CN104730072B - 含cd54表达之报告系统之免疫细胞的应用以及经克隆之新颖细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种确认免疫调节物质的方法，包括：(a)提供待测物与免疫细胞，其中该免疫细胞包括CD54表达之报告系统，而该CD54表达之报告系统，包括：CD54基因之启动子；以及报告基因，与该CD54基因之启动子连接，用以报告该CD54基因之启动子的表达；(b)以该待测物处理该免疫细胞；以及(c)测定经该待测物处理之该免疫细胞所产生之该报告基因的产物表达以判定该待测物是否有免疫调节作用。
Description
发明领域
本发明关于含CD54表达之报告系统之免疫细胞的应用，且特别关于将此含CD54表达之报告系统之免疫细胞应用于确认免疫调节物质的方法。
发明背景
CD54(分化簇54(Cluster of Difffeentiation 54))(也已知为细胞间黏附分子-1(Intercellular Adhesion Molecule 1，ICAM-1)，其为于人类体中由ICAM1基因所编码出之蛋白质。此基因编码出通常表达于内皮细胞(endothelial cells)与免疫系统之细胞上的细胞表面糖蛋白(glycoprotein)。CD54与CD11a/CD18型(type)，或CD11b/CD18型之整联蛋白(integrins)结合，且也被鼻病毒(rhinovirus)利用为一受体(receptor)。目前已知CD54为免疫反应，特别是过敏反应的一生物标记。
免疫反应在许多疾病皆扮演重要的角色，例如发炎反应，皮肤敏感性等等，因此许多药物皆针对调节免疫系统进行开发。但是免疫系统所涉及的生物分子及细胞种类繁多，因此常需要以活体动物实验以进行实验评估，而造成时间及成本增加。虽然目前已有许多的细胞实验模型可以进行调节免疫反应的测试，然而，其在分析上常需要以ELISA或流式细胞仪来进行实验，也较平常生物实验复杂。
又，致敏性是化妆品、各种化学品、农产品、环境毒物、工业制品等产品上市前的重要安全性评估项目。顺应动物实验伦理及减量的趋势，欧美日各国的研究机构和相关企业公司均投入相当大的资源于替代性动物实验方法的开发，但目前在国际上仍未出现公认可以取代动物实验的替代方式。
因此，目前亟需发展不须动物实验之确认免疫调节物质或致敏物质的新方法以适合高通量测试使用。
发明内容
本发明提供一种确认免疫调节物质的方法，包括：(a)提供待测物与免疫细胞，其中该免疫细胞包括CD54表达之报告系统，而该CD54表达之报告系统，包括：CD54基因之启动子；以及报告基因，与该CD54基因之启动子连接，用以报告该CD54基因之启动子的表达；(b)以该待测物处理该免疫细胞；以及(c)测定经该待测物处理之该免疫细胞所产生之该报告基因的产物表达以判定该待测物是否有免疫调节作用。
本发明也提供一种确认皮肤致敏物质的方法，包括：(a)提供待测物与免疫细胞，其中该免疫细胞包括CD54表达之报告系统，而该CD54表达之报告系统，包括：CD54基因之启动子；以及报告基因，与该CD54基因之启动子连接，用以报告该CD54基因之启动子的表达；(b)以该待测物处理该免疫细胞；以及(c)测定经该待测物处理之该免疫细胞所产生之该报告基因的产物表达以判定该待测物是否为皮肤致敏物质。
本发明更提供一种经克隆之新颖细胞，其系于2014年11月12日保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏编号为DSM ACC3257。
因此本发明提供了不须动物实验之确认免疫调节物质或皮肤致敏物质的新方法以适合高通量测试使用，开发出替代动物实验的方法，符合相关动物实验伦理及减量的趋势。
附图说明
图1显示本发明一实施例之CD54-启动子mLuc表达系统。
图2显示本发明一实施例之判定待测物质是否为皮肤致敏物的流程。以及
图3显示本发明一实施例之判定待测物质是否为抗发炎物质的流程。
发明详述
在本发明一实施方案中，本发明提供一种确认免疫调节物质的方法。本发明之确认免疫调节物质的方法，可包括，但不限于下列所述步骤。
首先，提供待测物与包括CD54表达之报告系统的免疫细胞。
