TWI648401B - 生長分化因子１５（ｇｄｆ－１５）構築體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包含GDF15及其突變體之構築體。在各種實施例中，包含GDF15及其突變體之該等構築體可用於治療或改善代謝病症。在各種實施例中，該代謝疾病或病症為2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、高葡糖含量、高胰島素含量及糖尿病性腎病。

Description

生長分化因子15(GDF-15)構築體
本發明係關於包含含有GDF15區之多肽的單體及多聚體。
生長分化因子15(GDF15)為TGFβ超家族之分支成員。亦稱為巨噬細胞抑制細胞因子1(MIC1)(Bootcov MR,1997,Proc Natl Acad Sci 94：11514-9)、胎盤骨形態生成因子(PLAB)(Hromas R 1997,Biochim Biophys Acta.1354：40-4)、胎盤轉型生長因子β(PTGFB)(Lawton LN 1997,Gene.203：17-26)、前列腺衍生因子(PDF)(Paralkar VM 1998,J Biol Chem.273：13760-7)及非類固醇消炎藥活化基因(NAG-1)(Baek SJ 2001,J Biol Chem.276：33384-92)。
人類GDF15基因位於染色體19p13.2-13.1上；大鼠GDF15基因位於染色體16上；且小鼠GDF15基因位於染色體8上。GDF15開放閱讀框架跨越兩個外顯子(Bottner M 1999,Gene.237：105-11 and NCBI)。成熟GDF15肽與其他家族成員之同源性低(Katoh M 2006,Int J Mol Med.17：951-5)。
GDF15以在二鹼基裂解位點裂解以釋放羧基端成熟肽之大前驅蛋白質形式來合成。小鼠與大鼠GDF15前原勝皆含有303個胺基酸。人類全長前驅體含有308個胺基酸。嚙齒動物成熟肽在RGRR(SEQ ID NO：1)裂解位點進行處理之後含有115個胺基酸。人類成熟肽在 RGRRRAR(SEQ ID NO：2)裂解位點進行處理之後含有112個胺基酸。人類成熟GDF15肽與大鼠及小鼠成熟GDF15肽之序列相似性為66.1%及68.1%(Bottner M 1999,Gene.237：105-11；Bauskin AR 2000,EMBO J.19：2212-20；NCBI)。成熟GDF15肽中不存在糖基化位點。
成熟GDF15肽含有7個保守半胱胺酸殘基，此等殘基係形成TGFβ超家族成員所特有之半胱胺酸結基元(具有三個鏈內二硫鍵)及單一鏈間二硫鍵必需的。成熟GDF15肽進一步含有兩個形成第四鏈內二硫鍵之額外半胱胺酸殘基。生物活性GDF15為藉由一個鏈間二硫鍵共價連接之成熟肽之25KD均二聚體。
已報導多個病理及生理病狀，尤其懷孕(Moore AG 2000.J Clin Endocrinol Metab 85：4781-4788)、β-地中海貧血症(Tanno T 2007,Nat Med 13：1096-101；Zimmermann MB,2008 Am J Clin Nutr 88：1026-31)及先天性紅血球生成障礙性貧血(Tamary H 2008,Blood.112：5241-4)中GDF15循環含量均升高。在文獻報導中GDF15亦與多種生物活性有關。GDF15基因剔除及轉殖基因小鼠之研究表明GDF15可預防局部缺血/再灌注或過載誘發之心臟損傷(Kempf T,2006,Circ Res.98：351-60；Xu J,2006,Circ Res.98：342-50)、預防老化相關之運動神經元及感覺神經元損失(Strelau J,2009,J Neurosci.29：13640-8)、適度預防腎臟之代謝酸中毒，且可導致癌症患者之惡病質(Johnen H 2007 Nat Med.11：1333-40)。許多群體亦已研究GDF15在細胞細胞凋亡及增殖中之作用且已報告使用不同細胞培養物及異種移植模型獲得之有爭議之結果。關於轉殖基因小鼠之研究顯示GDF15可預防腸及肺中致癌物或Apc突變誘發之瘤形成(Baek SJ 2006,Gastroenterology.131：1553-60；Cekanova M 2009,Cancer Prev Res 2：450-8)。
本文提供包含GDF15多肽或GDF15突變體多肽及Fc域之融合蛋 白。
在一個實施例中，Fc域包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：16、22、28、29、33、35、38、48、85、91、106、132、141、148、155、162、169、176、183、192、199、206、213、220、227、233、236、268、275、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301及302。在另一個實施例中，GDF15多肽或GDF15突變體多肽包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：4、8、12、25、52及55。在另一實施例中，融合蛋白進一步包含多肽連接子。在一個實施例中，多肽連接子具有選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：18、30、34、40、58、61、64、69、72、75、78、113、116、119、122、125、128。在一個實施例中，融合蛋白包含兩個或兩個以上Fc域。在一個實施例中，融合蛋白包含兩個或兩個以上多肽連接子。在一個實施例中，融合蛋白包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：46、24、27、32、37、20、42、50、54、57、60、63、66、68、71、74、77、82、84、88、93、96、98、100、102、104、108、134、137、139、143、146、150、153、269、272、276、279、157、160、164、167、171、174、178、181、185、188、194、197、201、204、208、211、215、218、222、225、229、232、233、238及240。
本文亦提供包含以下之二聚體：(i)包含上述融合蛋白中之一者的第一多肽鏈及(ii)包含Fc域之第二多肽鏈。在又一個實施例中，構築體進一步包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：16、22、28、29、33、35、38、48、85、91、106、132、141、148、155、162、169、176、183、192、199、206、213、220、227、233、236、268、275、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301及302。
在一個實施例中，第一及第二多肽鏈非共價締合。在另一個實施例中，第一及第二多肽鏈共價締合。在一個實施例中，第一及第二多肽鏈在其各別Fc域之間經由二硫鍵共價締合。在另一個實施例中，第一及第二多肽鏈藉由共價及非共價相互作用締合。
在一特定實施例中，提供包含以下之二聚體：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：46之融合蛋白；(b)兩個包含序列SEQ ID NO：24之融合蛋白；或(c)兩個包含序列SEQ ID NO：27之融合蛋白。
在一特定實施例中，提供包含以下之二聚體：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：32之融合蛋白；或(b)兩個包含序列SEQ ID NO：37之融合蛋白；在一特定實施例中，提供包含以下之二聚體：包含序列SEQ ID NO：20之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：17之第二多肽鏈。
在一特定實施例中，提供包含以下之二聚體：(a)包含序列SEQ ID NO：42之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：39之第二多肽鏈；(b)包含序列SEQ ID NO：50之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：47之第二多肽鏈；(c)包含序列SEQ ID NO：54之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：47之第二多肽鏈；(d)包含序列SEQ ID NO：57之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：47之第二多肽鏈；(e)包含序列SEQ ID NO：60之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：47之第二多肽鏈；(f)包含序列SEQ ID NO：63之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：47之第二多肽鏈；(g)包含序列SEQ ID NO：66之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：47之第二多肽鏈；(h)包含序列SEQ ID NO：68之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：47之第二多肽鏈；(i)包含序列SEQ ID NO：71之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：47之第二多肽鏈；(j)包含序列SEQ ID NO：74之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：47之第二多肽鏈；(k)包含序列SEQ ID NO：77之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：47之第二 多肽鏈；(l)包含序列SEQ ID NO：80之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：47之第二多肽鏈；(m)包含序列SEQ ID NO：82之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：47之第二多肽鏈；或(n)包含序列SEQ ID NO：84之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：47之第二多肽鏈。
在一特定實施例中，提供包含以下之二聚體：(a)包含序列SEQ ID NO：88之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：86之第二多肽鏈；(b)包含序列SEQ ID NO：93之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：90之第二多肽鏈；(c)包含序列SEQ ID NO：96之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：90之第二多肽鏈；(d)包含序列SEQ ID NO：98之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：90之第二多肽鏈；(e)包含序列SEQ ID NO：100之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：90之第二多肽鏈；(f)包含序列SEQ ID NO：102之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：90之第二多肽鏈；(g)包含序列SEQ ID NO：104之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：90之第二多肽鏈；或(h)包含序列SEQ ID NO：108之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：105之第二多肽鏈。
在一特定實施例中，提供包含以下之二聚體：(a)包含序列SEQ ID NO：112之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：12之第二多肽鏈；(b)兩個各包含序列SEQ ID NO：112之多肽鏈；(c)兩個各包含序列SEQ ID NO：115之多肽鏈；(d)兩個各包含序列SEQ ID NO：118之多肽鏈；(e)兩個各包含序列SEQ ID NO：121之多肽鏈；(f)兩個各包含序列SEQ ID NO：124之多肽鏈；(g)兩個各包含序列SEQ ID NO：127之多肽鏈；(h)兩個各包含序列SEQ ID NO：130之多肽鏈；或(i)兩個各包含序列SEQ ID NO：242之多肽鏈。
在一特定實施例中，提供包含以下之二聚體：(a)包含序列SEQ ID NO：134之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：131之第二多肽鏈；(b)包含序列SEQ ID NO：137之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：131 之第二多肽鏈；(c)包含序列SEQ ID NO：139之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：131之第二多肽鏈；(d)包含序列SEQ ID NO：143之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：140之第二多肽鏈；(e)包含序列SEQ ID NO：146之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：140之第二多肽鏈；(f)包含序列SEQ ID NO：150之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：147之第二多肽鏈；(g)包含序列SEQ ID NO：153之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：147之第二多肽鏈；(h)包含序列SEQ ID NO：269之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：267之第二多肽鏈；(i)EQ ID包含序列S NO：272之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：267之第二多肽鏈；(j)包含序列SEQ ID NO：276之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：274之第二多肽鏈；或(k)包含序列SEQ ID NO：279之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：274之第二多肽鏈。
在一特定實施例中，提供包含以下之二聚體：(a)包含序列SEQ ID NO：157之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：154之第二多肽鏈；(b)包含序列SEQ ID NO：160之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：154之第二多肽鏈；(c)包含序列SEQ ID NO：164之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：161之第二多肽鏈；(d)包含序列SEQ ID NO：167之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：161之第二多肽鏈。
在一特定實施例中，提供包含以下之二聚體：(a)包含序列SEQ ID NO：171之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：168之第二多肽鏈；或(b)包含序列SEQ ID NO：174之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：168之第二多肽鏈。
在一特定實施例中，提供包含以下之二聚體：(a)包含序列SEQ ID NO：178之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：175之第二多肽鏈；(b)包含序列SEQ ID NO：181之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：175之第二多肽鏈；(c)包含序列SEQ ID NO：185之第一多肽鏈及包含序列 SEQ ID NO：182之第二多肽鏈；(d)包含序列SEQ ID NO：188之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：182之第二多肽鏈；(e)包含序列SEQ ID NO：194之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：191之第二多肽鏈；(f)包含序列SEQ ID NO：197之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：191之第二多肽鏈；(g)包含序列SEQ ID NO：201之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：198之第二多肽鏈；或(h)包含序列SEQ ID NO：204之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：198之第二多肽鏈。
在一特定實施例中，提供包含以下之二聚體：(a)包含序列SEQ ID NO：208之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：205之第二多肽鏈；(b)包含序列SEQ ID NO：211之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：205之第二多肽鏈；(c)包含序列SEQ ID NO：215之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：212之第二多肽鏈；或(d)包含序列SEQ ID NO：218之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：212之第二多肽鏈。
在一特定實施例中，提供包含以下之二聚體：(a)包含序列SEQ ID NO：222之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：219之第二多肽鏈；(b)包含序列SEQ ID NO：225之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：219之第二多肽鏈；(c)包含序列SEQ ID NO：229之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：226之第二多肽鏈；或(d)包含序列SEQ ID NO：232之第一多肽鏈及包含序列SEQ ID NO：226之第二多肽鏈。
在一特定實施例中，提供包含以下之二聚體：(a)兩個各包含序列SEQ ID NO：235之多肽鏈；(b)兩個各包含序列SEQ ID NO：238之多肽鏈；或(c)兩個各包含序列SEQ ID NO：240之多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含以下之四聚體：(i)包含上述二聚體中之一者的第一二聚體及(ii)包含上述二聚體中之一者的第二二聚體。在某些實施例中，第一二聚體之第一多肽鏈與第二二聚體之第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
在一些實施例中，二聚體不選自包含以下之群：DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15：DhCpmFc(+).、DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15(H6D)：DhCpmFc(+)、DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(H6D)：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(N3Q)：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)(L351C)、DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)(Y349C)、CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15：CpmFc(+)、Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15、Fc-(G4S)3-Fc-GS(G4S)4-GDF15及Fc-(G4S)5-Fc-GS(G4S)4-GDF15。
在一些實施例中，二聚體不選自由以下組成之群：DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15：DhCpmFc(+)、DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15(H6D)：DhCpmFc(+)、DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(H6D)：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(N3Q)：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)(L351C)及DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)(Y349C)。
在一些實施例中，融合蛋白不選自由以下組成之群：Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15、Fc-(G4S)3-Fc-GS(G4S)4-GDF15及Fc-(G4S)5-Fc-GS(G4S)4-GDF15。
在一些實施例中，二聚體不選自由以下組成之群：DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)(L351C)及DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)(Y349C)。
在一些實施例中，二聚體不為DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15：DhCpmFc(+)、DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15：DhCpmFc(-)、 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15(H6D)：DhCpmFc(+)、DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(H6D)：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(N3Q)：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)(L351C)、DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)(Y349C)、CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15：CpmFc(+)、Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15、Fc-(G4S)3-Fc-GS(G4S)4-GDF15或Fc-(G4S)5-Fc-GS(G4S)4-GDF15。
在一些實施例中，二聚體不為DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15：DhCpmFc(+)、DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15(H6D)：DhCpmFc(+)、DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(H6D)：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(N3Q)：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF15：DhCpmFc(-)、DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)(L351C)或DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)(Y349C)。
在一些實施例中，融合蛋白不選自由以下組成之群：Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15、Fc-(G4S)3-Fc-GS(G4S)4-GDF15及Fc-(G4S)5-Fc-GS(G4S)4-GDF15。
在一些實施例中，融合蛋白不選自由以下組成之群：DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)(L351C)及DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)(Y349C)。
在一些實施例中，二聚體不為DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15：DhCpmFc(+)。在一些實施例中，二聚體不為DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15：DhCpmFc(-)。在一些實施例中，二聚體不為DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15(H6D)：DhCpmFc(+)。在一些實施例中，二 聚體不為DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(H6D)：DhCpmFc(-)。在一些實施例中，二聚體不為DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(N3Q)：DhCpmFc(-)。在一些實施例中，二聚體不為DhCpmFc(+)-GDF15：DhCpmFc(-)。在一些實施例中，二聚體不為DhCpmFc(+)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)。在一些實施例中，二聚體不為DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF15：DhCpmFc(-)。在一些實施例中，二聚體不為DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF15：DhCpmFc(-)。在一些實施例中，二聚體不為DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)(L351C)。在一些實施例中，二聚體不為DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15：DhCpmFc(-)(Y349C)。在一些實施例中，二聚體不為CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15：CpmFc(+)。在一些實施例中，二聚體不為Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15。在一些實施例中，二聚體不為Fc-(G4S)3-Fc-GS(G4S)4-GDF15。在一些實施例中，二聚體不為Fc-(G4S)5-Fc-GS(G4S)4-GDF15。
本文亦提供包含GDF15多肽或GDF15突變體多肽及人類血清白蛋白(HSA)多肽之融合蛋白。在另一實施例中，HSA多肽包含序列SEQ ID NO：110。在另一個實施例中，GDF15多肽或GDF15突變體多肽包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：4、8、12、25、52及55。在另一個實施例中，融合蛋白進一步包含多肽連接子，從而將GDF15多肽或GDF15突變體多肽連接至HSA多肽。在一個實施例中，多肽連接子具有選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：18、30、34、40、58、61、64、69、72、75、78、113、116、119、122、125、128。在一個實施例中，融合蛋白質包含兩個或兩個以上HSA多肽。在一個實施例中，融合蛋白包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：115、118、121、124、127及130。
本文亦提供包含以下之二聚體：(i)包含有包含第一GDF15區及第一HSA多肽之融合蛋白之第一多肽鏈，及(ii)包含第二HSA多肽之第 二多肽鏈。在一些實施例中，第二多肽鏈進一步包含第二GDF15區。在一些實施例中，二聚體為雜二聚體(亦即第一及第二多肽鏈具有不同序列)。在一些實施例中，二聚體為均二聚體(亦即第一及第二多肽鏈具有相同序列)。在一些實施例中，第一多肽鏈包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：115、118、121、124、127及130。在一些實施例中，第二多肽鏈包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：115、118、121、124、127及130。在一個實施例中，第一及第二多肽鏈非共價締合。在另一個實施例中，第一及第二多肽鏈共價締合。在一個實施例中，第二多肽鏈包含第二GDF15區且第一及第二多肽鏈在其各別GDF15區之間經由二硫鍵共價締合。在另一個實施例中，第一及第二多肽鏈藉由共價及非共價相互作用締合。
本文亦提供包含以下之二聚體：(i)包含有包含第一GDF15區及第一HSA多肽之融合蛋白之第一多肽鏈，及(ii)包含第二GDF15區之第二多肽鏈。在一些實施例中，第一多肽鏈包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：115、118、121、124、127及130。在一些實施例中，第二多肽鏈包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：4、8、12、25、52及55。在一個實施例中，第一及第二多肽鏈非共價締合。在另一個實施例中，第一及第二多肽鏈共價締合。在另一個實施例中，第一及第二多肽鏈藉由共價及非共價相互作用締合。
圖1為描繪包含兩個Dh凸Fc-(G4S)4-GDF15：Dh凹Fc雜二聚體之二聚體的凸凹構築體之圖形。
圖2為描繪包含兩個Dh單Fc-(G4S)4-GDF15融合蛋白之二聚體的Dh單Fc構築體之圖形。
圖3為描繪包含兩個GGGFc-(G4S)4-Fc-S(G4S)4-GDF15融合蛋白之二聚體的半Fc構築體之圖形。
圖4為描繪包含兩個DhCpmFc(-)-(G4S)2-GDF15：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體的帶電對(del鉸鏈)構築體之圖形。
圖5為描繪包含兩個DhCpmFc(-)(L351C)-(G4S)2-GDF15：DhCpmFc(-)(L351C)雜二聚體的二聚體之帶電對(del鉸鏈)半胱胺酸夾構築體之圖形。
圖6為描繪包含兩個HSA-(G4S)4-GDF15融合蛋白之二聚體的HSA構築體之圖形。
圖7為展示使用Dh凸Fc-G4-GDF15：Dh凹Fc雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重(BW))之作用隨劑量(log[kg構築體/kg BW])而變之曲線。
圖8為展示使用Fc-(G4S)4-GDF15融合蛋白之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖9為展示使用Fc-(G4S)4-GDF15(H6D)融合蛋白之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖10為展示使用Fc-(G4S)4-Fc-(G4S)4-GDF15融合蛋白之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖11為展示使用DhFc-(G4S)5-DhFc-(G4S)4-GDF15融合蛋白之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖12為展示使用DhCpmFc(+)-(1K)-GDF15：DhCpmFc(-)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖13為展示使用DhCpmFc(-)-GDF15：DhCpmFc(+)雜二聚體之二 聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖14為展示使用DhCpmFc(-)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖15為展示使用DhCpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖16為展示使用DhCpmFc(-)-G4-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖17為展示使用DhCpmFc(-)-G4S-GDF15：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖18為展示使用DhCpmFc(-)-(G4S)2-GDF15：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖19為展示使用DhCpmFc(-)-(G4S)2-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖20為展示使用DhCpmFc(-)-(G4Q)2-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖21為展示使用DhCpmFc(-)-G4P-GDF15：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖22為展示使用DhCpmFc(-)-(G4P)2-GDF15：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖23為展示使用DhCpmFc(-)-G4Q-GDF15：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖24為展示使用DhCpmFc(-)-(G4Q)2-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖25為展示使用DhCpmFc(-)-(G4Q)2-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖26為展示使用DhCpmFc(+)(Y349C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(-)(S354C)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖27為展示使用DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15：DhCpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖28為展示使用DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖29為展示使用DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖30為展示使用DhCpmFc(-)(Y349C)-G4-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+) (S354C)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖31為展示使用DhCpmFc(-)(Y349C)-(G4S)2-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖32為展示使用DhCpmFc(-)(Y349C)-(G4Q)2-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖33為展示使用DhCpmFc(-)(L351C)-(G4S)2-GDF15：DhCpmFc(+)(L351C)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖34為展示使用HSA-GSAAQAAQQGS-GDF15融合蛋白之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖35為展示使用HSA-GSPAPAPGS-GDF15融合蛋白之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖36為展示使用HSA-GS(AAQAAQQ)2GS-GDF15融合蛋白之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖37為展示使用HSA-GS(PAPAP)2GS-GDF15融合蛋白之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖38為展示使用HSA-GDF15融合蛋白之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變 之曲線。
