KR20210125880A

KR20210125880A - 위치특이적으로 hsa가 부착된 glp-1

Info

Publication number: KR20210125880A
Application number: KR1020200062410A
Authority: KR
Inventors: 권인찬; 박미정; 박준용; 양병섭; 조진환; 태기융; 민기윤; 조정행; 김현우; 정은정
Original assignee: 주식회사 프로앱텍
Priority date: 2020-04-08
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2021-10-19
Also published as: WO2021241810A1

Abstract

본 출원은 위치 특이적으로 알부민이 GLP-1에 연결된 펩타이드-알부민 컨주게이트 또는 이의 이용에 대한 것이다.

Description

위치특이적으로 HSA가 부착된 GLP-1 {GLP-1 with albumin linked to a specific site}

본 출원은 GLP-1 펩타이드를 이용하는 치료제와 관련된 기술이다.

당뇨병 치료에서 정상혈당으로 엄격하게 유지하는 것은 질환의 치료 또는 완화뿐만 아니라 당뇨병 합병증 예방에 필수적이라는 사실은 대규모 임상 연구들을 통해 이미 잘 알려져 있는 사실이다. 인슐린뿐만 아니라, glucagon like peptide-1(GLP-1)은 당뇨병을 치료하기 위한 대표적인 후보 물질이다.

치료용 단백질의 개발 시 중요한 고려사항 중 하나는 투여주기를 연장하는 것으로서, 이를 위해 제약분야에서 활발하게 연구되는 중이다. 당업자들은 반감기를 늘일 수 있는 물질, 대표적으로 알부민(albumin)을 치료제에 연결 또는 부착하거나, 체내에서 분해(degradation)되는 기작을 방해하거나 또는 지연시킴으로써 상기 문제점을 해결하기 위해 노력하고 있다.

본 출원을 통하여 펩타이드-알부민 컨주게이트 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 출원을 통하여 본 출원의 펩타이드-알부민 컨주게이트 또는 이를 포함하는 약학적 조성물의 혈당강하용도, 또는 당뇨병 또는 비만 치료용도를 제공하고자 한다.

본 출원을 통하여 GLP-1 유사체를 제공하고자 한다.

본 출원을 통하여 본 출원의 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조방법 또는 이를 제조할 수 있는 키트를 제공하고자 한다.

본 출원은 GLP-1 유사체, 연결 모이어티 및 알부민이 순차적으로 연결된 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공한다.

본 출원은 화학식 (I)을 포함하는 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공한다.

[화학식 (I)]

상기 P1은 GLP-1 유사체(GLP-1 analogue), 상기 B는 결합구조, L은 연결 모이어티(linking moiety) 및 상기 P2는 알부민 또는 이의 변이체이고, 이 때, 상기 GLP-1 유사체는 (i) 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나, 또는 이와 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열, 및 (ii) 상기 (i)의 아미노산 서열의 10번째, 13번째 또는 22번째 위치에 구조 (I)의 비천연 아미노산(non-natural amino acid)를 포함하고,

[구조 (I)]

이 때, 상기 D는 2가 링커(Bivalent linker), 상기 AA1과 상기 AA2는 비천연 아미노산과 결합되어 있는 아미노산이고, 이 때, 상기 B는 클릭-화학(click-chemistry)에 의해 형성된 결합구조이고, 이 때, 상기 연결 모이어티는 상기 B를 통하여 상기 GLP-1 유사체와 연결됨을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공한다.

본 출원은 상기 구조 (I)에 있어서, 상기 D는 결합(a bond), 알킬렌(alkylene), 치환된 알킬렌(substituted alkylene), 헤테로알킬렌(heteroalkylene), 치환된 헤테로알킬렌(substituted heteroalkylene), 아릴렌(arylene), 치환된 아릴렌(substituted arylene), 헤테로아릴렌(heteroarlyene), 치환된 헤테로아릴렌(substituted heteroarylene), 알카릴렌(alkarylene), 치환된 알카릴렌(substituted alkarylene), 헤테로알카릴렌(heteroalkarylene), 치환된 헤테로알카릴렌(substituted heteroalkarylene), 아랄킬렌(aralkylene), 치환된 아랄킬렌(substituted aralkylene), 헤테로아랄킬렌(heteroaralkylene), 및 치환된 헤테로아랄킬렌(substituted heteroaralkylene) 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공한다.

본 출원은 상기 구조 (I)에 있어서, 상기 B는

,

,

,

,

,

및

중 선택된 어느 하나이고, 이 때, 상기 A1 또는 상기 A2는 각각 상기 L 또는 상기 D에 연결됨을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공한다.

본 출원은 상기 연결 모이어티는 알부민 내 시스테인 잔기를 통하여 상기 알부민과 연결되는 것을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공한다.

본 출원은 서열번호 1 내지 서열번호 7 중 어느 하나 또는 이와 80% 이상의 상동성을 가지는 GLP-1 유사체를 포함하는 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공한다.

본 출원은 (C₂H₄O)_n를 포함하는 연결모이어티를 포함하는 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공한다. 이 때, 상기 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 이상의 정수이다.

본 출원은 상기 펩타이드-알부민 컨주게이트를 포함하는 혈당강하용, 당뇨병 치료용, 또는 비만 예방 또는 치료용약학적 조성물을 제공한다.

본 출원은 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 (i) 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나, 또는 이와 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열, 및 (ii) 상기 (i)의 아미노산 서열의 10번째, 13번째 또는 22번째 위치에 구조 (II)의 비천연 아미노산(non-natural amino acid)를 포함한다:

[구조 (II)]

이 때, 상기 D는 2가 링커(Bivalent linker), 상기 AA1과 상기 AA2는 비천연 아미노산과 결합되어 있는 아미노산이고, 이 때, 상기 H'은 클릭화학 작용기(click-chemistry functional group)를 포함함을 특징으로 하는 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드를 제공한다.

이 때, 상기 H'은 클릭화학 작용기이다. 상기 클릭화학 작용기는 말단 알킨, 아자이드, 스트레인된 알킨, 다이엔, 친다이엔체, 알켄, 티올, 노르보넨, 디벤조시클로옥신-아민 및 테트라진 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드를 제공한다.

본 출원은 상기 클릭화학 작용기는 O-propargly-L-tyrosine(oPa), L-Homopropargylglycine(HPG), 4-Ethynyl-L-phenylalanine hydrochloride(pEthF), p-Azido-L-phenylalanine(AzF), p-ethynyl-phenylalanine(pEPA), O-propargly-L-tyrosine(oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine(pPa) 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드를 제공한다.

