CN114316060A - 抗人cd19与cd206双特异性抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
抗人cd19与cd206双特异性抗体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗人CD19与CD206双特异性抗体及其制备方法和应用，该抗体包括特异性结合CD19的表位的第一多肽链以及特异性结合CD206的表位的第二多肽链和第三多肽链；第二多肽链分别与第一多肽链、第三多肽链彼此共价结合。本发明的抗体能够在体内与体外同时靶向人源CD20+B淋巴细胞表面的CD19分子与CD163+M2巨噬细胞表面的CD206分子，从而调节肿瘤微环境中CD20+B细胞与CD163+M2巨噬细胞之间的极性化距离，诱发CD20+B细胞与CD163+M2巨噬细胞共定位互作，促进肿瘤微环境中CD163+M2巨噬细胞，在CD20+B淋巴细胞分泌的TNF或者IFN‑γ诱导下，极性分化为CD86+M1巨噬细胞，介导肿瘤抑制与杀伤。
Description
技术领域
本申请涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种抗CD19与CD206受体胞外段的人源化IgG1型双特异性抗体及其制备方法和应用。
背景技术
目前在肿瘤相关巨噬细胞(TAM)方面的研究中，目前已经达成的共识为TAM，通常分为两种功能亚型，即经典活化的CD86+M1巨噬细胞和选择性活化的CD163+M2巨噬细胞。前者通常发挥抗肿瘤功能，包括直接介导细胞毒性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以杀死肿瘤细胞；后者可促进肿瘤细胞的发生和转移，抑制CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤血管生成，导致肿瘤进展。CD86+M1和CD163+M2巨噬细胞都具有高度的可塑性，因此可以在肿瘤微环境变化或治疗干预时相互转化。
目前针对于CD163+M2巨噬细胞与CD20+B淋巴细胞之间直接互作的机制研究尚且缺乏，但是CD86+M1细胞极性化反应的发生，需要IFN-γ和TNF-α的诱导。CD20+B淋巴细胞识别肿瘤抗原活化后，会分化为TNF或者IFN-γ分泌型CD20+B细胞。所以，如果能够在肿瘤微环境中实现CD163+M2巨噬细胞与CD20+B淋巴细胞的共定位分布或者近距离分布，将有助于CD163+M2巨噬细胞，在CD20+B淋巴细胞分泌的TNF或者IFN-γ诱导下，极性分化为CD86+M1巨噬细胞，实现肿瘤微环境的重塑，促进CD86+M1巨噬细胞介导的多元化抗肿瘤效应，达到肿瘤抑制或杀伤的治疗效果。
发明内容
本发明提供了一种抗人CD19与CD206双特异性抗体(下称anti-CD19/CD206)，可同时特异性识别CD20+B细胞表面的特异性辅助受体分子CD19受体分子胞外段，以及CD163+M2巨噬细胞表面的特异性受体分子CD206胞外段，实现体外条件下，或者体内实体瘤微环境中CD20+B细胞与CD163+M2巨噬细胞的共定位互作触发，以及极性化分布距离的调节。
本发明的抗人CD19与CD206双特异性抗体，包括特异性结合CD19的表位的第一多肽链以及特异性结合CD206的表位的第二多肽链和第三多肽链；所述第二多肽链分别与所述第一多肽链、第三多肽链彼此共价结合，其中：
(1)所述第一多肽链依次包括Anti-CD19信号肽、Anti-CD19-scFv(VH)、Anti-CD19-scFv(VL)，Anti-CD19-CH2和Anti-CD19-CH3，其中Anti-CD19-scFv(VH)与Anti-CD19-scFv(VL)彼此通过肽接头连接；
(2)所述第二多肽链依次包括Anti-CD206重链信号肽、Anti-CD206-VH、Anti-CD206-CH1、Anti-CD206-CH2和Anti-CD206-CH3；
(3)所述的第三多肽链依次包括Anti-CD206轻链信号肽、Anti-CD206-VL、Anti-CD206-CL；
Anti-CD19-scFv氨基酸序列为SEQ ID NO.3，Anti-CD19-scFv氨基酸序列为SEQID NO.5，Anti-CD206-VH氨基酸序列为SEQ ID NO.13，Anti-CD206-VL氨基酸序列为SEQ IDNO.23。
更具体的，
(1)所述第一多肽链依次包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1的Anti-CD19信号肽、氨基酸序列为SEQ ID NO.3的Anti-CD19-scFv(VH)、氨基酸序列为SEQ ID NO.5的Anti-CD19-scFv(VL)，氨基酸序列为SEQ ID NO.7的Anti-CD19-CH2以及氨基酸序列为SEQ ID NO.9的Anti-CD19-CH3，其中Anti-CD19-scFv(VH)与Anti-CD19-scFv(VH)彼此通过氨基酸序列为SEQ ID NO.27的肽接头连接；
(2)所述第二多肽链依次包括氨基酸序列为SEQ ID NO.11的Anti-CD206重链信号肽、氨基酸序列为SEQ ID NO.13的Anti-CD206-VH、氨基酸序列为SEQ ID NO.15的Anti-CD206-CH1、氨基酸序列为SEQ ID NO.17的Anti-CD206-CH2和氨基酸序列为SEQ ID NO.19的Anti-CD206-CH3；
(3)所述的第三多肽链依次包括氨基酸序列为SEQ ID NO.21的Anti-CD206轻链信号肽、氨基酸序列为SEQ ID NO.23的Anti-CD206-VL、氨基酸序列为SEQ ID NO.25的Anti-CD206-CL。
本发明还提供一种前述的抗人CD19与CD206双特异性抗体的制备方法，包括：
(1)根据前述抗体的结构域的核酸片段序列构建双特异性抗体真核表达载体；
(2)将所述真核表达载体导入宿主细胞中表达。
具体的，所述真核表达载体是利用自剪切2A肽系统构建的。
所述载体构建拼接顺序为第一多肽链的核酸片段-2A肽-第二多肽链的核酸片段-2A肽-第三多肽链的核酸片段。所述2A肽选自F2A、T2A或E2A。
更具体的，所述载体构建拼接顺序为第一多肽链的核酸片段-F2A-第二多肽链的核酸片段-T2A-第三多肽链的核酸片段。所述的宿主细胞是293F细胞。
