｏｕｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製ＪＴＸ－２０１１、Ｌｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製ＬＮ－１４４もしくはＬＮ－１４５、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｂｉｏ製ＭＢ－１０１もしくはＭＢ－１０２、Ｃｅｌｙａｄ製ＮＫＲ－２、Ｃｅｌｇｅｎｅ製ＰＮＫ－００７、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製チサゲンレクロイセル－Ｔ、またはＴｅｓｓａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製ＴＴ１２が挙げられる。
いくつかの例では、該免疫療法は、樹状細胞療法である。
いくつかの例では、該免疫療法は、サイトカイン療法を含み、これには、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、もしくはＩＬ－２１、インターフェロン（ＩＦＮ）－α、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）が含まれる。
いくつかの例では、該免疫療法は、免疫チェックポイントモジュレータを含む。例示的な免疫チェックポイントモジュレータとしては、ＰＤ－１モジュレータ、例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ製ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、Ｍｅｒｃｋ製ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、Ａｇｅｎｕｓ製ＡＧＥＮ ２０３４、ＢｅｉＧｅｎｅ製ＢＧＢ－Ａ３１７、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ－Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製Ｂｌ－７５４０９１、ＣＢＴ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製ＣＢＴ－５０１（ｇｅｎｏｌｉｍｚｕｍａｂ）、Ｉｎｃｙｔｅ製ＩＮＣＳＨＲ１２１０、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ製ＪＮＪ－６３７２３２８３、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ製ＭＥＤＩ０６８０、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ製ＭＧＡ ０１２、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製ＰＤＲ００１、Ｐｆｉｚｅｒ製ＰＦ－０６８０１５９１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｓａｎｏｆｉ製ＲＥＧＮ２８１０（ＳＡＲ４３９６８４）、もしくはＴＥＳＡＲＯ製ＴＳＲ－０４２、ＣＴＬＡ－４モジュレータ、例えば、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）、もしくはＡｇｅｎｕｓ製ＡＧＥＮ １８８４、ＰＤ－Ｌ１モジュレータ、例えば、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ製デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ製アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ／Ｐｆｉｚｅｒ製アベルマブ、ＣｙｔｏｍＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製ＣＸ－０７２、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製ＦＡＺ０５３、３Ｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ／Ａｌｐｈａｍａｂ製ＫＮ０３５、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ製ＬＹ３３０００５４、もしくはＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ製Ｍ７８２４（抗－ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦベータトラップ）、ＬＡＧ３モジュレータ、例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ製ＢＭＳ－９８６０１６、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製ＩＭＰ７０１、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製ＬＡＧ５２５、もしくはＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製ＲＥＧＮ３７６７、ＯＸ４０モジュレータ、例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ製ＢＭＳ－９８６１７８、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ製ＧＳＫ３１７４９９８、Ａｇｅｎｕｓ／Ｉｎｃｙｔｅ製ＩＮＣＡＧＮ１９４９、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ製ＭＥＤＩ０５６２、Ｐｆｉｚｅｒ製ＰＦ－０４５１８６００、もしくはＧｅｎｅｎｔｅｃｈｐ製ＲＧ７８８８、ＧＩＴＲモジュレータ、例えば、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製ＧＷＮ３２３、Ａｇｅｎｕｓ／Ｉｎｃｙｔｅ製ＩＮＣＡＧＮ１８７６、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ製ＭＥＤＩ１８７３、Ｍｅｒｃｋ製ＭＫ－４１６６、もしくはＬｅａｐ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製ＴＲＸ５１８、ＫＩＲモジュレータ、例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ製ｌｉｒｉｌｕｍａｂ、またはＴＩＭモジュレータ、例えば、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製ＭＢＧ４５３もしくはＴｅｓａｒｏ製ＴＳＲ－０２２が挙げられる。
いくつかの例では、該さらなる治療薬は、ホルモン系治療薬を含む。例示的なホルモン系治療薬としては、アロマターゼ阻害剤、例えば、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、もしくはアミノグルテチミド、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）類似体、例えば、リュープロレリンもしくはゴセレリン、選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、もしくはフルベストラント、抗アンドロゲン物質、例えば、フルタミドもしくはビカルタミド、黄体ホルモン物質、例えば、酢酸メゲストロールもしくは酢酸メドロキシプロゲステロン、アンドロゲン、例えば、フルオキシメステロン、エストロゲン、例えば、エストロゲンジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、Ｅｓｔｒａｃｅ、もしくはリン酸ポリエストラジオール、またはソマトスタチン類似体、例えば、オクトレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの例では、該さらなる治療薬は、第一選択治療薬である。
いくつかの実施形態では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及び該さらなる治療薬は、同時に投与される。
いくつかの例では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及び該さらなる治療薬は、連続して投与される。かかる場合には、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、該さらなる治療薬の投与に先立って該対象に投与される。他の例では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、該さらなる治療薬の投与の後に該対象に投与される。
場合によっては、該さらなる治療薬及び該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、異なる投与として製剤化される。
いくつかの例では、該対象は、手術を経験している。いくつかの例では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及び任意に該さらなる治療薬は、手術後に該対象に投与される。場合によっては、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及び任意に該さらなる治療薬は、手術前に該対象に投与される。
いくつかの例では、該対象は、放射線照射を経験している。いくつかの例では、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及び任意に該さらなる治療薬は、放射線治療中または後に該対象に投与される。場合によっては、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及び任意に該さらなる治療薬は、放射線照射を受ける前に該対象に投与される。
いくつかの例では、該対象はヒトである。
いくつかの実施形態では、殺細胞効果を誘導する方法もまた本明細書に記載する。場合によっては、該方法は、複数の細胞を、ペイロードを含む抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と、該抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を内在化するのに十分な時間接触させ、該殺細胞効果を誘導することを含む。場合によっては、該ペイロードは、メイタンシノイド、アウリスタチン、タキソイド、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、アマトキシン、またはそれらの誘導体を含む。場合によっては、該ペイロードは、アウリスタチンまたはその誘導体を含む。場合によっては、該ペイロードは、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。場合によっては、該ペイロードは、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である。
場合によっては、該細胞はがん細胞である。場合によっては、該細胞は、消化管癌に由来する。場合によっては、該消化管癌は、胃癌である。場合によっては、該消化管癌は、膵臓癌である。場合によっては、該消化管癌は、食道癌または胆管細胞癌である。場合によっては、該細胞は、肺癌または卵巣癌に由来する。
いくつかの実施形態では、該方法は、インビトロ法である。
いくつかの実施形態では、該方法は、インビボ法である。
医薬組成物
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、さらに、医薬組成物として製剤化される。いくつかの例では、該医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、皮内、腹腔内、硝子体内、脳内、もしくは脳室内）、経口、鼻腔内、口腔内、直腸、または経皮投与経路が挙げられるが、これらに限定されない複数の投与経路での対象への投与用に製剤化される。いくつかの例では、本明細書に記載の医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、皮内、腹腔内、硝子体内、脳内、もしくは脳室内）投与用に製剤化される。他の例では、本明細書に記載の医薬組成物は、経口投与用に製剤化される。さらに他の例では、本明細書に記載の医薬組成物は、鼻腔内投与用に製剤化される。
いくつかの実施形態では、該医薬組成物としては、水性分散液、自己乳化型分散体、固溶体、リポソーム分散体、エアロゾル、固体剤形、粉末、即時放出製剤、制御放出製剤、急速溶解製剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、多粒子製剤（例えば、ナノ粒子製剤）、ならびに混合型即時及び制御放出製剤が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの例では、該製剤処方は、多粒子製剤を含む。いくつかの例では、該製剤処方は、ナノ粒子製剤を含む。例示的なナノ粒子としては、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様物質、無機ナノチューブ、デンドリマー（例えば、共有結合した金属キレートとの）、ナノ繊維、ナノホーン、ナノオニオン、ナノロッド、ナノロープ及び量子ドットが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、ナノ粒子は、金属ナノ粒子、例えば、ナノ粒子のスカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、ガドリニウム、アルミニウム、ガリウム、インジウム、スズ、タリウム、鉛、ビスマス、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、リチウム、ナトリウム、カリウム、ホウ素、ケイ素、リン、ゲルマニウム、ヒ素、アンチモン、及びそれらの組み合わせ、合金または酸化物である。
いくつかの例では、ナノ粒子は、コアまたは、コアシェルナノ粒子にあるように、コア及びシェルを含む。場合によっては、ナノ粒子は、少なくとも１つの約５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、または１００ｎｍ未満の次元を有する。
いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、本明細書に開示する組成物との適合性、及び所望の剤形の放出プロファイル特性に基づいて選択される担体または担体材料を含む。例示的な担体材料としては、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定剤、滑沢剤、湿潤剤、希釈剤等が挙げられる。医薬的に適合する担体材料としては、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼインナトリウム、ダイズレシチン、タウロコール酸、フォスホチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロース及びセルロースコンジュゲート、糖類ステアロイル乳酸ナトリウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファ化デンプン等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）、Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５、Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０、及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）を参照されたい。
いくつかの例では、該医薬組成物は、さらに、ｐＨ調整剤または緩衝剤を含み、これらとしては、酸、例えば、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸及び塩酸、塩基、例えば、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム及びトリス－ヒドロキシメチルアミノメタン、ならびに緩衝剤、例えば、クエン酸／デキストロース、重炭酸ナトリウム及び塩化アンモニウムが挙げられる。かかる酸、塩基及び緩衝剤は、該組成物のｐＨを許容範囲に維持するために必要な量で含まれる。
いくつかの例では、該医薬組成物は、１つ以上の塩を、該組成物の浸透圧を許容範囲にするのに必要な量含む。かかる塩としては、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムカチオン及びクロライド、シトレート、アスコルベート、ボレート、ホスフェート、バイカーボネート、スルフェート、チオスルフェート、またはバイスルファイトアニオンを有するものが挙げられる。適切な塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、及び硫酸アンモニウムが挙げられる。
いくつかの例では、該医薬組成物は、さらに、より安定な環境を提供することができるため、化合物を安定化させるために使用される希釈剤を含む。リン酸緩衝生理食塩水が挙げられるが、これに限定されない緩衝液に溶解された塩（これはまた、ｐＨを制御または維持することができる）は、当技術分野では希釈剤として利用される。ある特定の例では、希釈剤は、該組成物の嵩を増大させて圧縮を容易にするか、またはカプセル充填用の均質なブレンドに十分な嵩を創出する。かかる化合物としては、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、微結晶性セルロース、例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物、リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム、無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース、アルファ化デンプン、圧縮性糖、例えば、Ｄｉ－Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）、マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、スクロース系希釈剤、粉砂糖、一塩基性硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物、乳酸カルシウム三水和物、デキストレート、加水分解穀物固形物、アミロース、粉末セルロース、炭酸カルシウム、グリシン、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、イノシトール、ベントナイト等を挙げることができる。