圖39為展示使用HSA-GGNAEAAAKEAAAKEAAAKAGG-GDF15融合蛋白之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖40為展示使用HSA-(G4S)6-GDF15融合蛋白之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖41為展示使用DhCpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖42為展示使用DhCpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖43為展示使用DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)(S354C)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖44為展示使用DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)(S354C)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖45為展示使用DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)(L351C)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖46為展示使用DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)(L351C)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖47為展示使用DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖48為展示使用CpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3)：CpmFc(+)(N297G)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖49為展示使用Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(N297G)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖50為展示使用Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)(N297G)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖51為展示使用Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)(N297G)(S354C)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖52為展示使用Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(-)(N297G)(S354C)雜二聚體之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體/kg BW])而變之曲線。
圖53為展示使用Dh單Fc(N297G)-GDF15融合蛋白之二聚體得到之對ob/ob小鼠之食物攝入(g食物/g體重)之作用隨劑量(log[g構築體 /kg BW])而變之曲線。
圖54為對於媒劑、0.1nmol、1nmol及10nmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體及0.1nmol、1nmol及10nmol Dh3ComFc(-)-GDF15(Ndel3)雜二聚體之二聚體，體重(g)隨時間(第1次注射後之天數)而變之曲線。
圖55為用以下治療2週時葡萄糖耐受性測試之曲線下面積(AUC)之條形圖：(a)媒劑、(b)10mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(c)1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(d)0.1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(e)10mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(g)1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體或(g)0.1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體。
圖56為用以下治療(飼餵)3週時胰島素(ng/mL)之條形圖：(a)媒劑、(b)10mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(c)1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(d)0.1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(e)10mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(g)1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體或(g)0.1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體。
圖57為用以下治療(飼餵)3週時三酸甘油酯(mg/mL)之條形圖：(a)媒劑、(b)10mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(c)1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(d)0.1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+) 雜二聚體之二聚體、(e)10mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(g)1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體或(g)0.1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體。
圖58為用以下治療(飼餵)3週時膽固醇(mg/mL)之條形圖：(a)媒劑、(b)10mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(c)1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(d)0.1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(e)10mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(g)1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體或(g)0.1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體。
圖59為用以下治療5週時葡萄糖耐受性測試之曲線下面積(AUC)之條形圖：(a)媒劑、(b)10mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(c)1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(d)0.1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(e)10mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體、(g)1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體或(g)0.1mmol Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體。
圖60為展示以下各物之關於FcγRI、FcγRIIIA及FcγRIIA之SPR結合(RU)之條形圖：(a)DhCpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)之二聚體；(b)DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(S354C)之二聚體；(c)Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)之二聚體；(d)Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)-Dh3CpmFc(+)(S354C)之二聚體；(e) Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)之二聚體；及(f)Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)(S354C)之二聚體(由左至右為各受體)。
圖61為展示相對於以下之DSC第一Tm(℃)之條形圖：(a)(對於標為「N3D」之條棒對)，DhCpmFc(-)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)之二聚體及Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)之二聚體；(b)(對於標為「Ndel3」之條棒對)，DhCpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)之二聚體及Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)之二聚體；(c)(對於標為「N3D+CC」之條棒對)，DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)之二聚體及Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)之二聚體；及(d)(對於標為「Ndel3+CC」之條棒對)，DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(S354C)之二聚體及Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(S354C)之二聚體。
本發明提供包含GDF15多肽或GDF15突變體多肽之融合蛋白及包含此類融合蛋白之構築體。亦提供所揭示之分子之產生及用途，例如用於治療代謝病症，諸如2型糖尿病、高葡萄糖含量、高胰島素含量、血脂異常或肥胖症。GDF15多肽、GDF15突變體多肽及包含GDF15多肽及GDF15突變體多肽之某些多肽構築體描述於共同擁有之PCT/US2012/032415(申請於04/05/2012)及PCT/2013/023465(申請於01/28/2013)中，兩文獻皆出於任何目的明確以全文引用的方式併入本文中。
本文所使用之重組多肽及核酸方法(包括於實例中)一般為Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)或Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編，Green Publishers Inc.及Wiley and Sons 1994)中所述之重組多肽及核酸方法。
I.一般定義
按照約定，除非另外明確規定，否則如本文所用，術語「一(a及an)」意謂「一或多個(種)」。
如本文所用，術語「胺基酸」及「殘基」可互換，且在用於肽或多肽之情形中時係指天然存在及合成之胺基酸以及胺基酸類似物、胺基酸模擬物及化學上與天然存在之胺基酸類似之非天然存在之胺基酸。
術語「天然存在之胺基酸」及「天然編碼之胺基酸」可互換使用，且係指藉由基因編碼進行編碼之胺基酸以及在合成之後經修飾之藉由基因編碼進行編碼之彼等胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷絲胺酸。
「胺基酸類似物」為具有與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構(亦即，與氫、羧基、胺基及R基結合之α碳)之化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物可具有經修飾之R基團(例如正白胺酸)或經修飾之肽主鏈，但仍將保持與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構。
「胺基酸模擬物」為具有與胺基酸之一般化學結構不同之結構，但以與天然存在之胺基酸類似之方式起作用之化合物。實例包括醯胺、β-、γ-、δ-亞胺基酸之甲基丙烯醯基或丙烯醯基衍生物(諸如哌啶-4-甲酸)及其類似物。
術語「非天然存在之胺基酸」及「非天然編碼之胺基酸」可互換使用，且係指與天然存在之胺基酸具有相同之基本化學結構，但不會藉由翻譯複合併入生長多肽鏈中之化合物。「非天然存在之胺基酸」亦包括(但不限於)因天然編碼之胺基酸(包括(但不限於)20種常見胺基酸)發生修飾(例如轉譯後修飾)而存在但本身不由轉譯複合物天然 併入生長中之多肽鏈中的胺基酸。可插入至多肽序列中或取代多肽序列中之野生型殘基之非天然存在之胺基酸之實例之非限制性列舉包括β-胺基酸、高胺基酸、環狀胺基酸及具有衍生之側鏈之胺基酸。實例包括(呈L形式或D形式；縮寫如圓括號中)：瓜胺酸(Cit)、高瓜胺酸(hCit)、Nα-甲基瓜胺酸(NMeCit)、Nα-甲基高瓜胺酸(Nα-MeHoCit)、鳥胺酸(Orn)、Nα-甲基鳥胺酸(Nα-MeOrn或NMeOrn)、肌胺酸(Sar)、高離胺酸(hLys或hK)、高精胺酸(hArg或hR)、高麩醯胺酸(hQ)、Nα-甲基精胺酸(NMeR)、Nα-甲基白胺酸(Nα-MeL或NMeL)、N-甲基高離胺酸(NMeHoK)、Nα-甲基麩醯胺酸(NMeQ)、正白胺酸(Nle)、正纈胺酸(Nva)、1,2,3,4-四氫異喹啉(Tic)、八羥吲哚-2-甲酸(Oic)、3-(1-萘基)丙胺酸(1-Nal)、3-(2-萘基)丙胺酸(2-Nal)、1,2,3,4-四氫異喹啉(Tic)、2-茚滿基甘胺酸(IgI)、對碘苯丙胺酸(pI-Phe)、對胺基苯丙胺酸(4AmP或4-Amino-Phe)、4-胍基苯丙胺酸(Guf)、甘胺醯離胺酸(縮寫為「K(Nε-甘胺醯基)」或「K(甘胺醯基)」或「K(gly)」)、硝基苯丙胺酸(nitrophe)、胺基苯丙胺酸(aminophe或Amino-Phe)、苄基苯丙胺酸(benzylphe)、γ-羧基麩胺酸(γ-carboxyglu)、羥脯胺酸(hydroxypro)、對羧基苯丙胺酸(Cpa)、α-胺基己二酸(Aad)、Nα-甲基纈胺酸(NMeVal)、N-α-甲基白胺酸(NMeLeu)、Nα-甲基正白胺酸(NMeNle)、環戊基甘胺酸(Cpg)、環己基甘胺酸(Chg)、乙醯精胺酸(acetylarg)、α,β-二胺基丙酸(Dpr)、α,γ-二胺基丁酸(Dab)、二胺基丙酸(Dap)、丙胺酸環己酯(Cha)、4-甲基-苯丙胺酸(MePhe)、β,β-二苯基-丙胺酸(BiPhA)、胺基丁酸(Abu)、4-苯基-苯丙胺酸(或聯苯丙胺酸；4Bip)、α-胺基-異丁酸(Aib)、β-丙胺酸、β-胺丙酸、胺基丁酸、胺基己酸、胺基庚酸、胺基庚二酸、鎖鏈素、二胺基庚二酸、N-乙基甘胺酸、N-乙基天冬醯胺、羥基離胺酸、別羥基離胺酸、異鎖鏈素、別異白胺酸、N-甲基甘胺酸、N-甲基異白胺酸、N-甲基纈胺酸、4-羥脯胺 酸(Hyp)、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、ω-甲基精胺酸、4-胺基-O-鄰苯二甲酸(4APA)、N-乙醯基葡糖胺基-L-絲胺酸、N-乙醯基葡萄糖基胺基-L-蘇胺酸、O-磷酸酪胺酸及其他類似胺基酸及彼等具體列舉者中之任一者之衍生形式。
「非天然存在之胺基酸」之定義中亦包括包含以下結構之任何胺基酸
其中R基團為除用於20個天然胺基酸之取代基外之任何取代基。
在一些實施例中，非天然編碼之胺基酸包含羰基。在一些實施例中，非天然編碼之胺基酸具有以下結構：
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代之烷基或經取代之芳基；R2為H、烷基、芳基、經取代之烷基及經取代之芳基；且R3為H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，且R4為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。
在一些實施例中，非天然編碼之胺基酸包含胺氧基。在一些實施例中，非天然編碼之胺基酸包含醯肼基。在一些實施例中，非天然編碼之胺基酸包含肼基。在一些實施例中，非天然編碼之胺基酸包含 胺脲。
在一些實施例中，非天然編碼之胺基酸殘基包含疊氮基。在一些實施例中，非天然編碼之胺基酸具有以下結構：
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代之烷基、經取代之芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10；R2為H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，且R3為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。
在一些實施例中，非天然編碼之胺基酸包含炔烴基。在一些實施例中，非天然編碼之胺基酸具有以下結構：
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代之烷基或經取代之芳基；X為O、N、S或不存在；m為0-10；R2為H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，且R3為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。
術語「經取代」意謂分子或基團上之氫原子經稱為取代基之基團或原子置換。典型取代基包括：鹵素、C1-8烷基、羥基、C1-8烷氧基、-NRxRx、硝基、氰基、鹵基或全鹵C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、-SRx、-S(=O)2Rx、-C(=O)ORx、-C(=O)Rx，其中各Rx獨立地為氫或C1-C8烷基。應注意當取代基為-NRxRx時，Rx基團可與氮原子連接 在一起以形成環。
術語「烷基」意謂直鏈或分支鏈烴。烷基之代表性實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、戊基及己基。典型烷基為具有1至8個碳原子之烷基，該等基團通常表示為C1-8烷基。
術語「烷氧基」意謂鍵結至氧原子之烷基。烷氧基之代表性實例包括甲氧基、乙氧基、第三丁氧基、丙氧基及異丁氧基。常見烷氧基為C1-8烷氧基。
術語「鹵素」或「鹵基」意謂氯、氟、溴或碘。
術語「烯基」意謂具有一或多個碳碳雙鍵之分支鏈或直鏈烴。烯基之代表性實例包括乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基及4-甲基丁烯基。常見烯基為C2-8烯基。
術語「炔基」意謂具有一或多個碳碳參鍵之分支鏈或直鏈烴。炔基之代表性實例包括乙炔基、丙炔基(炔丙基)及丁炔基。常見炔基為C2-8炔基。
術語「環烷基」意謂環狀非芳族烴。環烷基之實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基及環庚基。環烷基可含有一或多個雙鍵。含有雙鍵之環烷基之實例包括環戊烯基、環己烯基、環己二烯基及環丁二烯基。常見環烷基為C3-8環烷基。
術語「全氟烷基」意謂所有氫原子已經氟原子置換之烷基。常見全氟烷基基團為C1-8全氟烷基。常見全氟烷基之實例為-CF3。
術語「醯基」意謂藉由移除羥基(-OH)由有機酸衍生之基團。舉例而言，醯基CH3C(=O)-由自CH3C(=O)OH移除羥基來形成。
術語「芳基」意謂環狀芳族烴。芳基之實例包括苯基及萘基。常見芳基為6至13員環。
如本文所用，術語「雜原子」意謂氧、氮或硫原子。
術語「雜芳基」意謂芳基之一或多個碳原子已經雜原子置換之環狀芳族烴。若雜芳基含有一個以上雜原子，則雜原子可相同或不同。雜芳基之實例包括吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、吡嗪基、吡咯基、吲哚基、三唑基、噠嗪基、吲唑基、嘌呤基、喹嗪基、異喹啉基、喹啉基、啶基、喹喏啉基、異噻唑基及苯并[b]噻吩基。常見雜芳基為含有1至4個雜原子之5至13員環。為含有1至3個雜原子之5及6員環之雜芳基尤其常見。
術語「雜環烷基」意謂一或多個碳原子已經雜原子置換之環烷基。若雜環烷基含有一個以上雜原子，則雜原子可相同或不同。雜環烷基之實例包括四氫呋喃基、嗎啉基、哌嗪基、哌啶基及吡咯啶基。雜環烷基亦可能具有一或多個雙鍵，但不為芳族的。含有雙鍵之雜環烷基之實例包括二氫呋喃。常見雜環烷基為含有1至4個雜原子之3至10員環。為含有1至2個雜原子之5及6員環之雜芳基尤其常見。
亦應注意環狀環基，亦即芳基、雜芳基、環烷基及雜環烷基可包含一個以上環。舉例而言，萘基為稠合雙環狀環系統。本發明亦意欲包括具有橋接原子之環基或具有螺取向之環基。
視情況具有一或兩個雜原子之5至6員芳族環之代表性實例為苯基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、異噁唑基、異噻唑基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基及吡嗪基。
視情況具有一至三個雜原子之部分飽和、完全飽和或完全不飽和5至8員環之代表性實例為環戊基、環己基、環庚基、環辛基及苯基。其他例示性五員環為呋喃基、噻吩基、吡咯基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、吡咯啶基、1,3-二氧戊環基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、2H-咪唑基、2-咪唑啉基、咪唑啶基、吡唑基、2-吡唑啉基、吡唑啶基、異噁唑基、異噻唑基、1,2-二硫雜環戊烯基、1,3-二硫雜環戊烯基、3H-1,2-氧硫雜環戊烯基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、 1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,3,4-噻二唑基、3H-1,2,3-二噁唑基、1,2,4-二噁唑基、1,3,2-二噁唑基、1,3,4-二噁唑基、5H-1,2,5-氧噻唑基及1,3-氧硫雜環戊烯基。
其他例示性6員環為2H-哌喃基、4H-哌喃基、吡啶基、哌啶基、1,2-二氧雜環己烯基、1,3-二氧雜環己烯基、1,4-二氧雜環己烷基、嗎啉基、1,4-二噻烷基、硫代嗎啉基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、1,3,5-三嗪基、1,2,4-三嗪基、1,2,3-三嗪基、1,3,5-三噻烷基、4H-1,2-噁嗪基、2H-1,3-噁嗪基、6H-1,3-噁嗪基、6H-1,2-噁嗪基、1,4-噁嗪基、2H-1,2-噁嗪基、4H-1,4-噁嗪基、1,2,5-噁噻嗪基、1,4-噁嗪基、鄰異噁嗪基、對異噁嗪基、1,2,5-噁噻嗪基、1,2,6-噁噻嗪基及1,4,2-噁二嗪基。
其他例示性7員環為氮呯基、氧呯基、噻呯基及1,2,4-三氮呯基。
其他例示性8員環為環辛基、環辛烯基及環辛二烯基。
視情況具有1至4個雜原子之由兩個稠合部分飽和、完全飽和或完全不飽和5及/或6員環組成之例示性雙環狀環為吲哚嗪基、吲哚基、異吲哚基、吲哚啉基、環戊(b)吡啶基、吡喃并(3,4-b)吡咯基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并(b)噻吩基、苯并(c)噻吩基、1H-吲唑基、吲噁嗪基、苯并噁唑基、鄰胺基苯甲醯基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、喹啉基、異喹啉基、啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喏啉基、1,8-啶基、喋啶基、茚基、異茚基、萘基、萘滿基、十氫萘基、2H-1-苯并哌喃基、吡啶并(3,4-b)吡啶基、吡啶并(3,2-b)吡啶基、吡啶并(4,3-b)-吡啶基、2H-1,3-苯并噁嗪基、2H-1,4-苯并噁嗪基、1H-2,3-苯并噁嗪基、4H-3,1-苯并噁嗪基、2H-1,2-苯并噁嗪基及4H-1,4-苯并噁嗪基。
環狀環基可以一種以上方式鍵結至另一基團。若不指定特定鍵結排列，則意欲為所有可能排列。舉例而言，術語「吡啶基」包括2-、3-或4-吡啶基，且術語「噻吩基」包括2-或3-噻吩基。
術語「分離之核酸分子」係指在總核酸自源細胞分離時與天然與核酸一起存在之多肽、肽、脂質、碳水化合物、聚核苷酸或其他物質之至少約50%分離的自5'至3'端閱讀之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸鹼基之單或雙股聚合物(例如本文提供之GDF15核酸序列)或其類似物。較佳地，分離之核酸分子實質上不含在核酸之天然環境中可見之會干擾其在多肽生產或其治療性、診斷性、預防性或研究用途中之用途的任何其他污染核酸分子或其他分子。
術語「分離之多肽」係指在自源細胞分離時與天然與其一起存在之多肽、肽、脂質、碳水化合物、聚核苷酸或其他物質之至少約50%分離的多肽(本文提供之例如GDF15多肽或GDF15突變體多肽)。較佳地，分離之多肽實質上不含在其自然環境中可見之會干擾其治療性、診斷性、預防性或研究用途的任何其他污染多肽或其他污染物。
術語「編碼」係指聚核苷酸序列編碼一或多個胺基酸。該術語不需要起始或終止密碼子。胺基酸序列可以藉由聚核苷酸序列提供之不同閱讀框架中之任一者編碼。
在兩個或兩個以上核酸或多肽序列之情況下，術語「一致」及「一致性」百分比係指兩個或兩個以上相同之序列或子序列。「一致性百分比」意謂所比較分子中胺基酸或核苷酸之間相同殘基之百分比，且基於所比較之最小分子之尺寸來計算。對於此等計算，比對中之空隙(若存在)可經特定數學模型或電腦程式(亦即「演算法」)處理。可用於計算比對之核酸或多肽之一致性的方法包括以下文獻中描述之方法：Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.編)，1988,New York：Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.編)，1993,New York：Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，(Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編)，1994,New Jersey：Humana Press；von Heinje,G.,(1987)Sequence Analysis in Molecular Biology,New York：Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.及Devereux,J.編)，1991,New York：M.Stockton Press；及Carillo等人，(1988)SIAM J.Applied Math. 48：1073。
在計算一致性百分比時，以在序列之間得到最大匹配之方式比對所比較之序列。用以測定一致性百分比之電腦程式為GCG程式包，其包括GAP(Devereux等人，(1984)Nucl.Acid Res. 12：387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)。使用電腦演算法GAP來比對兩個欲測定序列一致性百分比之多肽或聚核苷酸。比對序列以獲得其各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配(「匹配跨度」，如由演算法所測定)。空隙開放罰分(gap opening penalty)(其係按3×平均對角線計算，其中「平均對角線」為所用比較矩陣之對角線的平均值；「對角線」為由特定比較矩陣分配給各完美胺基酸匹配之評分或數值)及空隙擴展罰分(gap extension penalty)(其通常為1/10×空隙開放罰分)以及比較矩陣(諸如PAM 250或BLOSUM 62)與演算法結合使用。在某些實施例中，演算法亦使用標準比較矩陣(對於PAM 250比較矩陣，參見Dayhoff等人，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure 5：345-352；對於BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89：10915-10919)。
使用GAP程式測定多肽或核苷酸序列之一致性百分比的推薦參數包括以下：演算法：Needleman等人，1970,J.Mol.Biol. 48：443-13；比較矩陣：BLOSUM 62，來自Henikoff等人，1992，同上；空隙罰分：12(但無末端空隙罰分)
空隙長度罰分：4
相似性臨限值：0
用於比對兩個胺基酸序列之某些比對方案可產生兩個序列之僅較短區域的匹配，且此較小比對區域可具有極高序列一致性，即使兩個全長序列之間不存在顯著關係。因此，若需要產生跨越目標多肽之至少50個鄰接胺基酸的比對，則可調整所選比對方法(例如GAP程式)。
術語「GDF15多肽」意謂在哺乳動物中表現之天然存在或「野生型」GDF15，哺乳動物包括(但不限於)人類、兔、猴(例如食蟹獼猴)、狗、大鼠、小鼠或豬。在一個態樣中，GDF15多肽係指任何全長GDF15，例如SEQ ID NO：4，其由308個胺基酸殘基組成且其藉由核苷酸序列SEQ ID NO：3編碼；包含多肽之活性結構域及前結構域之任何形式，例如SEQ ID NO：8，其由279個胺基酸殘基組成且其藉由核苷酸序列SEQ ID NO：7編碼，且其中全長GDF15之胺基端末端之29個胺基酸殘基(亦即其構成信號肽)已移除；及已移除前結構域及信號序列之包含活性結構域之GDF15之任何形式，例如SEQ ID NO：12，其由112個胺基酸殘基組成且其藉由核苷酸序列SEQ ID NO：11編碼，其中信號序列及前結構域已移除。GDF15多肽可(但無需)包含胺基端甲硫胺酸，其可藉由工程改造或由於細菌性表現方法而引入。
術語「GDF15突變體多肽」係指已進行修飾之GDF15多肽(例如SEQ ID NO：4、8或12)。此類修飾包括(但不限於)一或多個胺基酸取代(包括經非天然存在之胺基酸、非天然存在之胺基酸類似物及胺基酸模擬物取代)、添加或缺失。在一個態樣中，術語「GDF15突變體多肽」係指至少一個常見於天然存在之GDF15多肽之既定位置之殘基發生缺失或經不常見於天然存在之GDF15多肽之彼位置之殘基置換之GDF15多肽。在一些情況下，所需用一個以上不常見於天然存在之GDF15多肽之序列中之既定位置的殘基置換常見於該位置之單個殘基；在其他情況下，可能需要維持天然存在之GDF15多肽之序列且在 蛋白質中之既定位置插入一或多個殘基；在其他情況下，可能需要使既定殘基全部缺失；所有此等構築體均由術語「GDF15突變體多肽」涵蓋。
在各種實施例中，GDF15突變體多肽包含與天然存在之GDF15多肽(例如SEQ ID NO：4、8或12)至少約85%一致之胺基酸序列。在其他實施例中，GDF15突變體多肽包含與天然存在之GDF15多肽胺基酸序列(例如SEQ ID NO：4、8或12)至少約90%或約95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。此類GDF15突變體多肽較佳(但無需)具有天然存在之GDF15多肽之至少一種活性，諸如降低血糖、胰島素、三酸甘油酯或膽固醇含量之能力；減少體重之能力；改良葡萄糖耐受性、脂質耐受性或胰島素敏感性之能力；或降低尿葡萄糖及蛋白質排泄之能力。
術語「GDF15區」涵蓋GDF15多肽及GDF15突變體多肽及如上文所定義之序列。
GDF15多肽或GDF15突變體多肽較佳具生物活性。在一些情況下，GDF15多肽或GDF15突變體多肽用以治療或改善個體之來自或源自與該個體不同之物種的代謝病症。在一些情況下，GDF15多肽或GDF15突變體多肽用以治療或改善個體之來自或源自與該個體相同之物種的代謝病症。
術語「天然Fc」係指包含由完整抗體消化所得之非抗原結合片段之序列的分子或序列，無論其為單體或多聚體形式。天然Fc之原始免疫球蛋白來源較佳為人類來源且可為免疫球蛋白中之任一者，但IgG1及IgG2較佳。天然Fc由可藉由共價(亦即二硫鍵)及非共價締合連接成二聚體或多聚體形式之單體多肽組成。視種類(例如IgG、IgA、IgE)或亞類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2)而定，天然Fc分子之單體次單位之間的分子間二硫鍵之數目在1至4之範圍內。天然Fc 之一個實例為由IgG之番木瓜蛋白酶分解產生之二硫鍵鍵結之二聚體(參見Ellison等人，(1982),Nucleic Acids Res.10：4071-9)。如本文所用，術語「天然Fc」為單體、二聚體及多聚體形式之總稱。
術語「Fc變異體」係指自天然Fc修飾得到之分子或序列。此類修飾包括(但不限於)一或多個胺基酸取代(包括經非天然存在之胺基酸、非天然存在之胺基酸類似物及胺基酸模擬物取代)、缺失或添加。因此，術語「Fc變異體」包含自非人類天然Fc人源化得到之分子或序列。此外，天然Fc包含可移除之位點，因為該等位點提供非本發明之融合分子所需要之結構特徵或生物活性。因此，術語「Fc變異體」包含缺乏一或多個影響以下或與以下有關之天然Fc位點或殘基之分子或序列：(1)二硫鍵形成、(2)與所選宿主細胞之不相容性、(3)在所選宿主細胞中表現時之N端非均質性、(4)糖基化、(5)與補體之相互作用、(6)結合至除救助受體外之Fc受體、或(7)抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。Fc變異體描述於下文之其他細節中。在各種實施例中，Fc變異體包含與天然Fc至少約85%一致之胺基酸序列。在其他實施例中，Fc變異體包含與天然Fc至少約90%或約95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。
術語「Fc域」涵蓋如上文所定義之天然Fc及Fc變異體分子及序列。如同Fc變異體及天然Fc一樣，術語「Fc域」包括呈單體或多聚體形式之分子。
術語「多聚體」在應用於Fc域或包含Fc域之分子時係指具有兩個或兩個以上共價、非共價或藉由共價與非共價相互作用締合之多肽鏈的分子。IgG分子通常形成二聚體；IgM通常形成五聚體；IgD通常形成二聚體；且IgA通常形成單體、二聚體、三聚體或四聚體。多聚體可由利用Fc之天然Ig來源之序列及所得活性或藉由衍生此類天然Fc來形成。
術語「二聚體」在應用於Fc域或包含Fc域之分子時係指具有兩個共價、非共價或藉由共價與非共價相互作用締合之多肽鏈的分子。
術語「鉸鏈」或「鉸鏈區」在本文中包括包含抗體之第一與第二恆定域之間的胺基酸之可撓性多肽。如本文中所提及，「鉸鏈區」為長度為6-62個胺基酸之序列區，僅存在於IgA、IgD及IgG中，其涵蓋橋接兩個重鏈之半胱胺酸殘基。
「多肽連接子」係指長度一般為1至30個胺基酸殘基之短多肽，其通常經由肽鍵與兩個多肽共價連接於一起。
如本文所用，術語HSA多肽涵蓋天然存在之「野生型」人類血清白蛋白。該術語亦包括各種生物活性片段及變異體、融合蛋白及野生型HSA蛋白質之經修飾形式。此類生物活性片段或變異體、融合蛋白及野生型HSA蛋白質之經修飾形式具有與野生型HAS蛋白質大體序列一致之胺基酸序列之至少一部分。在某些實施例中，此類生物活性片段或變異體、融合蛋白及野生型HSA蛋白質之經修飾形式具有與野生型HSA至少約85%一致之胺基酸序列。在其他實施例中，此類生物活性片段或變異體、融合蛋白及野生型HSA蛋白質之經修飾形式具有與野生型HAS至少約90%、或約95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。
II.包含GDF15多肽或GDF15突變體多肽之Fc融合物及聚核苷酸
本文提供一系列包含GDF15多肽或GDF15突變體多肽之Fc融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白包含天然Fc。在一些實施例中，融合蛋白包含已進行工程改造之Fc域。
在一些實施例中，含有GDF15多肽(或GDF15突變體多肽)之Fc融合蛋白與由Fc域組成或包含Fc域之另一多肽鏈締合以形成雜二聚體。在一些實施例中，兩個此類二聚體締合以形成雜四聚體。如下文所呈現之實例中所描述，憑經驗研究此等多肽構築體中之一些(亦即含有 GDF15多肽(或GDF15突變體多肽)之融合蛋白及包含一或多個此類含有GDF15多肽(或GDF15突變體多肽)之Fc融合蛋白的多聚體)。