本发明还提供一种含有前述的抗人CD19与CD206双特异性抗体的核苷酸序列的重组表达载体。
本发明还提供一种含有前述的重组表达载体的宿主细胞。
本发明还提供一种前述的抗体、制备方法或重组表达载体在制备抗肿瘤药物或药物组合物中的应用。本发明设计的anti-CD19/CD206双特异性抗体，可作为独立的抗体药物，用于实体瘤微环境的调节，诱发肿瘤抑制，或者与其他抗体药物等联合使用，协同触发肿瘤杀伤与抑制。
本发明的有益效果包括：
本发明设计了一种可以同时特异性识别人源CD20+B淋巴细胞表面CD19分子胞外段，与人源CD163+M2巨噬细胞CD206分子胞外段的IgG1型双特异性抗体，并利用“自剪切2A肽”系统，构建了真核表达载体系统，实现了anti-CD19/CD206双特异性抗体的表达、纯化，以及靶点识别特异性的验证。本发明的抗体能够在体内与体外同时靶向人源CD20+B淋巴细胞表面的CD19分子与CD163+M2巨噬细胞表面的CD206分子，从而调节肿瘤微环境中CD20+B细胞与CD163+M2巨噬细胞之间的极性化距离，通过增加两种细胞直接共定位互作的比例，或者拉近两种细胞之间的极性化分布距离，促进肿瘤微环境中CD163+M2巨噬细胞，在CD20+B淋巴细胞分泌的TNF或者IFN-γ诱导下，极性分化为CD86+M1巨噬细胞，介导肿瘤抑制与杀伤。
附图说明
图1为anti-CD19/CD206双特异性抗体结构设计示意图；
图2为流式分析双anti-CD19/CD206特异性抗体在293F细胞中的表达，其中黑色线代表未转染293F细胞；灰色线代表转染anti-CD19/CD206双特异性抗体分子表达载体的293F细胞；
图3为Anti-CD19/CD206双特异性抗体分子表达与纯化的SDS-PAGE检测图；
图4为Alexa 647-anti-CD19/CD206识别人源CD19分子特异性的流式分析，其中黑色线代表对照组；灰色线代表实验组；
图5为Alexa 647-anti-CD19/CD206识别人源CD206分子特异性的流式分析，其中黑色线代表对照组；灰色线代表实验组。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、IgG1型anti-CD19/CD206双特异性抗体的结构设计
第一，Anti-CD19-scFv以及Fc区域的设计
(1)Anti-CD19信号肽设计
氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：
METGLRWLLLVAVLKGVQC
所对应核酸序列(SEQ ID NO.2)：
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGT
(2)Anti-CD19-scFv(VHs)设计
氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：
EVKLQSGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
所对应核酸序列(SEQ ID NO.4)：
GAGGTGAAACTGCAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
(3)Anti-CD19-scFv(VLs)设计
氨基酸序列(SEQ ID NO.5)：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITRADAAPTVSIFPPSSN
所对应的核酸序列(SEQ ID NO.6)：
GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACACGGGCTGATGCTGCACCAACT GTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAT
(4)Anti-CD19-CH2结构域设计
氨基酸序列(SEQ ID NO.7)：
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
所对应的核酸序列(SEQ ID NO.8)：
GCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA
(5)Anti-CD19-CH3结构域设计(带有knob突变)
氨基酸序列(SEQ ID NO.9)：
GQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
所对应的核酸序列(SEQ ID NO.10)：
GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA
第二：Anti-CD206 Fab以及Fc区域的设计
(1)Anti-CD206重链信号肽设计
氨基酸序列(SEQ ID NO.11)：
METGLRWLLLVAVLKGVQC
所对应核酸序列(SEQ ID NO.12)：
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGT
(2)Anti-CD206-VH(VHm)结构域设计
氨基酸序列(SEQ ID NO.13)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKCSPGAKWVRQAPGKGLEWVACSPGAKRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR CSPGAKWGQGTLVTVSS
所对应的核酸序列(SEQ ID NO.14)：
GAAGTTCAGC TGGTAGAATC TGGTGGTGGT CTGGTTCAGC CAGGTGGTTCTCTGCGTCTGTCTTGTGCCGCTTCCGGCTTCAACATTAAATGCTCTCCGGGCGCTAAATGGGTTCGTCAAGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTTGCCTGTAGCCCGGGTGCAAAACGCTTCACCATCAGCGCAGACACCTCCAAAAACACGGCGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGACACCGCGGTATATTATTGTTCTCGTTGTTCCCCGGGTGCAAAATGGGGTCAGGGTACTCTGGTAACCGTTAGCAGC