場合によっては、該医薬組成物は、物質の分解または崩壊を促進するための崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）または崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔ）を含む。「崩壊する」という用語は、胃腸液と接触した際の該剤形の溶解及び分散の両方を含む。崩壊剤の例としては、デンプン、例えば、天然デンプン、例えば、コーンスターチもしくはジャガイモデンプン、アルファ化デンプン、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ １５５１もしくはＡｍｉｊｅｌ（登録商標）、またはデンプングリコール酸ナトリウム、例えば、Ｐｒｏｍｏｇｅｌ（登録商標）もしくはＥｘｐｌｏｔａｂ（登録商標）、セルロース、例えば、木材製品、メチル結晶性セルロース、例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０１、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０５、Ｅｌｃｅｍａ（登録商標）Ｐ１００、Ｅｍｃｏｃｅｌ（登録商標）、Ｖｉｖａｃｅｌ（登録商標）、Ｍｉｎｇ Ｔｉａ（登録商標）、及びＳｏｌｋａ－Ｆｌｏｃ（登録商標）、メチルセルロース、クロスカルメロース、または架橋セルロース、例えば、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（Ａｃ－Ｄｉ－Ｓｏｌ（登録商標））、架橋カルボキシメチルセルロース、もしくは架橋クロスカルメロース、架橋デンプン、例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポリマー、例えば、クロスポビドン、架橋ポリビニルピロリドン、アルギネート、例えば、アルギン酸もしくはアルギン酸の塩、例えば、アルギン酸ナトリウム、クレー、例えば、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）ＨＶ（ケイ酸アルミニウムマグネシウム）、ガム、例えば、寒天、グアー、イナゴマメ、カラヤ、ペクチン、もしくはトラガカント、デンプングリコール酸ナトリウム、ベントナイト、天然海綿、界面活性剤、樹脂、例えば、カチオン交換樹脂、柑橘パルプ、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムとデンプンの組み合わせ等が挙げられる。
いくつかの例では、該医薬組成物は、充填剤、例えば、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶性セルロース、セルロース粉末、デキストロース、デキストレート、デキストラン、デンプン、アルファ化デンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール等を含む。
滑沢剤及び流動促進剤もまた、本明細書に記載の医薬組成物に任意に含まれ、材料の接着または摩擦を防止、低減または阻害する。例示的な滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、タルク、フマル酸ステアリルナトリウム、炭化水素、例えば、鉱油、硬化植物油、例えば、硬化大豆油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））、高級脂肪酸ならびにそれらのアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩、例えば、アルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、タルク、ワックス、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ－４０００）またはメトキシポリエチレングリコール、例えば、Ｃａｒｂｏｗａｘ（商標）、オレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムまたはナトリウム、コロイド状シリカ、例えば、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）、Ｃａｂ－Ｏ－Ｓｉｌ（登録商標）、デンプン、例えば、コーンスターチ、シリコーン油、界面活性剤等が挙げられる。
可塑剤としては、マイクロカプセル化材料またはフィルムコーティングを軟化させ、それらの脆弱性を低くするために使用される化合物が挙げられる。適切な可塑剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３３５０、及びＰＥＧ８００、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロースならびにトリアセチンが挙げられる。可塑剤は、分散剤または湿潤剤としても機能し得る。
可溶化剤としては、トリアセチン、トリエチルシトレート、エチルオレエート、エチルカプリレート、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクサート、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ－ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ－ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁酸塩、ポリエチレングリコール２００～６００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール、及びジメチルイソソルビド等の化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
安定剤としては、任意の抗酸化剤、緩衝剤、酸、防腐剤等の化合物が挙げられる。
懸濁剤としては、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール、例えば、該ポリエチレングリコールは、分子量約３００～約６０００、または約３３５０～約４０００、または約７０００～約５４００を有し得るもの、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースアセテートステアレート、ポリソルベート－８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ガム、例えば、トラガカントゴム及びアカシアゴム、グアーガム、キサンタン、キサンタンガム、糖、セルロース誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリソルベート－８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポビドン等の化合物が挙げられる。
界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクサート、Ｔｗｅｅｎ６０または８０、トリアセチン、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート、ポロキサマー、胆汁酸塩、グリセリルモノステアレート、エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）等の化合物が挙げられる。さらなる界面活性剤としては、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド及び植物油、例えば、ポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油、ならびにポリオキシエチレンアルキルエーテル及びアルキルフェニルエーテル、例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０が挙げられる。時として、物理的安定性を高めるため、または他の目的のために界面活性剤が含まれる場合がある。
粘度向上剤としては、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギネート、アカシア、キトサン及びそれらの組み合わせが挙げられる。
湿潤剤としては、オレイン酸、グリセリルモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ナトリウムドクサート、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクサート、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ８０、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、アンモニウム塩等の化合物が挙げられる。
治療レジメン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、治療への応用のために投与される。いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、１日１回、１日２回、１日３回、またはそれを超えて投与される。該医薬組成物は、毎日（ｄａｉｌｙ）、毎日（ｅｖｅｒｙ ｄａｙ）、１日おき、週５日、週１回、１週おき、月２週間、月３週間、月１回、月２回、月３回、またはそれを超えて投与される。該医薬組成物は、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２年、３年、またはそれを超えて投与される。
患者の状態が改善する場合、医師の裁量により、該組成物の投与は継続的に行われる。代替的に、投与される該組成物の用量は、ある特定の期間一時的に低減されるか、または一時的に中断される（すなわち、「休薬期間」）。いくつかの例では、休薬期間の長さは、２日～１年の間で変動し、ほんの一例として、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、または３６５日が挙げられる。休薬期間中の減量は、１０％～１００％であり、ほんの一例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が挙げられる。
患者の状態の改善が生じた後、必要に応じて維持量が投与される。その後、投与量もしくは投与頻度、またはその両方が、症状に応じて、該改善された疾患、障害、または状態が維持されるレベルに低減され得る。
いくつかの実施形態では、かかる量に対応する所与の薬剤の量は、具体的な化合物、該疾患の重症度、治療を必要とする対象または宿主の識別（例えば、体重）等の要因に応じて変化するが、それでもなお、例えば、投与される特定の薬剤、投与経路、及び治療される対象または宿主等の該症例を取り巻く特定の状況に従って、当技術分野で既知の方法で定期的に決定される。いくつかの例では、所望の用量は、便宜上、単回用量で、あるいは、同時に（もしくは短期間で）または適切な間隔で、例えば１日あたり２、３、４またはそれを超えるサブ用量として投与される分割用量として提供される。
前述の範囲は示唆的なものに過ぎず、個々の治療計画に関する可変要素の数は多く、これらの推奨値からの大幅な逸脱は珍しいことではない。かかる投与量は、いくつかの可変要素、限定されないが、使用される化合物の活性、治療される疾患または状態、投与方法、個々の対象の要件、治療される疾患または状態の重症度、及び開業医の判断に応じて変化する。
いくつかの実施形態では、かかる治療レジメンの毒性及び治療効果は、細胞培養または実験動物において、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）の特定が挙げられるが、これらに限定されない標準的な調剤手順によって特定される。毒性と治療効果間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０間の比として表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲を策定する際に使用される。かかる化合物の投与量は、好ましくは、毒性が最小限のＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動する。
キット／製品
ある特定の実施形態では、本明細書に開示するのは、本明細書に記載の組成物及び方法のうちの１つ以上とともに用いるキット及び製品である。かかるキットは、担体、包装、または容器を含み、これは、バイアル、チューブ等の１つ以上の容器を受けるように区切られ、該容器（複数可）の各々は、本明細書に記載の方法に用いられる別々の要素のうちの１つを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が挙げられる。１つの実施形態では、該容器は、ガラスまたはプラスチック等の多様な材料から形成される。
本明細書に提供する製品は、包装材料を含む。医薬包装材料の例としては、ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択された製剤ならびに意図された投与方法及び治療に適した任意の包装材料が挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、該容器（複数可）は、本明細書に開示する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、本明細書に記載の１つ以上の抗体を産生するための宿主細胞、及び／または本明細書に記載の抗体をコードする核酸分子を含むベクターを含む。かかるキットは、任意に、本明細書に記載の方法におけるその使用に関連する識別記載もしくはラベルまたは指示を含む。
キットには通常、内容物及び／または使用説明書を記載したラベル、ならびに使用説明書付きの添付文書が含まれる。通常、一連の手順も含まれる。
１つの実施形態では、ラベルは、容器上にあるか、または容器に結合される。１つの実施形態では、ラベルを形成する文字、数字、または他の文字が容器自体に取り付けられ、成形され、またはエッチングされる場合、ラベルは容器上にあり、ラベルが、容器を保持もするレセプタクルまたは担体内に含まれる場合は、例えば、添付文書として、該容器に結合される。１つの実施形態では、ラベルは、内容物が特定の治療用途に使用されることを示すために使用される。該ラベルはまた、例えば、本明細書に記載の方法における内容物の使用法も示す。
ある特定の実施形態では、該医薬組成物は、本明細書に提供する化合物を含む１つ以上の単位剤形を含むパックまたはディスペンサ装置に含まれる。該パックは、例えば、ブリスターパック等の金属またはプラスチック箔を含む。１つの実施形態では、該パックまたはディスペンサ装置には、投与のための説明書が添付される。１つの実施形態では、該パックまたはディスペンサは、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府の機関によって規定される形式で、容器に結合される掲示も伴う。この掲示は、ヒトまたは動物への投与用の該薬物の形態の該機関による承認を反映するものである。かかる掲示は、例えば、処方薬に対する米国食品医薬品局承認の表示であるか、または承認済み製品の挿入物である。１つの実施形態では、適合性のある医薬担体に製剤化された本明細書に提供する化合物を含む組成物もまた調製され、適切な容器に入れられ、適応する状態の治療用にラベルされる。
特定用語
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、特許請求の範囲に記載された対象が属する当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明は、例示的かつ説明的なものであるにすぎず、特許請求の範囲に記載された対象を限定するものではないと理解するべきである。本出願では、単数形の使用は、別途明確に記述されない限り、複数形を含む。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上別途明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されなければならない。本出願では、「または」の使用は、別途記載のない限り、「及び／または」を意味する。更に、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに他の形態、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は、限定的でない。
本明細書で使用される、範囲及び量は、「約」特定値または範囲として表され得る。約は、正確な量も含む。従って、「約５μＬ」は「約５μＬ」及び「５μＬ」も意味する。一般に、「約」という用語は、実験誤差の範囲内であると予想される量、例えば、１５％、１０％、または５％以内を含む。
本明細書で使用される節の見出しは、構成目的のみのためであり、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。
本明細書で使用される、「個体（複数可）」、「対象（複数可）」及び「患者（複数可）」という用語は、任意の哺乳類を意味する。いくつかの実施形態では、該哺乳類は、ヒトである。いくつかの実施形態では、該哺乳類は、非ヒトである。いずれの用語も、医療従事者（例えば、医師、登録看護師、ナースプラクティショナー、医師助手、オーダリーまたはホスピス職員）の管理（例えば、定期的または断続的）によって特徴づけられる状況を必要とせず、これらに限定もされない。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では同義で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。該ポリマーは、直鎖状でも、環状でも、分岐状でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。該用語はまた、例えば、硫酸化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、ヨウ素化、メチル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、転移ＲＮＡを介したアミノ酸のタンパク質への付加、例えば、アルギニル化、ユビキチン化、または任意の他の操作、例えば、標識成分とのコンジュゲーションを介して修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。
