JPH02504103A

JPH02504103A - 減少したｏ‐連結グリコシレーションを有するウイルスタンパク質

Info

Publication number: JPH02504103A
Application number: JP63506102A
Authority: JP
Inventors: トムセン，ダレル・アール; ポスト，レオナルド・イー
Original assignee: ジ・アップジョン・カンパニー
Priority date: 1987-06-30
Filing date: 1988-06-17
Publication date: 1990-11-29
Also published as: WO1989000196A1; EP0364492A1; AU2083788A; KR890701745A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】減少した〇一連連結グリコシレータ３ン有するウィルスタンパク質本出願は、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ｌＪｓ　８６１０１７６１号の一部継続出願であり、それは参照のためここに挙げられている。

発明の分野本発明は減少した〇一連連結グリコシレージョンｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を有するウィルス糖タンパク質に関する。本発明はまた、かかる糖タンパク質を産生する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は減少した〇一連結グリコシレーシｉンを有する仮性狂犬病ウィルス糖タンパク質および昆虫細胞宿主においてバキニロウイルスベクターを用いて該糖タンパク質を産生ずる方法に関する。減少した〇一連連結グリコシレータタン有するこれらの糖タンパク質は、それらから派生するウィルスによる感染から動物を保護するのに有用である。

発明の背景仮性狂犬病ウィルス（ＰＲＶ）は、世界的に多くの種の動物に感染する疾患である。ＰＲＶ感染は、種々、感染性延髄麻痺、アウジェスキー病および偽狂犬病（ｍｉｄ　１ｔｃｈ）と称される。感染、は、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ラットおよびミンクのような重要な家畜動物において知られている。宿主の範囲は非常に広範であり、はとんどの哺乳動物類、および実験的には少なくとも多種の鳥類を包含する（宿主の詳細なリストについては、ディ・ビー・グスタフソン（Ｄ　、　Ｐ　、　Ｃｕｓｔｄｓｏｎ）、「シニウドラビエス（Ｐ　５ｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）Ｊ　％ディシーズ・オブ・スワイン（Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｏｆ　５ｗ１ｎｅ）　、第５版、エイ・ディ・レマンらｌｉ　（Ａ、Ｄ、Ｌｅａａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、ｅｄｓ、）　　（３９８１）参照）＃はとんどの感染動物について、該疾患は致命的である。しかしながら、成熟ブタおよび恐らくラットは該疾患により死ぬことはなく、したがって保育動物である。

ブタの集団は、特にＰＲＶに感染しやすい。成熟ブタは稀にしか徴候を示したり、または該疾患により死ぬことはないが、子ブタが感染した場合、急性に何気となり、その結果、しばしば特異的臨床徴候を示すことなく、通常、２４〜４８時間のうちに死んでしまう（ティーウー・ジランズおよびアづル・ディ・ハント　（Ｔ　、　Ｃ、Ｊ　ｏｎｅｓおよびＲ，Ｄ、Ｈｕｎｔ）、ベテリナリー・パソロジー（Ｖ　ｅｔｅｒｉｎａｒｙＰ　ａｔｈｏｌｏｇｙ）　％第５版、リー＆フェビガ−（Ｌｅｇ　＆　Ｆｅｂｉｇｅｒ）（＋９８３））。

ＰＲＶワクチンは種々の技法により産生され、ヨーロッパの流行地域においてはワクチン接種が１５年以上の間行なわれてきた。死亡者数はワクチン接種により減少したが、ワクチン接種は、環境中に該ウィルスを維持しつづけてきた。感染を予防するワクチンは産生さ！；ではいない。ビルレントウイルスに！罪されたワクチン接種動物は感染しても生き残り、ついでよりビルレントなウィルスを放出する。したがって、ワクチン接種動物は、再発しうる潜伏感染を保育しているかもしれない（ディ・ピー・グスタフソン、前掲参Ｍ）。

ＰＲＶ用の主局毒化および不活性化ワクチンは、米国において商業的に入手可能であり、ｔ、’ｓＤＡにより認可されている（シー・イ−・アロンソン編（Ｃ，Ｅ、Ａｒｏｎｓｏｎ、ｅｄ、）　、ベテリナリー・ファーマシューティカルズ・アンド・バイオロジカルズ（ｖ　ｅｔｅｒｉｎａｒｙＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、（１９８３）参照）。

ＰＲＶはヘルペスウィルスである。ヘルペスウィルスは一般に、最も複雑な動物ウィルスの１つである。それらのゲノムは、少なくとも５０個のウィルス特異的タンパク質をコードし、１５００００個以上のヌクレオチドを含宵する。最も免疫学的に反応性であるヘルペスウィルスのタンパク質のうちの１つは、とりわけ、ヴイリオン膜および感染した細胞の膜中にて見いだされ几糖タンパク質である。ＰＲＶ糖タンパク質に関する文献は、少なくとも４つのウィルス糖タンパク質に言及している（ティー・ベン−ボラートおよびエイ・ニス・カブラン（Ｔ、Ｂｅｎ　−ＰｏｒａｔおよびＡ　、　Ｓ　、　Ｋ　ａｐｌａｎ）、バイｏａジー（Ｖ　ｉｒｏｌｏｇｙ）、４１，２６５〜７３頁（１９７０）＋エイーニス・カブランおよびティー・ベン−ボラート、プロシーディンゲス・才ブ・ナシタナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　６６．７９９〜８０６頁（＋９７０））。

情報の開示ヨーロッパ特許公開番号０１２７８３９号およびヨーロッパ特許公開番号０１５５４７６号は、選択された遺伝子の発現用の組換え型バキュロウィルス発現ベクターを産生ずる方法ならびにかかるベクターに言及している。彼等は、かかるベクターを用い、ワクチン使用について、天然のタンパク質よりもより少ない〇一連連結グリコシレータタン宵するウィルス糖タンパク質を産生ずることを開示していない。これら両方の資料は、参照のためここに挙げられている。