抗體屬於包括IgG、IgA、IgE、IgM及IgD之免疫球蛋白類蛋白質。人類血清中最豐富之免疫球蛋白類為IgG(Deisenhofer J 1981 Biochem 20：2361-2370；Huber R 1984 Behring Inst Mitt 76：1-14；Roux KH 1999 Int Arch Allergy Immunol 120：85-99)。IgG結構具有四個鏈，即兩個輕鏈及兩個重鏈；各輕鏈具有兩個域且各重鏈具有四個域。抗原結合位點位於含有可變輕(VL)鏈域及可變重(VH)鏈域以及恆定輕(LC)鏈域及恆定重(CH1)鏈域之Fab域(抗原結合片段)中。重鏈之CH2及CH3域區稱為Fc(可結晶片段)。IgG分子可視為具有兩個在鉸鏈區藉由二硫鍵(-S-S-)結合在一起之重鏈以及兩個輕鏈之雜四聚體。在免疫球蛋白亞類中鉸鏈二硫鍵之數目有所不同(Papadea C 1989 Crit Rev Clin Lab Sci 27：27-58)。FcRn結合位點位於抗體之Fc域(Martin WL 2001 Mol Cell 7：867-877)，且因此抗體之擴展血清半衰期特性保留於Fc片段中。可將單獨Fc域視為包含CH2及CH3域之重鏈之均二聚體。
在某些較佳實施例中，本文所述之融合蛋白包含源自野生型人類IgG Fc域之IgG Fc域。「野生型」人類IgG Fc意謂天然存在於人類群體內之胺基酸之序列。當然，正如個體之間Fc序列可略有不同一般，野生型序列可發生一或多種改變且仍保持在本發明之範疇內。舉例而言，Fc域可含有與本發明無關之其他改變，諸如糖基化位點中之突變或包含非天然胺基酸。在某些實施例中，含有CH3區之多肽為IgG分子且進一步含有CH1及CH2域。例示性人類IgG序列包含IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之恆定區。Fc域亦可包含在IgA、IgD、IgE及IgM重鏈之恆定區內。
一些含有GDF15多肽或GDF15突變體多肽之Fc融合蛋白及包含此類Fc融合蛋白之多聚體包括下文所述者。
II.A. Dh單Fc構築體
在本發明中名稱「單-」或「單Fc域」係指已進行工程改造以減少或防止均二聚體形成之Fc域。在一個實施例中，單Fc域藉由在天然Fc或Fc變異體中引入酪胺酸至蘇胺酸突變(Y349T)及兩個離胺酸至天冬胺酸突變(K392D及K409D)來提供。
單Fc中視情況可缺失C端離胺酸(K447)。舉例而言，當肽在C端稠合以減少融合蛋白之蛋白質分解時，此情況可為有利的。
提供包含單Fc域及GDF15區之融合蛋白。通常，GDF15區之N端直接或經由多肽連接子連接至單Fc域之C端。然而，在一些實施例中，單Fc域之N端直接或經由多肽連接子連接至GDF15區之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之此類融合蛋白的二聚體。在一些實施例中，二聚體為均二聚體。在其他實施例中，二聚體為雜二聚體。
在本發明中，名稱「Dh單」「Dh單Fc域」係指已移除所有或一部分鉸鏈區且已進行工程改造以減少或防止均二聚體形成之Fc域。在一個實施例中，在已移除所有或一部分鉸鏈區之天然Fc或Fc變異體中引入酪胺酸至蘇胺酸突變(Y349T)及兩個離胺酸至天冬胺酸突變(K392D及K409D)提供Dh單Fc域。
Dh單Fc中視情況可缺失C端離胺酸(K447)。舉例而言，當肽在C端稠合以減少融合蛋白之蛋白質分解時，此情況可為有利的。
提供包含Dh單Fc域及GDF15區之融合蛋白。通常，GDF15區之N端直接或經由多肽連接子連接至Dh單Fc域之C端。然而，在一些實施例中，Dh單Fc域之N端直接或經由多肽連接子連接至GDF15區之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之此類融合蛋白的二聚體。在一些實施例中，二聚體為均 二聚體。在其他實施例中，二聚體為雜二聚體。
II.A.1 Dh單Fc-GDF15
在本發明中，名稱「單Fc-GDF15」係指包含GDF15多肽之融合蛋白，其N端直接連接至單Fc域之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之此類融合蛋白的均二聚體。
更特定言之，在一特定實施例中，均二聚體包含：(a)兩個包含以下序列之單Fc域(各單體一個)： (SEQ ID NO：22)，及(b)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(各單體一個)。
在一較佳實施例中，融合蛋白包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：46)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：45)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：46之單體的均二聚體。
II.A.2 Dh單Fc-(G 4 S) 4 -GDF15
在本發明中，名稱「Dh單Fc-(G4S)4-GDF15」係指包含經由多肽連接子連接至Dh單Fc域之GDF15多肽之融合蛋白，該多肽連接子包含序列SEQ ID NO：18且使GDF15多肽之N端連接至Dh單Fc域之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之此類融合蛋白的均二聚體。
更特定言之，在一特定實施例中，均二聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：22之Dh單Fc域(各單體一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(各單體一個)，及(c)兩個包含以下序列之多肽連接子(各單體一個)：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：18)
各多肽連接子使GDF15多肽之N端連接至Dh單Fc域之C端。
在一較佳實施例中，融合蛋白包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：24)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：23)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：24之單體的均二聚體。
II.A.3 Dh單Fc-(G 4 S) 4 -GDF15(H6D)
在本發明中，名稱「Dh單Fc-(G4S)4-GDF15(H6D)」係指包含經由多肽連接子連接至Dh單Fc域之GDF15多肽之融合蛋白，該多肽連接子包含序列SEQ ID NO：18且使GDF15多肽之N端連接至Dh單Fc域之C端。GDF15(H6D)變異體為天然存在之人類GDF15變異體。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之此類融合蛋白的均二聚體。
更特定言之，在一特定實施例中，均二聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：22之Dh單Fc域(各單體一個)，(b)兩個包含以下序列之GDF15(H6D)多肽(各單體一個)： (SEQ ID NO：25)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：18之多肽連接子(各單體一個)，各多肽連接子使GDF15多肽之N端連接至Dh單Fc域之C端。
在一較佳實施例中，融合蛋白包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：27)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：26)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供兩個包含具有序列SEQ ID NO：27之單體的均二聚體。
II.B.半Fc
在本發明中，名稱「半-」或「半Fc域」係指包含直接或經由多肽連接子連接至第二Fc域之第一Fc域之多肽鏈。在一個實施例中，第一Fc域及第二Fc域具有相同序列。在另一個實施例中，第一Fc域及第二Fc域具有不同序列。通常，第一及第二Fc域在其各別鉸鏈區之間經由二硫鍵共價締合。
第一Fc域、第二Fc域或兩者中可視情況缺失C端離胺酸(K447)。舉例而言，當肽在C端稠合以減少融合蛋白之蛋白質分解時，此情況可為有利的。
提供包含半Fc域及GDF15區之融合蛋白。通常，GDF15區之N端直接或經由多肽連接子連接至半Fc域之C端。然而，在一些實施例中，半Fc域之N端直接或經由多肽連接子連接至GDF15區之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之此類融合蛋白的二聚體。在一些實施例中，二聚體為均二聚體。在其他實施例中，二聚體為雜二聚體。對於兩個GGG-Fc-(G4S)4-Fc-S(G4S)4-GDF15融合蛋白之均二聚體之實施例的圖形描述參 見圖3。
GGGFc-(G 4 S) 4 -Fc-S(G 4 S) 4 -GDF15
在本發明中，名稱「GGGFc-(G4S)4-Fc-S(G4S)4-GDF15」係指包含經由第一多肽連接子連接至半Fc域之GDF15多肽之融合蛋白，該第一多肽連接子包含序列SEQ ID NO：30且使GDF15多肽之N端連接至半Fc域之C端。半Fc域包含經由多肽連接子連接至第二Fc域之第一Fc域，該多肽連接子包含序列SEQ ID NO：18且使第一Fc域之N端連接至第二Fc域之C端(其具有三個添加至其N端之甘胺酸殘基)。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之此類融合蛋白的均二聚體。
更特定言之，在一特定實施例中，均二聚體包含：
(a)兩個包含以下序列(部分鉸鏈區位於圓括號中)之第二Fc域(各單體一個)： (SEQ ID NO：28)，
(b)兩個包含以下序列(部分鉸鏈區位於圓括號中)之第一Fc域(各單體一個)： (SEQ ID NO：29)。
(c)兩個包含序列SEQ ID NO：18之第二多肽連接子(各單體一個)，各第二多肽連接子使第一Fc域之N端連接至第二Fc域之C端，
(d)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(各單體一個)，及
(e)兩個包含以下序列之第一多肽連接子(各單體一個)：SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：30)
該等多肽連接子使GDF15多肽之N端連接至第一Fc域之C端。
在一較佳實施例中，融合蛋白包含以下胺基酸序列(部分鉸鏈區位於圓括號中；連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：32)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：31)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供兩個包含具有序列SEQ ID NO：32之單體的均二聚體。
II.C.Dh半Fc
在本發明中，名稱「Dh半-」或「Dh半Fc域」係指包含直接或經由多肽連接子連接至第二DhFc域之已移除所有或部分鉸鏈區之第一Fc域(「DhFc」域)的多肽鏈。在特定具體實例中，移除鉸鏈區中之N端12個胺基酸，例如ERKSSVECPPCP(SEQ ID NO：15)。在一個實施例中，第一DhFc域及第二DhFc域具有相同序列。在另一個實施例中，第一DhFc域及第二DhFc域具有不同序列。
提供包含Dh半Fc域及GDF15區之融合蛋白。通常，GDF15區之N端直接或經由多肽連接子連接至Dh半Fc域之C端。然而，在一些實施例中，Dh半Fc域之N端直接或經由多肽連接子連接至GDF15區之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之此類融合蛋白的二聚體。在一些實施例中，二聚體為均 二聚體。在其他實施例中，二聚體為雜二聚體。
GGGDhFc-(G 4 S) 5 -DhFc-S(G 4 S) 4 -GDF15
在本發明中，名稱「GGGDhFc-(G4S)5-DhFc-S(G4S)4-GDF15」係指包含經由第一多肽連接子連接至Dh半Fc域之GDF15多肽之融合蛋白，該第一多肽連接子包含序列SEQ ID NO：30且使GDF15多肽之N端連接至半Fc域之C端。半Fc域包含經由多肽連接子連接至第二DhFc域之第一DhFc域，該多肽連接子包含序列SEQ ID NO：34且使第一DhFc域之N端連接至第二DhFc域之C端(其具有三個添加至其N端之甘胺酸殘基)。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之此類融合蛋白的均二聚體。
更特定言之，在一特定實施例中，均二聚體包含：(a)兩個包含以下序列之第二DhFc域(各單體一個)： (SEQ ID NO：33)，(b)兩個包含以下序列之第一DhFc域(各單體一個)： (SEQ ID NO：35)，(c)兩個包含以下序列之第二多肽連接子(各單體一個)：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：34)
各第二多肽連接子使第一DhFc域之N端連接至第二DhFc域之C端，(d)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(各單體一個)，及(e)兩個包含序列SEQ ID NO：30之第一多肽連接子(各單體一 個)，各多肽連接子使GDF15多肽之N端連接至第一DhFc域之C端。
在一較佳實施例中，融合蛋白包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：37)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：36)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：37之單體的均二聚體。
II.D.凸/凹
在本發明中，名稱「凸-」或「凸Fc域」係指包含「凸」突變之Fc域。在本發明中，名稱「凹-」或「凹Fc域」係指包含「凹」突變之天然Fc或Fc變異體。
「凸」可藉由用較大胺基酸側鏈替換小胺基酸側鏈產生且「凹」可藉由用較小胺基酸側鏈替換大胺基酸側鏈產生。參見例如Ridgway JBB 1996,Protein Eng.9：617-621；Merchant AM 1998,Nature Biotech.16：677-681。
在一個實施例中，藉由在Fc域之序列中引入蘇胺酸至色胺酸突變(T366W)提供「凸Fc」域。在一個實施例中，藉由在Fc域之序列中引入蘇胺酸至絲胺酸突變(T366S)、白胺酸至丙胺酸突變(L368A)及酪胺酸至纈胺酸突變(Y407V)提供「凹Fc」域。
凸Fc域、凹Fc域或兩者中可視情況缺失C端離胺酸(K447)。舉例而言，當肽在C端稠合以減少融合蛋白之蛋白質分解時，此情況可為有利的。
在一個實施例中，藉由在已移除所有或部分鉸鏈區之Fc域之序列中引入蘇胺酸至色胺酸突變(T366W)提供「Dh凸Fc」域。在一個實施例中，藉由在已移除所有或部分鉸鏈區之Fc域之序列中引入蘇胺酸至絲胺酸突變(T366S)、白胺酸至丙胺酸突變(L368A)及酪胺酸至纈胺酸突變(Y407V)提供「Dh凹Fc」域。
Dh凸Fc域、Dh凹Fc域或兩者中可視情況缺失C端離胺酸(K447)。舉例而言，當肽在C端稠合以減少融合蛋白之蛋白質分解時，此情況可為有利的。
在一些實施例中，提供包含以下之雜二聚體：(i)包含直接或經由多肽連接子連接至凹Fc域之GDF15區之第一多肽鏈及(ii)包含凸Fc域之第二多肽鏈。在其他實施例中，提供包含以下之雜二聚體：(i)包含直接或經由多肽連接子連接至凸Fc域之GDF15區之第一多肽鏈及(ii)包含凹Fc域之第二多肽鏈。
在一些實施例中，提供包含以下之雜二聚體：(i)包含直接或經由多肽連接子連接至Dh凹Fc域之GDF15區之第一多肽鏈及(ii)包含Dh凸Fc域之第二多肽鏈。在其他實施例中，提供包含以下之雜二聚體：(i)包含直接或經由多肽連接子連接至Dh凸Fc域之GDF15區之第一多肽鏈及(ii)包含Dh凹Fc域之第二多肽鏈。
在一些實施例中，提供包含兩個此類雜二聚體之四聚體，其中該等雜二聚體在其各別第一多肽鏈之GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。對於包含兩個雜二聚體之雜四聚體之實施例的圖形描述參見圖1，其中各雜二聚體包含(i)包含經由多肽連接子連接至Dh凸Fc域之GDF15多肽的第一多肽鏈及(ii)包含Dh凹Fc域之第二多肽鏈。
Dh凸Fc-(G 4 S) 4 -GDF15：Dh凹Fc
在本發明中，名稱「Dh凸Fc-(G4S)4-GDF15：Dh凹Fc」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由連接子連接至Dh凸Fc域之GDF15多肽之 第一多肽鏈，該連接子包含序列SEQ ID NO：18且使GDF15多肽之N端連接至Dh凸Fc域之C端，及(ii)包含Dh凹Fc域之多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh凸Fc-(G4S)4-GDF15：Dh凹Fc雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列之Dh凸Fc域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：16)，(b)兩個包含以下序列之Dh凹Fc域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：281)，(c)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(每個雜二聚體各一個)，及(d)兩個包含序列SEQ ID NO：18之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)，各多肽連接子經由肽鍵使GDF15多肽之N端連接至Dh凸Fc域之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：20)， 其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：19)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：17)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：21)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：20之單體及兩個具有序列SEQ ID NO：17之單體的四聚體。
II.E.帶電(del鉸鏈)
在本發明中，名稱「CpmFc(+)域」係指包含帶「正」電對突變之Fc域。在本發明中，名稱「CpmFc(-)域」係指包含帶「負」電對突變之Fc域。應注意使用術語「正」及「負」係為了易於參考(亦即描述Fc域中帶電對突變之性質)且並不指示總序列或構築體必定具有正或負電荷。
在一個實施例中，藉由在Fc域之序列中引入麩胺酸至離胺酸突變(E356K)及天冬胺酸至離胺酸突變(D399K)提供帶「正」電對突變。在一個實施例中，藉由在Fc域之序列中引入兩個離胺酸至天冬胺酸突變(K392D、K409D)來提供帶「負」電對突變。
當一起培育時，天冬胺酸殘基與離胺酸殘基經由靜電力締合，從而有助於形成CpmFc(+)域與CpmFc(-)域之間的雜二聚體，並減少或防止形成CpmFc(+)序列之間或CpmFc(-)序列之間的均二聚體。
CpmFc(+)域、CpmFc(-)域或兩者中可視情況缺失C端離胺酸(K447)。舉例而言，當肽在C端稠合以減少融合蛋白之蛋白質分解 時，此情況可為有利的。
在一個實施例中，藉由在已移除所有或部分鉸鏈區之Fc域之序列中引入麩胺酸至離胺酸突變(E356K)及天冬胺酸至離胺酸突變(D399K)提供「DhCpmFc(+)」域。在一個實施例中，藉由在已移除所有或部分鉸鏈區之Fc域之序列中引入兩個離胺酸至天冬胺酸突變(K392D、K409D)提供「DhCpmFc(-)」域。
當一起培育時，天冬胺酸殘基與離胺酸殘基經由靜電力締合，從而有助於形成DhCpmFc(+)域與DhCpmFc(-)域之間的雜二聚體，並減少或防止形成DhCpmFc(+)序列之間或DhCpmFc(-)序列之間的均二聚體。
DhCpmFc(+)、DhCpmFc(-)或兩者中可視情況缺失C端離胺酸(K447)。舉例而言，當肽在C端稠合以減少融合蛋白之蛋白質分解時，此情況可為有利的。
在一些實施例中，提供包含以下之雜二聚體：(i)包含連接至CpmFc(+)域之GDF15區之第一多肽鏈及(ii)包含CpmFc(-)域之第二多肽鏈。在一些實施例中，GDF15區之N端直接或經由多肽連接子連接至CpmFc(+)域之C端。在其他實施例中，CpmFc(+)域之N端直接或經由多肽連接子連接至GDF15區之C端。
在其他實施例中，提供包含以下之雜二聚體：(i)包含連接至CpmFc(-)域之GDF15區之第一多肽鏈及(ii)包含CpmFc(+)域之第二多肽鏈。在一些實施例中，GDF15區之N端直接或經由多肽連接子連接至CpmFc(-)域之C端。在其他實施例中，CpmFc(-)域之N端直接或經由多肽連接子連接至GDF15區之C端。
在一些實施例中，提供包含以下之雜二聚體：(i)包含連接至DhCpmFc(+)域之GDF15區之第一多肽鏈及(ii)包含DhCpmFc(-)域之第二多肽鏈。在一些實施例中，GDF15區之N端直接或經由多肽連接子 連接至DhCpmFc(+)域之C端。在其他實施例中，DhCpmFc(+)域之N端直接或經由多肽連接子連接至GDF15區之C端。
在一些實施例中，提供包含以下之雜二聚體：(i)包含連接至DhCpmFc(-)域之GDF15區之第一多肽鏈及(ii)包含DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。在一些實施例中，GDF15區之N端直接或經由多肽連接子連接至DhCpmFc(-)域之C端。在其他實施例中，DhCpmFc(-)域之N端直接或經由多肽連接子連接至GDF15區之C端。
在一些實施例中，提供包含兩個此類雜二聚體之二聚體的四聚體，其中該等雜二聚體之兩個第一多肽在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。對於包含兩個雜二聚體之四聚體之實施例的圖形描述參見圖4，其中各雜二聚體包含(i)包含經由多肽連接子連接至DhCpmFc(-)域之GDF15多肽的第一多肽鏈及(ii)包含DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。
II.E.1 DhCpmFc(+)-(1K)-GDF15：DhCpmFc(-)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(+)-(1K)-GDF15：DhCpmFc(-)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由連接子連接至DhCpmFc(+)域之GDF15多肽之第一多肽鏈，該連接子包含序列SEQ ID NO：40且使GDF15多肽之N端連接至DhCpmFc(+)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(-)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(+)-(1K)-GDF15：DhCpmFc(-)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列之DhCpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：38)，(b)兩個包含以下序列之DhCpmFc(-)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：282)，(c)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(每個雜二聚體各一個)，及(d)兩個包含以下序列之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)：GSGSATGGSGSVASSGSGSATHL(SEQ ID NO：40)
各多肽連接子經由肽鍵使GDF15多肽之N端連接至DhCpmFc(+)域之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：42)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：41)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：39)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：43)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：42之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：39之多肽鏈的四聚體。
II.E.2 DhCpmFc(-)-GDF15：DhCpmFc(+)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)-GDF15：DhCpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15多肽之第一多肽鏈，該GDF15多肽之N端直接連接至DhCpmFc(-)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)-GDF15：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下胺基酸序列之DhCpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：283)，(b)兩個包含以下胺基酸序列之DhCpmFc(-)域(每個雜二聚體各一 個)： (SEQ ID NO：48)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：50)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：49)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：47)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：51)。
如上文所論述，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：50之多肽鏈及兩個具有序列SEQ ID NO：47之多肽鏈的四聚體。
II.E.3 DhCpmFc(-)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含具有天冬醯胺至天冬胺酸突變(N3D)之天然存在之GDF15變異體(「GDF15(N3D)」)之第一多肽鏈，該天然存在之GDF15變異體之N端直接連接至DhCpmFc(-)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。N3D突變可降低去醯胺誘發之非均質性。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含： (a)兩個具有序列SEQ ID NO：283之DhCpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個具有序列SEQ ID NO：48之DhCpmFc(-)域(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個包含以下序列之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：52)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：54)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：53)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：47，其藉由核酸序列SEQ ID NO：51編碼。
如上文所論述，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：54之多肽鏈及兩個具有序列SEQ ID NO：47之多肽鏈的四聚體。
II.E.4 DhCpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含前三個胺基酸缺失之GDF15變異體(「GDF15(Ndel3)」)之第一多肽鏈，該GDF15變異體之N端直接連接至DhCpmFc(-)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。Ndel3變異體可降低N3去醯胺及後續D3異構化誘發之非均質性。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個具有序列SEQ ID NO：283之DhCpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個具有序列SEQ ID NO：48之DhCpmFc(-)域(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個具有以下序列之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一 個)： (SEQ ID NO：55)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：57)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：56)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：47，其藉由核酸序列SEQ ID NO：51編碼。
如上文所論述，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：57之多肽鏈及兩個具有序列SEQ ID NO：47之多肽鏈的四聚體。
II.E.5 DhCpmFc(-)-G 4 -GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)-G4-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由連接子連接至DhCpmFc(-)域之GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該連接子包含序列SEQ ID NO：58且使GDF15(N3D)多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)-G4-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個具有序列SEQ ID NO：283之DhCpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個具有序列SEQ ID NO：48之DhCpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)，(c)兩個具有序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)，及(d)兩個包含以下序列之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)：GGGG(SEQ ID NO：58)
各多肽連接子經由肽鍵使GDF15(N3D)多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：60)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：59)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：47，其藉由核酸序列SEQ ID NO：51編碼。
如上文所論述，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：60之多肽鏈及兩個具有序列SEQ ID NO：47之多肽鏈的四聚體。
II.E.6 DhCpmFc(-)-G 4 S-GDF15：DhCpmFc(+)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)-G4S-GDF15：DhCpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由多肽連接子連接至DhCpmFc(-)域之GDF15多肽之第一多肽鏈，該多肽連接子包含序列SEQ ID NO： 61且使GDF15多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)-G4S-GDF15：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：283之DhCpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：48之DhCpmFc(-)域(每個雜二聚體各一個)，(c)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(每個雜二聚體各一個)，及(d)兩個包含以下序列之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)：GGGGS(SEQ ID NO：61)
各多肽連接子經由肽鍵使GDF15多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽包含以下胺基酸序列(連接子帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：63)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：62)。
在一較佳實施例中，第二多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：47，其藉由核酸序列SEQ ID NO：51編碼。
如上文所論述，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：63之多肽鏈及兩個具有序列SEQ ID NO：47之多肽鏈的四聚體。
II.E.7 DhCpmFc(-)-(G 4 S) 2 -GDF15：DhCpmFc(+)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)-(G4S)2-GDF15：DhCpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由多肽連接子連接至DhCpmFc(-)域之GDF15多肽之第一多肽鏈，該多肽連接子包含序列SEQ ID NO：64且使GDF15多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)-(G4S)2-GDF15：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：283之DhCpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：48之DhCpmFc(-)域(每個雜二聚體各一個)，(c)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(每個雜二聚體各一個)，及(d)兩個包含以下序列之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：64)，各多肽連接子經由肽鍵使GDF15多肽之N端連接至DhCpmFc(-)序列之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(連接子帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：66)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：65)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：47，其藉由核酸序列SEQ ID NO：51編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：66之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：47之多肽鏈的四聚體。
II.E.8 DhCpmFc(-)-(G 4 S) 2 -GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)-(G4S)2-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由連接子連接至DhCpmFc(-)域之GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該連接子包含序列SEQ ID NO：64且使GDF15(N3D)多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)-(G4S)2-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：283之DhCpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：48之DhCpmFc(-)域(每個雜二聚體各一個)，(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)，及(d)兩個包含序列SEQ ID NO：64之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)，各多肽連接子經由肽鍵使GDF15(N3D)多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：68)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：67)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：47，其藉由核酸序列SEQ ID NO：51編碼。