본 출원은 상기 구조 (II)에 있어서, 상기 D는 결합(a bond), 알킬렌(alkylene), 치환된 알킬렌(substituted alkylene), 헤테로알킬렌(heteroalkylene), 치환된 헤테로알킬렌(substituted heteroalkylene), 아릴렌(arylene), 치환된 아릴렌(substituted arylene), 헤테로아릴렌(heteroarlyene), 치환된 헤테로아릴렌(substituted heteroarylene), 알카릴렌(alkarylene), 치환된 알카릴렌(substituted alkarylene), 헤테로알카릴렌(heteroalkarylene), 치환된 헤테로알카릴렌(substituted heteroalkarylene), 아랄킬렌(aralkylene), 치환된 아랄킬렌(substituted aralkylene), 헤테로아랄킬렌(heteroaralkylene), 및 치환된 헤테로아랄킬렌(substituted heteroaralkylene) 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공한다.

본 출원은 상기 인슐린 분비활성을 가진 펩타이드를 포함하는 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트를 제공한다.

본 출원은 클릭화학 작용기 및 알부민 반응기를 포함하는 링커를 포함하고, 이 때, 상기 클릭화학 작용기는 GLP-1 유사체의 클릭화학 작용기와 특이적으로(complementary to) 반응가능하고, 이 때, 상기 알부민 반응기는 알부민과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있음을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트를 제공한다.

본 출원은 다음의 화학식 (II)를 포함하는 링커를 포함하는 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트를 제공한다.

[화학식 (II)]

본 출원은 상기 H''은 클릭화학 작용기이고, 상기 L은 연결 모이어티이고, 및 상기 A는 알부민 반응기인 것을 특징으로 하는 링커를 포함하는 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트를 제공한다.

본 출원은 상기 알부민 반응기는 Maleimide(MAL) 또는 3-arylpropiolonitriles(APN) 인 것을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트를 제공한다.

본 출원은 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트로서, 상기 키트는 (i) 인슐린 분비 활성을 가지는 펩타이드, 이 때, 상기 펩타이드는 제1 클릭화학 작용기를 포함하고, (ii) 제2 클릭화학 작용기를 포함하는 링커와 연결된 알부민 또는 이의 변이체, 이 때, 상기 제2 클릭화학 작용기는 제1 클릭화학 작용기와 특이적으로(complementary to) 반응가능함을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트를 제공한다.

본 출원은 혈당강하용 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조방법으로서,

(i) 인슐린 분비 활성을 가지는 펩타이드, (ii) 알부민 또는 이의 변이체 및 (iii) 링커를 준비함(preparing), 이 때, 상기 펩타이드는 제1 클릭화학 작용기를 포함하고, 이 때, 상기 제2 클릭화학 작용기는 제1 클릭화학 작용기와 특이적으로(complementary to) 반응가능하고, 이 때, 상기 알부민 반응기는 알부민과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있음.

상기 펩타이드의 상기 제1 클릭화학 작용기와 상기 링커의 제2 클릭화학 작용기가 특이적으로 반응하여 상기 펩타이드와 상기 링커가 서로 연결되도록, 상기 알부민과 상기 링커의 상기 알부민 반응기가 반응하여 상기 알부민과 상기 링커가 서로 연결되도록 유도하고(inducing), 이로써, 펩티드, 링커 및 알부민이 순차적으로 연결된 펩타이드-알부민 컨주게이트가 형성됨.

상기 펩타이드-알부민 컨주게이트를 포함하는 반응 혼합물(a reation mixture)을 얻음(obtaining)을 포함하는 혈당강하용 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조방법을 제공한다.

본 출원에 의하여 제공되는 반감기가 연장된 GLP-1-알부민 컨주게이트, 또는 상기 GLP-1-알부민컨주게이트는 당뇨병 치료제로 사용될 수 있다.

본 출원에 의하여 제공되는 GLP-1 유사체, 또는 상기 GLP-1 유사체를 포함하는 키트를 통하여 당뇨병 치료제를 제조할 수 있다

도 1은 SDS-PAGE를 이용하여 sfGFP-GLP1_16AzF 발현을 나타낸 것으로서, 보다 구체적으로 IPTG 유도 전(1) 및 후(2)를 나타낸 것이다.
도 2는 SDS-PAGE를 이용하여 sfGFP-GLP1_16AzF 발현을 나타낸 것으로서, 보다 구체적으로 Ni-NTA 분리 후 sfGFP-GLP1_16AzF SDS-PAGE 결과이다.
도 3 및 도 4는 Ni-NTA 분리 후 음이온 교환 크로마토그래피를 수행한 결과이며, F3과 F4 분획에서 sfGFP-GLP1_16AzF 분리됨을 확인한 결과이다.
도 5는 형광 dye와 반응시킨 후 SDS-PAGE 를 이용하여 AzF 도입을 확인한 결과이다.
도 6은 GLP1_C, recombinant GLP1-C, GLP1_16AzF, GLP1_19AzF, GLP1_28AzF의 분자량을 분석한 결과이다.
도 7은 sfGFP-GLP1_16AzF와 DBCO-HSA을 반응시킨 후 양이온 교환 크로마토그래피를 실시한 결과이다.
도 8은 상기 도 7의 F2 분획에서 sfGFP-GLP1_16HSA가 분리된 것을 확인한 것이다.
도 9는 Factor Xa 처리 후 음이온교환 크로마토그래피를 수행한 결과이다.
도 10 내지 도 12는 상기 도 9의 F2 분획에서 GLP1_16HSA가 분리된 것을 확인한 것이다. 또한, GLP1_19HSA, GLP1_28HSA의 SDS-PAGE를 분석한 결과이다.
도 13은 SEC-HPLC로 sfGFP-GLP-1_16HSA와 sfGFP-GLP1_16AzF의 순도 및 분자량을 분석한 결과이다. 및 GLP-1-HSA의 PI값을 확인한 것이다.
도 14는 GLP1_16HSA와 sfGFP-GLP1_16AzF의 PI를 분석한 결과이다.
도 15는 MALDI-TOF를 이용하여 GLP1_16HSA, GLP1_19HSA 및 GLP1_28HSA의 분자량을 분석한 결과이다.
도 16은 세포내에서 GLP1_C, GLP1_16HSA, GLP1_19HSA 및 GLP1_28HSA의 EC₅₀을 분석한 결과 이다.
도 17은 마우스 내에서 GLP1_16HSA, GLP1_19HSA 및 GLP1_28HSA의 반감기를 분석한 결과이다.
도 18 및 도 19는 마우스에서 GLP1_C, GLP1_16HSA, GLP1_19HSA 및 GLP1_28HSA의 당부하능을 확인한 결과이다.
도 20은 본 출원의 펩타이드-알부민 컨주게이트의 제조방법의 전반을 보여주는 도면이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 다른 참고문헌은 전체가 참조고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

본 출원은 펩타이드-알부민 컨주게이트 및 이를 이용하는 약학적 용도를 제공한다.

본 출원은 (i) GLP-1 유사체 내의 비천연 아미노산에 (ii) 알부민이 (iii) 연결 모이어티(linking moiety)를 통하여 위치 특이적으로 연결된 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공한다.