上述待测物之例子可包括，例如，化妆品、药物、化学物、天然物之萃取物等，但不限于此。而上述免疫细胞之来源的例子则可包括，但不限于THP-1细胞、U937细胞、MUTZ-3细胞等。在一实施例中，而上述免疫细胞之来源为THP-1细胞。
上述免疫细胞之CD54表达之报告系统，可包括，但不限于，CD54基因之启动子(CD54 promoter)与报告基因(reporter gene)，其中上述报告基因与上述CD54基因之启动子连接，用以报告CD54基因之启动子的表达。
在一实施例中，上述CD54基因之启动子之序列可包括序列辨识号：1之序列，而在另一实施例中，上述CD54基因之启动子之序列可为序列辨识号：1之序列。
再者，上述报告基因的例子可包括，但不限于长腹水蚤科萤光素酶(Metridialuciferase)基因、萤火虫萤光素酶(firefly luciferase)基因、绿色荧光蛋白质(greenfluorescent protein，GFP)基因、β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase)基因等。在一实施例中，上述报告基因为长腹水蚤科萤光素酶基因。长腹水蚤科萤光素酶基因之产物会被细胞直接分泌至培养液，因此测定其表达(例如，活性)时，可直接将培养基进行冷光分析，不须将细胞打破，具有节省分析时间之优点。
在一实施例中，上述CD54基因之启动子之序列为序列辨识号：1之序列，而上述免疫细胞之来源为THP-1细胞。在另一实施例中，上述CD54基因之启动子之序列为序列辨识号：1之序列，而上述报告基因为长腹水蚤科萤光素酶基因。又，在另一实施例中，上述CD54基因之启动子之序列为序列辨识号：1之序列，上述免疫细胞之来源为THP-1细胞，且上述报告基因为长腹水蚤科萤光素酶基因。
于本发明之确认免疫调节物质的方法的一实施例中，包含CD54基因之启动子与报告基因之前述CD54表达报告系统的序列可包括序列辨识号：2之序列。在一特定实施例中，前述CD54表达报告系统的序列可为序列辨识号：2之序列，即CD54表达报告系统为CD54基因之启动子-长腹水蚤科萤光素酶基因(CD54 promoter-Metridia Luc)之形式。而于此特定实施例中，所使用之包括CD54表达之报告系统的免疫细胞，可为藉由将具有序列辨识号：2之序列的病毒载体感染进入THP-1细胞所获得的细胞，而此细胞可以是命名为ITRI-54M之细胞，其于2014年11月12日保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏编号为DSMACC3257。
接着，以上述待测物处理上述包括CD54表达之报告系统的免疫细胞。在一实施例中，处理时间为约1-2天，但不限于此。又，在一实施例中，在以上述待测物处理上述包括CD54表达之报告系统的免疫细胞之前，可先将待测物对此免疫系胞进行细胞毒性分析，测定出此待测物对此细胞之半生长抑制浓度，并藉此获得处理浓度。
然后，在以上述待测物处理上述包括CD54表达之报告系统的免疫细胞之后，测定经上述待测物处理之上述免疫细胞所产生之报告基因的产物表达以判定上述待测物是否有免疫调节作用。
于本发明之确认免疫调节物质的方法的一实施例中，在测定经上述待测物处理之免疫细胞所产生之报告基因的产物表达以判定上述待测物是否有免疫调节作用的步骤中，系将经待测物处理之免疫细胞所产生之报告基因的产物表达与未经待测物处理之上述免疫细胞之报告基因产物的表达作比较，以判定待测物是否具有免疫调节作用。若经待测物处理之免疫细胞所产生之报告基因的产物表达高于未经待测物处理之免疫细胞之报告基因产物的表达，则判定此待测物具有免疫调节作用，为免疫调节物质。
在于本发明之确认免疫调节物质的方法的另一实施例中，在以待测物处理包括CD54表达之报告系统的免疫细胞的步骤中，进一步包含添加免疫诱发物质，以使免疫细胞产生免疫反应。于此实施例中，在测定经待测物处理之免疫细胞所产生之报告基因的产物表达以判定上述待测物是否有免疫调节作用的步骤中，系将经待测物与免疫诱发物质处理之免疫细胞所产生之报告基因的产物表达与仅经免疫诱发物质处理之免疫细胞之报告基因产物的表达作比较，以判定待测物是否有免疫调节作用。若经待测物与免疫诱发物质处理之免疫细胞所产生之报告基因的产物表达低于仅经免疫诱发物质处理之免疫细胞之报告基因产物的表达，则判定此待测物具有免疫抑制作用，为免疫抑制物质。