ニス・アレクサンダーおよびジエイ・エッチ・エルダー（Ｓ　、　Ａ　１ｅｘａｎｄｅｒおよびＪ、Ｈ，Ｅｌｄｅｒ）は、「炭水化物は、ウィルス糖タンパク質抗原に対する抗血清の免疫反応性に劇的に影響を及ぼす」、ザイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２２６．１３２８〜３０頁　（＋９８４）において、エンドグリコシダーゼＦにより除去されるＮ一連結炭水化物を有するウィルス糖タンパク質が異なる抗原効果を有することを証明した。ウィルスに対して調製されたベテロ抗血清：す、Ｎ一連結炭水化物除去後のウィルス糖タンパク質に対して実質的に非反応性であった。はとんどの場合、グリコジル化された抗原に対する調製モノクローナル抗体の反応性は改良されるが、少数のケースにおいて、Ｎ一連結炭水化物のない抗原と反応させた場合の反応性は同一かまたは減少したままでありた。合成ペプチド配列に対するほとんどの抗体はまた、Ｎ一連結炭水化物除去後の反応性を改良した。

デ４’ダブル・ミラーら（Ｄ、Ｗ、Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）は、「外来遺伝子（Ｆｏｒｅｉｇｎ　Ｇｅｎｅ）の高レベル発現に関する昆虫バキュロウィルス宿主−ベクター系」、シネティック・エンジニアリング（Ｇ　ｅｎｅｔｊｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）　、８．２７７〜９８頁（１９８６）において、異種遺伝子を発現するバキュロウィルス発現系に言及している。彼等はまた、バキュロウィルス発現系の使用についての総説を提供している。この総説中、彼等は、以下のように、グリコシレージジンを包含するバキュロウィルス系におけるポストトランスレージジン修飾を検討している：［昆虫細胞によるタンパク質グリコシレーンヨンの特性についてはほとんど知られていない［引用文省略コ３０．これら細胞のＮ一連結グリコシレージョンを実施する能力は、高マンノース複合体の添加にて終わると考えられる［引用文省略コ。〇一連結グリコシレーションは間接的に試験されているにすぎない［引用文省略コ。

［昆虫細胞にて発現したタンパク質は、マンノースに富み、シアリン酸を欠いている。この点において、このラミフイケーシジン（ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は明らかでなく、多少、産生物の最終使用に依存し、関係しているようである。

５ＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動により解析した場合、昆虫細胞にて発現させたタンパク質は、しばしば、その天然の相対物よりも小さい。これは、より複雑でないグリコシレージョンによるものであり、おそらく、高マンノース複合体単位の実質的加水分解によるものである［引用文省略コ。これは、バキュロウィルス発現系の異種遺伝子産生物に関しては直接測定されていない。

「このグリコシレージョン差のｉｎ　ｖｉｖｏにおける可能な生理学上の効果に関しては、多くの研究を行なう必要がある。我々は、グリクシレージぢン差がタンパク質の生物学的活性を変える明快な事例を宵していないが、このことは必然的に観察されるであろうと考えられる。」ティー・ディ’バターズら（Ｔ、Ｄ、Ｂｕｔｔｅｒｓ、　ｅｔ　ａｌ、）は、　「蚊の細胞膜着タンパク質の生合成における工程およびツニカマイシン（Ｔ　ｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）の効果」、バイオシミ力・エト・バイオロジー・アクタ（Ｂ　１ｏｃｈ、　Ｂ　１ｏｐｈ、　Ａ　ｅｔａ）、６４０．６７２〜８６頁（１９８１）において、蚊の細胞が、糖タンパク質に付着した、Ｎ−配糖体的に連結した炭水化物鎖および〇−配糖体的に連結した鎖を合成する証拠を明らかにしている。

ジー・イー・スミスら（Ｇ、Ｅ、Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、）は、「バキュロウィルス発現ベクターで感染させた昆虫細胞におけるヒトβ−インターフェロンの産生」、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー　（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　、３．２１５６〜６５頁（＋９８３）およびニス・マエダら（Ｓ、Ｍａｅｄａ　ｅｔ　ａｌ、）は、「バキニロウイルスベクターを用いるカイコにおけるヒトα−インターフェロンの産生」、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、３１５．５９２〜９４頁（１９８５）において、各々、発現ベクターとして、オートゲラファー・カリフｔルニカおよびボニビックス・そり・ヌクレアー・ポリヘトリス・ウィルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａおよびＢｏｎｉｂｙｘ　ｌ１ｌｏｒｉ　ｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｉｓ　ｖｉｒｕｓ）　（ＡｃＮ　Ｐ　ＶおよびＢｍＮＰＶ）を用いる、スボドブテラ・フルギベルダ（Ｓ　ｐｏｄｏｐＬｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｃｌａ）細胞およびカイコにおけるβ−およびα−インターフェロンの産生に言及している。

スミスらは、そうして産生されたβ−インターフェロンがグリ；シル化されることを示している。

国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８５１０２３１９号は、Ｎ一連結炭水化物のないウィルスポリペプチド、および糖タンパク質をエンドグリコシダーゼ酵素と反応させることによりそれらを産生ずる方法に関するものであり、それを用いて、宿主動物において抗体産生を誘発することができる。

エム・ダブル・ウェイセンおよび工Ｊいケイ・ウェイセン（λ４．Ｗ。

ＷａｔｈｅｎおよびＬ　、　Ｋ　、Ｗ　ａｔｈｅｎ）は、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ　、Ｖ　１ｒｏ１．）、５１．５７〜６２頁（１９８４）において、ウィルス着タンパク質（ｇｐ５０）中に突然変異を有するＰＲＶ、およびｇｐ５０に対して定方向化されたモノクローナル抗体を中和することを利用して突然変異体を選択する方法に言及している。ウェイセンおよびウェイセンはまた、ｇｐｓｏに対して定方向化されたモノクローナル抗体が補体の助けをかりてまたはなしでＰＲＶの強力な中和剤であること、および多価免疫血清がｇｐ５０に対して高反応性であることを示し、したがうて、ｇｐ５０は重要なＰＲＶ免疫原の１つであり得ると結論している。他方、９８０００ＭＷエンベロープ糖タンパク質と反応するモノクローナル抗体は、ＰＲＶ伝染性を中和するが、他のいくつかの膜着タンパク質に対して定方向化されたモノクローナル抗体は中和活性をほとんど有さないことが報告されている（エッチ・ハングルら（Ｈ，Ｈａｍｐｌ　ｅｔ　ａｌ、）　、ジャーナル・オブ・パイロロジー、５２．５８３〜９０頁（１９８４）；およびティー・ベンーポラトおよびエイ・ニス・カブラン（Ｔ、Ｂｅれ−Ｐ　ｏｒａｔおよびＡ、Ｓ、Ｋａｐｌａｎ）、「仮性狂犬病ウィルスの分子生物学」、ビイ・ロイラマン（Ｂ、Ｒｏｉｚ＋ｎａｎ）　ｌ１Ｗｘザ・ヘルペスバイラシス（ＴｈｅＨｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ）　、３．１０５〜７３頁（１９８４））。