GLP-1은 체내 포도당 농도가 높을 경우 인슐린 분비를 증강시키는 특징을 가진다. 회장과 대장의 L 세포에서 만들어진 GLP-1은 활성화되기 위하여 N 말단의 일부가 잘려 지면서 GLP-1(7-37) 또는 GLP-1(7-36) amide 형태가 된다.

다만, 상기의 GLP-1는 체내에서 디펩티딜 펩티데이즈 IV(dipeptidyl peptide IV (DPP-IV))라는 효소에 의해 N 말단의 2개의 아미노산이 끊기면서 GLP-1(9-36)가 되고 활성이 사라진다. GLP-1의 활성이 없어지는 시간은 체내에서 매우 짧으며, 정성적으로 GLP-1의 혈중 반감기는 약 2분 정도에 불과하다.

GLP-1의 혈중 반감기를 늘이기 위해서 (i) DPP-IV의 활성을 억제하는 물질을 함께 투여하거나, (ii) GLP-1의 입체구조를 인위적으로 변형 또는 조작함으로써 DPP-IV의 활성을 저해하거나, (iii) DPP-IV의 활성부위를 없애거나, 또는 (iv) GLP-1에 체내에서 긴 반감기를 가지는 알부민(albumin) 또는 폴리에틸렌글라이콜(polyethylene glycol, PEG)을 연결 또는 부착하는 등의 연구가 활발히 이루어지고 있다.

다만, 상기의 다양한 시도를 통해 완성된 반감기가 길어진 종래의 치료제는 면역원성이 발생하거나, 배출되지 않아 체내에 축적되거나, 또는 위장관계 장애 등의 부작용이 발생한다는 새로운 문제점이 존재한다.

따라서, 체내에서 안정하고 효과적이면서 반감기가 증가된 당뇨병 치료제가 필요한 실정이다

본 출원에서 제공되는 펩타이드-알부민 컨주게이트는 펩타이드 자체의 반감기보다 향상된 반감기를 가짐을 일 특징으로 한다. 본 출원에서 제공되는 펩타이드-알부민 컨주게이트는 펩타이드 자체의 활성과 동등하거나 유사한 수준의 활성을 가짐을 일 특징으로 한다.

신규한 펩타이드-알부민 컨주게이트의 구조를 통해 발생하는 효과

본 출원을 통하여 제공되는 펩타이드-알부민 컨주게이트는 알부민이 GLP-1 유사체의 특정 위치의 아미노산에 특이적으로 연결된, 신규한 구조를 가진다.

본 출원에서 제공되는 펩타이드-알부민 컨주게이트는, GLP-1 유사체의 구조가 그대로 유지되거나 상대적으로 적게 변형되는 위치에 알부민이 연결되는 것을 일 특징으로 할 수 있다. 이로 인하여, GLP-1 활성에 영향을 미치지 않거나, 다른 위치에 알부민이 연결된 컨주게이트와 비교할 때 활성의 감소가 상대적으로 적다는 효과를 가질 수 있다.

본 출원에서 제공되는 펩타이드-알부민 컨주게이트는 상기의 신규한 구성을 통하여 GLP-1 활성이 그대로 유지되거나, 자연 발생된 GLP-1의 활성과 동등 또는 유사한 수준의 활성을 가지거나, 또는 다른 위치에 알부민이 연결된 컨주게이트보다 더 높은 활성을 가진다는 효과를 제공할 수 있다.

또한 본 출원을 통하여 제공되는 펩타이드-알부민 컨주게이트는 반감기가 짧은 GLP-1 유사체에 알부민을 연결함으로써 GLP-1 자체의 반감기보다 향상된 반감기(improved half-life)를 가진다는 특징이 있다. 이 때, 향상된 반감기란 자연 발생된 GLP-1의 반감기보다 더 긴 반감기를 가짐을 의미한다. 일 구체예로, 자연 발생된 GLP-1 반감기보다 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 또는 10000배 이상 향상된 반감기를 가질 수 있다.

또한 본 출원을 통하여 제공되는 펩타이드-일부민 컨주게이트는 정전기적 반발력(electrostatic repulsion)에 의하여 신장에서 여과되지 않는 특징, 및 내피세포(endothelium)에서 FcRn 매개 순환작용을 통하여 오랫동안 체내에서 지속될 수 있는 특징을 가진다.

본 출원에서 제공하는 펩타이드-알부민 컨주게이트는 신규한 구조 및 그 구조를 통하여 발생하는 효과에 비추어 볼 때, GLP-1의 C-말단에 알부민을 연결한 Conjuchem의 CJC-1131(특허출원번호 US10/288340 등 관련 특허패밀리 참조) 등 보다 더 높은 활성을 가진다.

결국, 펩타이드-알부민 컨주게이트는 상기 GLP-1 유사체에 위치 특이적으로 알부민이 연결된다는 신규한 구조로 이루어짐으로써 (i) 펩타이드 자체보다 향상된 반감기를 가지고, 및 (ii) 펩타이드 단독으로 작용할 때와 동등한 활성을 가지거나, 그에 준하는 수준의 활성을 가짐을 특징으로 한다. 이로써 질병을 치료하기 위한 약물의 투여주기가 길어진다는 장점이 존재한다.

본 출원은 GLP-1 유사체를 제공한다.

본 출원은 비천연 아미노산을 포함하는 신규한 GLP-1 유사체를 제공한다. 본 출원에서 제공되는 GLP-1 유사체는 알부민을 원하는 위치에 특이적으로 연결하기 위하여 비천연 아미노산을 포함한다는 구성적 및 기술적 특징을 가진다. 이 때, 비천연 아미노산은 GLP-1 유사체 내에서 하기 구조 (ii)를 가지며, 비천연 아미노산은 R 그룹으로 D 및 H'을 포함하는 것을 특징으로 한다.

구조 (II)의 D는 2가 링커이고, H'은 클릭화학 작용기이다. 구조 (II)의 AA1과 AA2는 비천연 아미노산과 결합되어 있는 아미노산이다.

[구조 (II)]

일 예로, 상기 클릭화학 작용기는 말단 알킨(terminal alkyne), 아자이드(azide), 스트레인된 알킨(strained alkyne), 다이엔(diene(, 친다이엔체(dienophile), 알켄(alkene), 티올(thiol), 노르보넨(Norbornene), 디벤조시클로옥신-아민, 트랜스 시클로옥틴 (trans-cyclooctene) 및 테트라진(tetrazine) 중 선택된 어느 하나일 수 있다. 다만, 이에 한정되지 않는다. (영문병기)

일 구체예로, 상기 클릭화학 작용기는 O-propargly-L-tyrosine(oPa), L-Homopropargylglycine(HPG), 4-Ethynyl-L-phenylalanine hydrochloride(pEthF), p-Azido-L-phenylalanine(AzF), p-ethynyl-phenylalanine(pEPA), O-propargly-L-tyrosine(oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine(pPa) 중 선택된 어느 하나일 수 있다. 다만, 이에 한정되지 않는다.

