EA037355B1 - Конструкции на основе фактора дифференцировки и роста 15 (gdf-15) - Google Patents

Конструкции на основе фактора дифференцировки и роста 15 (gdf-15) Download PDF

Info

Publication number
EA037355B1
EA037355B1 EA201690297A EA201690297A EA037355B1 EA 037355 B1 EA037355 B1 EA 037355B1 EA 201690297 A EA201690297 A EA 201690297A EA 201690297 A EA201690297 A EA 201690297A EA 037355 B1 EA037355 B1 EA 037355B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
gdf15
seq
dhcpmfc
polypeptide
sequence
Prior art date
Application number
EA201690297A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201690297A1 (ru
Inventor
Юймэй Сюн
И Чжан
Джкеи Ц. Шэн
Агнес Эва Хамбургер
Мюриэлль Вениант-Эллисон
Грант Симамото
Сяошань Минь
Чжулунь Ван
Цзе Тан
Гунасекаран Каннан
Марисса Мок
Кеннет Уолкер
Original Assignee
Эмджен Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=51358091&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA037355(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Эмджен Инк. filed Critical Эмджен Инк.
Publication of EA201690297A1 publication Critical patent/EA201690297A1/ru
Publication of EA037355B1 publication Critical patent/EA037355B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Abstract

Предложены конструкции, содержащие GDF15 (фактор дифференцировки и роста 15) и мутанты GDF15. Согласно различным вариантам реализации изобретения конструкции, содержащие GDF15 и мутанты GDF15, могут найти применение при лечении или облегчении метаболического нарушения. Согласно различным вариантам реализации изобретения метаболическое заболевание или нарушение представляет собой диабет 2 типа, ожирение, дислипидемию, увеличенные уровни глюкозы, увеличенные уровни инсулина и диабетическую нефропатию.