上述免疫反应诱发物质可包括任何可引起免疫反应的物质，例如脂多糖体(lipopolysaccharide，LPS)、乙酸豆塞外佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)、刀豆素A(concanavalin A，Con A)等，但不限于此。
在一实施例中，于本发明之确认免疫调节物质的方法中所使用之免疫反应诱发物质可为脂多糖体、乙酸豆塞外佛波酯或刀豆素A，其为致发炎物质。
于上述实施例中，在测定经待测物处理之免疫细胞所产生之报告基因的产物表达以判定上述待测物是否有免疫调节作用的步骤中，判定待测物是否有免疫调节作用，可包含判定待测物是否具抗发炎作用，以判定此待测物是否抗发炎物质。
测定上述免疫细胞所产生之报告基因的产物表达的方式，根据报告基因之产物的性质而定(例如可测其活性)。而不同报告基因的产物表达的测定方式，为该技术领域中具有通常知识者所熟知。例如，由于长腹水蚤科萤光素酶基因之产物会被细胞直接分泌至培养液，因此可直接将培养细胞之培养基进行冷光分析来测定长腹水蚤科萤光素酶基因之产物表达。
在本发明另一实施方案中，本发明还提供一种确认皮肤致敏物质的方法，而本发明之确认皮肤致敏物质的方法，可包括下列所述步骤，但不限于此。
提供待测物与包括CD54表达之报告系统的免疫细胞。
待测物可为任何物质，并无特别限制。上述待测物之例子可包括，例如，化妆品、药物、化学物、天然物之萃取物等，但不限于。而上述免疫细胞之来源的例子则可包括，THP-1细胞、U937细胞、MUTZ-3细胞等，但不限于此。在一实施例中，上述免疫细胞之来源为THP-1细胞。
此外，上述免疫细胞所包含之CD54表达之报告系统，可包括CD54基因之启动子与报告基因，但不限于此，其中上述报告基因与上述CD54基因之启动子连接，用以报告CD54基因之启动子的表达。
在一实施例中，上述CD54基因之启动子之序列可包括序列辨识号：1之序列，而在另一实施例中，上述CD54基因之启动子之序列可为序列辨识号：1之序列。
而相似于前述本发明之确认免疫调节物质的方法中所使用之报告基因，本发明之确认皮肤致敏物质的方法中之报告基因的例子可包括，但不限于长腹水蚤科萤光素酶基因、萤火虫萤光素酶基因、绿色荧光蛋白质基因、β-葡萄糖醛酸苷酶基因等。在一实施例中，上述报告基因为长腹水蚤科萤光素酶基因。长腹水蚤科萤光素酶基因之产物会被细胞直接分泌至培养液，因此测定其表达(例如，活性)时，可直接将培养基进行冷光分析，不须将细胞打破，具有节省分析时间之优点。
在一实施例中，上述CD54基因之启动子之序列为序列辨识号：1之序列，而上述免疫细胞之来源为THP-1细胞。在另一实施例中，上述CD54基因之启动子之序列为序列辨识号：1之序列，而上述报告基因为长腹水蚤科萤光素酶基因。又，在另一实施例中，上述CD54基因之启动子之序列为序列辨识号：1之序列，上述免疫细胞之来源为THP-1细胞，且上述报告基因为长腹水蚤科萤光素酶基因。
于本发明之确认皮肤致敏物质的方法的一实施例中，包含CD54基因之启动子与报告基因之前述CD54表达报告系统的序列可包括序列辨识号：2之序列。在一特定实施例中，前述CD54表达报告系统的序列可为序列辨识号：2之序列，即CD54表达报告系统为CD54基因之启动子-长腹水蚤科萤光素酶基因(CD54 promoter-Metridia Luc)之形式。而于此特定实施例中，所使用之包括CD54表达之报告系统的免疫细胞，可为藉由将具有序列辨识号：2之序列的病毒载体感染进入THP-1细胞所获得的细胞，而此细胞可以是命名为ITRI-54M之细胞，其于2014年11月12日保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏编号为DSMACC3257。
接着，以上述待测物处理上述包括CD54表达之报告系统的免疫细胞。在一实施例中，处理时间为约1-2天，但不限于此。