일 예로, 상기 D는 결합(a bond), 알킬렌(alkylene), 치환된 알킬렌(substituted alkylene), 헤테로알킬렌(heteroalkylene), 치환된 헤테로알킬렌(substituted heteroalkylene), 아릴렌(arylene), 치환된 아릴렌(substituted arylene), 헤테로아릴렌(heteroarlyene), 치환된 헤테로아릴렌(substituted heteroarylene), 알카릴렌(alkarylene), 치환된 알카릴렌(substituted alkarylene), 헤테로알카릴렌(heteroalkarylene), 치환된 헤테로알카릴렌(substituted heteroalkarylene), 아랄킬렌(aralkylene), 치환된 아랄킬렌(substituted aralkylene), 헤테로아랄킬렌(heteroaralkylene), 및 치환된 헤테로아랄킬렌(substituted heteroaralkylene) 중 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 출원은 디펩티딜 펩티데이즈 4(dipeptidyl peptidase-4, DPP-4)가 작동하지 않거나 이의 영향을 적게 받는 GLP-1 유사체를 제공한다. DPP-4는 GLP-1의 아미노산 서열 내 제1 아미노산 및 제2 아미노산 간의 결합을 절단한다. 이 때, DPP-4에 의하여 절단되는 아미노산 사이의 결합을 DPP-4 인식부위라고 칭한다.

본 출원에서 제공되는 GLP-1 유사체는 DPP-4 인식부위가 변형됨으로써 더 이상 DPP-4에 의하여 GLP-1 유사체 내 아미노산 사이의 결합이 절단되지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 때, GLP-1의 아미노산 서열을 조작 또는 변경함으로써 상기 DPP-4 인식부위는 변형될 수 있다.

상기 DPP-4 인식부위의 변형은 상기 DPP-4에 의하여 절단되는 결합에 직접적으로 관여하고 있는 아미노산의 종류를 변경하거나, 상기 절단되는 결합으로부터 1, 2 또는 3 이상 떨어진 위치의 아미노산을 변경하거나 새로운 아미노산을 부가함으로써 유발시킬 수 있다. 일 예로, 서열번호 1로 표시되는 GLP-1, 예를 들어, X2가 글라이신인 GLP-1 유사체는 더 이상 DPP-4에 의하여 더 이상 절단되지 않음을 특징으로 할 수 있다.

신규한 GLP-1 유사체의 구조를 통해 발생하는 효과

본 출원을 통하여 제공되는 GLP-1 유사체는 클릭화학에 관여하는 작용기를 포함하는 임의의 분자, 화합물, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 위치 특이적으로 결합 또는 연결될 수 있다. 보다 구체적으로, 클릭화학 작용기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 GLP-1 유사체는 상기 GLP-1 유사체의 클릭화학 작용기와 페어(Pair)를 이루는 클릭화학 작용기를 포함하는 분자, 화합물, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 특이적으로 반응함으로써 위치 특이적으로 결합 또는 연결될 수 있다.

일 예로, 본 출원의 GLP-1은 본 출원에서 제공하는 클릭화학 작용기를 포함하는 링커와 위치 특이적으로 연결될 수 있다.

본 출원을 통하여 제공되는 GLP-1 유사체는 DPP-4의 인식부위를 변형시킨 아미노산 서열을 포함함으로써 향상된 반감기를 가짐을 특징으로 한다.

이하 상세히 설명한다.

펩타이드 치료제의 본질적인 문제점 - 짧은 반감기

인간 질환의 치료제로서 펩타이드에 대한 연구는 빠르게 증가하고 있다. 그러나, 분자량이 작은 펩타이드는 본질적으로 혈액 내에서 짧은 반감기를 갖는다는 점, 및 사구체에서 여과된다는 점의 문제점이 존재한다. 결국 치료효과가 오랜 시간 지속되지 못하므로 치료제의 투여주기가 짧다는 문제점이 존재한다.

개선된 펩타이드 치료제의 문제점 - 펩타이드의 기능(활성) 저하

한편, 종래에는 반감기가 짧다는 문제점을 해결하기 위해, PEG를 펩타이드에 공유적, 비공유적, 직접적 또는 간접적으로 연결 또는 결합하는 방법을 이용하기도 하였다. 그러나, 부착되는 PEG 개수를 조절하기 힘든 점, PEG는 면역원성 발생, 펩타이드의 활성부위 또는 이에 영향을 주는 위치에 연결됨으로써 펩타이드의 활성이 현저하게 떨어진다는 새로운 문제점이 발생하였다.

또는, 종래에는 반감기가 짧다는 문제점을 해결하기 위해, 알부민을 펩타이드에 공유적, 비공유적, 직접적 또는 간접적으로 연결 또는 결합하는 방법을 이용하기도 하였다 그러나, 알부민이 무작위로 연결되거나 펩타이드의 활성부위 또는 이에 영향을 주는 위치에 연결됨으로써 펩타이드의 활성이 현저하게 떨어진다는 새로운 문제점이 발생하였다.

일 예로, 펩타이드 내 수용체와 결합되는 부위, 펩타이드의 N말단, C말단 또는 이의 근처 위치(site)에 알부민이 연결됨으로써 펩타이드와 수용체 간의 결합 또는 신호전달을 방해한다는 문제가 발생하였다.

또 다른 일 예로, 펩타이드에 입체장애를 일으키는 위치에 연결 또는 부착되어 펩타이드의 활성을 떨어뜨리는 등의 문제점이 발생하였다.

또한 펩타이드의 임의의 위치에 무작위로 연결됨으로써 최종 생성물이 균일하지 못하여, 불균일 혼합물(heterogeneous mixture)이 제조된다는 문제점이 발생하였다. 이로 인하여 섬세하고 정밀한 정제(purification) 공정이 필수적으로 수반되어야 했다.

결국 분자량이 작은 펩타이드의 구조 또는 활성에 영향을 미치지 않거나 영향을 상대적으로적게 미치는 위치에 특이적으로 PEG 또는 알부민을 연결하여야 한다는 필요성이 대두되었다.

본 명세서에 의해 개시되는 발명의 일 태양은 위치 특이적으로 알부민이 연결되어 있는 펩타이드-알부민 컨주게이트이다.

본 출원은 (i) GLP-1 유사체와 (ii) 알부민 또는 이의 변이체가 (iii) 연결 모이어티(linking moiety)를 통하여 위치 특이적으로 연결된 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공한다. 일 예로, (i) GLP-1 유사체 내 비천연 아미노산에 (ii) 알부민 또는 이의 변이체가 (iii) 연결 모이어티를 통하여 위치 특이적으로 연결된 펩타이드-알부민 컨주게이트 일 수 있다. 이 때, 상기 펩타이드-알부민 컨주게이트는 GLP-1의 활성을 유지하면서 체내에서 향상된 반감기를 가짐을 특징으로 한다.