(3)Anti-CD206-CH1结构域设计
氨基酸序列(SEQ ID NO.15)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP
所对应的核酸序列(SEQ ID NO.16)：
GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA
(4)Anti-CD206-CH2结构域设计
氨基酸序列(SEQ ID NO.17)：
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
所对应的核酸序列(SEQ ID NO.18)：
GCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA
(5)Anti-CD206-CH3结构域设计(hole突变)
氨基酸序列(SEQ ID NO.19)：
GQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
所对应的核酸序列(SEQ ID NO.20)：
GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAGCTGCGCGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTTAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA
(6)Anti-CD206轻链信号肽设计
氨基酸序列(SEQ ID NO.21)：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCA
所对应核酸序列(SEQ ID NO.22)：
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTACTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCC
(7)Anti-CD206-VL(VLm)结构域设计
氨基酸序列(SEQ ID NO.23)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
所对应核酸序列(SEQ ID NO.24)：
GATATCCAGATGACTCAGTCCCCGTCTTCTCTGTCTGCATCTGTTGGTGATCGTGTGACCATCACTTGTCGTGCATCTCAGGATGTGAATACCGCCGTTGCATGGTACCAGCAGAAACCGGGCAAAGCTCCGAAACTGCTGATTTACTCTGCAAGCTTTCTGTACTCTGGTGTACCAAGCCGTTTCAGCGGCTCTCGTTCTGGTACCGATTTCACTCTGACTATCTCCTCTCTGCAGCCGGAGGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAGCACTACACCACCCCGCCGACGTTCGGTCAGGGTACTAAAGTTGAAATTAAG
(8)Anti-CD206-CL结构域设计
氨基酸序列(SEQ ID NO.25)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
所对应核酸序列(SEQ ID NO.26)：
CGTACCGTAG CGGCTCCGTC TGTTTTCATT TTTCCGCCGT CTGATGAACAACTGAAAAGCGGCACTGCATCTGTGGTATG TCTGCTGAACAACTTCTATCCGCGTGAAGC CAAAGTTCAG TGGAAAGTGGATAACGCGCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAATCTGTTAC TGAACAGGAC TCTAAAGACTCCACCTATTCCCTGTCCTCTACTCTGACCC TGTCTAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTATACGCCTGTGAAGTTACC CACCAGGGCCTGTCTAGCCC GGTTACGAAGTCTTTCAACC GTGGTGAATG C
实施例2、anti-CD19/CD206双特异性抗体真核表达系统的构建
根据实施例1中的抗体结构设计，利用“自剪切2A肽”系统构建了可以在293F细胞中表达的载体，载体构建步骤如下：
1)将Anti-CD19信号肽、Anti-CD19-scFv(VH)、Anti-CD19-scFv(VL)Anti-CD19-CH2、Anti-CD19-CH3结构域所对应的核酸序列，按照以上顺序进行拼接，通过人工合成获得相应的核酸片段序列。其中，Anti-CD19-scFv(VH)与Anti-CD19-scFv(VL)结构域之间添加Linker氨基酸序列(SEQ ID NO.27：GGGGSGGGGSGGGGS)，命名为Sequence fragment 1。
2)将Anti-CD206重链信号肽、Anti-CD206-VH、Anti-CD206-CH1、Anti-CD206-CH2、Anti-CD206-CH3结构域所对应的核酸序列，按照以上顺序进行拼接，通过人工合成获得相应的核酸序列，命名为Sequence fragment 2。
3)将Anti-CD206轻链信号肽、Anti-CD206-VL、Anti-CD206-CL结构域所对应的核酸序列按照以上顺序进行拼接，通过人工合成获得相应的核酸序列，命名为Sequencefragment 3。
4)将以上人工合成获得的序列，用“自剪切2A肽”系统，进行串联拼接，拼接顺序为Sequence fragment 1-F2A-Sequence fragment 2-T2A-Sequence fragment 3-E2A-mCherry。
其中，F2A所对应的氨基酸序列为——(GSG)VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ IDNO.28)；T2A所对应的氨基酸序列为——(GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO.29)；E2A所对应的氨基酸序列为——(GSG)QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO.30)。