又，在一实施例中，在以上述待测物处理上述包括CD54表达之报告系统的免疫细胞之前，可先将待测物对此免疫系胞进行细胞毒性分析，测定出此待测物对此细胞之半生长抑制浓度，并藉此获得处理浓度。
最后，在以上述待测物处理上述包括CD54表达之报告系统的免疫细胞之后，测定经上述待测物处理之上述免疫细胞所产生之报告基因的产物表达以判定上述待测物是否为皮肤致敏物质。
于一实施例中，在测定经上述待测物处理之上述免疫细胞所产生之报告基因的产物表达以判定上述待测物是否为皮肤致敏物质的步骤中，系将经上述待测物处理之上述免疫细胞所产生之报告基因的产物表达与未经上述待测物处理之免疫细胞之报告基因产物的表达作比较，以判定上述待测物是否具有免疫调节作用。若经待测物处理之免疫细胞所产生之报告基因的产物表达高于未经待测物处理之免疫细胞之报告基因产物的表达，则判定此待测物为皮肤致敏物质。
测定上述免疫细胞所产生之报告基因的产物表达的方式，根据报告基因之产物的性质而定(例如可测其活性)。而不同报告基因的产物表达的测定方式，为该技术领域中具有通常知识者所熟知。例如，由于长腹水蚤科萤光素酶基因之产物会被细胞直接分泌至培养液，因此可直接将培养细胞之培养基进行冷光分析来测定长腹水蚤科萤光素酶基因之产物表达。
此外，在本发明之又另一实施方案中，本发明更提供一种经克隆之新颖细胞，命名为ITRI-54M，其系于2014年11月12日保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏编号为DSM ACC3257。。
此细胞具有CD54基因之启动子-长腹水蚤科萤光素酶基因(CD54 promoter-Metridia Luc)之形式的CD54表达报告系统，而CD54表达报告系统之序列为序列辨识号：2之序列。
实施例
实施例1
建立ITRI-54M细胞
依照LVX-MetLuc(Clontech，PT4422-5)质粒的制造商操作指南，将LVX-MetLuc质粒以BstB I及BamH I限制酶处理，以使CD54启动子序列(序列辨识号：1)转移至LVX-MetLuc质粒中，以形成CD54-promoter mLuc表达系统(第1图)，其中于此表达系统中，CD54启动子-mLuc之序列为序列辨识号：2之序列。之后将所形成之CD54-promoter mLuc表达系统利用Lenti-XTMReady-To-GlowTM Secreted Luciferase Reporter System(Clontech，631746)转染至293FT细胞中以产生带有CD54-mLuc的慢病毒(Lentivirus)。接着以此病毒感染THP-1细胞。THP-1细胞系培养于THP-1培养液，其成分为RPMI培养液(GIBCO，31800)，内含10％FBS(GIBCO，10437)，4.5g/L葡萄糖(Sigma，G7021)，10mM HEPES(Sigma，H4034)、1x青霉素(penicillin)与链霉素(streptomycin)(Biowest，L0022)、1mM丙酮酸钠(sodiumpyruvate)(Biowest，L0642)、0.05mM 2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol，2-ME)(GIBCO，21985-023)。
然后，以0.5～1μg/mL嘌呤霉素(puromycin)(Invivogen，ant-pr-1)来对THP-1细胞进行筛选。筛选2周之后，再加入100uL带有细胞之培养液(浓度：5细胞/mL)至96孔盘(Corning Incorporation COSTAR，3599)中，待细胞数增加之后，将细胞逐步利用24孔盘(Corning Incorporation COSTAR，3516)、6孔盘(Corning Incorporation COSTAR，3524)及T25烧瓶(flask)(Corning Incorporation COSTAR，430639)放大。并将各细胞株以已知的致敏物(sensitizer)1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloro-2，4-dinitrobenzene，DNCB)以及非致敏物(non-sensitizer)十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammoniumbromide，CTAB)进行测试，并挑选最佳反应的细胞株，将其命名为ITRI-54M，且于2014年11月12日保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏编号为DSM ACC3257。