본 출원에서 제공하는 펩타이드-알부민 컨주게이트는 GLP-1 내 원하는 위치에 특이적으로 알부민을 연결한 것이다. 따라서, (i) 펩타이드의 활성에 영향을 미치지 않거나 종래의 발명과 비교할 때 상대적으로 현저하게 적은 영향을 미치는 위치에 특이적으로 알부민을 부착할 수 있다. 이로써, 본 출원은 GLP-1의 활성을 유지하면서 체내에서 향상된 반감기를 가지는 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공할 수 있다. 또한, (ii) GLP-1 내 원하는 위치에 알부민을 특이적으로 연결할 수 있으므로 최종 생성물이 균일하게 제공될 수 있다. 즉 균일 혼합물(homologous mixture)을 수득하게 되므로, 비균일 혼합물과 비교하면 간단한 정제 공정을 통하여 쉽게 수득할 수 있고, 더 나아가 높은 수율을 가짐을 기술적 특징으로 할 수 있다.

일 예로, 본 출원은 (i) GLP-1 유사체(analogue)와 (ii) 알부민(albumin)이 (iii) 연결 모이어티(linking moiety)를 통하여 서로 연결된 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공할 수 있다.

일 예로, 본 출원은 (i) GLP-1 유사체와 (ii) 알부민 사이에 (iii) 연결 모이어티가 위치한 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공할 수 있다.

일 예로, 본 출원은 [GLP-1]-[연결 모이어티]-[알부민] 구조를 가진 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공할 수 있다.

일 예로, 본 출원은 (i) GLP-1, (ii) 연결모이어티 및 (iii) 알부민이 순서대로 연결되어 있는 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공할 수 있다.

일 예로, 본 출원에서 제공되는 펩타이드-알부민 컨주게이트는 GLP-1 내 특정 아미노산에 알부민이 연결되는 것을 특징으로 한다.

일 예로, 본 출원에서 제공되는 펩타이드-알부민 컨주게이트는 화학식 (I)을 포함하는 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공할 수 있다.

[화학식 (I)]

이 때, 상기 P1은 GLP-1 유사체(analogue)이고, 상기 P2는 알부민 또는 이의 변이체(variant)이고, 상기 L은 연결 모이어티(linking moiety)이고, 상기 B는 클릭-화학(click-chemistry)에 의해 형성된 결합구조인 펩타이드-알부민 컨주게이트일 수 있다.

[펩타이드-알부민 컨주게이트의 제1 구성 - GLP-1 유사체]

본 출원은 비천연 아미노산을 포함하는 GLP-1 유사체를 제공한다. 이 때, 상기 비천연 아미노산은 알부민이 GLP-1 유사체에 연결되는 부분이다. 즉, 비천연 아미노산을 매개로 GLP-1과 알부민이 연결된 펩타이드-알부민 컨주게이트가 형성될 수 있다.

GLP-1 유사체는 비천연 아미노산(Non-natural amino acid)을 포함한다.

본 출원에서 비천연 아미노산이란 20개의 아미노산 외의 아미노산을 지칭한다. 구체적으로, 글라이신(glycine, G), 알라닌(alanine, A), 세린(serine, S), 트레오닌(Threonine, T), 시스테인(Cysteine, C), 발린(Valine, V), 류신(Leucine, L), 이소류신(Isoleucine, I), 메티오신(Methionine, M), 프롤린(Proline, P), 페닐알라닌(Phenylalanine, F), 타이로신(Tyrosine, Y), 트립토판(Tryptophan, W), 아스파르트산(Aspartic acid, D), 글루탐산(Glutamic acid, E), 아스파라긴(Asparagine, N), 글루타민(Glutamine, Q), 히스티딘(Histidine, H), 라이신(Lysine, K), 및 아르기닌(Arginine, R) 외의 아미노산을 지칭한다.

비천연 아미노산은 인공적으로 합성되거나 자연적으로 발생한 것일 수 있다.

본 출원의 명세서에서 현출되거나 기재되는 아미노산 서열 내 Z는 비천연 아미노산을 의미한다.

펩타이드-알부민 컨주게이트 내 비천연 아미노산의 구조

펩타이드-알부민 컨주게이트 내 비천연 아미노산은 하기의 구조 (I)를 의미할 수 있다.

[구조 (I)]

일 예로, 펩타이드-알부민 컨주게이트 내 비천연 아미노산은 GLP-1 유사체 내의 아미노산 AA1 및 AA2 사이에 위치할 수 있다. 이 때, AA1 또는 AA2는 상기 20개의 아미노산 중 선택된 어느 하나일 수 있다. 이 때, AA1 또는 AA2는 비천연 아미노산일 수 있다.

일 예로, 펩타이드-알부민 컨주게이트 내 비천연 아미노산은 연결 모이어티와 직접적, 간접적, 공유적 또는 비공유적으로 연결될 수 있다.

일 예로, 비천연 아미노산은 GLP-1 유사체의 N-말단 또는 C-말단에 위치할 수 있다. 일 구체예로, AA1은 수소(-H)일 수 있다. 일 구체예로, AA2는 하이드록실기(-OH)일 수 있다.

상기 구조(I)의 D는 결합(a bond), 알킬렌(alkylene), 치환된 알킬렌(substituted alkylene), 헤테로알킬렌(heteroalkylene), 치환된 헤테로알킬렌(substituted heteroalkylene), 아릴렌(arylene), 치환된 아릴렌(substituted arylene), 헤테로아릴렌(heteroarlyene), 치환된 헤테로아릴렌(substituted heteroarylene), 알카릴렌(alkarylene), 치환된 알카릴렌(substituted alkarylene), 헤테로알카릴렌(heteroalkarylene), 치환된 헤테로알카릴렌(substituted heteroalkarylene), 아랄킬렌(aralkylene), 치환된 아랄킬렌(substituted aralkylene), 헤테로아랄킬렌(heteroaralkylene), 및 치환된 헤테로아랄킬렌(substituted heteroaralkylene) 중 어느 하나일 수 있다.

상기 구조 (I)의 B는 다음의 구조 중 어느 하나 일 수 있다.

,

,

,

,

,

및

중 어느 하나이다.

이 때, 상기 A1 또는 A2는 각각 연결 모이어티 L 또는 구조(I)의 D와 연결될 수 있다.

일 구현예로, 펩타이드-알부민 컨주게이트는 하기의 구성을 포함할 수 있다.

GLP-1 유사체는 비천연 아미노산(Non-natural amino acid)을 포함하는 특정 아미노산 서열로 이루어져 있다.

일 예로, GLP-1 유사체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.

이 때, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은

His-X2-X3-X4-X5-Phe-Thr-Ser-X9-X10-X11-X12-X13-Leu-X15-X16-Gln-Ala-Ala-X20-X21-X22-ile-X24-X25-Leu-X27-X28-Gly-Arg-X31(서열번호 1)

이다.