Description

Область техники
Изобретение относится к мономерам и мультимерам, содержащим полипептид, который содержит область GDF15.
Уровень техники
Фактор дифференцировки и роста 15 (growth differentiation factor 15, GDF15) представляет собой нетипичный член суперсемейства TGFe. Его также называют ингибирующим макрофаги цитокином 1 (macrophage inhibitory cytokine 1, MIC1) (Bootcov M.R., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:11514-9), плацентарным костным морфогенетическим фактором (placental bone morphogenetic factor, PLAB) (Hromas R., 1997, Biochim. Biophys. Acta. 1354:40-4), плацентарным трансформирующим фактором роста β (placental transforming growth factor beta, PTGFB) (Lawton L.N., 1997, Gene. 203:17-26), фактором, полученным из предстательной железы (prostate derived factor, PDF) (Paralkar V.M., 1998, J. Biol. Chem. 273:137 60-7) и геном, активируемым нестероидными противовоспалительными лекарственными препаратами (nonsteroidal anti-inflammatory drug-activated gene, NAG-1) (Baek S.J., 2001, J. Biol. Chem. 276: 33384-92).
Ген GDF15 человека расположен на хромосоме 19р13.2-13.1; ген GDF15 крысы расположен на хромосоме 16; и ген GDF15 мыши расположен на хромосоме 8. Открытые рамки считывания GDF15 распространяются на два экзона (Bottner M., 1999, Gene. 237:105-11 и NCBI). Зрелый пептид GDF15 обладает низкой гомологией с другими членами семейства (Katoh M., 2006, Int. J. Mol. Med. 17:951-5).
GDF15 синтезируется в виде большого белка-предшественника, который расщепляется в двухосновном сайте расщепления с высвобождением карбокситерминального зрелого пептида.
Препропептиды GDF15 мыши и крысы содержат по 303 аминокислоты. Полноразмерный белокпредшественник человека содержит 308 аминокислот. Зрелые пептиды грызунов после процессинга по сайту расщепления RGRR (SEQ ID NO:1) содержат по 115 аминокислот. Зрелый пептид человека после процессинга по сайту расщепления RGRRRAR (SEQ ID NO:2) содержит 112 аминокислот. Сходство последовательности зрелого пептида GDF15 человека с последовательностями зрелого пептида GDF15 крысы и мыши составляет 66,1 и 68,1% (Bottner M., 1999, Gene. 237:105-11; Bauskin A.R., 2000, EMBO J. 19:2212-20; NCBI). В зрелом пептиде GDF15 отсутствует сайт гликозилирования.
Зрелый пептид GDF15 содержит семь консервативных остатков цистеина, необходимых для образования мотива цистеиновый узел (который содержит три внутрицепочечные дисульфидные связи) и одной межцепочечной дисульфидной связи, которые типичны для членов суперсемейства TGFe. Зрелый пептид GDF15 также содержит два дополнительных остатка цистеина, образующих четвертую внутрицепочечную дисульфидную связь. Биологически активный GDF15 представляет собой гомодимер зрелого пептида с молекулярной массой 25 кДа, ковалентно связанный одной межцепочечной дисульфидной связью.
Сообщалось, что уровни циркулирующего GDF15 увеличиваются при многих патологических и физиологических состояниях, в особенности при беременности (Moore A.G., 2000. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85: 4781-4788), β-талассемии (Tanno T., 2007, Nat. Med. 13:1096-101; Zimmermann M.B., 2008 Am. J. Clin. Nutr. 88:1026-31) и врожденной дизэритропоэтической анемии (Tamary H., 2008, Blood. 112:5241-4). В опубликованных сообщениях GDF15 также связывали с множеством биологических активностей. Исследования нокаута GDF15 и трансгенных мышей свидетельствуют, что GDF15 может защищать от повреждений сердца, вызванных ишемией/реперфузией или перегрузкой (Kempf Т., 2006, Circ. Res.98:351-60; Xu J., 2006, Circ. Res. 98:342-50), защищать от связанной с возрастом утраты моторных и сенсорных нейронов (Strelau J., 2009, J. Neurosci. 29:13640-8), в умеренной степени защищать от метаболического ацидоза в почках, а также может вызывать истощение у пациентов, страдающих от рака (Johnen H., 2007 Nat Med. 11:1333-40). Несколько групп ученых также исследовали роль GDF15 в апоптозе и пролиферации клеток, в результате чего при применении различных культур клеток и ксенотрансплантатных моделей были получены противоречивые результаты. Исследования на трансгенных мышах показали, что GDF15 защищает от новообразований в кишечнике и легком, вызванных канцерогеном или мутацией Apc (Baek S.J., 2006, Gastroenterology. 131:1553-60; Cekanova M., 2009, Cancer Prev. Res. 2:450-8).
Краткое описание изобретения
В настоящей заявке предложены гибридные белки, содержащие полипептид GDF15 или мутантный полипептид GDF15 и Fc-домен.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения Fc-домен содержит последовательность, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO:16, 22, 28, 29, 33, 35, 38, 48, 85, 91, 106, 132, 141, 148, 155, 162, 169, 176, 183, 192, 199, 206, 213, 220, 227, 233, 236, 268, 275, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301 и 302. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид GDF15 или мутантный полипептид GDF15 содер- 1 037355 жит последовательность, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO:4, 8, 12, 25, 52 и 55. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок также содержит полипептидный линкер. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидный линкер содержит последовательность, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO:18, 30, 34, 40, 58, 61, 64, 69, 72, 75, 78, 113, 116, 119, 122, 125, 128. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит два или более Fc-доменов. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит два или более полипептидных линкеров. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит последовательность, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 46, 24, 27, 32, 37, 20, 42, 50, 54, 57, 60, 63, 66, 68, 71, 74, 77, 82, 84, 88, 93, 96, 98, 100, 102, 104, 108, 134, 137, 139, 143, 146, 150, 153, 269, 272, 276, 279, 157, 160, 164, 167, 171, 174, 178, 181, 185, 188, 194, 197, 201, 204, 208, 211, 215, 218, 222, 225, 229, 232, 233, 238 и 240.
Также в настоящей заявке предложены димеры, содержащие (i) первую полипептидную цепь, которая содержит один из вышеупомянутых гибридных белков, и (ii) вторую полипептидную цепь, которая содержит Fc-домен. Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения указанная конструкция также содержит последовательность, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 16, 22, 28, 29, 33, 35, 38, 48, 85, 91, 106, 132, 141, 148, 155, 162, 169, 176, 183, 192, 199, 206, 213, 220, 227, 233, 236, 268, 275, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301 и 302.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения первая и вторая полипептидные цепи соединены нековалентным образом. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения первая и вторая полипептидные цепи соединены ковалентным образом. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения первая и вторая полипептидные цепи являются ковалентно связанными посредством дисульфидных связей между соответствующими Fc-доменами. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения первая и вторая полипептидные цепи соединены посредством как ковалентных, так и нековалентных взаимодействий.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен димер, который содержит: (а) два гибридных белка, содержащих последовательность SEQ ID NO:46; (b) два гибридных белка, содержащих последовательность SEQ ID NO:24; или (с) два гибридных белка, содержащих последовательность SEQ ID NO:27.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен димер, который содержит (а) два гибридных белка, содержащих последовательность SEQ ID NO:32; или (b) два гибридных белка, содержащих последовательность SEQ ID NO:37.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен димер, который содержит первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:20, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:17.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен димер, который содержит (а) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:42, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:39; (b) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:50, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:47; (с) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:54, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:47; (d) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:57, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:47; (е) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:60, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:47; (f) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:63, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:47; (g) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:66, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:47; (h) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:68, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:47; (i) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:71, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:47; (j) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:74, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:47; (k) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:77, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:47; (l) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:80, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:47; (m) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:82, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:47; или (n) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:84, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:47.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен димер, который содержит (а) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:88, и вторую
- 2 037355 полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:86; (b) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:93, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:90; (с) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:96, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:90; (d) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:98, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:90; (е) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:100, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:90; (f) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:102, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:90; (g) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:104, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:90; или (h) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:108, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:105.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен димер, который содержит (а) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:112, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:12; (b) две полипептидные цепи, каждая из которых содержит последовательность SEQ ID NO:112; (с) две полипептидные цепи, каждая из которых содержит последовательность SEQ ID NO:115; (d) две полипептидные цепи, каждая из которых содержит последовательность SEQ ID NO:118; (е) две полипептидные цепи, каждая из которых содержит последовательность SEQ ID NO:121; (f) две полипептидные цепи, каждая из которых содержит последовательность SEQ ID NO:124; (g) две полипептидные цепи, каждая из которых содержит последовательность SEQ ID NO:127; (h) две полипептидные цепи, каждая из которых содержит последовательность SEQ ID NO:130; или (i) две полипептидные цепи, каждая из которых содержит последовательность SEQ ID NO:242.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен димер, который содержит: (а) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:134, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:131; (b) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:137, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:131; (с) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:139, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:131; (d) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:143, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:140; (е) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:146, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:140; (f) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:150, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:147; (g) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:153, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:147; (h) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:269, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:267; (i) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:272, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:267; (j) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:276, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:274; или (k) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:279, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:274.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен димер, который содержит: (а) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:157, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:154; (b) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:160, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:154; (с) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:164, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:161; (d) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:167, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO :161.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен димер, который содержит: (а) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:171, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:168; или (b) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:174, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:168.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен димер, который содержит: (а) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:178, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:175; (b) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:181, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:175; (с) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:185, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:182; (d) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:188, и вторую полипептид
- 3 037355 ную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:182; (е) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:194, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:191; (f) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:197, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:191; (g) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:201, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:198; или (h) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:204, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:198.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен димер, который содержит: (а) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:208, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:205; (b) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:211, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:205; (с) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:215, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:212; или (d) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:218, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:212.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен димер, который содержит: (а) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:222, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:219; (b) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:225, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:219; (с) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:229, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:226; или (d) первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:232, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:226.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен димер, который содержит: (а) две полипептидные цепи, каждая из которых содержит последовательность SEQ ID NO:235; (b) две полипептидные цепи, каждая из которых содержит последовательность SEQ ID NO:238; или (с) две полипептидные цепи, каждая из которых содержит последовательность SEQ ID NO:240.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит (i) первый димер, содержащий один из вышеуказанных димеров, и (ii) второй димер, содержащий один из вышеуказанных димеров. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь первого димера связана с первой полипептидной цепью второго димера посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой димер, выбранный из группы, включающей DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+), DhCpmFc(+)-(G4S)4GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15(H6D):DhCpmFc(+), DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(H6D): DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(N3Q):DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc (+)-G4-GDF 15 :DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF 15 :DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF 15: DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(L351C), DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15: DhCpmFc(-)(Y349C), CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+), Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15, Fc-(G4S)3-FcGS(G4S)4-GDF15 и Fc-(G4S)5-Fc-GS(G4S)4-GDF15.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой димер, выбранный из группы, включающей DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+), DhCpmFc(+)-(G4S)4GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15(H6D):DhCpmFc(+), DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(H6D): DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(N3Q):DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc (+)-G4-GDF 15 :DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF 15 :DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF 15: DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(L351C) и DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15: DhCpmFc(-)(Y349C).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок представляет собой белок, выбранный из группы, включающей Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15, Fc-(G4S)3-Fc-GS (G4S)4GDF15 и Fc-(G4S)5-Fc-GS (G4S)4-GDF15.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой димер, выбранный из группы, включающей DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(L351C) и DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(Y349C).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой: DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+), DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc(-)-(G4S)4GDF 15(H6D):DhCpmFc(+), DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF 15(H6D) :DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-(G4S)4GDF15(N3Q):DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-G4-GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF15:DhCpmF (-), DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)(L351C)G4-GDF15:DhCpmFc(-)(L351C), DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(Y349C), CpmFc(-)-(G4S)4GDF15:CpmFc(+), Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15, Fc-(G4S)3-Fc-GS(G4S)4-GDF15 или Fc-(G4S)5-Fc-GS
- 4 037355 (G4S)4-GDF15.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой
DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+), DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc(-)-(G4S)4GDF 15(H6D):DhCpmFc(+), DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF 15(H6D) :DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-(G4S)4GDF15(N3Q):DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-G4-GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)(L351C)G4-GDF15:DhCpmFc(-)(L351C) или DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(Y349C).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок не представляет собой белок, выбранный из группы, включающей Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15, Fc-(G4S)3-Fc-GS (G4S)4-GDF15 и Fc-(G4S)5-Fc-GS(G4S)4-GDF15.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок не представляет собой белок, выбранный из группы, включающей DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-) (L351C) и DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(Y349C).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой DhCpmFc(-)-(G4S)4GDF15(H6D): DhCpmFc(+). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(H6D):DhCpmFc(-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(N3Q): DhCpmFc(-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой DhCpmFc(+)-GDF15:DhCpmFc(-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой DhCpmFc(+)-G4-GDF15:DhCpmFc(-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF15:DhCpmFc (-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF15:DhCpmFc(-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(L351C). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой DhCpmFc(+) (S354C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(Y349C). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой Fc- (G4S) 8-Fc-GS (G4S)4-GDF15. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой Fc(G4S)3-Fc-GS (G4S)4-GDF15. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер не представляет собой Fc-(G4S)5-Fc-GS (G4S)4-GDF15.
Также в настоящей заявке предложены гибридные белки, содержащие полипептид GDF15 или мутантный полипептид GDF15 и полипептид сывороточный альбумин человека (Human serum albumin, HSA). Согласно следующему варианту реализации настоящего изобретения последовательность полипептида HSA представляет собой последовательность SEQ ID NO:110. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид GDF15 или мутантный полипептид GDF15 содержит последовательность, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO:4, 8, 12, 25, 52 и 55. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок также содержит полипептидный линкер, который соединяет полипептид GDF15 или мутантный полипептид GDF15 с полипептидом HSA. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептидный линкер содержит последовательность, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO:18, 30, 34, 40, 58, 61, 64, 69, 72, 75, 78, 113, 116, 119, 122, 125, 128. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит два или более полипептидов HSA. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит последовательность, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 115, 118, 121, 124, 127 и 130.
Также в настоящей заявке предложены димеры, содержащие (i) первую полипептидную цепь, которая содержит гибридный белок, содержащий первую область GDF15 и первый полипептид HSA, и (ii) вторую полипептидную цепь, которая содержит второй полипептид HSA. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь также содержит вторую область GDF15. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер представляет собой гетеродимер (т.е. первая и вторая полипептидные цепи содержат различные последовательности). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер представляет собой гомодимер (т.е. первая и вторая полипептидные цепи содержат одинаковую последовательность). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит последовательность, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 115, 118, 121, 124, 127 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит последовательность, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 115, 118, 121, 124, 127 и 130. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения первая и вторая полипептидные цепи соединены нековалентным образом. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пер- 5 037355 вая и вторая полипептидные цепи соединены ковалентным образом. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит вторую область GDF15, и первая и вторая полипептидные цепи соединены ковалентным образом посредством дисульфидных связей между соответствующими областями GDF15 данных цепей. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения первая и вторая полипептидные цепи соединены посредством как ковалентных, так и нековалентных взаимодействий.
Также в настоящей заявке предложены димеры, содержащие (i) первую полипептидную цепь, которая содержит гибридный белок, содержащий первую область GDF15 и полипептид HSA, и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую вторую область GDF15. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит последовательность, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 115, 118, 121, 124, 127 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит последовательность, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 4, 8, 12, 25, 52 и 55. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения первая и вторая полипептидные цепи соединены нековалентным образом. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения первая и вторая полипептидные цепи соединены ковалентным образом. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения первая и вторая полипептидные цепи соединены посредством как ковалентных, так и нековалентных взаимодействий.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой графическое изображение, представляющее конструкцию knob-hole (выступ-впадина), содержащую димер, который состоит из двух гетеродимеров DhknobFc-(G4S)4GDF15:DhholeFc;
фиг. 2 - графическое изображение, представляющее конструкцию DhMonoFc, содержащую димер, который состоит из двух гибридных белков DhMonoFc-(G4S)4-GDF15;
фиг. 3 - графическое изображение, представляющее конструкцию HemiFc, содержащую димер, который состоит из двух гибридных белков GGGFc-(G4S)4-Fc-S(G4S)4-GDF15;
фиг. 4 - графическое изображение, представляющее конструкцию charged pair (заряженная пара, delHinge), содержащую димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)-(G4S)2-GDF15: DhCpmFc(+);
фиг. 5 - графическое изображение, представляющее конструкцию charged pair (заряженная пара, delHinge) cysteine clamp (цистеиновый хомут), содержащую димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(L351 C)-(G4S)2-GDF 15 :DhCpmFc(-)(L3 51C);
фиг. 6 - графическое изображение, представляющее конструкцию HSA (сывороточный альбумин человека), содержащую димер, состоящий из двух гибридных белков HSA- (G4S)4-GDF15;
фиг. 7 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhknobFc-G4GDF15:DhholeFc на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела (МТ)) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 8 - график, демонстрирующий влияние применения димера гибридного белка Fc-(G4S)4-GDF15 на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 9 - график, демонстрирующий влияние применения димера гибридного белка Fc-(G4S)4GDF15(H6D) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 10 - график, демонстрирующий влияние применения димера гибридного белка Fc-(G4S)4-Fc(G4S)4-GDF15 на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 11 - график, демонстрирующий влияние применения димера гибридного белка DhFc-(G4S)5DhFc-(G4S)4-GDF15 на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 12 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(+)-(1K)GDF15:DhCpmFc(-) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 13 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-)GDF15:DhCpmFc(+) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 14 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-)GDF15(N3D):DhCpmFc(+) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 15 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-)GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 16 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-)-G4GDF15(N3D):DhCpmFc(+) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зави- 6 037355 симости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 17 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-)-G4SGDF15:DhCpmFc(+) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 18 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-)-(G4S)2GDF15:DhCpmFc(+) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 19 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-)-(G4S)2GDF15(N3D):DhCpmFc(+) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 20 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-)-(G4Q)2GDF15(N3D):DhCpmFc(+) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 21 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-)-G4PGDF15:DhCpmFc(+) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 22 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-)-(G4P)2GDF15:DhCpmFc(+) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 23 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-)-G4QGDF15:DhCpmFc(+) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 24 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-)-(G4Q)2GDF15(N3D):DhCpmFc(+) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 25 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-)-(G4Q)2GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 26 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(+) (Y349C)-GDF15(N3D):DhCpmFc(-)(S354C) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 27 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-) (Y349C)-GDF15:DhCpmFc(+)(S354C) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 28 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-) (Y349C)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(S354C) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 29 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-) (Y349C)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(S354C) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 30 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-) (Y349C)-G4-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(S354C) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 31 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-) (Y349C)-(G4S)2-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(S354C) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 32 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-) (Y349C)-(G4Q)2-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(S354C) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 33 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-) (L351C)-(G4S)2-GDF15:DhCpmFc(+)(L351C) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 34 - график, демонстрирующий влияние применения димера гибридного белка HSAGSAAQAAQQGS-GDF15 на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 35 - график, демонстрирующий влияние применения димера гибридного белка HSAGSPAPAPGS-GDF15 на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 36 - график, демонстрирующий влияние применения димера гибридного белка HSAGS(AAQAAQQ)2GS-GDF15 на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 37 - график, демонстрирующий влияние применения димера гибридного белка HSA- 7 037355
GS(PAPAP)2GS-GDF15 на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 38 - график, демонстрирующий влияние применения димера гибридного белка HSA-GDF15 на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 39 - график, демонстрирующий влияние применения димера гибридного белка HSAGGNAEAAAKEAAAKEAAAKAGG-GDF15 на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 40 - график, демонстрирующий влияние применения димера гибридного белка HSA-(G4S)6GDF15 на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 41 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-) (N297G)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(N297G) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 42 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-) (N297G)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(N297G) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 43 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-) (N297G)(Y349C)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(N297G)(S354C) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 44 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-) (N297G)(Y349C)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(N297G)(S354C) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 45 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-) (N297G)(L351C)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(N297G)(L351C) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 46 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-) (N297G) (L351C)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+) (N297G) (L351C) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 47 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера DhCpmFc(-) (N297G)(А287С)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(N297G)(L306C) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 48 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера CpmFc(-)(N297G)GDF15(Ndel3):CpmFc(+)(N297G) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 49 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(N297G) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 50 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+)(N297G) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 51 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера Dh3CpmFc(-) (Y349C)-GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+)(N297G)(S354C) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 52 - график, демонстрирующий влияние применения димера гетеродимера Dh3CpmFc(-) (Y349C)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(-)(N297G)(S354C) на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 53 - график, демонстрирующий влияние применения димера гибридного белка DhMonoFc(N297G)-GDF15 на потребление пищи (грамм пищи/грамм массы тела) мышами ob/ob в зависимости от дозы (log [грамм конструкции/кг МТ]);
фиг. 54 - график массы тела (г) в зависимости от времени (дни после 1-й инъекции) при введении наполнителя, 0,1, 1 и 10 нмоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+) и 0,1, 1 и 10 нмоль димера гетеродимера Dh3ComFc(-)-GDF15(Ndel3);
фиг. 55 - столбчатую диаграмму площади под кривой (AUC) для теста толерантности к глюкозе в неделю 2 введения (а) наполнителя (b) 10 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D): Dh3CpmFc(+), (с) 1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+), (d) 0,1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+), (е) 10 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+) (g) 1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+) или (g) 0,1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel): Dh3CpmFc(+);
фиг. 56 - столбчатую диаграмму уровня инсулина (нг/мл) (после приема пищи) в неделю 3 введения (а) наполнителя, (b) 10 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+), (с) 1
- 8 037355 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+), (d) 0,1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+), (е) 10 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+), (g) 1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3):
Dh3CpmFc(+) или (g) 0,1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel):Dh3CpmFc(+);
фиг. 57 - столбчатую диаграмму уровня триглицеридов (мг/мл) (после приема пищи) в неделю 3 введения (а) наполнителя, (b) 10 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+), (с) 1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+), (d) 0,1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+), (е) 10 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+), (g) 1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3): Dh3CpmFc(+) или (g) 0,1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel):Dh3CpmFc(+);
фиг. 58 - столбчатую диаграмму уровня холестерола (мг/мл) (после приема пищи) в неделю 3 введения (а) наполнителя, (b) 10 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+), (с) 1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+), (d) 0,1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+), (е) 10 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+), (g) 1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3): Dh3CpmFc(+) или (g) 0,1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel):Dh3CpmFc(+);
фиг. 59 - столбчатую диаграмму площади под кривой (AUC) для теста толерантности к глюкозе в неделю 5 введения (а) наполнителя, (b) 10 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+), (с) 1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+), (d) 0,1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+), (е) 10 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+), (g) 1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+) или (g) 0,1 ммоль димера гетеродимера Dh3CpmFc(-)GDF 15(Ndel):Dh3 CpmFc(+);
фиг. 60 - столбчатую диаграмму, демонстрирующую связывание, определенное методом НИР поверхностного плазмонного резонанса (ЕО, единицы ответа), в отношении FcyRI, FcyRIIIA и FcyRIIA для (а) димера DhCpmFc(-)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+), (b) димера DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3): DhCpmFc(+)(S354C); (с) димера Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+); (d) димера Dh3CpmFc(-) (Y349C)-GDF15(Ndel3)Dh3CpmFc(+)(S354C); (e) димера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+); и (f) димера Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+)(S354C) (слева направо в отношении каждого рецептора);
фиг. 61 - столбчатую диаграмму, демонстрирующую первую Tm (°С), определенную методом ДСК (дифференциальной сканирующей калориметрии), в отношении (а) (для пары столбцов, подписанных N3D) димера DhCpmFc(-)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+) и димера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D): Dh3CpmFc(+); (b) (для пары столбцов, подписанных Ndel3) димера DhCpmFc(-)-GDF15(Ndel3): DhCpmFc(+) и димера Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+); (с) (для пары столбцов, подписанных N3D+CC) димера DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(S354C) и димера Dh3CpmFc(-) (Y349C)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+)(S354C); и (d) (для пары столбцов, подписанных Ndel3+CC) димера DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(S354C) и димера Dh3CpmFc(-)(Y349C)GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+)(S354C).
Подробное описание изобретения
В изобретении предложены гибридные белки, содержащие полипептид GDF15 или мутантные полипептиды GDF15, и конструкции, содержащие такие гибридные белки. Также предложено получение и применения раскрытых молекул, например, при лечении метаболического нарушения, такого как диабет 2 типа, увеличение уровней глюкозы, увеличение уровней инсулина, дислипидемия или ожирение. Нолипептиды GDF15, мутантные полипептиды GDF15 и определенные полипептидные конструкции, содержащие полипептиды GDF15 и мутантные полипептиды GDF15, описаны в заявках того же заявителя PCT/US2012/032415, поданной 5 апреля 2012, и РСТ/2013/023465, поданной 28 января 2013, которые явным образом включены посредством ссылки в настоящую заявку для любой цели.
Способы на основе рекомбинантных полипептидов и нуклеиновой кислоты, используемые в настоящей заявке, в том числе в примерах, в общем виде изложены в руководствах Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) или Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994).
I. Общие определения.
Согласно концепции термины, приведенные в настоящей заявке в единственном числе, означают один или несколько перечисленных объектов, если конкретно не указано обратное.
В настоящей заявке термины аминокислота и остаток используются взаимозаменяемо и при использовании в контексте пептида или полипептида означают как существующие в природе, так и синтетические аминокислоты, а также аналоги аминокислот, миметики аминокислот и несуществующие в природе аминокислоты, которые с химической точки зрения являются подобными существующим в природе аминокислотам.
Термины существующая в природе аминокислота и кодируемая в природе аминокислота ис- 9 037355 пользуются взаимозаменяемо и означают аминокислоту, которая кодируется генетическим кодом, а также аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом, модифицированные после синтеза, например гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и О-фосфосерин.
Аналог аминокислоты представляет собой соединение, которое обладает такой же основной химической структурой, что и существующая в природе аминокислота, т.е. α-углерод, который связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группой, например гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионин-метил-сульфоний. Такие аналоги могут содержать модифицированные Rгруппы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные скелеты, но сохраняют ту же основную химическую структуру, которой обладает существующая в природе аминокислота.
Миметик аминокислоты представляет собой химическое соединение, структура которого отличается от общей химической структуры аминокислоты, но которая функционирует способом, аналогичным способу функционирования существующей в природе аминокислоты. Примеры включают метакриолильное или акриолильное производное амида, β-, γ-, δ-иминокислоты (такие как пиперидин-4-карбоновая кислота) и подобные соединения.
Термины несуществующая в природе аминокислота и некодируемая в природе аминокислота используются взаимозаменяемо и означают соединение, которое обладает той же основной химической структурой, что и существующая в природе аминокислота, но которое не встраивается в растущую полипептидную цепь комплексом трансляции. Термин несуществующая в природе аминокислота также включает, но не ограничивается ими, аминокислоты, которые образуются в результате модификации (например, пост-трансляционных модификаций) кодируемой в природе аминокислоты (включая, но не ограничиваясь ими, 20 общепринятых аминокислот), но которые в природе сами по себе не встраиваются в растущую полипептидную цепь комплексом трансляции. Неограничивающий перечень примеров несуществующих в природе аминокислот, которые могут быть включены в последовательность полипептида или на которые может быть заменен остаток дикого типа в последовательности полипептида, включает β-аминокислоты, гомоаминокислоты, циклические аминокислоты и аминокислоты с дериватизированными боковыми цепями. Примеры включают (в L-форме или D-форме; сокращенное название приведено в скобках): цитруллин (Cit), гомоцитруллин (hCit), Να-метилцитруллин (NMeCit), Ναметилгомоцитруллин (Να-MeHoCit), орнитин (Orn), Να-метилорнитин (Να-MeOrn или NMeOrn), саркозин (Sar), гомолизин (hLys или hK), гомоаргинин (hArg или hR) , гомоглутамин (hQ), Να-метиларгинин (NMeR), Να-метиллейцин (Na-MeL или NMeL), N-метилгомолизин (NMeHoK), Να-метилглутамин (NMeQ), норлейцин (Nle), норвалин (Nva), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин (Tic), октагидроиндол-2карбоновую кислоту (Oic), 3-(1-нафтил)аланин (1-Nal), 3-(2-нафтил)аланин (2-Nal), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин (Tic), 2-инданилглицин (Igl), пара-иодфенилаланин (pl-Phe), пара-аминофенилаланин (4AmP или 4-Amino-Phe), 4-гуанидинофенилаланин (Guf), глициллизин (сокращенно называемый Κ(Νεглицил) или К(глицил) или K(gly)), нитрофенилаланин (nitrophe), аминофенилаланин (aminophe или Amino-Phe), бензилфенилаланин (benzylphe), γ-карбоксиглутаминовую кислоту (γ-carboxyglu), гидроксипролин (hydroxypro), п-карбоксил-фенилаланин (Сра), α-аминоадипиновую кислоту (Aad), Ναметилвалин (NMeVal), Ν-α-метиллейцин (NMeLeu), Να-метилнорлейцин (NMeNle), циклопентилглицин (Cpg), циклогексилглицин (Chg), ацетиларгинин (acetylarg), α,β-диаминопропионовую кислоту (Dpr), α,γ-диаминомасляную кислоту (Dab), диаминопропионовую кислоту (Dap), циклогексилаланин (Cha), 4метил-фенилаланин (MePhe), β,β-дифенил-аланин (BiPhA), аминомасляную кислоту (Abu), 4-фенилфенилаланин (или бифенилаланин; 4Bip), α-амино-изомасляную кислоту (Aib), β-аланин, βаминопропионовую кислоту, пиперидиновую кислоту, аминокапроновую кислоту, аминогептановую кислоту, аминопимелиновую кислоту, десмозин, диаминопимелиновую кислоту, N-этилглицин, Νэтиласпарагин, гидроксилизин, аллогидроксилизин, изодесмозин, аллоизолейцин, N-метилглицин, Νметилизолейцин, N-метилвалин, 4-гидроксипролин (Hyp), γ-карбоксиглутамат, ε-Ν,Ν,Ν-триметиллизин, ε-Ν-ацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, ω-метиларгинин, 4-амино-О-фталевую кислоту (4АРА), N-ацетилглюкозаминил-L-серин, Nацетилглюкозиламинил-L-треонин, О-фосфотирозин и другие подобные аминокислоты и дериватизированные формы любой из перечисленных аминокислот.
Также в определение несуществующая в природе аминокислота включена любая аминокислота, имеющая структуру
НА соон где R-группа представляет собой любой заместитель, отличный от заместителей, которые используются в двадцати природных аминокислотах.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения некодируемая в природе ами- 10 037355 нокислота содержит карбонильную группу. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения некодируемая в природе аминокислота имеет структуру (CH2jfiR1COR2
R3HN COR4 где n представляет собой 0-10; R1 представляет собой алкил, арил, замещенный алкил или замещенный арил; R2 представляет собой Н, алкил, арил, замещенный алкил и замещенный арил; R3 представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую амино-конец, и R4 представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую карбокси-конец.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения некодируемая в природе аминокислота содержит аминоокси-группу. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения некодируемая в природе аминокислота содержит группу гидразида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения некодируемая в природе аминокислота содержит группу гидразина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения остаток некодируемой в природе аминокислоты содержит группу семикарбазида.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения остаток некодируемой в природе аминокислоты содержит азидную группу. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения некодируемая в природе аминокислота имеет структуру:
r2hn cor3 где n представляет собой 0-10; R1 представляет собой алкил, арил, замещенный алкил, замещенный арил или отсутствует; X представляет собой О, N, S или отсутствует; m представляет собой 0-10; R2 представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую амино-конец, и R3 представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую карбокси-конец.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения некодируемая в природе аминокислота содержит алкинную группу. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения некодируемая в природе аминокислота имеет структуру (CH2)hR1X(CH2)hCCH
R2HN COR3 где n представляет собой 0-10; R1 представляет собой алкил, арил, замещенный алкил или замещенный арил; X представляет собой О, N, S или отсутствует; m представляет собой 0-10, R2 представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую амино-конец, и R3 представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую карбокси-конец.
Термин замещенный означает, что атом водорода в молекуле или группе заменен группой или атомом, который называют заместителем. Типичные заместители включают: галоген, С1-8алкил, гидроксил, С1-8алкокси, -NRxRx, нитро, циано, галоген- или пергалогенС1-8алкил, С2-8алкенил, С2-8алкинил, SRx, -S(=O)2Rx, -С(=O)ORx, -C(=O)Rx, где каждый Rx представляет собой независимо водород или С1С8алкил. Следует отметить, что, когда заместитель представляет собой -NRxRx, группы Rx могут быть объединены посредством атома азота с образованием кольца.
Термин алкил означает углеводород с неразветвленной или разветвленной цепью. Типичные примеры алкильных групп включают метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, трет-бутил, вторбутил, пентил и гексил. Типичные алкильные группы представляют собой алкильные группы, содержащие от 1 до 8 атомов углерода; такие группы широко представлены С1-8алкилом.
Термин алкокси означает алкильную группу, присоединенную к атому кислорода. Типичные примеры алкокси-групп включают метокси, этокси, трет-бутокси, пропокси и изобутокси. Распространенные алкокси-группы представляют собой С1-8алкокси.
Термин галоген означает хлор, фтор, бром или иод.
Термин алкенил означает углеводород с неразветвленной или разветвленной цепью, содержащий одну или несколько двойных связей углерод-углерод. Типичные примеры алкенильных групп включают винил, пропенил, аллил, бутенил и 4-метилбутенил. Распространенные алкенильные группы представляют собой С2-8алкенил.
Термин алкинил означает углеводород с неразветвленной или разветвленной цепью, содержащий
- 11 037355 одну или несколько тройных связей углерод-углерод. Типичные примеры алкинильных групп включают этинил, пропинил (пропаргил) и бутинил.
Распространенные алкинильные группы представляют собой С2-8алкинил.
Термин циклоалкил означает циклический неароматический углеводород. Примеры циклоалкильных групп включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил.
Циклоалкильная группа может содержать одну или несколько двойных связей. Примеры циклоалкильных групп, содержащих двойные связи, включают циклопентенил, циклогексенил, циклогексадиенил и циклобутадиенил. Распространенные циклоалкильные группы представляют собой С3-8циклоалкильные группы.
Термин перфторалкил означает алкильную группу, в которой все атомы водорода были замещены атомами фтора. Распространенные перфторалкильные группы представляют собой C1-8перфторалкuл. Пример распространенной перфторалкильной группы представляет собой -CF3.
Термин ацил означает группу, полученную из органической кислоты путем удаления гидроксильной группы (-ОН). Например, ацильная группа СН3С(=О)- образована в результате удаления гидроксильной группы из СН3С(=0)ОН.
Термин арил означает циклический ароматический углеводород. Примеры арильных групп включают фенил и нафтил. Распространенные арильные группы представляют собой от шести- до тринадцатичленные кольца.
Термин гетероатом в настоящей заявке означает атом кислорода, азота или серы.
Термин гетероарил означает циклический ароматический углеводород, в котором один или несколько атомов углерода арильной группы были замещены гетероатомом. Если гетероарильная группа содержит более одного гетероатома, гетероатомы могут быть одинаковыми или различными. Примеры гетероарильных групп включают пиридил, пиримидинил, имидазолил, тиенил, фурил, пиразинил, пирролил, индолил, триазолил, пиридазинил, индазолил, пуринил, хинолизинил, изохинолил, хинолил, нафтиридинил, хиноксалинил, изотиазолил и бензо[b]тиенил. Распространенные гетероарильные группы представляют собой от пяти- до тринадцатичленные кольца, содержащие 1-4 гетероатома. Гетероарильные группы, которые представляют собой пяти- или шестичленные кольца, содержащие от 1 до 3 гетероатомов, являются особенно распространенными.
Термин гетероциклоалкил означает циклоалкильную группу, в которой один или несколько атомов углерода были замещены гетероатомом. Если гетероциклоалкильная группа содержит более одного гетероатома, гетероатомы могут быть одинаковыми или различными. Примеры гетероциклоалкильных групп включают тетрагидрофурил, морфолинил, пиперазинил, пиперидинил и пирролидинил. Гетероциклоалкильная группа может также содержать одну или несколько двойных связей, но не являться ароматической. Примеры гетероциклоалкильных групп, содержащих двойные связи, включают дигидрофуран. Распространенные гетероциклоалкильные группы представляют собой от трех- до десятичленные кольца, содержащие 1-4 гетероатома.
Гетероциклоалкильные группы, которые представляют собой пяти- или шестичленные кольца, содержащие 1 -2 гетероатома, являются особенно распространенными.
Также следует отметить, что циклические кольцевые группы, т.е. арил, гетероарил, циклоалкил и гетероциклоалкил, могут содержать более одного кольца. Например, нафтильная группа представляет собой конденсированную бициклическую кольцевую систему. Также предполагается, что настоящее изобретение включает кольцевые группы, содержащие мостиковые атомы, или кольцевые группы, имеющие спиро-ориентацию.
Типичные примеры пяти- и шестичленных ароматических колец, необязательно содержащих один или два гетероатома, представляют собой фенил, фурил, тиенил, пирролил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, изоксазолил, изотиазолил, пиридинил, пиридиазинил, пиримидинил и пиразинил.
Типичные примеры частично насыщенных, полностью насыщенных или полностью ненасыщенных пяти-восьмичленных колец, необязательно содержащих один-три гетероатома, представляют собой циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклоактил и фенил. Дополнительные примеры пятичленных колец представляют собой фурил, тиенил, пирролил, 2-пирролинил, 3-пирролинил, пирролидинил, 1,3диоксоланил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, 2Н-имидазолил, 2-имидазолинил, имидазолидинил, пиразолил, 2-пиразолинил, пиразолидинил, изоксазолил, изотиазолил, 1,2-дитиолил, 1,3-дитиолил, 3Н-1,2оксатиолил, 1,2,3-оксадиазолил, 1,2,4-оксадиазолил, 1,2,5-оксадиазолил, 1,3,4-оксадиазолил, 1,2,3-триазолил, 1,2,4-триазолил, 1,3,4-тиадиазолил, 3Н-1,2,3-диоксазолил, 1,2,4-диоксазолил, 1,3,2-диоксазолил, 1,3,4-диоксазолил, 5Н-1,2,5-оксатиазолил и 1,3-оксатиолил.
Дополнительные примеры шестичленных колец представляют собой 2Н-пиранил, 4Н-пиранил, пиридинил, пиперидинил, 1,2-диоксинил, 1,3-диоксинил, 1,4-диоксанил, морфолинил, 1,4-дитианил, тиоморфолинил, пиндазинил, пиримидинил, пиразинил, пиперазинил, 1,3,5-триазинил, 1,2,4-триазинил, 1,2,3-триазинил, 1,3,5-тритианил, 4Н-1,2-оксазинил, 2Н-1,3-оксазинил, 6Н-1,3-оксазинил, 6Н-1,2-оксазинил, 1,4-оксазинил, 2Н-1,2-оксазинил, 4Н-1,4-оксазинил, 1,2,5-оксатиазинил, 1,4-оксазинил, о-изоксазинил, п-изоксазинил, 1,2,5-оксатиазинил, 1,2,6-(3-оксатиазинил), 1,4,2-оксадиазинил.
Дополнительные примеры семичленных колец представляют собой азепинил, оксепинил, тиепинил
- 12 037355 и 1,2,4-триазепинил.
Дополнительные примеры восьмичленных колец представляют собой циклооктил, циклооктенил и циклооктадиенил.
Примеры бициклических колец, состоящих из двух конденсированных частично насыщенных, полностью насыщенных или полностью ненасыщенных пяти- и/или шестичленных колец, необязательно содержащих от одного до четырех гетероатомов, представляют собой индолизинил, индолил, изоиндолил, индолинил, циклопента(b)пиридинил, пирано(3,4-Ъ)пирролил, бензофурил, изобензофурил, бензо(b)тиенил, бензо(с)тиенил, 1Н-индазолил, индоксазинил, бензоксазолил, антранилил, бензимидазолил, бензтиазолил, пуринил, хинолинил, изохинолинил, циннолинил, фталазинил, хиназолинил, хиноксалинил, 1,8-нафтиридинил, птеридинил, инденил, изоинденил, нафтил, тетралинил, декалинил, 2Н-1бензопиранил, пиридо(3,4-Ъ)пиридинил, пиридо(3,2-Ъ)пиридинил, пиридо(4,3-Ъ)-пиридинил, 2Н-1,3бензоксазинил, 2Н-1,4-бензоксазинил, 1Н-2,3-бензоксазинил, 4Н-3,1-бензоксазинил, 2Н-1,2-бензоксазинил и 4Н-1,4-бензоксазинил.
Циклическая кольцевая группа может быть присоединена к другой группе более чем одним способом. Если конкретное расположение связей не указано, включены все возможные расположения. Например, термин пиридил включает 2-, 3- или 4-пиридил, и термин тиенил включает 2- или 3-тиенил.
Термин выделенная молекула нуклеиновой кислоты означает одно- или двухцепочечный полимер оснований дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов, считываемых от 5'-конца к З'-концу (например, последовательность нуклеиновой кислоты GDF15, предложенная в настоящей заявке), или аналог указанного полимера, который был отделен по меньшей мере от приблизительно 50% полипептидов, пептидов, липидов, углеводов, полинуклеотидов или других веществ, с которыми данную нуклеиновую кислоту обнаруживают в природе, когда суммарную нуклеиновую кислоту выделяют из клеток источника. Предпочтительно выделенная молекула нуклеиновой кислоты по существу свободна от любых других загрязняющих молекул нуклеиновой кислоты или других молекул, которые обнаружены в природном окружении нуклеиновой кислоты, препятствующих ее применению для получения полипептида или применению в терапии, диагностике, профилактике или исследовании.
Термин выделенный полипептид означает полипептид (например, полипептид GDF15 или мутантный полипептид GDF15, предложенные в настоящей заявке), который был отделен по меньшей мере от приблизительно 50% полипептидов, пептидов, липидов, углеводов, полинуклеотидов или других веществ, с которыми данный полипептид обнаруживают в природе, когда его выделяют из клеток источника. Предпочтительно выделенный полипептид по существу свободен от любых других загрязняющих полипептидов или других загрязняющих веществ, которые обнаружены в его природном окружении, препятствующих его применению в терапии, диагностике, профилактике или исследовании.
Термин кодирующий означает полинуклеотидную последовательность, кодирующую одну или несколько аминокислот. Данный термин не требует наличия старт- или стоп-кодона. Аминокислотная последовательность может кодироваться в любой из различных рамок считывания, которые содержит полинуклеотидная последовательность.
Термины идентичный и процент идентичности в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются аналогичными. Процент идентичности означает процент идентичных остатков среди аминокислот или нуклеотидов в сравниваемых молекулах; процент идентичности рассчитывают на основе размера наименьшей молекулы среди молекул, подвергаемых сравнению. Для данных расчетов с учетом пропусков (gap) в выравниваниях (в случае наличия таковых) можно прибегнуть к конкретной математической модели или компьютерной программе (т.е. алгоритму). Способы, которые можно применять для расчета идентичности выровненных нуклеиновых кислот или полипептидов, включают способы, описанные в руководствах Computational Molecular Biology, (Lesk A.M., ed.), (1988) New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects (Smith D.W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin A.M., and Griffin H.G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje G. (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer (Gribskov M. and Devereux J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; и Carillo et al. (1988) SIAM J. Applied Math. 48:1073.
При расчете процента идентичности последовательности, подвергаемые сравнению, выравнивают таким способом, который обеспечивает максимальное совпадение последовательностей. Компьютерная программа, которую используют для определения процента идентичности, представляет собой пакет программ GCG, который включает GAP (Devereux et al. (1984) Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). Компьютерный алгоритм GAP используют для выравнивания двух полипептидов или полинуклеотидов, для которых проводят определение процента идентичности последовательности. Последовательности выравнивают для максимального совпадения соответствующих аминокислот или нуклеотидов данных последовательностей (сходного участка, который определяется алгоритмом). Вместе с алгоритмом используют штраф за введение пропуска (gap opening penalty, который рассчитывают как умноженная на 3 средняя диагональ, где средняя диагональ представляет собой среднюю величину диагонали используемой матрицы сравнения; диагональ представляет
- 13 037355 собой балл или количественный показатель, назначаемый за каждое полное совпадение аминокислот в соответствии с конкретной матрицей сравнения) и штраф за удлинение пропуска (gap extension penalty, который обычно составляет 1/10 долю от штрафа за введение пропуска), а также матрицу сравнения, такую как РАМ 250 или BLOSUM 62. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения в данном алгоритме также используется стандартная матрица сравнения (см. публикацию Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5: 345-352 для матрицы сравнения РАМ 250; публикацию Henikoff et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10915-10919 для матрицы сравнения BLOSUM 62).
Рекомендуемые параметры для определения процента идентичности полипептидной или нуклеотидной последовательности с применением программы GAP являются следующими:
алгоритм: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-13;
матрица сравнения: BLOSUM 62 из Henikoff et al., 1992, выше;
штраф за пропуск в последовательности (Gap Penalty): 12 (штрафы за концевые пропуски отсутствуют);
штраф за длину пропуска (Gap Length Penalty): 4;
порог подобия (Threshold of Similarity): 0.
Определенные схемы выравнивания для выравнивания двух аминокислотных последовательностей могут привести к совпадению только короткого участка двух последовательностей, и данный небольшой выровненный участок может обладать очень высокой идентичностью последовательности даже при отсутствии значительной взаимосвязи между двумя полноразмерными последовательностями. Соответственно, выбранный метод выравнивания (например, программа GAP) можно при необходимости откорректировать, чтобы обеспечить выравнивание, которое охватывает по меньшей мере 50 последовательных аминокислот целевого полипептида.
Термин полипептид GDF15 означает существующий в природе GDF15 или GDF15 дикого типа, который экспрессируется у млекопитающих, включая, без ограничения, человека, кролика, обезьяну (например, яванского макака), собаку, крысу, мышь или свинью. Согласно одному аспекту настоящего изобретения полипептид GDF15 означает любой полноразмерный GDF15, например SEQ ID NO:4, который состоит из 308 аминокислотных остатков и который кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:3; любую форму, содержащую активный домен и продомены полипептида, например SEQ ID NO:8, которая состоит из 279 аминокислотных остатков и кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:7 и в которой 29 аминокислотных остатков на амино-терминальном конце полноразмерного GDF15 (т.е. остатки, образующие сигнальный пептид) были удалены; и любую форму GDF15, содержащую активный домен, из которой были удалены продомен и сигнальная последовательность, например SEQ ID NO:12, которая состоит из 112 аминокислотных остатков и кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:11, из которой были удалены сигнальная последовательность и продомен. Полипептиды GDF15 могут содержать, но не обязательно содержат, амино-концевой метионин, который может быть введен генно-инженерным способом или в результате процесса экспрессии в бактерии.
Термин мутантный полипептид GDF15 означает полипептид GDF15 (например, согласно SEQ ID NO:4, 8 или 12), который был модифицирован. Такие модификации включают, но не ограничены ими, замены одной или нескольких аминокислот, в том числе замены несуществующими в природе аминокислотами, несуществующими в природе аналогами аминокислот и миметиками аминокислот, делеции или добавления. Согласно одному аспекту настоящего изобретения термин мутантный полипептид GDF15 означает полипептид GDF15, в котором по меньшей мере один остаток, который в норме присутствует в данном положении существующего в природе полипептида GDF15, был удален или замещен остатком, который в норме не присутствует в данном положении существующего в природе полипептида GDF15. В некоторых случаях необходимо заменить единичный остаток, который в норме присутствует в данном положении в последовательности существующего в природе полипептида GDF15, более чем одним остатком, который в норме не присутствует в данном положении; в других случаях может быть необходимо сохранить последовательность существующего в природе полипептида GDF15 и встроить один или несколько остатков в данном положении белка; в других случаях может быть необходимо удалить данный остаток полностью; все данные конструкции охватываются термином мутантный полипептид GDF15.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения мутантный полипептид GDF15 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 85% идентична существующему в природе полипептиду GDF15 (например, SEQ ID NO:4, 8 или 12). Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения мутантный полипептид GDF15 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 90% или приблизительно на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности существующего в природе полипептида GDF15 (например, SEQ ID NO:4, 8 или 12). Такие мутантные полипептиды GDF15 предпочтительно, но не обязательно, обладают по меньшей мере одной активностью существующего в природе полипептида GDF15, такой как способность уменьшать уровни глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерола в крови; способность уменьшать массу тела; способность улучшать толерантность к глюко- 14 037355 зе, толерантность к липидам или чувствительность к инсулину; или способность уменьшать уровень глюкозы в моче и выведение белка.
Термин область GDF15 охватывает полипептиды GDF15 и мутантные полипептиды GDF15 и последовательности, определенные выше.
Полипептид GDF15 или мутантный полипептид GDF15 являются предпочтительно биологически активными. В некоторых случаях для лечения или облегчения метаболического нарушения у субъекта применяют полипептид GDF15 или мутантный полипептид GDF15 вида или происходящий из вида, отличного от вида субъекта. В некоторых случаях для лечения или облегчения метаболического нарушения у субъекта применяют полипептид GDF15 или мутантный полипептид GDF15 того же вида или происходящий из того же вида, что и субъект.
Термин нативная Fc означает молекулу или последовательность, содержащую последовательность, отличную от последовательности антиген-связывающего фрагмента, полученную в результате расщепления целого антитела, которая представлена в мономерной или мультимерной форме. Исходный иммуноглобулин - источник нативной Fc - предпочтительно получен из человека и может представлять собой любой иммуноглобулин, однако предпочтительными являются IgG1 и IgG2. Нативные Fc состоят из мономерных полипептидов, которые могут быть объединены в димерные или мультимерные формы в результате ковалентного (т.е. посредством дисульфидных связей) и нековалентного связывания. Количество внутримолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных молекул Fc варьирует от 1 до 4 в зависимости от класса (например, IgG, IgA, IgE) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2). Примером нативной Fc является связанный дисульфидной связью димер, полученный в результате расщепления IgG папаином (см. публикацию Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). Термин нативная Fc в настоящей заявке является общим для мономерной, димерной и мультимерной форм.
Термин вариант Fc означает молекулу или последовательность, которая является модифицированной относительно нативной Fc. Такие модификации включают, но не ограничены ими, замены одной или нескольких аминокислот, в том числе замены несуществующими в природе аминокислотами, несуществующими в природе аналогами аминокислот и миметиками аминокислот, делеции или добавления. Таким образом, термин вариант Fc включает молекулу или последовательность, которая представляет собой гуманизированную нативную Fc, отличную от Fc человека. Более того, нативная Fc содержит сайты, которые могут быть удалены, поскольку данные сайты отвечают за структурные свойства или биологическую активность, которые не требуются для гибридных молекул согласно настоящему изобретению. Таким образом, термин вариант Fc включает молекулу или последовательность, в которой отсутствуют один или несколько сайтов или остатков нативной Fc, влияющие на или вовлеченные в (1) образование дисульфидной связи, (2) несовместимость с избранной клеткой-хозяином (3) N-терминальную гетерогенность после экспрессии в избранной клетке-хозяине, (4) гликозилирование, (5) взаимодействие с комплементом, (6) связывание с Fc-рецептором, отличным от рецептора реутилизации, или (7) антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC). Варианты Fc описаны более подробно ниже. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения вариант Fc содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 85% идентична нативной Fc. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вариант Fc содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 90% или приблизительно на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична нативной Fc.
Термин Fc-домен охватывает молекулы и последовательности нативной Fc и варианта Fc, как определено выше. Как и в случае вариантов Fc и нативных Fc, термин Fc-домен включает молекулы в мономерной или мультимерной форме.
Термин мультимер применительно к Fc-доменам или молекулам, содержащим Fc-домены, означает молекулы, содержащие две или более полипептидных цепей, соединенных ковалентным образом, нековалентным образом или посредством как ковалентных, так и нековалентных взаимодействий. Молекулы IgG, как правило, образуют димеры; IgM - пентамеры; IgD - димеры; и IgA мономеры, димеры, тримеры или тетрамеры. Мультимеры могут быть получены путем использования последовательности и полученной в результате активности нативного Ig - источника Fc либо путем получения производных такой нативной Fc.
Термин димер применительно к Fc-доменам или молекулам, содержащим Fc-домены, означает молекулы, содержащие две полипептидные цепи, соединенные ковалентным образом, нековалентным образом или посредством как ковалентных, так и нековалентных взаимодействий.
Термин шарнир или шарнирная область в настоящей заявке включает подвижный полипептид, содержащий аминокислоты, расположенные между первым и вторым константными доменами антитела. Шарнирная область в настоящей заявке означает последовательность области, составляющей 6-62 аминокислоты в длину и присутствующей только в IgA, IgD и IgG, которая охватывает остатки цистеина, образующие мостики между двумя тяжелыми цепями.
Полипептидный линкер означает короткий полипептид, обычно составляющий от 1 до 30 аминокислотных остатков в длину, который ковалентным образом связывает два полипептида вместе, как пра- 15 037355 вило, посредством пептидных связей.
В настоящей заявке термин полипептид HSA охватывает существующий в природе сывороточный альбумин человека дикого типа. Данный термин также включает различные биологически активные фрагменты и варианты, гибридные белки и модифицированные формы белка HSA дикого типа. Такие биологически активные фрагменты или варианты, гибридные белки и модифицированные формы белка HSA дикого типа содержат по меньшей мере часть аминокислотной последовательности, обладающей значительной идентичностью последовательности белка HSA дикого типа. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения такие биологически активные фрагменты или варианты, гибридные белки и модифицированные формы белка HSA дикого типа содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 85% идентичную последовательности дикого типа HSA. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения такие биологически активные фрагменты или варианты, гибридные белки и модифицированные формы белка HSA дикого типа содержат аминокислотную последовательность, по меньшей приблизительно на 90% или приблизительно на 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную последовательности HSA дикого типа.
II. Fc-слияния, содержащие полипептиды GDF15 или мутантные полипептиды GDF15, а также полинуклеотиды.
В настоящей заявке предложен ряд белков, гибридных с Fc, содержащих полипептид GDF15 или мутантный полипептид GDF15. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибридные белки содержат нативную Fc. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибридные белки содержат Fc-домен, который был сконструирован.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения Fc-гибридные белки, содержащие полипептид GDF15 (или мутантный полипептид GDF15), связаны с другой полипептидной цепью, состоящей из или содержащей Fc-домен, с образованием гетеродимера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения два таких гетеродимера объединяются с образованием гетеротетрамера. Некоторые из данных полипептидных конструкций (т.е. Fc-гибридные белки, содержащие полипептид GDF15 (или мутантный полипептид GDF15), и мультимеры, содержащие один или несколько таких Fcгибридных белков, содержащих полипептид GDF15 (или мутантный полипептид GDF15)) исследовали эмпирическим способом, как описано в примерах, представленных в настоящей заявке ниже.
Антитела относятся к классу белков иммуноглобулинов, который включает IgG, IgA, IgE, IgM и IgD. Наиболее многочисленным классом иммуноглобулинов в сыворотке человека является IgG (Deisenhofer J. 1981, Biochem. 20:2361-2370; Huber R. 1984, Behring Inst. Mitt. 76:1-14; Roux K.H. 1999, Int. Arch. Allergy Immunol. 120:85-99). Структура IgG включает четыре цепи, две легкие и две тяжелые цепи; каждая легкая цепь содержит по два домена, и каждая тяжелая цепь содержит по четыре домена. Антигенсвязывающий сайт расположен в Fab-домене (fragment antigen binding, антиген-связывающий фрагмент), который содержит вариабельный домен легкой (VL) и вариабельный домен тяжелой (VH) цепи, а также константный домен легкой (LC) и константный домен тяжелой (СН1) цепи. Область доменов СН2 и СН3 тяжелой цепи называют Fc (fragment crystallizable, кристаллизуемый фрагмент). Молекулу IgG можно рассматривать как гетеротетрамер, содержащий две тяжелые цепи, которые поддерживаются вместе дисульфидными связями (-S-S-) в шарнирной области, и две легкие цепи. Количество дисульфидных связей в шарнирной области среди подклассов иммуноглобулинов варьирует (Papadea С., 1989, Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 27:27-58). Сайт связывания FcRn расположен в Fc-домене антитела (Martin W.L., 2001, Mol. Cell 7:867-877), и, таким образом, свойство увеличенного периода полужизни антитела в сыворотке обеспечивается Fc-фрагментом. Fc-домен сам по себе можно рассматривать в качестве гомодимера, который состоит из тяжелых цепей, содержащих домены СН2 и СН3.
Согласно определенным предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения гибридные белки, описанные в настоящей заявке, содержат Fc-домен IgG, полученный из Fc-домена IgG человека дикого типа. Под Fc IgG человека дикого типа подразумевают последовательность аминокислот, которая в природе присутствует в популяции человека. Разумеется, поскольку последовательности Fc могут незначительно варьировать среди индивидуумов, в последовательности дикого типа могут быть введены одно или несколько изменений, и данная последовательность все еще будет относиться к объему настоящего изобретения. Например, Fc-домен может содержать дополнительные изменения, не связанные с настоящим изобретением, такие как мутация в сайте гликозилирования или встраивание неприродной аминокислоты. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, содержащий СН3-область, представляет собой молекулу IgG и также содержит СН1- и СН2домен. Примеры последовательностей IgG человека включают константные области IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Fc-домен также может содержаться в константной области тяжелой цепи IgA, IgD, IgE и IgM.
Некоторые Fc-гибридные белки, содержащие полипептид GDF15 или мутантный полипептид GDF15, и мультимеры, содержащие такие Fc-гибридные белки, включают описанные ниже.
П.А. Конструкции DhMonoFc.
Определения Mono- или MonoFc-домен в настоящем изобретении означают Fc-домен, который был сконструирован для уменьшения или предотвращения образования гомодимеров. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения MonoFc-домен получают посредством введения мутации
- 16 037355 тирозина на треонин (Y349T) и мутаций двух лизинов на аспарагиновую кислоту (K392D и K409D) в нативной Fc или варианте Fc.
С-терминальный лизин (K447) в MonoFc может быть необязательно удален. Данная модификация может иметь преимущество, например, когда пептид является гибридным с С-концом для уменьшения протеолиза гибридного белка.
Предложен гибридный белок, содержащий MonoFc-домен и область GDF15. Как правило, N-конец области GDF15 соединен напрямую или посредством полипептидного линкера с С-концом MonoFcдомена. Однако согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения N-конец MonoFcдомена соединен напрямую или посредством полипептидного линкера с С-концом области GDF15.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен димер, который содержит два таких гибридных белка, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер представляет собой гомодимер. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения димер представляет собой гетеродимер.
Определения DhMono- или DhMonoFc-домен в настоящем изобретении означают Fc-домен, из которого была удалена шарнирная область целиком либо ее часть и который был сконструирован для уменьшения или предотвращения образования гомодимеров. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен DhMonoFc-домен, в котором была введена мутация тирозина на треонин (Y349T) и мутации двух лизинов на аспарагиновую кислоту (K392D и K409D) в нативной Fc или варианте Fc, из которых была удалена шарнирная область целиком либо ее часть.
С-терминальный лизин (K447) в DhMonoFc может быть необязательно удален. Данная модификация может иметь преимущество, например, когда пептид является гибридным на С-конце, для уменьшения протеолиза гибридного белка.
Предложен гибридный белок, содержащий DhMonoFc-домен и область GDF15. Как правило, Nконец области GDF15 соединен напрямую или посредством полипептидного линкера с С-концом DhMonoFc-домена. Однако согласно некоторым вариантам реализации изобретения N-конец DhMonoFcдомена соединен напрямую или посредством полипептидного линкера с С-концом области GDF15.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен димер, который содержит два таких гибридных белка, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер представляет собой гомодимер. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения димер представляет собой гетеродимер.
И.А.1. DhMonoFc-GDF15.
Определение MonoFc-GDF15 в настоящем изобретении означает гибридный белок, содержащий полипептид GDF15, N-конец которого соединен напрямую с С-концом MonoFc-домена.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два таких гибридных белка, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения гомодимер содержит:
(а) два MonoFc-домена (в каждом мономере), содержащие последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVTTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:22), и (b) два полипептида GDF15 (в каждом мономере), содержащие последовательность SEQ ID NO:12.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVTTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPGARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL
S PREVQVTMCIGAG Р S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKPDTVPAPCCVPAS YN
PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:46),
- 17 037355 которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccc caaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgc gtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggta cgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagc agtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccag gactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccct cccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgag aaccacaggtgaccaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgc cgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgc ctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcacc gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgat gcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctc cgggtgcgcgcaacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgc cgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattg ggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcc cgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctg caccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccag ctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctcc agacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:45).
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, который содержит два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO:46.
П.А.2. DhMonoFc-(G4S)4-GDF15.
Определение DhMonoFc-(G4S)4-GDFI5 в настоящем изобретении означает гибридный белок, содержащий полипептид GDF15, связанный с DhMonoFc-доменом посредством полипептидного линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:18 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом DhMonoFc-домена.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два таких гибридных белка, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения гомодимер содержит: (a) два DhMonoFc-домена (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:22;
(b) два полипептида GDF15 (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12, и (c) два полипептидных линкера (в каждом мономере), содержащих последовательность GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:18), причем каждый линкер соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом DhMonoFc-домена.
Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой) APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVTTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRC CRLHTVRAS LE DLGWADWVL S PREVQVTMCIGAG Р S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID
NO:24), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 18 037355 cacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaaccc aaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggt ggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacg gcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaac agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggct gaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagccc ccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacag gtgaccaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcag cctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagt gggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtg ctggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggacaa gagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgagg ctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgga ggtggtggatccggaggcggtggaagcggaggtggtggatctggaggcgg tggaagcgcgcgcaacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgct gccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgat tgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtg cccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcc tgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgcc agetacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgteget ccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga (SEQ ID NO:23).
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, который содержит два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO:24.
П.А.3. DhMonoFc-(G4S)4-GDF15 (H6D).
Определение DhMonoFc-(G4S)4-GDF15(H6D) в настоящем изобретении означает гибридный белок, содержащий полипептид GDF15, соединенный с DhMonoFc-доменом посредством полипептидного линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:18 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом DhMonoFc-домена. Вариант GDF15(H6D) представляет собой существующий в природе вариант GDF15 человека.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два таких гибридных белка, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения гомодимер содержит: (a) два DhMonoFc-домена (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:22;
(b) два полипептида GDF15(H6D) (в каждом мономере), содержащих последовательность
ARNGDDCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPS QFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQT YDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:25), и (с) два полипептидных линкера (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:18, каждый из которых связывает N-конец полипептида GDF15 с С-концом DhMonoFc-домена.
Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVTTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHY Т QKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDDCРLGРGRC CRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTS LHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:27), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 19 037355 gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc Itgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgaccaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg aggtggtggatccggaggcggtggaagcggaggtggtggatctggaggcg gtggaagcgcgcgcaacggagacgactgtccgctcgggcccgggcgttgc tgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccga ttgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgt gcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagc ctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgc cagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgc tccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga (SEQ ID NO:2 6) .
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, который содержит два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO:27.
П.В. HemiFc.
Определения Hemi- или HemiFc-домен в настоящем изобретении означают полипептидную цепь, содержащую первый Fc-домен, соединенный напрямую или посредством полипептидного линкера со вторым Fc-доменом. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения первый Fc-домен и второй Fc-домен содержат одинаковую последовательность. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения первый Fc-домен и второй Fc-домен содержат различные последовательности. Как правило, первый и второй Fc-домены соединены ковалентным образом связанными посредством дисульфидных связей между соответствующими шарнирными областями данных доменов.
С-терминальный лизин (K447) может быть необязательно удален в первом Fc-домене, во втором Fcдомене или в обоих доменах. Данная модификация может иметь преимущество, например, когда пептид является гибридным на С-конце, для уменьшения протеолиза гибридного белка.
Предложен гибридный белок, содержащий HemiFc-домен и область GDF15. Как правило, N-конец области GDF15 соединен напрямую или посредством полипептидного линкера с С-концом HemiFcдомена. Однако согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения N-конец HemiFcдомена соединен напрямую или посредством полипептидного линкера с С-концом области GDF15.
Согласно определенным вариантам реализации изобретения предложен димер, который содержит два таких гибридных белка, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер представляет собой гомодимер. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения димер представляет собой гетеродимер. Графическое представление варианта реализации гомодимера, состоящего из двух гибридных белков GGG-Fc-(G4S)4-Fc-S(G4S)4-GDF15, см. на фиг. 3.
GGGFc-(G4S)4-Fc-S(G4S)4-GDF 15.
Определение GGGFc-(G4S)4-Fc-S(G4S)4-GDF15 в настоящем изобретении означает гибридный белок, содержащий полипептид GDF15, соединенный с HemiFc-доменом посредством первого полипептидного линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:30 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом HemiFc-домена. HemiFc-домен содержит первый Fc-домен, соединенный со вторым Fc-доменом посредством полипептидного линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:18 и который соединяет N-конец первого Fc-домена с С-концом второго Fc-домена (который содержит три остатка глицина, присоединенные к его N-концу).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два таких гибридных белка, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи
- 20 037355 между соответствующими областями GDF15 данных белков.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения гомодимер содержит:
(а) два вторых Fc-домена (в каждом мономере), содержащих последовательность (часть шарнирной области включена в скобки)
GGG(ERKSSVECPPCP)APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW
DVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWL
NGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:28), (b) два первых Fc-домена (в каждом мономере), содержащих последовательность (часть шарнирной области включена в скобки) (ERKSSVECPPCP)APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS
HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGK
EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC
LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:29).
(c) два вторых полипептидных линкера (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:18, которые соединяют N-конец первого Fc-домена с С-концом второго Fc-домена, (d) два полипептида GDF15 (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12, и (e) два первых полипептидных линкера (в каждом мономере), содержащих последовательность
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:30), которые соединяют N-конец полипептида GDF15 с С-концом первого Fc-домена.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность (часть шарнирной области включена в скобки; последовательность линкера подчеркнута двойной чертой)
GGG(ERKSSVECPPCP)APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW
DVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSСSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGG GS(ERKSSVECPPCP) APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWD VSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLN GKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL
TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVOVTMCIGAC PSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSL QTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:32), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 21 037355 ggaggtggagagcgcaaatcttctgtcgagtgcccaccgtgcccagcacc acctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggaca ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtg agccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaaaccacgggaggagcagttcaacagcacgt tccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggc aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtaca ccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacc tgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagag caatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggact ccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgca caaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtggaggtggcg gtagcggtggcggaggttcaggtggcggcggaagcggtggaggaggttca gagcggaaatccagcgttgaatgtcctccgtgccctgctccacccgtcgc ggggcctagtgtcttccttttccctccaaaaccaaaggatacactgatga tcagccggacccccgaggttacgtgcgtcgtcgtcgatgtctcccacgag gatccagaggtccaattcaactggtacgtggacggggtcgaggtgcataa tgcaaagacaaagccacgggaagagcagtttaactctactttccgcgtgg tttctgtgctgaccgtggtgcaccaagattggctcaacggcaaggagtac aagtgcaaggtaagcaataaggggctccctgcccccattgagaagactat ctccaagacaaagggacagccacgcgagccacaagtctatacactccccc cttcccgcgaagaaatgaccaagaatcaggttagcctgacatgcttggtt aagggtttctacccctctgacatagccgtggagtgggagagcaatggaca accagagaacaactacaagaccaccccacccatgctggatagcgacggtt cattctttctgtatagtaagcttaccgtggacaagtcccggtggcaacaa ggaaatgtcttttcatgctctgtgatgcacgaggccttgcataatcacta tactcagaagagcttgagcctcagccccggatctggaggtggcggatccg ggggcggtggaagcggaggtggtggatcgggaggcggtggaagcgcgcgc aacggcgaccactgtccgctcgggcccggacgttgctgccgtctgcacac ggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgc cacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttc cgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaa gcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatccca tggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgat gacttgttagccaaagactgccactgcatatga (SEQ ID NO:31).
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, который содержит два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO:32.
П.С. DhHemiFc.
Определения DhHemI- или DhHemiFc-домен в настоящем изобретении означают полипептидную цепь, содержащую первый Fc-домен, из которого была удалена шарнирная область целиком либо ее часть (домен DhFc), соединенный напрямую или посредством полипептидного линкера со вторым DhFc-доменом. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения удаляют 12 Nтерминальных аминокислот в шарнирной области, например ERKSSVECPPCP (SEQ ID NO:15). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения первый DhFc-домен и второй DhFc-домен содержат одинаковую последовательность. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения
- 22 037355 первый DhFc-домен и второй DhFc-домен содержат различные последовательности.
Предложен гибридный белок, содержащий DhHemiFc-домен и область GDF15. Как правило, Nконец области GDF15 соединен напрямую или посредством полипептидного линкера с С-концом DhHemiFc-домена. Однако согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения N-конец DhHemiFc-домена соединен напрямую или посредством полипептидного линкера с С-концом области GDF15.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен димер, который содержит два таких гибридных белка, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер представляет собой гомодимер. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения димер представляет собой гетеродимер.
GGGDhFc-(G4S)5-DhFc-S(G4S)4-GDF 15.
Определение GGGDhFc-(G4S)5-DhFc-S(G4S)4-GDF15 в настоящем изобретении означает гибридный белок, содержащий полипептид GDF15, соединенный с DhHemiFc-доменом посредством первого полипептидного линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:30 и который соединяет Nконец полипептида GDF15 с С-концом HemiFc-домена. HemiFc-домен содержит первый DhFc-домен, соединенный со вторым DhFc-доменом посредством полипептидного линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:34 и который соединяет N-конец первого DhFc-домена с С-концом второго DhFc-домена (который содержит три остатка глицина, присоединенные к его N-концу).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два таких гибридных белка, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения гомодимер содержит: (а) два вторых DhFc-домена (в каждом мономере), содержащих последовательность
GGGAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:33), (b) два первых DhFc-домена (в каждом мономере), содержащих последовательность APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDG
VEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAP IEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:35), (с) два вторых полипептидных линкера (в каждом мономере), содержащих последовательность GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO :34), которые соединяют N-конец первого DhFc-домена с С-концом второго DhFc-домена, (d) два полипептида GDF15 (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12, и (e) два первых полипептидных линкера (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:30, которые соединяют N-конец полипептида GDF15 с С-концом первого DhFc-домена.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой) GGGAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM
НЕALHNHY Т QKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAPРVAGР SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISK TKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVR ASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPD TVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:37),
- 23 037355 которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ggcggtggagctccgccggtggctggaccctcagtgttcctctttccacc gaagccgaaggacacccttatgattagccggaccccagaggtcacttgcg tcgtcgtggacgtgtcccatgaggatcccgaagtgcagtttaactggtat gtggacggagtggaggtccataacgccaagaccaagccaagggaagaaca gttcaatagcaccttccgggtggtgtccgtgctcaccgtggtgcatcaag actggctgaatggcaaagagtacaaatgtaaggtgtcaaacaaggggctc ccagcccctattgaaaagaccatctcaaagactaagggacagccacgcga acctcaagtgtataccctcccgccttcacgcgaagaaatgactaagaatc aggtcagccttacttgtctggtcaagggcttctacccgagcgacattgca gtcgaatgggagagcaatggtcagccagagaataactacaagaccactcc tcccatgcttgatagcgatggaagctttttcctttacagcaagcttactg tggataagtctcgctggcaacagggaaatgtgttcagctgttcagtgatg catgaagcactccacaatcattacacccagaagtcactcagcctctcacc cggaggaggaggcggttctggtggaggagggtctggaggtggagggagcg gcggaggcgggtctggcggtggtgggtctgagaggaagtcatcagtggaa tgcccaccatgccctgctcctcccgtggccggtccgagcgtgtttctctt cccacctaagcccaaggacactctgatgatctcacggactccggaagtga cttgtgtggtggtggacgtgtctcatgaggaccctgaagtgcagttcaac tggtacgtggacggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagaga ggaacagttcaattccacctttcgcgtggtgagcgtcctgaccgtcgtgc accaggactggcttaacggaaaggaatacaagtgcaaggtgtccaacaaa ggccttccagctcccattgagaaaaccatctctaaaactaagggtcaacc aagggaaccccaagtctacaccctccctccgtctagagaagagatgacca aaaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggattttacccctcagac atcgccgtggagtgggaaagcaacggacagcccgaaaacaactataagac tacccctcctatgctggactcagacggatctttcttcctctatagcaagc tcactgtggacaaatccagatggcaacaagggaatgtgttctcatgcagc gtgatgcacgaggctcttcacaaccactatacccagaagagcctgtctct ttcacctggttccggaggtggtgggagcggagggggtggatcaggtggtg gagggtccggaggcggaggatccgcacggaatggcgaccactgtccactg ggacccggaagatgttgtcgcctccacaccgtgagggcctctctggagga ccttggctgggccgactgggtcctgtcacctcgggaggtccaagtcaeca tgtgtatcggagcctgccccagccaattcagagcagcaaatatgcacgca садаttaagaccagcctgcatcggcttaaacctgatactgtgccggctcc ttgttgcgtgccagcatcttacaacccgatggtgctgatccagaaaaccg ataccggtgtctccctccagacttacgacgacctccttgcaaaggactgc cattgcatc (SEQ ID NO:36).
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, который содержит два мономера, содержащие последовательность SEQ ID NO:37.
II.D. Knob/Hole.
Определения knob- или knobFc-домен в настоящем изобретении означает Fc-домен, содержащий мутацию knob (выступ). Определения hole- или holeFc-домен в настоящем изобретении означают нативную Fc или вариант Fc, содержащий мутацию hole (впадина).
Мутации knob могут быть получены посредством замены небольших аминокислот боковых цепей большими аминокислотами, а мутации hole могут быть получены посредством замены больших аминокислот боковых цепей меньшими аминокислотами. См., например, публикации Ridgway JBB 1996, Protein Eng. 9:617-621; Merchant AM 1998, Nature Biotech. 16:677-681.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения домен knobFc получают посред- 24 037355 ством введения в последовательность Fc-домена мутации треонина на триптофан (T366W). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения домен holeFc получают посредством введения в последовательность Fc-домена мутации треонина на серин (T366S), мутации лейцина на аланин (L368A) и мутации тирозина на валин (Y407V).
С-терминальный лизин (K447) может быть необязательно удален в knobFc-домене, holeFc-домене или в обоих доменах. Данная модификация может иметь преимущество, например, когда пептид является гибридным на С-конце, для уменьшения протеолиза гибридного белка.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения домен DhknobFc получают посредством введения в последовательность Fc-домена, из которого была удалена шарнирная область целиком либо ее часть, мутации треонина на триптофан (T366W). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения домен DhholeFc получают посредством введения в последовательность Fcдомена, из которого была удалена шарнирная область целиком либо ее часть, мутации треонина на серин (T366S), мутации лейцина на аланин (L368A) и мутации тирозина на валин (Y407V).
С-терминальный лизин (K447) может быть необязательно удален в DhknobFc, DhholeFc, или в обоих доменах. Данная модификация может иметь преимущество, например, когда пептид является гибридным на С-конце, для уменьшения протеолиза гибридного белка.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую область GDF15, соединенную с holeFcдоменом напрямую или посредством полипептидного линкера, и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую knobFc-домен. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложен гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую область GDF15, соединенную с knobFc-доменом напрямую или посредством полипептидного линкера, и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую holeFc-домен.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую область GDF15, соединенную с DhholeFcдоменом напрямую или посредством полипептидного линкера, и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую DhknobFc-домен. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложен гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую область GDF15, соединенную с DhknobFc-доменом напрямую или посредством полипептидного линкера, и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую DhholeFc-домен.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, содержащий два таких гетеродимера, в которых гетеродимеры соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между областями GDF15 соответствующих первых полипептидных цепей данных гетеродимеров. Графическое представление варианта реализации гетеротетрамера, содержащего два гетеродимера, в котором каждый гетеродимер содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15, который соединен с DhknobFc-доменом посредством полипептидного линкера, и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую DhholeFc-домен, см. на фиг. 1.
DhknobFc- (G4S)4-GDF15:DhholeFc.
Определение DhknobFc-(G4S)4-GDF15:DhholeFc в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15, соединенный с DhknobFc-доменом посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:18 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом DhknobFc-домена, и (ii) полипептидную цепь, содержащую DhholeFc-домен.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, содержащий димер двух гетеродимеров DhknobFc-(G4S)4-GDF15:DhholeFc, в котором первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит (а) два DhknobFc-домена (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность:
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:16), (b) два DhholeFc-домена (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
- 25 037355
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO :281) , (c) два полипептида GDF15 (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12, и (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:18, каждый из которых связывает N-конец полипептида GDF15 с С-концом DhknobFc-домена посредством пептидных связей.
Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTOKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRC CRLHTVRAS LE DLGWADWVL S PREVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:20), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtca gcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg aggtggtggatccggaggcggtggaagcggaggtggtggatctggaggcg gtggaagcgcgcgcaacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgc tgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccga ttgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgt gcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagc ctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgc cagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgc tccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga (SEQ ID NO:19) .
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:17),
- 26 037355 которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtca gcctgagctgcgcggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttcctcgtcagcaagctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaa atga (SEQ ID NO:21)
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO:20, и два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO:17.
П.Е. Charged pair (заряженная пара, delHinqe).
Определение CpmFc(+) домен в настоящем изобретении означает Fc-домен, содержащий положительно заряженную пару мутаций. Определение CpmFc(-) домен в настоящем изобретении означает Fc-домен, содержащий отрицательно заряженную пару мутаций. Следует отметить, что использование терминов положительный и отрицательный предназначено для удобства описания (т.е. для описания природы заряженной пары мутаций в Fc-доменах) и не означает, что последовательность или конструкция в целом обязательно имеет положительный или отрицательный заряд.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения положительно заряженную пару мутаций получают посредством введения в последовательность Fc-домена мутации глутаминовой кислоты на лизин (Е356К) и мутации аспарагиновой кислоты на лизин (D399K). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения отрицательно заряженную пару мутаций получают посредством введения в последовательность Fc-домена мутаций двух лизинов на аспарагиновую кислоту (K392D, K409D).
При инкубации вместе остатки аспартата связываются с остатками лизина посредством электростатического взаимодействия, что облегчает образование гетеродимеров между доменами CpmFc(+) и доменами CpmFc(-) и уменьшает или предотвращает образование гетеродимеров между последовательностями CpmFc(+) или между последовательностями CpmFc(-).
С-терминальный лизин (K447) может быть необязательно удален в домене CpmFc(+), домене CpmFc(-) или в обоих доменах. Данная модификация может иметь преимущество, например, когда пептид является гибридным на С-конце, для уменьшения протеолиза гибридного белка.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения домен DhCpmFc(+) получают посредством введения в последовательность Fc-домена, из которого была удалена шарнирная область целиком либо ее часть, мутации глутаминовой кислоты на лизин (Е356К) и мутации аспарагиновой кислоты на лизин (D399K). Согласно одному варианту реализации изобретения домен DhCpmFc(-) получают посредством введения в последовательность Fc-домена, из которого была удалена шарнирная область целиком либо ее часть, мутаций двух лизинов на аспарагиновую кислоту (K392D, K409D).
При инкубации вместе остатки аспартата связываются с остатками лизина посредством электростатического взаимодействия, что облегчает образование гетеродимеров между доменами DhCpmFc(+) и доменами DhCpmFc(-) и уменьшает или предотвращает образование гомодимеров между последовательностями DhCpmFc(+) или между последовательностями DhCpmFc(-).
С-терминальный лизин (K447) может быть необязательно удален в DhCpmFc(+), DhCpmFc(-) или в обоих доменах. Данная модификация может иметь преимущество, например, когда пептид является гибридным на С-конце, для уменьшения протеолиза гибридного белка.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую область GDF15, соединенную с доменом CpmFc(+), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен CpmFc(-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения N-конец области GDF15 соединен с С-концом домена CpmFc(+) напрямую или посредством полипептидного линкера. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения N-конец домена CpmFc(+) соединен с С-концом области GDF15 напрямую или посредством полипептидного линкера.
- 27 037355
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложен гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую область GDF15, соединенную с доменом CpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен CpmFc(+). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения N-конец области GDF15 соединен с С-концом домена CpmFc(-) напрямую или посредством полипептидного линкера. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения N-конец домена CpmFc(-) соединен с С-концом области GDF15 напрямую или посредством полипептидного линкера.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую область GDF15, соединенную с доменом DhCpmFc(+), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения N-конец области GDF15 соединен с С-концом домена DhCpmFc(+) напрямую или посредством полипептидного линкера. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения N-конец домена DhCpmFc(+) соединен с С-концом области GDF15 напрямую или посредством полипептидного линкера.
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложен гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую область GDF15, соединенную с доменом DhCpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения N-конец области GDF15 соединен с С-концом домена DhCpmFc(-) напрямую или посредством полипептидного линкера. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения N-конец домена DhCpmFc(-) соединен с С-концом области GDF15 напрямую или посредством полипептидного линкера.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, содержащий димер, состоящий из двух таких гетеродимеров, в котором две первые полипептидные цепи гетеродимеров соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей. Графическое представление варианта реализации тетрамера, содержащего два гетеродимера, в котором каждый гетеродимер содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15, соединенную посредством полипептидного линкера с доменом DhCpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+), см. на фиг. 4.
П.Е. 1. DhCpmFc(+)-(1K)-GDF15:DhCpmFc(-).
Определение DhCpmFc(+)-(1K)-GDF15:DhCpmFc(-) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15, который соединен с доменом DhCpmFc(+) посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:40 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhCpmFc(+), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(-).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, содержащий димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(+)-(1K)-GDF15:DhCpmFc(-), в которых две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит (а) два домена DhCpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:38), (b) два домена DhCpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:282), (c) два полипептида GDF15 (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12, и (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность GSGSATGGSGSVASSGSGSATHL (SEQ ID NO:40), каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhCpmFc(+) посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная
- 28 037355 цепь содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTOKSLSLSPGGSGSATGGSGSVASSGSGSATHLARNGDHCPLGP GRCCRLHTVRAS LE DLGWADWVL S PREVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQI
KTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHC
I (SEQ ID NO:42), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gccccagagctgcttggtggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcc gaaggacaccctgatgatctcaagaactccggaagtgacttgcgtcgtcg tggacgtgtcacatgaggatccagaggtcaagttcaattggtatgtggac ggagtggaagtgcataacgccaagaccaaaccccgcgaagaacagtacaa tagcacctaccgcgtggtgagcgtccttactgtgctccaccaggactggc ttaatgggaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaaggccctccccgct cccatcgaaaagaccatctcaaaggcaaaggggcaaccaagggaacctca agtgtacaccctgcctccgagcaggaaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacttgtctcgtgaagggcttctatcccagcgatattgctgtggaa tgggagtcaaatggccagcccgagaataactacaaaactaccccacccgt gctgaaatctgatgggtccttcttcctttactccaagctgaccgtggaca agagccgctggcaacaaggcaatgtctttagctgctcagtgatgcatgag gctctccataatcactacactcagaagtcactgtccctgtcacctggcgg atccggttctgctactggtggttccggctccgtcgcaagctctggttcag gcagtgcgactcatctggcacggaacggggaccattgtcccctgggacct ggtcggtgctgccggcttcacaccgtcagagcctctctggaggaccttgg atgggctgattgggtgctgagccctcgggaggtgcaagtcaccatgtgca tcggggcctgccctagccagttccgcgcagccaacatgcacgctcagatc aaaacctctcttcacagactgaagcccgacaccgtgccagcaccttgctg tgtgccggcctcttataaccccatggtcctcattcagaaaaccgacaccg gagtgtcacttcagacttacgatgacctcctggccaaggactgccactgc ata (SEQ ID NO:41).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:39), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 29 037355 gcgccggaactgctgggcggcccgagcgtgtttctgtttccgccgaaacc gaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtgg tggatgtgagccatgaagatccggaagtgaaatttaactggtatgtggat ggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtataa cagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggc tgaacggcaaagaatataaatgcaaagtgagcaacaaagcgctgccggcg ccgattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgca ggtgtataccctgccgccgagccgcgaagaaatgaccaaaaaccaggtga gcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaa tgggaaagcaacggccagccggaaaacaactatgataccaccccgccggt gctggatagcgatggcagcttttttctgtatagcgatctgaccgtggata aaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaa gcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcaa a (SEQ ID NO:43).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:42, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:39.
П.Е.2. DhCpmFc(-)-GDF15:DhCpmFc(+).
Определение DhCpmFc(-)-GDF15:DhCpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15, N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, содержащий димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)-GDF15:DhCpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит (а) два домена DhCpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:283), (b) два домена DhCpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO :48), и (с) два полипептида GDF15 (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
- 30 037355
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL S PREVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKPDTVPAP CCVPAS YN PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:50), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt getggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgc gcgcaacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgc acacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctg tcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagcca gttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcc tgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaat cccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagaccta tgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:49).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:47), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 31 037355 gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccggaaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgt gctgaagtccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaa atga (SEQ ID NO:51).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:50, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:47.
II.E.3. DhCpmFc(-)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+).
Определение DhCpmFc(-)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую существующий в природе вариант GDF15, который содержит мутацию аспарагина на аспарагиновую кислоту (N3D) (GDF15(N3D)) и N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+). Мутация N3D может уменьшать гетерогенность, вызванную деамидированием.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, содержащий димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:283, (b) два домена DhCpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:48, и (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
ARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPS
Q FRAANMHAQIКТ S LHRLKP DТVPAPССVPAS YNPMVLIQKTDTGVSLQT YDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:52).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL S PREVQVTMCIGAC Р S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKP DTVPAP C CVPAS YN PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:54), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 32 037355 gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgc gcgcgacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgc acacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctg tcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagcca gttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcc tgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaat cccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagaccta tgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:53).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:51.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:54, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:47.
П.Е.4. DhCpmFc(-)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+).
Определение DhCpmFc(-)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую вариант GDF15, в котором первые три аминокислоты удалены (GDF15 (Ndel3) и N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+). Вариант Ndel3 может уменьшать деамидирование N3 и гетерогенность, вызванную изомеризацией D3.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:283, (b) два домена DhCpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:48, и (c) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность GDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFR AANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDD
LLAKDCHCI (SEQ ID NO:55).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
- 33 037355
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPR EVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMV LIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:57), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt getggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg agaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtcc gcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgg gaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggc ggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccg acacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtg ctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgactt gttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:56).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:51.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:57, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:47.
П.Е.5. DhCpmFc(-)-G4-GDF15 (N3D):DhCpmFc(+).
Определение DhCpmFc(-)-G4-GDF15(N3D):DhCpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), соединенный с доменом DhCpmFc(-) посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:58 и который соединяет N-конец полипептида GDF15(N3D) с С-концом домена DhCpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)-G4-GDF15(N3D):DhCpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:283, (b) два домена DhCpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:48, (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52, и (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность GGGG (SEQ ID NO:58),
- 34 037355 каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15(N3D) с С-концом домена DhCpmFc(-) посредством пептидных связей.
Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения первый полипептид содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGGGGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWA DWVL S PREVQVTMCIGAC Р S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKP DTVPAPC CVP ASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:60), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg aggtggtggagcgcgcgacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgtt gctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggcc gattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgc gtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacga gcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgccc gccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtc gctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:59).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:51.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:60, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:47.
П.Е.6. DhCpmFc(-)-G4S-GDF 15:DhCpmFc(+).
Определение DhCpmFc(-)-G4S-GDF15:DhCpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15, который соединен с доменом DhCpmFc(-) посредством полипептидного линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:61 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhCpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)-G4S-GDF15:DhCpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:283, (b) два домена DhCpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID
- 35 037355
NO:48, (c) два полипептида GDF15 (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12, и (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность GGGGS (SEQ ID NO:61), каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhCpmFc(-) посредством пептидных связей.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первый полипептид содержит аминокислотную последовательность (линкер подчеркнут двойной чертой)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGGGGQARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCV PASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:63), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc Itgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt getggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg aggtggtggatccgcgcgcaacggagaccactgtccgctcgggcccgggc gttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgg gccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcgg cgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaaga cgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtg cccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggt gtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatat ga (SEQ ID NO:62).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:51.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:63, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:47.
П.Е.7. DhCpmFc(-)-(G4S)2-GDF15:DhCpmFc(+).
Определение DhCpmFc(-)-(G4S)2-GDF15:DhCpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15, который соединен с доменом DhCpmFc(-) посредством полипептидного линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:64 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhCpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)-(G4S)2-GDF15:DhCpmFc(+), в кото- 36 037355 ром две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID
NO:283, (b) два домена DhCpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:48, (c) два полипептида GDF15 (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12, и (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность: GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:64), каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом последовательности DhCpmFc(-) посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (линкер подчеркнут двойной чертой)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTOKSLSLSPGGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASL EDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVP APCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:66), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg aggtggtggatccggaggcggtggaagcgcgcgcaacggagaccactgtc cgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctg gaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagt gaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgc acgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgcca gcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaa gaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaag actgccactgcata (SEQ ID NO:65).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:51.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:66, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:47.
- 37 037355
II.E.8. DhCpmFc(-)-(G4S)2-GDF15(N3D):DhCpmFc(+).
Определение DhCpmFc(-)-(G4S)2-GDF15(N3D):DhCpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), соединенный с доменом DhCpmFc(-) посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:64 и который соединяет N-конец полипептида GDF15(N3D) с С-концом домена DhCpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)-(G4S)2-GDF15(N3D):DhCpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:283, (b) два домена DhCpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:48, (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52, и (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:64, каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15(N3D) с С-концом домена DhCpmFc(-) посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTOKSLSLSPGGGGGSGGGGSARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASL EDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVP APCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:68), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag
- 38 037355 tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg aggtggtggatccggaggcggtggaagcgcgcgcgacggagaccactgtc cgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctg gaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagt gaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgc acgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgcca gcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaa gaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaag actgccactgcata (SEQ ID NO:67).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:51.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:68, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:47.
П.Е.9. DhCpmFc(-)-G4P-GDF15:DhCpmFc(+).
Определение DhCpmFc(-)-(G4P)-GDF15:DhCpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15, который соединен с доменом DhCpmFc(-) посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:69 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhCpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)-(G4P)-GDF15:DhCpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:283, (b) два домена DhCpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:48, (c) два полипептида GDF15 (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12, и (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность GGGGP (SEQ ID NO:69), каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhCpmFc(-) посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTOKSLSLSPGGGGGPARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVL S PREVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKPDTVPAPCCV PASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO :71) , которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 39 037355 gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt getggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg aggtggtggacccgcgcgcaacggagaccactgtccgctcgggcccgggc gttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgg gccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcgg cgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaaga cgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtg cccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggt gtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID
NO:7 0) .
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:51.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:71, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:47.
И.Е.10. DhCpmFc(-)-(G4P)2-GDF15:DhCpmFc (+).
Определение DhCpmFc(-)-(G4P)2-GDF15:DhCpmFc (+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15, который соединен с доменом DhCpmFc(-) посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:72 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhCpmFc(-), и (ii) вторую v, содержащую последовательность DhCpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)-(G4P)2-GDF15:DhCpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:283, (b) два домена DhCpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:48, (c) два полипептида GDF15 (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12, и (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность GGGG PGGGGP(SEQ ID NO:72), каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhCpmFc(-) посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой)
- 40 037355
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTOKSLSLSPGGGGGPGGGGPARNGDHGPLGPGRGGRLHTVRASL EDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVP APCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:74), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacacccteatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg aggtggtggacctggaggcggtggaccagcgcgcaacggagaccactgtc cgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctg gaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagt gaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgc acgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgcca gcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaa gaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaag actgccactgcatatga (SEQ ID NO:73).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:51.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:74, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:47.
П.Е.11. DhCpmFc(-)-G4Q-GDF15:DhCpmFc(+).
Определение DhCpmFc(-)-G4Q-GDF15:DhCpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15, который соединен с доменом DhCpmFc(-) посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:75 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhCpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)-G4Q-GDF15:DhCpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(а) две цепи DhCpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:283, (b) две цепи DhCpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:48, (c) два полипептида GDF15 (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12, и
- 41 037355 (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность GGGGQ (SEQ ID NO:75), каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhCpmFc(-) посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTOKSLSLSPGGGGGOARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVL S PREVQVTMCIGAC Р S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKPDTVPAPCCV PASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:77), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcactgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg aggtggtggacaggcgcgcaacggagaccactgtccgctcgggcccgggc gttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgg gccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcgg cgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaaga cgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtg cccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggt gtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatat ga (SEQ ID NO:76).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:51.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:77, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:47.
П.Е.12. DhCpmFc (-)-(G4Q)2-GDF15:DhCpmFc(+).
Определение DhCpmFc(-)-(G4Q)2-GDF15:DhCpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15, который соединен с доменом DhCpmFc(-) посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:78 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhCpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)-(G4Q)2-GDF15:DhCpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
- 42 037355
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(а) два домена DhCpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:283, (b) два домена DhCpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:48, (c) два полипептида GDF15 (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12, и (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность GGGGQGGGGQ (SEQ ID NO:78), каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhCpmFc(-) посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTOKSLSLSPGGGGGOGGGGOARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASL EDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVP APCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:80), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg aggtggtggacagggaggcggtggacaggcgcgcaacggagaccactgtc cgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctg gaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagt gaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgc acgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgcca gcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaa gaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaag actgccactgcatatga (SEQ ID NO:79).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:51.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:80, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:47.
П.Е.13. DhCpmFc (-)-(G4Q)2-GDF15(N3D):DhCpmFc(+).
Определение DhCpmFc(-)-(G4Q)2-GDF15(N3D):DhCpmFc(+) в настоящем изобретении означает
- 43 037355 гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), соединенный с доменом DhCpmFc(-) посредством линкера, который содержит последовательность SEQ
ID NO:78 и который соединяет N-конец полипептида GDF15(N3D) с С-концом домена DhCpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)-(G4Q)2-GDF15(N3D):DhCpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:283, (b) два домена DhCpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:48, (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52, и (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:78, каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15(N3D) с С-концом домена DhCpmFc() посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTOKSLSLSPGGGGGOGGGGOARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASL EDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVP APCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:82), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg aggtggtggacagggaggcggtggacaggcgcgcgacggagaccactgtc cgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctg gaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagt gaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgc acgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgcca gcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaa gaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaag actgccactgcata (SEQ ID NO:81).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, которая кодируется последователь- 44 037355 ностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:51.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:82, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:47.
И.Е.14. DhCpmFc(-)-(G4Q)2-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+).
Определение DhCpmFc(-)-(G4Q)2-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), соединенный с доменом DhCpmFc(-) посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:78 и который соединяет N-конец полипептида GDF15(Ndel3) с С-концом домена DhCpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)-(G4Q)2-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:283, (b) два домена DhCpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:48, (c) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:55, и (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:78, каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15(Ndel3) с С-концом домена DhCpmFc(-) посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGGGGQGGGGQGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDL GWADWVL S PREVQVTMCIGAG Р S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKPDTVPAPC CVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:84), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 45 037355 gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg aggtggtggacagggaggcggtggacagggagaccactgtccgctcgggc ccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctg ggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtg catcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcaga tcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgc tgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacac cggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccact gcata (SEQ ID NO:83).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:51.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:84, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:47.
II.F. Charged pair (заряженная пара, delHinqe) cysteine clamp (цистеиновый хомут).
Мутацию cysteine clamp (цистеиновый хомут) можно ввести в Fc-домен, такой как домен CpmFc(+), домен CpmFc(-), домен DhCpmFc(+) или домен DhCpmFc(-). Мутация cysteine clamp, как правило, включает введение цистеина в СН3-домен Fc-домена в конкретном положении посредством мутации так, что при инкубации с другим Fc-доменом, также содержащим цистеин, введенный в СН3домен в конкретном положении посредством мутации, между двумя Fc-доменами (например, между доменом CpmFc(+), содержащим мутацию cysteine clamp, и доменом CpmFc(-), содержащим мутацию cysteine clamp, или между доменом DhCpmFc(+), содержащим мутацию cysteine clamp, и доменом DhCpmFc(-), содержащим мутацию cysteine clamp) может образоваться дисульфидная связь (цистеиновый хомут). Fc-домен может содержать одну или несколько таких мутаций cysteine clamp.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения cysteine clamp получают посредством введения мутации серина на цистеин (S354C) в первом Fc-домене и мутации тирозина на цистеин (Y349C) во втором Fc-домене.
Определение домен DhCpmFc(-)(S354C) в настоящем изобретении означает домен DhCpmFc(-), содержащий мутацию серина на цистеин (S354C). Определение домен DhCpmFc(+) (S354C) в настоящем изобретении означает домен DhCpmFc(+), содержащий мутацию серина на цистеин (S354C).
Определение домен DhCpmFc(-)(Y349C) в настоящем изобретении означает домен DhCpmFc(-), содержащий мутацию серина на цистеин (Y349C). Определение домен DhCpmFc(+) (Y349C) в настоящем изобретении означает домен DhCpmFc(+), содержащий мутацию серина на цистеин (Y349C).
Определение домен CpmFc(-)(S354C) в настоящем изобретении означает домен CpmFc(-), содержащий мутацию серина на цистеин (S354C). Определение домен CpmFc(+) (S354C) в настоящем изобретении означает домен CpmFc(+), содержащий мутацию серина на цистеин (S354C). Определение домен CpmFc(-)(Y349C) в настоящем изобретении означает домен CpmFc(-), содержащий мутацию серина на цистеин (Y349C). Определение домен CpmFc(+) (Y349C) в настоящем изобретении означает домен CpmFc(+), содержащий мутацию серина на цистеин (Y349C).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения cysteine clamp получают посредством введения мутации лейцина на цистеин (L351C) в первом и Fc-домене.
- 46 037355
Определение домен DhCpmFc(-)(L351C) в настоящем изобретении означает домен DhCpmFc(-), содержащий мутацию серина на цистеин (L351C). Определение домен DhCpmFc(+) (L351C) в настоящем изобретении означает домен DhCpmFc(+), содержащий мутацию серина на цистеин (L351C).
Определение домен CpmFc(-)(L351C) в настоящем изобретении означает домен CpmFc(-), содержащий мутацию серина на цистеин (L351C). Определение домен CpmFc(+)(L351C) в настоящем изобретении означает домен CpmFc(+), содержащий мутацию серина на цистеин (L351C).
С-терминальный лизин (K447) может быть необязательно удален в домене CpmFc(+), домене CpmFc(-) или в обоих доменах. Данная модификация может иметь преимущество, например, когда пептид является гибридным на С-конце, для уменьшения протеолиза гибридного белка.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую область GDF15, соединенную с доменом CpmFc(+), содержащим мутацию cysteine clamp, и (ii) вторую полипептидную цепь, которая содержит домен CpmFc(-), содержащий мутацию cysteine clamp. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения N-конец области GDF15 соединен с С-концом домена CpmFc(+), содержащего мутацию cysteine clamp, напрямую или посредством полипептидного линкера. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения N-конец домена CpmFc(+), содержащего мутацию cysteine clamp, соединен с С-концом области GDF15 напрямую или посредством полипептидного линкера.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую область GDF15, соединенную с доменом CpmFc(-), содержащим мутацию cysteine clamp, и (ii) вторую полипептидную цепь, которая содержит домен CpmFc(+), содержащий мутацию cysteine clamp. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения N-конец области GDF15 соединен с С-концом домена CpmFc(-), содержащего мутацию cysteine clamp, напрямую или посредством полипептидного линкера. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения N-конец домена CpmFc(-), содержащего мутацию cysteine clamp, соединен с С-концом области GDF15 напрямую или посредством полипептидного линкера.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения предложен гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую область GDF15, соединенную с доменом DhCpmFc(+), содержащим мутацию cysteine clamp, и (ii) вторую полипептидную цепь, которая содержит домен DhCpmFc(-), содержащий мутацию cysteine clamp. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения N-конец области GDF15 соединен с С-концом домена DhCpmFc(+), содержащего мутацию cysteine clamp, напрямую или посредством полипептидного линкера. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения N-конец домена DhCpmFc(+), содержащего мутацию cysteine clamp, соединен с С-концом области GDF15 напрямую или посредством полипептидного линкера.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую область GDF15, соединенную с доменом DhCpmFc(-), содержащим мутацию cysteine clamp, и (ii) вторую полипептидную цепь, которая содержит домен DhCpmFc(+), содержащий мутацию cysteine clamp. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения N-конец области GDF15 соединен с С-концом домена DhCpmFc(-), содержащего мутацию cysteine clamp, напрямую или посредством полипептидного линкера. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения N-конец домена DhCpmFc(-), содержащего мутацию cysteine clamp, соединен с С-концом области GDF15 напрямую или посредством полипептидного линкера.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения предложен тетрамер, содержащий димер, состоящий из двух таких гетеродимеров, в котором две первые полипептидные цепи гетеродимеров соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей. Графическое представление варианта реализации тетрамера, содержащего два гетеродимера, в котором каждый гетеродимер содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15, соединенный посредством полипептидного линкера с доменом DhCpmFc(+)(L351C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(-)(L351C), см. на фиг. 5.
II.F.1. DhCpmFc(+)(S354C)-GDF15(N3D):DhCpmFc(-)(Y349C).
Определение DhCpmFc(+)(S354C)-GDF15(N3D):DhCpmFc(-)(Y349C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(+)(S354C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(-)(Y349C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С354 первой полипептидной цепи и С349 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(+)(S354C)-GDF15(N3D):DhCpmFc(-)(Y349C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит
- 47 037355 (а) два домена DhCpmFc(+)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:85), (b) два домена DhCpmFc(-)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:284), и (с) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL S PREVQVTMCIGAG Р S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKPDTVPAPCCVPAS YN PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO :88) , которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gccccagagctgcttggtggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcc gaaggacaccctgatgatctcaagaactccggaagtgacttgcgtcgtcg tggacgtgtcacatgaggatccagaggtcaagttcaattggtatgtggac ggagtggaagtgcataacgccaagaccaaaccccgcgaagaacagtacaa tagcacctaccgcgtggtgagcgtccttactgtgctccaccaggactggc ttaatgggaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaaggccctccccgct cccatcgaaaagaccatctcaaaggcaaaggggcaaccaagggaacctca agtgtacaccctgcctccgtgcaggaaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacttgtctcgtgaagggcttctatcccagcgatattgctgtggaa tgggagtcaaatggccagcccgagaataactacaaaactaccccacccgt gctgaaatctgatgggtccttcttcctttactccaagctgaccgtggaca agagccgctggcaacaaggcaatgtctttagctgctcagtgatgcatgag gctctccataatcactacactcagaagtcactgtccctgtcacctggcgc gcgcgacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgc acacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctg tcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagcca gttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcc tgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaat cccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagaccta tgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:87).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
- 48 037355
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:86), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt getggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaa a (SEQ ID NO:89).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:88, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:86.
II.F.2. DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15:DhCpmFc(+)(S354C).
Определение DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15:DhCpmFc(+)(S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15, Nконец которого соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(-)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+)(S345C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С349 первой полипептидной цепи и С354 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15:DhCpmFc(+) (S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит: (а) два домена DhCpmFc(+) (S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:285), (b) два домена DhCpmFc(-)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO :91), и (с) два полипептида GDF15 (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID
NO:12.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
- 49 037355
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL SPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYN PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:93), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgc gcgcaacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgc acacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctg tcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagcca gttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcc tgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaat cccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagaccta tgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:92).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:90), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 50 037355 gccccagagctgcttggtggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcc gaaggacaccctgatgatctcaagaactccggaagtgacttgcgtcgtcg tggacgtgtcacatgaggatccagaggtcaagttcaattggtatgtggac ggagtggaagtgcataacgccaagaccaaaccccgcgaagaacagtacaa tagcacctaccgcgtggtgagcgtccttactgtgctccaccaggactggc ttaatgggaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaaggccctccccgct cccatcgaaaagaccatctcaaaggcaaaggggcaaccaagggaacctca agtgtacaccctgcctccgtgcaggaaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacttgtctcgtgaagggcttctatcccagcgatattgctgtggaa tgggagtcaaatggccagcccgagaataactacaaaactaccccacccgt gctgaaatctgatgggtccttcttcctttactccaagctgaccgtggaca agagccgctggcaacaaggcaatgtctttagctgctcagtgatgcatgag gctctccataatcactacactcagaagtcactgtccctgtctccgggtaa a (SEQ ID NO:94).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:93, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:90.
II.F.3. DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(S354C).
Определение DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(-)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+)(S345C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С349 первого полипептида и С354 второго полипептида.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D): DhCpmFc(+)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей. Мутация N3D может быть введена в последовательность GDF15, например, для устранения гетерогенности, вызванной N-деамидированием.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:285, (b) два домена DhCpmFc(-)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:91, и (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL SPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYN
PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:96), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 51 037355 gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgc gcgcgacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgc acacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctg tcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagcca gttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcc tgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaat cccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagaccta tgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:95).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:90, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO :94.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:96, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:90.
II.F.4. DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(S354C).
Определение DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(-)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+)(S345C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С349 первой полипептидной цепи и С354 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3): DhCpmFc(+)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей. Удаление 3 N-терминальных аминокислот (Ndel3) в последовательности GDF15 можно применять, например, для устранения гетерогенности, вызванной деамидированием аспарагинов или изомеризацией аспарагиновой кислоты.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:285, (b) два домена DhCpmFc(-)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:91, и (c) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
- 52 037355
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPR EVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKPD TVPAPCCVPAS YNPMV LIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:98), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg agaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtcc gcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgg gaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggc ggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccg acacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtg ctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgactt gttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:97).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:90, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:94.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:98, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:90.
II.F.5. DhCpmFc(-)(Y349C)-G4-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(S354C).
Определение DhCpmFc(-)(Y349C)-G4-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), соединенный с доменом DhCpmFc(-)(Y349C) посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:58 и который соединяет N-конец полипептида GDF15(N3D) с С-концом домена DhCpmFc(-)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+) (S345C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С349 первой полипептидной цепи и С354 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(Y349C)-G4-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:285, (b) два домена DhCpmFc(-)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:91,
- 53 037355 (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ
ID NO:52, и (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID
NO:58, каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15(N3D) с С-концом домена DhCpmFc()(Y349C) посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGGGGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWA DWVL S PREVQVTMCIGAC Р S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPD TVPAPCCVP ASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:100), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt getggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg tggaggtggtgcgcgcgacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgtt gctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggcc gattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgc gtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacga gcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgccc gccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtc gctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:99).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:90, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO :94.
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен гетеротетрамер, который содержит два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO:100, и два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO:90.
II.F.6. DhCpmFc(-)(Y349C)-(G4S)2-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(S354C).
Определение DhCpmFc(-)(Y349C)-(G4S)2-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(S354C) в изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), соединенный с доменом DhCpmFc(-)(Y349C) посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:64 и который соединяет N-конец полипептида GDF15(N3D) с С-концом домена DhCpmFc(-)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+) (S345C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С349 первой полипептидной цепи и С354 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(Y349C)-(G4S)2-GDF15(N3D):
- 54 037355
DhCpmFc(+)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер:
(a) два домена DhCpmFc(+)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:285, (b) два домена DhCpmFc(-)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:91, (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52, и (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:64, каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15(N3D) с С-концом домена DhCpmFc()(Y349C) посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения первый полипептид содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой) APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASL EDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVP APCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:102), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg aggtggtggatccggaggcggtggaagcgcgcgcgacggagaccactgtc cgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctg gaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagt gaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgc acgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgcca gcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaa gaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaag actgccactgcata (SEQ ID NO:101).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:90, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:94.
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен гетеротетрамер, который содержит два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO: 102, и два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO:90.
II.F.7. DhCpmFc(-)(Y349C)-(G4Q)2-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(S354C).
Определение DhCpmFc(-)(Y349C)-(G4Q)2-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(S354C) в настоящем изобре
- 55 037355 тении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), соединенный с доменом DhCpmFc(-)(Y349C) посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:78 и который соединяет N-конец полипептида GDF15(N3D) с С-концом домена DhCpmFc(-) (Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+) (S345C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С349 первой полипептидной цепи и С354 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(Y349C)-(G4Q)2-GDF15(N3D): DhCpmFc(+)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:285, (b) два домена DhCpmFc(-)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:91, (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52, и (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:78, каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15(N3D) с С-концом домена DhCpmFc(-)(Y349C) посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения первый полипептид содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPGGGGGQGGGGQARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASL
EDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVP
APCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:104), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 56 037355 gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg aggtggtggacagggaggcggtggacaggcgcgcgacggagaccactgtc cgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctg gaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagt gaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgc acgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgcca gcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaa gaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaag actgccactgcata (SEQ ID NO:103).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:90, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:94.
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен гетеротетрамер, который содержит два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO:104, и два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO:90.
II.F.8. DhCpmFc(-)(L3 51C)-(G4S)2-GDF15: DhCpmFc(+)(L3 51C).