实施例2
待测物质是否为皮肤致敏物(或免疫调节物质)的判定
于本实验中之判定待测物质是否为皮肤致敏物的流程如图2所示。参见图2与下方详细步骤说明。
1.待测物对ITRI-54M细胞之毒性测试
ITRI-54M细胞培养于THP-1培养液，其成分为RPMI培养液(GIBCO，31800)，内含10％胎牛血清(GIBCO，10437)、4.5g/L葡萄糖(Sigma，G7021)、10mM HEPES(Sigma，H4034)、1x青霉素(penicillin)与链霉素(streptomycin)(Biowest，L0022)、1mM丙酮酸钠(sodiumpyruvate)(Biowest，L0642)、0.05mM 2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)(GIBCO，21985-023)及0.5μg/mL嘌呤霉素(puromycin)。
将表1中所列已知致敏性之参考化学样品或表2中所列常见于化妆品中之中草药萃取物，以适当之溶剂(DMSO或不含2-ME之THP-1培养液)，溶解后形成储备溶液(stocksolution)。接着将储备溶液进行6～8次之3倍连续稀释，以形成不同稀释倍数之操作溶液(working solution)。
表1、已知皮肤致敏特性之参考化学物质
表2、常用于化妆品之中草药萃取物
| 名称 | 萃取方式 |
| 红蔘 | 95％乙醇热萃 |
| 丁香 | 95％乙醇热萃 |
接着进行细胞毒性测试(步骤101)。将10μL/孔之操作溶液添加至96孔盘中。接着将ITRI-54M细胞悬浮在不含2-ME及嘌呤霉素的THP-1培养液中，之后并以5×104个细胞/90μL/孔的密度接种于上述96孔细胞培养盘中。然后将培养盘置于细胞培养箱(NUAIR nu-5510)并培养1天。需注意的是，若待测物溶于DMSO，则需将最终待测物与细胞接触时之培养液中的DMSO浓度控制于0.2％。
然后，将10μL之5mg/mL MTT的培养液加入培养盘中，并置于二氧化碳细胞培养箱中培养2小时。接着，将100μL之10％SDS加至培养盘并静置隔夜。然后将紫色沉淀溶解，并以连续波长微孔盘分析系统(Molecular Devices，SPECTRAMAX 5)中，测定细胞于560nm波长的吸光值。
以对照组之平均吸光值代表100％之细胞的存活率(％)，来计算加入各种不同浓度之样品之实验组细胞的存活率(％)。细胞存活率计算公式为：(实验组吸光值/对照组吸光值)×100％。并计算各浓度测试物的细胞生长抑制率，细胞生长抑制率计算公式为：1-细胞存活率。
之后，以各实验组之细胞生长抑制率作xy散布图，并利用Grafit软件以IC50方程式求得各待测物之50％细胞生长抑制的样品浓度(CC50)(步骤103)。
若药物会干扰MTT的颜色判读，则改用Cell-Glo kit进行细胞毒性测试。步骤如下：
将35μL之细胞液添加至冷光用之96孔白盘，之后将35μl之Cell-Glo kit(Promega，G7571)加入上述96孔白盘，且将白盘置于震荡器震荡10分钟。然后，将底物添加至上述96孔白盘中，并立即以微盘冷光仪(Berthold，MPL4)来测量细胞所产生之冷光强度(Rlu/s)，作为当次实验之各浓度测试物细胞毒性参考值。
细胞存活率计算公式为：(实验组冷光值/对照组冷光值)×100％。并计算各浓度测试物的细胞生长抑制率，细胞生长抑制率计算公式为：(1-细胞存活率)。
并以各实验组之细胞生长抑制率作xy散布图，并利用Grafit软件以IC50方程式求得各待测物之50％细胞生长抑制的浓度(CC50)。