本明細書で使用される、「アミノ酸」という用語は、天然及び／または非天然または合成アミノ酸のいずれかを指し、グリシン及びＤまたはＬの両光学異性体、ならびにアミノ酸類似体及びペプチド模倣体を含む。
指定されたタンパク質に「由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、該ポリペプチドの起源を指す。好ましくは、該ポリペプチドは、該配列でコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と本質的に同一であるアミノ酸配列、またはその部分を有し、この場合、該部分は、少なくとも１０～２０アミノ酸、または少なくとも２０～３０アミノ酸、または少なくとも３０～５０アミノ酸からなるか、または該配列でコードされるポリペプチドと免疫学的に識別可能である。この用語には、指定された核酸配列から発現されるポリペプチドも含まれる。
Ｋａｂａｔの付番システムに関しては、抗体重鎖分子内のＣＤＲは、通常、アミノ酸位置３１～３５に存在し、これは、任意に、１つまたは２つの追加のアミノ酸を、３５の次（Ｋａｂａｔ付番スキームでは３５Ａ及び３５Ｂと呼ばれる）（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０～６５（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸位置９５～１０２（ＣＤＲ３）を含むことができる。Ｋａｂａｔの付番システムを使用すると、抗体軽鎖分子内のＣＤＲは、通常、アミノ酸位置２４～３４（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０～５６（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸位置８９～９７（ＣＤＲ３）に存在する。当業者には周知のように、Ｋａｂａｔの付番システムを使用すると、該抗体可変ドメインの実際の線状アミノ酸配列は、ＦＲ及び／またはＣＤＲの短縮または延長に起因して、より少ないまたはさらなるアミノ酸を含む場合があり、従って、アミノ酸のＫａｂａｔ番号は、その線状アミノ酸番号と必ずしも同じではない。
これらの実施例は、例示の目的のためのみに提供されており、本明細書に提供する特許請求の範囲を限定するためではない。
実施例１－標的及び試薬
ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３及びＣＨＯ細胞は、免疫付与及びスクリーニング目的で、ＮｏｖｏＢｉｏＳｃｉ及びＧｅｎｏｍｅｄｉｔｅｃｈで生成された。ＣＬＤＮ１８．２を発現するＨＥＫ２９３細胞は、ＩＲＥＳによってＧＦＰと共発現させた。ＧＦＰ及びＣＬＤＮ１８．２の発現は、ＣＬＤＮ１８（ａｂ２０３５６３）に対する市販の蛍光標識抗体で染色することにより実証した（図１）。ＣＨＯ細胞でのＣＬＤＮ１８．２の発現は、ＤＮＡシーケンシングによって確認した。
実施例２－免疫付与
抗体を産生するためのラットの免疫付与は、以下の免疫付与スケジュールを使用して実施した（表１０）。簡潔には、最初の２回の免疫付与では、２種類のＤＮＡ構築物、すなわち、細胞外ループ１（ＥＣＬ１、図３）のみまたは完全長ＣＬＤＮ１８．２（図２）ＤＮＡのいずれかを使用した。３回目の免疫付与は、ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞で行い、４回目の免疫付与は、対応するＤＮＡを使用して、またはＤＮＡとＣＬＤＮ１８．２を過剰発現する細胞を使用して行った。最終ブーストは、ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞で行った。４匹のラットを融合に使用した。
表１０．ラットの免疫付与スキーム
Figure 2022512132000016
＊融合用に選択されたラット
マウスの免疫付与（表１１）では、ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞のいずれかを、４回の免疫付与に加えて最終ブーストで使用した。各群で４匹のマウスを使用し、ハイブリドーマを生成するために３つの融合を行った。
表１１．マウスの免疫付与スキーム。
Figure 2022512132000017
＊融合用に選択されたマウス
実施例３－ＦＡＣＳ結合による一次ハイブリドーマクローンのスクリーニング
ハイブリドーマの上清は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合した。合計８０枚の９６ウェルプレートに播種し、これらを、細胞ベースのＥＬＩＳＡによって免疫付与動物のハイブリドーマからスクリーニングした。１９４個のクローンを、ＯＤ値＞０．３に基づいて陽性と識別した。ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合したがＣＬＤＮ１８．１には結合しなかった抗体を得るため、ラットまたは／及びマウスの改変細胞株、すなわち、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１及びＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２での免疫付与由来のハイブリドーマをスクリーニングした。簡潔には、５０μＬのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１またはＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞（細胞密度：２×１０６細胞／ｍＬ、生存率＞９０％）を、等量のハイブリドーマ上清とともに９６ウェルプレートにて４℃で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳを含むＤＰＢＳ）で洗浄した後、その細胞／抗体混合物を二次抗体（ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ｉＦｌｏｕｒ６４７、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ（登録商標）６４７コンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。最後に、その混合物を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａでＦＡＣＳ分析に供した。その生データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
免疫付与ラットからの７ハイブリドーマ及び免疫付与マウスからの３１ハイブリドーマは、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２に対する特異的結合が、それぞれのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１細胞へ結合と比較して強かった。
実施例４－精製抗体はＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する
精製抗体を、上清からプロテインＧアフィニティー精製によって生成した。簡潔には、ハイブリドーマ上清を８０００ｒｐｍ及び４℃にて３０分間遠心分離した。次に、その上清を０．２２μｍの精密ろ過膜でろ過した。ＮａＣｌをその上清に、１０ｍＬの上清に対して１ｇのＮａＣｌの比で加えた。この上清サンプルを４℃で毎分３ｍＬの速度で精製カラムにロードした。プロテインＧレジンを４～５カラム容量の１ｘＰＢＳで平衡化し、その後溶出緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ１２）で洗浄した。中和緩衝液を、次に、溶出した抗体を含む収集チューブに直ちに加え、そのｐＨを中和した。次に、溶出した抗体を１ｘＰＢＳに対して室温で２時間透析した。この抗体を、その後分析用に保存した。
精製ラット抗体を、上記の方法に従って、ＣＬＤＮ１８．２またはＣＬＤＮ１８．１を過剰発現する細胞を使用した結合アッセイで調べた。４つの精製ラット抗体１８１Ｂ７Ｂ７、１９３Ｈ１１Ｄ８、１８４Ａ１０Ｄ８、及び２８２Ａ１２Ｆ３は、ＣＬＤＮ１８．２に特異的結合を示したが、ＣＬＤＮ１８．１には示さなかった。特に、２８２Ａ１２Ｆ３は、参照抗体１７５Ｄ１０よりもＣＬＤＮ１８．２に強い結合を示し、２つの精製ラット抗体１０１Ｃ６Ａ８及び１８６Ａ４Ｂ９は、ＣＬＤＮ１８．１及びＣＬＤＮ１８．２の両方に結合した。
３２５Ｆ１２Ｈ３、３２５Ｅ８Ｃ８、３２８Ｇ２Ｃ４、３５０Ｇ１２Ｅ１、３５７Ｂ８Ｆ８、３６０Ｆ１Ｇ１、３６４Ｄ１Ａ７、３８２Ａ１１Ｈ１２、３９９Ｈ６Ａ１０、４０６Ｄ１０Ｈ７、４０８Ｂ９Ｄ４、４０９Ｅ２Ｃ５、４１３Ｂ５Ｂ４、４１３Ｈ９Ｆ８、４１６Ｅ８Ｇ１０、４１７Ｈ３Ｂ１、４２０Ｇ５Ｅ２、及び４２９Ｇ１Ｂ７を含めた１８の精製マウス抗体は、ＣＬＤＮ１８．２に特異的結合を示したが、ＣＬＤＮ１８．１には示さなかった。特に、３２５Ｅ８Ｃ８、３５０Ｇ１２Ｅ１、３５７Ｂ８Ｆ８、３６４Ｄ１Ａ７、４０８Ｂ９Ｄ４、及び４１３Ｈ９Ｆ８は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２に対して、参照抗体１７５Ｄ１０よりも強い結合を示した。
実施例５－精製抗体の結合曲線
ハイブリドーマ抗体の結合親和性をランク付けするために結合曲線を作成した。簡潔には、各ウェルに対して、合計１×１０５のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞を９６ウェルプレートに播種し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳを含むＤＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞を、連続希釈した精製ハイブリドーマ抗体で１時間インキュベートした。一次抗体のインキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、細胞を、二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ（登録商標）６４７コンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。染色した細胞のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７シグナルを、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａで検出し、幾何平均蛍光シグナルを特定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを分析に使用した。データを、平均蛍光シグナルに対する抗体濃度の対数としてプロットした。非線形回帰分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で行い、ＥＣ５０値を計算した。
図４Ａ～図４Ｃに示すように、精製抗ＣＬＤＮ１８．２マウス産生抗体は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対して用量依存的な結合を示した。調べた合計１８の抗体のうち、５つの抗体、すなわち、３２５Ｅ８Ｃ８、３５０Ｇ１２Ｅ１、３６４Ｄ１Ａ７、４０８Ｂ９Ｄ４、及び４１３Ｈ９Ｆ８が、参照抗体１７５Ｄ１０と比較して最も高い最大結合を示した（図４Ａ）。５つの抗体、すなわち、４１７Ｈ３Ｂ１、４１３Ｂ５Ｂ４、３５７Ｂ８Ｆ８、３６０Ｆ１Ｇ１及び４２９Ｇ１Ｂ７は、１７５Ｄ１０よりも高い最大結合を示したが、抗体３２５Ｅ８Ｃ８、３５０Ｇ１２Ｅ１、３６４Ｄ１Ａ７、４０８Ｂ９Ｄ４、及び４１３Ｈ９Ｆ８より低かった（図４Ｂ）。調べたさらなる抗体は、１７５Ｄ１０と比較して、同様のまたはより弱い最大結合を示した（図４Ｃ）。選択された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＣＬＤＮ１８．２に対するＥＣ５０は、約１０ｎＭ以下であった（表１２）。
表１２．マウス免疫付与ハイブリドーマクローン由来の抗体のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合親和性（ＥＣ５０）。
Figure 2022512132000018
本明細書及び以下の表で使用される「ｎａ」という用語は、「該当なし」を示している。
実施例６－胃癌細胞株への抗体の結合
胃癌細胞株ＳＮＵ６０１及びＳＮＵ６２０はＣＬＤＮ１８．２の内因性発現を有する。ＳＮＵ６０１及びＳＮＵ６２０細胞でのＣＬＤＮ１８．２の発現を、ＣＬＤＮ１８．２特異的プライマー及びＤＮＡシーケンシングを使用したＲＴ－ＰＣＲで確認した。高レベルのＣＬＤＮ１８．２を発現するＳＮＵ６０１及びＳＮＵ６２０細胞を結合アッセイのために選別した。結合アッセイは、前述のように行った。ラット産生クローン２８２Ａ１２及び１０１Ｃ６ならびに参照抗体１７５Ｄ１０はすべて、胃癌株ＳＮＵ６０１に結合したが、クローン２８２Ａ１２及び１０１Ｃ６は、ＳＵ６２０にも結合した（図５Ａ及び図５Ｂ）。
ＳＮＵ６２０細胞株は、内因性発現ＣＬＤＮ１８．２に対するマウスモノクローナル抗体の結合親和性を特定するために使用した。すべてのマウス免疫付与陽性抗体は、最終濃度１０μｇ／ｍＬで試験した。１８のマウスモノクローナル抗体のうちの３２５Ｆ１２Ｈ３、３２５Ｅ８Ｃ８、３２８Ｇ２Ｃ４、３５０Ｇ１２Ｅ１、３６０Ｆ１Ｇ１、３６４Ｄ１Ａ７、４０６Ｄ１０Ｈ７、４０８Ｂ９Ｄ４、４０９Ｅ２Ｃ５、４１３Ｂ５Ｂ４、４１３Ｈ９Ｆ８、４１６Ｅ８Ｇ１０、４１７Ｈ３Ｂ１、４２０Ｇ５Ｅ２、及び４２９Ｇ１Ｂ７を含む１５は、１７５Ｄ１０と比較して、ＳＵ６２０に強い結合を示した。特に、４１３Ｈ９Ｆ８、３６４Ｄ１Ａ７、及び４０８Ｂ９Ｄ４は、ＳＮＵ６２０癌細胞に強く結合した。
要約すれば、２８２Ａ１２Ｆ３、３６４Ｄ１Ａ７、及び４１３Ｈ９Ｆ８等の抗体は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２及び胃癌ＳＮＵ６２０に特異的に結合した（表１３）。
表１３．ＣＬＤＮ１８．２特異的抗体の結合活性の要約。
Figure 2022512132000019
実施例７－キメラ化
マウス及びラットの抗体は、ヒトＩｇＧ１のシグナル配列及び定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むｐＣＤＮＡ３．１（＋）プラスミドにおいて、マウス及びラットの軽鎖可変領域を発現させることによってキメラ化した。ヒトＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖定常領域（ＣＨ及びＣＬ）の配列を表４に示す。
キメラ抗体のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株に対する結合親和性を、前述のように特定した。図６Ａ～６Ｄに示すように、キメラ抗体２８２Ａ１２Ｆ３、６４Ｄ１Ａ７、及び４１３Ｈ９Ｆ８は、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する。キメラ２８２Ａ１２Ｆ３、６４Ｄ１Ａ７及び４１３Ｈ９Ｆ８は、参照抗体１７５Ｄ１０と比較して高い結合親和性を示した。
実施例８－抗体配列分析及び翻訳後修飾部位の除去
時として、不均一性の増加、生物活性の低下、安定性の低下、免疫原性、断片化及び凝集等、治療用タンパク質の開発中に問題を引き起こす翻訳後修飾（ＰＴＭ）について、ハイブリドーマ技術によって生成された抗体の配列を分析した。ＰＴＭの潜在的な影響は、ＰＴＭの場所によって決まり、場合によっては、溶剤への暴露によって決まる。すべての配列のＣＤＲを、アスパラギンの脱アミノ化、アスパラギン酸の異性化、遊離システインのチオール基、Ｎ－グリコシル化、酸化、及び潜在的な加水分解部位による断片化について分析した。
Ｉｇｂｌａｓｔツールを使用して、親配列のヒト生殖細胞系列配列に対する多重アラインメントを行った。ヒト生殖細胞系列に対する親抗体配列アラインメントに基づいて、最も高い相同性エントリを同定した。
抗体２８２Ａ１２Ｆ３、４１３Ｈ９Ｆ８及び３６４Ｄ１Ａ７の構造モデルを、カスタマイズされたビルドホモロジーモデルプロトコルを使用して生成した。候補構造の鋳型断片は、標的との配列同一性、及び鋳型構造の定性的結晶学的測定に基づいて、スコア付けし、ランクを付け、ＰＤＢデータベースから選択した。２８２Ａ１２Ｆ３、４１３Ｈ９Ｆ８、３６４Ｄ１Ａ７それぞれのホモロジーモデリングデータに基づいて、フレームワーク領域（ＦＲ）及びＣＤＲ領域の露出残基を同定し、タンパク質構造表面の潜在的なＰＴＭ部位を強調表示した。ヒト生殖細胞系列鋳型のＰＴＭ分析データ及び配列同一性に基づいて、３つの抗体２８２Ａ１２Ｆ３、４１３Ｈ９Ｆ８、及び３６４Ｄ１Ａ７をさらにヒト化するための親抗体として利用した。
ＰＴＭ部位を除去した変異体の結合試験を、ＣＬＤＮ１８．２またはＣＬＤＮ１８．１を発現する細胞で、陽性対照としての参照抗体１７５Ｄ１０とともに行った。図７Ａ～図１０Ｂに示すように、潜在的なＰＴＭ部位の除去後、２８２Ａ１２Ｆ３クローン由来の２８２Ａ１２Ｆ３－ＶＨ－Ｎ６０Ｑ、２８２Ａ１２Ｆ３－ＶＨ－Ｎ６０Ｅ、及び２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）、４１３Ｈ９Ｆ８クローン由来の４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｎ３１Ｅ、４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｌ、及び４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ、ならびに３６４Ｄ１Ａ７クローン由来の３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｎ３１Ｅ、３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｌ、及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖは、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１細胞株の代わりにＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２への特異的結合を示した。潜在的なＰＴＭ部位を除去した抗体のすべては、参照抗体１７５Ｄ１０と比較してＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対する強い結合を示した。３５７Ｂ８Ｆ８クローン由来の３５７Ｂ８Ｆ８－ＶＨ－Ｎ６０Ｅ－ＶＬ－Ｎ３１Ｅ、３５７Ｂ８Ｆ８－ＶＨ－Ｎ６０Ｅ－ＶＬ－Ｓ３２Ｉ、３５７Ｂ８Ｆ８－ＶＨ－Ｓ６１Ｉ－ＶＬ－Ｎ３１Ｅ、及び３５７Ｂ８Ｆ８－ＶＨ－Ｓ６１Ｉ－ＶＬ－Ｓ３２Ｉは、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２への特異的結合を示したが、３５７Ｂ８Ｆ８－ＶＨ－Ｓ６１Ｉ－ＶＬ－Ｓ３２Ｉのみが、１７５Ｄ１０（ｘｉ１７５Ｄ１０）と同等のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２への結合親和性を示した。