5)将拼接好的核酸序列采用GibsonAssembly的方法，克隆到带有CMV启动子的pHAGE载体上。
6)将以上构建好的质粒，利用脂质体瞬时转染293F细胞，进行悬浮培养表达24-48h，收集PEI瞬时转染24-48h的293F细胞，以未转染的293F细胞作为对照组，利用流式细胞仪对细胞内双特异性抗体分子的表达情况进行分析。
7)利用mCherry荧光蛋白，对双特异性抗体在293F细胞中的表达能力检测结果见图2。通过流式分析可以发现，利用“自剪切2A肽”系统构建的anti-CD19/CD206双特异性抗体分子可以在293F细胞中进行有效表达。
实施例3、anti-CD19/CD206双特异性抗体的纯化
收获表达48h的293F表达细胞以及培养上清，利用ProteinA亲和层析进行anti-CD19/CD206双特异性抗体分子纯化，利用SDS-PAGE对表达纯度以及双特异性抗体分子重链、轻链结构的合理性进行检测。结果表明，本发明实施例2中利用“自剪切2A肽”系统所设计的anti-CD19/CD206分子，可以在293F细胞实现正确的表达与剪切，anti-CD19与anti-CD206的重链部分，分子量在49-50KD左右。Anti-CD206的轻链部分，分子量在19-25KD左右(图3)。
实施例4、anti-CD19/CD206双特异性抗体靶向识别CD19受体分子的验证
对表达与纯化的anti-CD19/CD206双特异性抗体的靶点识别功能进行验证与分析。
首先，将所纯化的anti-CD19/CD206双特异性抗体分子进行Alexa Fluor647染色标记，形成Alexa 647-anti-CD19/CD206，用于后续靶点特异性结合实验的流式分析。
将表达人源CD19跨膜分子的表达载体pCDNA3-CD19瞬时转染到293F细胞中，表达24h后，收获细胞作为实验组，同时以转染pCDNA3空载体的293F细胞作为对照组。
实验组、对照组同时与Alexa 647-anti-CD19/CD206抗体分子进行孵育染色后，洗涤非特异性结合的Alexa 647-anti-CD19/CD206分子。利用流式分析Alexa647-anti-CD19/CD206在两组细胞中的结合情况，结果见图4。如图4所示，Alexa647-anti-CD19/CD206识别结合293F细胞膜表达的CD19分子后，会引发293F细胞的荧光强度偏移，表明，Alexa 647-anti-CD19/CD206可以特异性的识别与结合293F细胞表面表达的人源CD19分子。
实施例5：anti-CD19/CD206双特异性抗体靶向识别CD206受体分子的验证
对实施例4中Alexa 647-anti-CD19/CD206识别结合人源CD206分子的能力进行流式检测与分析。
将表达人源CD206分子跨膜蛋白的pCDNA3-CD206瞬时转染到293F细胞中，表达24h后，收获细胞作为实验组，同时以转染pCDNA3空载体的293F细胞作为对照组。
实验组、对照组同时与Alexa 647-anti-CD19/CD206抗体分子进行孵育染色后，洗涤非特异性结合的Alexa 647-anti-CD19/CD206分子。利用流式分析Alexa647-anti-CD19/CD206在两组细胞中的结合情况，结果见图5。如图5所示，Alexa647-anti-CD19/CD206识别结合293F细胞膜表达的CD206分子后，会引发293F细胞的荧光强度偏移，表明，Alexa 647-anti-CD19/CD206可以特异性的识别与结合293F细胞表面表达的人源CD206分子。
序列表
<110> 北京市肿瘤防治研究所
<120> 抗人CD19与CD206双特异性抗体及其制备方法和应用
<130> BJ2102295CN
<141> 2021-12-15
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgt 57
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Val Lys Leu Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
1 5 10 15
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
20 25 30
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
35 40 45
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
50 55 60
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
85 90 95
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaggtgaaac tgcagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccgtcaca 60
tgcactgtct caggggtctc attacccgac tatggtgtaa gctggattcg ccagcctcca 120
cgaaagggtc tggagtggct gggagtaata tggggtagtg aaaccacata ctataattca 180
gctctcaaat ccagactgac catcatcaag gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa 240
atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atttactact gtgccaaaca ttattactac 300
ggtggtagct atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357
<210> 5
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Asn