이 때, 상기 X2는 Ser, D-Ser, Gly, Ala, D-Ala 로부터 선택되고, 상기 X3은 Gln, Glu, His 및 Pro로부터 선택되고, 상기 X4는 L-Ala, D-Ala 및 Gly 로부터 선택되고, 상기 X5는 TyR 및 Thr 로부터 선택되고, 상기 X9는 Asp 및 Ser로부터 선택되고, 상기 X10은 Val, Tyr, Leu 및 비천연 아미노산(Z)으로부터 선택되고, 상기 X11은 Ser 및 Arg로부터 선택되고, 상기 X12는 Lys 및 Ser로부터 선택되고, 상기 X13은 Tyr 및 비천연 아미노산(Z)으로부터 선택되고, 상기 X15는 Glu 및 Asp로부터 선택되고, 상기 X16은 Glu 및 Gly로부터 선택되고, 상기 X20은 Lys 및 Cys로부터 선택되고, 상기 X21은 Glu, Asp 및 Gly 로부터 선택되고, 상기 X22는 Phe 및 비천연 아미노산(Z)으로부터 선택되고, 상기 X24는 Ala, Glu, Lys 및 Cys 로부터 선택되고, 상기 X25는 Trp 및 Asp 로부터 선택되고, 상기 X27은 Val 및 Arg 로부터 선택되고, 상기 X28은 Arg 및 Lys 로부터 선택되고, 상기 X31은 Gly이거나 부재한 것일 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.

일 예로, 상기 서열번호 1 내 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 및 31번째 위치의 아미노산 중 선택된 어느 하나 이상의 아미노산은 비천연 아미노산일 수 있다.

일 예로, 상기 서열번호 1 내 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 및 31번째 위치의 아미노산 중 선택된 둘 이상의 아미노산은 비천연 아미노산일 수 있다.

일 예로, 상기 서열번호 1 내 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 및 31번째 위치의 아미노산 중 선택된 셋 이상의 아미노산은 비천연 아미노산일 수 있다.

일 예로, GLP-1 유사체는 한 개의 비천연 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일 구체예로, 상기 아미노산 서열은

(i) N말단-HAEGTFTSDZSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG-C말단 (서열번호 2),

(ii) N말단-HAEGTFTSDVSSZLEGQAAKEFIAWLVRGRG-C말단 (서열번호 3),

(iii) N말단-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEZIAWLVRGRG-C말단 (서열번호 4),

(iv) N말단-HGEGTFTSDZSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG-C말단 (서열번호 5),

(v) N말단-HGEGTFTSDVSSZLEGQAAKEFIAWLVRGRG-C말단 (서열번호 6), 및

(vi) N말단-HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEZIAWLVRGRG-C말단 (서열번호 7) 중 어느 하나일 수 있다.

이 때, 상기 (i) 내지 (vi)의 Z는 비천연 아미노산이다.

일 예로, GLP-1 유사체는 서열번호 2 내지 7 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일 예로, GLP-1 유사체는 두 개의 비천연 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일 구체예로, 상기 아미노산 서열은

(i) N말단-HAEGTFTSDZSSZLEGQAAKEFIAWLVRGRG-C말단 (서열번호 8),

(ii) N말단-HAEGTFTSDZSSYLEGQAAKEZIAWLVRGRG-C말단 (서열번호 9),

(iii) N말단-HAEGTFTSDVSSZLEGQAAKEZIAWLVRGRG-C말단 (서열번호 10),

(iv) N말단-HGEGTFTSDZSSZLEGQAAKEFIAWLVRGRG-C말단 (서열번호 11),

(v) N말단-HGEGTFTSDZSSYLEGQAAKEZIAWLVRGRG-C말단 (서열번호 12), 및

(vi) N말단-HGEGTFTSDVSSZLEGQAAKEZIAWLVRGRG-C말단 (서열번호 13) 중 어느 하나일 수 있다.

일 예로, GLP-1 유사체는 서열번호 8 내지 13 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일 예로, GLP-1 유사체는 세 개의 비천연 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일 구체예로, 상기 아미노산 서열은

(i) N말단-HAEGTFTSDZSSZLEGQAAKEZIAWLVRGRG-C말단 (서열번호 14), 또는

(ii) N말단-HGEGTFTSDZSSZLEGQAAKEZIAWLVRGRG-C말단 (서열번호 15) 일 수 있다.

일 예로, GLP-1 유사체는 서열번호 14 또는 15로 표시되는 아미노산 서열과 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

[펩타이드-알부민 컨주게이트의 제2 구성 - 알부민 또는 이의 변이체]

본 출원의 명세서에서 알부민은 자연 그대로의 알부민, 재조합(recombinant) 알부민, 또는 이의 변이체를 의미한다. 일 예로, 상기 알부민은 인간의 혈청 알부민(Human Serum Albumin, HSA) 또는 소의 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin)일 수 있다.

페길레이션(PEGylation) 단점

펩타이드 또는 단백질 치료제, 약물 등의 반감기를 연장하기 위하여 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 중합체를 공유 또는 비공유 결합으로 연결할 수 있다. 다만, PEG는 높은 면역원성을 갖는 점, 체내 분해성이 낮아 축적될 수 있다는 점, 페길레이션 된 물질의 활성이 떨어지는 점 등의 문제점을 가지고 있다.

위치 특이적 알부미네이션의 장점

알부민은 혈액 내에서 약 2~3주에 달하는 반감기를 가진다. 알부민은 FcRn 매개 순환작용(FcRn-mediated recycling mechanism)에 의하여 세포 내 분해를 회피하기 때문이다. 따라서, 이러한 알부민의 특성에 의하여 펩타이드, 단백질 등에 부착하여 반감기를 연장시킬 수 있다.

50kDa 이하의 분자량을 가지는 펩타이드는 신장에서 쉽게 여과될 가능성이 있는데, 알부민의 분자량은 약 67kDa이므로 펩타이드에 알부민을 연결함으로써 이를 해결할 수 있다. 더 나아가, 알부민은 낮은 면역 원성(immunogenicity), 우수한 생체 적합성(biocompatibility) 및 체내 우수한 분해성(degradability)을 가진다는 특성이 있으므로 PEG 대신 펩타이드에 컨주게이션할 때 유용하다.

본 출원에서 제공되는 알부민은 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 이와 약80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일 예로, 본 출원에서 제공되는 알부민의 아미노산 서열은

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(서열번호 16) 일 수 있다.

본 출원은 알부민이 포함하는 상기 서열번호 16 또는 이와 약 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열 내 Cys 또는 Lys을 통하여 연결모이어티에 연결된 것을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공할 수 있다.

일 구체예로, 본 출원은 서열번호 16 내 34번 위치의 시스테인을 통하여 연결모이어티와 알부민이 서로 연결된 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공할 수 있다.

[펩타이드-알부민 컨주게이트의 제3 구성 - 연결 모이어티(linking moiety)]

본 출원의 명세서에서 연결 모이어티란 펩타이드-알부민 컨주게이트에서는 펩타이드와 알부민의 사이에 위치한 부분(part)을 의미한다. 연결모이어티는 GLP-1 유사체 및 알부민에 각각 연결되어 있다.