ＰＴＭ除去変異を有するキメラクローンを、内因性ＣＬＤＮ１８．２発現を有するＳＮＵ６２０へのそれらの結合について上記のように調べた。図１１Ａ～図１１Ｃに示すように、４１３Ｈ９Ｆ８及び３６４Ｄ１Ａ７の両バリアントは、異なるレベルでＳＮＵ６２０に結合した。Ｓ３２Ｖ及びＳ３２Ｌ変異体は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２及びＳＮＵ６２０細胞に対してＮ３１Ｅ変異体よりも良好な結合活性を示した。クローン４１３Ｈ９Ｆ８は、ＣＬＤＮ１８．２に対して３６４Ｄ１Ａ７より良好な結合活性を示した。キメラ３５７Ｂ８Ｆ８、及びそのＰＴＭ除去バリアントは、ＳＮＵ６２０癌細胞株に、参照抗体１７５Ｄ１０と同様、結合することができなかった。
実施例９－キメラ抗体の競合的結合
ＣＬＤＮ１８．２結合抗体のエピトープ結合基を調べるため、４つのキメラ抗体の競合的結合活性を、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞を使用して試験した。各抗体の作用濃度は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞ベースの結合アッセイによって特定した。細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄した後、１×１０５細胞を含む５０μＬのＰＢＳを９６ウェルプレートに加えた。試験抗体を、ＰＢＳにより、６０μｇ／ｍＬから３倍で１２段階に連続希釈し、５０μＬの希釈抗体を細胞と混合し、４℃で１２０分間インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳで洗浄した。競合結合アッセイでは、１００μＬのビオチン標識抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を作用濃度（それぞれ、５、１、０．５及び１μｇ／ｍＬのｘｉ１７５Ｄ１０、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）、４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ、及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ）で加えた。ビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧのＦｃを、１：８００希釈で、１００μＬ／ウェルにて対照として加えた。これらのプレートを４℃で４０分間インキュベートした。ストレプトアビジン－ＡＰＣ（１：１７００）を使用し、ビオチン標識抗体を検出した。フローサイトメトリーを実施し、結合を測定した。
ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２に対する１７５Ｄ１０の結合は、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）、４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ、または３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－３２Ｖによって完全に阻害された（図１２Ａ～図１２Ｄ）。ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２に対する２８２Ａ１２（Ｔ６２Ａ）の結合は、４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖまたは３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖによって完全に阻害され、１７５Ｄ１０によって部分的に阻害された。ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２に対する４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖの結合は、１７５Ｄ１０または２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）によって部分的に阻害された。
実施例１０－マウス及びカニクイザルＣＬＤＮ１８．２に対する交差結合活性
種間交差反応性により、薬理学モデル（マウス）及び毒性モデル（カニクイザル）での臨床候補の評価が可能である。抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体の種間交差反応性を、細胞ベースの結合アッセイによって特定した。同定されたモノクローナル抗体のマウス及びカニクイザルＣＬＤＮ１８．２への結合をフローサイトメトリーで分析した。ＨＥＫ２９３細胞を、蛍光マーカーならびにマウスＣＬＤＮ１８．２及びカニクイザルＣＬＤＮ１８．２で一過性コトランスフェクトした。簡潔には、ディッシュあたり２．５×１０６のＨＥＫ－２９３細胞を、各ディッシュに対して１０ｍＬのＤＭＥＭ培地を用いて、２枚の１０ｃｍ２ディッシュに播種した。播種の２４時間後、細胞をマウスＧＦＰ－ＣＬＤＮ１８．２及びカニクイザルＧＦＰ－ＣＬＤＮ１８．２プラスミドでトランスフェクトした。ディッシュあたり全プラスミド質量１０μｇを、２０μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの５時間後に培地を交換した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を解離させ、結合親和性検出用に調製した。ヒトＣＬＤＮ１８．２を発現する安定細胞株ＨＥＫ２９３－ＧＦＰ－ＣＬＤＮ１８．２を使用し、ヒトＧＦＰ－ＣＬＤＮ１８．２を検出した。
抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体の結合親和性を、ヒト、マウス及びカニクイザルＣＬＤＮ１８．２過剰発現細胞で測定した。簡潔には、各ウェルに対して、１×１０５の細胞を９６ウェルプレートに播種し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳを含むＤ－ＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞を、連続希釈した抗ＣＬＤＮ１８．２抗体で１時間インキュベートした。対照群は、ヒトＩｇＧ１とインキュベートしたがん細胞で構成した。一次抗体のインキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次に、細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により、４℃で３０分間染色した。染色した細胞のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７及びＧＦＰシグナルを、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａで検出し、幾何平均蛍光シグナルを特定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを分析に使用した。データを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７／ＧＦＰによる平均蛍光に対する抗体濃度の比としてプロットした。非線形回帰分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で行った。図１３Ａ～図１３Ｅに示すように、キメラ抗体４１３Ｈ９Ｆ８、３６４Ｄ１Ａ７、及び３５７Ｂ８Ｆ８のバリアント、ヒト化２８２Ａ１２（Ｔ６２Ａ）（ｈｚ２８２－１１）及び参照抗体１７５Ｄ１０は、マウス及びカニクイザルＣＬＤＮ１８．２と交差反応した。調べた抗体はすべて、ヒトＣＬＤＮ１８．２に対する結合が、カニクイザル及びマウスＣＬＤＮ１８．２のものと比較して強かった。
実施例１１－キメラ抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
キメラ抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対して特異的なＡＤＣＣを誘導した。
抗ＣＬＤＮ１８．２抗体誘導ＡＤＣＣの特異性を、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１及びＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞で調べた。標的細胞であるＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１及びＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２を、ＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって最終濃度２．５μＭにて３０分間標識した。標識した標的細胞濃度を２×１０５細胞／ｍＬに調整し、エフェクター細胞（ＦｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ）、ＣＤ１６ａを過剰発現する改変ＮＫ９２細胞株、ＩｍｍｕｎｅＯｎｃｏによって開発されたもの）を、８×１０５細胞／ｍＬに調整した。次に、５０μＬの標的細胞懸濁液、１００μＬのエフェクター細胞懸濁液及び５０μＬの連続希釈抗体を各ウェルで混合した（エフェクター細胞／標的細胞比は８：１であった）。各濃度の抗体に対して二連ウェルを調製した。対照群は、エフェクター細胞のみとインキュベートしたがん細胞で構成した。３７℃、５％ＣＯ２にて４～１６時間のインキュベーション後、１μｇ／ｍＬの７－ＡＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、フローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ）により分析した。ＡＤＣＣは次式によって計算した：ＡＤＣＣ％＝抗体を含む７－ＡＡＤ陽性細胞％－抗体を含まない７－ＡＡＤ陽性細胞％。
抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及びＦｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ）細胞は、ＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２胃細胞株に対してＡＤＣＣを誘導した
キメラ抗体及びヒト化抗体のＡＤＣＣを、ＮＣＩ－Ｎ８７癌細胞で調べた。標的細胞を、ＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって最終濃度２．５μＭにて３０分間標識した。標識した標的細胞濃度を２×１０５細胞／ｍＬに調整し、エフェクター細胞（ＦｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ）を、８×１０５細胞／ｍＬに調整した。次に、５０μＬの標的細胞懸濁液、１００μＬのエフェクター細胞懸濁液及び５０μＬの連続希釈抗体を各ウェルで混合した（エフェクター細胞／標的細胞比は８：１であった）。各濃度の抗体に対して二連ウェルを調製した。対照群は、エフェクター細胞のみとインキュベートしたがん細胞で構成した。３７℃、５％ＣＯ２にて４～１６時間のインキュベーション後、１μｇ／ｍＬの７－ＡＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、フローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ）により分析した。ＡＤＣＣは次式によって計算した：ＡＤＣＣ％＝抗体を含む７－ＡＡＤ陽性細胞％－抗体を含まない７－ＡＡＤ陽性細胞％。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２胃癌細胞株に対してＡＤＣＣを誘導した
ＰＢＭＣが誘導するキメラ抗体及びヒト化抗体のＡＤＣＣを、ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２胃癌細胞で調べた。凍結保存された健常者のＰＢＭＣ（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）を、アッセイの前日に解凍し、２００ＩＵのＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ）とともに、ＲＰＭＩ－１０％ＦＢＳ培地中、ＣＯ２インキュベーター内で終夜培養した。これら標的細胞を、ＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により最終濃度２．５μＭで１５分間標識した。染色後、細胞濃度を６×１０４細胞／ｍＬに調整し、１×１０６細胞／ｍＬに調整した２倍容量のＰＢＭＣと混合した（エフェクター細胞／標的細胞比は４０：１であった）。次に、１５０μＬの混合された標的及びエフェクター細胞の懸濁液ならびに５０μＬの連続希釈抗体を各ウェルで混合した。各濃度の抗体に対して二連ウェルを調製した。標的細胞単独が対照群であった。３７℃、５％ＣＯ２にて５時間のインキュベーション後、１μｇ／ｍＬのＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、フローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ）により分析した。特異的細胞傷害は次式により計算した：特異的細胞傷害＝抗体を含むＰＩ陽性細胞％－抗体を含まないＰＩ陽性細胞％。
腫瘍特異的ｍＡｂは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を含めたＦｃベースのメカニズムを通じてそれらの効果を発揮する可能性がある。ＣＬＤＮ１８．２特異的キメラ抗体のＡＤＣＣ機能を、選択された抗体の存在下、ＮＫ細胞株またはＰＢＭＣ誘導ＡＤＣＣによって分析した。図１４Ａ～図１４Ｂに示すように、キメラ抗体を、ヒトＣＬＤＮ１８．１を安定に発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１）またはヒトＣＬＤＮ１８．２を安定に発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２）に対してＦｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ）でＡＤＣＣを誘導するそれらの能力について分析した。ＣＬＤＮ１８．２特異的抗体である２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）、ｘｉ１７５Ｄ１０、４１３Ｈ９Ｆ８、及び３６４Ｄ１Ａ７は、ＡＤＣＣ媒介性のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２の溶解を誘導したが、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１の溶解は誘導しなかった。ＣＬＤＮ１８．１及びＣＬＤＮ１８．２の両方に結合するクローン１０１Ｃ６は、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１細胞及びＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞の両方に対してＡＤＣＣ活性を誘導した。２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）、ｘｉ１７５Ｄ１０、４１３Ｈ９Ｆ８、及び３６４Ｄ１Ａの特異的ＡＤＣＣ活性は、ＣＬＤＮ１８．２へのそれらの特異的結合プロファイルと一致する。
ヒトＣＬＤＮ１８．２を安定に発現する胃癌株ＮＣＩ－Ｎ８７（ＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２）を、キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を調べるための標的細胞として使用した。図１５及び表１４に示すように、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）、参照抗体１７５Ｄ１０、４１３Ｈ９Ｆ８、及び３６４Ｄ１Ａ７は、ＡＤＣＣ媒介性のＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２細胞の溶解を誘導した。クローン２８２Ａ１２Ｆ３、４１３Ｈ９Ｆ８、及び３６４Ｄ１Ａ７は、参照抗体１７５Ｄ１０より高いＡＤＣＣ活性を示したが、３５７Ｂ８Ｆ８は、より低い活性を示した。Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥのＦｃバリアントは、強化された抗体のＡＤＣＣ活性を媒介することが示されている（Ｌａｚａｒ，ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｉｔｏｎ，”ＰＮＡＳ ＵＳＡ ２００６；１０３：４００５－４０１０）。１７５Ｄ１０のＦｃにおけるＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅの変異を、ＡＤＣＣ活性を高めるために導入した（１７５Ｄ１０－Ｖ２）。図１５及び表１４に示すように、ＦｃにＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅの変異を有する１７５Ｄ１０（ｘｉ１７５Ｄ１０－Ｖ２）は、その親抗体１７５Ｄ１０より高いＡＤＣＣ活性を有した。