115 120
<210> 6
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300
gggactaagt tggaaataac acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 360
tccagtaat 369
<210> 7
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 8
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240
caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 330
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 10
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat gccgggagga gatgaccaag 60
aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 180
gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 300
ctctccctgt ccccgggtaa a 321
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 12
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgt 57
<210> 13
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Cys Ser
20 25 30
Pro Gly Ala Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Cys Ser Pro Gly Ala Lys Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr
50 55 60
Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
65 70 75 80
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Cys Ser Pro Gly Ala Lys Trp Gly
85 90 95
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105
<210> 14
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaagttcagc tggtagaatc tggtggtggt ctggttcagc caggtggttc tctgcgtctg 60
tcttgtgccg cttccggctt caacattaaa tgctctccgg gcgctaaatg ggttcgtcaa 120
gctccgggca aaggcctgga atgggttgcc tgtagcccgg gtgcaaaacg cttcaccatc 180
agcgcagaca cctccaaaaa cacggcgtac ctgcagatga acagcctgcg tgcggaagac 240
accgcggtat attattgttc tcgttgttcc ccgggtgcaa aatggggtca gggtactctg 300
gtaaccgtta gcagc 315
<210> 15
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro
<210> 16
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgccca 339
<210> 17
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240
caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 330
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 20
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 60
aaccaggtca gcctgagctg cgcggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 180
gacggctcct tcttcctcgt tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 300
ctctccctgt ccccgggtaa a 321
<210> 21
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala
20
<210> 22
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctac tgctctggct cccaggtgcc 60
agatgtgcc 69
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gatatccaga tgactcagtc cccgtcttct ctgtctgcat ctgttggtga tcgtgtgacc 60
atcacttgtc gtgcatctca ggatgtgaat accgccgttg catggtacca gcagaaaccg 120
ggcaaagctc cgaaactgct gatttactct gcaagctttc tgtactctgg tgtaccaagc 180
cgtttcagcg gctctcgttc tggtaccgat ttcactctga ctatctcctc tctgcagccg 240
gaggacttcg caacttatta ctgtcagcag cactacacca ccccgccgac gttcggtcag 300