后续实验中将选择各待测物的CC50±25％作为ITRI-54M细胞之mLuc冷光活性之参考测试起始浓度。
若第一次实验无法测得准确之CC50，则参考实验结果改变待测物浓度及稀释倍率。以取得最佳趋势线以求得CC50。
而所测得之各待测物之50％细胞生长抑制的浓度如表3所示。
表3、上述各待测物之50％细胞生长抑制的浓度
2.待测物对ITRI-54M细胞之m-Luc活性影响测试
依据上方所获得之各待测物的CC50，来选择各待测物之测试起始浓度(约CC50±25％浓度，若无法求得准确CC50，则以待测物最高可溶解浓度或是最终浓度4000μM进行测试)，并以此浓度来配制待测物之储备溶液。之后将上述待测物之储备溶液以1.4倍连续两次稀释成以形成另外两个浓度之操作溶液，总共获得3个浓度之溶液(步骤105)。
将10μL/孔之操作溶液添加至96孔盘中。接着将ITRI-54M细胞悬浮在不含2-ME及嘌呤霉素的THP-1培养液中，之后并以5×104个细胞/90μL/孔的密度接种于上述96孔细胞培养盘中。然后将培养盘置于细胞培养箱(NUAIR nu-5510)中培养1天，其中以50ng/mL之脂多糖体(lipopolysaccharide，LPS)作为阳性对照组(positive control)。需注意的是，若待测物溶于DMSO，则需将最终待测物与细胞接触时之培养液中的DMSO浓度控制于0.2％。
之后，从上述培养盘取出10μL之细胞液并将其添加至冷光用之96孔白盘。接着，将40μL之Luciferase Assay试剂(GeneCopoeia，SPGA-G100)添加至上述白盘，并立即以微盘冷光仪(Berthold，MPL4)来测量细胞之冷光强度(Rlu/s)(步骤107)。
以对照组的冷光强度为标准来计算各样品实验组之促进CD54启动子活性之诱导率(induction rate)。诱导率(induction rate)的计算公式为：(实验组冷光值/对照组冷光值)。若结果显示一待测物促进mLuc表达，则判定此待测物为致敏物质(步骤109(含步骤109A与步骤109B))。上述各待测物所测得之促进CD54启动子活性之诱导率的结果显示于表4中，而判定各待测物是否为致敏物质之结果，则显示于表5中。
表4、各待测物所测得之促进CD54启动子活性之诱导率
表5、各待测物是否为致敏物质之判定结果
| 皮肤致敏性 | |
| IU | + |
| DNCB | + |
| PB | - |
| EU | + |
| MBT | + |
| SA | - |
| CTAB | - |
| 红蔘 | - |
| 丁香 | - |
此外，另将35μL之细胞液添加至冷光用之96孔白盘，之后将35μL之Cell-Glo kit(Promega，G7571)加入上述96孔白盘，且将白盘置于震荡器震荡10分钟。然后，将底物添加至上述96孔白盘中，并立即以微盘冷光仪(Berthold，MPL4)来测量细胞所产生之冷光强度(Rlu/s)，作为当次实验之各浓度测试物细胞毒性参考值。细胞存活率计算公式为：(实验组冷光值/对照组冷光值)×100％。
实施例3
待测物质是否为抗发炎物质(或免疫调节物质)的判定
于本实验中之判定待测物质是否为皮肤致敏物的流程如图3所示。参见图3与下方详细步骤说明。
1.待测物对ITRI-54M细胞之毒性测试
ITRI-54M细胞培养于THP-1培养液，其成分为RPMI培养液(GIBCO，31800)，内含10％胎牛血清(GIBCO，10437)、4.5g/L葡萄糖(Sigma，G7021)、10mM HEPES(Sigma，H4034)、1x青霉素(penicillin)与链霉素(streptomycin)(Biowest，L0022)、1mM丙酮酸钠(sodiumpyruvate)(Biowest，L0642)、0.05mM 2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)(GIBCO，21985-023)及0.5μg/mL嘌呤霉素(puromycin)。
将表6中所列已知具有抗发炎能力之待测物，以适当之溶剂(DMSO或不含2-ME之THP-1培养液)，溶解后形成储备溶液(stock solution)。接着将储备溶液进行6～8次之3倍连续稀释，以形成不同稀释倍数之操作溶液(working solution)