ＣＬＤＮ１８．２特異的抗体の機能をさらに検証するため、健康なヒトドナー由来の凍結保存ＰＢＭＣを使用して、ＣＬＤＮ１８．２を安定に発現する別の胃癌株ＮＵＧＣ４（ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２）に対するそれらのＡＤＣＣ活性を調べた。図１６及び表１５に示すように、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）、ｘｉ１７５Ｄ１０、４１３Ｈ９Ｆ８、及び３６４Ｄ１Ａ７は、濃度依存的にＡＤＣＣ媒介性のＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞の溶解を誘導した。２８２Ａ１２Ｆ３、３５７Ｂ８Ｆ８、４１３Ｈ９Ｆ８、及び３６４Ｄ１Ａ７は、対照抗体１７５Ｄ１０より高いＡＤＣＣ活性を示し、４１３Ｈ９Ｆ８は、最も高い最大特異的細胞傷害を示した。
表１４．ＮＣＩ－Ｎ８７－１８．２細胞株に対するキメラ抗体のＡＤＣＣ活性
Figure 2022512132000020

＊２つの独立した実験の平均
表１５．ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞株に対するキメラ抗体のＡＤＣＣ活性
Figure 2022512132000021


＊１ドナー由来のデータ。残りのデータは、３ドナーの平均を示す。
実施例１２－キメラ抗体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性
いくつかの例では、腫瘍特異的ｍＡｂは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によってもそれらの効果を発揮する。ヒト血清及びＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株を使用して、キメラ抗体のＣＤＣ機能を検証した。３×１０４のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞５０μＬを、２５μＬの連続希釈キメラ抗ヒトＣＬＤＮ１８．２ｍＡｂと混合した。室温で１５～３０分間インキュベートした。２５μＬの４０％ヒト血清を加え、最終血清濃度１０％を得た。３７℃、５％ＣＯ２にて３０分間のインキュベーション後、１μｇ／ｍＬのＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、フローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ）により分析した。
図１７に示すように、キメラ抗体である２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）、ｘｉ１７５Ｄ１０、４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ、及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖは、ＣＤＣ媒介性のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２の溶解を誘導した。抗体２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）、４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ、及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖは、参照抗体１７５Ｄ１０と比較して強いＣＤＣを誘導した。
実施例１３－例示的な抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のヒト化
抗体２８２Ａ１２Ｆ３のヒト化
マウス抗体のヒト化を、マウス抗体由来のＣＤＲ残基をヒト生殖系列フレームワークにグラフティングすることによって行った。最初に、選択された候補のＶＨ及びＶＬ領域の配列を、ヒト生殖細胞系列配列と比較し、相同性、標準構造及び物理的特性に基づいて最良適合生殖細胞系列アクセプターを選択した。続いて、候補の構造モデルを、ホモロジーモデリングを使用して生成した。候補抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＣＤＲ領域を固定し、マウスのフレームワークを、選択されたヒト生殖細胞系フレームワークで置き換えた。ＣＤＲの立体配座に影響を与える可能性のあるマウス及びヒトのフレームワーク間で異なる残基を逆突然変異に供した。設計されたヒト化バリアントをコードするＤＮＡ断片を合成し、ＩｇＧ発現ベクターにサブクローニングした。ＤＮＡ配列をシーケンシングによって確認した。ヒト化重鎖と軽鎖の異なる組み合わせを、ＣＨＯ－Ｋ１にコトランスフェクトし、発現させた。ヒト化抗体を、例えば、該標的抗原を発現する細胞のＦＡＣＳによって、抗原結合親和性において親抗体と比較した。
このＶＨ配列には、ＴからＡに変異した１つのグリコシル化部位があった。この配列は、遊離システインもＡｓｎ／Ａｓｐ分解モチーフＮＧもＤＧも含まなかった。２８２Ａ１２ＶＨ（配列番号４０）及び２８２Ａ１２ＶＬ（配列番号４４）の元の配列を、ＢＬＡＳＴに入力して分析した。最良の突然変異部位の配列を、ＣＤＲグラフティングのための相同性分析に従って選択した。
配列番号６５～６８は、４つのバリアント２８２Ａ１２ＶＨの配列を示し、配列番号６９～７３は５つのバリアント２８２Ａ１２ＶＬの配列を示す。
表６は、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）のヒト化重鎖及び軽鎖の組み合わせを示す。
抗体４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖのヒト化
４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖのヒト化設計用に、ＣＤＲグラフティング法がわずかに異なる２つの方法を使用した。配列番号７４～７６は、３つのバリアント４１３Ｈ９Ｆ８ＶＨの配列を示し、配列番号７７～８０は、４つのバリアント４１３Ｈ９Ｆ８ＶＬの配列を示し、これらは第一の方法を使用した。表７は、４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ誘導体のヒト化重鎖及び軽鎖の組み合わせを示す。
第二の方法下では、配列番号８１～８４は、４つのバリアント４１３Ｈ９Ｆ８ＶＨの配列を示し、配列番号８５～８８は、４つのバリアント４１３Ｈ９Ｆ８ＶＬの配列を示す。表８は、４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ誘導体のヒト化重鎖及び軽鎖の組み合わせを示す。
３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖのヒト化
配列番号８９～９２は、４つのバリアント３６４Ｄ１Ａ７ＶＨの配列を示し、配列番号９３～９７は５つのバリアント３６４Ｄ１Ａ７ＶＬの配列を示す。表９は、３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ誘導体のヒト化重鎖及び軽鎖の組み合わせを示す。
実施例１４－ヒト化２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）抗体の結合活性
ヒト化抗体の結合親和性及び特異性を、ＦＡＣＳ分析により、上記のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１及びＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞を用いて親抗体のものと比較した。図１８～図１８Ｂに示すように、ｈｚ２８２－３、ｈｚ２８２－４、ｈｚ２８２－８、ｈｚ２８２－１０、ｈｚ２８２－１１、ｈｚ２８２－１２、ｈｚ２８２－１５、ｈｚ２８２－１９、及びｈｚ２８２－１０を含むヒト化２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）クローンは、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）と同様の結合親和性をＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２に対して示した。ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１に結合したヒト化クローンはなかった。このデータは、ヒト化２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）抗体が、ＣＬＤＮ１８．２への結合特異性及び親和性を保持していたことを示している。
ヒト化２８２Ａ１２Ｔ６２Ａクローンの結合親和性を、ＳＮＵ６２０胃癌細胞でさらに検証した。図１９Ａ～図１９Ｂに示すように、ヒト化２８２Ａ１２Ｔ６２Ａクローンの大部分は、ＳＮＵ６２０癌細胞に対して高い結合親和性を示した。２８２Ａ２－ＶＨｇ０重鎖を含む抗体、例えば、ｈｚ２８２－１、ｈｚ２８２－５、ｈｚ２８２－９、ｈｚ２８２－１３、及びｈｚ２８２－１７は、ＳＮＵ６２０に結合しなかった。これは、２８２Ａ１２（Ｔ６２Ａ）のＶｈ領域のＦＲ３における少なくとも２つの残基、すなわち、Ｋ及びＶが、ＳＮＵ６２０への結合に関与していることを示している（表６）。
結合親和性及び特異性のデータを表１６に要約する。２８２Ａ１２（Ｔ６２Ａ）のヒト化抗体のほとんどは、父系の抗体の特異性及び親和性を保持していた。
表１６．ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２及びＳＮＵ６２０癌細胞株に対するヒト化２８２Ａ１２（Ｔ６２Ａ）抗体の結合活性の要約。
Figure 2022512132000022
Figure 2022512132000023
－、未試験または該当なし
実施例１５－ヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体の結合活性
ヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体の結合親和性及び特異性を、ＦＡＣＳ分析により、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１及びＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞を用いて親抗体のものと比較した。図２０Ａ～図２０Ｄ、図２１Ａ～図２１Ｄ、表１７、及び表１８に示すように、調べたヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体のすべてが、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対して４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖと同等の結合親和性を示した。図２２Ａ～図２２Ｅ及び表１９に示すように、調べたヒト化３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体のすべてが、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対して３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖと同等の結合親和性を示した。ヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体の結合親和性を、ＳＮＵ６２０胃癌細胞でさらに検証した。図２３Ａ～図２３Ｃに示すように、調べたヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体のすべてが、それらの親抗体と比較して、ＳＮＵ６２０胃癌細胞に対して同様の親和性を示した。このデータは、ヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体が、結合特異性及び親和性を保持していたことを示している。
表１７．ヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体（方法１）のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対する結合のＥＣ５０。
Figure 2022512132000024
表１８．ヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体（方法２）のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２に対する結合のＥＣ５０。
Figure 2022512132000025
表１９．ヒト化３６４Ｄ１Ａ７抗体のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２に対する結合のＥＣ５０。
Figure 2022512132000026
実施例１６－例示的なヒト化抗体のＡＤＣＣ機能
ヒト化抗体のＣＬＤＮ１８．２特異的ＡＤＣＣ活性を、上記のようにＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１及びＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株で検証した。図１４Ａ～図１４Ｂに示すように、ヒト化抗体４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ１Ｌ１及び３６４Ｄ１Ａ７－Ｈ１Ｌ１は、ＡＤＣＣ媒介性のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２の溶解を誘導したが、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．１の溶解は誘導しなかった。これにより、ヒト化抗体が、それらの親抗体の標的特異性を保持していたことが示された。
ヒト化抗体のバリアント及び親抗体のＡＤＣＣ効果を分析した。簡潔には、エフェクターＦｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ）細胞を、ＣＦＳＥ標識標的細胞ＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２とエフェクター：標的細胞比８：１で混合した。混合細胞をヒト化抗体とともに４時間培養した。ＡＤＣＣ効果は、上記のように分析及び計算した。図２４Ａ～図２４Ｃ及び表２０に示すように、調べたヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体のほとんどすべてが、それらの親抗体と比較して、それぞれ同様のＡＤＣＣ活性を示した。ヒト化抗体のＡＤＣＣ活性を、ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２胃癌細胞に対して上記のようにＰＢＭＣでさらに調べた。図２５Ａ～図２５Ｃ及び表２１に示すように、調べたヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ抗体のほとんどすべてが、それらの親抗体と比較して、それぞれ同様のＡＤＣＣ活性を示した。
表２０．ＦｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ）細胞での４１３Ｈ９Ｆ８及び３６４Ｄ１Ａ７抗体のヒト化抗体のＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２胃癌細胞に対するＥＣ５０及び最大ＡＤＣＣ活性。
Figure 2022512132000027
表２１．ＰＢＭＣでの４１３Ｈ９Ｆ８及び３６４Ｄ１Ａ７抗体のヒト化抗体のＮＵＧＣ４－ＣＨＯ１８．２胃癌細胞に対するＥＣ５０及び最大ＡＤＣＣ活性。
Figure 2022512132000028
＊１ドナー由来のデータ。他のデータは３ドナーの平均である
実施例１７ ヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＦｃバリアントのＡＤＣＣ活性。
重鎖が異なるＧ１ｍ１（Ｄ３５６／Ｌ３５８）、Ｇ１ｍ－１（Ｅ３５６／Ｍ３５８）、Ｇ１ｍ３（Ｒ２１４）、及びＧ１ｍ１７（Ｋ２１４）を含むヒトＩｇＧ１の４つの主要なアロタイプがある。アロタイプは共優性のメンデルの法則で遺伝し、アフリカ人、白人、及びモンゴロイドの集団では様々な組み合わせが見られる（ＰＭＩＤ：２５３６８６１９、２６６８５２０５）。これらの試験に含まれる抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、Ｄ３５６／Ｌ３５８またはＥ３５６／Ｍ３５８のＦｃバリアントを有する。例えば、参照抗体Ｘｉ１７５Ｄ１０には、Ｄ３５６／Ｌ３５８のＦｃバリアントを有する。Ｄ３５６／Ｌ３５８及びＥ３５６／Ｍ３５８のＦｃバリアントを有する抗体が同様のＡＤＣＣ活性を有することは注目に値する（データは示さず）。該ＦｃのＤ３５６／Ｌ３５８を有する抗体を示すために「ＤＬ」の名称接尾辞を付加したが、Ｅ３５６／Ｍ３５８バリアントのものに関しては、特定の名称接尾辞を付加しなかった。Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ及びＦ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌの突然変異を含む様々なＦｃの改変法を開発し、抗体のエフェクター機能を高めている（ＰＭＩＤ：２９０７０９７８）。
Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥまたはＦ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６ＬのＦｃバリアントを有する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を生成し、それらのエフェクター機能を改善した。Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥのＦｃバリアントを有する抗体には、「Ｖ２」の名称接尾辞を付加し、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６ＬのＦｃバリアントを有する抗体には、「ＭＧ」の名称接尾辞を付加した。