エル・エム・ケイ・ウェイセンら（Ｌ、Ｍ、に、Ｗａｔｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）は、パイラス・リサーチ（Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、４．１９〜２９頁（１９８５）において、ｇｐ５０およびｇＰ８３として同定されるＰＲＶ糖タンパク質に対して定方向化されたモノクローナル抗体の産生および特徴ならびにマウスをｐＲｖ感染に対して受動的に免疫とするその使用に言及している。

エイ・ケイーロビンスら（Ａ、に、Ｒｏｂｂｉｎ＊　ｅＬ　ａｌ、）は、「イー・コリー（Ｅ、Ｃｏ１１）発現プラスミドライブラリーを用いる仮性狂犬病ウィルス糖タンパク質遺伝子の位置測定」、ヘルペスパイラス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、５５１〜６１頁（１９８４）において、ＰＲＶＤＮＡを存するイー・コリー・プラスミドのライブラリーの組立てに言及している。彼等はまた、７４０００および９２０００ＭＷの糖タンパク質をコードするＰＲＶ遺伝子の同定に言及している。彼等は本発明の糖タンパク質に言及していない。

エイ・ケイ・ロビンスら、ヨーロッパ特許出願番号８５４００７０４．４号（公開番号０１６２７３８号）は、ｇ］およびｇｍとして同定されるＰ　Ｒｖ糖タンパク質の単離、クローニングおよび発現に言及している。彼等は、本発明の減少した〇一連連結グリコリレーション有するＰＲＶ糖タンパク質に言及していない。

ティー・シー・メチンライターら（Ｔ、Ｃ，Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）は、「仮性狂犬病ウィルス糖タンパク質Ａの構造遺伝子のマツピングおよび２種の非グリコジル化先駆体ポリペプチドの同定」、ジャーナル・オブ・パイロロジー、５３．５２〜５７頁（＋　９８５）において、ＰＲＶ　　ＤＮＡのＢａｍＨ１７フラグメントに対する糖タンパク質ｇＡ（これはｇｌに一致する）のコーディング領域のマツピングに言及している。彼等はまた、ＰＲＶのＢａ１ＨＩ　７フラグメントが少なくとも３種の他の６５に、６０におよび４０ＫＭＷのウィルスタンパク質をコードすることを示している。彼等は、本発明の減少した〇一連連結グリコリレーション有するウィルス糖タンパク質またはバキニロウイルスベクターを用いて昆虫細胞における類似するポリペプチドの産生を開示もしくは示唆していない。

ビ４・ｏムニクツイら（Ｂ、Ｌｏｍｎｉｃｚｉ　ｅｔ　ａｌ、）は、「仮性狂犬病ウィルスワクチン株のゲノムにおける欠失および該ゲノムの４種異性体の存在」、ジャーナル・オブ・パイロロジー、４９．９７０〜７９頁（１９８４）において、０．８５５および０．８８２マツプ単位間の独特（ｕｎｉｑｕｅ）短配列において欠失を有するＰＲＶワクチン株に言及している。これはｇｌ遺伝子の近傍においてである。ティー・シー・メチンライターらは、「仮性狂犬病ウィルスのアビルレント株は主要糖タンパク質を発現しない」、ジャーナル・オブ・パイロロジー、５６．３０７〜１１頁（１９８５）において、３種の市販ＰＲＶワクチン株が糖タンパク質ｇｌを欠くことを証明した。本発明者らはまた、最近、バルサ（Ｂ　ａｒｔｈａ）ワクチン株がｇｐ６３遺伝子の：！とんどについての欠失を有することを見いだした。

ティー・ジェイ・リ−ら（Ｔｊ　、Ｒｅａ　ｅｔ　ａｌ、）は、ジャーナル・オブ・パイロロジー、５４．２１〜２９頁（１９８５）において、感染細胞の培地中に蓄積するＰＲＶ糖タンノくり質につ（１ての遺伝子（ｇＸ）のマツピングおよび配列に言及している。そこに示されているｇＸ遺伝子のフランキング配列の中には、第６図の塩基１６８２にて特異的に開始するｇｐ５０配列が少しの割合で含まれる。

ヨーロッパ公開特許出願０１３３２００号は、ＰＲＶのキャリアと非キャリアを識別するのにある種のレシチン−結合ＰＲＶ糖タンパク質サブユニットワクチンと一緒に用いる診断抗原ファクターについて言及している。

ジー・イー・スミスら’（Ｇ、Ｅ、Ｓ＋＋ｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、）は、　「バキ、ＬＤウィルス発現ベクターにより昆虫細胞において産生されるヒト・インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）　２の修飾および分泌」、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス　ＵＳＡ。

８２．８４０４〜０８頁（１９８５）において、そのｃＤＮＡをポリへドリンプロモーター（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）に隣接するオートゲラファー・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリへドロシス・ウィルス（Ａ　ｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌ汀ｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒ　Ｐｏ１ｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ）のゲノムに挿入し、ついでこの組換え型ウィルスを用いて昆虫細胞宿主を感染させることによって、ＩＬ−２を産生ずることに言及している。彼等は、産生された組換え型」Ｌ−２がグリコジル化されている確証はないことを示している。彼等は、ワクチンとしての使用について、天然の相同体よりもより少量の〇一連連結グリコリレーション宵するウィルス糖タンパク質の産生について開示もしくは示唆本発明は天然の糖タンパク質よりも少量の〇一連結グリコシレーシ８ンを有するウィルス糖タンパク質、さらに詳しくは、該糖タンパク質が仮性狂犬病ウィルス糖タンパク質であり、さらにより詳しくは、仮性狂犬病ウィルスｇｐ５０であるウィルス糖タンパク質に関する。