Определение DhCpmFc(-)(L351C)-(G4S)2-GDF15:DhCpmFc(+)(L351C) в изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15, который соединен с доменом DhCpmFc(-)(L351C) посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:64 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhCpmFc(-)(L351C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+)(L351C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С351 первой полипептидной цепи и С351 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(L351C)-(G4S)2-GDF15:DhCpmFc(+) (L351C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(а) два домена DhCpmFc(+)(L351C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTCPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO :286) , (b) два домена DhCpmFc(-)(L351C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTCPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:106),
- 57 037355 (c) две цепи полипептида GDF15 (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ
ID NO:12, и (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:64, каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhCpmFc(-) (L351C) посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (последовательность линкера подчеркнута двойной чертой)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTCPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTOKSLSLSPGGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASL
EDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVP
APCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:108) которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcgccggaactgctgggcggcccgagcgtgtttctgtttccgccgaaacc gaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtgg tggatgtgagccatgaagatccggaagtgaaatttaactggtatgtggat ggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtataa cagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggc tgaacggcaaagaatataaatgcaaagtgagcaacaaagcgctgccggcg ccgattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgca ggtgtatacctgcccgccgagccgcgaagaaatgaccaaaaaccaggtga gcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaa tgggaaagcaacggccagccggaaaacaactatgataccaccccgccggt gctggatagcgatggcagcttttttctgtatagcgatctgaccgtggata aaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaa gcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcgg cggcggcggcagcggcggcggcggcagcgcgcgcaacggcgatcattgcc cgctgggcccgggccgctgctgccgcctgcataccgtgcgcgcgagcctg gaagatctgggctgggcggattgggtgctgagcccgcgcgaagtgcaggt gaccatgtgcattggcgcgtgcccgagccagtttcgcgcggcgaacatgc atgcgcagattaaaaccagcctgcatcgcctgaaaccggataccgtgccg gcgccgtgctgcgtgccggcgagctataacccgatggtgctgattcagaa aaccgataccggcgtgagcctgcagacctatgatgatctgctggcgaaag attgccattgcatt (SEQ ID NO:107).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTCPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:105), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 58 037355 gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacacctgtcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt getggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaa a (SEQ ID NO:109).
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен гетеротетрамер, который содержит два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO:108, и два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO:105.
II.G. HSA.
Определения HSA или сывороточный альбумин человека в настоящем изобретении означают гибридный белок, содержащий область GDF15, соединенную напрямую или посредством полипептидного линкера с полипептидом сывороточным альбумином человека (HSA). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит два или более полипептидов HSA.
Как правило, N-конец области GDF15 соединен напрямую или посредством полипептидного линкера с С-концом полипептида HSA. Однако согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения N-конец полипептида HSA соединен напрямую или посредством полипептидного линкера с Сконцом области GDF15.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два таких гибридных белка, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков. Графическое представление варианта реализации такого гомодимера см. на фиг. 6. В качестве альтернативы, предложен гетеродимер, который содержит один такой гибридный белок и полипептид GDF15 или мутантный полипептид GDF, соединенные посредством межцепочечной дисульфидной связи между областью GDF15 гибридного белка и полипептидом GDF15 или мутантным полипептидом.
II.G.1. Гетеродимер HSA-(G4S)4-GDF15:GDF15.
Определение HSA-(G4S)4-GDF15:GDF15 в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15, соединенный с полипептидом HSA посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:18 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом полипептида HSA, и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15.
Как правило, первая и вторая полипептидные цепи соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения гетеродимер содержит: (а) один полипептид HSA (в первом мономере), содержащий последовательность
- 59 037355
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFA KTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFY APELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKC ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK E FNAE TFT FHADICTLSEKERQIKKQTALVE LVKHKPKATKE QLKAVMDD FAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO:110), и (b) два полипептида GDF15 (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12, и (c) один полипептидный линкер (в первом мономере), содержащий последовательность SEQ ID NO:18, который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом полипептида HSA посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первый полипептид содержит аминокислотную последовательность (линкер подчеркнут двойной чертой)
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFA
KTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFY APELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKC ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK EFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDD FAAFVEKCCKADDKE Т С FAEEGKKLVAAS OAALGLGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSARNGDHCPLGPGRCCRIjHTVRASLEDLGWADWVLSPREVOVTMCI GACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTG VSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO :112), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 60 037355 gatgcacacaagagtgaggttgctcatcgatttaaagatttgggagaaga aaatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagt gtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgca aaaacatgtgttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttca taccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacct atggtgaaatggctgactgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaa tgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgattggtgag accagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacat ttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagacatccttacttttat gccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacaga atgttgccaagctgctgataaagctgcctgcctgttgccaaagctcgatg aacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgccaaacagagactcaagtgt gccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagcatgggcagtagc tcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtttccaagt tagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatggagatctg cttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaa tcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctctgt tggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctget gacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaa aaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaat atgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgcc aagacatatgaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctca tgaatgctatgccaaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagc ctcagaatttaatcaaacaaaattgtgagctttttgagcagcttggagag tacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtacccca agtgtcaactccaactcttgtagaggtctcaagaaacctaggaaaagtgg gcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaa gactatctatccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaaac gccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgcacagaatccttggtgaaca ggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatgaaacatacgttcccaaa gagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagatatatgcacactttc tgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgttgagctcgtga aacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttatggatgat ttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggagacctg ctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgcggccagtcaggccgccttag gcttaggaggtggtggatccggaggcggtggaagcggaggtggtggatct ggaggcggtggaagcgcgcgcaacggagaccactgtccgctcgggcccgg gcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggct gggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatc ggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaa gacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcg tgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggg gtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcat atga (SEQ ID NO:111).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:11.
- 61 037355
Как обсуждалось выше, предложен гетеродимер, который содержит первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:112, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12.
II.G.2. HSA-(G4S)4-GDF15.
Определение HSA-(G4S)4-GDF15 в настоящем изобретении означает гибридный белок, содержащий полипептид GDF15, соединенный с полипептидом HSA посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:18 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом полипептида HSA.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два гибридных белка HSA-(G4S)4-GDF15, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения гомодимер содержит:
(a) два полипептида HSA (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO: 110;
(b) два полипептида GDF15 (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO: 12, и (c) два полипептидных линкера (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:18, каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом полипептида HSA посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:112, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 111.
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, который содержит два гибридных белка, содержащих последовательность SEQ ID NO:112.
II.G.3. HSA-GSPAPAPGS-GDF15.
Определение HSA-(GSPAPAPGS)-GDF15 в настоящем изобретении означает гибридный белок, содержащий полипептид GDF15, соединенный с полипептидом HSA посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:113 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с Сконцом полипептида HSA.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два гибридных белка HSA-(GSPAPAPGS)-GDF15, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения гомодимер содержит:
(a) два полипептида HSA (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO: 110;
(b) два полипептида GDF15 (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO: 12; и (c) два полипептидных линкера (в каждом мономере), содержащих последовательность GSPA PAPGS (SEQ ID NO:113), каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF-15 с С-концом полипептида HSA посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность (линкер подчеркнут двойной чертой)
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFA KTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFY APELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKC ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK Е FNAE TFT FHADICTLSEKERQIKKQTALVE LVKHKPKATKE QLKAVMDD FAAFVEKCCKADDKE ТС FAEEGKKLVAAS OAALGLGSPAPAPGSARNGDH CPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAAN MHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLA KDCHCI (SEQ ID NO:115),
- 62 037355 которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gatgcacacaagagtgaggttgctcatcgatttaaagatttgggagaaga aaatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagt gtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgca aaaacatgtgttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttca taccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacct atggtgaaatggctgactgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaa tgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgattggtgag accagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacat ttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagacatccttacttttat gccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacaga atgttgccaagctgctgataaagctgcctgcctgttgccaaagctcgatg aacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgccaaacagagactcaagtgt gccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagcatgggcagtagc tcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtttccaagt tagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatggagatctg cttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaa tcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctctgt tggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctget gacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaa aaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaat atgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgcc aagacatatgaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctca tgaatgctatgccaaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagc ctcagaatttaatcaaacaaaattgtgagctttttgagcagcttggagag tacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtacccca agtgtcaactccaactcttgtagaggtctcaagaaacctaggaaaagtgg gcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaa gactatctatccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaaac gccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgcacagaatccttggtgaaca ggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatgaaacatacgttcccaaa gagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagatatatgcacactttc tgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgttgagctcgtga aacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttatggatgat ttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggagacctg ctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgcggccagtcaggccgccttag gcttaggatccccagctccagctccaggaagcgcgcgcaacggagaccac tgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtc gctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgc aagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaac atgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggt gccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattc aaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagcc aaagactgccactgcatatga (SEQ ID NO:114).
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации изобретения предложен гомодимер, который содержит два гибридных белка, содержащих последовательность SEQ ID NO:115.
II.G.4. HSA-GS(PAPAP)2GS-GDF15.
- 63 037355
Определение HSA-GS(PAPAP)2GS-GDF15 в настоящем изобретении означает гибридный белок, содержащий полипептид GDF15, соединенный с полипептидом HSA посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:116 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с Сконцом полипептида HSA.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два гибридных белка HSA-GS (PAPAP)2GS-GDF15, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения гомодимер содержит:
(a) два полипептида HSA (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:110;
(b) два полипептида GDF15 (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO: 12; и (c) два полипептидных линкера (в каждом мономере), содержащих последовательность GSPAPAPP APAPGS (SEQ ID NO:116), каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF-15 с С-концом полипептида HSA посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность (линкер подчеркнут двойной чертой)
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFA KTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFY APELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKC ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK Е FNAE TFT FHADICTLSEKERQIKKQTALVE LVKHKPKATKE QLKAVMDD FAAFVE КС CKADDKEТ С FAEЕ GKKLVAAS OAAFGLGSPAPAPPAPAPGSA RNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQ FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTY DDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 118), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 64 037355 gatgcacacaagagtgaggttgctcatcgatttaaagatttgggagaaga aaatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagt gtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgca aaaacatgtgttgctgatgagtcagetgaaaattgtgacaaatcacttea taccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacct atggtgaaatggctgactgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaa tgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgattggtgag accagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacat ttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagacatccttacttttat gccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacaga atgttgccaagctgctgataaagctgcctgcctgttgccaaagctcgatg aacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgccaaacagagactcaagtgt gccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagcatgggcagtagc tcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtttccaagt tagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatggagatctg cttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaa tcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctctgt tggaaaaatcccactgcattgeegaagtggaaaatgatgagatgeetget gacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaa aaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaat atgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgcc aagacatatgaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctca tgaatgctatgccaaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagc ctcagaatttaatcaaacaaaattgtgagctttttgagcagcttggagag tacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtacccca agtgtcaactccaactcttgtagaggtctcaagaaacctaggaaaagtgg gcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaa gactatctatccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaaac gccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgcacagaatccttggtgaaca ggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatgaaacatacgttcccaaa gagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagatatatgcacactttc tgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgttgagctcgtga aacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttatggatgat ttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggagacctg ctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgcggccagtcaggccgccttag gcttaggatccccagctccagctccacccgcacctgcccctggaagcgcg cgcaacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgca cacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgt cgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccag ttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcct gaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatc ccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctat gatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga (SEQ ID NO:117).
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации изобретения предложен гомодимер, который содержит два гибридных белка, содержащих последовательность SEQ ID NO:118.
II.G.5. HSA-GSAAQAAQQGS-GDF15.
Определение HSA-GSAAQAAQQGS-GDF15 в настоящем изобретении означает гибридный белок, содержащий полипептид GDF15, соединенный с полипептидом HSA посредством линкера, который
- 65 037355 содержит последовательность SEQ ID NO:119 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с Сконцом полипептида HSA.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два гибридных белка HSA-GSAAQAAQQGS-GDF15, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения гомодимер содержит:
(a) два полипептида HSA (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO: 110;
(b) два полипептида GDF15 (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO: 12; и (c) два полипептидных линкера (в каждом мономере), содержащих последовательность GSAAQAAQQGS (SEQ ID NO: 119), каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом полипептида HSA посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность (линкер подчеркнут двойной чертой)
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFA KTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFY APELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKC ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK EFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDD FAAFVEKCCKADDKE Т С FAEEGKKLVAAS OAALGLGSAAOAAOOGSARNG DHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRA ANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDL LAKDCHCI (SEQ ID NO:121), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gatgcacacaagagtgaggttgctcatcgatttaaagatttgggagaaga aaatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagt gtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgca aaaacatgtgttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttca taccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacct atggtgaaatggctgactgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaa tgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgattggtgag accagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacat ttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagacatccttacttttat gccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacaga atgttgccaagctgctgataaagctgcctgcctgttgccaaagctcgatg aacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgccaaacagagactcaagtgt gccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagcatgggcagtagc tcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtttccaagt tagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatggagatctg cttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaa
- 66 037355 tcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctctgt tggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgeetget gacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaa aaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaat atgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgcc aagacatatgaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctca tgaatgctatgccaaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagc ctcagaatttaatcaaacaaaattgtgagctttttgagcagcttggagag tacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtacccca agtgtcaactccaactcttgtagaggtctcaagaaacctaggaaaagtgg gcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaa gactatctatccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaaac gccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgcacagaatccttggtgaaca ggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatgaaacatacgttcccaaa gagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagatatatgcacactttc tgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgttgagctcgtga aacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttatggatgat ttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggagacctg ctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgcggccagtcaggccgccttag gcttaggatccgccgctcaggctgcacagcaaggaagcgcgcgcaacgga gaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccg cgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacggg aggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcg gcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccga cacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgc tcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttg ttagccaaagactgccactgcatatga (SEQ ID NO:120).
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации изобретения предложен гомодимер, который содержит два гибридных белка, содержащих последовательность SEQ ID NO: 121.
II.G.6. HSA-GS (AAQAAQQ)2GS-GDF15.
Определение HSA-GS (AAQAAQQ)2GS-GDF15 в настоящем изобретении означает гибридный белок, содержащий полипептид GDF15, соединенный с полипептидом HSA посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:122 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом полипептида HSA.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два гибридных белка HSA-GS(AAQAAQQ)2GS-GDF15, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения гомодимер содержит:
(a) два полипептида HSA (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:110;
(b) два полипептида GDF15 (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12; и (c) два полипептидных линкера (в каждом мономере), содержащих последовательность
GSAAQAAQQAAQAAQQGS (SEQ ID NO:122), каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF-15 с С-концом полипептида HSA посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность (линкер подчеркнут двойной чертой)
- 67 037355
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFA KTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFY APELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKC ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK E FNAE TFT FHADICTLSEKERQIKKQTALVE LVKHKPKATKE QLKAVMDD FAAFVEKCCKADDKE TC FAEEGKKLVAAS OAALGLGSAAOAAOOAAOAAO QGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGA CPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVS LQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:124), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 68 037355 gatgcacacaagagtgaggttgctcatcgatttaaagatttgggagaaga aaatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagt gtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgca aaaacatgtgttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttca taccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacct atggtgaaatggctgactgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaa tgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgattggtgag accagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacat ttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagacatccttacttttat gccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacaga atgttgccaagctgctgataaagctgcctgcctgttgccaaagctcgatg aacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgccaaacagagactcaagtgt gccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagcatgggcagtagc tcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtttccaagt tagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatggagatctg cttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaa tcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctctgt tggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctget gacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaa aaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaat atgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgcc aagacatatgaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctca tgaatgctatgccaaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagc ctcagaatttaatcaaacaaaattgtgagctttttgagcagcttggagag tacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtacccca agtgtcaactccaactcttgtagaggtctcaagaaacctaggaaaagtgg gcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaa gactatctatccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaaac gccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgcacagaatccttggtgaaca ggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatgaaacatacgttcccaaa gagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagatatatgcacactttc tgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgttgagctcgtga aacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttatggatgat ttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggagacctg ctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgcggccagtcaggccgccttag gcttaggatccgccgctcaggctgcacagcaagcagcccaagcagctcag cagggaagcgcgcgcaacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttg ctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccg attgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcg tgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgag cctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccg ccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcg ctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga (SEQ ID NO:123).
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации изобретения предложен гомодимер, который содержит два гибридных белка, содержащих последовательность SEQ ID NO:124.
II.G.7. HSA-GGNAEAAAKEAAAKEAAAKAGG-GDF15.
Определение HSA-GGNAEAAAKEAAAKEAAAKAGG-GDF15 в настоящем изобретении означа- 69 037355 ет гибридный белок, содержащий полипептид GDF15, соединенный с полипептидом HSA посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:125 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом полипептида HSA.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два гибридных белка HSA-GGNAEAAAKEAAAKEAAAKAGG-GDF15, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения гомодимер содержит:
(a) два полипептида HSA (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO: 110;
(b) два полипептида GDF15 (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12; и (c) два полипептидных линкера (в каждом мономере), содержащих последовательность: GGNAEAAAKEAAAKEAAAKAGG (SEQ ID NO:125), каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF-15 с С-концом полипептида HSA посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность (линкер подчеркнут двойной чертой)
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFA KTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFY APELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKC ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK Е FNAE TFT FHADICTLSEKERQIKKQTALVE LVKHKPKATKE QLKAVMDD FAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASOAALGLGGNAEAAAKEAAAKE AAAKEAAAKAGGARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPRE VQVTMCIGAC Р S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKP D TVPAPCCVPAS YNPMVL IQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:127), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gatgcacacaagagtgaggttgctcatcgatttaaagatttgggagaaga aaatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagt gtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgca aaaacatgtgttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttca taccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacct atggtgaaatggctgactgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaa tgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgattggtgag accagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacat ttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagacatccttacttttat gccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacaga atgttgccaagctgctgataaagctgcctgcctgttgccaaagctcgatg aacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgccaaacagagactcaagtgt gccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagcatgggcagtagc tcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtttccaagt tagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatggagatctg cttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaa tcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctctgt
- 70 037355 tggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctget gacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaa aaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaat atgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgcc aagacatatgaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctca tgaatgctatgccaaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagc ctcagaatttaatcaaacaaaattgtgagctttttgagcagcttggagag tacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtacccca agtgtcaactccaactcttgtagaggtctcaagaaacctaggaaaagtgg gcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaa gactatctatccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaaac gccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgcacagaatccttggtgaaca ggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatgaaacatacgttcccaaa gagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagatatatgcacactttc tgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgttgagctcgtga aacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttatggatgat ttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggagacctg ctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgcggccagtcaggccgccttag gcttaggaggcaacgccgaggctgccgctaaggaagccgctgccaaggag gccgcagcaaaagaggctgcagctaaggccggaggagcgcgcaacggaga ccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcg cgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggag gtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggc aaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgaca cggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctc attcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgtt agccaaagactgccactgcatatga (SEQ ID NO:126).
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации изобретения предложен гомодимер, который содержит два гибридных белка, содержащих последовательность SEQ ID NO: 127.
II.G.8. HSA-(G4S)6-GDF15.
Определение HSA-(G4S)6-GDF15 в настоящем изобретении означает гибридный белок, содержащий полипептид GDF15, соединенный с полипептидом HSA посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:128 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом полипептида HSA.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два гибридных белка HSA-(G4S)6-GDF15, соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения гомодимер содержит: (a) два полипептида HSA (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:110;
(b) два полипептида GDF15 (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12; и (c) два полипептидных линкера (в каждом мономере), содержащих последовательность:
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:128), каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF-15 с С-концом полипептида HSA посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность (линкер подчеркнут двойной чертой)
- 71 037355
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFA DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFA KTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFY APELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKC ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK E FNAE TFT FHADICTLSEKERQIKKQTALVE LVKHKPKATKE QLKAVMDD FAAFVEKCCKADDKE TC FAEEGKKLVAAS OAALGLGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPDGPGRCCRDHTVRASTF.DDGWADWVDS PREVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKPDTVPAPCCVPAS YNP MVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:130), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 72 037355 gatgcacacaagagtgaggttgctcatcgatttaaagatttgggagaaga aaatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagt gtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgca aaaacatgtgttgctgatgagtcagetgaaaattgtgacaaatcacttea taccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacct atggtgaaatggctgactgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaa tgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgattggtgag accagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacat ttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagacatccttacttttat gccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacaga atgttgccaagctgctgataaagctgcctgcctgttgccaaagctcgatg aacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgccaaacagagactcaagtgt gccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagcatgggcagtagc tcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtttccaagt tagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatggagatctg cttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaa tcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctctgt tggaaaaatcccactgcattgeegaagtggaaaatgatgagatgeetget gacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaa aaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaat atgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgcc aagacatatgaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctca tgaatgctatgccaaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagc ctcagaatttaatcaaacaaaattgtgagctttttgagcagcttggagag tacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtacccca agtgtcaactccaactcttgtagaggtctcaagaaacctaggaaaagtgg gcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaa gactatctatccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaaac gccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgcacagaatccttggtgaaca ggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatgaaacatacgttcccaaa gagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagatatatgcacactttc tgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgttgagctcgtga aacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttatggatgat ttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggagacctg ctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgcggccagtcaggccgccttag gcttaggaggtggtggctctggaggcggtggaagcggaggcggtggatcc ggaggcggtggaagcggaggtggtggatctggaggcggtggaagcgcgcg caacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcaca cggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcg ccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagtt ccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctga agcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatccc atggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatga tgacttgttagccaaagactgccactgcatatga (SEQ ID NO:129).
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации изобретения предложен гомодимер, который содержит два гибридных белка, содержащих последовательность SEQ ID NO: 130.
II.G.9. HSA-GS(AAQAAQQ)2GS-GDF15(N3D).
Определение HSA-GS(AAQAAQQ)2GS-GDF15(N3D) в настоящем изобретении означает гибрид- 73 037355 ный белок, содержащий полипептид GDF15(N3D), соединенный с полипептидом HSA посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:122 и который соединяет N-конец полипептида
GDF15(N3D) с С-концом полипептида HSA.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два гибридных белка HSA-GS(AAQAAQQ)2GS-GDF15(N3D), соединенных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных белков.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения гомодимер содержит:
(a) два полипептида HSA (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO: 110;
(b) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52; и (c) два полипептидных линкера (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO: 122, каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15(N3D) с С-концом полипептида HSA посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность (линкер подчеркнут двойной чертой)
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFA KTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFY APELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKC ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK Ε FNAE TFT FHADICTLSEKERQIKKQTALVE LVKHKPKATKE QLKAVMDD FAAFVEKCCKADDKE ТС FAEEGKKLVAAS OAALGLGSAAOAAOOAAOAAO OGSARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVOVTMCIGA CPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVS LQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:242), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gatgcacacaagagtgaggttgctcatcgatttaaagatttgg gagaagaaaatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatctt cagcagtgtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactga atttgcaaaaacatgtgttgetgatgagtcagetgaaaattgtgacaaat cacttcataccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgt gaaacctatggtgaaatggctgactgctgtgcaaaacaagaacctgagag aaatgaatgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgat tggtgagaccagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaa gagacatttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagacatcctta cttttatgccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgctt ttacagaatgttgccaagctgctgataaagctgcctgcctgttgccaaag ctcgatgaacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgccaaacagagact caagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagcatggg cagtagctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtt tccaagttagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatgg agatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatct
- 74 037355 gtgaaaatcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaa cctctgttggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagat gcctgctgacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatg tttgcaaaaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttg tatgaatatgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgag acttgccaagacatatgaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcag atcctcatgaatgctatgccaaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtg gaagagcctcagaatttaatcaaacaaaattgtgagctttttgagcagct tggagagtacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaag taccccaagtgtcaactccaactcttgtagaggtctcaagaaacctagga aaagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctg tgcagaagactatctatccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatg agaaaacgccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgcacagaatccttg gtgaacaggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatgaaacatacgt tcccaaagagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagatatatgca cactttctgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgttgag ctcgtgaaacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttat ggatgatttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataagg agacctgctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgcggccagtcaggcc gccttaggcttaggatccgccgctcaggctgcacagcaagcagcccaagc agctcagcagggaagcgcgcgcgacggagaccactgtccgctcgggcccg ggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggc tgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcat cggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatca agacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgc gtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccgg ggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgca ta (SEQ ID NO:241).
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, который содержит два гибридных белка, содержащих последовательность SEQ ID NO:242.
II.H. Конструкции с мутациями для корректирования аффинности связывания с FcyR.
Было обнаружено, что определенные мультимеры с мутацией charged pair (delHinge) демонстрируют связывание с рецептором Fey (FcyR), в частности с FcyRI и FcyRIII. См., например, пример 7. В некоторых случаях аффинность связывания с FcyR была сравнима с аффинностью, наблюдаемой для мультимеров, содержащих шарнирную область. Данный факт стал неожиданностью, поскольку рецептор Fcy взаимодействует с шарнирной областью, а данные мультимеры представляют собой мультимеры delHinge, как описано выше, в которых отсутствует шарнирная область целиком или ее часть. Мутационный анализ остатков Fc, вовлеченных в связывание с FcyR, позволил предположить, что основной сайт взаимодействия расположен в шарнирной области и СН2-домене (Tamm A., 1997, Int. Rev. Immunol. 16:57-85). См. также публикации Radaev S. et al., J. Biol. Chem. 276:16469-16477; Sondermann P. et al., 2000, Nature 406:267-273.
Антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC), иммунный ответ, опосредованный преимущественно клетками естественными киллерами (natural killer, NK), у человека зависит от взаимодействия FcyR, в особенности FcyRIIIA человека, с Fc-доменом антитела или Fc-содержащего белка. При ADCC связывание Fc с FcyRIII на поверхности клетки NK активирует клетку NK, которая высвобождает перфорины и гранзимы.
Соответственно, предложены конструкции, содержащие дополнительные модификации для модулирования взаимодействия конструкции с FcyR. Согласно одному ряду вариантов реализации настоящего изобретения мутацию аспарагина на глицин (N297G) вводят в нативную Fc или вариант Fc, в том числе в различные Fc-домены, описанные выше. В результате мутации N297G удаляют консервативный сайт N-гликозилирования в СН2-домене.
- 75 037355
Согласно другому ряду вариантов реализации настоящего изобретения дополнительные Nтерминальные аминокислотные остатки удаляют из Fc-домена, из которого была удалена шарнирная область целиком или ее часть. Например, аминокислотную последовательность
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT
ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH
YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:303) получают посредством делеции аминокислотных остатков, N-терминальных относительно G236 Fcдомена IgG1 дикого типа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Стерминальный лизин (K447) в данном варианте Fc может быть необязательно удален. Аминокислотную последовательность
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI
SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:304) получают посредством делеции аминокислотных остатков, N-терминальных относительно G237 Fcдомена IgG1 дикого типа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Стерминальный лизин (K447) в данном варианте Fc может быть необязательно удален. Аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP
ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO:305) получают посредством делеции аминокислотных остатков, N-терминальных относительно Р238 Fcдомена IgG1 дикого типа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Стерминальный лизин (K447) в данном варианте Fc может быть необязательно удален.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(-), в который была введена мутация аспарагина на глицин (N297G) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(-)(N297G)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(+), в который была введена мутация аспарагина на глицин (N297G) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(+) (N297G)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(-) (Y349C), в который была введена мутация аспарагина на глицин (N297G) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(+)(S354C), в который была введена мутация аспарагина на глицин (N297G) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(+)(N297G)(S354C)).
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен домен DhCpmFc(+)(Y349C), в который была введена мутация аспарагина на глицин (N297G) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(+)(N297G)(Y349C)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(-)(S354C), в который была введена мутация аспарагина на глицин (N297G) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(-)(N297G) (S354C)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(+)(L351C), в который была введена мутация аспарагина на глицин (N297G) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(+)(N297G)(L351C)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(-)(L351C), в который была введена мутация аспарагина на глицин (N297G) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(-), в который была введена мутация аланина на цистеин (А287С) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(-)(A287C)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(+), в который была введена мутация аланина на цистеин (А287С) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(+) (A287C)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(-), в который была введена мутация лейцина на цистеин (L306C) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(-)(L306C)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен
- 76 037355 домен DhCpmFc(+), в который была введена мутация лейцина на цистеин (L306C) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(+) (L306C)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(-) (A287C), в который была введена мутация тирозина на цистеин (Y349C) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(-)(A287C)(Y349C)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(+)(A287C), в который была введена мутация тирозина на цистеин (Y349C) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(+)(A287C)(Y349C)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(-) (A287C), в который была введена мутация серина на цистеин (S354C) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(-)(A287C)(S354C)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(+)(A287C), в который была введена мутация серина на цистеин (S354C) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(+)(A287C)(S354C)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(-) (L306C), в который была введена мутация тирозина на цистеин (Y349C) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(-)(L306C)(Y349C)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(+)(L306C), в который была введена мутация тирозина на цистеин (Y349C) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(+)(L306C)(Y349C)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(-) (L306C), в который была введена мутация серина на цистеин (S354C) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(-)(L306C)(S354C)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(+)(L306C), в который была введена мутация серина на цистеин (S354C) (в настоящей заявке данный домен называют DhCpmFc(+)(A287C)(L306C)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(-), в котором были удалены 7 N-терминальных аминокислот (в настоящей заявке данный домен называют Dh2CpmFc(-)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(+), в котором были удалены 7 N-терминальных аминокислот (в настоящей заявке данный домен называют Dh2CpmFc(+)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(-) (Y349C), в котором были удалены 7 N-терминальных аминокислот (в настоящей заявке данный домен называют Dh2CpmFc(-)(Y349C)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(+)(S354C), в котором были удалены 7 N-терминальных аминокислот (в настоящей заявке данный домен называют Dh2CpmFc(+)(S354C)).
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен домен DhCpmFc(+)(Y349C), в котором были удалены 7 N-терминальных аминокислот (в настоящей заявке данный домен называют Dh2CpmFc(+)(Y349C)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен DhCpmFc(-)(S354C), в котором были удалены 7 N-терминальных аминокислот (в настоящей заявке данный домен называют Dh2CpmFc(-)(S354C)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен CpmFc(+), в который была введена мутация аспарагина на глицин (N297G) (в настоящей заявке данный домен называют CpmFc(+)(N297G)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен CpmFc(-), в который была введена мутация аспарагина на глицин (N297G) (в настоящей заявке данный домен называют CpmFc(-)(N297G)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен Dh2CpmFc(+), в который была введена мутация аспарагина на глицин (N297G) (в настоящей заявке данный домен называют Dh2CpmFc(+) (N297G)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен Dh2CpmFc(-), в который была введена мутация аспарагина на глицин (N297G) (в настоящей заявке данный домен называют Dh2CpmFc(-) (N297G)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен Dh2CpmFc(-) (N297G), в который была введена мутация аланина на цистеин (А287С) (в настоящей заявке данный домен называют Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен Dh2CpmFc(+)(N297G), в который была введена мутация лейцина на цистеин (L306C) (в настоящей заявке данный домен называют Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен Dh2CpmFc(-) (N297G)(А287С), в который была введена мутация тирозина на цистеин (Y349C) (в настоящей заявке данный домен называют Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C), в который была введена мутация серина на цистеин (S354C) (в настоящей заявке данный домен называют Dh2CpmFc(+)(N297G) (L306C)(S354C)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен Dh2CpmFc(-), в котором к N-концу были добавлены два глицина (в настоящей заявке данный домен называют GGDh2CpmFc(-)(N297G)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен Dh2CpmFc(+), в котором к N-концу были добавлены два глицина (в настоящей заявке данный домен
- 77 037355 называют GG-Dh2CpmFc(+)(N297G)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен GG-Dh2CpmFc(-), в который была введена мутация тирозина на цистеин (Y349C) (в настоящей заявке данный домен называют GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен GG-Dh2CpmFc(+), в который была введена мутация серина на цистеин (S354C) (в настоящей заявке данный домен называют GG-Dh2CpmFc(+)(S354C)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен GGDh2CpmFc(+), в который была введена мутация тирозина на цистеин (Y349C) (в настоящей заявке данный домен называют GG-Dh2CpmFc(+)(Y349C)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен GG-Dh2CpmFc(-), в который была введена мутация серина на цистеин (S354C) (в настоящей заявке данный домен называют GG-Dh2CpmFc(-)(S354C)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен Dh2CpmFc(-), в котором к N-концу был добавлен глицин (в настоящей заявке данный домен называют Dh3CpmFc(-) (N297G)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен Dh2CpmFc(+), в котором к N-концу был добавлен глицин (в настоящей заявке данный домен называют Dh3CpmFc(+)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен Dh3CpmFc(-), в который была введена мутация тирозина на цистеин (Y349C) (в настоящей заявке данный домен называют Dh3CpmFc(-)(Y349C)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен домен Dh3CpmFc(+), в который была введена мутация серина на цистеин (S354C) (в настоящей заявке данный домен называют Dh3CpmFc(+)(S354C)).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения в DhMonoFc-домен введена мутация аспарагина на глицин (N297G) (в настоящей заявке называют DhMonoFc(N297G)).
П.Н.1. DhCpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(N297G).
Определение DhCpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(N297G) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(-)(N297G), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+)(N297G).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+) (N297G), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(а) два домена DhCpmFc(+)(N297G) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:287), (b) два домена DhCpmFc(-)(N297G) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:132), и (с) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPR
ЕVQVTMCIGAC Р S Q FRAANMHAQIКТ S LHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMV
LIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:134),
- 78 037355 которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgg gagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt getggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg agaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtcc gcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgg gaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggc ggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccg acacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtg ctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgactt gttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:133).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:131), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgg gagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccggaaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgt gctgaagtccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaa atga (SEQ ID NO:135).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:134, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:131.
П.Н.2. DhCpmFc(-)(N297G)-GDF 15(N3D):DhCpmFc(+)(N297G).
Определение DhCpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(N297G) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую последователь- 79 037355 ность GDF15(N3D), N-конец которой соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(-)(N297G), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+)(N297G).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+) (N297G), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+)(N297G) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:287, (b) два домена DhCpmFc(-)(N297G) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:132, и (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL S PREVQVTMCIGAC Р S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKPDTVPAPC CVPAS YN PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:137), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgg gagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt getggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgc gcgcgacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgc acacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctg tcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagcca gttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcc tgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaat cccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagaccta tgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:136).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:131, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:135.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:137, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:131.
II.H.3. DhCpmFc(-)(N297G)-G4-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(N297G).
Определение DhCpmFc(-)(N297G)-G4-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(N297G) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид
- 80 037355
GDF15(N3D), соединенный с доменом DhCpmFc(-)(N297G) посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:58 и который соединяет N-конец полипептида GDF15(N3D) с С-концом домена DhCpmFc(-)(N297G), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+) (N297G).
Согласно определенным вариантам реализации изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(N297G)-G4-GDF15(N3D):DhCpmFc(+) (N297G), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+)(N297G) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:287, (b) два домена DhCpmFc(-)(N297G) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:132, (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52, и (d) два полипептидных линкера (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:58, каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15(N3D) с С-концом домена DhCpmFc(-)(N297G) посредством пептидной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGGGGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWA DWVLS PREVQVTMCIGACPS QFRAANMHAQIКТ S LHRLKPDTVPAPCCVP ASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:139), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgg gagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt getggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg aggtggtggagcgcgcgacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgtt gctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggcc gattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgc gtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacga gcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgccc gccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtc gctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:138) .
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:131, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 135.
- 81 037355
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:139, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:131.
П.Н.4. DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(N297G)(S354C).
Определение DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(N297G)(S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(-) (N297G)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+)(N297G)(S345C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С349 первой полипептидной цепи и С354 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(Ndel3): DhCpmFc(+) (N297G) (S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(а) два домена DhCpmFc(+)(N297G)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:288), (b) два домена DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:141), и (с) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPR
ЕVQVTMCIGAG Р S Q FRAANMHAQIКТ S LHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMV
LIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:143), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 82 037355 gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgg cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt getggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgg agaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtcc gcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgg gaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggc ggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccg acacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtg ctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgactt gttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:142).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:140), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gccccagagctgcttggtggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcc gaaggacaccctgatgatctcaagaactccggaagtgacttgcgtcgtcg tggacgtgtcacatgaggatccagaggtcaagttcaattggtatgtggac ggagtggaagtgcataacgccaagaccaaaccccgcgaagaacagtacgg gagcacctaccgcgtggtgagcgtccttactgtgctccaccaggactggc ttaatgggaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaaggccctccccgct cccatcgaaaagaccatctcaaaggcaaaggggcaaccaagggaacctca agtgtacaccctgcctccgtgcaggaaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacttgtctcgtgaagggcttctatcccagcgatattgctgtggaa tgggagtcaaatggccagcccgagaataactacaaaactaccccacccgt gctgaaatctgatgggtccttcttcctttactccaagctgaccgtggaca agagccgctggcaacaaggcaatgtctttagctgctcagtgatgcatgag gctctccataatcactacactcagaagtcactgtccctgtctccgggtaa a (SEQ ID NO:144).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:143, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:140.
П.Н.5. DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(N297G)(S354C).
Определение DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(N297G)(S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(-) (N297G)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+)(N297G)(S345C).
- 83 037355
Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С349 первой полипептидной цепи и С354 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(N3D): DhCpmFc(+)(N297G)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+)(N297G)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:288, (b) два домена DhCpmFc(-)(N297G)(Y349C), содержащих последовательность SEQ ID NO:141, и (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL
S PREVQVTMCIGAC Р S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKP DTVPAPCCVPAS YN PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:146), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgg gagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt gctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgc gcgcgacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgc acacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctg tcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagcca gttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcc tgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaat cccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagaccta tgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:145).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:140, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 144.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:146, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:140.
П.Н.6. DhCpmFc(-)(N297G)(L351С)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(N297G)(L351C).
Определение DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(N297G)(L351C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержа- 84 037355 щую полипептид GDF15(Ndel3), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(-) (N297G)(L351C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+)(N297G)(L351C).
Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С351 первой полипептидной цепи и С351 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)-GDF15(Ndel3): DhCpmFc(+)(N297G)(L351C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(а) два домена DhCpmFc(+)(N297G)(L351C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTCPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:289), (b) два домена DhCpmFc(-)(N297G)(L351C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTCPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:148), и (с) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTCPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL
S PREVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKP D TVPAPC CVPAS YN PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:150), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcgccggaactgctgggcggcccgagcgtgtttctgtttccgccgaaacc gaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtgg tggatgtgagccatgaagatccggaagtgaaatttaactggtatgtggat ggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtatgg cagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggc tgaacggcaaagaatataaatgcaaagtgagcaacaaagcgctgccggcg ccgattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgca ggtgtatacctgcccgccgagccgcaaagaaatgaccaaaaaccaggtga gcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaa
- 85 037355 tgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggt gctgaaaagcgatggcagcttttttctgtatagcaaactgaccgtggata aaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaa gcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcgc gcgcaacggcgatcattgcccgctgggcccgggccgctgctgccgcctgc ataccgtgcgcgcgagcctggaagatctgggctgggcggattgggtgctg agcccgcgcgaagtgcaggtgaccatgtgcattggcgcgtgcccgagcca gtttcgcgcggcgaacatgcatgcgcagattaaaaccagcctgcatcgcc tgaaaccggataccgtgccggcgccgtgctgcgtgccggcgagctataac ccgatggtgctgattcagaaaaccgataccggcgtgagcctgcagaccta tgatgatctgctggcgaaagattgccattgcatt (SEQ ID NO:149).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTCPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:147), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgg gagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggc tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacacctgtcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtca gcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgt getggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggaca agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaa a (SEQ ID NO:151).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:150, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO: 147.
П.Н.7. DhCpmFc(-)(N297G) (I351C)-GDF15 (N3D):DhCpmFc(+)(N297G)(L351C).
Определение DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(N297G)(L351C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(-) (N297G)(L351C) посредством пептидной связи, и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+)(N297G)(L351C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С351 первой полипептидной цепи и С351 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(N297G)(L351C)-GDF15(N3D): DhCpmFc(+)(N297G)(L351C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+)(N297G)(L351C) (в каждом гетеродимере), содержащих последователь- 86 037355 ность SEQ ID NO:289, (b) два домена DhCpmFc(-)(N297G)(L351C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:148, и (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ
ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTCPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL SPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYN PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:153), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcgccggaactgctgggcggcccgagcgtgtttctgtttccgccgaaacc gaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtgg tggatgtgagccatgaagatccggaagtgaaatttaactggtatgtggat ggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtatgg cagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggc tgaacggcaaagaatataaatgcaaagtgagcaacaaagcgctgccggcg ccgattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgca ggtgtatacctgcccgccgagccgcaaagaaatgaccaaaaaccaggtga gcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaa tgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggt gctgaaaagcgatggcagcttttttctgtatagcaaactgaccgtggata aaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaa gcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcgc gcgcgatggcgatcattgcccgctgggcccgggccgctgctgccgcctgc ataccgtgcgcgcgagcctggaagatctgggctgggcggattgggtgctg agcccgcgcgaagtgcaggtgaccatgtgcattggcgcgtgcccgagcca gtttcgcgcggcgaacatgcatgcgcagattaaaaccagcctgcatcgcc tgaaaccggataccgtgccggcgccgtgctgcgtgccggcgagctataac ccgatggtgctgattcagaaaaccgataccggcgtgagcctgcagaccta tgatgatctgctggcgaaagattgccattgcatt (SEQ ID NO:152).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:147, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 151.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:153, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO: 147.
П.Н.8. DhCpmFc(-)(N297G)(А287С)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(N297G)(L306C).
Определение DhCpmFc(-)(N297G)(А287С)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(N297G)(L306C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(-) (N297G)(А287С), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+)(N297G)(L306C).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(N297G)(А287С)-GDF15(Ndel3): DhCpmFc(+)(N297G)(L306C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(а) два домена DhCpmFc(+)(N297G)(L306C) (в каждом гетеродимере), содержащих последо-
- 87 037355 вательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNCKTKPREEQYGSTYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:290), (b) два домена DhCpmFc(-)(N297G)(A287C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNCKTKPREEQYGSTYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:268), и (с) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNCKTKPREEQYGSTYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPR EVQVTMCIGACP S QFRAANMHAQIКТ S LHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMV LIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:269), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccc caaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgc gtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggta cgtggacggcgtggaggtgcataattgcaagacaaagccgcgggaggagc agtacggcagcacgtaccgtgtggtcagcgtctgcaccgtcctgcaccag gactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccct cccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgag aaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgc cgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgc ctcccgtgetggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcacc gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgat gcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctc cgggtggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcac acggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtc gccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagt tccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctg aagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcc catggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatg atgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:270).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
- 88 037355
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNCKTKPREEQYGSTYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO :267), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccc caaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgc gtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggta cgtggacggcgtggaggtgcataattgcaagacaaagccgcgggaggagc agtacggcagcacgtaccgtgtggtcagcgtctgcaccgtcctgcaccag gactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccct cccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgag aaccacaggtgtacaccctgcccccatcccggaaggagatgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgc cgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgc ctcccgtgctgaagtccgacggctccttcttcctctatagcaagctcacc gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgat gcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctc cgggtaaa (SEQ ID NO:271).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:269, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:267.
П.Н.9. DhCpmFc(-)(N297G)(А287С)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(N297G)(I306C).
Определение DhCpmFc(-)(N297G)(А287С)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(N297G)(L306C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(-) (N297G)(А287С), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+)(N297G)(L306C).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(N297G)(А287С)-GDF15(N3D): DhCpmFc(+)(N297G)(L306C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+)(N297G)(L306C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:290, (b) два домена DhCpmFc(-)(N297G)(А287С) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:268, и (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNCKTKPREEQYGSTYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL S PREVQVTMCIGACPS QFRAANMHAQIKT S LHRLKPDTVPAPCCVPAS YN PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:272), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 89 037355 gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccc caaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgc gtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggta cgtggacggcgtggaggtgcataattgcaagacaaagccgcgggaggagc agtacggcagcacgtaccgtgtggtcagcgtctgcaccgtcctgcaccag gactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccct cccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgag aaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgc cgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgc ctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcacc gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgat gcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctc cgggtgcgcgcgacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgc cgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattg ggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcc cgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctg caccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccag ctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctcc agacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:273).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:267, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:271.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:272, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:267.
II.H.10. DhCpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(N297G)(I306C)(S354C).
Определение DhCpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(N297G)(L306C) (S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C)-GDF15 (Ndel3):DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(а) два домена DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNCKTKPREEQYGSTYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:291), (b) два домена DhCpmFc(-)(N297G)(А287С)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNCKTKPREEQYGSTYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:275),
- 90 037355 и (с) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNCKTKPREEQYGSTYRVVSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPR ЕVQVTMCIGAG Р S Q FRAANMHAQIКТ S LHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMV LIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:276), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccc caaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgc gtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggta cgtggacggcgtggaggtgcataattgcaagacaaagccgcgggaggagc agtacggcagcacgtaccgtgtggtcagcgtctgcaccgtcctgcaccag gactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccct cccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgag aaccacaggtgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgc cgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgc ctcccgtgetggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcacc gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgat gcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctc cgggtggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcac acggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtc gccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagt tccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctg aagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcc catggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatg atgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:277).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNCKTKPREEQYGSTYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:274), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 91 037355 gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccc caaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgc gtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggta cgtggacggcgtggaggtgcataattgcaagacaaagccgcgggaggagc agtacggcagcacgtaccgtgtggtcagcgtctgcaccgtgctccaccag gactggcttaatgggaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaaggccct ccccgctcccatcgaaaagaccatctcaaaggcaaaggggcaaccaaggg aacctcaagtgtacaccctgcctccgtgcaggaaggagatgaccaagaac caggtcagcctgacttgtctcgtgaagggcttctatcccagcgatattgc tgtggaatgggagtcaaatggccagcccgagaataactacaaaactaccc cacccgtgctgaaatctgatgggtccttcttcctttactccaagctgacc gtggacaagagccgctggcaacaaggcaatgtctttagctgctcagtgat gcatgaggctctccataatcactacactcagaagtcactgtccctgtctc cgggtaaa (SEQ ID NO:278).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:276, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:274.
II.H. 11. DhCpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C).