일 예로, 연결모이어티는 GLP-1 유사체 내 비천연 아미노산과 연결될 수 있다. 이 때, 연결모이어티와 비천연 아미노산은 클릭-화학 반응 결과 연결된 것일 수 있다.

일 예로, 연결 모이어티는 GLP-1 유사체의 비천연 아미노산에 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다. 일 구체예로, 서열번호 1 내지 16 또는 이와 약 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열 내 비천연 아미노산에 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다.

일 예로, 연결 모이어티는 알부민과 연결될 수 있다. 일 예로, 연결모이어티와 알부민은 알부민 내 Cys 또는 Lys을 통하여 연결될 수 있다. 일 예로, 연결모이어티와 알부민은 알부민 내 티올(Thiol)기 또는 아민기(-NH2)를 통하여 연결될 수 있다.

일 구체예로, 연결모이어티와 알부민은 티올 케미스트리(티올 화학, Thiol chemistry)를 통하여 서로 연결될 수 있다.

이 때, 연결모이어티와 알부민은 상기 복합 구조(Complex structure)를 통하여 연결될 수 있다.

알부민의 FcRn 결합 도메인에서 이격된 아미노산 잔기에 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다. 일 예로, 알부민의 시스테인(Cys 또는 라이신(Lys) 잔기에 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다. 일 구체예로, 서열번호 16 내 34번 위치의 시스테인과 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다. 일 구체예로, 본 출원의 연결모이어티와 본 출원의 알부민은 알부민 내 34번 위치의 아미노산이 포함하는 자유 티올기(free thiol group)가 상기의 Thiol chemistry 반응한 결과 연결된 것일 수 있다.

일 예로, 연결모이어티는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol, PEG)를 포함할 수 있다.

일 예로, 연결모이어티는 하기의 단위체를 포함할 수 있다.

이 때, 상기 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 이상의 정수일 수 있다.

일 예로, 연결 모이어티는 (C₂H₄O)_n 을 포함할 수 있다.

[펩타이드-알부민 컨주게이트의 구체 예]

본 출원은 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제공한다.

일 예로, 화학식 (I)을 포함하는 펩타이드-알부민 컨주게이트:

[화학식 (I)]

상기 P1은 GLP-1 유사체(GLP-1 analogue), 상기 B는 결합구조, L은 연결 모이어티(linking moiety) 및 상기 P2는 알부민 또는 이의 변이체이고, 이 때, 상기 GLP-1 유사체는 (i) 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나, 또는 이와 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열, 및 (ii) 상기 (i)의 아미노산 서열의 10번째, 13번째 또는 22번째 위치의 아미노산에 구조 (I)의 비천연 아미노산(non-natural amino acid)를 포함하고,

[구조 (I)]

이 때, 상기 D는 2가 링커(Bivalent linker), 상기 AA1과 상기 AA2는 상기 비천연 아미노산과 결합되어 있는 아미노산이고, 이 때, 상기 B는 클릭-화학(click-chemistry)에 의해 형성된 결합구조이고, 이 때, 상기 연결 모이어티는 상기 B를 통하여 상기 GLP-1 유사체와 연결됨을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트일 수 있다.

일 예로, i) 서열번호 1 내지 서열번호 7 중 어느 하나, 또는 이와 80% 이상의 상동성을 가지는아미노산 서열을 포함하는 GLP-1 유사체, 및 ii) 알부민 또는 이의 변이체가 연결 모이어티(linking moiety)를 통하여 위치특이적으로 연결된 GLP-1-알부민 컨주게이트일 수 있다.

이 때, 상기 GLP-1 유사체는 비천연 아미노산(Non-natural amino acid)를 포함하고, 상기 연결 모이어티는 GLP-1 유사체의 비천연 아미노산과 연결된 것을 특징으로 한다. 즉 GLP-1 유사체가 포함하는 비천연 아미노산에 특이적으로 알부민이 결합 또는 연결되는 것을 특징으로 한다.

일 예로, 상기 서열번호 1로 표시되는 GLP-1 유사체의 아미노산 서열 중 X10, X13 또는 X22 중 어느 하나는 비천연 아미노산(non-natural amino acid)일 수 있다.

일 구체예로, 본 출원의 펩타이드-알부민 컨주게이트는 서열번호 1로 표시되는 GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)-NH₂ 또는 GLP-1(7-36) amide의 아미노산 서열의 X10은 비천연 아미노산이고, 상기 비천연 아미노산에 알부민이 위치 특이적으로 연결된 것일 수 있다. 일 구현예로, 본 출원의 펩타이드-알부민 컨주게이트는 서열번호 2 또는 서열번호 5를 포함하는 펩타이드-알부민 컨주게이트일 수 있다.

일 구체예로, 본 출원의 펩타이드-알부민 컨주게이트는 서열번호 1로 표시되는 GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)-NH₂ 또는 GLP-1(7-36) amide의 아미노산 서열의 X13은 비천연 아미노산이고, 상기 비천연 아미노산에 알부민이 위치 특이적으로 연결된 것일 수 있다. 일 구현예로, 본 출원의 펩타이드-알부민 컨주게이트는 서열번호 3 또는 서열번호 6을 포함하는 펩타이드-알부민 컨주게이트일 수 있다.

일 구체예로, 본 출원의 펩타이드-알부민 컨주게이트는 서열번호 1로 표시되는 GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)-NH₂ 또는 GLP-1(7-36) amide의 아미노산 서열의 X22는 비천연 아미노산이고, 상기 비천연 아미노산에 알부민이 위치 특이적으로 연결된 것일 수 있다. 일 구현예로, 본 출원의 펩타이드-알부민 컨주게이트는 서열번호 4 또는 서열번호 7을 포함하는 펩타이드-알부민 컨주게이트일 수 있다.

일 예로, 상기 GLP-1 유사체는

(i) His-Ala-Glu-Gly-Tyr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly (서열번호 2),

(ii)His-Gly-Glu-Gly-Tyr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly (서열번호 3),

(iii)His-Ala-Glu-Gly-Tyr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-X13-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly (서열번호 4),

(iv)His-Gly-Glu-Gly-Tyr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-X13-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly (서열번호 5),

(v)His-Ala-Glu-Gly-Tyr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-X22-ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly (서열번호 6), 및

(vi)His-Gly-Glu-Gly-Tyr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-X22-ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly (서열번호 7) 중 어느 하나를 포함하는 GLP-1 유사체일 수 있다.

일 구체예로, 상기 D는 결합(a bond), 알킬렌(alkylene), 치환된 알킬렌(substituted alkylene), 헤테로알킬렌(heteroalkylene), 치환된 헤테로알킬렌(substituted heteroalkylene), 아릴렌(arylene), 치환된 아릴렌(substituted arylene), 헤테로아릴렌(heteroarlyene), 치환된 헤테로아릴렌(substituted heteroarylene), 알카릴렌(alkarylene), 치환된 알카릴렌(substituted alkarylene), 헤테로알카릴렌(heteroalkarylene), 치환된 헤테로알카릴렌(substituted heteroalkarylene), 아랄킬렌(aralkylene), 치환된 아랄킬렌(substituted aralkylene), 헤테로아랄킬렌(heteroaralkylene), 및 치환된 헤테로아랄킬렌(substituted heteroaralkylene) 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트일 수 있다.