如上文所論述，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：68之多肽鏈及兩個具有序列SEQ ID NO：47之多肽鏈的四聚體。
II.E.9 DhCpmFc(-)-G 4 P-GDF15：DhCpmFc(+)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)-(G4P)-GDF15：DhCpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由連接子連接至DhCpmFc(-)域之GDF15多肽之第一多肽鏈，該連接子包含序列SEQ ID NO：69且使GDF15多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)-(G4P)-GDF15：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：283之DhCpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：48之DhCpmFc(-)域(每個雜二聚體 各一個)，(c)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(每個雜二聚體各一個)，及(d)兩個包含以下序列之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)：GGGGP(SEQ ID NO：69)，各多肽連接子經由肽鍵使GDF15多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：71)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：70)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：47，其藉由核酸序列SEQ ID NO：51編碼。
如上文所論述，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：71之多肽鏈及兩個具有序列SEQ ID NO：47之多肽鏈的四聚體。
II.E.10 DhCpmFc(-)-(G 4 P) 2 -GDF15：DhCpmFc(+)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)-(G4P)2-GDF15：DhCpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由連接子連接至DhCpmFc(-)域之GDF15多肽之第一多肽鏈，該連接子包含序列SEQ ID NO：72且使GDF15多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)-(G4P)2-GDF15：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：283之DhCpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：48之DhCpmFc(-)域(每個雜二聚體各一個)，(c)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(每個雜二聚體各一個)，及(d)兩個包含以下序列之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)：GGGGPGGGGP(SEQ ID NO：72)，各多肽連接子經由肽鍵使GDF15多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域 之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：74)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：73)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：47，其藉由核酸序列SEQ ID NO：51編碼。
如上文所論述，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：74之多肽鏈及兩個具有序列SEQ ID NO：47之多肽鏈的四聚體。
II.E.11 DhCpmFc(-)-G 4 Q-GDF15：DhCpmFc(+)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)-G4Q-GDF15：DhCpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由連接子連接至DhCpmFc(-)域之GDF15多肽之第一多肽鏈，該連接子包含序列SEQ ID NO：75且使GDF15多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)-G4Q-GDF15：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：283之DhCpmFc(+)鏈(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：48之DhCpmFc(-)鏈(每個雜二聚體各一個)，(c)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(每個雜二聚體各一個)，及(d)兩個包含以下序列之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)：GGGGQ(SEQ ID NO：75)
各多肽連接子經由肽鍵使GDF15多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：77)， 其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：76)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：47，其藉由核酸序列SEQ ID NO：51編碼。
如上文所論述，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：77之多肽鏈及兩個具有序列SEQ ID NO：47之多肽鏈的四聚體。
II.E.12 DhCpmFc(-)-(G 4 Q) 2 -GDF15：DhCpmFc(+)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)-(G4Q)2-GDF15：DhCpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由連接子連接至DhCpmFc(-)域之GDF15多肽之第一多肽鏈，該連接子包含序列SEQ ID NO：78且使GDF15多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)-(G4Q)2-GDF15：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之 兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：283之DhCpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：48之DhCpmFc(-)域(每個雜二聚體各一個)，(c)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(每個雜二聚體各一個)，及(d)兩個包含以下序列之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)：GGGGQGGGGQ(SEQ ID NO：78)
各多肽連接子經由肽鍵使GDF15多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：80)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：79)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：47，其藉由核酸序列SEQ ID NO：51編碼。
如上文所論述，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：80之多肽鏈及兩個具有序列SEQ ID NO：47之多肽鏈的四聚體。
II.E.13 DhCpmFc(-)-(G 4 Q) 2 -GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)-(G4Q)2-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由連接子連接至DhCpmFc(-)域之GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該連接子包含序列SEQ ID NO：78且使GDF15(N3D)多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端及(ii)包含DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)-(G4Q)2-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：283之DhCpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：48之DhCpmFc(-)域(每個雜二聚體各一個)，(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)，及 (d)兩個包含序列SEQ ID NO：78之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)，各多肽連接子經由肽鍵使GDF15(N3D)多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：82)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：81)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：47，其藉由核酸序列SEQ ID NO：51編碼。
如上文所論述，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：82之多肽鏈 及兩個具有序列SEQ ID NO：47之多肽鏈的四聚體。
II.E.14 DhCpmFc(-)-(G 4 Q) 2 -GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)-(G4Q)2-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由連接子連接至DhCpmFc(-)域之GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該連接子包含序列SEQ ID NO：78且使GDF15(Ndel3)多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)-(G4Q)2-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：283之DhCpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：48之DhCpmFc(-)域(每個雜二聚體各一個)，(c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)，及(d)兩個包含序列SEQ ID NO：78之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)，各多肽連接子經由肽鍵使GDF15(Ndel3)多肽之N端連接至DhCpmFc(-)域之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：84)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：83)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：47，其藉由核酸序列SEQ ID NO：51編碼。
如上文所論述，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：84之多肽鏈及兩個具有序列SEQ ID NO：47之多肽鏈的四聚體。
II.F.帶電對(del鉸鏈)半胱胺酸夾
可將「半胱胺酸夾」突變引入Fc域中，諸如(+)域、CpmFc(-)域、DhCpmFc(+)域或DhCpmFc(-)域。「半胱胺酸夾」突變通常包括經由突變將半胱胺酸引入Fc域之CH3域之特定位置，使得當與另一Fc域培育時，亦經由突變將半胱胺酸引入CH3域之特定位置，二硫鍵(半胱胺酸夾)可形成於兩個Fc域之間(例如具有「半胱胺酸夾」突變之CpmFc(+)域與具有「半胱胺酸夾」突變之CpmFc(-)域之間或具有「半 胱胺酸夾」突變之DhCpmFc(+)域與具有「半胱胺酸夾」突變之DhCpmFc(-)之間)。Fc域可含有一或多個此類半胱胺酸夾突變。
在一個實施例中，藉由將絲胺酸至半胱胺酸突變(S354C)引入Fc域中及將酪胺酸至半胱胺酸突變(Y349C)引入第二Fc域中提供半胱胺酸夾。
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(S354C)」係指包含絲胺酸至半胱胺酸突變(S354C)之DhCpmFc(-)域。在本發明中，名稱「DhCpmFc(+)(S354C)」係指包含絲胺酸至半胱胺酸突變(S354C)之DhCpmFc(+)域。在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(Y349C)」係指包含絲胺酸至半胱胺酸突變(Y349C)之DhCpmFc(-)域。在本發明中，名稱「DhCpmFc(+)(Y349C)」係指包含絲胺酸至半胱胺酸突變(Y349C)之DhCpmFc(+)域。
在本發明中，名稱「CpmFc(-)(S354C)」係指包含絲胺酸至半胱胺酸突變(S354C)之CpmFc(-)域。在本發明中，名稱「CpmFc(+)(S354C)」係指包含絲胺酸至半胱胺酸突變(S354C)之CpmFc(+)域。在本發明中，名稱「CpmFc(-)(Y349C)」係指包含絲胺酸至半胱胺酸突變(Y349C)之CpmFc(-)域。在本發明中，名稱「CpmFc(+)(Y349C)」係指包含絲胺酸至半胱胺酸突變(Y349C)之CpmFc(+)域。
在另一個實施例中，藉由將白胺酸至半胱胺酸突變(L351C)引入第一與Fc域中提供半胱胺酸夾。
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(L351C)」係指包含絲胺酸至半胱胺酸突變(L351C)之DhCpmFc(-)域。在本發明中，名稱「DhCpmFc(+)(L351C)」係指包含絲胺酸至半胱胺酸突變(L351C)之DhCpmFc(+)域。
在本發明中，名稱「CpmFc(-)(L351C)」係指包含絲胺酸至半胱 胺酸突變(L351C)之CpmFc(-)域。在本發明中，名稱「CpmFc(+)(L351C)」係指包含絲胺酸至半胱胺酸突變(L351C)之CpmFc(+)域。
CpmFc(+)域、CpmFc(-)域或兩者中可視情況缺失C端離胺酸(K447)。此情況可能有利於例如：當肽在C端稠合時，以減少融合蛋白之蛋白質分解。
在一些實施例中，提供包含以下之雜二聚體：(i)包含連接至含有半胱胺酸夾突變之CpmFc(+)域之GDF15區之第一多肽鏈，及(ii)包含含有半胱胺酸夾突變之CpmFc(-)域之第二多肽鏈。在一些實施例中，GDF15區之N端直接或經由多肽連接子連接至包含半胱胺酸夾突變之CpmFc(+)域之C端。在其他實施例中，包含半胱胺酸夾突變之CpmFc(+)域之N端直接或經由多肽連接子連接至GDF15區之C端。
在一些實施例中，提供包含以下之雜二聚體：(i)包含連接至包含半胱胺酸夾突變之CpmFc(-)域之GDF15區之第一多肽鏈，及(ii)包含有包含半胱胺酸夾突變之CpmFc(+)域之第二多肽鏈。在一些實施例中，GDF15區之N端直接或經由多肽連接子連接至包含半胱胺酸夾突變之CpmFc(-)域之C端。在其他實施例中，包含半胱胺酸夾突變之CpmFc(-)域之N端直接或經由多肽連接子連接至GDF15區之C端。
在一些實施例中，提供包含以下之雜二聚體：(i)包含連接至包含半胱胺酸夾突變之DhCpmFc(+)域之GDF15區之第一多肽鏈，及(ii)包含有包含半胱胺酸夾突變之DhCpmFc(-)域之第二多肽鏈。在一些實施例中，GDF15區之N端直接或經由多肽連接子連接至包含半胱胺酸夾突變之DhCpmFc(+)域之C端。在其他實施例中，包含半胱胺酸夾突變之DhCpmFc(+)域之N端直接或經由多肽連接子連接至GDF15區之C端。
在一些實施例中，提供包含以下之雜二聚體：(i)包含連接至包 含半胱胺酸夾突變之DhCpmFc(-)域之GDF15區之第一多肽鏈，及(ii)包含有包含半胱胺酸夾突變之DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。在一些實施例中，GDF15區之N端直接或經由多肽連接子連接至包含半胱胺酸夾突變之DhCpmFc(-)域之C端。在其他實施例中，包含半胱胺酸夾突變之DhCpmFc(-)域之N端直接或經由多肽連接子連接至GDF15區之C端。
在一些實施例中，提供包含兩個此類雜二聚體之二聚體的四聚體，其中該等雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。對於包含兩個雜二聚體之四聚體之實施例的圖形描述參見圖5，其中各雜二聚體包含(i)包含經由多肽連接子連接至DhCpmFc(+)(L351C)域之GDF15多肽的第一多肽鏈及(ii)包含DhCpmFc(-)(L351C)域之第二多肽鏈。
II.F.1 DhCpmFc(+)(S354C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(-)(Y349C)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(+)(S354C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(-)(Y349C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)多肽之N端直接連接至DhCpmFc(+)(S354C)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(-)(Y349C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C354與第二多肽鏈之C349之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(+)(S354C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(-)(Y349C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列之DhCpmFc(+)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：85)，(b)兩個包含以下序列之DhCpmFc(-)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：284)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：88)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：87)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：86)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：89)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：88之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：86之多肽鏈的四聚體。
II.F.2 DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15：DhCpmFc(+)(S354C)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15：DhCpmFc(+)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15多肽之第一多肽鏈，該GDF15多肽之N端直接連接至DhCpmFc(-)(Y349C)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(S345C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C349與第二多肽鏈之C354之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15：DhCpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列之DhCpmFc(+)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：285)，(b)兩個包含以下序列之DhCpmFc(-)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：91)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(每個雜二聚體各一 個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：93)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：92)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下序列： (SEQ ID NO：90)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：94)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：93之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：90之多肽鏈的四聚體。
II.F.3 DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)多肽之N端直接連接至DhCpmFc(-)(Y349C)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(S345C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽之C349與第二多肽之C354之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。可引入GDF15序列中之N3D突變例如消除由N去醯胺化所產生之非均質性。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：285之DhCpmFc(+)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)， (b)兩個包含序列SEQ ID NO：91之DhCpmFc(-)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：96)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：95)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：90，其藉由核酸序列SEQ ID NO：94編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：96之多肽鏈 及兩個包含序列SEQ ID NO：90之多肽鏈的四聚體。
II.F.4 DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(S354C)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連接至DhCpmFc(-)(Y349C)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(S345C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C349與第二多肽鏈之C354之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。可引入GDF15序列中N端3個胺基酸缺失(Ndel3)例如以消除由天冬醯胺之去醯胺或天冬胺酸之異構化所產生之非均質性。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：285之DhCpmFc(+)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：91之DhCpmFc(-)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：98)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：97)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：90，其藉由核酸序列SEQ ID NO：94編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：98之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：90之多肽鏈的四聚體。
II.F.5 DhCpmFc(-)(Y349C)-G 4 -GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(Y349C)-G4-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由連接子連接至DhCpmFc(-)(Y349C)域之GDF15(N3D)多肽之第 一多肽鏈，該連接子包含序列SEQ ID NO：58且使GDF15(N3D)多肽之N端連接至DhCpmFc(-)(Y349C)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(S345C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C349與第二多肽鏈之C354之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(Y349C)-G4-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：285之DhCpmFc(+)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：91之DhCpmFc(-)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)，(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)，及(d)兩個包含序列SEQ ID NO：58之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)，各多肽連接子經由肽鍵使GDF15(N3D)多肽之N端連接至DhCpmFc(-)(Y349C)域之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：100)， 其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：99)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：90，其藉由核酸序列SEQ ID NO：94編碼。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：100之單體及兩個具有序列SEQ ID NO：90之單體的四聚體。
II.F.6 DhCpmFc(-)(Y349C)-(G 4 S) 2 -GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(Y349C)-(G4S)2-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由連接子連接至DhCpmFc(-)(Y349C)域之GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該連接子包含序列SEQ ID NO：64且使GDF15(N3D)多肽之N端連接至DhCpmFc(-)(Y349C)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(S345C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C349與第二多肽鏈之C354之間經由鏈間二硫 鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(Y349C)-(G4S)2-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：285之DhCpmFc(+)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：91之DhCpmFc(-)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)，(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)，及(d)兩個包含序列SEQ ID NO：64之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)，各多肽連接子經由肽鍵使GDF15(N3D)多肽之N端連接至DhCpmFc(-)(Y349C)域之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：102)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：101)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：90，其藉由核酸序列SEQ ID NO：94編碼。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：102之單體及兩個具有序列SEQ ID NO：90之單體的四聚體。
II.F.7 DhCpmFc(-)(Y349C)-(G 4 Q) 2 -GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(Y349C)-(G4Q)2-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由連接子連接至DhCpmFc(-)(Y349C)域之GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該連接子包含序列SEQ ID NO：78且使GDF15(N3D)多肽之N端連接至DhCpmFc(-)(Y349C)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(S345C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C349與第二多肽鏈之C354之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(Y349C)-(G4Q)2-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：285之DhCpmFc(+)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：91之DhCpmFc(-)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)，(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)，及(d)兩個包含序列SEQ ID NO：78之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)，各多肽連接子經由肽鍵使GDF15(N3D)多肽之N端連接至DhCpmFc(-)(Y349C)域之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：104)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：103)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：90，其藉由核酸序列SEQ ID NO：94編碼。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：104之單體及兩個具有序列SEQ ID NO：90之單體的四聚體。
II.F.8. DhCpmFc(-)(L351C)-(G 4 S) 2 -GDF15：DhCpmFc(+)(L351C)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(L351C)-(G4S)2-GDF15：DhCpmFc(+)(L351C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由連接子連接至DhCpmFc(-)(L351C)域之GDF15多肽之第一多肽鏈，該連接子包含序列SEQ ID NO：64且使GDF15多肽之N端連接至DhCpmFc(-)(L351C)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(L351C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C351與第二多肽鏈之C351之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(L351C)-(G4S)2-GDF15：DhCpmFc(+)(L351C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含： (a)兩個包含以下序列之DhCpmFc(+)(L351C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：286)，(b)兩個包含以下序列之DhCpmFc(-)(L351C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：106)，(c)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽鏈(每個雜二聚體各一個)，及(d)兩個包含序列SEQ ID NO：64之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)，各多肽連接子經由肽鍵使GDF15多肽之N端連接至DhCpmFc(-)(L351C)域之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(連接子序列帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：108)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：107)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：105)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：109)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：108之單體及兩個具有序列SEQ ID NO：105之單體的四聚體。