Определение DhCpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(N297G)(L306C) (S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена DhCpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен DhCpmFc(+) (N297G) (L306C) (S354C).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров DhCpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C)-GDF15 (N3D):DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена DhCpmFc(+)(N297G)(L306C)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:291, (b) два домена DhCpmFc(-)(N297G)(А287С)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:275, и (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNCKTKPREEQYGSTYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL S PREVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKPDTVPAPCCVPAS YN PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:279), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 92 037355 gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccc caaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgc gtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggta cgtggacggcgtggaggtgcataattgcaagacaaagccgcgggaggagc agtacggcagcacgtaccgtgtggtcagcgtctgcaccgtcctgcaccag gactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccct cccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgag aaccacaggtgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgc cgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgc ctcccgtgetggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcacc gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgat goatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctcootgtetc cgggtgcgcgcgacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgc cgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattg ggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcc cgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctg caccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccag ctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctcc agacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:280).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:274, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:278.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:279, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:274.
II.H12. Dh2CpmFc(-)-GDF15(Ndel3):Dh2CpmFc(+).
Определение Dh2CpmFc(-)-GDF15(Ndel3):Dh2CpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), Nконец которого соединен напрямую с С-концом домена Dh2CpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен Dh2CpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров Dh2CpmFc(-)-GDF15(Ndel3):Dh2CpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит (а) два домена Dh2CpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG(SEQ ID NO:292), (b) два домена Dh2CpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQYNS TYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG(SEQ ID NO:155), и (с) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
- 93 037355
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMC IGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDT GVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:157), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctc ccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacc ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgcc aagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcag cgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatc ccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaag gcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccg gagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcctt cttoctetatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggga acgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg cagaagagcctctccctgtctccgggtggagaccactgtccgctegggee cgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgg gctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgc atcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagat caagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgct gcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacacc ggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactg cata (SEQ ID NO:156).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNS ТYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK(SEQ ID NO:154), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctc
- 94 037355 ccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacc ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgcc aagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcag cgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatc ccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaag gcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccg gagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgaagtccgacggctcctt cttoctetatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggga acgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg cagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (SEQ ID NO:158)
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:157, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:154.
П.Н. 13. Dh2CpmFc(-)-GDF 15(N3D):Dh2CpmFc(+).
Определение Dh2CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh2CpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), Nконец которого соединен напрямую с С-концом домена Dh2CpmFc(-) посредством пептидной связи, и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен Dh2CpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров Dh2CpmFc(-)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена Dh2CpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:292, (b) два домена Dh2CpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:155, и (с) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQV TMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQK TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:160), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 95 037355 ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctc ccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacc ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgcc aagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcag cgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatc ccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaag gcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccg gagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcctt cttoctetatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggga acgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg cagaagagcctctccctgtctccgggtgcgcgcgacggagaccactgtcc gctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctgg aagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtg accatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgca cgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccag cgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaag accgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaaga ctgccactgcata (SEQ ID NO:159).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:154, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 158.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:160, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:154.
II.H.14. Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3):Dh2CpmFc(+)(S354C).
Определение Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3):Dh2CpmFc(+)(S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена Dh2CpmFc(-)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен Dh2CpmFc(+)(S345C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С349 первой полипептидной цепи и С354 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3): Dh2CpmFc(+)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(а) два домена Dh2CpmFc(+)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG (SEQ ID NO:293), (b) два домена Dh2CpmFc(-)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQYNS ТYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG (SEQ ID NO:162), и (с) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
- 96 037355
SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMC IGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDT GVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:164), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctc ccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacc ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgcc aagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcag cgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtgcaccctgcccccatc ccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaag gcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccg gagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcctt cttoctetatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggga aegtettotcatgetccgtgatgoatgaggctctgcacaaccactacacg cagaagagcctctccctgtctccgggtggagaccactgtccgctegggee cgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgg gctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgc atcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagat caagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgct gcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacacc ggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactg cata (SEQ ID NO:163).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO:161), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 97 037355 ccatccgtgttcctgtttcctccaaagccgaaggacaccctgatgatctc aagaactccggaagtgacttgcgtcgtcgtggacgtgtcacatgaggatc cagaggtcaagttcaattggtatgtggacggagtggaagtgcataacgcc aagaccaaaccccgcgaagaacagtacaatagcacctaccgcgtggtgag cgtccttactgtgctccaccaggactggcttaatgggaaggaatacaagt gtaaggtgtccaacaaggccctccccgctcccatcgaaaagaccatctca aaggcaaaggggcaaccaagggaacctcaagtgtacaccctgcctccgtg caggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacttgtctcgtgaagg gcttctatcccagcgatattgctgtggaatgggagtcaaatggccagccc gagaataactacaaaactaccccacccgtgctgaaatctgatgggtcctt cttcctttactccaagctgaccgtggacaagagccgctggcaacaaggca atgtctttagctgctcagtgatgcatgaggctctccataatcactacact cagaagtcactgtccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO:165).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:164, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:161.
II.H.15. Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D):Dh2CpmFc(+)(S354C).
Определение Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D):Dh2CpmFc(+)(S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена Dh2CpmFc(-)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен Dh2CpmFc(+)(S345C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С349 первой полипептидной цепи и С354 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D): Dh2CpmFc(+)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена Dh2CpmFc(+)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:293, (b) два домена Dh2CpmFc(-)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:162, и (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQV ТМСIGAG Р S Q FRAANMHAQIКТ S LHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMVLIQK TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:167), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctc ccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacc ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgcc aagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcag
- 98 037355 cgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtgcaccctgcccccatc ccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaag gcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccg gagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcctt cttoctetatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggga acgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg cagaagagcctctccctgtctccgggtgcgcgcgacggagaccactgtcc gctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctgg aagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtg accatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgca cgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccag cgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaag accgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaaga ctgccactgcata (SEQ ID NO:166).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения второй мономер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:161, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:165.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:167, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:161.
II.H.16. CpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3):CpmFc(+)(N297G).
Определение CpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(N297G) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена CpmFc(-)(N297G), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен CpmFc(+)(N297G).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров CpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3):CpmFc(+) (N297G), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(а) два домена CpmFc(+)(N297G) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность (часть шарнирной области включена в скобки) (DKTHTCPPCP)APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:294), (b) два домена CpmFc(-)(N297G) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность (часть шарнирной области включена в скобки) (DKTHTCPPCP)APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:169), и (с) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
- 99 037355 (DKTHTCPPCP)APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLE
DLGWADWVL S PREVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKPDTVPA
PCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:171) которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcc tggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctc atgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagcca cgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgc ataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacggcagcacgtaccgt gtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagga gtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctg cccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcct ggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatg ggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgac ggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggca gcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaacc actacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtggagaccactgtccg ctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctgga agacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtga ccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcac gcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagc gccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaaga ccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagac tgccactgcata (SEQ ID NO:170).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (DKTHTCPPCP)APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVS LTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:168), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcc tggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctc atgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagcca cgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgc ataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacggcagcacgtaccgt gtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagga
- 100 037355 gtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctg cccccatcccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcct ggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatg ggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgaagtccgac ggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggca gcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaacc actacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO:172).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:171, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:168.
И.Н.17. CpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D):CpmFc(+)(N297G).
Определение CpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(N297G) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена CpmFc(-)(N297G), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен CpmFc(+)(N297G).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров CpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D):CpmFc(+) (N297G), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена CpmFc(+)(N297G) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:294, (b) два домена CpmFc(-)(N297G) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:169, и (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (DKTHTCPPCP)APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH
EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRA SLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDT VPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:174), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 101 037355 gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcc tggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctc atgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagcca cgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgc ataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacggcagcacgtaccgt gtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagga gtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaa ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctg cccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcct ggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatg ggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgac ggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggca gcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaacc actacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgcgcgcgacggagac cactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgc gtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggagg tgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggca aacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacac ggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctca ttcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgtta gccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:173).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:168, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность SEQ ID NO:172.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:174, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO: 168.
II.H.18. Dh2CpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3):Dh2CpmFc(+)(N297G).
Определение Dh2CpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3):Dh2CpmFc(+)(N297G) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена Dh2CpmFc(-)(N297G), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен Dh2CpmFc(+)(N297G).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров Dh2CpmFc(-)(N297G)-GDF15(Ndel3): Dh2CpmFc(+)(N297G), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(а) два домена Dh2CpmFc(+)(N297G) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG(SEQ ID NO:295), (b) два домена Dh2CpmFc(-)(N297G) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG(SEQ ID NO:176), и (с) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
- 102 037355
SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMC IGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDT GVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:178), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctc ccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacc ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgcc aagacaaagccgcgggaggagcagtacgggagcacgtaccgtgtggtcag cgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatc ccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaag gcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccg gagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcctt cttoctetatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggga acgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg cagaagagcctctccctgtctccgggtggagaccactgtccgctegggee cgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgg gctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgc atcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagat caagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgct gcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacacc ggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactg cata (SEQ ID NO:177).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK(SEQ ID NO:175), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 103 037355 ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctc ccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacc ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgcc aagacaaagccgcgggaggagcagtacgggagcacgtaccgtgtggtcag cgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatc ccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaag gcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccg gagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgaagtccgacggctcctt cttoctetatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggga acgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg cagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (SEQ ID NO:179).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:178, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:175.
II.H.19. Dh2CpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D):Dh2CpmFc(+)(N297G).
Определение Dh2CpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+)(N297G) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена Dh2CpmFc(-)(N297G), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен Dh2CpmFc(+)(N297G).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров Dh2CpmFc(-)(N297G)-GDF15(N3D): Dh2CpmFc(+)(N297G), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена Dh2CpmFc(+)(N297G) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:295, (b) два домена Dh2CpmFc(-)(N297G) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:176, и (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность:
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYGS ТYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQV ТМСIGACPS Q FRAANMHAQIКТ S LHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQK TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:181), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 104 037355 ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctc ccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacc ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgcc aagacaaagccgcgggaggagcagtacgggagcacgtaccgtgtggtcag cgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatc ccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaag gcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccg gagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcctt cttoctetatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggga acgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg cagaagagcctctccctgtctccgggtgcgcgcgacggagaccactgtcc gctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctgg aagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtg accatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgca cgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccag cgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaag accgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaaga ctgccactgcata (SEQ ID NO:180).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:175, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 179.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:181, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:175.
II.H.20. Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(Ndel3):Dh2CpmFc(+)(N297G)(S354C).
Определение Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(Ndel3):Dh2CpmFc(+)(N297G)(S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), N-конец которого соединен напрямую с С-концом полипептида Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен Dh2CpmFc(+) (N297G) (S345C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С349 первой полипептидной цепи и С354 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(Ndel3): h2CpmFc(+)(N297G)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(а) два домена Dh2CpmFc(+)(N297G)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG (SEQ ID NO:296), (b) два домена Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
- 105 037355
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG (SEQ ID NO:183), и (с) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMC IGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDT GVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:185), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctc ccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacc ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgcc aagacaaagccgcgggaggagcagtacggcagcacgtaccgtgtggtcag cgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtgcaccctgcccccatc ccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaag gcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccg gagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcctt cttoctetatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggga acgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg cagaagagcctctccctgtctccgggtggagaccactgtccgctegggee cgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgg gctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgc atcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagat caagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgct gcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacacc ggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactg cata (SEQ ID NO:184).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO:182), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 106 037355 ccatccgtgttcctgtttcctccaaagccgaaggacaccctgatgatctc aagaactccggaagtgacttgcgtcgtcgtggacgtgtcacatgaggatc cagaggtcaagttcaattggtatgtggacggagtggaagtgcataacgcc aagaccaaaccccgcgaagaacagtacgggagcacctaccgcgtggtgag cgtccttactgtgctccaccaggactggcttaatgggaaggaatacaagt gtaaggtgtccaacaaggccctccccgctcccatcgaaaagaccatctca aaggcaaaggggcaaccaagggaacctcaagtgtacaccctgcctccgtg caggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacttgtctcgtgaagg gcttctatcccagcgatattgctgtggaatgggagtcaaatggccagccc gagaataactacaaaactaccccacccgtgctgaaatctgatgggtcctt cttcctttactccaagctgaccgtggacaagagccgctggcaacaaggca atgtctttagctgctcagtgatgcatgaggctctccataatcactacact cagaagtcactgtccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO:186).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:185, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:182.
II.H.21. Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF 15(N3D):Dh2CpmFc(+)(N297G)(S354C).
Определение Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(N3D):Dh2CpmFc(+)(N297G)(S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена Dh2CpmFc() (N297G)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен Dh2CpmFc(+)(N297G)(S345C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С349 первого полипептида и С354 второго полипептида.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C)-GDF15(N3D): Dh2CpmFc(+)(N297G)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена Dh2CpmFc(+)(N297G)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:296, (b) два домена Dh2CpmFc(-)(N297G)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:183, и (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQV TMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQK TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:188), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 107 037355 ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctc ccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacc ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgcc aagacaaagccgcgggaggagcagtacgggagcacgtaccgtgtggtcag cgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtgcaccctgcccccatc ccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaag gcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccg gagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcctt cttoctetatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggga acgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg cagaagagcctctccctgtctccgggtgcgcgcgacggagaccactgtcc gctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctgg aagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtg accatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgca cgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccag cgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcecatggtgetcattcaaaag accgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaaga ctgccactgcata (SEQ ID NO:187).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:182, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 186.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:188, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:182.
II.H.22. Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)-GDF15(Ndel3):Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C).
Определение Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)-GDF15(Ndel3):Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена Dh2CpmFc(-) (N297G)(А287С), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С287 первого мономера и С306 второго мономера.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)-GDF15(Ndel3): Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит:
(а) два домена Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNC KTKPREEQYGSTYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG (SEQ ID NO:297), (b) два Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
- 108 037355
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNC KTKPREEQYGSTYRVVSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG (SEQ ID NO:192), и (с) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNC KTKPREEQYGSTYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMC IGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDT GVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:194), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctca tgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccac gaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgca taattgcaagacaaagccgcgggaggagcagtacggcagcacgtaccgtg tggtcagcgtctgcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag tacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaac catctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgc ccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctg gtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgg gcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacg getccttcttoctetatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcag caggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaacca ctacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtggagaccactgtccgc tcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaa gacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgac catgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacg cgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcg ccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagac cgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagact gccactgcata(SEQ ID NO:193).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNC KTKPREEQYGS TYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO:191), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 109 037355 ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctca tgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccac gaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgca taattgcaagacaaagccgcgggaggagcagtacggcagcacgtaccgtg tggtcagcgtctgcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag tacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaac catctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgc ccccatcccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctg gtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgg gcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgaagtccgacg gctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcag caggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaacca ctacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO:195).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:194, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:191.
II.H.23. Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)-GDF15(N3D):Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C).
Определение Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)-GDF15(N3D):Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена Dh2CpmFc() (N297G)(А287С), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С287 первой полипептидной цепи и С306 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)-GDF15(N3D): Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит:
(a) два домена Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:297, (b) два домена Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:192, и (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNC KTKPREEQYGSTYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQV TMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQK TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:197), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 110 037355 ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctca tgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccac gaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgca taattgcaagacaaagccgcgggaggagcagtacggcagcacgtaccgtg tggtcagcgtctgcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag tacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaac catctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgc ccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctg gtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgg gcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacg getccttcttoctetatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcag caggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaacca ctacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgcgcgcgacggagacc actgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcg tcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggt gcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaa acatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacg gtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcat tcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttag ccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:196).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:191, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 195.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:197, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:191.
II.H.24. Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C)-GDF15(Ndel3):Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C)
Определение Dh2CpmFc(-)(N297G)(A287C)(Y349C)-GDF15(Ndel3):Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C) (S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С287 первой полипептидной цепи и С306 второй полипептидной цепи и между С349 первой полипептидной цепи и С349 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C)-GDF15 (Ndel3):Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит:
(а) два домена Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNC
KTKPREEQYGSTYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG (SEQ ID NO:298), (b) два домена Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
- 111 037355
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNC KTKPREEQYGSTYRVVSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG (SEQ ID NO:199), и (с) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNC KTKPREEQYGS TYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIЕКТIS KAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMC IGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDT GVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:201), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctca tgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccac gaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgca taattgcaagacaaagccgcgggaggagcagtacggcagcacgtaccgtg tggtcagcgtctgcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag tacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaac catctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtgcaccctgc ccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctg gtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgg gcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacg gctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcag caggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaacca ctacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtggagaccactgtccgc tcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaa gacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgac catgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacg cgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcg ccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagac cgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagact gccactgcata (SEQ ID NO:200).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNC KTKPREEQYGSTYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO:198), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 112 037355 ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctca tgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccac gaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgca taattgcaagacaaagccgcgggaggagcagtacggcagcacgtaccgtg tggtcagcgtctgcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag tacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaac catctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgc ccccatgccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctg gtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgg gcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgaagtccgacg getccttcttoctetatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcag caggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaacca ctacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NQ:202).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:201, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:198.
II.H.25. Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C)-GDF15(N3D):Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C).
Определение Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C)-GDF15(N3D):Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C) (S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первый мономер, содержащий полипептид GDF15(N3D), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С287 первой полипептидной цепи и С306 второй полипептидной цепи и между С349 первой полипептидной цепи и С349 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C)GDF15(N3D):Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит:
(а) два домена Dh2CpmFc(+)(N297G)(L306C)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:298, (b) два домена Dh2CpmFc(-)(N297G)(А287С)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:199, и (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность (SEQ ID NO:52).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNC KTKPREEQYGSTYRWSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQV TMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQK TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:204), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 113 037355 ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctca tgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccac gaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgca taattgcaagacaaagccgcgggaggagcagtacggcagcacgtaccgtg tggtcagcgtctgcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag tacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaac catctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtgcaccctgc ccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctg gtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgg gcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacg getccttcttoctetatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcag caggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaacca ctacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgcgcgcgacggagacc actgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcg tcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggt gcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaa acatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacg gtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcat tcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttag ccaaagactgccactgcata (SEQ ID NQ:203).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:198, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:202.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:204, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:198.
П.Н.26. GG-Dh2CpmFc(-)-GDF15(Ndel3):GG-Dh2CpmFc(+).
Определение GG-Dh2CpmFc(-)-GDF15(Ndel3):GG-Dh2CpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена GG-Dh2CpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен GG-Dh2CpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров GG-Dh2CpmFc(-)-GDF15(Ndel3):GGDh2CpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(а) два домена GG-Dh2CpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:299), (b) два домена GG-Dh2CpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:206), и (с) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная
- 114 037355 цепь содержит аминокислотную последовательность
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVT МСIGAC Р S Q FRAANMHAQIКТ S LHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMVLIQKT DTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:208), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ggtggcccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggaca ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtg agccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgt accgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtaca ccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacc tgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagag caatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggact ccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgca caaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtggagaccact gtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcg ctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgca agtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaaca tgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtg ccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattca aaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagcca aagactgccactgcata (SEQ ID NO:207).
Согласно варианту реализации настоящего изобретения, в котором применяется сигнальная последовательность VH21, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (сигнальная последовательность подчеркнута)
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRAS LEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTV PAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:243), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (сигнальная последовательность подчеркнута)
- 115 037355 atqqaatqqaqctqqqtctttctcttcttcctqtcaqtaacqactqqtqt ccactccgqtqqcccqtcaqtcttcctcttccccccaaaacccaagqaca cccteatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtg agccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgt accgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtaca ccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacc tgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagag caatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggact ccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgca caaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtggagaccact gtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcg ctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgca agtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaaca tgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtg ccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattca aaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagcca aagactgccactgcata (SEQ ID NO:244).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:205), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ggtggcccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggaca ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtg agccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgt accgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtaca ccctgcccccatcccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacc tgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagag caatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgaagt ccgacggctccttcttoctetatagcaagctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttotcatgotccgtgatgoatgaggetetgea caaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO:209).
Согласно варианту реализации настоящего изобретения, в котором применяется сигнальная последовательность VH21, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (сигнальная последовательность подчеркнута)
- 116 037355
MEWSWVFLFFLSVTTGVHS GGP S VFL FPPKPKDT LMISRT PEVT CVWDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:245), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (сигнальная последовательность подчеркнута) atggaatqgagctqggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactqgtgt ccactccggtggcccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggaca ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtg agccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgt accgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtaca ccctgcccccatcccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacc tgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagag caatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgaagt ccgacggctccttcttoctetatagcaagctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgca caaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID
NO:246).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:208, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:205.
II.H.27. GG-Dh2CpmFc(-)-GDF15(N3D):GG-Dh2CpmFc(+).
Определение GG-Dh2CpmFc(-)-GDF15(N3D):GG-DhCpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена GG-Dh2CpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен GG-DhCpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров GG-Dh2CpmFc(-)-GDF15(N3D):GG-Dh2CpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена GG-Dh2CpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:299, (b) два домена GG-Dh2CpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:206, и (с) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREV QVTMCIGAG Р S Q FRAANMHAQIКТ S LHRLKPDTVPAPC CVPAS YNPMVLI QKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:211), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 117 037355 ggtggcccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggaca ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtg agccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgt accgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtaca ccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacc tgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagag caatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggact ccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgca caaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgcgcgcgacg gagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtc cgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacg ggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccggg cggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagccc gacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggt gctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgact tgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NQ:210).
Согласно варианту реализации настоящего изобретения, в котором применяется сигнальная последовательность VH21, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (сигнальная последовательность подчеркнута)
MEWSWVFLFFLSVTTGVHS GGP S VFL ЕР PKPKDT LMIS RT РЕ VT CVWDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTV RASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKP DTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:247), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (сигнальная последовательность подчеркнута)
- 118 037355 atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgt ccactccqqtqqcccqtcaqtcttcctcttccccccaaaacccaaqqaca ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtg agccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgt accgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtaca ccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacc tgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagag caatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggact ccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgca caaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgcgcgcgacg gagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtc cgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacg ggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccggg cggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagccc gacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggt gctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgact tgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:248).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:205, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:209.
Согласно варианту реализации настоящего изобретения, в котором применяется сигнальная последовательность VH21, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:245, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:246.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:211, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:205.
П.Н.2. GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3):GG-Dh2CpmFc(+)(S354C).
Определение GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3):GG-Dh2CpmFc(+)(S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена GG-Dh2CpmFc(-) (Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен GG-Dh2CpmFc(+)(S345C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С349 первой полипептидной цепи и С354 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3):GGDh2CpmFc(+)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(а) два GG-Dh2CpmFc(+)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:300), (b) две цепи GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
- 119 037355
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:213), и (с) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVT MCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKT DTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:215), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ggtggcccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggaca ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtg agccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgt accgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtgca ccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacc tgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagag caatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggact ccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgca caaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtggagaccact gtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcg ctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgca agtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaaca tgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtg ccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattca aaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagcca aagactgccactgcata (SEQ ID NO:214).
Согласно варианту реализации настоящего изобретения, в котором применяется сигнальная последовательность VH21, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (сигнальная последовательность подчеркнута)
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRAS LEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTV
PAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:249), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (сигнальная последовательность
- 120 037355 подчеркнута) atqqaatgqaqctqqqtctttctcttcttcctqtcaqtaacqactqqtqt ccactccgqtqqcccqtcaqtcttcctcttccccccaaaacccaaqqaca ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgegtggtggtggacgtg agccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgt accgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtgca ccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacc tgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagag caatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggact ccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgca caaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtggagaccact gtcagetcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgteg ctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgca agtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaaca tgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtg ccagcgccctgctgegtgcccgccagctacaatcocatggtgetcattea aaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagcca aagactgccactgcata (SEQ ID NO:250).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:212), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ggtggcccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggaca ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgegtggtggtggacgtg agccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgt accgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtaca ccctgcccccatgccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacc tgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagag caatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgaagt ccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgca caaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO:216) .
Согласно варианту реализации настоящего изобретения, в котором применяется сигнальная последовательность VH21, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (сигнальная последовательность подчеркнута)
- 121 037355
MEWSWVFLFFLSVTTGVHS GGP S VFL FPPKPKDTLMISRT PEVT CVWDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:251), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (сигнальная последовательность подчеркнута) atqqaatqqaqctqqqtctttctcttcttcctqtcaqtaacqactqqtqt ccactccggtggcccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggaca ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtg agccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgt accgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtaca ccctgcccccatgccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacc tgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagag caatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgaagt ccgacggctccttcttoctetatagcaagctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttotcatgotccgtgatgoatgaggetetgea caaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO:252) .
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:215, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:212.
П.Н.29. GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D):GG-Dh2CpmFc(+)(S354C).
Определение GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D):GG-Dh2CpmFc(+)(S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена GG-Dh2CpmFc(-) (Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен GG-Dh2CpmFc(+) (S345C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С349 первой полипептидной цепи и С354 второй полипептидной цепи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D):GGDh2CpmFc(+)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена GG-Dh2CpmFc(+)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:300, (b) два домена GG-Dh2CpmFc(-)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:213, и (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
- 122 037355
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREV QVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKP D TVPAP C CVPAS YNPMVLI
QKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO :218) , которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ggtggcccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggaca ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtg agccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgt accgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtgca ccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacc tgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagag caatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggact ccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgca caaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgcgcgcgacg gagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtc cgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacg ggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccggg cggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagccc gacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggt gctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgact tgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:217).
Согласно варианту реализации настоящего изобретения, в котором применяется сигнальная последовательность VH21, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (сигнальная последовательность подчеркнута)
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTV RAS LE DLGWADWVL S PREVQVTMCIGAC Р S Q FRAANMHAQIKT S LHRLKP
DTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:253), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (сигнальная последовательность подчеркнута) atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgt ccactccggtggcccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggaca ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtg agccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgt accgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc
- 123 037355 aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtgca ccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacc tgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagag caatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggact ccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgca caaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgcgcgcgacg gagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtc cgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacg ggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccggg cggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagccc gacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggt gctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgact tgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:254).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:212, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:218.
Согласно варианту реализации настоящего изобретения, в котором применяется сигнальная последовательность VH21, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:251, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:252.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:218, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:212.
И.Н.30. Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+).
Определение Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), Nконец которого соединен напрямую с С-концом домена Dh3CpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен Dh3CpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(а) два домена Dh3CpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPG (SEQ ID NO:301), (b) два домена Dh3CpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPG (SEQ ID NO:220), и (с) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
- 124 037355
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTM CIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTD
TGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:222), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ggcccgtcagtcttcctcttccccccaaaaccca aggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacgg cgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccc catcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg tgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtg ggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgc tggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggacaag agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggc tctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtggag accactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgc gcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacggga ggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcgg caaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgac acggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgct cattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgt tagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:221).
Согласно варианту реализации настоящего изобретения, в котором применяется сигнальная последовательность VK1, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (сигнальная последовательность подчеркнута)
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCGPSVFLFPPKPKDTLMISRT РЕVT CVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVR ASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPD
TVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:255), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (сигнальная последовательность подчеркнута)
- 125 037355 atggacatgagggtgcccgctcagctcctggggctcctgctgctgtggct qaqaqqtqcqcqctqtqqcccqtcaqtcttcctcttccccccaaaaccca aggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacgg cgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccc catcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg tgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtg ggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgc tggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggacaag agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggc tctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtggag accactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgc gcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacggga ggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcgg caaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgac acggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgct cattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgt tagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:256).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:219), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ggcccgtcagtcttcctcttccccccaaaaccca aggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacgg cgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccc catcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg tgtacaccctgcccccatcccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtg ggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgc tgaagtccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaag agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggc tctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO:223).
Согласно варианту реализации настоящего изобретения, в котором применяется сигнальная последовательность VK1, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (сигнальная последовательность подчеркнута)
- 126 037355
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCGPSVFL FPPKPKDTLM IS RT PE VT CVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:257), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (сигнальная последовательность подчеркнута) atqqacatqaqqqtqcccqctcaqctcctqqqqctcctqctqctqtqqct qaqaqqtqcqcqctqtqqcccqtcaqtcttcctcttccccccaaaaccca aggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacgg cgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccc catcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg tgtacaccctgcccccatcccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtg ggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgc tgaagtccgacggctccttcttoctetatagcaagctcaccgtggacaag agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggc tctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO:258).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:222, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:219.
П.Н.31. Dh3CpmFc(-)-GDF 15(N3D):Dh3CpmFc(+).
Определение Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), Nконец которого соединен напрямую с С-концом домена Dh3CpmFc(-), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен Dh3CpmFc(+).
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена Dh3CpmFc(+) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:301, (b) два Dh3CpmFc(-) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:220, и (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQ VTMCIGAC Р S Q FRAANMHAQIКТ S LHRLKPD ТVPAPCCVPAS YNPMVLIQ KTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:225), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 127 037355 atggacatgagggtgcccgctcagctcctggggctcctgctgctgtggct gagaggtgcgcgctgtggcccgtcagtcttcctcttccccccaaaaccca aggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacgg cgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccc catcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg tgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtg ggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgc tggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggacaag agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggc tctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgcgc gcgacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcac acggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtc gccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagt tccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctg aagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcc catggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatg atgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:224).
Согласно варианту реализации настоящего изобретения, в котором применяется сигнальная последовательность VK1, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (сигнальная последовательность подчеркнута)
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCGPSVFLFPPKPKDTLMISRT РЕVT CVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLH ТVRAS LE DLGWADWVL S PREVQVTMCIGAG Р S Q FRAANMHAQIKT S LHRL KPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID
NO:259) , которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (сигнальная последовательность подчеркнута)
- 128 037355 atggacatgagggtgcccgctcagctcctggggctcctgctgctgtggct gagaggtgcgcgctgtggcccgtcagtcttcctcttccccccaaaaccca aggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacgg cgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccc catcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg tgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtg ggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgc tggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggacaag agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggc tctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgcgc gcgacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcac acggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtc gccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagt tccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctg aagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcc catggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatg atgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:260).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:219, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:223.
Согласно варианту реализации настоящего изобретения, в котором применяется сигнальная последовательность VK1, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:257, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:258.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:225, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:219.
II.H.32. Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+)(S354C).
Определение Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+)(S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(Ndel3), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена Dh3CpmFc(-)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен Dh3CpmFc(+)(S345C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С349 первого полипептида и С354 второго полипептида.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3): Dh3CpmFc(+) (S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения тетрамер содержит:
(а) два домена Dh3CpmFc(+)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPG (SEQ ID NO:302), (b) два домена Dh3CpmFc(-)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность
- 129 037355
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNS TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPG (SEQ ID NO:227), и (с) два полипептида GDF15(Ndel3) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:55.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTM CIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTD TGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:229), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты atggacatgagggtgcccgctcagctcctggggctcctgctgctgtggct gagaggtgcgcgctgtggcccgtcagtcttcctcttccccccaaaaccca aggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacgg cgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccc catcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg tgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtg ggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgc tggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggacaag agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggc tctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtggag accactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgc gcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacggga ggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcgg caaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgac aeggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcecatggtget cattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgt tagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:228).
Согласно варианту реализации настоящего изобретения, в котором применяется сигнальная последовательность VK1, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (сигнальная последовательность подчеркнута)
- 130 037355
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCGPSVFLFP PKPKDT LMIS RTPEVT CVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGDHCPLGPGRCCRLHTVR ASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPD
TVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:261), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (сигнальная последовательность подчеркнута) atqqacatqaqqqtqcccqctcaqctcctqqqqctcctqctqctqtqqct qaqaqqtqcqcqctqtgqcccqtcaqtcttcctcttccccccaaaaccca aggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacgg cgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccc catcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg tgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtg ggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgc tggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggacaag agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggc tctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtggag accactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgc gcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacggga ggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcgg caaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgac aeggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcecatggtget cattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgt tagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:262).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:226), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты
- 131 037355 ggcccgtcagtcttcctcttccccccaaaaccca aggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacgg cgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccc catcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg tgtacaccctgcccccatgccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtg ggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgc tgaagtccgacggctccttcttoctetatagcaagctcaccgtggacaag agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggc tctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 230).
Согласно варианту реализации настоящего изобретения, в котором применяется сигнальная последовательность VK1, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (сигнальная последовательность подчеркнута)
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCG Р S VFL FP PKPKD Т LMIS RT РЕ VT CVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:263), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (сигнальная последовательность подчеркнута) atqqacatqaqqqtqcccqctcaqctcctqqqqctcctqctqctqtqqct aaqaaatqcacactqtgacccatcaatcttcctcttccccccaaaaccca aggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacgg cgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccc catcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg tgtacaccctgcccccatgccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtg ggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgc tgaagtccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaag agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggc tctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID
NO:264).
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:229, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:226.
II.H.33. Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+)(S354C).
Определение Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+)(S354C) в настоящем изобретении означает гетеродимер, который содержит (i) первую полипептидную цепь, содержащую полипептид GDF15(N3D), N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена Dh3CpmFc(-)(Y349C), и (ii) вторую полипептидную цепь, содержащую домен Dh3CpmFc(+)(S345C). Мутации cysteine clamp позволяют соединить первую и вторую полипептидные цепи посредством межцепочечной дисульфидной связи между С349 первой полипептидной цепи и С354 второй полипептидной цепи.
- 132 037355
Согласно определенным вариантам реализации изобретения предложен тетрамер, который содержит димер, состоящий из двух гетеродимеров Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D): Dh3CpmFc(+)(S354C), в котором две первые полипептидные цепи каждого гетеродимера соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими областями GDF15 данных цепей.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения тетрамер содержит:
(a) два домена Dh3CpmFc(+)(S354C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:302, (b) два домена Dh3CpmFc(-)(Y349C) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:227, и (c) два полипептида GDF15(N3D) (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:52.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQ VTMCIGAG Р S Q FRAANMHAQIКТ S LHRLKPDTVPAP CCVPAS YNPMVLIQ KTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 232), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ggcccgtcagtcttcctcttccccccaaaaccca aggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacgg cgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccc catcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg tgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtg ggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgc tggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggacaag agcaggtggcagcaggggaacgtcttotcatgotccgtgatgoatgaggc tctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgcgc gcgacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcac acggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtc gccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagt tccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctg aagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcc catggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatg atgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:231).
Согласно варианту реализации настоящего изобретения, в котором применяется сигнальная последовательность VK1, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность (сигнальная последовательность подчеркнута)
- 133 037355
MDMRVPAQLLGLLLL^RGARCGP S VFL FP PKPKDT LMIS RT PE VT CVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGARDGDHCPLGPGRCCRLH TVRAS LE D L GWADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRL KPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:265), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (сигнальная последовательность подчеркнута) atggacatgagggtgcccgctcagctcctggggctcctgctgctgtggct qaqaqqtqcqcqctqtqqcccqtcaqtcttcctcttccccccaaaaccca aggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacgg cgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccc catcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg tgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtg ggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgc tggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcaccgtggacaag agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggc tctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtgcgc gcgacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcac acggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtc gccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagt tccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctg aagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcc catggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatg atgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:266).
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:226, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:230.
Согласно варианту реализации настоящего изобретения, в котором применяется сигнальная последовательность VK1, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:263, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:264.
Как обсуждалось выше, предложен тетрамер, содержащий две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:232, и две полипептидные цепи, которые содержат последовательность SEQ ID NO:226.
II.H.34. DhMonoFc (N297G)-GDF15.