異なるＦｃバリアントを有する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＡＤＣＣ効果を、上記のようにＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞株で評価した。簡潔には、エフェクターＦｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ）細胞を、ＣＦＳＥ標識標的細胞ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２とエフェクター：標的細胞比４：１で混合した。混合細胞を抗体とともに４時間培養した。ＡＤＣＣ効果は、上記のように分析及び計算した。図３１及び表２２に示すように、４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ２－Ｖ２－ＤＬ及び４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ２－ＭＧ－ＤＬの両方が、親抗体４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ２と比較して高いＡＤＣＣ活性を示した。
表２２．ＦｃＲ－ＴＡＮＫ（ＣＤ１６Ａ－１５Ｖ）細胞での４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ２バリアントのＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対するＡＤＣＣ活性。
Figure 2022512132000029
ＮＡ．該当なし
ヒト化抗体のＡＤＣＣ活性を、ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２胃癌細胞に対して上記のようにＰＢＭＣでさらに調べた。異なるＦｃバリアントを有するヒト化抗体４１３Ｈ９Ｆ８抗体及び４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ２を、ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対して、ヒトＰＢＭＣがＡＤＣＣを誘導する能力について、エフェクター：標的細胞比４０：１で分析し、細胞を５時間培養した。データは、健康な１ドナー由来のＰＢＭＣから生成される。各データポイントは、二連の平均値を表す。図３２及び表２３に示すように、４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ２及び４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ２の「Ｖ２」及び「ＭＧ」の両バリアントが、それらの親抗体と比較して、それぞれ高いＡＤＣＣ活性を示した。
表２３．ヒトＰＢＭＣでの４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ２及び４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ２バリアントのＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２胃癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性。
Figure 2022512132000030
 ＮＡ．該当なし
実施例１８－選択されたヒト化抗体のＣＤＣ活性
ヒト化抗体バリアントのＣＤＣ活性を分析し、それらのＣＤＣ機能を上記のように親抗体と比較した。図２６Ａ～図２６Ｂ及び表２４に示すように、調べたヒト化４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ及び３６４Ｄ１Ａ７－ＶＬ－Ｓ３２Ｖクローンのほとんどすべてが、それらの親抗体と比較して、それぞれ同様のＣＤＣ活性を示した。
表２４．ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対するヒト血清で誘導されたＣＤＣによる選択されたヒト化４１３Ｈ９Ｆ８及び３６４Ｄ１Ａ７クローンのＥＣ５０。
Figure 2022512132000031
実施例１９ 腫瘍細胞による抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の内在化。
腫瘍細胞による抗体の内在化を、３７℃でインキュベートして抗体の内在化を誘導した後の抗体の細胞表面保持を検出することによって間接的に特定した。簡潔には、ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２及びＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２細胞を収集し、洗浄緩衝液（１％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で洗浄し、１×１０５細胞／５０μＬに調整した。抗体を２０μｇ／ｍＬに希釈し、５０μＬの希釈抗体を体積比１：１で細胞と混合した後、氷浴で３０分間インキュベートした。細胞を予冷洗浄緩衝液で２回洗浄し、８００μＬの予冷洗浄緩衝液に再懸濁した。１００μＬの細胞懸濁液を９６ウェルプレートに異なる時点で加え、３７℃でインキュベートした。２００μＬの予冷洗浄緩衝液を加え、すべてのサンプルのエンドサイトーシス温度条件を終了した。氷浴でインキュベートしたサンプルを、内在化がないまたは最小限の対照として設定した。１回洗浄した後、１００μＬ／ウェルの二次抗体（ＡＦ６４７－ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ、Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１０９－６０６－１７０、１：８００希釈）を加え、氷浴で３０分間インキュベートした。細胞を予冷洗浄緩衝液で２回洗浄し、２００μＬの予冷洗浄緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ）で分析した。
抗体の内在化％＝［ＭＦＩ（氷浴インキュベート）－ＭＦＩ（異なる時間３７℃インキュベート）］／ＭＦＩ（氷浴インキュベート）×１００％。
図３３Ａに示すように、Ｘｉ１７５Ｄ１０－Ｖ２及び２８２Ａ１２Ｆ３（Ｘｉ２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）－Ｖ２－ＤＬ、ｈｚ２８２－１１－Ｖ２及びｈｚ２８２－１５－Ｖ２バリアントを含む）は、ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞によって迅速に内在化され、これら抗体の８０％超は、３７℃で２時間のインキュベーション後に内在化された。Ｘｉ３５０Ｇ１２Ｅ１－Ｖ２－ＤＬ及びＸｉ３２５Ｅ８Ｃ８０Ｖ２－ＤＬの約５０％は、ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞によって、３７℃で２時間のインキュベーション後に内在化された。４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ－Ｖ２－ＤＬならびにＸｉ４０８Ｂ９Ｄ４－Ｖ２－ＤＬ、Ｘｉ４１７Ｈ３Ｂ１－Ｖ２－ＤＬ、Ｘｉ３２８Ｇ２Ｃ４－Ｖ２－ＤＬ及びＸｉ３２５Ｆ１２Ｈ３－Ｖ２－ＤＬの１５％未満が、ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞によって、３７℃で２時間のインキュベーション後に内在化されたことは注目に値した。ＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２細胞もまた、内在化アッセイに使用した（図３３Ｂ）。具体的には、Ｘｉ１７５Ｄ１０－Ｖ２、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｘｉ２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）－Ｖ２－ＤＬ、ｈｚ２８２－１１－Ｖ２及びｈｚ２８２－１５－Ｖ２バリアントを含む）、ｘｉ３５０Ｇ１２Ｅ１－Ｖ２－ＤＬ及びＸｉ３２５Ｅ８Ｃ８０Ｖ２－ＤＬの５０％超が、ＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２細胞によって、３７℃で２時間のインキュベーション後に内在化された。４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ－Ｖ２－ＤＬ、Ｘｉ４０８Ｂ９Ｄ４－Ｖ２－ＤＬ、Ｘｉ４１７Ｈ３Ｂ１－Ｖ２－ＤＬ、Ｘｉ３２８Ｇ２Ｃ４－Ｖ２－ＤＬ及びＸｉ３２５Ｆ１２Ｈ３－Ｖ２－ＤＬの３０％未満が、ＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２細胞によって、３７℃で２時間のインキュベーション後に内在化された。
全体として、胃癌細胞株で過剰発現するＣＬＤＮ１８．２への２８２Ａ１２Ｆ３の関与は、抗体の高レベルの内在化をもたらすが、抗体４１３Ｈ９Ｆ８－ＶＬ－Ｓ３２Ｖ－Ｖ２－ＤＬ、Ｘｉ４０８Ｂ９Ｄ４－Ｖ２－ＤＬ、Ｘｉ４１７Ｈ３Ｂ１－Ｖ２－ＤＬ、Ｘｉ３２８Ｇ２Ｃ４－Ｖ２－ＤＬ及びＸｉ３２５Ｆ１２Ｈ３－Ｖ２－ＤＬは、最小から軽度の抗体内在化を誘発するのみであり、抗体Ｘｉ１７５Ｄ１０－Ｖ２、Ｘｉ３２５Ｅ８Ｃ８０Ｖ２－ＤＬ及びｘｉ３５０Ｇ１２Ｅ１－Ｖ２－ＤＬは、中～高レベルの内在化を誘導する。
実施例２０－抗体薬物コンジュゲーション
裸抗体１７５Ｄ１０（ｘｉ１７５Ｄ１０）、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）及びアイソタイプ対照抗体ヒトＩｇＧ１を、ｍｃ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ、すなわち、開裂可能なバリン－シトルリン（ｖｃ）リンカーを含むモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）誘導体にコンジュゲートした（図２７）。簡潔には、抗体を４時間かけて４℃の冷蔵庫で解凍し、コンジュゲーション緩衝液（２５ｍＭのＮａ２Ｂ４Ｏ７、２５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＰＡ、ｐＨ７．４）に対して４℃で終夜透析した。新たに調製したＴＣＥＰ使用液（５ｍＭのＴＣＥＰを含むシステイン－マレイミドコンジュゲーション緩衝液、ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）を加え、２５℃の水浴で２時間インキュベートすることによって抗体を還元した。抗体は、新たに調製したｍｃ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（ＸＤＣＥｘｐｌｏｒｅｒ）のＤＭＳＯ（１０ｍＭ）使用液で、６の比にて、１０％ｖ／ｖの有機溶媒（ＤＭＳＯ）の存在下、その混合物を２５℃の水浴で２時間インキュベートしてコンジュゲートした。この抗体薬物コンジュゲーションを、Ｌ－ヒスチジン透析緩衝液（２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、ｐＨ５．５）に対して４℃にて終夜透析した。透析緩衝液の交換を４時間後に１回行った。最終生成物を取り出し、０．２ｍフィルターでろ過し、品質をＨＩＣ－ＨＰＬＣで分析した。ＨＩＣ－ＨＰＬＣの結果、すべてのコンジュゲートの薬物対抗体比（ＤＡＲ）値が３．５～４．０の範囲であることが示された（表２５）。ＴＣＥＰのモル比の増加に伴い、ＡＤＣのＤＡＲ値も増加した。
表２５．ＡＤＣのＤＡＲ値。
Figure 2022512132000032
実施例２１－ＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対するＡＤＣの殺細胞活性
ｘｉ－１７５Ｄ１０－ｖｃＭＭＡＥ、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）－ｖｃＭＭＡＥ、及びｈｕＩｇＧ１－ｖｃＭＭＡＥ（３つの異なるＤＡＲを有する）ならびに対応する裸抗体の細胞毒性を、ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９（ＨＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２）細胞株で調べた。簡潔には、ＨＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２細胞を、９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて終夜増殖させた。裸抗体及びＡＤＣを４倍濃度（６０μｇ／ｍＬ、４００ｎＭ）で調製し、細胞増殖培地にて５倍連続希釈した。１００μＬの一次希釈液を１００μＬの培地と混合して２倍濃度にした。各複合希釈液５０μＬを、三連で細胞に加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて５日間インキュベートした。細胞毒性は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ発光細胞生存アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で特定した。１００μｌ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬を加え、細胞生存を読み取った。シェーカー上で室温にて１０分間インキュベートし、Ｅｎｖｉｓｉｏｎで発光を記録した。
図２８Ａ～図２８Ｂに示すように、細胞生存率は、裸抗体での処理では影響を受けなかったが、ＡＤＣ ２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）－ｖｃＭＭＡＥ及びｘｉ１７５Ｄ１０－ｖｃＭＭＡＥで処理した場合、濃度依存的に細胞生存率が低下した。さらに、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）－ｖｃＭＭＡＥは、細胞死の誘導においてｘｉ１７５Ｄ１０－ｖｃＭＭＡＥと比較して効率が高かった。ＡＤＣ ２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）－ｖｃＭＭＡＥ及びｘｉ１７５Ｄ１０－ｖｃＭＭＡＥは、ＣＬＤＮ１８．２陰性であるＨＥＫ２９３細胞の生存率に影響を与えなかった。これは、ＡＤＣ ２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）－ｖｃＭＭＡＥ及びｘｉ１７５Ｄ１０－ｖｃＭＭＡＥが、ＣＬＤＮ１８．２陽性細胞の生存を特異的に阻害することを示している。
実施例２２－ＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対するＡＤＣの殺細胞活性
ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現する２つ胃癌細胞株、すなわち、ＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２及びＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞を使用して、上記のようにＡＤＣの殺細胞活性を調べた。図２９Ａ～図２９Ｂに示すように、細胞生存率は、ＡＤＣ ２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）－ｖｃＭＭＡＥ及びｘｉ１７５Ｄ１０－ｖｃＭＭＡＥで処理した場合、濃度依存的に低下した。さらに、２８２Ａ１２（Ｔ６２Ａ）－ｖｃＭＭＡＥのＡＤＣは、ｘｉ１７５Ｄ１０－ｖｃＭＭＡＥよりも高い殺細胞を誘導した。ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２は、ＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２細胞と比較して、ＡＤＣが誘導する細胞死に対する感受性が低かった。
実施例２３－ＡＤＣＣに対する感受性が低い細胞に対するＡＤＣの殺細胞活性
ＣＬＤＮ１８．２で安定にトランスフェクトし、キメラ２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）が媒介するＡＤＣＣ効果に対する感受性が低いことが分かった（図３０Ａ）膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ－１－ＣＬＤＮ１８．２を、ＡＤＣ依存性殺細胞アッセイに使用した。図３０Ｂに示すように、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）－ｖｃＭＭＡＥ及びｘｉ１７５Ｄ１０－ｖｃＭＭＡＥの両方がＰＡＮＣ－１－ＣＬＤＮ１８．２細胞の生存を濃度依存的に阻害し、２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）－ｖｃＭＭＡＥは、ＰＡＮＣ－１－ＣＬＤＮ１８．２細胞の細胞死の誘導において、ｘｉ１７５Ｄ１０－ｖｃＭＭＡＥよりも強力であった。
要約すれば、抗ＣＬＤＮ１８．２－ＡＤＣは、ＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２、ＮＣＩ－Ｎ８７－ＣＬＤＮ１８．２、及びＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２を含むＣＬＤＮ１８．２を過剰発現する細胞株を殺した。２８２Ａ１２Ｆ３（Ｔ６２Ａ）－ｖｃＭＭＡＥは、調べた細胞株の生存の阻害において、ｘｉ１７５Ｄ１０－ｖｃＭＭＡＥよりも強力であった。さらに、薬物－抗体比３．５～４．０の範囲では、ＡＤＣの殺細胞活性を調節することが認められなかった（表２６）。
表２６．ＣＬＤＮ１８．２特異的ＡＤＣの殺細胞活性
Figure 2022512132000033
実施例２４ ヌードマウスのヒト胃癌ＧＡ０００６患者由来異種移植（ＰＤＸ）モデルにおける抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の効果。
抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のインビボ効果を、ヌードマウスの患者由来異種移植（ＰＤＸ）モデルで調べた。ＧＡ０００６は、腺癌型、すなわち、多コピーＥＲＢＢ２の病理学的診断をされたアジア人の胃癌患者の胃から得た。ＧＡ０００６でのＣＬＤＮ１８．２の高発現は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を用いたＩＨＣ及びＦＡＣＳ分析によって確認した（データは示さず）。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、約３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍのサイズの腫瘍を右足首から皮下移植した。平均腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に達した時点で、マウスをランダムに８群（１群あたり８匹）：ＰＢＳ、ｈＩｇＧ１アイソタイプ（１００ｍｇ／ｋｇ）、ｘｉ１７５Ｄ１０－Ｖ２、４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ２－Ｖ２－ＤＬ及び４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ２－Ｖ２－ＤＬ（５０及び１００ｍｇ／ｋｇ）に分けた。腫瘍体積の変動係数は４０％未満であった。これは次式により計算した：ＣＶ＝ＳＤ／ＭＴＶ×１００％。ランダム化の当日を０日目として記録した。マウスの処理を０日目に開始した。抗体を週３回、３週間にわたり、交互に静脈内注射と腹腔内注射で投与した。腫瘍サイズを週２回観察した。