天然の糖タンパク質よりも少量のグリコシレージタンを宵する糖タンパク質は、該糖タンパク質をコードするＤＮＡ配列からなるバキニロウイルスベクターを用いて感染させた昆虫細胞宿主により産生される。

さらに詳しくは、前記の昆虫細胞宿主は、スポドブテラ・フルギベルダ（Ｓ　ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ボンビックス・そり（Ｂ　ｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）、トリコブルシア・二（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）および他の鱗翅類細胞株からなる群より選択される。例えば、宿主として、ＡｃＮＰＶベクター、キャベツ・ローパー（ｃａｂｂａｇｅ　１ｏｐｐｅｒ”）または７ｔ−ルーアーミワーム（ｆａｌｌ　ａｒｇ＋ｙｖｏｒｍ）のような無傷の虫もまた用いることができる。マエダら、前掲参照。

さらに詳しくは、天然の糖タンパク質上りも少量のグリコシレージ１ンを有する糖タンパク質は、該糖タンパク質、とりわけ、ｇ９５０をコードするＤＮＡ配列からなるバキニロウィルスベクターを用いて感染させたスボドプテラ・フルギベルダ昆虫細胞宿主により産生される。

また、：（ａ）組換え型Ｄ　Ｎ　Ａ分子を調製し、該分子は糖タンパク質をコードするＤＮＡ配列と、バキニロウィルスベクターとからなり：（ｂ）昆虫宿主細胞を該組換え型Ｄ　Ｎ　Ａ分子を用いて感染させ：（ｃ　）該感染昆虫宿主細胞を培養し：および（ｄ　’）該糖タンパク質を収集することからなる、かかる減少したグリコシレージョンを有する糖タンパク質を産生ずる方法を提供する。

さらに詳しくは、該方法においては、糖タンパク質は仮性狂犬病ウィルス糖タンパク質、さらに詳しくは、ｇｐ５０である。

また、さらに詳しくは、前記方法において用いられる昆虫宿主細胞はスポドプテラ・フルギベルダである。

発明の詳説ＰＲＶの糖タンパク質ｇｐ５０をコードする遺伝子の存在および位置決定は、エム・ダブル・ウェイセンおよびエル・ダブル・ウェイセン、前掲により示された。

該遺伝子によりコードされる糖タンパク質を、特定のモノクローナル抗体と反応する糖タンパク質と定義した。この糖タンパク質は、以前に知られたＰＲＶ糖タンパク質のいずれにも対応しなかった。

ウェイセンおよびウェイセンはモノクローナル抗体に対して耐性の突然変異をマツプしたが、それは単純ヘルペスウィルスでの慣行に基づき（例えば、ティー・シー・ホランドら（Ｔ、（、、Ｈｏ１ｌａｎｄｅｔ　ａｌ、）　、ジャーナル・オブ・パイロロジ、−１５２，５６６〜７４頁（１９８４））、ｇｐ５０についての構造遺伝子の位置をマツプするものである。ウェイセンおよびウェイセンは、ｇｐ５０遺伝子をＰＲＶのＢａ＠ＨＩ７フラグメント内からのより小さな５ａｉｌ／Ｂａａ＋ＨＩフラグメントに対してマツプした。シーら前掲は、ＰＲＶ糖タンパク質ｇＸ遺伝子を同一領域に対してマツプした。

ＰＲＶＩＩＩタンパク５ｒｇｐ５０の産生およびＰＲＶ感染の予防用のサブユニットワクチンとしてのその使用に関する多くの詳細部が、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１０１７６１およびイー・エイ・ベトロフスキーズら（Ｅ、Ａ、Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ　ｅｔ　ｍｌ、　）、　ｒ仮性狂犬病ウィルスｇｐ５０、Ｎ一連結グリコシレーシリンのない糖タンパク質に関する遺伝子のＤＮＡ配列」、パイロａジー（Ｖ　ｉ　ｒｏ　ｌｏｇｙ）、５９．２１６−２３頁　（１９８６）に示されており、それらを参照のためここに挙げる。

本発明者らは、バキユロウイルスのオートゲラファー・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリへドロシス・ウィルス（ＡｃＮＰＶ）におけるポリヘトリン・プロモーターの制御下、ｇｐ５０遺伝子をクローン化した。２つの形態の遺伝子をＡｃＮＰＶ中に挿入した＝（１）完全なｇｐ５０アミノ酸配列をコードし、ＡｃＮＰＶ−ｇｐ５０と称される組換え型ウィルスを産生する無傷の遺伝子、および（２）欠失したｇＰ５０のアンカー（ａｎｃｈｏｒ）配列をコードし、ＡｃＮ　Ｐ　Ｖ　−ｇｐ５０　Ｔと称される組換え盟ウィルスを産生ずる塩基対を有する遺伝子。

ＡｃＮＰＶ−ｇｐ５０感染細胞は細胞質（ｅｅｌ　１ｕｎａｒ）形のｇｐ５０を産生じ、ＡｃＮ　Ｐ　Ｖ−ｇｐ５０　Ｔ感染細胞は培地中に分泌される切形（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）のｇｐ５０を産生した。昆虫細胞にて産生されるこれら両方の形態のｇｐ５０は、減少した〇一連連結グリコシレージジンため、哺乳動物細胞にて産生される同一のタンパク質よりも有意に低分子量であった。昆虫細胞において産生されるｇｐ５０を；１４Ｃ−グルコサミンでラベル化する。該ｇｐ５０配列は、Ｎ一連結グリコシレージ１ン部位を有していないため（イー・エイ・ベトロフスキーズら、前掲）、哺乳動物細胞にて産生されるｇｐ５０と比較し、かつ天然の糖タンパク質と比較した場合、実質的に減少したレベルであるが。

これは昆虫細胞における〇一連連結グリコシレージョンよると推定される。結果として、本発明者らは、「対応する天然のウィルス糖タンパク質よりも少量の〇一連結グリコシレーシａンを有する」として本発明の糖タンパク質に言及している。これが、〇一連連結グリコシレーククンまりたく有さない糖タンパク質を産生ずる原核生物宿主、例えば、イー・コリー（Ｅ、ｃｏｌｉ）において産生されるような糖タンパク質を包含しないことはその分野における当業者には明らかである。対比において、本発明のポリペプチドは、〇−−結炭水化物がまったくないわけではないが、対応する天然のポリペプチドと比較した場合、減少量の〇− −結グリコシレーシ−ンを有している。