Определение DhMonoFc(N297G)-GDF15 в настоящем изобретении означает гибридный белок, содержащий полипептид GDF15, N-конец которого соединен напрямую с С-концом домена DhMonoFc (N297G) посредством пептидной связи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два таких гибридных белка, связанных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими полипептидами GDF15 данных белков.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации изобретения гомодимер содержит:
(а) два домена DhMonoFc(N297G) (в каждом мономере), содержащих последовательность
- 134 037355
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVTTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:233);
и (b) два полипептида GDF15 (в каждом гетеродимере), содержащих последовательность SEQ ID NO:12.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVTTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL SPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYN PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:235), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccc caaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgc gtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggta cgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagc agtacggcagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccag gactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccct cccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgag aaccacaggtgaccaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgc cgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgc ctcccgtgetggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcacc gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgat gcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctc cgggtgcgcgcaacggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgc cgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattg ggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcc cgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctg caccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccag ctacaatcecatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctec agacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:234).
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, который содержит два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO:235.
П.Н.35. DhMonoFc (N297g)-(G4S)4-GDF15.
Определение DhMonoFc(N297G)-(G4S)4-GDF15 в настоящем изобретении означает гибридный белок, содержащий полипептид GDF15, соединенный с доменом DhMonoFc(N297G) посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:18 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhMonoFc(N297G) посредством пептидной связи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два таких гибридных белка, связанных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими полипептидами GDF15 данных белков.
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения гомодимер содержит:
(а) два домена DhMonoFc(N297G) (в каждом мономере), содержащих последовательность
- 135 037355
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVTTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:236);
(b) два полипептида GDF15 (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO: 12; и (c) два полипептидных линкера (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:18, каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhMonoFc (N297G) посредством пептидных связей.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность (линкер подчеркнут двойной чертой):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVTTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALΗΝΗYТQКSLSLSРGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDНСРLGРGRС CRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTS LHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:238), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccc caaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgc gtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggta cgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagc agtacggcagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccag gactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccct cccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgag aaccacaggtgaccaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgc cgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgc ctcccgtgetggactccgacggctccttcttoctetatagcgacctcacc gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgat gcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctc cgggtggaggtggtggatccggaggcggtggaagcggaggtggtggatct ggaggcggtggaagcgcgcgcaacggagaccactgtccgctcgggcccgg gcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggct gggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatc ggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaa gacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcg tgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggg gtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (SEQ ID NO:237).
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, который содержит два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO:238.
II.H.36. DhMonoFc(N297G)-G4-GDF15.
Определение DhMonoFc(N297G)-G4-GDF15 в настоящем изобретении означает гибридный белок, содержащий полипептид GDF15, соединенный с доменом DhMonoFc(N297G) посредством линкера, который содержит последовательность SEQ ID NO:58 и который соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhMonoFc(N297G) посредством пептидной связи.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, содержащий два таких гибридных белка, связанных посредством межцепочечной дисульфидной связи между соответствующими полипептидами GDF15 данных белков.
- 136 037355
Более конкретно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения гомодимер содержит:
(a) два домена DhMonoFc(N297G) (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:236;
(b) два полипептида GDF15 (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO: 12; и (c) два полипептидных линкера (в каждом мономере), содержащих последовательность SEQ ID NO:58, каждый из которых соединяет N-конец полипептида GDF15 с С-концом домена DhMonoFc(N297G) посредством пептидных связей.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность (линкер подчеркнут двойной чертой)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVTTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGGGGGARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWA DWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVP ASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:240), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccc caaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgc gtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggta cgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagc agtacggcagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccag gactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccct cccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgag aaccacaggtgaccaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgc cgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgc ctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcacc gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgat gcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctc cgggtggaggtggtggagcgcgcaacggagaccactgtccgctcgggccc gggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctggg ctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgca tcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagate aagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctg cgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccg gggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgc ata (SEQ ID NO:239).
Как обсуждалось выше, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложен гомодимер, который содержит два мономера, содержащих последовательность SEQ ID NO:240.
III. Полипептиды GDF15 и конструкции, содержащие GDF15, в том числе мутантные формы GDF15.
Как раскрыто в настоящей заявке, полипептиды GDF15 (в том числе полноразмерная и зрелая формы GDF15 человека) и конструкции, содержащие GDF15, описанные в настоящем изобретении, можно сконструировать и/или получить с применением стандартных молекулярно-биологических методик образования мутантной формы полипептидов GDF15 и конструкций, предложенных в настоящей заявке. В различных примерах последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую мутантную форму полипептидов GDF15 и конструкции, предложенные в настоящей заявке, которые могут содержать все последовательности SEQ ID NO:4, 8 или 12 или их часть, можно выделить и/или амплифицировать из геномной ДНК или кДНК с применением соответствующих олигонуклеотидных праймеров. Праймеры могут быть сконструированы на основе последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотной последо- 137 037355 вательности, предложенных в настоящей заявке, согласно стандартным методикам амплификации методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Затем амплифицированную нуклеиновую кислоту мутантного полипептида GDF15 можно клонировать в подходящий вектор и охарактеризовать посредством анализа последовательности ДНК.
Олигонуклеотиды для применения в качестве зондов при выделении или амплификации всех или части мутантных форм полипептидов GDF15 и конструкций, предложенных в заявке, могут быть сконструированы и получены с применением стандартных методик синтеза, например приборов для автоматического синтеза ДНК, или могут быть выделены из более протяженной последовательности ДНК.
Ш.А. Полипептидная и полинуклеотидная последовательности GDF15.
GDF15 экспрессируется in vivo в виде непрерывной аминокислотной последовательности, содержащий сигнальную последовательность, продомен и активный домен.
Аминокислотная последовательность полноразмерного GDF15 человека длиной 308 аминокислот представляет собой
MPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSED SRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGH LHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARP QAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNG DHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRA ANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDL LAKDCHCI (SEQ ID NO:4) и кодируется последовательностью ДНК atgcccgggcaagaactcaggacggtgaatggctctcagatgctcctggt gttgctggtgctctcgtggctgccgcatgggggcgccctgtctctggccg aggcgagccgcgcaagtttcccgggaccctcagagttgcactccgaagac tccagattccgagagttgcggaaacgctacgaggacctgctaaccaggct gcgggccaaccagagctgggaagattcgaacaccgacctcgtcccggccc ctgcagtccggatactcacgccagaagtgcggctgggatccggcggccac ctgcacctgcgtatctctcgggccgcccttcccgaggggctccccgaggc ctcccgccttcaccgggctctgttccggctgtccccgacggcgtcaaggt cgtgggacgtgacacgaccgctgcggcgtcagctcagccttgcaagaccc caggcgcccgcgctgcacctgcgactgtcgccgccgccgtcgcagtcgga ccaactgctggcagaatcttcgtccgcacggccccagctggagttgcact tgcggccgcaagccgccagggggcgccgcagagcgcgtgcgcgcaacggg gaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccg cgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacggg aggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcg gcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccga cacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgc tcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttg ttagccaaagactgccactgcatatga (SEQ ID NO:3).
Аминокислотная последовательность полноразмерного GDF15 мыши длиной 303 аминокислоты представляет собой
MAPPALQAQPPGGSQLRFLLFLLLLLLLLSWPSQGDALAMPEQRPSGPES QLNADELRGRFQDLLSRLHANQSREDSNSEPSPDPAVRILSPEVRLGSHG QLLLRVNRASLSQGLPEAYRVHRALLLLTPTARPWDITRPLKRALSLRGP RAPALRLRLTPPPDLAMLPSGGTQLELRLRVAAGRGRRSAHAHPRDSCPL GPGRCCHLETVQATLEDLGWSDWVLSPRQLQLSMCVGECPHLYRSANTHA QIKARLHGLQPDKVPAPCCVPSSYTPWLMHRTDSGVSLQTYDDLVARGC НСА (SEQ ID NO:6) и кодируется последовательностью ДНК
- 138 037355 atggccccgcccgcgctccaggcccagcctccaggcggctctcaactgag gttcctgctgttcctgctgctgttgctgctgctgctgtcatggccatcgc agggggacgccctggcaatgcctgaacagcgaccctccggccctgagtcc caactcaacgccgacgagctacggggtcgcttccaggacctgctgagccg gctgcatgccaaccagagccgagaggactcgaactcagaaccaagtcctg acccagctgtccggatactcagtccagaggtgagattggggtcccacggc cagetgctactccgcgtcaaccgggcgtcgctgagtcagggtctccccga agcctaccgcgtgcaccgagcgctgctcctgctgacgccgacggcccgcc cctgggacatcactaggcccctgaagcgtgcgctcagcctccggggaccc cgtgctcccgcattacgcctgcgcctgacgccgcctccggacctggctat gctgccctctggcggcacgcagctggaactgcgcttacgggtagccgccg gcagggggcgccgaagcgcgcatgcgcacccaagagactcgtgcccactg ggtccggggcgctgctgtcacttggagactgtgcaggcaactcttgaaga cttgggctggagcgactgggtgctgtccccgcgccagctgcagctgagca tgtgcgtgggcgagtgtccccacctgtatcgctccgcgaacacgcatgcg садаtcaaagcacgcctgcatggcctgcagcctgacaaggtgeetgcccc gtgctgtgtcccctccagctacaccccggtggttcttatgcacaggacag acagtggtgtgtcactgcagacttatgatgacctggtggcccggggctgc cactgcgcttga (SEQ ID NO:5).
Аминокислотная последовательность GDF15 человека после отщепления сигнальной последовательности длиной 29 остатков представляет собой
LSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTD LVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSP TASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQ LELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWV LSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASY NPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:8) и кодируется последовательностью ДНК ctgtctctggccgaggcgagccgcgcaagtttcccgggaccctcagagtt gcactccgaagactccagattccgagagttgcggaaacgctacgaggacc tgctaaccaggctgcgggccaaccagagctgggaagattcgaacaccgac ctcgtcccggcccctgcagtccggatactcacgccagaagtgcggctggg atccggcggccacctgcacctgcgtatctctcgggccgcccttcccgagg ggctccccgaggcctcccgccttcaccgggctctgttccggctgtccccg acggcgtcaaggtcgtgggacgtgacacgaccgctgcggcgtcagctcag ccttgcaagaccccaggcgcccgcgctgcacctgcgactgtcgccgccgc cgtcgcagtcggaccaactgctggcagaatcttcgtccgcacggccccag ctggagttgcacttgcggccgcaagccgccagggggcgccgcagagcgcg tgcgcgcaacggggaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtc tgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtg ctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgag ccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcacc gcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctac aatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagac ctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga (SEQ ID NO:7)
Аминокислотная последовательность GDF 15 мыши после отщепления сигнальной последовательности длиной 32 остатка представляет собой
- 139 037355
SQGDALAMPEQRPSGPESQLNADELRGRFQDLLSRLHANQSREDSNSEPS PDPAVRILSPEVRLGSHGQLLLRVNRASLSQGLPEAYRVHRALLLLTPTA RPWDITRPLKRALSLRGPRAPALRLRLTPPPDLAMLPSGGTQLELRLRVA AGRGRRSAHAHPRDSCPLGPGRCCHLETVQATLEDLGWSDWVLSPRQLQL SMCVGECPHLYRSANTHAQIKARLHGLQPDKVPAPCCVPSSYTPWLMHR
TDSGVSLQTYDDLVARGCHCA (SEQ ID NO:10) и кодируется последовательностью ДНК tcgcagggggacgccctggcaatgcctgaacagcgaccctccggccctga gtcccaactcaacgccgacgagctacggggtcgcttccaggacctgctga gccggctgcatgccaaccagagccgagaggactcgaactcagaaccaagt cctgacccagctgtccggatactcagtccagaggtgagattggggtccca cggccagctgctactccgcgtcaaccgggcgtcgctgagtcagggtctcc ccgaagcctaccgcgtgcaccgagcgctgctcctgctgacgccgacggcc cgcccctgggacatcactaggcccctgaagcgtgcgctcagcctccgggg accccgtgctcccgcattacgcctgcgcctgacgccgcctccggacctgg ctatgctgccctctggcggcacgcagctggaactgcgcttacgggtagcc gccggcagggggcgccgaagcgcgcatgcgcacccaagagactcgtgccc actgggtccggggcgctgctgtcacttggagactgtgcaggcaactcttg aagacttgggctggagcgactgggtgctgtccccgcgccagctgcagctg agcatgtgcgtgggcgagtgtccccacctgtatcgctccgcgaacacgca tgcgcagatcaaagcacgcctgcatggcctgcagcctgacaaggtgcctg ccccgtgctgtgtcccctccagctacaccccggtggttcttatgcacagg acagacagtggtgtgtcactgcagacttatgatgacctggtggcccgggg ctgccactgcgcttga (SEQ ID NO:9)
Биологически активная форма GDF15 содержит гомодимер, содержащий два зрелых мономера GDF15, каждый из которых содержит SEQ ID NO:12. Мономер, который подвергается гомодимеризации с образованием димера нативного зрелого GDF15 человека, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты gcgcgcaacggggaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtct gcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgc tgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagc cagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccg cctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctaca atcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacc tatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga (SEQ ID NO:11) и содержит аминокислотную последовательность
ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPS QFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQT YDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:12).
Таким образом, димер нативного зрелого GDF15 человека содержит два ковалентно связанных мономера, содержащих SEQ ID NO:12.
Аминокислотная последовательность рекомбинантной активной формы GDF15 человека, который содержит гомодимер, содержащий в каждом мономере девять цистеинов для образования одной межцепочечной дисульфидной связи и четырех внутрицепочечных дисульфидных связей, представляет собой (последовательность показана с необязательным N-терминальным остатком метионина в скобках) (М)ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGA CPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVS LQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:189) и кодируется последовательностью ДНК (показана с необязательным кодоном N-терминального метионина в скобках)
- 140 037355 (atg) gcgcgcaacggggaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgc cgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattg ggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcc cgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctg caccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccag ctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctcc agacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatataa (SEQ ID NO:190).
Аминокислотная последовательность рекомбинантной активной формы GDF15 мыши, который содержит гомодимер, содержащий в каждом мономере девять цистеинов для образования одной межцепочечной дисульфидной связи и четырех внутрицепочечных дисульфидных связей, представляет собой (М)SAHAHPRDSCPLGPGRCCHLETVQATLEDLGWSDWVLSPRQLQLSMC
VGECPHLYRSANTHAQIKARLHGLQPDKVPAPCCVPSSYTPWLMHRTDS
GVSLQTYDDLVARGCHCA (SEQ ID NO:14) и кодируется последовательностью ДНК (atg)agcgcgcatgcgcacccaagagactcgtgcccactgggtccgggg cgctgctgtcacctggagactgtgcaggcaactcttgaagacttgggctg gagcgactgggtgttgtccccgcgccagctgcagctgagcatgtgcgtgg gcgagtgtccccacctgtatcgctccgcgaacacgcatgcgcagatcaaa gcacgcctgcatggcctgcagcctgacaaggtgcctgccccgtgctgtgt cccctccagctacaccccggtggttcttatgcacaggacagacagtggtg tgtcactgcagacttatgatgacctggtggcccggggctgccactgcgct tga (SEQ ID NO:13) .
Как указано в настоящей заявке, термин полипептид GDF15 означает полипептид GDF, содержащий аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 8 и 12 человека. Термин мутантный полипептид GDF15, однако, включает полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности существующих в природе последовательностей полипептида GDF, например, SEQ ID NO: 4, 8 и 12, одной или несколькими аминокислотами, вследствие чего данная последовательность по меньшей мере на 85% идентична SEQ ID NO: 4, 8 и 12. Полипептиды GDF15 могут быть получены посредством введения одной или нескольких аминокислотных замен, консервативных или неконсервативных, а также с применением природных или несуществующих в природе аминокислот в конкретных положениях полипептида GDF15, или посредством удаления конкретных остатков или совокупностей остатков.
Консервативная аминокислотная замена может включать замену нативного остатка аминокислоты (т.е. остатка, обнаруженного в данном положении последовательности полипептида GDF15 дикого типа) ненативным остатком (т.е. остатком, который не обнаруживается в данном положении последовательности полипептида GDF15 дикого типа), вследствие чего наблюдается незначительное влияние либо отсутствие влияния на полярность или заряд аминокислотного остатка в данном положении. Консервативные аминокислотные замены также включают несуществующие в природе аминокислотные остатки (как определено в настоящей заявке), которые, как правило, встраивают посредством химического синтеза пептидов, а не синтеза в биологических системах. Данные остатки включают пептидомиметики и другие обратимые или инвертированные формы групп аминокислот.
Существующие в природе остатки можно разделить на классы на основании общих свойств боковых цепей:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr;
(3) кислые: Asp, Glu;
(4) основные: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro; и (6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Дополнительные группы аминокислот могут также быть получены с применением принципов, описанных, например, в руководстве Creighton (1984) PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES (2d Ed. 1993), W.H. Freeman and Company. В некоторых случаях может быть полезна дополнительная характеризация замен на основе двух или более из таких свойств (например, замена небольшим полярным остатком, таким как остаток Thr, может представлять собой высококонсервативную замену в соответствующем контексте).
- 141 037355
Консервативные замены могут включать замену члена одного из данных классов другим членом того же класса. Неконсервативные замены могут включать замену члена одного из данных классов членом другого класса.
Синтетические, редкие или модифицированные аминокислотные остатки, обладающие известными аналогичными физиологическими свойствами с остатками из вышеописанных групп, можно использовать в качестве консервативной замены для конкретного остатка аминокислоты в последовательности. Например, остаток D-Arg может выступать в качестве замены для типичного остатка L-Arg. Также возможен случай, при котором конкретную замену можно описать в контексте двух или нескольких из вышеописанных классов (например, замена небольшим и гидрофобным остатком означает замену одной аминокислоты остатком (остатками), которые обнаружены в обоих вышеописанных классах или другими синтетическими, редкими или модифицированными остатками, о которых в данной области техники известно, что они обладают аналогичными физиологическими свойствами с такими остатками, удовлетворяющими обоим определениям).
Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид GDF15, предложенный в настоящей заявке, в том числе последовательности, которые являются вырожденными SEQ ID NO: 3, 7, 11 и 15, и последовательности, которые кодируют варианты полипептида согласно SEQ ID NO:4, 8 и 12, составляют другие аспекты настоящего изобретения.
Ш.В. Векторы, пригодные для экспрессии полипептидов GDF15 и конструкций, содержащих GDF15, в том числе мутантные формы GDF15.
Для экспрессии последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид, содержащий область GDF15, соответствующие кодирующие последовательности, например SEQ ID NO:3, 7 и 11, можно клонировать в подходящий вектор, а после введения в подходящий хозяин последовательность можно экспрессировать для получения кодируемого полипептида согласно стандартным методикам клонирования и экспрессии, известным в данной области техники (например, которые описаны в руководстве Sambrook J., Fritsh E.F. and Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Настоящее изобретение также относится к таким векторам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
Вектор означает переносчик для доставки, который (а) способствует экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид; (b) способствует получению полипептида из нуклеиновой кислоты; (с) способствует трансфекции/трансформации целевых клеток нуклеиновой кислотой; (d) способствует репликации последовательности нуклеиновой кислоты; (е) способствует стабильности нуклеиновой кислоты; (f) способствует обнаружению нуклеиновой кислоты и/или трансформированных/трансфицированных клеток; и/или (g) иным образом наделяет нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, предпочтительной биологической и/или физико-химической функцией. Вектор может представлять собой любой подходящий вектор, в том числе хромосомные, нехромосомные векторы и векторы на основе синтетической нуклеиновой кислоты (последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая подходящий набор контрольных элементов экспрессии). Примеры таких векторов включают производные SV40, бактериальные плазмиды, ДНК фага, бакуловируса, плазмиды дрожжей, векторы, полученные из комбинаций плазмид и ДНК фага, и векторы на основе вирусной нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК).
Можно получить рекомбинантный вектор экспрессии для экспрессии полипептида, содержащего область GDF15, в прокариотических (например, Е.coli) или эукариотических клетках (например, клетки насекомых, применение бакуловирусных векторов экспрессии, клеток дрожжей или клеток млекопитающих). Типичные клетки-хозяева включают хозяев, которых, как правило, используют для клонирования и экспрессии, в том числе штаммы Escherichia coli TOP10F', ТОР10, DH10B, DH5a, HB101, W3110, BL21(DE3) и BL21 (DE3)pLysS, BLUESCRIPT (Stratagene), векторы линий клеток млекопитающих СНО, Сно-Κι, HEK293, 293-EBNA pIN (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509 (1989); векторы рЕТ (Novagen, Madison Wis.). В качестве альтернативы, рекомбинантный вектор экспрессии можно транскрибировать и транслировать in vitro, например, с применением регуляторной последовательности промотора Т7 и полимеразы Т7, а также системы трансляции in vitro. Вектор предпочтительно содержит промотор, расположенный выше сайта клонирования, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид. К примерам промоторов, которые можно включать и выключать, относятся lac-промотор, Т7-промотор, trc-промотор, tac-промотор и trp-промотор.
Таким образом, в настоящей заявке предложены векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий область GDF15, которые облегчают экспрессию полипептида или конструкции, представляющей интерес. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения векторы содержат функционально связанную нуклеотидную последовательность, регулирующую экспрессию полипептида, содержащего область GDF15. Вектор может содержать или быть связанным с любым подходящим промотором, энхансером и другими элементами, облегчающими экспрессию. Примеры таких элементов включают сильные промоторы экспрессии (например, промотор/энхансер CMV IE человека, промотор RSV, промотор SV40, промотор SL3-3, промотор MMTV или промотор HIV LTR, промотор EFlalpha, промотор CAG), эффективные поли (А) терминирующие
- 142 037355 последовательности, точка начала репликации (origin) плазмидного продукта в E.coli, ген устойчивости к антибиотикам в качестве селектируемого маркера и/или соответствующий сайт клонирования (например, полилинкер). Векторы также могут содержать индуцибельный промотор, а не конститутивный промотор, такой как CMV IE. Согласно одному аспекту настоящего изобретения нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую полипептид, содержащий область GDF15, функционально связана с тканеспецифичным промотором, который стимулирует экспрессию последовательности в соответствующей с метаболической точки зрения ткани, такой как ткань печени или поджелудочной железы.
Ш.С. Клетки-хозяева.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновые кислоты и векторы, раскрытые в настоящей заявке. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения вектор или нуклеиновая кислота встроены в геном клетки-хозяина, тогда как согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вектор или нуклеиновая кислота являются внехромосомными.
Предложены рекомбинантные клетки, такие как клетки дрожжей, бактерий (например, Е.coli) и млекопитающих (например, иммортализованные клетки млекопитающих), содержащие такую нуклеиновую кислоту, вектор или комбинации какого-либо одного или всех перечисленных компонентов. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения клетки содержат не встроенную нуклеиновую кислоту, например, плазмиду, космиду, фагемиду или линейный элемент экспрессии, которые содержат кодирующую последовательность для экспрессии полипептида, содержащего область GDF15.
Вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, содержащий область GDF15, можно ввести в клетку-хозяин посредством трансформации или трансфекции. Способы трансформации клетки вектором экспрессии хорошо известны.
Нуклеиновая кислота, которая кодирует полипептид, содержащий область GDF15, может быть расположена в клетке-хозяине или животном-хозяине и/или доставлена в клетку-хозяин или животноехозяин посредством вирусного вектора. В качестве вектора можно применять любой подходящий вирусный вектор. Вирусный вектор может содержать любое количество вирусных полинуклеотидов самих по себе или в комбинации с одним или несколькими вирусными белками, которые облегчают доставку, репликацию и/или экспрессию нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению в желаемой клеткехозяине. Вирусный вектор может представлять собой полинуклеотид, содержащий вирусный геном целиком или его часть, конъюгат вирусного белка/нуклеиновой кислоты, вирусоподобную частицу (ВПЧ) или интактную вирусную частицу, содержащую нуклеиновые кислоты вируса и нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, содержащий область GDF15. Вирусный вектор на основе вирусной частицы может содержать вирусную частицу дикого типа или модифицированную вирусную частицу. Вирусный вектор может представлять собой вектор, который требует присутствия другого вектора или вируса дикого типа для репликации и/или экспрессии (например, вирусный вектор может представлять собой хелпер-зависимый вирус), такой как ампликон аденовирусного вектора. Как правило, такие вирусные векторы состоят из вирусной частицы дикого типа либо вирусная частица модифицирована по содержанию в ней белка и/или нуклеиновой кислоты для увеличения трансгенной мощности или способствования трансфекции и/или экспрессии нуклеиновой кислоты (примеры таких векторов включают ампликоны герпесвируса/ампликоны ААВ, аденоассоциированного вируса). Как правило, вирусный вектор аналогичен вирусу и/или получен из вируса, который в норме инфицирует человека. Подходящие в этом отношении частицы вирусных векторов включают, например, частицы аденовирусного вектора (в том числе любой вирус семейства Adenoviridae или вирус, полученный из вируса семейства Adenoviridae), векторные частицы на основе аденоассоциированного вируса (ААВ вектор) или другие парвовирусы и частицы парвовирусных векторов, папилломавирусные векторные частицы, флавивирусные векторы, альфавирусные векторы, герпесвирусные векторы, поксвирусные векторы, ретровирусные векторы, включая лентивирусные векторы.
III. D. Выделение полипептида GDF15, конструкции, содержащей полипептид GDF15 или мутантную форму полипептида GDF15.
Полипептид, содержащий область GDF15, можно выделить с применением стандартных способов очистки белка. Полипептид, содержащий область GDF15, можно выделить из клетки, которая была сконструирована для экспрессии полипептида, содержащего область GDF15, например, из клетки, которая в природе не экспрессирует нативный GDF15.
Способы очистки белка, которые можно применять для выделения полипептида, содержащего область GDF15, а также необходимые вещества и реактивы, известны в данной области техники. Примеры способов очистки полипептида, содержащего область GDF15, предложены в настоящей заявке в примерах ниже. Дополнительные способы очистки, которые можно применять для выделения полипептида, содержащего область GDF15, можно найти в публикациях, таких как Bootcov M.R., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11514-9, Fairlie W.D., 2000, Gene 254: 67-76.
IV. Фармацевтические композиции, содержащие полипептид GDF15, конструкцию, содержащую полипептид GDF15 или мутантную форму полипептида GDF15.
Предложены фармацевтические композиции, содержащие мономер или мультимер, содержащий
- 143 037355 полипептид, который содержит область GDF15. Такие полипептидные фармацевтические композиции могут содержать терапевтически эффективное количество полипептида, который содержит мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15, в смеси с фармацевтически или физиологически приемлемым веществом для приготовления лекарственной формы, выбранным в соответствии с путем введения. Термин фармацевтически приемлемый носитель или физиологически приемлемый носитель в настоящей заявке означает одно или несколько веществ для приготовления лекарственной формы, подходящих для осуществления или улучшения доставки мономера или мультимера, содержащего полипептид, который содержит область GDF15, в тело субъекта-человека или субъекта, отличного от человека. Данный термин включает любые и все растворители, дисперсионную среду, покрывающие вещества, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические вещества и вещества, отсрочивающие всасывание, а также подобные вещества, которые являются физиологически совместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или несколько носителей, которые выбраны из воды, солевого раствора, фосфатно-буферного раствора, декстрозы, глицерола, этанола и подобных растворителей, а также комбинации указанных носителей. В некоторых случаях в фармацевтическую композицию предпочтительно включать изотонические средства, например, сахара, многоатомные спирты, такие как маннитол, сорбитол, или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые вещества, такие как смачивающие вещества или незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие вещества, консерванты или буферы, увеличивающие срок хранения или эффективность мономера или мультимера, содержащего полипептид, который содержит область GDF15, могут также выступать в качестве носителя или могут образовывать составную часть носителя. Подходящие фармацевтически приемлемые носители являются предпочтительно нетоксичными по отношению к реципиенту в применяемых дозах и концентрациях.
Фармацевтическая композиция может содержать вещество (вещества) для приготовления лекарственной формы для модификации, поддержания или сохранения, например, рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, степени растворения или высвобождения, всасывания или проникновения композиции. Подходящие вещества для приготовления лекарственной формы включают, но не ограничены ими, аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин), антимикробные средства, антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или гидрогенсульфит натрия), буферы (такие как боратный, бикарбонатный, Tris-HCl, цитратный, фосфатный буферы или другие органические кислоты), наполнители (такие как маннитол или глицин), хелатирующие вещества (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA)), комплексообразующие вещества (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-в-циклодекстрин), наполнители, моносахариды, дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины), белки (такие как свободный сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины), окрашивающие, вкусовые вещества и разбавители, эмульгирующие средства, гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон), полипептиды с низкой молекулярной массой, солеобразующие противоионы (такие как натрий), консерванты (такие как бензалкония хлорид, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или перекись водорода), растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль), сахароспирты (такие как маннитол или сорбитол), суспендирующие вещества, поверхностно-активные вещества или смачивающие вещества (такие как Pluronics; ПЭГ; сложные эфиры сорбитана; полисорбаты, такие как Полисорбат 20 или Полисорбат 80; Triton; трометамин; лецитин; холестерол или тилоксапол), вещества, увеличивающие стабильность (такие как сахароза или сорбитол), вещества, увеличивающие тоничность (такие как галогениды щелочных металлов - предпочтительно хлорид натрия или калия, - или маннитол, сорбитол), носители для доставки, разбавители, вспомогательные вещества и/или фармацевтические вспомогательные средства (см., например, руководство REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, 19th edition, (1995); Berge et al., J. Pharm. Sci., 6661), 1-19 (1977). Дополнительные соответствующие принципы, способы и вещества описаны, например, в руководствах Lieberman et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS-DISPERSE SYSTEMS (2nd ed., vol. 3, 1998); Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS & DRUG DELIVERY SYSTEMS (7th ed. 2000); Martindale, THE EXTRA PHARMACOPEIA (31st edition), Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES (16th-20th and subsequent editions); The Pharmacological Basis Of Therapeutics, Goodman and Gilman, Eds. (9th ed.-1996); Wilson and Gisvolds, TEXTBOOK OF ORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY, Delgado and Remers, Eds. (10th ed., 1998). Принципы приготовления в состав фармацевтически приемлемых композиций также описаны, например, в руководствах Aulton, PHARMACEUTICS: THE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESIGN, Churchill Livingstone (New York) (1988), EXTEMPORANEOUS ORAL LIQUID DOSAGE PREPARATIONS, CSHP (1998)).
Оптимальная фармацевтическая композиция будет определена специалистом в данной области техники в зависимости от, например, предполагаемого пути введения, формата доставки и желаемой дозы (см., например, руководство Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES, выше). Такие композиции могут оказывать влияние на физиологическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo, скорость клиренса in vivo полипептида GDF15, конструкции, содержащей полипептид GDF15 или му
- 144 037355 тантную форму полипептида GDF15.
Первичный наполнитель или носитель в фармацевтической композиции может иметь водную либо неводную природу. Например, подходящий наполнитель или носитель для инъекции может представлять собой воду, физиологический солевой раствор или искусственную спинномозговую жидкость, в которые можно добавлять другие вещества, общепринято используемые в композициях для парентерального введения. Нейтральный забуференный солевой раствор или солевой раствор, смешанный со свободным сывороточным альбумином, представляют собой дополнительные примеры наполнителей. Другие примеры фармацевтических композиций включают буфер Tris приблизительно рН 7,0-8,5 или ацетатный буфер приблизительно рН 4,0-5,5, которые могут дополнительно содержать сорбитол или его подходящий аналог. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения композиции, содержащие полипептид GDF15, конструкцию, содержащую полипептид GDF15 или мутантную форму полипептида GDF15, могут быть получены в форме для хранения посредством смешивания избранной композиции желаемой степени чистоты с необязательными средствами для приготовления лекарственной формы (Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES, выше) в форме лиофилизованной таблетки или водного раствора. Более того, продукт, содержащий мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15, можно приготовить в состав в форме лиофилизата с применением соответствующих вспомогательных веществ, таких как сахароза.
Фармацевтические композиции на основе полипептида могут быть выбраны для парентеральной доставки. В качестве альтернативы, композиции могут быть выбраны для ингаляции или для доставки через желудочно-кишечный тракт, например, для пероральной доставки. Приготовление такой фармацевтически приемлемой композиции соответствует компетенции специалиста в данной области техники.
Компоненты лекарственной формы присутствуют в концентрациях, которые являются приемлемыми для участка введения. Например, буферы применяют для поддержания рН композиции на физиологическом уровне или на уровне незначительно более низкого рН, как правило, в диапазоне рН от приблизительно 5 до приблизительно 8.
Если предполагается парентеральное введение, терапевтические композиции для применения согласно настоящему изобретению могут находиться в форме апирогенного, приемлемого для парентерального введения водного раствора, содержащего желаемый полипептид GDF15, конструкцию, содержащую полипептид GDF15 или мутантную форму полипептида GDF15, в фармацевтически приемлемом наполнителе. В особенности подходящий наполнитель для парентеральной инъекции представляет собой стерильную дистиллированную воду, в которой полипептид GDF15, конструкция, содержащая мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15, приготовлены в состав в виде стерильного изотоничного раствора, надлежащим образом консервированного. Получение другого препарата может включать приготовление желаемой молекулы в состав со средством, таким как инъецируемые микросферы, разлагаемые биологическим способом частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), бусины или липосомы, обеспечивающие контролируемое или замедленное высвобождение продукта, который затем можно доставить посредством инъекции с замедленным всасыванием. Также можно применять гиалуроновую кислоту, которая может способствовать большей длительности циркуляции. Другие подходящие способы введения желаемой молекулы включают применение имплантируемых устройств для доставки лекарственных препаратов.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическую композицию можно приготовить в состав для ингаляции. Например, мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15, можно приготовить в состав в виде сухого порошка для ингаляции. Растворы для ингаляции, содержащие мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15, можно также приготовить в состав с распыляющим веществом для доставки в форме аэрозоля. Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения растворы можно распылять. Легочное введение также описано в международной публикации № WO 94/20069, в которой описана легочная доставка белков, модифицированных химическим способом.
Также предполагают, что определенные составы можно вводить пероральным путем. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения мономер или мультимер, который содержит полипептид, содержащий область GDF15, который вводят таким способом, можно приготовить в состав с добавлением таких носителей, которые обычно применяют при составлении твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы, либо без добавления данных носителей. Например, можно разработать капсулу для высвобождения активной части состава в определенном участке желудочно-кишечного тракта, когда биологическая доступность является максимальной и пресистемная деградация является минимальной. Можно добавлять дополнительные средства для облегчения всасывания мономера или мультимера, содержащего полипептид, который содержит область GDF15. Также можно применять разбавители, ароматизирующие вещества, воски с низкой температурой плавления, растительные масла, смазывающие вещества, суспендирующие вещества, вещества для улучшения распадаемости таблеток и связывающие вещества.
Другая фармацевтическая композиция может содержать эффективное количество мономера или мультимера, содержащего полипептид, который содержит область GDF15, в смеси с нетоксичными
- 145 037355 вспомогательными веществами, подходящими для производства таблеток. Посредством растворения таблеток в стерильной воде или в другом подходящем наполнителе можно получить растворы в форме одной дозы. Подходящие вспомогательные вещества включают, но не ограничены ими, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактоза или фосфат кальция; или связывающие вещества, такие как крахмал, желатин или аравийская камедь; или смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.
Дополнительные фармацевтические композиции, содержащие мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15, будут очевидными специалисту в данной области техники, в том числе составы с замедленной или контролируемой доставкой, содержащие мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15. Методики приготовления множества других составов с замедленной или контролируемой доставкой, таких как применение носителей на основе липосом, разлагаемых биологическим способом микрочастиц или пористых бусин и инъекций с замедленным всасыванием, также известны специалисту в данной области техники (см. например, международную публикацию № WO 93/15722, в которой описаны пористые полимерные микрочастицы с контролируемым высвобождением для доставки фармацевтических композиций, а также публикации Wischke & Schwendeman, 2008, Int. J. Pharm. 364: 298-327 и Freiberg & Zhu, 2004, Int. J. Pharm. 282: 1-18, в которых обсуждается получение и применение микросфер/микрочастиц). Как описано в настоящей заявке, гидрогель представляет собой пример состава с замедленной или контролируемой доставкой.
Дополнительные примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые полимерные матрицы в форме формованных изделий, например, пленок, или микрокапсулы. Матрицы для замедленного высвобождения могут содержать полиэфиры, гидрогели, полилактиды (патент США № 3773919 и европейский патент № 0058481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-Lглутамата (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-56), поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 и Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), этиленвинилацетат (Langer et al., выше) или поли-Э(-)-3-гидроксимасляную кислоту (европейский патент № 0133988). Композиции с замедленным высвобождением могут также содержать липосомы, которые могут быть получены любым из способов, известных в данной области техники. См., например, публикации Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-92; и европейские патенты № 0036676, 0088046 и 0143949.
Фармацевтическая композиция, содержащая мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15, которую используют для введения in vivo, как правило, должна быть стерильной. Стерильность можно обеспечить посредством фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны. Если композиция является лиофилизованной, стерилизацию с применением данного способа можно провести до или после лиофилизации и восстановления. Композицию для парентерального введения можно хранить в лиофилизованной форме или в растворе. Кроме того, парентеральные композиции, как правило, помещают в контейнер, имеющий стерильное входное отверстие, например, пакет для внутривенного раствора или флакон, имеющий пробку, поддающуюся прокалыванию с помощью иглы для подкожных инъекций.
После приготовления фармацевтической композиции в состав ее можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или в виде дегидрированного или лиофилизованного порошка. Такие составы можно хранить в форме, готовой к применению, или в форме (например, лиофилизованной), требующей восстановления перед введением.
Согласно конкретному варианту реализации настоящее изобретение направлено на наборы для получения единицы для введения однократной дозы. Наборы могут содержать каждый первый контейнер, содержащий высушенный белок, и второй контейнер, содержащий водный состав. Также в объем настоящего изобретения включены наборы, содержащие однокамерные или многокамерные преднаполненные шприцы (например, шприцы с жидкостью либо шприцы с лиофилизатом).
Эффективное количество фармацевтической композиции, которая содержит мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15, предназначенной для терапевтического применения, зависит, например, от терапевтического контекста и целей. Специалист в данной области техники понимает, что соответствующие уровни доз для лечения будут, таким образом, отчасти варьировать в зависимости от доставляемой молекулы, показания, по которому применяют мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15, пути введения и размера (массы тела, поверхности тела или размера органа) и состояния (возраста и общего здоровья) пациента. Соответственно, врач может титровать дозу и модифицировать путь введения для достижения оптимального терапевтического эффекта. Типичная доза может варьировать от приблизительно 0,1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг или более в зависимости от факторов, упомянутых выше. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения доза может находиться в диапазоне от 0,1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг; или от 1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг; или составлять 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 200 или до приблизительно 10 мг/кг.
Частота введения дозы зависит от параметров фармакокинетики мономера или мультимера, содержащего полипептид, который содержит область GDF15, в применяемом составе. Как правило, врач вводит композицию до тех пор, пока не будет достигнута доза, которая обеспечивает желаемый эффект.
- 146 037355
Вследствие этого композицию можно вводить в виде единичной дозы, в виде двух или более доз (которые могут содержать одинаковое количество желаемой молекулы или могут не содержать одинакового количества желаемой молекулы) в течение времени или в виде непрерывной инфузии посредством имплантируемого устройства или катетера. Последующую корректировку соответствующей дозы общепринятым способом может осуществить средний специалист в данной области техники, и такая корректировка соответствует задачам, регулярно выполняемым средним специалистом в данной области техники. Соответствующие дозы могут быть установлены с применением соответствующих данных дозаответ.
Пути введения фармацевтической композиции находятся в соответствии с известными способами и включают, например, пероральный путь; введение посредством инъекции, внутривенный, интраперитонеальный, интрацеребральный (интрапаренхиматозный), интрацеребровентрикулярный, внутримышечный, внутриглазной, внутриартериальный, интрапортальный или внутриочаговый пути; введение с применением систем с замедленным высвобождением (которые можно также инъецировать); или введение с применением имплантируемых устройств. При необходимости композиции можно вводить посредством болюсной инъекции или непрерывно посредством инфузии, либо с применением имплантируемого устройства.
В качестве альтернативы или дополнительно, композицию можно вводить местно посредством имплантации мембраны, губки или другого соответствующего материала, в который была абсорбирована или инкапсулирована желаемая молекула. В случае применения имплантируемого устройства такое устройство можно имплантировать в любую подходящую ткань или орган, и доставка желаемой молекулы может осуществляться посредством диффузии, болюсного введения с высвобождением в течение времени или непрерывного введения.
Для доставки лекарственного препарата, например, мономера или мультимера, содержащего полипептид, который содержит область GDF15, с предопределенной скоростью, вследствие чего концентрация лекарственного препарата может поддерживаться на желаемом терапевтически эффективном уровне в течение длительного периода, можно применять множество различных подходов. В одном примере можно применять гидрогель, содержащий полимер, такой как желатин (например, желатин быка, желатин человека или желатин из другого источника) или существующий в природе или полученный синтетическим способом полимер. В гидрогеле можно применять любое процентное содержание полимера (например, желатина), например 5, 10, 15 или 20%. Выбор соответствующей концентрации может зависеть от множества факторов, таких как желаемый терапевтический профиль и профиль фармакокинетики терапевтической молекулы.
Примеры полимеров, которые могут содержаться в гидрогеле, включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиэтиленоксид, полиэтиленоксид-со-полипропиленоксид, блок-сополимеры или случайные сополимеры со-полиэтиленоксида, поливинилалкоголь, поли(винилпирролидинон), поли(аминокислоты), декстран, гепарин, полисахариды, полиэфиры и подобные полимеры.
Другим фактором, который следует учитывать при получении составов на основе гидрогеля, является степень перекрестного сшивания гидрогеля и средства, образующего поперечные сшивки. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения перекрестного сшивания можно достичь посредством реакции метакрилирования, в которой используют метакриловый ангидрид. В некоторых случаях высокая степень образования перекрестных сшивок может быть желательной, тогда как в других предпочтительной является меньшая степень образования перекрестных сшивок. В некоторых случаях большая степень перекрестного сшивания обеспечивает более длительное замедленное высвобождение. Большая степень перекрестного сшивания может обеспечивать получение более жесткого гидрогеля и более длительный период, в течение которого осуществляется доставка лекарственного препарата.
Для получения гидрогеля с желаемыми свойствами можно применять любое соотношение полимера к средству, образующему поперечные сшивки (например, метакриловому ангидриду). Например, соотношение полимера к средству, образующему поперечные сшивки, может составлять, например, 8:1, 16:1, 24:1 или 32:1. Например, когда полимер гидрогеля представляет собой желатин, а средство, образующее поперечные сшивки, представляет собой метакрилат, для метакрилового ангидрида:желатина можно применять соотношения 8:1, 16:1, 24:1 или 32:1.
V. Терапевтические применения полипептида GDF15, конструкции, содержащей полипептид GDF15 или мутантную форму полипептида GDF15.
Мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15, можно применять для лечения, диагностики или облегчения метаболического состояния или нарушения. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения метаболическое нарушение, которое подвергают лечению, представляет собой диабет, например диабет 2 типа. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения метаболическое состояние или нарушение представляет собой ожирение. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения метаболическое состояние или нарушение представляет собой дислипидемию, увеличение уровней глюкозы, увеличение уровней инсулина или диабетическую нефропатию. Например, метаболическое состояние или нарушение, которое можно лечить или облегчать с применением мономера или мультимера, содержащего полипептид, который со
- 147 037355 держит область GDF15, включает состояние, при котором субъект-человек имеет уровень глюкозы в крови натощак 125 мг/дл или более, например 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 или более 200 мг/дл. Уровни глюкозы в крови можно определить в состоянии после приема пищи или натощак либо случайным образом. Метаболическое состояние или нарушение может также включать состояние, при котором субъект подвержен увеличенному риску развития метаболического состояния. В случае субъекта-человека такие состояния включают уровень глюкозы в крови натощак 100 мг/дл. Состояния, которые можно лечить с применением фармацевтической композиции, содержащей мутантный полипептид GDF15, можно также найти в публикации American Diabetes Association Standards of Medical Care in Diabetes Care-2011, American Diabetes Association, Diabetes Care Vol. 34, No. Supplement 1, S11-S61, 2010.
При практическом применении метаболическое нарушение или состояние, такое как диабет 2 типа, увеличение уровней глюкозы, увеличение уровней инсулина, дислипидемия, ожирение или диабетическая нефропатия, можно лечить посредством введения пациенту, который нуждается в таком лечении, терапевтически эффективной дозы полипептида GDF15, конструкции, содержащей мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15. Введение можно осуществлять, как описано в настоящей заявке, например, посредством внутривенной (ВВ) инъекции, интраперитонеальной (ИП) инъекции, подкожной инъекции, внутримышечной инъекции или пероральным путем в форме таблетки или жидкого состава. В некоторых случаях терапевтически эффективную или предпочтительную дозу мономера или мультимера, содержащего полипептид, который содержит область GDF15, может определить врач. Терапевтически эффективная доза мономера или мультимера, содержащего полипептид, который содержит область GDF15, зависит, среди прочего, от графика введения, разовой дозы вводимого средства, от того, вводят ли мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15, в комбинации с другими терапевтическими средствами, иммунного статуса и здоровья реципиента. Термин терапевтически эффективная доза в настоящей заявке означает количество мономера или мультимера, содержащего полипептид, который содержит область GDF15, которое вызывает биологический или медицинский ответ в системе ткани, животном или человеке, причем указанный ответ определяет исследователь, врач лечебного дела или другой врач, и указанный ответ включает смягчение или облегчение симптомов заболевания или нарушения, которое подвергают лечению. Т.е. данный термин означает количество мономера или мультимера, содержащего полипептид, который содержит область GDF15, которое поддерживает наблюдаемый уровень одного или нескольких желаемых биологических или медицинских ответов, например уменьшения уровней глюкозы, инсулина, триглицерида или холестерола в крови; уменьшения массы тела; или улучшение толерантности к глюкозе, расхода энергии или чувствительности к инсулину.
Следует отметить, что терапевтически эффективная доза мономера или мультимера, содержащего полипептид, который содержит область GDF15, может также варьировать в зависимости от желаемого результата. Таким образом, например, в случаях, при которых показано уменьшение уровня глюкозы в крови, доза мономера или мультимера, содержащего полипептид, который содержит область GDF15, будет соответствующим образом выше дозы, при которой желательно относительное уменьшение уровня глюкозы в крови. И наоборот, в случаях при которых показан больший уровень глюкозы в крови, доза мономера или мультимера, содержащего полипептид, который содержит область GDF15, будет соответствующим образом меньше дозы, при которой желателен относительно больший уровень глюкозы в крови.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения субъект представляет собой человека, уровень глюкозы в крови у которого составляет 100 мг/дл или больше и который может получать лечение мономером или мультимером, содержащим полипептид, который содержит область GDF15.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения способ согласно настоящему изобретению включает первый измеряемый исходный уровень одного или нескольких значимых с точки зрения метаболизма соединений, таких как глюкоза, инсулин, холестерол, липид, у субъекта. Затем фармацевтическую композицию, содержащую мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15, вводят субъекту. После желаемого периода времени снова определяют уровень одного или нескольких значимых с точки зрения метаболизма соединений (например, глюкозы, инсулина, холестерола, липида в крови) у субъекта. Затем два уровня можно сравнить для определения относительного изменения значимых с точки зрения метаболизма соединений у субъекта. В зависимости от результата данного сравнения можно вводить другую дозу фармацевтической композиции, содержащей мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15, для достижения желаемого уровня одного или нескольких значимых с точки зрения метаболизма соединений.
Следует отметить, что фармацевтическую композицию, содержащую мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15, можно вводить совместно с другим соединением. Природа и свойства соединения, которое совместно вводят с мономером или мультимером, содержащим полипептид, который содержит область GDF15, зависят от природы состояния, которое подвергают лечению или которое необходимо облегчить. Неограничивающий перечень примеров соединений, которые можно вводить в комбинации с фармацевтической композицией, содержащей мономер или мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15, включают розиглитазон, пиог- 148 037355 литазон, репаглинид, натеглитинид, метформин, экзенатид, стиаглиптин, прамлинтид, глипизид, глимеприридеакарбозу и миглитол.
VI. Наборы.
Также предложены наборы для реализации раскрытых способов на практике. Такие наборы могут содержать фармацевтическую композицию, такую как композиции, описанные в настоящей заявке, в том числе нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды или белки, предложенные в настоящей заявке, векторы и клетки, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и фармацевтические композиции, которые содержат такие соединения, содержащие нуклеиновую кислоту, которые могут быть предложены в стерильном контейнере. Необязательно в наборы могут также включаться или быть доступными пациенту или организации, оказывающей медицинские услуги, инструкции относительно того, как применять предложенную фармацевтическую композицию для лечения метаболического нарушения.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения набор включает (а) фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество мономера или мультимера, содержащего полипептид, который содержит область GDF15; и (b) один или несколько контейнеров для фармацевтической композиции. Такой набор может также включать инструкции по его применению; инструкции могут быть приспособлены к конкретному метаболическому нарушению, которое подвергают лечению. Инструкции могут описывать процесс применения и природу материалов, предоставленных в наборе. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения наборы включают инструкции для пациента по проведению введения для лечения метаболического нарушения, такого как увеличение уровней глюкозы, увеличение уровней инсулина, ожирение, диабет 2 типа, дислипидемия или диабетическая нефропатия.
Инструкции могут быть напечатаны на носителе, таком как бумага или пластик и т.д., и могут быть представлены в наборах в виде листка-вкладыша, на этикетке контейнера набора или его компонентов (например, присоединены к упаковке) и т.д. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения инструкции предложены в виде файла с данными для электронного хранения, представленного на подходящем машиночитаемом носителе информации, например, диске CD-ROM, дискете и т.д. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения фактические инструкции в наборе отсутствуют, однако предложены способы получения инструкций из удаленного источника, например, через интернет. Пример такого варианта реализации представляет собой набор, который включает веб-адрес, по которому можно увидеть инструкции и/или с которого можно выгрузить инструкции.
Часто желательно, чтобы некоторые или все компоненты набора были упакованы в соответствующую упаковку для поддержания стерильности. Компоненты набора можно упаковать в элемент, содержащий набор, для получения отдельной простой в применении единицы, причем указанный элемент, содержащий набор, например, коробка или аналогичная структура, может представлять собой герметичный контейнер, например, для дополнительного сохранения стерильности некоторых или всех компонентов набора, либо может представлять собой негерметичный контейнер.
Примеры
Следующие примеры, в том числе проведенные эксперименты и полученные результаты, предложены исключительно с иллюстративной целью, и их не следует истолковывать как ограничивающие настоящее изобретение.
Пример 1. Получение молекулы FC-GDF15.
Слияния GDF15 с последовательностями knob/holeFc, HemiFc, charged pair (delHinge) Fc и charged pair (delHinge) cysteine clamp Fc стабильно экспрессировали в бессывороточной, адаптированной к росту в суспензии клеточной линии Сно-Κι. Молекулы GDF15-FC клонировали в стабильный вектор экспрессии, содержащий ген резистентности к пуромицину, тогда как Fc-цепи клонировали в вектор экспрессии, содержащий ген резистентности к гигромицину (Selexis, Inc.). Плазмиды трансфицировали в соотношении 1:1 с применением липофектамина LTX, и селекцию клеток проводили через 2 дня после трансфекции в запатентованной среде роста, содержащей 10 мкг/мл пуромицина и 600 мкг/мл гигромицина. Среду меняли 2 раза в неделю при проведении селекции. Когда жизнеспособность клеток достигала приблизительно 90%, культуру масштабировали до масштаба серийной продукции с подпиткой. Клетки высевали в концентрации 1е6/мл в запатентованной продуктивной среде и подпитку проводили в дни 3, 6 и 8. Кондиционную среду (КС), образуемую клетками, собирали в день 10 и фильтровали. Конечные показатели жизнеспособности, как правило, составляли приблизительно 90%.
Fc-GDF15 из отфильтрованной кондиционной среды выделяли с применением двухэтапной хроматографической процедуры.
Приблизительно 5 л КС наносили непосредственно на колонку GE MabSelect SuRe, которую предварительно уравновешивали фосфатно-буферным раствором (ФБР) Дульбекко. Связавшийся белок подвергали трем этапам промывки: первый - 3 объемами колонки (ОК) ФБР; следующий - 1 ОК 20 мМ Tris, 100 мМ хлорида натрия, рН 7,4; и, наконец, 3 ОК 500 мМ L-аргинина, рН 7,5. В результате данных этапов промывки были удалены не связавшиеся или слабо связавшиеся компоненты среды и примеси клеток-хозяев. Затем колонку повторно уравновешивали 5 ОК 20 мМ Tris, 100 мМ хлорида натрия при рН 7,4, в результате чего УФ-поглощение возвращалось к базовой линии. Целевой белок элюировали 100
- 149 037355 мМ уксусной кислотой при рН 3,6 и собирали в общей массе. Общую массу белка быстро титровали в диапазоне рН от 5,0 до 5,5 1 М Tris-HCl, рН 9,2.
Затем общую массу белка с откорректированным значением рН наносили на колонку GE SP Sepharose HP, которую предварительно уравновешивали 20 мМ MES при рН 6,0. После этого связавшийся белок промывали 5 ОК буфера для уравновешивания, после чего элюировали 20 ОК с линейным градиентом 0-50% 0-400 мМ хлорида натрия в 20 мМ MES при рН 6,0. Фракции собирали во время элюирования и анализировали методом аналитической эксклюзионной хроматографии (Superdex 200) для определения соответствующих фракций для сбора гомогенного продукта. Хроматография SP HP удаляет родственные примеси продукта, такие как свободный Fc, агрегированные формы и мультимеры FC-GDF15.
Затем посредством диализа проводили смену буфера общей массы SP HP на 10 мМ ацетат натрия, 5% пролин, рН 5,2. Продукт концентрировали до концентрации приблизительно 15 мг/мл с применением устройства для центрифугирования Sartorius Vivaspin 20 с отсечением по молекулярной массе десять килодальтон. После этого проводили стерилизующую фильтрацию продукта, и полученный в результате раствор, содержащий молекулы очищенного FC-GDF15, хранили при температуре 5°С. Подлинность и чистоту конечных продуктов оценивали с применением масс-спектрального анализа, электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Способ очистки, описанный выше, применяли для очистки гибридных белков DhMonoFc-GDF15. Однако было обнаружено, что введение в DhMonoFc-GDF15 мутации H6D вызывало образование растворимых агрегатов при элюировании SP. Вследствие этого очистка DhMonoFc-GFF15(H6D) включала дополнительный этап эксклюзионной хроматографии (Superdex 200 с применением 20 мМ фосфата, 250 мМ NaCl, рН 6,8), после которого следовало нанесение на Q-sepharose HP и элюирование градиентом от 0 до 0,6 М NaCl в 20 мМ tris, рН 8,5.
Пример 2. Получение молекул GDF15-HSA и DhMonoFc.
Слияние GDF15 с последовательностями HSA и DhMonoFc стабильно экспрессировали в клетках CHO-S (Invitrogen). Для каждой из конструкций, образующих гомодимеры, кодирующую последовательность клонировали в стабильный вектор экспрессии, содержащий ген устойчивости к пуромицину (Selexis, Inc.). В случае гетеродимера HSA-(G4S)4-GDF15:GDF15 последовательность слияния HSA-(G4S)4GDF15 клонировали в вектор экспрессии, содержащий ген устойчивости к пуромицину, и последовательность GDF15 клонировали в вектор экспрессии, содержащий ген устойчивости к гигромицину. Родительские клетки CHO-S поддерживали в среде CD-CHO (Invitrogen) с добавлением 8 мМ L-глутамина и трансфицировали 4 мкг ДНК плазмиды с применением набора для трансфекции Lipofectamine LTX (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. В случае гетеродимера HSA-(G4S)4-GDF15:GDF15 две плазмиды смешивали перед трансфекцией в соотношении 1:1. Стабильные линии клеток подвергали селекции с применением 10 мкг/мл пуромицина (гомодимеры) или 10 мкг/мл пуромицина и 400 мкг/мл гигромицина (гетеродимер). После восстановления, которое определяли по показателю жизнеспособности >90% с применением счетчика Vi-Cell (Beckman Coulter), стабильные линии клеток CHO-S размножали и высевали для периодической продукции во встряхиваемых колбах либо для продукции с подпиткой в биореакторах WAVE (GE Healthcare). Для обоих процессов клетки высевали в концентрации 1е6 жизнеспособных клеток/мл в продуктивной среде. Продукты периодического процесса собирали посредством центрифугирования в день 6, тогда как продукты процесса с подпиткой подпитывали в дни 3, 6 и 8. КС, образованную клетками, собирали посредством центрифугирования в день 10 и фильтровали.
Гибридные белки HSA-GDF15 очищали от отфильтрованной кондиционной среды с применением двух этапов хроматографии. Отфильтрованную кондиционную среду, содержащую гибридный белок HSA-GDF15, наносили на колонку Cibracon Blue Sepharose HP, уравновешенную 20 мМ фосфатом, 150 мМ NaCl, pH 7,4. Затем колонку промывали буфером для уравновешивания до получения базового уровня УФ-поглощения. Продукт и загрязняющие вещества элюировали буфером, содержащим 20 мМ фосфат, 2 М NaCl, а затем элюаты собирали и анализировали методом ПААГ-ДСН (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) с окрашиванием кумасси для определения того, какие фракции элюата содержат полипептид, мигрирующий с предполагаемой молекулярной массой гибридного белка HSA-GDF15. После этапа с применением Blue Sepharose объединенные фракции, содержащие продукт, диализовали против 10 мМ Tris, pH 8,0. Этап диализа позволял гибридному белку HSA-GDF15 связаться при нанесении на анион-обменную хроматографическую смолу. Итоговым этапом хроматографии являлась хроматография на Q-Sepharose HP с применением линейного градиента (от 0 до 0,6М NaCl в 10 мМ Tris, pH 8,0) для элюирования связавшегося гибридного белка. Элюат собирали с QSepharose HP в виде фракций, а затем анализировали методом ПААГ-ДНС и аналитической эксклюзионной хроматографии для определения соответствующих фракций для объединения. Анализ методами ЖХМС (жидкостная хроматография/масс-спектрометрия) и ПААГ-ДСН проводили для подтверждения подлинности каждого белка. Затем посредством диализа проводили смену буфера в полученной общей массе на 10 мМ ацетат натрия, 9% сахарозу, рН 4,5, продукт подвергали стерилизующей фильтрации, после чего хранили при температуре 5°С или замораживали.
- 150 037355
Гибридные белки DhMonoFc-GDF15 очищали, как описано в примере 2 выше для других гибридных белков FC-GDF15.
Пример 3. Подавление потребления пищи у прожорливых мышей ob/ob с применением полипептидов Fc, гибридных с GDF15, и полипептидов HSA, гибридных с GDF15.
GDF15 уменьшает потребление пищи у прожорливых мышей ob/ob; анализ потребления пищи применяли для оценки эффективности различных форм аналогов GDF15. Поскольку период полужизни полипептида GDF15 человека у мыши, согласно наблюдениям, составляет приблизительно 3 ч, для увеличения периода полужизни белка применяли стратегию слияния с Fc. Были получены различные мультимеры, содержащие полипептид, который содержит область GDF15, и активность данных мультимеров in vivo анализировали посредством введения мультимера прожорливым мышам ob/ob, дефицитным по лептину, и измерения способности конкретного мультимера, содержащего полипептид, который содержит область GDF15, подавлять потребление пищи у данных животных. Исследуемый мультимер, содержащий полипептид, который содержит область GDF15, вводили мышам ob/ob возрастом 7-8 недель (Jackson Laboratory) посредством подкожной инъекции в день 0 в 16-17 ч. После инъекции животных переносили в клетки, количество пищи в которых было предварительно измерено, и потребление пищи измеряли на следующий день в 9-10 ч.
Результаты иллюстративных экспериментов представлены на фиг. 6-53. Данные эксперименты свидетельствуют, что описанные мультимеры, содержащие области GDF15, демонстрируют уменьшение потребления пищи мышами ob/ob с большей активностью, чем нативный зрелый гомодимер чGDF15.
Пример 4. Хроническая эффективность конструкций GDF15 у мышей DIP.
Определенные мультимеры, содержащие области GDF15, вводили хронически и подкожно мышам DIO один раз в неделю. Конструкции продемонстрировали эффективность улучшения различных параметров метаболизма, в том числе массы тела, уровней глюкозы в крови и толерантности к глюкозе, уровней инсулина в сыворотке, уровней холестерола в сыворотке, уровней триглицерида в сыворотке и пероральной толерантности к липидам.
Пример 5. Активность конструкций GDF15 in vivo.
Самцов С57В1/6 кормили рационом с высоким 60%-ным содержанием жиров в течение 15 недель и разделяли на различные группы лечения, причем до начала лечения животные каждой группы имели одинаковую массу тела и уровни глюкозы, инсулина, триглицерида и холестерола. Животным подкожно вводили белки или наполнитель (буфер) еженедельно в течение 5 недель. Использовали три различных уровня доз белков: 10, 1, 0,1 нмоль/кг, что эквивалентно 1,25, 0,125, 0,0125 мг/кг. Исследования проводили в течение 5 недель, последнюю дозу вводили в день 28.
Массу тела измеряли еженедельно в течение 5 недель лечения и вымывания лекарственного препарата. Один пероральный тест толерантности к глюкозе (ПТТГ) проводили через 2 недели после первой инъекции белка на животных, которые находились натощак в течение 4 ч. Другой пероральный тест толерантности к глюкозе (ПТТГ) проводили через 5 недель после первой инъекции белка на животных, которые находились натощак в течение 16 ч. При проведении ПТТГ животным пероральным путем вводили раствор глюкозы 2 г/кг, и уровни глюкозы измеряли во временных точках 0, 15, 30, 60, 120 мин с применением глюкометра AlphaTRAK (Abbott). Рассчитывали площадь под кривой (area under curve, AUC) уровней глюкозы во время ПТТГ для сравнения толерантности к глюкозе различных групп лечения. Образцы сыворотки отбирали через 3 недели после первой инъекции белка и применяли для измерения уровней инсулина, триглицерида и холестерола, а также уровней исследуемых соединений. Уровни инсулина измеряли с применением набора для иммуноанализа (Alpco). Уровни триглицерида и холестерола измеряли с применением ферментативных анализов (Wako).
Результаты представлены на фигурах 54-59 (звездочки показывают статистическую значимость). Данные эксперименты продемонстрировали, что описанные мультимеры, содержащие области GDF15, уменьшают AUC уровней глюкозы во время ПТТГ (фиг. 55 и 59), уменьшают массу тела (фиг. 54) уменьшают уровни инсулина (фиг. 56), уменьшают уровни холестерола (фиг. 58) и уменьшают уровни триглицеридов (фиг. 57).
Пример 6. Температурная стабильность конструкций GDF15.
Температурную стабильность избранных конструкций GDF15 оценивали методом дифференциальной сканирующей калориметрии на системе MicroCal Capillary VP-DSC, в которой разницу температур между эталонной ячейкой и ячейкой с образцом непрерывно измеряют и калибруют к единицам мощности. Канал данных называют в настоящей заявке сигнал РМ или разница мощности (РМ) между эталонной ячейкой и ячейкой с образцом. Разворачивание молекулы белка выглядит на термограмме ДСК как эндотермический переход и может быть охарактеризовано с помощью средних точек температурного перехода (Tm). Образцы нагревали в диапазоне от 10 до 100°С со скоростью нагревания 60°С/ч. Время предварительного сканирования составляло 15 мин, период фильтрации составлял 10 с. Концентрации, которые применяли в экспериментах методом ДСК, составляли приблизительно 1,0 мг/мл. Анализ данных для коррекции базовой линии и определения значений Tm проводили с применением программного обеспечения MicroCal Origin 7.
В частности, димер DhCpmFc(-)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+) сравнивали с димером Dh3CpmFc(-)- 151 037355
GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+); димер DhCpmFc(-)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+) сравнивали с димером Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+); димер DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D):DhCpmFc(+) (S354C) сравнивали с димером Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+)(S354C); и димер DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+)(S354C) сравнивали с димером Dh3CpmFc(-)(Y349C)GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+)(S354C). Результаты представлены на фиг. 61. Данные эксперименты свидетельствуют, что домены Dh3CpmFc характеризуются большей стабильностью, чем соответствующие домены DhCpmFc.
Пример 7. Анализ связывания рецептора Fcy.
Активность связывания с рецепторами Fcy избранных конструкций GDF15 анализировали на приборе BIA3000. Каждый рецептор Fcy захватывали на поверхности СМ5, покрытой антителом против His (уровень удерживания захвата ~ 200 ЕО, единиц ответа). Конструкции GDF15 разводили до концентрации 250 нМ в буфере для образца (0,1 мг/мл БСА, 0,005% Р20, ФБР). Каждую конструкцию GDF15 инъецировали над поверхностями с рецептором Fcy и захваченными антителами против His со скоростью 50 мкл/мин в течение 3 мин. После 5-минутной диссоциации в приборном буфере для анализа (0,005% Р20 в ФБР) поверхность каждого рецептора Fcy регенерировали инъекцией 8 мМ глицина, рН 1,5, 1М NaCl в течение 30 с с последующей инъекцией 10 мМ глицина, рН 1,5 в течение 30 с. Полученные в результате сенсограммы анализировали с применением программного обеспечения BIAcore BIAEvaluation (v. 4.1). Ответы связывания в единицах ЕО считывали за 10 с до окончания инъекции.
В частности, связывание с FcyRI, FcyRIIIA и FcyRIIA определяли для димера DhCpmFc(-)GDF15(Ndel3):DhCpmFc(+), димера DhCpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3): DhCpmFc(+)(S354C); димера Dh3CpmFc(-)-GDF15(Ndel3):Dh3CpmFc(+); димера Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(Ndel3)Dh3CpmFc(+) (S354C); димера Dh3CpmFc(-)-GDF15(N3D):Dh3CpmFc(+); и димера Dh3CpmFc(-)(Y349C)-GDF15(N3D): Dh3CpmFc(+)(S354C). Результаты представлены на фиг. 60. Данные эксперименты свидетельствуют, что домены Dh3CpmFc по существу устраняют связывание с FcyRI, FcyRIIIA и FcyRIIA.
Несмотря на то что настоящее изобретение было описано в отношении различных вариантов реализации, следует понимать, что различные вариации и модификации будут очевидными специалисту в данной области техники. Вследствие этого предполагают, что прилагаемая формула изобретения охватывает все такие эквивалентные вариации, которые относятся к заявленному объему настоящего изобретения. Кроме того, заголовки разделов используются в настоящей заявке исключительно с организационной целью, и их не следует истолковывать как ограничивающие описываемый предмет изобретения.
Все публикации, ссылки на которые содержатся в настоящей заявке, явным образом включены посредством ссылки в настоящую заявку для любой цели.