表6、已知具抗发炎活性之参考化学物质
| 名称 | Cas | 货号 | 厂商 |
| 小檗碱(Berberine) | 2086-83-1 | B3251 | Sigma |
| 姜黄素(Curcumin) | 458-37-7 | C1386 | Sigma |
| 水飞蓟素(Silibinin) | 22888-70-6 | S0417 | Sigma |
接着进行细胞毒性测试(步骤201)。将10μL/孔之操作溶液添加至96孔盘中。接着将ITRI-54M细胞悬浮在不含2-ME及嘌呤霉素的THP-1培养液中，之后并以5×104个细胞/90μL/孔的密度接种于上述96孔细胞培养盘中。然后将培养盘置于细胞培养箱(NUAIR nu-5510)并培养1天。需注意的是，若待测物溶于DMSO，则需将最终待测物与细胞接触时之培养液中的DMSO浓度控制于0.2％。
然后，将10μl之5mg/mL MTT的培养液加入培养盘中，并置于二氧化碳细胞培养箱中培养2小时。接着，将100μl之10％SDS加至培养盘并静置隔夜。然后将紫色沉淀溶解，并以连续波长微孔盘分析系统(Molecular Devices，SPECTRAMAX 5)中，测定细胞于560nm波长的吸光值。
以对照组之平均吸光值代表100％之细胞的存活率(％)，来计算加入各种不同浓度之样品之实验组细胞的存活率(％)。细胞存活率计算公式为：(实验组吸光值/对照组吸光值)×100％。并计算各浓度测试物的细胞生长抑制率，细胞生长抑制率计算公式为：1-细胞存活率。
之后，以各实验组之细胞生长抑制率作xy散布图，并利用Grafit软件以IC50方程式求得各待测物之50％细胞生长抑制的样品浓度(CC50)(步骤203)。
若药物会干扰MTT的颜色判读，则改用Cell-Glo kit进行细胞毒性测试。步骤如下：
将35μL之细胞液添加至冷光用之96孔白盘，之后将35μL之Cell-Glo kit(Promega，G7571)加入上述96孔白盘，且将白盘置于震荡器震荡10分钟。然后，将底物添加至上述96孔白盘中，并立即以微盘冷光仪(Berthold，MPL4)来测量细胞所产生之冷光强度(Rlu/s)，作为当次实验之各浓度测试物细胞毒性参考值。
细胞存活率计算公式为：(实验组冷光值/对照组冷光值)×100％。并计算各浓度测试物的细胞生长抑制率，细胞生长抑制率计算公式为：(1-细胞存活率)。
并以各实验组之细胞生长抑制率作xy散布图，并利用Grafit软件以IC50方程式求得各待测物之50％细胞生长抑制的浓度(CC50)。
后续实验中将选择各待测物的CC50±25％作为ITRI-54M细胞之mLuc冷光活性之参考测试起始浓度。
若第一次实验无法测得准确之CC50，则参考实验结果改变待测物浓度及稀释倍率。以取得最佳趋势线以求得CC50。
而所测得之各待测物之50％细胞生长抑制的浓度如表7所示。
表7
| 名称 | CC50(μM) | IC50(μM) |
| 小檗碱(Berberine) | ＞25 | 4.7 |
| 姜黄素(Curcumin) | ＞50 | 11.36 |
| 水飞蓟素(Silibinin) | ＞200 | 91.00 |
2.待测物对脂多糖体(LPS)诱发ITRI-54M细胞之m-Luc活性影响测试
依据上方所获得之各待测物的CC50，来选择各待测物之测试起始浓度(约CC50±25％浓度，若无法求得准确CC50，则以待测物最高可溶解浓度或是最终浓度4000μM进行测试)，并以此浓度来配制待测物之储备溶液。之后将上述待测物之储备溶液以2倍连续三次稀释成以形成另外三个浓度之操作溶液，总共获得四个浓度之溶液(步骤205)。
将10μL/孔之操作溶液以及10μL之100ng/mL脂多糖体(Sigma，L2880)添加至96孔盘中。接着将ITRI-54M细胞悬浮在不含2-ME及嘌呤霉素的THP-1培养液中，之后并以5×104个细胞/80μL/孔的密度接种于上述96孔细胞培养盘中。然后将培养盘置于细胞培养箱(NUAIR nu-5510)中培养1天。需注意的是，若待测物溶于DMSO，则需将最终待测物与细胞接触时之培养液中的DMSO浓度控制于0.2％。