II.G. HSA
在本發明中，名稱「HSA」或「人類血清白蛋白」係指包含直接或經由多肽連接子連接至人類血清白蛋白(HSA)多肽之GDF15區之融合蛋白。在一個實施例中，融合蛋白包含兩個或兩個以上HSA多肽。
通常，GDF15區之N端直接或經由多肽連接子連接至HSA多肽之C端。然而，在一些實施例中，HSA多肽之N端直接或經由多肽連接子連接至GDF15區之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之此類融合蛋白的均二聚體。對於此類均二聚體之實施例之圖形描述參見圖6。或者，提供包含在融合蛋白之GDF15區與GDF15多肽或突變體多肽之間經由鏈間二硫鍵連接之一個此類融合蛋白及GDF15多肽或GDF突變體多肽之雜二聚體。
II.G.1 HSA-(G 4 S) 4 -GDF15：GDF15雜二聚體
在本發明中，名稱「HSA-(G4S)4-GDF15：GDF15」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由連接子連接至HSA多肽之GDF15多肽之第一多肽鏈，該連接子包含序列SEQ ID NO：18且使GDF15多肽之N端連接至HSA多肽之C端，及(ii)包含GDF15多肽之第二多肽鏈。
通常，第一及第二多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，雜二聚體包含：(a)一個包含以下序列之HSA多肽(第一單體)： (SEQ ID NO：110)，及(b)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(各單體一個)，及(c)一個包含序列SEQ ID NO：18之多肽連接子(第一單體)，該多肽連接子經由肽鍵使GDF15多肽之N端連接至HSA多肽之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽包含以下胺基酸序列(連接子帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：112)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：111)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：12，其藉由核酸序列SEQ ID NO：11編碼。
如上文所論述，提供包含具有序列SEQ ID NO：112之第一多肽鏈及具有序列SEQ ID NO：12之第二多肽鏈的雜二聚體。
II.G.2 HSA-(G 4 S) 4 -GDF15
在本發明中，名稱「HSA-(G4S)4-GDF15」係指包含經由連接子連接至HSA多肽之GDF15多肽之融合蛋白，該連接子包含序列SEQ ID NO：18且使GDF15多肽之N端連接至HSA多肽之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之HSA-(G4S)4-GDF15融合蛋白的均二聚體。
更特定言之，在一特定實施例中，均二聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：110之HSA多肽(各單體一個)；(b)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(各單體一個)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：18之多肽連接子(各單體一個)，各多肽連接子使GDF15多肽之N端經由肽鍵連接至HSA多肽之C端。
在一較佳實施例中，融合蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO：112，其藉由核酸序列SEQ ID NO：111編碼。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：112之融合蛋白之均二聚體。
II.G.3 HSA-GSPAPAPGS-GDF15
在本發明中，名稱「HSA-(GSPAPAPGS)-GDF15」係指包含經由 連接子連接至HSA多肽之GDF15多肽之融合蛋白，該連接子包含序列SEQ ID NO：113且使GDF15多肽之N端連接至HSA多肽之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之HSA-(GSPAPAPGS)-GDF15融合蛋白的均二聚體。
更特定言之，在一特定實施例中，均二聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：110之HSA多肽(各單體一個)；(b)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(各單體一個)；及(c)兩個包含以下序列之多肽連接子(各單體一個)：GSPAPAPGS(SEQ ID NO：113)
各多肽連接子經由肽鍵使GDF-15多肽之N端連接至HSA多肽之C端。
在一較佳實施例中，融合蛋白包含以下胺基酸序列(連接子帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：115)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：114)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：115之融合蛋白之均二聚體。
II.G.4 HSA-GS(PAPAP) 2 GS-GDF15
在本發明中，名稱「HSA-GS(PAPAP)2GS-GDF15」係指包含經由連接子連接至HSA多肽之GDF15多肽之融合蛋白，該連接子包含序列SEQ ID NO：116且使GDF15多肽之N端連接至HSA多肽之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之HSA-GS(PAPAP)2GS-GDF15融合蛋白的均二聚體。
更特定言之，在一特定實施例中，均二聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：110之HSA多肽(各單體一個)；(b)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(各單體一個)；及(c)兩個包含以下序列之多肽連接子(各單體一個)：GSPAPAPPAPAPGS(SEQ ID NO：116)
各多肽連接子經由肽鍵使GDF-15多肽之N端連接至HSA多肽之C端。
在一較佳實施例中，融合蛋白包含以下胺基酸序列(連接子帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：118)， 其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：117)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：118之融合蛋白之均二聚體。
II.G.5 HSA-GSAAQAAQQGS-GDF15
在本發明中，名稱「HSA-GSAAQAAQQGS-GDF15」係指包含經由連接子連接至HSA多肽之GDF15多肽之融合蛋白，該連接子包含序列SEQ ID NO：119且使GDF15多肽之N端連接至HSA多肽之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之HSA-GSAAQAAQQGS-GDF15融合蛋白的均二聚體。
更特定言之，在一特定實施例中，均二聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：110之HSA多肽(各單體一個)；(b)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(各單體一個)；及(c)兩個包含以下序列之多肽連接子(各單體一個)：GSAAQAAQQGS(SEQ ID NO：119)
各多肽連接子經由肽鍵使GDF15多肽之N端連接至HSA多肽之C端。
在一較佳實施例中，融合蛋白包含以下胺基酸序列(連接子帶雙 下劃線)： (SEQ ID NO：121)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：120)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：121之融合蛋白之均二聚體。
II.G.6 HSA-GS(AAQAAQQ) 2 GS-GDF15
在本發明中，名稱「HSA-GS(AAQAAQQ)2GS-GDF15」係指包含經由連接子連接至HSA多肽之GDF15多肽之融合蛋白，該連接子包含序列SEQ ID NO：122且使GDF15多肽之N端連接至HSA多肽之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之HSA-GS(AAQAAQQ)2GS-GDF15融合蛋白的均二聚體。
更特定言之，在一特定實施例中，均二聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：110之HSA多肽(各單體一個)；(b)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(各單體一個)；及 (c)兩個包含以下序列之多肽連接子(各單體一個)：GSAAQAAQQAAQAAQQGS(SEQ ID NO：122)
各多肽連接子經由肽鍵使GDF-15多肽之N端連接至HSA多肽之C端。
在一較佳實施例中，融合蛋白包含以下胺基酸序列(連接子帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：124)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：123)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：124之融合蛋白之均二聚體。
II.G.7 HSA-GGNAEAAAKEAAAKEAAAKAGG-GDF15
在本發明中，名稱「HSA-GGNAEAAAKEAAAKEAAAKAGG- GDF15」係指包含經由連接子連接至HSA多肽之GDF15多肽之融合蛋白，該連接子包含序列SEQ ID NO：125且使GDF15多肽之N端連接至HSA多肽之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之HSA-GGNAEAAAKEAAAKEAAAKAGG-GDF15融合蛋白的均二聚體。
更特定言之，在一特定實施例中，均二聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：110之HSA多肽(各單體一個)；(b)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(各單體一個)；及(c)兩個包含以下序列之多肽連接子(各單體一個)：GGNAEAAAKEAAAKEAAAKAGG(SEQ ID NO：125)
各多肽連接子經由肽鍵使GDF-15多肽之N端連接至HSA多肽之C端。
在一較佳實施例中，融合蛋白包含以下胺基酸序列(連接子帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：127)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：126)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：127之融合蛋白之均二聚體。
II.G.8 HSA-(G 4 S) 6 -GDF15
在本發明中，名稱「HSA-(G4S)6-GDF15」係指包含經由連接子連接至HSA多肽之GDF15多肽之融合蛋白，該連接子包含序列SEQ ID NO：128且使GDF15多肽之N端連接至HSA多肽之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之HSA-(G4S)6-GDF15融合蛋白的均二聚體。
更特定言之，在一特定實施例中，均二聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：110之HSA多肽(各單體一個)；(b)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(各單體一個)；及(c)兩個包含以下序列之多肽連接子(各單體一個)：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：128)
各多肽連接子經由肽鍵使GDF-15多肽之N端連接至HSA多肽之C端。
在一較佳實施例中，融合蛋白包含以下胺基酸序列(連接子帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：130)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：129)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：130之融合蛋白之均二聚體。
II.G.9 HSA-GS(AAQAAQQ) 2 GS-GDF15(N3D)
在本發明中，名稱「HSA-GS(AAQAAQQ)2GS-GDF15(N3D)」係指包含經由連接子連接至HSA多肽之GDF15(N3D)多肽之融合蛋白，該連接子包含序列SEQ ID NO：122且使GDF15(N3D)多肽之N端連接至HSA多肽之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接之HSA-GS(AAQAAQQ)2GS-GDF15(N3D)融合蛋白的均二聚體。
更特定言之，在一特定實施例中，均二聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：110之HSA多肽(各單體一個)； (b)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(各單體一個)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：122之多肽連接子(各單體一個)，各多肽連接子經由肽鍵使GDF15(N3D)多肽之N端連接至HSA多肽之C端。
在一較佳實施例中，融合蛋白包含以下胺基酸序列(連接子帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：242)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：241)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含兩個具有序列SEQ ID NO：242之融合蛋白之均二聚體。
II.H. 具有解決對FcγR結合之親和力的突變之構築體
發現某些帶電對(del鉸鏈)多聚體展示Fcγ受體(FcγR)結合，尤其與FcγRI及FcγRIII結合。參見例如實例7。在一些情況下，FcγR結合親和力與包含鉸鏈區之多聚體中所觀測類似。此情況出人意料，因為 Fcγ受體會與鉸鏈區相互作用且此等多聚體為del鉸鏈，如上文所描述，從而缺乏所有或部分鉸鏈區。與結合至FcγR有關之Fc殘基之突變分析表明主要相互作用位點位於鉸鏈區及CH2域中(Tamm A,1997,Int.Rev.Immunol.16：57-85)。亦參見Radaev S等人，J.Biol.Chem.276：16469-16477；Sondermann,P等人，2000,Nature 406：267-273。
抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，一種主要藉由人類中之自然殺手(NK)細胞介導之免疫反應，取決於FcγR，尤其人類中之FcγRIIIA與抗體之Fc域或含Fc蛋白質之相互作用。在ADCC中，Fc結合至NK細胞表面上之FcγRIII使NK細胞活化，由此釋放穿孔蛋白及顆粒酶。
因此，提供具有其他修飾之構築體以調節構築體與FcγR之相互作用。在一系列實施例中，將天冬醯胺至甘胺酸突變(N297G)引入天然Fc或Fc變異體，包括各種上述Fc域中。N297G突變會移出CH2域中之保守N-糖基化位點。
在另一系列實施例中，已移除所有或部分鉸鏈區之Fc域會缺失其他N端胺基酸殘基。舉例而言，以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：303)
藉由缺失野生型IgG1之Fc域的N端至G236胺基酸殘基來提供。在一些實施例中，此Fc變異體可視情況缺失C端離胺酸(K447)。以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：304)
藉由缺失野生型IgG1之Fc域的N端至G237胺基酸殘基來提供。在一些實施例中，此Fc變異體可視情況缺失C端離胺酸(K447)。以下胺 基酸序列： (SEQ ID NO：305)
藉由缺失野生型IgG1之Fc域的N端至P238胺基酸殘基來提供。在一些實施例中，此Fc變異體可視情況缺失C端離胺酸(K447)。
在一個實施例中，提供引入天冬醯胺至甘胺酸突變(N297G)之DhCpmFc(-)域(在本文中稱為「DhCpmFc(-)(N297G)」域)。在另一個實施例中，提供引入天冬醯胺至甘胺酸突變(N297G)之DhCpmFc(+)域(在本文中稱為「DhCpmFc(+)(N297G)」域)。
在另一個實施例中，提供引入天冬醯胺至甘胺酸突變(N297G)之DhCpmFc(-)(Y349C)域(本文中稱為「DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)」域)。在一個實施例中，提供引入天冬醯胺至甘胺酸突變(N297G)之DhCpmFc(+)(S354C)域(本文中稱為「DhCpmFc(+)(N297G)(S354C)」域)。
在另一個實施例中，提供引入天冬醯胺至甘胺酸突變(N297G)之DhCpmFc(+)(Y349C)域(在本文中稱為「DhCpmFc(+)(N297G)(Y349C)」域)。在另一個實施例中，提供引入天冬醯胺至甘胺酸突變(N297G)之DhCpmFc(-)(S354C)域(在本文中稱為「DhCpmFc(-)(N297G)(S354C)」域)。
在另一個實施例中，提供引入天冬醯胺至甘胺酸突變(N297G)之DhCpmFc(+)(L351C)域(在本文中稱為「DhCpmFc(+)(N297G)(L351C)」域)。在另一個實施例中，提供引入天冬醯胺至甘胺酸突變(N297G)之DhCpmFc(-)(L351C)域(在本文中稱為「DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)」域)。
在另一個實施例中，提供引入丙胺酸至半胱胺酸突變(A287C)之 DhCpmFc(-)域(本文中稱為「DhCpmFc(-)(A287C)」域)。在另一個實施例中，提供引入丙胺酸至半胱胺酸突變(A287C)之DhCpmFc(+)域(本文中稱為「DhCpmFc(+)(A287C)」域)。
在另一個實施例中，提供引入白胺酸至半胱胺酸突變(L306C)之DhCpmFc(-)域(本文中稱為「DhCpmFc(-)(L306C)」域)。在另一個實施例中，提供引入白胺酸至半胱胺酸突變(L306C)之DhCpmFc(+)域(本文中稱為「DhCpmFc(+)(L306C)」域)。
在另一個實施例中，提供已引入酪胺酸至半胱胺酸突變(Y349C)之DhCpmFc(-)(A287C)域(在本文中稱為「DhCpmFc(-)(A287C)(Y349C)」域)。在另一個實施例中，提供已引入酪胺酸至半胱胺酸突變(Y349C)之DhCpmFc(+)(A287C)域(在本文中稱為「DhCpmFc(+)(A287C)(Y349C)」域)。
在另一個實施例中，提供已引入絲胺酸至半胱胺酸突變(S354C)之DhCpmFc(-)(A287C)域(在本文中稱為「DhCpmFc(-)(A287C)(S354C)」域)。在另一個實施例中，提供已引入絲胺酸至半胱胺酸突變(S354C)之DhCpmFc(+)(A287C)域(在本文中稱為「DhCpmFc(+)(A287C)(S354C)」域)。
在另一個實施例中，提供已引入酪胺酸至半胱胺酸突變(Y349C)之DhCpmFc(-)(L306C)域(在本文中稱為「DhCpmFc(-)(L306C)(Y349C)」域)。在另一個實施例中，提供已引入酪胺酸至半胱胺酸突變(Y349C)之DhCpmFc(+)(L306C)域(在本文中稱為「DhCpmFc(+)(L306C)(Y349C)」域)。
在另一個實施例中，提供已引入絲胺酸至半胱胺酸突變(S354C)之DhCpmFc(-)(L306C)域(在本文中稱為「DhCpmFc(-)(L306C)(S354C)」域)。在另一個實施例中，提供已引入絲胺酸至半胱胺酸突變(S354C)之DhCpmFc(+)(L306C)域(在本文中稱為 「DhCpmFc(+)(A287C)(L306C)」域)。
在另一個實施例中，提供已移除N端7個胺基酸之DhCpmFc(-)域(在本文中稱為「Dh2CpmFc(-)」域)。在另一個實施例中，提供已移除N端7個胺基酸之DhCpmFc(+)域(在本文中稱為「Dh2CpmFc(+)」域)。
在另一個實施例中，提供已移除N端7個胺基酸之DhCpmFc(-)(Y349C)域(在本文中稱為「Dh2CpmFc(-)(Y349C)」域)。在另一個實施例中，提供已移除N端7個胺基酸之DhCpmFc(+)(S354C)域(在本文中稱為「Dh2CpmFc(+)(S354C)」域)。
在另一個實施例中，提供已移除N端7個胺基酸之DhCpmFc(+)(Y349C)域(在本文中稱為「Dh2CpmFc(+)(Y349C)」域)。在另一個實施例中，提供已移除N端7個胺基酸之DhCpmFc(-)(S354C)域(在本文中稱為「Dh2CpmFc(-)(S354C)」域)。
在另一個實施例中，提供引入天冬醯胺至甘胺酸突變(N297G)之CpmFc(+)域(在本文中稱為「CpmFc(+)(N297G)」域)。在另一個實施例中，提供引入天冬醯胺至甘胺酸突變(N297G)之CpmFc(-)域(在本文中稱為「CpmFc(-)(N297G)」域)。
在另一個實施例中，提供引入天冬醯胺至甘胺酸突變(N297G)之Dh2CpmFc(+)域(在本文中稱為「Dh2CpmFc(+)(N297G)」域)。在另一個實施例中，提供引入天冬醯胺至甘胺酸突變(N297G)之Dh2CpmFc(-)域(在本文中稱為「Dh2CpmFc(-)(N297G)」域)。
在另一個實施例中，提供引入丙胺酸至半胱胺酸突變(A287C)之Dh2CpmFc(-)(N297G)域(本文中稱為「Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)」域)。在另一個實施例中，提供引入白胺酸至半胱胺酸突變(L306C)之Dh2CpmFc(+)(N297G)域(本文中稱為「Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)」域)。
在另一個實施例中，提供已引入酪胺酸至半胱胺酸突變(Y349C)之Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)域(在本文中稱為「Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)」域)。在另一個實施例中，提供已引入絲胺酸至半胱胺酸突變(S354C)之Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)域(在本文中稱為「Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)」域)。
在另一個實施例中，提供已將兩個甘胺酸添加至N端上之Dh2CpmFc(-)域(在本文中稱為「GG-Dh2CpmFc(-)(N297G)」域)。在另一個實施例中，提供已將兩個甘胺酸添加至N端上之Dh2CpmFc(+)域(在本文中稱為「GG-Dh2CpmFc(+)(N297G)」域)。
在另一個實施例中，提供已引入酪胺酸至半胱胺酸突變(Y349C)之GG-Dh2CpmFc(-)域(在本文中稱為「GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)」域)。在另一個實施例中，提供已引入絲胺酸至半胱胺酸突變(S354C)之GG-Dh2CpmFc(+)域(在本文中稱為「GG-Dh2CpmFc(+)(S354C)」域)。
在另一個實施例中，提供已引入酪胺酸至半胱胺酸突變(Y349C)之GG-Dh2CpmFc(+)域(在本文中稱為「GG-Dh2CpmFc(+)(Y349C)」域)。在另一個實施例中，提供已引入絲胺酸至半胱胺酸突變(S354C)之GG-Dh2CpmFc(-)域(在本文中稱為「GG-Dh2CpmFc(-)(S354C)」域)。
在另一個實施例中，提供已將甘胺酸添加至N端上之Dh2CpmFc(-)域(在本文中稱為「Dh3CpmFc(-)(N297G)」域)。在另一個實施例中，提供已將甘胺酸添加至N端上之Dh2CpmFc(+)域(在本文中稱為「Dh3CpmFc(+)」域)。
在另一個實施例中，提供已引入酪胺酸至半胱胺酸突變(Y349C)之Dh3CpmFc(-)域(在本文中稱為「Dh3CpmFc(-)(Y349C)」域)。在另一個實施例中，提供已引入絲胺酸至半胱胺酸突變(S354C)之 Dh3CpmFc(+)域(在本文中稱為「Dh3CpmFc(+)(S354C)」域)。
在另一個實施例中，將天冬醯胺至甘胺酸突變(N297G)引入Dh單Fc域中(在本文中稱為「Dh單Fc(N297G)」)。
II.H.1 DhCpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連接至DhCpmFc(-)(N297G)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(N297G)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(N297G)-GDF15(Nde13)：DhCpmFc(+)(N297G)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列之DhCpmFc(+)(N297G)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：287)，(b)兩個包含以下序列之DhCpmFc(-)(N297G)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：132)，及 (c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：134)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：133)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：131)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：135)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：134之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：131之多肽鏈的四聚體。
II.H.2 DhCpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)序列之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)序列之N端直接連接至DhCpmFc(-)(N297G)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(N297G)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：287之DhCpmFc(+)(N297G)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：132之DhCpmFc(-)(N297G)域(每個雜二聚體各一個)，及 (c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：137)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：136)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：131，其藉由核酸序列SEQ ID NO：135編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：137之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：131之多肽鏈的四聚體。
II.H.3 DhCpmFc(-)(N297G)-G 4 -GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(N297G)-G4-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含經由連接子連接至DhCpmFc(-)(N297G)域之GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該連接子包含序列SEQ ID NO：58且使GDF15(N3D)多肽之N端連接至DhCpmFc(-)(N297G)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(N297G)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(N297G)-G4-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：287之DhCpmFc(+)(N297G)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：132之DhCpmFc(-)(N297G)域(每個雜二聚體各一個)，(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)，及(d)兩個包含序列SEQ ID NO：58之多肽連接子(每個雜二聚體各一個)，各多肽連接子使GDF15(N3D)多肽之N端經由肽鍵連接至DhCpmFc(-)(N297G)域之C端。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：139)， 其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：138)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：131，其藉由核酸序列SEQ ID NO：135編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：139之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：131之多肽鏈的四聚體。
II.H.4 DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)- GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)(S354C)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連接至DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(N297G)(S354C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C349與第二多肽鏈之C354之間經由 鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列之DhCpmFc(+)(N297G)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：288)，(b)兩個包含以下序列之DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：141)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：143)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：142)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：140)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：144)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：143之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：140之多肽鏈的四聚體。
II.H.5 DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)- GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)(S354C)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)多肽之N端直接連接至DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(N297G)(S345C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使得第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C349與第二多肽鏈之C354之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：288之DhCpmFc(+)(N297G)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：141之DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)域，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：146)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：145)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：140，其藉由核酸序列SEQ ID NO：144編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：146之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：140之多肽鏈的四聚體。
II.H.6 DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)- GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)(L351C)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)(L351C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連 接至DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(N297G)(L351C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C351與第二多肽鏈之C351之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)(L351C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列之DhCpmFc(+)(N297G)(L351C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：289)，(b)兩個包含以下序列之DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：148)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：150)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：149)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：147)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：151)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：150之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：147之多肽鏈的四聚體。