図３４に示すように、５０ｍｇ／ｋｇのｘｉ１７５Ｄ１０－Ｖ２または４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ２－Ｖ２－ＤＬでの処理は、アイソタイプ（１００ｍｇ／ｋｇ）群と比較して、腫瘍の成長を遅らせたものの、有意差をもたらさなかった（ｐ＞０．０５）。１００ｍｇ／ｋｇのｘｉ１７５Ｄ１０－Ｖ２及び４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ２－Ｖ２－ＤＬでの処理は、アイソタイプ（１００ｍｇ／ｋｇ）で処理されたものと比較して、有意に腫瘍成長を抑制した（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）。５０及び１００ｍｇ／ｋｇの両４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ２－Ｖ２－ＤＬでの処理は、アイソタイプ（１００ｍｇ／ｋｇ）で処理されたものと比較して、有意に腫瘍成長を抑制した（ｐ＜０．０００１）。５０ｍｇ／ｋｇの４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ２－Ｖ２－ＤＬでの処理は、ｘｉ１７５Ｄ１０－Ｖ２（５０ｍｇ／ｋｇ）及び４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ２－Ｖ２－ＤＬ（５０ｍｇ／ｋｇ）で処理されたものと比較して、有意に腫瘍成長を抑制した（ｐ＜０．０００１及びｐ＜０．０１）。１００ｍｇ／ｋｇの４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ２－Ｖ２－ＤＬでの処理は、ｘｉ１７５Ｄ１０－Ｖ２（１００ｍｇ／ｋｇ）及び４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ２－Ｖ２－ＤＬ（１００ｍｇ／ｋｇ）で処理されたものと比較して、有意に腫瘍成長を抑制した（ｐ＜０．００１及びｐ＜０．０００１）。
実施例２５ Ｎｕ／Ｎｕマウスの膵臓癌のマウス異種移植モデルにおける抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の効果
抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のインビボ効果を、Ｎｕ／Ｎｕマウスの膵臓癌の皮下異種移植モデルで調べた。ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現する膵臓癌細胞株ＭＩＡ Ｐａｃａ－２（ＭＩＡ Ｐａｃａ－２－ＣＬＤＮ１８．２）を、１０％ウシ胎児血清、２．５％馬血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、５μｇ／ｍＬのブラストサイジンを添加したＤＭＥＭ培地中、３７℃にて、５％ＣＯ２を含む空気の雰囲気中、単層培養としてインビトロで維持した。ＭＩＡ Ｐａｃａ－２－ＣＬＤＮ１８．２細胞を、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により週２回定期的に継代培養した。指数増殖期に増殖中のＭＩＡ Ｐａｃａ－２－ＣＬＤＮ１８．２細胞を回収し、腫瘍接種用に計数した。４～６週齢のＮｕ／Ｎｕヌードマウスの雌に、５×１０６のＭＩＡ Ｐａｃａ－２－ＣＬＤＮ１８．２細胞を含む０．２ｍｌのＰＢＳ（Ｍａｔｒｉｇｅｌを補充、ＰＢＳ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ＝１：１）を右脇腹から皮下移植し、腫瘍を成長させた。Ｐａｃａ－２－ＣＬＤＮ１８．２担腫瘍Ｎｕ／Ｎｕマウス（１群あたり１０匹）の処理を腫瘍移植の３日後に開始した。抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（１０及び４０ｍｇ／ｋｇ）を、週２回、５週間にわたり、交互に静脈内注射と腹腔内注射で投与した。ＰＢＳまたはアイソタイプ（ｈＩｇＧ１、４０ｍｇ／ｋｇ）で処理した担腫瘍Ｎｕ／Ｎｕマウスを陰性対照として設定した。
Ｘｉ１７５Ｄ１０－Ｖ２、４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ２－Ｖ２－ＤＬで１０及び４０ｍｇ／ｋｇにて処理したマウスは、ＰＢＳまたはアイソタイプ（４０ｍｇ／ｋｇ）で処理したマウスと比較して、有意な腫瘍成長の遅延を示した（ｐ＜０．０１）（図３５Ａ～Ｄ）。４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ２－Ｖ２－ＤＬで４０ｍｇ／ｋｇにて処理したマウスは、ＰＢＳまたはアイソタイプ（４０ｍｇ／ｋｇ）で処理したマウスと比較して、有意に腫瘍成長を抑制した（ｐ＜０．０１）（図３５Ａ及びＥ）。４１３Ｈ９Ｆ８－ｃｐ２－Ｖ２－ＤＬで１０ｍｇ／ｋｇにて処理したマウスは、腫瘍成長を抑制したが、ＰＢＳまたはアイソタイプ（４０ｍｇ／ｋｇ）で処理したマウスと比較して、有意差のないものであった（図３５Ａ及びＥ）。
実施例２６ ヒト胃癌ＧＡ０００６患者由来異種移植（ＰＤＸ）モデルにおける抗ＣＬＤ１Ｎ８．２抗体と化学療法の組み合わせ効果
ＰＤＸマウスモデルを上記のように確立した。マウスの処理を０日目に開始した。担腫瘍マウスをＰＢＳ、ＥＯＦ（１．２５ｍｇ／ｋｇのエピルビシン、３．２５ｍｇ／ｋｇのオキサリプラチン及び５６．２５ｍｇ／ｋｇの５－フルオロウラシル）、ｘｉ１７５Ｄ１０－Ｖ２（４０ｍｇ／ｋｇ）とＥＯＦの組み合わせまたは４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ２－Ｖ２－ＤＬ（４０ｍｇ／ｋｇ）とＥＯＦの組み合わせで処理した。ＥＯＦは、週１回腹腔内に投与した。抗体を、週３回、交互に静脈内注射と腹腔内注射で投与した。腫瘍サイズを週２回観察した。合計で５回のＥＯＦ投与及び１４回の抗体処理を行った。
図３６に示すように、ＥＯＦ単独またはＥＯＦとｘｉ１７５Ｄ１０－Ｖ２もしくは４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ２－Ｖ２－ＤＬの組み合わせによる処理は、ＰＢＳで処理したものと比較して、腫瘍成長を有意に抑制した（ｐ＜０．０１）。４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ２－Ｖ２－ＤＬとＥＯＦの組み合わせは、ＥＯＦ療法単独より優れた効果を示した（ｐ＜０．０１）。しかしながら、ｘｉ１７５Ｄ１０－Ｖ２とＥＯＦの組み合わせは、ＥＯＦ療法単独と比較して良好な効果を示さなかった（ｐ＝０．１４７）。さらに、４１３Ｈ９Ｆ８－Ｈ２Ｌ２－Ｖ２－ＤＬとＥＯＦの組み合わせは、ｘｉ１７５Ｄ１０－Ｖ２とＥＯＦの組み合わせより優れていた（ｐ＜０．０５）。
実施例２７
表２７は、参照抗体１７５Ｄ１０（ｘｉ１７５Ｄ１０）の重鎖及び軽鎖の配列を示す。
Figure 2022512132000034
本開示の好ましい実施形態を示し、本明細書に記載してきたが、かかる実施形態が、例示として提供されるにすぎないことは当業者に明らかであろう。ここで、多くの変形、変更、及び置き換えが、本開示から逸脱することなく、当業者には想起されよう。本開示を実施する際には、本明細書に記載の本開示の実施形態に対する様々な代替物が使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義し、これら特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物がそれにより包含されることが意図される。

Claims (97)

  1. 半数効果濃度（ＥＣ５０）が、参照抗体１７５Ｄ１０のＥＣ５０より低い抗クローディン１８．２（抗ＣＬＤＮ１８．２）抗体であって、前記参照抗体１７５Ｄ１０は、配列番号９８に記載の重鎖（ＨＣ）配列及び配列番号９９に記載の軽鎖（ＬＣ）配列を含む、前記抗体。
  2. 翻訳後修飾部位に少なくとも１つの突然変異を含む抗クローディン１８．２（抗ＣＬＤＮ１８．２）抗体。
  3. Ｆｃ領域において抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の向上をもたらす少なくとも１つの突然変異を含む抗クローディン１８．２（抗ＣＬＤＮ１８．２）抗体であって、前記ＡＤＣＣの向上は、配列番号９８に記載の重鎖（ＨＣ）配列及び配列番号９９に記載の軽鎖（ＬＣ）配列を含む参照抗体１７５Ｄ１０と比較される、前記抗体。
  4. 前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の前記ＥＣ５０が、約５ｎＭ以下である、請求項１に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  5. 前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の前記ＥＣ５０が、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ、またはそれより低い、請求項１に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  6. ＣＬＤＮ１８．２に対する結合親和性が、参照抗体１７５Ｄ１０の結合親和性と比較して高い抗クローディン１８．２（抗ＣＬＤＮ１８．２）抗体であって、前記参照抗体１７５Ｄ１０は、配列番号９８に記載の重鎖（ＨＣ）配列及び配列番号９９に記載の軽鎖（ＬＣ）配列を含む、前記抗体。
  7. 可変重鎖（ＶＨ）領域及び可変軽鎖（ＶＬ）領域を含む請求項１～６のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体であって、前記ＶＨ領域が、以下を含む、前記抗体：
    ＣＤＲ１配列ＧＦＳＬＴＳＹＸ１ＶＸ２、
    ここで、Ｘ１は、ＮまたはＧから選択され、Ｘ２は、ＹまたはＨから選択されるもの、
    ＣＤＲ２配列ＶＩＷＸ３Ｘ４ＧＸ５ＴＸ６ＹＸ７Ｘ８Ｘ９ＬＸ１０Ｓ、
    ここで、Ｘ３は、ＮまたはＰから選択され、Ｘ４は、ＴまたはＧから選択され、Ｘ５は、ＡまたはＮから選択され、Ｘ６は、ＲまたはＮから選択され、Ｘ７は、Ｎ、Ｑ、またはＥから選択され、Ｘ８は、ＳまたはＩから選択され、Ｘ９は、ＴまたはＡから選択され、Ｘ１０は、ＫまたはＭから選択されるもの、及び
    ＣＤＲ３配列ＤＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０、
    ここで、Ｘ１１は、ＳまたはＲから選択され、Ｘ１２は、ＡまたはＲから選択され、Ｘ１３は、ＭまたはＬから選択され、Ｘ１４は、ＰまたはＡから選択され、Ｘ１５は、ＡまたはＭから選択され、Ｘ１６は、ＩまたはＤから選択され、Ｘ１７は、ＰまたはＹから選択され、Ｘ１８は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆであり、Ｘ１９は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ａであり、Ｘ２０は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｙであるもの。
  8. 前記ＶＨ領域が、以下を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体：
    ＣＤＲ１配列Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５ＳＦＧＭＨ、
    ここで、Ｘ２１は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｇであり、Ｘ２２は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆであり、Ｘ２３は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｔであり、Ｘ２４は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆであり、Ｘ２５は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｓであるもの、
    ＣＤＲ２配列ＹＩＳＳＧＳＸ２６Ｘ２７ＩＹＹＸ２８ＤＸ２９Ｘ３０ＫＧ、
    ここで、Ｘ２６は、ＳまたはＧから選択され、Ｘ２７は、ＰまたはＳから選択され、Ｘ２８は、ＶまたはＡから選択され、Ｘ２９は、ＫまたはＴから選択され、Ｘ３０は、ＬまたはＶから選択されるもの、及び
    ＣＤＲ３配列ＡＸ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１、
    ここで、Ｘ３１は、ＧまたはＴから選択され、Ｘ３２は、ＹまたはＳから選択され、Ｘ３３は、ＡまたはＹから選択され、Ｘ３４は、ＶまたはＹから選択され、Ｘ３５は、ＲまたはＹから選択され、Ｘ３６は、ＮまたはＧから選択され、Ｘ３７は、ＡまたはＮから選択され、Ｘ３８は、ＬまたはＡから選択され、Ｘ３９は、ＤまたはＬから選択され、Ｘ４０は、ＹまたはＥから選択され、Ｘ４１は、存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｙであるもの。
  9. 前記ＶＨ領域が、配列番号１からなるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列ＶＩＷＮＴＧＡＴＲＹＸ７ＳＸ９ＬＫＳ、及び配列番号３からなるＣＤＲ３配列を含み、ここで、Ｘ７は、Ｎ、Ｑ、またはＥから選択され、Ｘ９は、ＴまたはＡから選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  10. 前記ＶＨ領域が、配列番号１３からなるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列ＶＩＷＰＧＧＮＴＮＹＸ７Ｘ８ＡＬＭＳ、及び配列番号１５からなるＣＤＲ３配列を含み、ここで、Ｘ７は、ＮまたはＥから選択され、Ｘ８は、ＳまたはＩから選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  11. 前記ＶＨ領域が、配列番号１、７、１０、または１３から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２、４、５、６、８、１１、１４、１６、または１７から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号３、９、１２、または１５から選択されるＣＤＲ３配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  12. 前記ＶＨ領域が、配列番号１からなるＣＤＲ１配列、配列番号２、４、５、または６から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号３からなるＣＤＲ３配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  13. 前記ＶＨ領域が、配列番号１３からなるＣＤＲ１配列、配列番号１４、１６、または１７から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１５からなるＣＤＲ３配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  14. 前記ＶＨ領域が、配列番号７からなるＣＤＲ１配列、配列番号８からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号９からなるＣＤＲ３配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  15. 前記ＶＨ領域が、配列番号１０からなるＣＤＲ１配列、配列番号１１からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号１２からなるＣＤＲ３配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  16. 前記ＶＬ領域が、配列番号１８、２１、２４～２８、３１～３５、３８、または３９から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１９、２２、２９、または３６から選択されるＣＤＲ２配列、及び配列番号２０、２３、３０、または３７から選択されるＣＤＲ３配列を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  17. 前記ＶＬ領域が、配列番号２１または２４～２７から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２２からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号２３からなるＣＤＲ３配列を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  18. 前記ＶＬ領域が、配列番号２８または３１～３４から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２９からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号３０からなるＣＤＲ３配列を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  19. 前記ＶＬ領域が、配列番号３５、３８、または３９から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号３６からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号３７からなるＣＤＲ３配列を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  20. 