Claims (19)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Гибридный белок для лечения метаболического нарушения, содержащий область фактора дифференцировки и роста 15 (GDF15), где область GDF15 содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 97%-ную идентичность последовательности SEQ ID NO: 4, 8 или 12, где указанная область связана посредством полипептидного линкера с Fc-доменом с последовательностью SEQ ID NO:220 или Fc-доменом с последовательностью SEQ ID NO:227.
  2. 2. Гибридный белок по п.1, отличающийся тем, что указанный Fc-домен имеет аминокислотную последовательность 227.
  3. 3. Гибридный белок по п.2, отличающийся тем, что указанная область GDF15 содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 97%-ную идентичность последовательности SEQ ID NO: 12 и содержит мутацию в положении 3.
  4. 4. Гибридный белок по п.3, где мутацией в положении 3 является мутация N3D.
  5. 5. Гибридный белок по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что указанная область GDF15 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, 8, 12, 25, 52 или 55.
  6. 6. Гибридный белок по п.1, отличающийся тем, что указанный гибридный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 222, 225, 229 или 232.
  7. 7. Гибридный белок по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептидный линкер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18, 30, 34, 40, 58, 61, 64, 69, 72, 75, 78, 113, 116, 119, 122, 125 или 128.
  8. 8. Гибридный белок по любому из пп.1-7, где метаболическое нарушение представляет собой диабет, ожирение, дислипидемию или диабетическую нефропатию.
  9. 9. Димер для лечения метаболического нарушения, содержащий (i) первый белок, содержащий гибридный белок по любому из пп.1-8, и (ii) второй белок, содержащий Fc-домен.
  10. 10. Димер по п.9, отличающийся тем, что второй белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 219, 226, 301 или 302.
  11. 11. Димер по п.9 или 10, отличающийся тем, что указанный первый белок и указанный второй белок соединены нековалентным образом.
  12. 12. Димер по п.9 или 10, отличающийся тем, что указанный первый белок и указанный второй бе-
    - 152 037355 лок соединены ковалентным образом.
  13. 13. Димер по п.9 или 10, отличающийся тем, что указанный первый белок и указанный второй белок соединены посредством дисульфидной связи.
  14. 14. Димер по любому из пп.9-13, где метаболическое нарушение представляет собой диабет, ожирение, дислипидемию или диабетическую нефропатию.
  15. 15. Тетрамер для лечения метаболического нарушения, содержащий (i) первый димер по любому из пп.9-14 и (ii) второй димер по любому из пп.9-14, где указанный первый димер и указанный второй димер соединены посредством межцепочечной дисульфидной связи между областью GDF15 первого димера и областью GDF15 второго димера.
  16. 16. Тетрамер по п.15, где метаболическое нарушение представляет собой диабет, ожирение, дислипидемию или диабетическую нефропатию.
  17. 17. Применение гибридного белка по любому из пп.1-8, димера по любому из пп.9-14 или тетрамера по любому из пп.15, 16 для лечения метаболического нарушения.
  18. 18. Применение гибридного белка по любому из пп.1-8, димера по любому из пп.9-14 или тетрамера по любому из пп.15, 16 для лечения диабета, ожирения, дислипидемии или диабетической нефропатии.
  19. 19. Применение гибридного белка по любому из пп.1-8, димера по любому из пп.9-14 или тетрамера по любому из пп.15, 16 для уменьшения потребления пищи, массы тела, уровней инсулина, уровней триглицерида, уровней холестерола или уровней глюкозы у субъекта.
EA201690297A 2013-07-31 2014-07-31 Конструкции на основе фактора дифференцировки и роста 15 (gdf-15) EA037355B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361860723P 2013-07-31 2013-07-31
PCT/US2014/049254 WO2015017710A1 (en) 2013-07-31 2014-07-31 Growth differentiation factor 15 (gdf-15) constructs