II.H.7 DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)- GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)(L351C)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)(L351C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)多肽之N端藉由肽鍵直接連接至DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(N297G)(L351C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C351與第二多肽鏈之C351之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)(L351C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：289之DhCpmFc(+)(N297G)(L351C) 域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：148之DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)域(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：153)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：152)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：147，其藉由核酸序列SEQ ID NO：151編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：153之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：147之多肽鏈的四聚體。
II.H.8 DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)- GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連接至DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列之DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：290)，(b)兩個包含以下序列之DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：268)，及 (c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：269)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：270)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：267)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：271)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：269之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：267之多肽鏈的四聚體。
II.H.9 DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)- GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)多肽之N端直接連接至DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：290之DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：268之DhCpmFc(-)(N297G)(A287C) 域(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：272)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：273)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：267，其藉由核酸序列SEQ ID NO：271編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：272之多肽鏈 及兩個包含序列SEQ ID NO：267之多肽鏈的四聚體。
II.H.10 DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)- GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連接至DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列之DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：291)，(b)兩個包含以下序列之DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：275)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二 聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：276)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：277)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：274)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：278)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：276之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：274之多肽鏈的四聚體。
II.H.11 DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)- GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)
在本發明中，名稱「DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)多肽之N端直接連接至DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)域之C端，及(ii)包含DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個DhCpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：291之DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：275之DhCpmFc(-)(N297G)(A287C) (S354C)域(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：279)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：280)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：274，其藉由核酸序列SEQ ID NO：278編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：279之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：274之多肽鏈的四聚體。
II.H.12 Dh2CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)
在本發明中，名稱「Dh2CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連接至Dh2CpmFc(-)域之C端，及(ii)包含Dh2CpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh2CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列之Dh2CpmFc(+)域(各二聚體一個)： (SEQ ID NO：292)，(b)兩個包含以下序列之Dh2CpmFc(-)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：155)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：157)， 其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：156)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：154)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：158)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：157之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：154之多肽鏈的四聚體。
II.H.13 Dh2CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh2CpmFc(+)
在本發明中，名稱「Dh2CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh2CpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)多肽之N端藉由肽鍵直接連接至Dh2CpmFc(-)域之C端，及(ii)包含Dh2CpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh2CpmFc(-)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：292之Dh2CpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：155之Dh2CpmFc(-)域(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：160)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：159)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：154，其藉由核酸序列SEQ ID NO：158編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：160之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：154之多肽鏈的四聚體。
II.H.14 Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)(S354C)
在本發明中，名稱「Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連接至Dh2CpmFc(-)(Y349C)域之C端，及(ii)包含Dh2CpmFc(+)(S345C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C349與第二多肽鏈之C354之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫 鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列之Dh2CpmFc(+)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：293)，(b)兩個包含以下序列之Dh2CpmFc(-)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：162)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：164)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：163)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：161)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：165)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：164之多肽鏈 及兩個包含序列SEQ ID NO：161之多肽鏈的四聚體。
II.H.15 Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：Dh2CpmFc(+)(S354C)
在本發明中，名稱「Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：Dh2CpmFc(+)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)多肽之N端直接連接至Dh2CpmFc(-)(Y349C)域之C端，及(ii)包含Dh2CpmFc(+)(S345C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C349與第二多肽鏈之C354之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：Dh2CpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：293之Dh2CpmFc(+)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：162之Dh2CpmFc(-)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：167)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：166)。
在一較佳實施例中，第二單體包含胺基酸序列SEQ ID NO：161，其藉由核酸序列SEQ ID NO：165編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：167之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：161之多肽鏈的四聚體。
II.H.16 CpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3)：CpmFc(+)(N297G)
在本發明中，名稱「CpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(N297G)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連接至CpmFc(-)(N297G)域之C端，及(ii)包含CpmFc(+)(N297G)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個CpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3)：CpmFc(+)(N297G)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列(部分鉸鏈區位於圓括號中)之CpmFc(+)(N297G)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：294)，(b)兩個包含以下序列(部分鉸鏈區位於圓括號中)之CpmFc(-)(N297G)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：169)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：171)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：170)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：168)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：172)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：171之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：168之多肽鏈的四聚體。
II.H.17 CpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D)：CpmFc(+)(N297G)
在本發明中，名稱「CpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)多肽之N端直接連接至CpmFc(-)(N297G)域之C端，及(ii)包含CpmFc(+)(N297G)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個CpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D)：CpmFc(+)(N297G)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：294之CpmFc(+)(N297G)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：169之CpmFc(-)(N297G)域(每個雜二聚體各一個)，及 (c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：174)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：173)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：168，其藉由包含序列SEQ ID NO：172之核酸序列編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：174之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：168之多肽鏈的四聚體。
II.H.18 Dh2CpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)(N297G)
在本發明中，名稱「Dh2CpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)(N297G)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連接至Dh2CpmFc(-)(N297G)域之C端，及(ii)包含Dh2CpmFc(+)(N297G)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh2CpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)(N297G)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列之Dh2CpmFc(+)(N297G)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：295)，(b)兩個包含以下序列之Dh2CpmFc(-)(N297G)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：176)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：178)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：177)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：175)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：179)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：178之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：175之多肽鏈的四聚體。
II.H.19 Dh2CpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D)：Dh2CpmFc(+)(N297G)
在本發明中，名稱「Dh2CpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(N297G)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)多肽之N端直接連接至Dh2CpmFc(-)(N297G)域之C端，及(ii)包含Dh2CpmFc(+)(N297G)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh2CpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D)：Dh2CpmFc(+)(N297G)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：295之Dh2CpmFc(+)(N297G)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：176之Dh2CpmFc(-)(N297G)域(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚 體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：181)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：180)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：175，其藉由核酸序列SEQ ID NO：179編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：181之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：175之多肽鏈的四聚體。
II.H.20 Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C)- GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(S354C)
在本發明中，名稱「Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連接至Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C)多肽之C端，及(ii)包含Dh2CpmFc(+)(N297G)(S354C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C349與第二多肽鏈之C354之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列之Dh2CpmFc(+)(N297G)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：296)，(b)兩個包含以下序列之Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：183)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：185)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：184)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：182)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：186)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：185之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：182之多肽鏈的四聚體。
II.H.21 Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C)- GDF15(N3D)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(S354C)
在本發明中，名稱「Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(N3D)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)多肽之N端直接連接至Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C)域之C端，及(ii)包含Dh2CpmFc(+)(N297G)(S345C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使得第一及第二多肽鏈在第一多肽之C349與第二多肽之C354之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(N3D)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：296之Dh2CpmFc(+)(N297G)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)， (b)兩個包含序列SEQ ID NO：183之Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：188)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：187)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：182，其藉由核酸序列SEQ ID NO：186編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：188之多肽鏈 及兩個包含序列SEQ ID NO：182之多肽鏈的四聚體。
II.H.22 Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)- GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)
在本發明中，名稱「Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)-GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連接至Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)域之C端，及(ii)包含Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一單體之C287與第二單體之C306之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)-GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，提供四包含以下之聚體：(a)兩個包含以下序列之Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：297)，(b)兩個包含以下序列之Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：192)，及 (c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：194)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：193)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：191)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：195)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：194之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：191之多肽鏈的四聚體。
II.H.23 Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)- GDF15(N3D)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)
在本發明中，名稱「Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)-GDF15(N3D)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)多肽之N端直接連接至Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)域之C端，及(ii)包含Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C287與第二多肽鏈之C306之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)-GDF15(N3D)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，提供四包含以下之聚體：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：297之Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)域(每個雜二聚體各一個)， (b)兩個包含序列SEQ ID NO：192之Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)域(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：197)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：196)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：191，其藉由核酸序列SEQ ID NO：195編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：197之多肽鏈 及兩個包含序列SEQ ID NO：191之多肽鏈的四聚體。
II.H.24 Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)- GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)
在本發明中，名稱「Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連接至Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)域之C端，及(ii)包含Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使得第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C287與第二多肽鏈之C306之間及在第一多肽鏈之C349與第二多肽鏈之C349之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，提供四包含以下之聚體：(a)兩個包含以下序列之Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：298)，(b)兩個包含以下序列之Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：199)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：201)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：200)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：198)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：202)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：201之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：198之多肽鏈的四聚體。
II.H.25 Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)- GDF15(N3D)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)
在本發明中，名稱「Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)-GDF15(N3D)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一單體，該GDF15(N3D)多肽之N端直接連接至Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)域之C端，及(ii)包含Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使得第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C287與第二多肽鏈之C306之間及在第一多肽鏈之C349與第二多肽鏈之C349之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)-GDF15(N3D)：Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)雜二聚體之二 聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，提供四包含以下之聚體：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：298之Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：199之Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個包含序列(SEQ ID NO：52)之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：204)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：203)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：198，其藉由核酸序列SEQ ID NO：202編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：204之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：198之多肽鏈的四聚體。
II.H.26 GG-Dh2CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：GG-Dh2CpmFc(+)