ggtactaaag ttgaaattaa g 321
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 26
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cgtaccgtag cggctccgtc tgttttcatt tttccgccgt ctgatgaaca actgaaaagc 60
ggcactgcat ctgtggtatg tctgctgaac aacttctatc cgcgtgaagc caaagttcag 120
tggaaagtgg ataacgcgct gcagagcggc aacagccagg aatctgttac tgaacaggac 180
tctaaagact ccacctattc cctgtcctct actctgaccc tgtctaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tatacgcctg tgaagttacc caccagggcc tgtctagccc ggttacgaag 300
tctttcaacc gtggtgaatg c 321
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 28
<211> 25
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
<400> 28
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 29
<211> 21
<212> PRT
<213> 点褐翅蛾病毒(Thosea asigna virus)
<400> 29
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 30
<211> 23
<212> PRT
<213> 马鼻炎A病毒(Equine rhinitis A virus )
<400> 30
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
Claims (10)
1.一种抗人CD19与CD206双特异性抗体，其特征在于，所述抗体包括特异性结合CD19的表位的第一多肽链以及特异性结合CD206的表位的第二多肽链和第三多肽链；所述第二多肽链分别与所述第一多肽链、第三多肽链彼此共价结合，其中：
(1)所述第一多肽链依次包括Anti-CD19信号肽、重链可变区Anti-CD19-scFv、轻链可变区Anti-CD19-scFv，Anti-CD19-CH2和Anti-CD19-CH3，其中Anti-CD19-scFv与Anti-CD19-scFv彼此通过肽接头连接；
(2)所述第二多肽链依次包括Anti-CD206重链信号肽、Anti-CD206-VH、Anti-CD206-CH1、Anti-CD206-CH2和Anti-CD206-CH3；
(3)所述的第三多肽链依次包括Anti-CD206轻链信号肽、Anti-CD206-VL、Anti-CD206-CL；
Anti-CD19-scFv氨基酸序列为SEQ ID NO.3，Anti-CD19-scFv氨基酸序列为SEQ IDNO.5，Anti-CD206-VH氨基酸序列为SEQ ID NO.13，Anti-CD206-VL氨基酸序列为SEQ IDNO.23。
2.根据权利要求1所述的抗人CD19与CD206双特异性抗体，其特征在于，
(1)所述第一多肽链依次包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1的Anti-CD19信号肽、氨基酸序列为SEQ ID NO.3的Anti-CD19-scFv、氨基酸序列为SEQ ID NO.5的Anti-CD19-scFv，氨基酸序列为SEQ ID NO.7的Anti-CD19-CH2以及氨基酸序列为SEQ ID NO.9的Anti-CD19-CH3，其中Anti-CD19-scFv与Anti-CD19-scFv彼此通过氨基酸序列为SEQ ID NO.27的肽接头连接；
(2)所述第二多肽链依次包括氨基酸序列为SEQ ID NO.11的Anti-CD206重链信号肽、氨基酸序列为SEQ ID NO.13的Anti-CD206-VH、氨基酸序列为SEQ ID NO.15的Anti-CD206-CH1、氨基酸序列为SEQ ID NO.17的Anti-CD206-CH2和氨基酸序列为SEQ ID NO.19的Anti-CD206-CH3；
(3)所述的第三多肽链依次包括氨基酸序列为SEQ ID NO.21的Anti-CD206轻链信号肽、氨基酸序列为SEQ ID NO.23的Anti-CD206-VL、氨基酸序列为SEQ ID NO.25的Anti-CD206-CL。
3.权利要求2所述的抗人CD19与CD206双特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)根据权利要求2所述抗体的结构域的核酸片段序列构建双特异性抗体真核表达载体；
(2)将所述真核表达载体导入宿主细胞中表达。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述真核表达载体是利用自剪切2A肽系统构建的。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述载体构建拼接顺序为第一多肽链的核酸片段-2A肽-第二多肽链的核酸片段-2A肽-第三多肽链的核酸片段。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述2A肽选自F2A、T2A或E2A。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞是293F细胞。
8.含有权利要求1或2所述的抗人CD19与CD206双特异性抗体的核苷酸序列的重组表达载体。
9.含有权利要求8所述的重组表达载体的宿主细胞。
10.权利要求1或2所述的抗体、权利要求3-7任一项所述的制备方法或权利要求8所述的重组表达载体在制备抗肿瘤药物或药物组合物中的应用。
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