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201690297A1 EA201690297A1 (ru) 2016-06-30
EA037355B1 true EA037355B1 (ru) 2021-03-17

Family

ID=51358091

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA202092386A EA202092386A1 (ru) 2013-07-31 2014-07-31 Конструкции на основе фактора дифференцировки и роста 15 (gdf15)
EA201690297A EA037355B1 (ru) 2013-07-31 2014-07-31 Конструкции на основе фактора дифференцировки и роста 15 (gdf-15)

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA202092386A EA202092386A1 (ru) 2013-07-31 2014-07-31 Конструкции на основе фактора дифференцировки и роста 15 (gdf15)

Country Status (35)

Country Link
US (3) US9862752B2 (ru)
EP (2) EP3027642B1 (ru)
JP (4) JP6509852B2 (ru)
KR (3) KR102376451B1 (ru)
CN (2) CN105980400B (ru)
AP (1) AP2016009011A0 (ru)
AR (1) AR097181A1 (ru)
AU (1) AU2014296107B2 (ru)
BR (1) BR112016002213A2 (ru)
CA (1) CA2918624C (ru)
CL (1) CL2016000249A1 (ru)
CR (1) CR20160097A (ru)
CY (1) CY1123836T1 (ru)
DK (1) DK3027642T3 (ru)
EA (2) EA202092386A1 (ru)
ES (1) ES2828670T3 (ru)
HK (1) HK1225738A1 (ru)
HU (1) HUE050630T2 (ru)
IL (1) IL243749B (ru)
JO (1) JO3566B1 (ru)
LT (1) LT3027642T (ru)
MA (1) MA38873B1 (ru)
MX (2) MX369152B (ru)
NZ (2) NZ754961A (ru)
PE (1) PE20160189A1 (ru)
PH (1) PH12016500208A1 (ru)
PL (1) PL3027642T3 (ru)
PT (1) PT3027642T (ru)
SG (1) SG11201600713RA (ru)
SI (1) SI3027642T1 (ru)
TN (1) TN2016000035A1 (ru)
TW (1) TWI648401B (ru)
UA (1) UA116665C2 (ru)
UY (1) UY35686A (ru)
WO (1) WO2015017710A1 (ru)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103533951B (zh) 2011-04-08 2017-04-19 安姆根有限公司 使用生长分化因子15(gdf‑15)治疗或改善代谢障碍的方法
US9714276B2 (en) * 2012-01-26 2017-07-25 Amgen Inc. Growth differentiation factor 15 (GDF-15) polypeptides
WO2013148117A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
US9161966B2 (en) 2013-01-30 2015-10-20 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. GDF15 mutein polypeptides
EP2950807B1 (en) 2013-01-30 2018-03-28 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use in treating metabolic disorders
EA202092386A1 (ru) 2013-07-31 2021-04-30 Эмджен Инк. Конструкции на основе фактора дифференцировки и роста 15 (gdf15)
JP2015182969A (ja) * 2014-03-21 2015-10-22 四国化成工業株式会社 トリアゾールシラン化合物、該化合物の合成方法及びその利用
US20170204149A1 (en) * 2014-06-23 2017-07-20 Novartis Ag Hsa-gdf-15 fusion polypeptide and use thereof
US10588980B2 (en) 2014-06-23 2020-03-17 Novartis Ag Fatty acids and their use in conjugation to biomolecules
US9272019B2 (en) 2014-06-24 2016-03-01 Novo Nordisk A/S MIC-1 fusion proteins and uses thereof
KR20170065026A (ko) 2014-07-30 2017-06-12 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 대사 장애 치료용으로 이용되는 조성물 및 방법
CA2961587A1 (en) 2014-10-31 2016-05-06 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
US20190000923A1 (en) 2015-12-22 2019-01-03 Novartis Ag Methods of treating or ameliorating metabolic disorders using growth differentiation factor 15 (gdf-15)
TWI815793B (zh) 2016-03-31 2023-09-21 美商恩格姆生物製藥公司 結合蛋白質及其使用方法
US10336812B2 (en) * 2016-05-10 2019-07-02 Janssen Biotech, Inc. GDF15 fusion proteins and uses thereof
TWI710377B (zh) 2017-05-23 2020-11-21 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 Ｍｉｃ－１化合物及其用途
KR102010652B1 (ko) * 2017-08-21 2019-08-13 서울대학교병원 간질환 예측 또는 진단용 조성물 및 이를 이용한 간질환 예측 또는 진단 방법
WO2019048660A1 (en) 2017-09-10 2019-03-14 Novo Nordisk A/S MIC-1 AND GLP-1 FOR USE IN THE TREATMENT OF OBESITY
TWI724392B (zh) 2018-04-06 2021-04-11 美商美國禮來大藥廠 生長分化因子15促效劑化合物及其使用方法
CR20200510A (es) * 2018-04-09 2020-11-26 Amgen Inc Protreínas de fusión del factor de diferenciación de crecimiento 15
SG11202012993SA (en) * 2018-07-13 2021-02-25 Genmab As Variants of cd38 antibody and uses thereof
JP2022513363A (ja) * 2018-10-22 2022-02-07 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． グルカゴン様ペプチド１（ｇｌｐ１）－増殖分化因子１５（ｇｄｆ１５）融合タンパク質及びその使用
SG11202111570TA (en) * 2019-04-23 2021-11-29 Lg Chemical Ltd Fusion polypeptide comprising fc region of immunoglobulin and gdf15
US20220259329A1 (en) 2019-06-07 2022-08-18 Amgen Inc. Bispecific binding constructs
BR112022006546A2 (pt) 2019-10-07 2022-08-30 Kallyope Inc Agonistas de gpr119
BR112022010227A2 (pt) * 2019-11-26 2022-09-13 Yuhan Corp Proteína de fusão gdf15 de ação prolongada e composição farmacêutica compreendendo a mesma
CA3159979A1 (en) * 2019-12-11 2021-06-17 Yeonchul Kim Fusion polypeptide comprising gdf15 and polypeptide region capable of o-glycosylation
CN114981297A (zh) 2019-12-23 2022-08-30 戴纳立制药公司 颗粒蛋白前体变体
CN116925237A (zh) 2019-12-31 2023-10-24 北京质肽生物医药科技有限公司 Glp-1和gdf15的融合蛋白以及其缀合物
MX2022014505A (es) 2020-05-19 2022-12-13 Kallyope Inc Activadores de la ampk.
CA3183575A1 (en) 2020-06-26 2021-12-30 Iyassu Sebhat Ampk activators
CN115244076B (zh) 2020-10-27 2023-08-04 北京质肽生物医药科技有限公司 Gdf15融合蛋白及其用途
WO2022219495A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 Novartis Ag 2-((4-((s)-2-(4-chloro-2-fluorophenyl)-2-methylbenzo[d][1,3]dioxol-4-yl)piperidin-1-yl)methyl)-1-(((s)-oxetan-2-yl)methyl)-1h-imidazole derivatives as activators of the glp1 receptor for the treatment of obesity
CA3226178A1 (en) * 2021-08-24 2023-03-02 Jiangyu YAN Gdf15 fusion proteins and uses thereof
TW202342014A (zh) 2022-02-10 2023-11-01 瑞士商諾華公司 １，３－苯并二氧戊環衍生物
WO2023154953A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Gdf15 polypeptides for treating and preventing autoimmune diseases
CN114835810B (zh) * 2022-03-31 2024-01-05 浙江特瑞思药业股份有限公司 一种抗pd-1纳米抗体及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999006445A1 (en) * 1997-07-31 1999-02-11 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-15
WO2006000448A2 (en) * 2004-06-28 2006-01-05 Merck Patent Gmbh Fc-INTERFERON-BETA FUSION PROTEINS
WO2010048670A1 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 St Vincent's Hospital Sydney Limited Method of prognosis in chronic kidney disease
WO2011064758A2 (en) * 2009-11-30 2011-06-03 Pfizer Limited Fusion protein
WO2013113008A1 (en) * 2012-01-26 2013-08-01 Amgen Inc. Growth differentiation factor 15 (gdf-15) polypeptides
WO2013148117A1 (en) * 2012-03-27 2013-10-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
US5288931A (en) * 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
US5470582A (en) 1992-02-07 1995-11-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles
SK9432001A3 (en) * 1999-01-07 2003-02-04 Lexigen Pharm Corp Expression and export of anti-obesity proteins as Fc fusion proteins
US6737056B1 (en) * 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
GB9912350D0 (en) * 1999-05-26 1999-07-28 European Molecular Biology Lab Embl Modified cytokine
US20030103978A1 (en) 2000-02-23 2003-06-05 Amgen Inc. Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein
SI1724284T1 (sl) 2000-12-07 2009-12-31 Lilly Co Eli Glp-1 fuzijski proteini
TWI329129B (en) * 2001-02-08 2010-08-21 Wyeth Corp Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof
EP1395605B8 (en) 2001-03-09 2014-12-17 Iterative Therapeutics, Inc. Polymeric immunoglobulin fusion proteins that target low-affinity fcgamma receptors
JP4422949B2 (ja) 2001-06-26 2010-03-03 武田薬品工業株式会社 ＴＧＦ−βスーパーファミリー産生・分泌促進剤
FI117667B (fi) * 2001-07-05 2007-01-15 Univ Zuerich Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä
US7332474B2 (en) 2001-10-11 2008-02-19 Amgen Inc. Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
US7662925B2 (en) * 2002-03-01 2010-02-16 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US7101852B2 (en) 2003-05-30 2006-09-05 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Composition and method for treatment and prevention of restenosis
WO2004108157A2 (en) * 2003-06-02 2004-12-16 Wyeth Use of myostatin (gdf8) inhibitors in conjunction with corticosteroids for treating neuromuscular disorders
WO2005063815A2 (en) 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
EP1682584B1 (en) * 2003-11-13 2013-04-17 Hanmi Science Co., Ltd. A pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin fc region as a carrier
WO2005077981A2 (en) 2003-12-22 2005-08-25 Xencor, Inc. Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES
EP2774620A1 (en) 2004-04-13 2014-09-10 St Vincent's Hospital Sydney Limited Method for modulating weight loss
WO2005113585A2 (en) * 2004-05-20 2005-12-01 Acceleron Pharma Inc. Modified tgf-beta superfamily polypeptides
BRPI0514253A (pt) * 2004-08-12 2008-06-03 Wyeth Corp terapia de combinação para diabetes, obesidade e doenças cardiovasculares usando composições contendo inibidores de gdf-8
EP1931709B1 (en) 2005-10-03 2016-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
EP1954714A2 (en) * 2005-11-10 2008-08-13 Receptor Biologix, Inc. Hepatocyte growth factor intron fusion proteins
CN1974601A (zh) * 2005-11-28 2007-06-06 上海新生源医药研究有限公司 一种新型Fc融合蛋白及其生产方法
US8629244B2 (en) 2006-08-18 2014-01-14 Ablynx N.V. Interleukin-6 receptor binding polypeptides
CN101854947A (zh) 2007-08-16 2010-10-06 圣文森特医院悉尼有限公司 用于调节巨噬细胞抑制因子(mic-1)活性的药剂和方法
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
EP2279419A1 (en) 2008-05-20 2011-02-02 Roche Diagnostics GmbH Gdf-15 as biomarker in type 1 diabetes
BRPI0916904A2 (pt) 2008-08-04 2016-10-11 Fiveprime Therapeutics Inc polipeptídeos, moléculares de fusão ecd fgfr4, composições farmacêuticas, polinucleotídio e métodos de tratamento de desordem angiogênica, câncer em paciente e degeneração macular em paciente e respectivos usos
JP2013511281A (ja) 2009-11-23 2013-04-04 アムジェン インコーポレイテッド 単量体抗体Ｆｃ
JP2013512672A (ja) * 2009-12-02 2013-04-18 アムジエン・インコーポレーテツド ヒトＦＧＦＲ１ｃ、ヒトβ−クロト−、ならびにヒトＦＧＦＲ１ｃおよびヒトβ−クロト−の両方に結合する結合タンパク質
US8362210B2 (en) * 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
EP2593431B1 (en) 2010-07-12 2014-11-19 Pfizer Limited N-sulfonylbenzamides as inhibitors of voltage-gated sodium channels
CA2804716A1 (en) 2010-07-12 2012-01-19 Pfizer Limited Chemical compounds
ES2526541T3 (es) 2010-07-12 2015-01-13 Pfizer Limited N-sulfonilbenzamidas como inhibidores de canales de sodio dependientes de voltaje
EP2796874B1 (en) 2010-08-26 2017-03-08 Roche Diagnostics GmbH Use of biomarkers in monitoring a medication in a subject suffering from heart failure
EP2439535A1 (en) 2010-10-07 2012-04-11 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnosis of diabetes related heart disease and GDF-15 and Troponin as predictors for the development of type 2 diabetes mellitus
AU2011325833C1 (en) * 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
JP5972915B2 (ja) 2011-03-16 2016-08-17 アムジエン・インコーポレーテツド Ｆｃ変異体
CN103533951B (zh) 2011-04-08 2017-04-19 安姆根有限公司 使用生长分化因子15(gdf‑15)治疗或改善代谢障碍的方法
HUE033008T2 (hu) * 2011-04-13 2017-11-28 Bristol Myers Squibb Co FC fúziós proteinek, amelyek tartalmaznak új linkereket
EA201892619A1 (ru) * 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
CA2859667C (en) * 2011-12-20 2022-05-24 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
MX360109B (es) * 2012-04-20 2018-10-23 Merus Nv Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig.
DK2934584T3 (da) 2012-12-21 2020-05-18 Aveo Pharmaceuticals Inc Anti-gdf15-antistoffer
EP2950807B1 (en) 2013-01-30 2018-03-28 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use in treating metabolic disorders
EA202092386A1 (ru) 2013-07-31 2021-04-30 Эмджен Инк. Конструкции на основе фактора дифференцировки и роста 15 (gdf15)
US20170204149A1 (en) 2014-06-23 2017-07-20 Novartis Ag Hsa-gdf-15 fusion polypeptide and use thereof
US10588980B2 (en) 2014-06-23 2020-03-17 Novartis Ag Fatty acids and their use in conjugation to biomolecules
WO2015200080A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 Novartis Ag Site specific protein modifications
US9272019B2 (en) 2014-06-24 2016-03-01 Novo Nordisk A/S MIC-1 fusion proteins and uses thereof
US20190000923A1 (en) 2015-12-22 2019-01-03 Novartis Ag Methods of treating or ameliorating metabolic disorders using growth differentiation factor 15 (gdf-15)
US10336812B2 (en) 2016-05-10 2019-07-02 Janssen Biotech, Inc. GDF15 fusion proteins and uses thereof
US20190248852A1 (en) 2016-05-24 2019-08-15 Novo Nordisk A/S MIC-1 Compounds and Use Thereof
TWI724392B (zh) 2018-04-06 2021-04-11 美商美國禮來大藥廠 生長分化因子15促效劑化合物及其使用方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999006445A1 (en) * 1997-07-31 1999-02-11 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-15
WO2006000448A2 (en) * 2004-06-28 2006-01-05 Merck Patent Gmbh Fc-INTERFERON-BETA FUSION PROTEINS
WO2010048670A1 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 St Vincent's Hospital Sydney Limited Method of prognosis in chronic kidney disease
WO2011064758A2 (en) * 2009-11-30 2011-06-03 Pfizer Limited Fusion protein
WO2013113008A1 (en) * 2012-01-26 2013-08-01 Amgen Inc. Growth differentiation factor 15 (gdf-15) polypeptides
WO2013148117A1 (en) * 2012-03-27 2013-10-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders

Also Published As

Publication number Publication date
PL3027642T3 (pl) 2021-01-11
JO3566B1 (ar) 2020-07-05
JP6509852B2 (ja) 2019-05-08
TWI648401B (zh) 2019-01-21
EA201690297A1 (ru) 2016-06-30
PE20160189A1 (es) 2016-05-06
TN2016000035A1 (en) 2017-07-05
NZ717030A (en) 2022-04-29
KR102616674B1 (ko) 2023-12-29
MX2016001164A (es) 2016-07-26
PT3027642T (pt) 2020-10-30
US9862752B2 (en) 2018-01-09
MX369152B (es) 2019-10-30
CY1123836T1 (el) 2022-03-24
KR20160038896A (ko) 2016-04-07
JP2019178132A (ja) 2019-10-17
NZ754961A (en) 2022-04-29
BR112016002213A2 (pt) 2017-08-29
EP3027642A1 (en) 2016-06-08
EA202092386A1 (ru) 2021-04-30
PH12016500208B1 (en) 2016-04-25
JP2021113219A (ja) 2021-08-05
CN105980400A (zh) 2016-09-28
KR20220038829A (ko) 2022-03-29
LT3027642T (lt) 2020-10-12
AP2016009011A0 (en) 2016-01-31
KR20240000642A (ko) 2024-01-02
MX2019012848A (es) 2019-11-28
JP6877478B2 (ja) 2021-05-26
MA38873A1 (fr) 2017-09-29
DK3027642T3 (da) 2020-11-02
US20160168213A1 (en) 2016-06-16
UY35686A (es) 2015-01-30
CA2918624A1 (en) 2015-02-05
PH12016500208A1 (en) 2016-04-25
UA116665C2 (uk) 2018-04-25
CA2918624C (en) 2024-02-13
US20210079051A1 (en) 2021-03-18
SI3027642T1 (sl) 2020-11-30
US10894814B2 (en) 2021-01-19
CN105980400B (zh) 2021-05-07
AU2014296107A1 (en) 2016-02-04
US20180079790A1 (en) 2018-03-22
HK1225738A1 (zh) 2017-09-15
IL243749A0 (en) 2016-04-21
AR097181A1 (es) 2016-02-24
ES2828670T3 (es) 2021-05-27
HUE050630T2 (hu) 2020-12-28
MA38873B1 (fr) 2018-11-30
AU2014296107B2 (en) 2018-07-26
CL2016000249A1 (es) 2016-07-22
CN113527512A (zh) 2021-10-22
JP2016532690A (ja) 2016-10-20
CR20160097A (es) 2016-07-29
TW201602345A (zh) 2016-01-16
SG11201600713RA (en) 2016-02-26
EP3027642B1 (en) 2020-08-19
KR102376451B1 (ko) 2022-03-23
JP2023116723A (ja) 2023-08-22
EP3763734A1 (en) 2021-01-13
WO2015017710A1 (en) 2015-02-05
IL243749B (en) 2018-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210079051A1 (en) Growth differentiation factor 15 (gdf-15) constructs
US11739131B2 (en) Growth differentiation factor 15 (GDF-15) polypeptides
CA3134538A1 (en) Formulations of protein molecules comprising iduronate 2-sulfatase
CN113747912A (zh) 重组ccn结构域蛋白和融合蛋白
US7579316B2 (en) Compositions and methods to modulate an immune response to an immunogenic therapeutic agent
EA046387B1 (ru) Конструкции на основе фактора дифференцировки и роста 15 (gdf15)

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG TJ TM