在本發明中，名稱「GG-Dh2CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：GG-Dh2CpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連接至GG-Dh2CpmFc(-)域之C端，及(ii)包含GG-Dh2CpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個GG-Dh2CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：GG-Dh2CpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列之GG-Dh2CpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：299)，(b)兩個包含以下序列之GG-Dh2CpmFc(-)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：206)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：208)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：207)。
在一實施例中，採用VH21信號序列，在一較佳實施例中，第一 多肽鏈包含以下胺基酸序列(信號序列帶單下劃線)： (SEQ ID NO：243)，其藉由以下核酸序列(信號序列帶下劃線)編碼： (SEQ ID NO：244)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：205)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：209)。
在一實施例中，採用VH21信號序列，在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列(信號序列帶單下劃線)： (SEQ ID NO：245)，其藉由以下核酸序列(信號序列帶下劃線)編碼： (SEQ ID NO：246)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：208之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：205之多肽鏈的四聚體。
II.H.27 GG-Dh2CpmFc(-)-GDF15(N3D)：GG-Dh2CpmFc(+)
在本發明中，名稱「GG-Dh2CpmFc(-)-GDF15(N3D)：GG-DhCpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)多肽之N端直接連接至GG-Dh2CpmFc(-)域之C端，及(ii)包含GG-DhCpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個GG-Dh2CpmFc(-)-GDF15(N3D)：GG-Dh2CpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：229之GG-Dh2CpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：206之GG-Dh2CpmFc(-)域(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：211)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：210)。
在一實施例中，採用VH21信號序列，在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(信號序列帶單下劃線)： (SEQ ID NO：247)，其藉由以下核酸序列(信號序列帶下劃線)編碼： (SEQ ID NO：248)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：205，其藉由核酸序列SEQ ID NO：209編碼。
在一實施例中，採用VH21信號序列，在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：245，其藉由核酸序列SEQ ID NO：246編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：211之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：205之多肽鏈的四聚體。
II.H.28 GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：GG- Dh2CpmFc(+)(S354C)
在本發明中，名稱「GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：GG-Dh2CpmFc(+)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連接至GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)域之C端，及(ii)包含GG-Dh2CpmFc(+)(S345C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第 二多肽鏈在第一多肽鏈之C349與第二多肽鏈之C354之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：GG-Dh2CpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個h包含以下序列之GG-Dh2CpmFc(+)(S354C)(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：300)，(b)兩個包含以下序列之GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)鏈(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：213)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：215)， 其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：214)。
在一實施例中，採用VH21信號序列，在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(信號序列帶單下劃線)： (SEQ ID NO：249)，其藉由以下核酸序列(信號序列帶下劃線)編碼： (SEQ ID NO：250)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：212)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：216)。
在一實施例中，採用VH21信號序列，在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列(信號序列帶單下劃線)： (SEQ ID NO：251)，其藉由以下核酸序列(信號序列帶下劃線)編碼： (SEQ ID NO：252)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：215之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：212之多肽鏈的四聚體。
II.H.29 GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：GG- Dh2CpmFc(+)(S354C)
在本發明中，名稱「GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：GG-Dh2CpmFc(+)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)多肽之N端直接連接至GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)域之C端，及(ii)包含GG-Dh2CpmFc(+)(S345C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C349與第二多肽鏈之C354之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：GG-Dh2CpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體， 其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：300之GG-Dh2CpmFc(+)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：213之GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：218)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：217)。
在一實施例中，採用VH21信號序列，在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(信號序列帶單下劃線)： (SEQ ID NO：253)，其藉由以下核酸序列(信號序列帶下劃線)編碼： (SEQ ID NO：254)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：212，其藉由核酸序列SEQ ID NO：218編碼。
在一實施例中，採用VH21信號序列，在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：251，其藉由核酸序列SEQ ID NO：252編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：218之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：212之多肽鏈的四聚體。
II.H.30 Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)
在本發明中，名稱「Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連接至Dh3CpmFc(-)域之C端，及(ii)包含Dh3CpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列之Dh3CpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：301)，(b)兩個包含以下序列之Dh3CpmFc(-)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：220)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：222)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：221)。
在一實施例中，採用VK1信號序列，在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(信號序列帶單下劃線)： (SEQ ID NO：255)，其藉由以下核酸序列(信號序列帶下劃線)編碼： (SEQ ID NO：256)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：219)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：223)。
在一實施例中，採用VK1信號序列，在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列(信號序列帶單下劃線)： (SEQ ID NO：257)，其藉由以下核酸序列(信號序列帶下劃線)編碼： (SEQ ID NO：258)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：222之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：219之多肽鏈的四聚體。
II.H.31 Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)
在本發明中，名稱「Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)多肽之N端直接連接至Dh3CpmFc(-)域之C端，及(ii)包含Dh3CpmFc(+)域之第二多肽鏈。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：301之Dh3CpmFc(+)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：220之Dh3CpmFc(-)(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：225)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：224)。
在一實施例中，採用VK1信號序列，在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(信號序列帶單下劃線)： (SEQ ID NO：259)， 其藉由以下核酸序列(信號序列帶下劃線)編碼： (SEQ ID NO：260)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：219，其藉由核酸序列SEQ ID NO：223編碼。
在一實施例中，採用VK1信號序列，在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：257，其藉由核酸序列SEQ ID NO：258編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：225之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：219之多肽鏈的四聚體。
II.H.32 Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)(S354C)
在本發明中，名稱「Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(Ndel3)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(Ndel3)多肽之N端直接連接至Dh3CpmFc(-)(Y349C)域之C端，及(ii)包含 Dh3CpmFc(+)(S345C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽之C349與第二多肽之C354之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：Dh3CpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含以下序列之Dh3CpmFc(+)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：302)，(b)兩個包含以下序列之Dh3CpmFc(-)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)： (SEQ ID NO：227)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：55之GDF15(Ndel3)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：229)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：228)。
在一實施例中，採用VK1信號序列，在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(信號序列帶單下劃線)： (SEQ ID NO：261)，其藉由以下核酸序列(信號序列帶下劃線)編碼： (SEQ ID NO：262)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：226)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：230)。
在一實施例中，採用VK1信號序列，在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含以下胺基酸序列(信號序列帶單下劃線)： (SEQ ID NO：263)，其藉由以下核酸序列(信號序列帶下劃線)編碼： (SEQ ID NO：264)。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：229之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：226之多肽鏈的四聚體。
II.H.33 Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)(S354C)
在本發明中，名稱「Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)(S354C)」係指包含以下之雜二聚體：(i)包含GDF15(N3D)多肽之第一多肽鏈，該GDF15(N3D)多肽之N端直接連接至Dh3CpmFc(-)(Y349C)域之C端，及(ii)包含Dh3CpmFc(+)(S345C)域之第二多肽鏈。半胱胺酸夾突變使第一及第二多肽鏈在第一多肽鏈之C349與第二多肽鏈之C354之間經由鏈間二硫鍵連接。
在某些實施例中，提供包含兩個Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)(S354C)雜二聚體之二聚體的四聚體，其中各雜二聚體之兩個第一多肽鏈在其各別GDF15區之間經由鏈間二硫鍵連接。
更特定言之，在一特定實施例中，四聚體包含：(a)兩個包含序列SEQ ID NO：302之Dh3CpmFc(+)(S354C)域(每個雜二聚體各一個)，(b)兩個包含序列SEQ ID NO：227之Dh3CpmFc(-)(Y349C)域(每個雜二聚體各一個)，及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：52之GDF15(N3D)多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：232)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：231)。
在一實施例中，採用VK1信號序列，在一較佳實施例中，第一多肽鏈包含以下胺基酸序列(信號序列帶單下劃線)： (SEQ ID NO：265)，其藉由以下核酸序列(信號序列帶下劃線)編碼： (SEQ ID NO：266)。
在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：226，其藉由核酸序列SEQ ID NO：230編碼。
在一實施例中，採用VK1信號序列，在一較佳實施例中，第二多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：263，其藉由核酸序列SEQ ID NO：264編碼。
如上文所論述，提供包含兩個包含序列SEQ ID NO：232之多肽鏈及兩個包含序列SEQ ID NO：226之多肽鏈的四聚體。
II.H.34 Dh單Fc(N297G)-GDF15
在本發明中，名稱「Dh單Fc(N297G)-GDF15」係指包含GDF15多肽之融合蛋白，該GDF15多肽之N端藉由肽鍵直接連接至Dh單Fc(N297G)之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15多肽之間經由鏈間二硫鍵連接之此類融合蛋白的均二聚體。
更特定言之，在一特定實施例中，均二聚體包含：(a)包含以下序列之兩個單Fc(N297G)域(各單體一個)： (SEQ ID NO：233)；及(b)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(每個雜二聚體各一個)。
在一較佳實施例中，融合蛋白包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：235)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：234)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含具有序列SEQ ID NO：235之兩個單體之均二聚體。
II.H.35 Dh單Fc(N297G)-(G 4 S) 4 -GDF15
在本發明中，名稱「Dh單Fc(N297G)-(G4S)4-GDF15」係指包含經由連接子連接至Dh單Fc(N297G)域之GDF15多肽之融合蛋白，該連接子包含序列SEQ ID NO：18且藉由肽鍵使GDF15多肽之N端連接至Dh單Fc(N297G)域之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15多肽之間經由鏈間二硫鍵連接之此類融合蛋白的均二聚體。
更特定言之，在一特定實施例中，均二聚體包含：(a)包含以下序列之兩個單Fc(N297G)域(各單體一個)： (SEQ ID NO：236)；(b)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(各單體一個)；及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：18之多肽連接子(各單體一個)，各多肽連接子使GDF15多肽之N端經由肽鍵連接至Dh單Fc(N297G)域之C端。
在一較佳實施例中，融合蛋白包含以下胺基酸序列(連接子帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：238)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：237)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含具有序列SEQ ID NO：238之兩個單體之均二聚體。
II.H.36 Dh單Fc(N297G)-G 4 -GDF15
在本發明中，名稱「Dh單Fc(N297G)-G4-GDF15」係指包含經由連接子連接至Dh單Fc(N297G)域之GDF15多肽之融合蛋白，該連接子包含序列SEQ ID NO：58且藉由肽鍵使GDF15多肽之N端連接至Dh單 Fc(N297G)域之C端。
在某些實施例中，提供包含兩個在其各別GDF15多肽之間經由鏈間二硫鍵連接之此類融合蛋白的均二聚體。
更特定言之，在一特定實施例中，均二聚體包含：(a)包含序列SEQ ID NO：236之兩個Dh單Fc(N297G)域(各單體一個)；(b)兩個包含序列SEQ ID NO：12之GDF15多肽(各單體一個)；及(c)兩個包含序列SEQ ID NO：58之多肽連接子(各單體一個)，各多肽連接子使GDF15多肽之N端經由肽鍵連接至Dh單Fc(N297G)域之C端。
在一較佳實施例中，融合蛋白包含以下胺基酸序列(連接子帶雙下劃線)： (SEQ ID NO：240)，其藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：239)。
如上文所論述，在一特定實施例中，提供包含具有序列SEQ ID NO：240之兩個單體之均二聚體。
III. GDF15多肽及包含GDF15(包括其突變體形式)之構築體
如本文所揭示，可使用標準分子生物學方法工程改造及/或產生GDF15多肽(包括全長及成熟形式之人類GDF15)及包含本發明中所述之GDF15之構築體以形成本文所提供之GDF15多肽之突變體形式及構築體。在各種實例中，可包含所有或一部分SEQ ID NO：4、8或12之編碼本文所提供之GDF15多肽之突變體形式及構築體之核酸序列可使用適當寡核苷酸引子由基因組DNA或cDNA分離及/或擴增。引子可根據標準(RT)-PCR擴增技術基於本文所提供之核酸及胺基酸序列來設計。接著可將擴增GDF15突變體多肽核酸選殖至適合載體中且藉由DNA序列分析來表徵。
在分離或擴增所有或一部分本文所提供之GDF15多肽及構築體之 突變體形式中用作探針之寡核苷酸可使用標準合成技術，例如自動DNA合成裝置來設計並產生，或可自更長DNA序列分離。
III.A. GDF15多肽及多核苷酸序列
GDF15在活體內表示為包含信號序列、前結構域及活性結構域之鄰近胺基酸序列。
全長人類GDF15之308胺基酸序列為： (SEQ ID NO：4)
且藉由DNA序列編碼： (SEQ ID NO：3)。
全長鼠類GDF15之303胺基酸序列為： (SEQ ID NO：6)
且藉由DNA序列編碼： (SEQ ID NO：5)。
在29殘基信號序列裂解之後人類GDF15之胺基酸序列為： (SEQ ID NO：8)
且藉由DNA序列編碼： (SEQ ID NO：7)。
在32殘基信號序列裂解之後鼠類GDF15之胺基酸序列為： (SEQ ID NO：10)
且藉由DNA序列編碼： (SEQ ID NO：9)。
GDF15生物活性形式包含有包含兩個成熟GDF15單體之均二聚體，各成熟GDF15單體包含SEQ ID NO：12。均二聚以形成天然成熟人類GDF15二聚體之單體藉由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：11)
其包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：12)。
因此，「天然成熟人類GDF15二聚體」包含兩個包含SEQ ID NO：12之共價締合之單體。
包含有在各單體包含9個半胱胺酸以形成一個鏈間二硫鍵及4個鏈內二硫鍵之均二聚體的人類GDF15之重組活性形式之胺基酸序列(與位於圓括號中之視情況存在之N端甲硫胺酸殘基一起展示)為： (SEQ ID NO：189)
且藉由DNA序列(與位於圓括號中之視情況存在之N端甲硫胺酸密碼子一起展示)編碼： (SEQ ID NO：190)。
包含有在各單體中包含9個半胱胺酸以形成一個鏈間二硫鍵及4個鏈內二硫鍵之均二聚體的鼠類GDF15之重組活性形式之胺基酸序列 為： (SEQ ID NO：14)
且藉由DNA序列編碼： (SEQ ID NO：13)。
如本文所述，術語「GDF15多肽」係指包含人類胺基酸序列SEQ ID NO：4、8及12之GDF多肽。然而，術語「GDF15突變體多肽」涵蓋包含如下胺基酸序列之多肽：該胺基酸序列與天然存在之GDF多肽序列之胺基酸序列，例如SEQ ID NO：4、8及12有一或多個胺基酸不同以使得該序列與SEQ ID NO：4、8及12至少85%一致。GDF15多肽可藉由在GDF15多肽之特定定位引入一或多個保守性或非保守性胺基酸取代及使用天然或非天然存在之胺基酸或藉由使特定殘基或數段殘基缺失來產生。
「保守性胺基酸取代」可涉及用非天然殘基(亦即野生型GDF15多肽序列之既定位置中未見之殘基)取代天然胺基酸殘基(亦即野生型GDF15多肽序列之既定位置中所見之殘基)以使得對彼位置處之胺基酸殘基之極性或電荷存在少許影響或無影響。保守性胺基酸取代亦涵蓋非天然存在之胺基酸殘基(如本文所定義)，其通常藉由化學肽合成而非藉由生物系統中之合成來併入。此等胺基酸殘基包括肽模擬物，及胺基酸部分之其他反向或反相形式。
天然存在之胺基酸可基於共同側鏈特性分成數類：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
亦可使用例如Creighton(1984)PROTEINS：STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES(第2版，1993),W.H.Freeman and Company中所述之原理調配其他群組之胺基酸。在一些情況下，可適用於基於此類特徵中之兩者或兩者以上進一步表徵取代(例如在適當情形中用諸如Thr殘基之「小極性」殘基取代可表示高度保守性取代)。
保守性取代可涉及將此等類別中之一者的成員換成同一類別中之另一成員。非保守性取代可涉及將此等類別中之一者的成員換成另一類別之成員。
具有與上述分組中之彼等胺基酸殘基類似之已知生物化學特性之合成、罕見或經修飾胺基酸殘基可用作序列中特定胺基酸殘基之「保守性」取代物。舉例而言，D-Arg殘基可充當典型L-Arg殘基之取代物。情況亦可為可根據上述類別中之兩者或兩者以上描述特定取代(例如用小且疏水性殘基取代意謂用可見於上述類別中之兩者中之一或多個殘基或此項技術中已知與符合兩種界定之此類殘基具有類似生物化學特性的其他合成、罕見或經修飾殘基取代一個胺基酸)。
編碼本文所提供之GDF15突變體多肽之核酸序列，包括簡併成SEQ ID NO：3、7、11及15之彼等核酸序列及編碼SEQ ID NO：4、8及12之多肽變異體之彼等核酸序列，形成本發明之其他態樣。
III.B. 適用於表現GDF15多肽及包含GDF15(包括其突變體形式)之構築體的載體
為表現編碼包含GDF15區之多肽之核酸序列，根據此項技術中已知之標準選殖及表現技術可將例如SEQ ID NO：3、7及11之適當編碼序列選殖至適合載體中且在引入適合宿主中之後該序列可經表現產生編碼之多肽(例如，如Sambrook,J.,Fritsh,E.F.及Maniatis,T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989中所述)。本發明亦係關於此類包含本發明之核酸序列之載體。
「載體」係指具有如下特徵之傳遞媒劑：(a)有助於編碼多肽之核酸序列之表現；(b)有助於多肽由其生產；(c)有助於標靶細胞與其轉染/轉型；(d)有助於核酸序列之複製；(e)有助於核酸之穩定性；(f)有助於核酸及/或經轉型/經轉染細胞之偵測；及/或(g)另外賦予編碼多肽之核酸有利生物及/或生物化學功能。載體可為任何合適之載體，包括染色體、非染色體及合成核酸載體(包含一組適合之表現控制元素之核酸序列)。此類載體之實例包括SV40之衍生物、細菌質體、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質體、衍生自質體及噬菌體DNA之組合的載體及病毒核酸(RNA或DNA)載體。
重組表現載體可經設計以在原核(例如大腸桿菌(E.coli))或真核細胞(例如昆蟲細胞，使用桿狀病毒表現載體、酵母細胞或哺乳動物細胞)中表現包含GDF15區之多肽。代表性宿主細胞包括通常用於選殖及表現之彼等宿主，包括大腸桿菌(Escherichia coli)菌株TOP10F'、TOP10、DH10B、DH5a、HB101、W3110、BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysS、BLUESCRIPT(Stratagene)、哺乳動物細胞株CHO、CHO-K1、HEK293、293-EBNA pIN載體(Van Heeke & Schuster,J.Biol.Chem.264：5503-5509(1989))；pET載體(Novagen,Madison Wis.)。或者，重組表現載體可例如使用T7啟動子調節序列及 T7聚合酶及活體外轉譯系統進行活體外轉錄及轉譯。較佳地，載體在含有編碼多肽之核酸序列的選殖位點之上游含有啟動子。可進行開關轉換之啟動子之實例包括lac啟動子、T7啟動子、trc啟動子、tac啟動子及trp啟動子。
因此，本文提供包含編碼包含GDF15區之多肽之核酸序列且有助於所關注之多肽或構築體表現的載體。在各種實施例中，載體包含調節包含GDF15區之多肽之表現的可操作連接之核苷酸序列。載體可包含任何合適之啟動子、強化子及其他有助於表現之元素或與其結合。此類元素之實例包括強表現啟動子(例如人類CMV IE啟動子/強化子、RSV啟動子、SV40啟動子、SL3-3啟動子、MMTV啟動子或HIV LTR啟動子、EF1α啟動子、CAG啟動子)、有效多聚(A)終止序列、大腸桿菌中質體產物之複製源、呈可選標記形式之抗生素抗性基因及/或適宜選殖位點(例如多酶切點接頭)。載體亦可包含與諸如CMV IE之組成性啟動子相反之誘導性啟動子。在一個態樣中，提供包含編碼包含GDF15區之多肽之序列的核酸，該GDF15區可操作地連接至組織特異性啟動子，由此有助於序列在代謝相關組織(諸如肝或胰腺組織)中之表現。
III.C. 宿主細胞
在本發明之另一態樣中，提供包含本文所揭示之核酸及載體之宿主細胞。在各種實施例中，將載體或核酸整合至宿主細胞基因組中，在其他實施例中載體或核酸為染色體外載體或核酸。
提供包含此類核酸、載體或其中任一者或兩者之組合的重組細胞，諸如酵母、細菌(例如大腸桿菌)及哺乳動物細胞(例如永生化哺乳動物細胞)。在各種實施例中，提供包含諸如質體、黏質體、噬菌粒或線性表現元素之非整合核酸之細胞，該非整合核酸包含用於表現包含GDF15區之多肽之編碼序列。
可藉由轉型或藉由轉染將包含編碼包含GDF15區之多肽的核酸序列之載體引入宿主細胞中。已熟知用表現載體使細胞轉型之方法。
編碼包含GDF15區之多肽之核酸可經由病毒載體而位於及/或傳遞至宿主細胞或宿主動物中。任何合適之病毒載體均可用於此能力。病毒載體可包含任何數目之單獨或與一或多種病毒蛋白質組合之病毒聚核苷酸，其有助於本發明之核酸在所需宿主細胞中之傳遞、複製及/或表現。病毒載體可為包含所有或部分包含病毒核酸及編碼包含GDF15區之多肽之核酸的病毒基因組、病毒蛋白質/核酸結合物、病毒樣粒子(VLP)或完整病毒粒子之多核苷酸。病毒粒子病毒載體可包含野生型病毒粒子或經修飾病毒粒子。病毒載體可為對於複製及/或表現需要存在另一載體或野生型病毒之載體(例如病毒載體可為輔助病毒依賴性病毒)，諸如腺病毒載體擴增子。通常，此類病毒載體由野生型病毒粒子或其蛋白質及/或核酸內含物經修飾以增加轉殖基因能力或有助於核酸之轉染及/或表現之病毒粒子組成(此類載體之實例包括疱疹病毒/AAV擴增子)。通常，病毒載體與通常感染人類之病毒類似及/或自其衍生。就此而言，適合病毒載體粒子包括例如腺病毒載體粒子(包括腺病毒科病毒之任何病毒或衍生自腺病毒科病毒之任何病毒)、腺相關病毒載體粒子(AAV載體粒子)或其他小病毒及小病毒性載體粒子、乳突狀瘤病毒性載體粒子、黃病毒性載體、α病毒性載體、疱疹病毒性載體、痘病毒載體、反轉錄病毒性載體，包括慢病毒性載體。
III.D. GDF15多肽、包含GDF15多肽或其突變體形成之構築體之分離
包含GDF15區之多肽可使用標準蛋白質純化方法進行分離。包含GDF15區之多肽可自已工程改造以表現包含GDF15區之多肽的細胞，例如並不天然表現天然GDF15之細胞分離。
可用以分離包含GDF15區之多肽的蛋白質純化方法以及相關物質 及試劑在此項技術中已知。在下文之實例中提供純化包含GDF15區之多肽之例示性方法。可適用於分離包含GDF15區之多肽之其他純化方法可見於諸如以下之參考文獻中：Bootcov MR,1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：11514-9,Fairlie WD,2000,Gene 254：67-76。
IV. 包含GDF15多肽、包含GDF15多肽或其突變體形成之構築體的醫藥組合物
提供包含有包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體的醫藥組合物。此類多肽醫藥組合物可包含治療有效量之多肽與經選擇適用於投藥模式之醫藥學上或生理學上可接受之調配劑混合，該多肽包含有包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體。如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」或「生理學上可接受之載體」係指一或多種適用於實現或增強包含含GDF15區多肽之單體或多聚體向人類或非人類個體體內傳遞之調配劑。術語包括生理學上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及其類似物。醫藥學上可接受之載劑之實例包括水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物中之一或多者以及其組合。在一些情況下，醫藥組合物將較佳包括等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉。會增強包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體的存放期或有效性之醫藥學上可接受之物質，諸如潤濕物質或少量助劑物質，諸如潤濕或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，亦可充當載體或形成載體之組分。可接受之醫藥學上可接受之載劑較佳在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒。