前記ＶＬ領域が、配列番号１８からなるＣＤＲ１配列、配列番号１９からなるＣＤＲ２配列、及び配列番号２０からなるＣＤＲ３配列を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  21. 完全長抗体である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  22. 結合断片である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  23. 一価のＦａｂ’、二価のＦａｂ２、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ科動物抗体もしくはその結合断片を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  24. ヒト化抗体もしくはその結合断片、キメラ抗体もしくはその結合断片、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、または二重特異性抗体もしくはその結合断片を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  25. 翻訳後修飾部位に突然変異を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  26. 前記突然変異が、ＶＨ領域のアミノ酸位置６０、６１、または６２にあり、前記アミノ酸位置が、配列番号４０の６０、６１、または６２位に対応する、請求項２５に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  27. 前記突然変異が、配列番号４０のアミノ酸位置６０または６２にある、請求項２６に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  28. 前記突然変異が、配列番号５７のアミノ酸位置６０または６１にある、請求項２６に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  29. アミノ酸残基Ｎ６０での前記突然変異が、グルタミンまたはグルタミン酸への突然変異である、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  30. アミノ酸残基Ｓ６１での前記突然変異が、イソロイシンへの突然変異である、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  31. アミノ酸残基Ｔ６２での前記突然変異が、アラニンへの突然変異である、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  32. 前記突然変異が、ＶＬ領域のアミノ酸位置３１または３２にあり、前記アミノ酸位置が、配列番号４６、５２、または６０の３１または３２位に対応する、請求項２５に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  33. 前記突然変異が、配列番号４６、５２、または６０のアミノ酸位置３１または３２にある、請求項３２に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  34. アミノ酸残基Ｎ３１での前記突然変異が、アスパラギン酸またはグルタミン酸への突然変異である、請求項３２または３３に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  35. アミノ酸残基Ｓ３２での前記突然変異が、ロイシン、バリン、またはイソロイシンへの突然変異である、請求項３２または３３に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  36. 前記突然変異が、修飾抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の結合親和性を、前記参照抗体１７５Ｄ１０と比較して高める、請求項２５～３５のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  37. キメラ抗体またはその結合断片を含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  38. 前記キメラ抗体またはその結合断片が、配列番号４０～４３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号４４に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む、請求項３７に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  39. 前記キメラ抗体またはその結合断片が、配列番号４５に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号４６～５０に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む、請求項３７に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  40. 前記キメラ抗体またはその結合断片が、配列番号５１に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号５２～５６に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む、請求項３７に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  41. 前記キメラ抗体またはその結合断片が、配列番号５７～５９に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号６０～６２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む、請求項３７に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  42. 前記キメラ抗体またはその結合断片が、配列番号６３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＣＨ領域及び配列番号６４に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＣＬ領域を含む、請求項３７～４１のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  43. ヒト化抗体またはその結合断片を含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  44. 前記ヒト化抗体またはその結合断片が、配列番号６５～６８に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号６９～７３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む、請求項４３に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  45. 前記ヒト化抗体またはその結合断片が、配列番号７４～７６に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号７７～８０に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む、請求項４３に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  46. 前記ヒト化抗体またはその結合断片が、配列番号８１～８４に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号８５～８８に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む、請求項４３に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  47. 前記ヒト化抗体またはその結合断片が、配列番号８９～９２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＨ領域及び配列番号９３～９７に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性からなるＶＬ領域を含む、請求項４３に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  48. ＩｇＭのフレームワークを含む、請求項１～４７のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  49. ＩｇＧ２のフレームワークを含む、請求項１～４７のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  50. ＩｇＧ１のフレームワークを含む、請求項１～４７のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  51. 前記Ｆｃ領域に１つ以上の突然変異を含む、請求項１～５０のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  52. 前記１つ以上の突然変異が、アミノ酸位置Ｓ２３９、アミノ酸位置Ｉ３３２、アミノ酸位置Ｆ２４３、アミノ酸位置Ｒ２９２、アミノ酸位置Ｙ３００、アミノ酸位置Ｖ３０５、アミノ酸位置Ｐ３９６またはそれらの組み合わせでの突然変異を含む、請求項５１に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  53. 前記Ｆｃ領域での１つ以上の突然変異が、前記参照抗体１７５Ｄ１０に対して向上したＡＤＣＣを与える、請求項５１または５２に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  54. 前記参照抗体１７５Ｄ１０と比較して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する、請求項１～５３のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  55. さらにペイロードにコンジュゲートされる、請求項１～５４のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  56. 前記ペイロードが、アウリスタチンまたはその誘導体である、請求項５５に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  57. 前記アウリスタチン誘導体が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項５６に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  58. 前記アウリスタチン誘導体が、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、請求項５６に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  59. 薬物対抗体比（ＤＡＲ）が、約２、約３、または約４である、請求項５５～５８のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  60. 前記参照抗体１７５Ｄ１０と結合エピトープを共有する、請求項１～５９のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  61. マウス及びカニクイザルＣＬＤＮ１８．２タンパク質に対して交差結合活性を有する、請求項１～６０のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  62. ＣＬＤＮ１８．２のアイソフォームに特異的に結合する抗クローディン１８．２（抗ＣＬＤＮ１８．２）抗体。
  63. 前記ＣＬＤＮ１８．２のアイソフォームが、細胞株ＳＮＵ６２０で発現されるアイソフォームである、請求項６２に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体。
  64. 請求項１～６３に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体をコードする核酸ポリマー。
  65. 請求項６４に記載の核酸ポリマーを含むベクター。
  66. 請求項１～６３に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、及び
    医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  67. 全身投与用に製剤化される、請求項６６に記載の医薬組成物。
  68. 非経口投与用に製剤化される、請求項６６または６７に記載の医薬組成物。
  69. ＣＬＤＮ１８．２タンパク質の過剰発現を特徴とするがんを有する対象の治療方法であって、
    請求項１～６３に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体または請求項６６～６８に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それにより、前記対象における前記がんを治療することを含む、前記方法。
  70. 前記がんが消化管癌である、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記消化管癌が胃癌である、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記消化管癌が膵臓癌である、請求項７０に記載の方法。
  73. 前記消化管癌が、食道癌または胆管細胞癌である、請求項７０に記載の方法。
  74. 前記がんが、肺癌または卵巣癌である、請求項６９に記載の方法。
  75. さらに、前記対象に対して、さらなる治療薬を投与することを含む、請求項６９に記載の方法。
  76. 前記さらなる治療薬が、化学療法剤、免疫療法薬、標的治療薬、ホルモン系治療薬、幹細胞系治療薬、または放射線を含む、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記さらなる治療薬及び前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体が、同時に投与される、請求項７５または７６に記載の方法。
  78. 前記さらなる治療薬及び前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体が、連続して投与される、請求項７５または７６に記載の方法。
  79. 前記さらなる治療薬が、前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体に先立って投与される、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記さらなる治療薬が、前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の投与後に投与される、請求項７８に記載の方法。
  81. 前記さらなる治療薬及び前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体が、異なる投与として製剤化される、請求項７５～８０のいずれか１項に記載の方法。
  82. 殺細胞効果を誘導する方法であって、
    複数の細胞を、ペイロードを含む抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と、前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を内在化するのに十分な時間接触させ、それにより、前記殺細胞効果を誘導することを含む、前記方法。
  83. 前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体が、請求項１～５４に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記ペイロードが、メイタンシノイド、アウリスタチン、タキソイド、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、アマトキシン、またはそれらの誘導体を含む、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記ペイロードが、アウリスタチンまたはその誘導体を含む、請求項８３に記載の方法。
  86. 前記ペイロードが、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記ペイロードが、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、請求項８５に記載の方法。
  88. 前記細胞が、がん細胞である、請求項８２に記載の方法。
  89. 前記細胞が消化管癌に由来する、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記消化管癌が胃癌である、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記消化管癌が膵臓癌である、請求項８９に記載の方法。
  92. 前記消化管癌が、食道癌または胆管細胞癌である、請求項８９に記載の方法。
  93. 前記細胞が、肺癌または卵巣癌に由来する、請求項８８に記載の方法。
  94. インビトロ法である、請求項８２～９３のいずれか１項に記載の方法。
  95. インビボ法である、請求項８２～９３のいずれか１項に記載の方法。
  96. 前記対象がヒトである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  97. 請求項１～６３に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、請求項６５に記載のベクター、または請求項６６～６８に記載の医薬組成物を含むキット。
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