ＡｃＮ　Ｐ　Ｖ　−ｇｐ５０で感染させた昆虫細胞を用い、マウスを免疫処置した。１０”個の感染細胞で一連の３回の免疫処置を行なった場合、はとんどのマウスはビルレントＰＲＶでの攻撃から生存した。

前記のように、ｇｐ５０をコードする遺伝子をＰＲ〜’　ＤＮＡのＢａｍＨＩ７フラグメントに対してマツプした。ＰＲＶからのＢａＩＩＩＨＩ７フラグメントはプラスミドｐＰＲＸｈｌ　（ｐＬｌｏ　１１２９としてもま几知られている）から誘導でき、ＤＮＡ配列解析に都合のよいフラグメントは標準的サブクローニング操作により誘導することができる。プラスミドｐＵｃ１１２９は、イー・コリーＨＢＩＯＩ、ＮＲＲＬ−Ｂ−１５７７２から入手可能である。この培養物は、米国、イリノイ州、ベオリア（Ｐｅｏｒｉａ）　、Ｕ、Ｓ、農務省、常設寄託のノーザン・リージョナル・リサーチ・センター・ファーメンテ−ジョン−ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ＦｅｒｌＩｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（Ｎ　ＲＲＬ　）から入手可能である。

ＰＵＣ１１２９を含有するイー・コリーＨＢＩＯＩは、周知操作によりＬ−ブロスにおいて増殖させることができる。典型的には、培養物を光学濃度０．６まで増殖さ仕、その後、クロラムフェニコールを添加し、該培養物を一夜振盪する。

ついで、該培養物を、例えば、高塩ＳＤＳを用いて溶解させ、上澄液を塩化セシウム／臭化エチジウムの平衡濃度グラジェント遠心作用に付し、プラスミドを得る。

ＰＲＶ糖タンパク質ｇｐｓｏのアミノ製配列を、ＰＣＴ／ＵＳ８６１０ｉ７６！のチャートＡにおいて示す。本発明の方法により産生された、天然の糖タンパク質よりも少量の〇一連結グリコシレーシ芦ンを有し、かつＰＲＶ糖タンパク質抗原性を示す糖タンパク質は、チャートＡに示される配列、ならびに該ポリペプチド配列およびまた該ポリペプチドの免疫原的機能同族体を注射された動物、例えば、哺乳動物において免疫応答を引出す能力を有するポリペプチド配列のいずれの部分も包含する。

ＰＲＶ糖タンパク質をコードする完全な遺伝子を、ベクターを組立てるのに、および昆虫宿主細胞を感染するのに用い、減少したＯ一連結グリコシレージョンを有するＰＲＶ糖タンパク質を発現させることができ、あるいはＰＲＶ糖タンパク質をコードする遺伝子フラグメントを用いることができ、それにより得−られた昆虫宿主細胞はＰＲＶ抗原性を示すポリペプチドを発現する。ＰＲＶ糖タンパク質遺伝子のいずれのフラグメントも用いることができ、その結果、ＰＲＶ糖タンパク質の免疫原フラグメントまたはその同族体であるポリペプチドを発現する。

当該分野においてよく知られているように、遺伝コードの縮重は塩基対の容易な置換を可能とし、ＰＲＶ糖タンパク質抗原性を示すポリペプチドをコードする機能的に均等な遺伝子およびそのフラグメントを産生する。これらの機能的均等物もまた本発明の範囲内に包含される。非必須アミノ酸の当該分野においてはまたよく知られている置換、およびポリペプチドのＰＲＶ抗原性に影響を及ぼさない欠失を宵するＰＲＶ糖タンパク質もまた包含される。

チャートＡおよびＢは実施例の組立てを示すために揚げられている。プラスミドおよびＤＮＡフラグメントを示すために、以下のようにある種の約束事を用いる：（１）単一線の図は、環状および線状の両方の二重鎖ＤＮＡを表わす。

（２）星印（＊）は、表わされた分子が環状であることを示す。

星印が無いのは分子が線状であることを示す。

（３）注目するエンドヌクレアーゼ制限部位は、直線の上方に示す。

（４）遺伝子は直線の下方に示す。

（５）遺伝子と制限部位の間の距離は、スケール通りではない。

特に断らない限り、図は相対的な位置のみを示す。

本発明を実施するのに用いる組換え型ＤＮＡ法のほとんどは、当業者によく知られた標準方法であり、例えば、モレキユラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、ティー・マニアナイスら（Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）　、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、（１９８２）およびビー・バーパル（Ｂ　、　Ｐ　ｅｒｂａｌ）、ア・プラクティカル・ガイド・ツー・モレキニラー壷クローニング（Ａ　　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｉｎｇ）、ジジン・ウィリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　　５ｏｎｓ）（１９８４）に詳細に記載されており、参照のｎめここに挙げる。

特に、バキュロウィルスに関連する操作は、テキサス州、カレッジ・ステーション、テキサス・アグリカルチニアル・エクステンシロン・サービス、テキサス・アグリカルチエアル・エクスペリメンタル・ステーション、カレッジ・オブ・アグリカルチャー（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｒ　Ａｇｒｉ−ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ、ＴｅｘａｓＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　５ｅｒｖｉｃｅ、ＣｏＣｏ１１ｅ　５ｔａｔｉｏｎ、Ｔｅｘａｓ）（１９８６）から出版されたエム・ディ・サマースおよびシイ・イー・スミス（Ｍ　、　Ｄ　、　Ｓ　ｕｍｍｅｒｓおよびＧ、Ｅ、５ｎｉｔｈ）、「バキュロウィルスベクターおよび昆虫細胞培養操作のマニュアル」に示されており、参照のためここに挙げる。

ここに挙げる個々の実施例は、主としてＰＲＶに関するが、他のウィルスおよび他のポリペプチドを同様の方法において、例えば、呼吸性シンチシャル（ｓｙｎｃｉＬｉａｌ）ウィルス糖タンパク質Ｇおよび単純ヘルペスウィルス糖タンパク質Ｃを用いることができることは当該分野における当業者には明らかである。