醫藥組合物可含有用於改變、維持或保持例如組合物之pH值、容積滲透濃度、黏度、透明度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸收或滲透之調配劑。適合調配劑包括(但不限於)胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸)、 抗菌劑、抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)、緩衝劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)、膨化劑(諸如甘露糖醇或甘胺酸)、螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))、錯合劑(諸如咖啡鹼、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)、填充劑、單醣、雙醣及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白質(諸如無血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、著色劑、調味劑及稀釋劑、乳化劑、親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)、低分子量多肽、成鹽相對離子(諸如鈉)、防腐劑(諸如氯化苯甲烴銨、苯甲酸、柳酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫)、溶劑(諸如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)、懸浮劑、界面活性劑或潤濕劑(諸如普洛尼克(pluronic)；PEG；脫水山梨糖醇酯；聚山梨醇酯，諸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；曲拉通(Triton)；緩血酸胺；卵磷脂；膽固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))、穩定性增強劑(諸如蔗糖或山梨醇)、張力增強劑(諸如鹼金屬鹵化物，較佳為氯化鈉或氯化鉀，或甘露醇、山梨糖醇)、傳遞媒劑、稀釋劑、賦形劑及/或醫藥佐劑(參見例如REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY，第19版，(1995)；Berge等人，J.Pharm.Sci.,6661),1-19(1977)。其他相關原理、方法及藥劑描述於例如Lieberman等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS-DISPERSE SYSTEMS(第2版，第3卷1998)；Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS & DRUG DELIVERY SYSTEMS(第7版2000)；Martindale,THE EXTRA PHARMACOPEIA(第31版)，Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES(第16-20版及後續版本)；The Pharmacological Basis Of Therapeutics,Goodman及Gilman編(第9版--1996)；Wilson and Gisvolds' TEXTBOOK OF ORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY,Delgado and Remers編(第10版，1998)中。調配醫藥學上可接受之組合物之原理亦描述於例如Aulton,PHARMACEUTICS：THE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESIGN,Churchill Livingstone(New York)(1988),EXTEMPORANEOUS ORAL LIQUID DOSAGE PREPARATIONS,CSHP(1998))中。
最佳醫藥組合物將由熟習此項技術者視例如預期投藥途徑、傳遞形式及所要劑量而確定(參見例如Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上)。此類組合物可影響GDF15多肽、包含GDF15多肽或其突變體形成之構築體的物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。
醫藥組合物中之主要媒劑或載體實際上可為水溶性或非水性的。舉例而言，適用於注射之媒劑或載劑可為水、生理食鹽水溶液或人工腦脊髓液，可能補充有供非經腸投與之組合物中所常見之其他物質。中性緩衝鹽水或與無血清白蛋白混合之生理食鹽水為其他例示性媒劑。其他例示性醫藥組合物包含pH值為約7.0-8.5之Tris緩衝劑或pH值為約4.0-5.5之乙酸鹽緩衝劑，其可進一步包括山梨糖醇或適合替代物。在本發明之一個實施例中，可藉由混合具有所需純度之所選組合物與視情況存在之呈凍乾餅狀物或水溶液形式之調配劑(Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上)來製備包含GDF15多肽、包含GDF15多肽或其突變體形式之構築體的組合物以供儲存。此外，包含有包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體的產物可使用諸如蔗糖之適當賦形劑調配成凍乾物。
可選擇多肽醫藥組合物以用於非經腸傳遞。或者，可選擇組合物以用於吸入或經由消化道(諸如經口)傳遞。該等醫藥學上可接受之組合物之製備在此項技術之技能範圍內。
調配組分係以投藥部位可接受之濃度存在。舉例而言，緩衝劑 係用以將組合物維持於生理pH值或略低之pH值下，通常在約5至約8之pH值範圍內。
當涵蓋非經腸投藥時，用於本發明之治療組合物可呈無熱原質、非經腸可接受之水溶液形式，該水溶液在醫藥學上可接受之媒劑中包含所需GDF15多肽、包含GDF15多肽或其突變體形式之構築體。尤其適用於非經腸注射之媒劑為無菌蒸餾水，其中GDF15多肽、包含有包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體的構築體調配成無菌等滲溶液，加以適當保存。另一種製備可涉及用諸如可注射微球體、生物可侵蝕性粒子、聚合化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體之試劑調配所要分子，其提供接著可經由積存注射傳遞之產物的控制或持續釋放。亦可使用玻糖醛酸，且此物可具有促進循環中持續時間之作用。其他適用於引入所需分子之方法包括可植入藥物傳遞裝置。
在一個實施例中，可調配醫藥組合物用於吸入。舉例而言，包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體可調配成吸入用乾粉。亦可用推進劑調配包含有包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體的吸入溶液以用於氣霧劑傳遞。在另一個實施例中，溶液可進行霧化。經肺投藥進一步描述於國際公開案第WO 94/20069號中，其描述化學修飾蛋白質之經肺傳遞。
亦預期某些調配物可經口投與。在本發明之一個實施例中，以此方式投與之包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體可用或不用混合諸如錠劑及膠囊之固體劑型中慣用之彼等載劑來調配。舉例而言，膠囊可經設計以於胃腸道中在生物可用性最大且全身循環前降解最小之時釋放調配物之活性部分。可包括其他藥劑以有助於吸收包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體。亦可利用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及黏合劑。
另一醫藥組合物可包括有效量之包含含GDF15區之多肽之單體或 多聚體與適用於製造錠劑之無毒賦形劑混合。藉由將錠劑溶解於無菌水或另一適當媒劑中，可以單位劑形製備溶液。適合賦形劑包括(但不限於)惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或黏合劑，諸如澱粉、明膠或阿拉伯膠；或潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
包含有包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體的其他醫藥組合物對於熟習此項技術者顯而易見，其包括呈持續或控制傳遞調配物形式之包含有包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體的調配物。用於調配諸如脂質體載劑、生物可侵蝕性微米粒子或多孔珠粒及儲槽式注射劑之多種其他持續或控制傳遞手段之技術亦為熟習此項技術者所已知(參見例如國際公開案第WO 93/15722號，其描述多孔聚合微米粒子控制釋放以傳遞醫藥組合物，及Wischke及Schwendeman,2008,Int.J.Pharm.364：298-327，及Freiberg及Zhu,2004,Int.J.Pharm.282：1-18，其論述微球體/微粒製備及用途)。如本文所述，水凝膠為持續或控制傳遞調配物之實例。
持續釋放製劑之其他實例包括成形製品(例如膜)或微囊形式之半透聚合物基質。持續釋放基質可包含聚酯、水凝膠、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號及歐洲專利第0 058 481號)、L-麩胺酸及γ乙基-L-麩胺酸之共聚物(Sidman等人，1983,Biopolymers 22：547-56)、聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981,J.Biomed.Mater.Res.15：167-277及Langer,1982,Chem.Tech.12：98-105)、乙烯乙酸伸乙酯(Langer等人，同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利第0 133 988號)。持續釋放組合物亦可包括可藉由此項技術中已知之若干方法中之任一者製備之脂質體。參見例如Epstein等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-92；及歐洲專利第0 036 676號、第0 088 046號及第0 143 949號。
用於活體內投藥之包含有包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體的醫藥組合物通常應為無菌的。此可藉由經由無菌過濾膜過濾而實現。當組合物凍乾時，可於凍乾及復水之前或之後使用此方法進行滅菌。用於非經腸投藥之組合物可以凍乾形式或以溶液形式儲存。此外，一般將非經腸組合物置於具有無菌取用口之容器中，例如具有可由皮下注射針穿透之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶中。
醫藥組合物一經調配，即可以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體形式或脫水或凍乾粉末形式儲存於無菌小瓶中。該等調配物可以即用形式或以於投與前需復水之形式(例如凍乾形式)儲存。
在一特定實施例中，本發明係針對產生單次劑量投藥單位之套組。該套組可各自含有具有乾燥蛋白質之第一容器與具有水性調配物之第二容器。本發明之範疇內亦包括含有單腔室及多腔室預填充注射器(例如液體注射器及藥粉注射器(lyosyringe))之套組。
治療上所用之包含有包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體的醫藥組合物之有效量將視例如治療情形及目的而定。熟習此項技術者將瞭解，適用於治療之劑量將因此部分視所遞送之分子、包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體所用之適應症、投藥途徑及患者之尺寸(體重、體表面積或器官尺寸)及狀況(年齡及大體健康狀況)而改變。因此，臨床醫師可滴定劑量並修改投藥途徑以獲得最佳治療效應。典型劑量可在約0.1μg/kg至至多約100mg/kg或100mg/kg以上之範圍內，視以上所提及之因素而定。在其他實施例中，劑量可在0.1μg/kg至至多約100mg/kg；或1μg/kg至至多約100mg/kg之範圍內；或為5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、100μg/kg、200μg/kg或至多約10mg/kg。
給藥頻率將視所用調配物中包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體之藥物動力學參數而定。通常，臨床醫師將投與組合物直至達到達成所需效應之劑量。因此，可以單次劑量、隨時間以兩次或兩次以上劑量(其可含有或可不含相同量之所需分子)或經由植入裝置或導管連續輸注來投與組合物。適當劑量之進一步改進由一般熟習此項技術者按常規進行且在其常規進行之工作範圍內。可經由使用適當劑量-反應資料來確定適當劑量。
醫藥組合物之投藥途徑與已知方法一致，例如經口；經由靜脈內、腹膜內、腦內(腦實質內(intraparenchymal))、腦室內(intracerebroventricular)、肌肉內、眼內、動脈內、門靜脈內或病灶內途徑注射；藉由持續釋放系統(其亦可注入)或藉由植入裝置。需要時，可藉由快速注射(bolus injection)或藉由連續輸注或藉由植入裝置投與該等組合物。
或者或另外，可經由植入已吸收或囊封所需分子之膜、海綿體或另一適當物質來局部投與組合物。使用植入裝置時，可將該裝置植入任何合適的組織或器官中，且可經由擴散、定時釋放大丸劑(timed-release bolus)或連續投藥來進行所需分子之傳遞。
為以預定速率傳遞藥物，例如包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體，以便可在擴展期間內使藥物濃度維持於所需治療有效程度，可採用多種不同方法。在一個實例中，可採用包含聚合物(諸如明膠(例如牛明膠、人類明膠或來自另一來源之明膠))之水凝膠或天然存在或合成產生之聚合物。在水凝膠中可採用任何聚合物(例如明膠)百分比，諸如5%、10%、15%或20%。適當濃度之選擇可視多種因素而定，諸如所需治療概況及治療分子之藥物動力學概況。
可併入水凝膠中之聚合物之實例包括聚乙二醇(「PEG」)、聚氧化乙烯、聚氧化乙烯-共-聚氧化丙烯、共-聚氧化乙烯阻斷或無規共聚 物、聚乙烯醇、聚(乙烯基吡咯啶酮)、聚(胺基酸)、聚葡萄糖、肝素、多醣、聚醚及其類似物。
產生水凝膠調配物時可考慮之另一因素為水凝膠及交聯劑中之交聯程度。在一個實施例中，交聯可經由涉及甲基丙烯酸酐之甲基丙烯酸酯化反應實現。在一些情況下，可能需要較高交聯程度，而在其他情況下較低交聯程度較佳。在一些情況下，較高交聯之程度提供更長持續釋放。較高之交聯程度可提供更為牢固之水凝膠及較長藥物遞送時段。
可採用任何聚合物與交聯劑(例如甲基丙烯酸酐)之比率以生成具有所需特性之水凝膠。舉例而言，聚合物與交聯劑之比率可為例如8：1、16：1、24：1或32：1。舉例而言，當水凝膠聚合物為明膠時且交聯劑為甲基丙烯酸酯，可採用8：1、16：1、24：1或32：1之甲基丙烯酸酸酐：明膠比率。
V. GDF15多肽、包含GDF15多肽或其突變體形成之構築體之治療用途
包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體可用以治療、診斷或改善代謝病狀或病症。在一個實施例中，待治療之代謝病症為糖尿病，例如2型糖尿病。在另一個實施例中，代謝病狀或病症為肥胖症。在其他實施例中，代謝病狀或病症為血脂異常、高葡萄糖含量、高胰島素含量或糖尿病性腎病。舉例而言，可使用包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體治療或改善之代謝病狀或病症包括人類個體之空腹血糖含量為125mg/dL或大於125mg/dL之病況，例如130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200或大於200mg/dL。血糖含量可在飼餵或空腹狀態下或隨意測定。代謝病狀或病症亦可包含個體顯現代謝病狀之風險增加之病狀。對於人類個體，此類病狀包括空腹血糖含量為100mg/dL。可使用包含GDF15突變體多肽之醫藥組合物治療之病狀亦可見於American Diabetes Association Standards of Medical Care in Diabetes Care-2011,American Diabetes Association,Diabetes Care第34卷，增刊1,S11-S61,2010。
在應用中，諸如2型糖尿病、高葡萄糖含量、高胰島素含量、血脂異常、肥胖症或糖尿病性腎病之代謝病症或病狀可藉由向有需要之患者投與治療有效劑量之GDF15多肽、包含有包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體的構築體治療。可如本文所述進行投藥，諸如藉由靜脈內注射、腹膜內(IP)注射、皮下注射、肌肉內注射或以錠劑或液體形式經口。在一些情況下，包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體之治療有效或較佳劑量可藉由臨床醫生判定。治療有效劑量之包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體將尤其視投藥時程、所投與之藥劑之單位劑量、包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體是否與其他治療劑之組合投與、免疫狀態及接受者之健康狀況而定。如本文所用，術語「治療有效劑量」意謂在組織系統、動物或人類中引發研究人員、醫生或其他臨床醫師所探尋之生物或醫藥反應(其包括緩解或改善所治療之疾病或病症之症狀)之包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體之量，亦即支撐可見程度之一或多種所需生物或藥用反應之包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體之量，例如降低血糖、胰島素、三酸甘油酯或膽固醇含量；降低體重；或改良葡萄糖耐受性、能量消耗或胰島素敏感性。
應注意，包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體之治療有效劑量亦可隨所需結果而變化。因此，例如在表明較低血糖含量之情況下，包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體之劑量將相對應地高於需要相對低血糖含量之劑量。相反，在表明較高血糖含量之情況下，包含含GDF15區多肽之單體或多聚體之劑量將相對應地低於需要相對高血糖含量之劑量。
在各種實施例中，個體為血糖含量為100mg/dL或大於100mg/dL 之人類，可用包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體治療。
在一個實施例中，本發明之方法包含首先測量個體中諸如葡萄糖、胰島素、膽固醇、脂質之一或多種代謝相關化合物之基線含量。接著向個體投與包含有包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體之醫藥組合物。在所需時段之後，再測量個體中一或多種代謝相關化合物(例如血糖之、胰島素、膽固醇、脂質)含量。接著可比較兩種含量以測定個體中代謝相關化合物之相對變化。視彼比較之結果而定，可投與另一劑量之包含有包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體的醫藥組合物以達到一或多種代謝相關化合物之所需含量。
應注意，包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體的醫藥組合物可與另一化合物共同投與。與包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體共同投與之化合物的個性及特性將視待治療或改善之病狀之性質而定。可與包含有包含含GDF15區之多肽之單體或多聚體的醫藥組合物組合投與化合物之實例之非限制性清單包括羅格列酮(rosiglitizone)、匹格列酮(pioglitizone)、瑞格列奈(repaglinide)、耐格列奈(nateglitinide)、二甲雙胍(metformin)、艾塞那肽(exenatide)、西他列汀(stiagliptin)、普蘭林肽(pramlintide)、格列吡嗪(glipizide)、格列美脲醣祿(glimeprirideacarbose)及米格列醇(miglitol)。
VI. 套組
亦提供用於實踐所揭示之方法的套組。此類套組可包含醫藥組合物，諸如本文所述之彼等醫藥組合物，其包括編碼本文所提供之肽或蛋白質之核酸、包含此類核酸之載體及細胞及包含此類含核酸化合物之醫藥組合物，其可為提供於無菌容器中。視情況，關於使用所提供之醫藥組合物治療代謝病症之方式的說明書亦可包括在內或提供給患者或醫學服務提供者。
在一個態樣中，套組包含(a)包含治療有效量之包含含GDF15區 之多肽之單體或多聚體的醫藥組合物；及(b)一或多個用於醫藥組合物之容器。此類套組亦可包含關於其用途之說明書；該說明書可適用於所治療之確切代謝病症。該說明書可描述套組中所提供之物質的用途及性質。在某些實施例中，套組包括關於患者進行投藥以治療諸如高葡萄糖含量、高胰島素含量、肥胖症、2型糖尿病、血脂異常或糖尿病性腎病之代謝病症之說明書。
說明書可印刷於諸如紙或塑膠等之基材上，且可以藥品說明書之形式存在於套組中、存在於套組之容器之標籤中或其組件(例如與包裝關聯)等中。在其他實施例中，說明書以呈現於適合電腦可讀儲存媒體(例如CD-ROM、磁片等)上之電子儲存資料文件之形式存在。在其他具體實例中，實際說明書不存在於套組中，但提供自遠端源(諸如經網際網路)獲得說明書之方式。此實施例之實例為包括可觀看到說明書及/或可下載說明書之網路位址之套組。
通常，需要將套組之一些或所有組件封裝於適合包裝中以保持無菌性。可將套組之組件封裝於套組密閉元件中以得到單個易於處理單元，其中套組密閉元件，例如箱式結構或類似結構，可為或可不為氣密容器，例如以進一步保持套組之一些或所有組件之無菌性。
實例
包括所進行實驗及所達成結果之以下實例僅為說明目的而提供而不欲解釋為限制本發明。
實例1 製備Fc-GDF15分子
具有凸/凹Fc、半Fc、帶電對(del鉸鏈)Fc及帶電對(del鉸鏈)半胱胺酸夾Fc序列之GDF15融合物穩定表現於無血清懸浮液適應CHO-K1細胞株中。將GDF15-Fc分子選殖至含有嘌呤黴素抗性之穩定表現載體中，而將Fc鏈選殖至含有潮黴素之表現載體(Selexis,Inc.)中。使用 脂染胺LTX以1：1比率轉染質體且轉染後2天在含有10μg/mL嘌呤黴素及600μg/mL潮黴素之專有生長培養基中對細胞進行選擇。在選擇期間每週更換培養基2次。當細胞達到約90%存活率時，將其按比例擴大以進行分批補料式生產運作。細胞以1e6/mL接種於專有生產培養基中且在第3、6及8天補料。在第10天收集藉由細胞產生之條件培養基(CM)並澄清。終點生存力通常高於90%。
使用兩步層析程序純化Fc-GDF15澄清之條件培養基。將約5L CM直接施用於已預先用達爾伯克氏磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)平衡之GE MabSelect SuRe管柱。結合蛋白經歷三個洗滌步驟：首先，3管柱體積(CV)PBS；接下來，1CV 20mM Tris、100mM氯化鈉(pH 7.4)；及最後，3CV 500mM L-精胺酸(pH 7.5)。此等洗滌步驟會移除非結合或輕微結合之培養基組分及宿主細胞雜質。接著用5CV 20mM Tris、100mM氯化鈉(pH 7.4)再平衡管柱，由此使UV吸光度返回至基線。用100mM乙酸(pH 3.6)溶離所需蛋白質並整體收集。用1M Tris-HCl(pH 9.2)將蛋白質彙集物快速滴定至5.0至5.5之pH範圍內。
接下來將pH調節之蛋白質彙集物裝載於已預先用20mM MES(pH 6.0)平衡之GE SP瓊脂糖HP管柱上。接著用5CV平衡緩衝液洗滌結合蛋白，且最終經20CV 0至50%線性梯度為含0至400mM氯化鈉之20mM MES(pH 6.0)溶離。在溶離期間收集溶離份且藉由分析型尺寸排阻層析(Superdex 200)進行分析以測定彙集物之適當溶離份的均質產物。SP HP層析會移除產物相關之雜質，諸如無Fc截割物質及Fc-GDF15多聚體。
接著藉由透析將SP HP彙集物緩衝劑更換為10mM乙酸鈉、5%脯胺酸(pH 5.2)。使用Sartorius Vivaspin 20 1萬道爾頓分子量截斷離心裝置濃縮成約15mg/ml。最終，進行無菌過濾且將含有純化Fc-GDF15分子之所得溶液儲存於5℃下。使用質譜分析、十二烷基硫酸 鈉聚丙烯醯胺電泳及尺寸排阻高效液相層析評估最終產物之一致性及純度。
採用上述純化方法純化Dh單Fc-GDF15融合蛋白。然而，已發現向Dh單Fc-GDF15中添加H6D突變使得在SP溶離中形成可溶聚集體。因此，純化Dh單Fc-GFF15(H6D)包括其他SEC步驟(具有20mM磷酸鹽、250mM NaCl(pH 6.8)之Superdex 200)，隨後加載於Q-瓊脂糖HP上且用梯度為含0至0.6M NaCl之20mM tris(pH 8.5)之溶離。
實例2 製備GDF15-HSA及Dh單Fc分子
與HSA及Dh單Fc序列之GDF15融合物穩定表現於CHO-S細胞(Invitrogen)中。對於各構築體產生之均二聚體，將編碼序列選殖至含有嘌呤黴素抗性之穩定表現載體中(Selexis,Inc.)。在HSA-(G4S)4-GDF15：GDF15雜二聚體之情況下，將HSA-(G4S)4-GDF15融合序列選殖至含有嘌呤黴素抗性之表現載體中且將GDF15序列選殖至含有潮黴素抗性之表現載體中。使CHO-S親本細胞維持於補充有8mM L-麩醯胺酸之CD-CHO培養基(Invitrogen)中且使用脂染胺LTX轉染套組(Invitrogen)根據製造商之說明書用4μg質體DNA轉染。在HSA-(G4S)4-GDF15：GDF15雜二聚體之情況下，在轉染之前將兩種質體以1：1之比率混合。使用10μg/mL嘌呤黴素(均二聚體)或10μg/mL嘌呤黴素加400μg/mL潮黴素(雜二聚體)選擇穩定細胞株。在回收時，即使用Vi-Cell計數器(Beckman Coulter)確定為存活率>90%時，使穩定CHO-S細胞株擴增且用以接種振盪燒瓶中之分批生產或於WAVE生物反應器(GE Healthcare)中之分批補料式生產。兩種方法皆於生產培養基中以1e6個活細胞/mL接種。分批生產在第6天藉由離心進行收集，而分批補料式生產在第3、6及8天進行補料。在第10天藉由離心收集藉由細胞產生之CM並澄清。
使用兩個層析步驟由澄清條件培養基純化HSA-GDF15融合蛋白。將含有HSA-GDF15融合蛋白之澄清條件培養基施用於用20mM磷酸鹽、150mM NaCl(pH 7.4)平衡之汽巴藍瓊脂糖HP管柱(Cibracon Blue Sepharose HP column)中。接下來用平衡緩衝液洗滌管柱直至獲得基線紫外線(UV)水準。產物及污染物藉由20mM磷酸鹽、2M NaCl緩衝液進行溶離，且收集溶離物並隨後藉由庫馬斯染色之SDS-PAGE(Coomasie-stained SDS-PAGE)(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)分析以鑑別含有預計HSA-GDF15融合蛋白分子量下遷移之多肽的溶離份。在藍瓊脂糖步驟之後，相對於10mM tris(pH 8.0)對彙集之含有產物之溶離份進行透析。透析步驟使得HSA-GDF15融合蛋白在施用於陰離子交換層析樹脂時發生結合。最終層析步驟為Q-瓊脂糖HP，其施用線性梯度(含0至0.6M NaCl之10mM tris(pH 8.0))以溶離結合融合蛋白。收集來自Q-瓊脂糖HP之溶離物作為溶離份，接著藉由SDS-PAGE及分析型尺寸排外層析法進行分析以測定彙集物之適當溶離份。運作LCMS及SDS-PAGE以確認各蛋白質之一致性。藉由透析使所得彙集物緩衝劑更換為10mM乙酸鈉、9%蔗糖(pH 4.5)，無菌過濾且最終儲存於5℃下或冷凍。
如上文實例2中針對其他Fc-GDF15融合蛋白所述純化Dh單Fc-GDF15融合蛋白。
實例3 藉由Fc融合GDF15多肽及HSA融合GDF15多肽抑制食慾過盛ob/ob小鼠之食物攝入
GDF15減少食慾過盛ob/ob小鼠中之食物攝入，且使用食物攝入分析評價不同形式GDF15類似物之功效。由於觀測到人類GDF15多肽在小鼠中之半衰期為約3小時，因此使用Fc融合策略延長蛋白質半衰期。產生包含含GDF15區之多肽之各種多聚體，且藉由將多聚體引入 食慾過盛之缺乏瘦素之ob/ob小鼠中及測量包含含GDF15區之多肽之特定多聚體抑制此等動物之食物攝入的能力來分析活體內活性。在第0天4-5pm之間將待測試之包含含GDF15區之多肽之多聚體皮下注入7-8週齡ob/ob小鼠(Jackson Laboratory)中。在注射之後將動物輸送至籠中，其中食物已進行前測，且在第二天在9-10AM之間測量食物攝入。
代表性實驗之結果提供於圖6-53中。此等實驗展現所述包含GDF15區之多聚體呈現ob/ob小鼠之食物攝入減少，其效能大於天然成熟hGDF15均二聚體。
實例4 GDF15構築體在DIO小鼠中之長期功效
向DIO小鼠長期且皮下投與某些包含GDF15區之多聚體每週一次。構築體表明改良各種代謝參數之功效，該等代謝參數包括體重、血糖含量及葡萄糖耐受性、血清胰島素含量、血清膽固醇含量、血清三酸甘油酯含量及口服脂質耐受性。
實例5 GDF15構築體之活體內活性
雄性C57Bl/6飼餵60%高脂肪膳食15週且分成不同治療組，每組處理前的體重、葡萄糖、胰島素、三酸甘油酯及膽固醇含量相同。動物每週皮下給與蛋白質或媒劑緩衝劑，歷時5週。蛋白質選擇三種不同劑量水準：10、1、0.1nmol/kg，其相當於1.25、0.125、0.0125mg/kg。研究進行5週，其中第28天為最後之給藥。
在5週之治療及藥物清除期間每週測量體重。在空腹4小時之動物中，在第一次蛋白質注射之後2週進行一次口服葡萄糖耐受性測試(OGTT)。在空腹16小時之動物中，在第一次蛋白質注射之後5週再進行一次口服葡萄糖耐受測試(OGTT)。在OGTT中，動物經口投與2 g/kg葡萄糖溶液，且在0、15、30、60、120min藉由AlphaTRAK血糖儀(Abbott)測量葡萄糖含量。計算OGTT期間葡萄糖含量之曲線下面積(AUC)，以比較不同治療組之葡萄糖耐受性。在第一次蛋白質注射之後3週收集血清樣品，且用以測量胰島素、三酸甘油酯及膽固醇含量以及測試物品之含量。使用免疫分析套組(Alpco)測量胰島素含量。使用酶促分析(Wako)測量三酸甘油酯及膽固醇含量。
結果示於圖54-59中(星號指示統計顯著性)。此等實驗表明，所述包含GDF15區之多聚體降低OGTT期間葡萄糖含量之AUC(圖55及59)、降低體重(圖54)、降低胰島素含量(圖56)、降低膽固醇(圖58)及降低三酸甘油酯(圖57)。
實例6 GDF15構築體之熱穩定性
藉由差示掃描熱量測定法、經MicroCal毛細管VP-DSC系統評估所選GDF15構築體之熱穩定性，其中連續測量參比室與樣品室之間的溫度差且依功率單位校準。此資料通道稱為DP信號，或參比室與樣品室之間的差分功率。蛋白質分子之去摺疊在DSC熱分析圖上呈現為吸熱轉變且可藉由熱轉變中點(Tm)表徵。將樣品以60℃/小時之加熱速率由10℃加熱至100℃。預掃描時間為15分鐘且過濾期為10秒。DSC實驗中所用之濃度為約1.0mg/ml。用於Tm值之基線校正及測定之資料分析使用MicroCal Origin 7軟體完成。
詳言之，比較DhCpmFc(-)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)之二聚體與Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)之二聚體；比較DhCpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)之二聚體與Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)之二聚體；比較DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)之二聚體與Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：DhCpmFc(+)(S354C)之二聚體；且比較DhCpmFc(- )(Y349C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(S354C)之二聚體與Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(S354C)之二聚體。結果展示於圖61中。此等實驗表明「Dh3CpmFc」域賦予的穩定性大於對應「DhCpmFc」域。
實例7 Fcγ受體結合分析
經BIA3000分析所選GDF15構築體對Fcγ受體之結合活性。在塗佈抗his抗體之CM5表面上捕捉各Fcγ受體(捕捉RL為約200RU)。用樣品緩衝液(0.1mg/ml BSA、0.005%P20、PBS)將GDF15構築體稀釋成250nM。以50μL/min將各GDF15構築體注入抗his抗體捕捉之Fcγ受體表面上持續3分鐘。在用儀器運作緩衝劑(含0.005% P20之PBS)解離5分鐘之後，藉由注射8mM甘胺酸(pH 1.5)、1M NaCl持續30秒，隨後注射10mM甘胺酸(pH 1.5)持續30秒使各Fcγ受體表面再生。使用BIAcore BIAEvaluation(4.1版)分析所得感測器圖譜。在注射結束之前10秒時讀取以RU單位計之結合反應。
詳言之，相對於DhCpmFc(-)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)之二聚體、DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)：DhCpmFc(+)(S354C)之二聚體；Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3)之二聚體；Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)-Dh3CpmFc(+)(S354C)之二聚體；Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D)之二聚體；及Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D)：Dh3CpmFc(+)(S354C)之二聚體測定FcγRI、FcγRIIIA及FcγRIIA。結果展示於圖60中。此等實驗表明「Dh3CpmFc」域基本上消除了FcγRI、FcγRIIIA及FcγRIIA結合。
儘管本發明已根據各種實施例形式進行描述，但應理解熟習此項技術者將進行變化及修改。因此，隨附申請專利範圍意欲涵蓋出現在所主張之本發明之範疇內的所有此類等效變化。此外，本文中所用 之章節標題僅出於組織目的而不應理解為限制所述標的物。
所有本申請案中所引用之參考文獻均為任何目的明確以引用的方式併入本文中。
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Claims (25)

  1. 一種融合蛋白，其包含一個生長分化因子15(GDF15)區及一個Fc域，其中該GDF15區藉由多肽連接子連接至該Fc域，該Fc域為SEQ ID NO：220或包含位置113之酪胺酸至半胱胺酸突變之SEQ ID NO：220。
  2. 如請求項1之融合蛋白，其中該Fc域具有SEQ ID NO：227的序列。
  3. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該GDF15區包含與SEQ ID NO：4、8或12至少約85%一致之胺基酸序列。
  4. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該GDF15區包含SEQ ID NO：4、8、12、25、52或55之胺基酸序列。
  5. 如請求項3之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO：222、225、229或232之胺基酸序列。
  6. 如請求項3之融合蛋白，其中該多肽連接子包含SEQ ID NO：18、30、34、40、58、61、64、69、72、75、78、113、116、119、122、125或128之胺基酸序列。
  7. 如請求項1或2之融合蛋白，其係用於治療代謝病症之療法。
  8. 如請求項7之融合蛋白，其中該療法係治療糖尿病、肥胖症、血脂異常或糖尿病性腎病。
  9. 一種二聚體，其包含(i)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如請求項1至8中任一項之融合蛋白及(ii)包含第二Fc域之第二多肽鏈。
  10. 如請求項9之二聚體，其中該第二蛋白包含SEQ ID NO：219、226、301或302之胺基酸序列：。
  11. 如請求項9或10之二聚體，其中該第一蛋白及第二蛋白係非共價締合。
  12. 如請求項9或10之二聚體，其中該第一蛋白及第二蛋白係共價締合。
  13. 如請求項9或10之二聚體，其中該第一蛋白及第二蛋白係經由二硫鍵締合。
  14. 如請求項9或10之二聚體，其係用於治療代謝病症之療法。
  15. 如請求項14之二聚體，其中該療法係治療糖尿病、肥胖症、血脂異常或糖尿病性腎病。
  16. 一種四聚體，其包含(i)如請求項9至13中任一項之第一二聚體及(ii)如請求項9至13中任一項之第二二聚體。
  17. 如請求項16之四聚體，其中該第一二聚體及第二二聚體係非共價締合。
  18. 如請求項16之四聚體，其中該第一二聚體及第二二聚體係共價締合。
  19. 如請求項16之四聚體，其中該第一二聚體及第二二聚體係經由二硫鍵締合。
  20. 如請求項19之四聚體，其中該第一二聚體及第二二聚體係經由第一二聚體之GDF15區與第二二聚體之GDF15區間之鏈間二硫鍵締合。
  21. 如請求項16至20中任一項之四聚體，其係用於治療代謝病症之療法。
  22. 如請求項21之四聚體，其中該療法係治療糖尿病、肥胖症、血脂異常或糖尿病性腎病。
  23. 一種如請求項1至6中任一項之融合蛋白、如請求項9至13中任一項之二聚體或如請求項16至20中任一項之四聚體之用途，其係用於製備治療代謝病症之藥物。
  24. 一種如請求項1至6中任一項之融合蛋白、如請求項9至13中任一項之二聚體或如請求項16至20中任一項之四聚體之用途，其係用於製備治療糖尿病、肥胖症、血脂異常或糖尿病性腎病之藥物。
  25. 一種如請求項1至6中任一項之融合蛋白、如請求項9至13中任一項之二聚體或如請求項16至20中任一項之四聚體之用途，其係用於製備降低個體之食物攝入、體重、胰島素含量、三酸甘油酯含量、膽固醇含量或葡萄糖含量之藥物。
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