之后，从上述培养盘取出10μL之细胞液并将其添加至冷光用之96孔白盘。接着，将40μL之Luciferase Assay试剂(GeneCopoeia，SPGA-G100)添加至上述白盘，并立即以微盘冷光仪(Berthold，MPL4)来测量细胞之冷光强度(Rlu/s)。(步骤207)。
以对照组及脂多糖体诱导组的冷光活性为标准来计算各样品待测物抑制脂多糖体诱发之CD54启动子活性的抑制率(inhibition rate)。抑制率(induction rate)的计算公式为：(脂多糖体诱导组之冷光值-待测物共处理后之脂多糖体诱导之冷光值)/(脂多糖体诱导组之冷光值-未处理组之冷光值)x100％。若抑制率为正值，即代表该待测物具有抑制脂多糖体诱发之免疫反应(步骤209(含步骤209A与步骤209B))。
之后以各实验组之CD54启动子活性的抑制率作xy散布图，并利用Grafit软件以IC50方程式求得各待测物之抑制50％脂多糖体诱发之mLuc活性的浓度(IC50)，结果参见表7。
符号说明
101、103、105、107、109、109A、109B、201、203、205、207、209、209A、209B～步骤。
生物材料保藏
保藏信息(依保藏机构、日期、号码顺序注记)
THP-1细胞名称：ITRI-54M；德国微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Inhoffenstr.7 B D-38124Braunschweig，German)，2014年11月12日，保藏号DSM ACC3257。
台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(Bioresource Collectionand Research Center；BCRC)，2013年12月04日，BCRC No.960475。
Claims (9)
1.一种确认皮肤致敏物质的方法，包括：
(a)提供待测物与免疫细胞，
其中该免疫细胞包括CD54表达之报告系统，而该CD54表达之报告系统，包括：
CD54基因之启动子，其中该CD54基因之启动子之序列包括序列辨识号：1之序列；以及
报告基因，与该CD54基因之启动子连接，用以报告该CD54基因之启动子的表达；
(b)以该待测物处理该免疫细胞；以及
(c)测定经该待测物处理之该免疫细胞所产生之该报告基因的产物表达以判定该待测物是否为皮肤致敏物质。
2.如权利要求1所述之确认皮肤致敏物质的方法，其中系将经该待测物处理之该免疫细胞所产生之该报告基因的产物表达与未经该待测物处理之该免疫细胞之该报告基因产物的表达作比较，以判定该待测物是否为皮肤致敏物质。
3.如权利要求2所述之确认皮肤致敏物质的方法，其中，若经该待测物处理之该免疫细胞所产生之该报告基因的产物表达高于未经该待测物处理之该免疫细胞之该报告基因产物的表达，则判定该待测物为皮肤致敏物质。
4.如权利要求1所述之确认皮肤致敏物质的方法，其中该免疫细胞之来源包括THP-1细胞、U937细胞或MUTZ-3细胞。
5.如权利要求1所述之确认皮肤致敏物质的方法，其中该报告基因包括长腹水蚤科萤光素酶基因、萤火虫萤光素酶基因、绿色荧光蛋白质基因或β-葡萄糖醛酸苷酶基因。
6.如权利要求1所述之确认皮肤致敏物质的方法，其中该CD54表达报告系统之序列为序列辨识号：2。
7.如权利要求6所述之确认皮肤致敏物质的方法，其中该免疫细胞为于2014年11月12日保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏编号为DSMACC3257的THP-1细胞。
8.如权利要求1所述之确认皮肤致敏物质的方法，其中该待测物包括化妆品、药物、化学物或天然物之萃取物。
9.一种经克隆之新颖细胞，其系于2014年11月12日保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏编号为DSM ACC3257。
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