実施例１　　プラスミドｐＡｃｇｐ５０−４の組立てこの実施例においては、ポリへドロンプロモーターから下流にｇ９５０遺伝子を有し、バキュロウィルスＤＮＡによってフランクにされたプラスミドの組立てを記載している。

ｇｐ５０遺伝子を有する出発物質は、特許出願ＰＣＴ／ｌＪｓ　８６１０１７６１のチャートＩに開示されているプラスミドｐＤ５０およびそれに関連した本文上の物質である。

以下、チャー）Ａを参照して、ｐＤ５０をＥｃｏＲＩで切断し、末端をＴ４　　ＤＮＡポリメラーゼでの処理により平滑にした。ついで、ＢａｍＨＩリンカ−を結び、そうして得られたフラグメントをＢａｍＨＩで処理した。ｇｐ５０遺伝子（約１３００塩基対）を有するフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法により単離した。

プラスミドｐＡｃ３７３　（７、１ｋｂ）は、ＡｃＮＰＶのポリへドロンプロモーターからすぐ下流に独特Ｂａｍ８１部位を有するバキュロウィルス発現ベクターである。該プラスミドは、テキサス州７７８４３、カレッジ・ステージジン、テキサスＡ＆Ｍユニバージティー、昆虫学科、プロフェッサー・マックス・サマース（Ｐ　ｒ−ｏｒｅｓｓｏｒ　Ｍ　ａｘＳ　ｕｍｍｅｒｓ）から入手可能であり、モレキユラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．ａｎｄ　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　、３．２１５６〜６５頁（１９８３）において、およびヨーロッパ特許公開番号０１２７８３９号において詳細に記載されている。それはまた、受入れ番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５７７８と称され、アグリカルチニアル・リサーチ・カルチャー・コレクシロン（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）　（ＮＲＲＬ）から入手可能である。

ｐＡｃ３７３をＢａｍＨＩで消化し、その末端を細菌アルカリホスファターゼで脱リン化した＊ｇｐ５０遺伝子を有するＢａｍＨｌフラグメントを直線化したｐＡｃ３７３に結び、プラスミドｐＡｃｇｐ５０−４を得た。ポリへドロンプロモーターに関して適当な配位においてｇｐｓ。

遺伝子を宵する組換体を、適当な配位を有するクローンについての９７５塩基対フラグメントを産生する５ａｉｌで消化することにより決定した。

実施例２　　プラスミドｐＡｃｇｐ５０Ｔ−５の組立て本発明者らは、不完全な分泌形のｇＰ５０をコードする遺伝子（Ｐ　ＣＴ／ＵＳ　８６１０　Ｉ　７６１参照）をｐＡｃ３７３ベクターに入れでこのプラスミド組み立て７′：。

以下、チャートＢを参照して、プラスミドｐＤ５０Ｔは、ｐＤ　Ｉ　Ｅ５０の代わりにｐＤ５０を出発プラスミドとして用いる以外、プラスミドｐＤＩＥ５０Ｔを、ＰＣＴ／ＵＳ　８６１０　Ｉ　７６１、チャートＬおよびその関連物質にて組み立てたと同じように正確に組み立てた。ｐＤ５０を５ａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化した場合、ｐＤ　ｒ　Ｅ５０に関する５　、　Ｏｋｂフラグメントの代わりに、４．２ｋｂＳａｌｌ／ＥｃｏＲＩフラグメントが得られる。得られたプラスミドの間における差異は、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターがプラスミドｐＤ５０Ｔになく、Ｂａｍ８１部位が残っているだけである。

ｐＤ５０について実施例１に記載された方法に従い、ｐＤ　５０　Ｔを不完全なｇｐｓｏについての遺伝子をｐＡｃ３７３ベクターに導入するように操作し、ｐＡｃｇｐ５０−Ｔ−５を得た。同一の９７５　ｂｐｓａｌ　１フラグメントは、不完全なｇｐｓｏをコードする配列の適当な配位について特徴的でありだ。

実施例３　　組換え堅バキ二口ウイルスの組立てバキュロウィルスの組立方法は、ドクター・マックス・サマース（Ｄｒ、Ｍａｘ　Ｓｕ＋Ｉ１ｍｅｒｓ）に上る発表（例えば、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、３．２１５６〜６５頁（１９８３））および特に前記のマニュアル（エム・ディ・サマースおよびシイ・イー・スミス、前掲）において詳細に記載されており、参照のためここに誉げる。

前記実施例Ｉおよび２において産生じたプラスミドを、バキュロウィルスＡｃＮＰＶ　ＤＮＡと共に、スボドブテラ・フルギベルダ（Ｓ　ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）　Ｓ　Ｆ　９細胞（メリーランド州、ローｔクヴイル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシタン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から供託番号ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１として入手可能）中にて共トランスフェクションに付した。、ｐ５０遺伝子を有する組換え型ウィルスを、８ｇウェルのｌウェル当たり約１０’プラーク形成単位の限定希釈により濃厚にし、つづいて″’ｐ−ｍ識ｇｐ５０ＤＮＡでハイブリダイゼーションに付し、組換え型ウィルスが増殖しているウェルを検出した。組換え型ウィルスは、希釈ウィルスをプレートアウトし、閉塞ウィルスを欠いている個々のプラークを選びとることにより単離した。該ウィルスを４回プラーク精製し、ウィルスストックを増殖する前に閉塞圧ウィルスが排除されたことを確認した。

組換え型ウィルスは、ｐＡｃｇｐ５０−４およびｐＡｃｇｐ５０Ｔ−５の両方とのトランスフェクションから単離され、各々、ＡｃＮＰＶ−ｇｐｓｏおよびＡｃＮＰＶ−ｇｐ５０Ｔと称される。

実施例４　　組換え型バキュロウィルスからｇｐ５０発現の検出Ｓｆ９細胞を、細胞当たり少なくとも１．０プラ一ク形成単位の種々の感染にて、実施例３において産生じた組換え型ウィルスの１つで感染させる。感染の２４〜４８時間後、細胞をブレース培地（Ｇ　ｒａｃｅ’　ｓ　ｓｅｄｊｕｍ）に懸濁させ、静かに遠心分離に付し、メチオニンを欠くが、１００μＣ４の”Ｓ−メチオニン／Ｉｆｆを加えたブレース培地に再懸濁させる。試料を収穫し、ｇｐ５０発現を、イー・エイ・ペトロフスキーズら（ε、Ａ、Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）　、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ　、Ｖｉｒｏｌ、）　、５９．２１６〜２３頁（１９８６）に記載されている免疫沈降法により解析する。

ＡｃＮＰＶｇｐ５　ｏｘ染細胞は、分子量４４．４６および４７ｉ＜ｄを有する３形態のｇｐｓｏを産生した。ＡｃＮＰＶｇｐ５０Ｔ感染細胞は、分子量約４１ｋｄを有する形態のｇｐｓｏを産生しに０分子量４３および４４ｋｄを有する２形憩のｇｐｓｏが、これら後者の感染細胞の培地にて見いだされた。低分子量ポリペプチドは、〇一連連結グリコリレーションほとんどまたはまったくないｇｐ５０分子のタンパク質バックボーンの予想分子量に対応する。

′４Ｃ−グルコサミンでの同様な実験は、これら形態のｇｐｓｏのいくつかが、炭水化物先駆体により標識化され得ることを示した。昆虫細胞は、哺乳動物細胞がなすよりもずっと低い程度であり、天然の糖タンパク質について見いだされるよりもずっと低い度合であるが、しかしながら原核生物細胞よりも多くの〇−− 結炭水化物を糖タンパク質に付加することができるようである。

実施例５　　ワクチンとしてのバキュロウィルスにおいて産生されたｇｐｓｏの使用第１表は、Ｓｆ９細胞にて産生されたｇｐ５０ま―は対照としてＳｆ’９細胞にて産生された組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）（各々、ＡｅＮＰＶｇｐ５０またｌ！ＡｃＮＰＶ−ｔＰＡ）ｒ免疫処ｆｔすることによって、マウスがビルレントＰＲＶによる攻撃から保護されることを示している。マウスは攻撃の２８日、１８日および７日前にて免疫処置した。

第　　１　　表免疫剤／アジュバント　　　　　　細胞数　　　　　生存１％ｇｐ５０／ＣＦＡ″　　　　ｌＸｌ０”　　　　８８　（７／８）ｔＰＡ／ＣＦＡ　　　　　　１　ｘ　１０＠　　　２５　（２／８）ｇｐ５０／無　　　　　　ｌＸｌ０＠　　１００　（８／８）ｇｐ５０／無　　　　　　　ｌＸｌ０’　　　　７５　（６／８）ｇｐ５０／無　　　　　　　ｌＸｌ０’　　　　３８　（３／８）ワクチン接種を施していない　　　　　　３Ｂ　（３／８）ａ：内組経路により、ＰＲＶライス（Ｒｉｃｅ）系の３０　　ＬＤ５０で攻撃ｂ：完全フロイントアジ、ノイント第１表から解るように、ワクチン接種を施していない対照および非−ＰＲＶ抗原であるＬＰＡを発現する細胞の両方と比較した場合、ｇｐ５０抗原を発現する細胞は、ＰＲＶを用いる感染かみマウスを保護するのに効果的であった。かかる保護がまた、ｇＰ５０量の減少と共に減少することは明らかである。

本発明のｇｐｓｏタンパク質またはその免疫原フラグメントを用いて調製されるワクチンは、固定した宿主細胞、宿主細胞抽出物または宿主細胞から部分的または完全に精製したＰＲＶ糖タンパク質調製物から構成することができる。本発明に従って調製されるｇｐ５０免疫原は、好ましくは、ＰＲＶウィルスを含まない。したがって、本発明のワクチン免疫原は、実質上、完全に所望の免疫原ＰＲＶｇｐ５０ポリペプチドおよび／またはＰＲＶ抗原性を示す他のＰＲＶポリペプチドから構成される。

免疫原は、よく知られた操作によりワクチン投与形にて調製することができる。

該ワクチンは筋肉内、皮下内または鼻腔内に投与することができる。筋肉内注射のような非経口投与では、免疫原を適当な担体と組み合わせてもよく、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ａｌｕｍ）　、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、カーボン、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、ムラミルジペプチド、細菌内毒素、Ｉ］ＨｉＸ。

コリネバクテリウム・バルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｂ　ｐａｒｖｕｍ）　（プロピオノバクテリウムーアクネス（Ｐ　ｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｎｅｓ）　）、ボルデテラ・ベルタスシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）　、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ１サポニン、リポソーム、レバミンール、ＤＥＡＥ−デ牛ストラン、ブロック共重合体もしくは他の合成アジユバントを包含する種々のアジ二バントまたは免疫調節剤と共にまたはなしで水、セラインまたは緩衝ビヒクル中にて投与することができる。かかるアジ一バントは、種々の供給源、例えば、メルク・アジュバント（Ｍｅｒｅｋ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　）　６５　（二ニーシャーシー州、ラーウエイ（Ｒａｈｗａｙ）　、メルク・アンド・カンパニー、インコーホレイティ・７ド（Ｍｅｒｅｋ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ、））より商業的に入手可能である。

他の適当なアジュバントはフロイント不完全アジュバント（ミシガン州、デトロイト、ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄ　１ｆｃｏ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ）　）である。

免疫原およびアジ一バントの割合は、両方が有効量で存在する限り、広範囲にわたって変化しうる。例えば、水酸化アルミニウムは、ワクチン混合物（Ａ　Ｉ　、Ｏ，ベース）の約０．５％の量にて存在させることができる。投与量ベース当たりについては、免疫原の濃度を動物当たり約１．０Ｂｇから約１００ｍｇの範囲とすることができる。ブタにおいて、好ましい範囲は、ブタ１匹当たり約１００μｇから約３、Ｏｍｇである。適当な投与量容量は、約１〜ＩＭ、好ましくは約１．０ｄである。したがって、筋肉内注射用の投与量は、例えば、０．５％水酸化アルミニウムとの混合物中、免疫原１．０ｍｇを含有する１ｍ１２よりなる。匹敵する投与形は、幼少のブタに対する非経口投与用にも調製することができるが、１投与量当たりの免疫原の量はより少雪に、例えば、ｌ投与！当たり約０．２５〜約１．０ｍｇである。

雌ブタのワクチン接種については、二投与方法を用いることができる。第１の投与は、分娩の約数カ月前から約５〜７週間前に投与することができる。ついで、ワクチンの第２の投与は、第１の投与の数週間後、例えば、約２〜４週間後に投与すべきであり、ついで分娩までであって、分娩前にワクチンを投与することができる。別法として、ワクチンを単一の２−用量として、例えば、分娩の約５〜７週間前に投与することができる。しかしながら、幼少ブタの最も効果的な免疫化には二投与方法が好ましいと考えられる。動物を飼育するのに、年２回の再ワクチン接種が推薦される。雄ブタはいつ再ワクチン接種をしてもよい。また、雌ブタは飼育前に再ワクチン接種を行なうこともできる。ワクチン接種をしていない雌ブタから生まれた子ブタは、約３〜１０日に、再度４〜６力月に、およびその後、毎年または好ましくは半年毎にワクチン接種することができる。

キー−ＬΔ　　　ゴ丹ズミドＤＡｃｔｏ７ｒｏ−４の組立てまた、該ワクチンを他の疾患についての他のワクチンと組み合わせ、多価ワクチンを得ることもできる。また、該ワクチンは他の医薬、例えば、抗生物質と組み合わせることもできる。医薬的に有効量のワクチンを、医薬上許容される担体または希釈剤と共に用い、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギおよび他の哺乳動物のような動物をワクチン接種することができる。

他のワクチンを、例えば、アイ・チザード（１、Ｔ　１ｚａｒｄ）　％アン・イントロダクシ璽ン・ツー・ベテリナリー・イムノロジー、第２版、（１９８２）に示されるように、当該分野における当業者によく知られた方法に従って調製することができ、参照のためここに挙げる。

フラグメント３アヤートへ　　　ノフ＾−１ｙＡすＩ’　ｌ＋’　ｖ−＋１−／　Ｑ’ＸＬ−ｍ（ａ）プラスミドｐＤ５０をＥｃｏＲＩで切断し、フラグメント１を得る。

Ｂａ！１ｌＨＩ　　　ＨｌｎｄｍｌＸ　　　　　ＰｖｕＩＸ　　　　　ＥｅｏＲＺ　　　　ＮＺ１ｒｉフラグメントＩＥｃｏＲＩ　　　　　　　　　　Ｂａ＋Ｉ＋１（Ｉ　　　　　　　ＥｃｏＲＩ６ｈｆｒ　　　　御東（ｂ）フラグメント１は平滑末端であり、ＢａｍＨＩリンカ−を加え、ついでＢａａＨＩで消化し、フラグメント２を得る。

Ｂａ！Ｉ＋）！Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＢａｍＨＩ（ｃ）プラスミドｐＡｃ３７３をＢａｍＨｌおよびＢＡＰで消化し、フラグメント３を得る。

Ａｃ３７３Ｂａ＋ｍｌ！’　　ｐｏｌｙ ―工　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｈ吐１（ｄ）フラグメント２および３を結び、プラスミドｐＡｃｇＰ５０−４を得る。

Ｂ　ａＨＭＩ　　　　　　　　　　　　　Ｂａｗ１１ｄｈｆｒ＝ジヒドロ葉酸塩レダクターゼ遺伝子５Ｖ４００ｒｉ−ＳＶ４０ブｏ　％　−９−ト複製開始点Ａｍｐ”＝アンピシリン耐性遺伝子Ｐ＝ポリへドリンプロモーターＰｏ１ｙ＝ポリヘトリン遺伝子チャートＢ　　プラスミドｐＡｅｇｐ５０　Ｔ　−５の組立て（ａ）プラスミドｐＡｅｇｐ５０　Ｔ　−５を、ｐＤ５０Ｔで出発する以外、チャー）Ｂにて行なったと同一の操作に従い、プラスミドｐＤ５０Ｔから産生する。

Ｄ５０ＴｋｏＲｌ　　　　　ハ關ＩｐＡｃｇｐ５０Ｔ−５Ｂ−Ｘ　　　　　Ｂａ５ａ１５０Ｔ＝処理形（Ｔｒａｎｓａｃｔｅｄ　ｆｏｒＩｌｌ）のｇｐ５０遺伝子国際調査報告ｌｅｍ＋１１ｍＭＩＡａ１１．ｌｊｌｉＧＳｆｉｇρＬ’ｒ７（ＩＳｎｕ１０２０２１

Claims

【特許請求の範囲】

１．対応する天然のウイルス糖タンパク質よりも少量のＯ−連結グリコシレーションを有し、バキユロウイルスペクターと糖タンパク質をコードするＤＮＡ配列とからなる組換え型ＤＮＡ分子で感染させた昆虫細胞宿主によって産生されるウイルス糖タンパク質。
２．糖タンパク質が仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質である請求項１記載の糖タンパク質。
３．仮性狂犬病ウイルスｇｐ５０である請求項２記載の糖タンパク質。
４．昆虫細胞宿主が、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）およびトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｕｓｉａ　ｎｉ）からなる群より選択される請求項１記載の糖タンパク質。
５．糖タンパク質が仮性狂犬病ワイルスｇｐ５０であり、昆虫細胞宿主がスポドプテラ・フルギペルダである請求項１記載の糖タンパク質。
６．（ａ）分子が糖タンパク質をコードするＤＮＡ配列とバキュロゥイルスベクターとからなる組換え型ＤＮＡ分子を調製し；（ｂ）昆虫宿主細胞を該組換え型ＤＮＡ分子を用いて感染させ；（ｃ）該感染昆虫宿主細胞を培養し；（ｄ）該糖タンパク質を収集することからなることを特徴とする、天然のグリコシル化形と比較した場合に減少したＯ−連結グリコシレーションを有するウイルス糖タンパク質を産生する方法。
７．糖タンパク質が仮性狂犬病ウイルスｇｐ５０である請求項６記載の方法。
８．昆虫宿主細胞がスポドプテラ・フルギペルダである請求項６記載の方法。
９．糖タンパク質が仮性狂犬病ウイルスｇｐ５０であり、昆虫宿主細胞がスポドプテラ・フルギペルダである請求項６記載の方法。
１０．その対応する天然に存在する形態よりも少量のＯ−連結グリコシレーションを有する仮性狂犬病ウイルスｇｐ５０ポリペプチド。
１１．請求項１０記載の糖タンパク質からなるワクチン。