일 구체예로, 상기 B는

,

,

,

,

,

및

중 선택된 어느 하나이고,

이 때, 상기 A1 또는 상기 A2는 각각 상기 L 또는 상기 D에 연결됨을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트일 수 있다.

일 구체예로, 상기 연결 모이어티 및 상기 알부민 또는 이의 변이체는 알부민의 시스테인 잔기를 통해 연결된 것을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트일 수 있다.

일 구체예로, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1이고, 이 때, 상기 X2는 글라이신, 세린 및 D-알라닌 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트일 수 있다.

일 구체예로, 상기 아미노산 서열 내 X2는 Gly 또는 Ala이고, 상기 X10, 상기 X13 및 상기 X22 중 어느 하나는 비천연 아미노산인 것을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트일 수 있다.

일 구체예로, 상기연결 모이어티는 (C2H4O)n를 포함하고, 이 때, 상기 n은 1 이상의 정수인 것을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트일 수 있다.

일 구체예로, 상기 P2는 인간의 혈청 알부민(Human Serum Albumin, HSA)인 것을 특징으로 하는펩타이드-알부민 컨주게이트일 수 있다.

일 구현 예로, 본 출원의 펩타이드-알부민 컨주게이트는 다음의 구조 중 어느 하나를 포함할 수 있다.

(a)

, (b)

,

(c)

, (d)

,

(e)

, (f)

,

(g)

, (h)

,

(i)

, (j)

,

(k)

, (l)

,

(o)

, 및 (p)

본 명세서에 의해 개시되는 발명의 일 태양은 펩타이드-알부민 컨주게이트를 포함하는 약학적 조성물이다.

일 구현예에서, 본 출원은 펩타이드-알부민 컨주게이트, 및 약학적으로 허용되는 담체(pharmaceutically acceptable carrier), 또는 부형제(excipient) 중 어느 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

상기 펩타이드-알부민 컨주게이트는 전술하였다.

상기 약학적으로 허용되는 담체는 당업계에 공지되어 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 덱스트로즈(dextrose) 용액, 말토덱스트린(maltodextrin) 용액, 글리세롤(glycerol), 에탄올(ethanol), 리포좀(liposome) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

상기 약학적으로 허용되는 부형제를 갖는 약학적 활성 성분의 제형은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (e.g. 19th edition (1995), and any later editions). 참조할 수 있다.

본 출원에서 제공되는 약학적 조성물은 안정화된 제형(stabilised formuulation)일 수 있다. 상기 안정화된 제형이란 물지적 및/또는 화학적 안정성, 바람직하게는 둘 다를 가지는 제형을 지칭한다. 일반적으로 제제는 유효기간에 도달할 때까지 사용 또는 보관시 안정적이어야 한다.

본 출원에서 제공되는 약학적 조성물은 하나 이상의 추가적인 약리학적 활성 물질(pharmacologically active substance)을 더 포함할 수 있다. 일 예로, GLP-1 수용체 작용제(GLP-1 receptor agonist)를 더 포함할 수 있다.

본 출원에서 제공되는 약학적 조성물은 하나 이상의 저혈당제(hypoglycaemic agent)를 더 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 저혈당제는 GLP-1 작용제(a GLP-1 agonist), 인크레틴 호르몬(incretin hormone), 인크레틴 미메틱(incretin mimetic), 인슐린의 분비를 향상시키는 작용 물질(agent to increase insulin secretion), 설포닐유레아(sulfonylurea), 메글리티나이드(meglitinide), 아세토헥사마이드(acetohexamide), 클로르프로파마미드(chlorpropamide), 톨라자마이드(tolazamide), 글리피짓(glipizide), 글리클라지드(gliclazide), 글리벤클라미드(glibenclamide (glyburide)), 글리퀴돈(gliquidone), 글리메피리드(glimepiride, GLP-1 분해를 저해하는 작용물질(agent to inhibit GLP-1 break down), DPP-IV 억제제(DPP-IV inhibitor), 글루코스의 사용을 향상시키는 작용 물질(agent to increase glucose utilization), 글리타존(glitazones), 치아졸리딘디온(thiazolidinediones), 로시글리타존(rosiglitazone), 피오글리타존(pioglitazone), pPAR 아고니스트(pPAR agonists), 간장 글루코오스의 생산을 줄이는 작용물질(agent to reduce hepatic glucose production), 메트포르민(metformin), 그루코스의 흡수를 지연시키는 작용물질(agent to delay glucose absorption), 알파 글루코시데이즈 억제제(α-glucosidase inhibitor), 인슐린 글라진(insulin glargine) 및/또는 인슐린(insulin)일 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 GLP-1 유사체를 포함하는 혈당강하 용도, 당뇨병 치료 용도, 비만 치료 또는 예방 용도 약학적 조성물은 상기의 치료를 필요로 하는 환자에게 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 바람직하게는 비경구로 투여될 수 있다.

상기 비경구투여는 주사(injection)에 의한 투여일 수 있다. 일 예로, 피하 주사, 근육내 또는 정맥내 주사로 투여될 수 있다. 다른 예로, 비경구투여는 주입펌프에 의한 투여일 수 있다. 다른 예로, 분말 또는 액체인 조성물을 흡입(inhalation)하여 코 또는 폐를 통한 투여일 수 있다. 다른 예로, 경피투여 또는 구강 경점막을 통한 투여일 수 있다.

본 출원의 약학적 조성물은 인간에서 HbA1c 및 혈액 내 포도당 농도를 감소시킬 수 있다. 본 출원의 약학적 조성물은 고혈당증(hyperglycemia diabetes), 2형 당뇨병(type II diebetes)을 포함하는 글루코스(glucose) 레벨의 상승과 관련된 질병의 치료용도로 사용될 수 있다. 본 출원의 약학적 조성물은 투여된 대상의 체중 감소를 유도 또는 유발할 수 있다. 일 예로, 본 출원에서 제공되는 약학적 조성물은 인간의 혈당강하 용도, 당뇨병 치료 용도, 비만 치료 또는 예방 용도로 사용될 수 있다.

본 명세서에 의해 개시되는 발명의 일 태양은 GLP-1 유사체이다.

본 출원은 GLP-1 유사체를 제공한다.

상기 GLP-1이 알부민에 연결 모이어티를 통하여 연결되어 있는 경우와는 달리, GLP-1 유사체 그 자체로 존재하는 경우, 상기 GLP-1 유사체는 클릭화학 작용기를 포함하는 기술적 특징이 존재한다.

GLP-1의 일 구성요소인 아미노산 서열에 대해서는 전술하였다.

[GLP-1 유사체의 구성적 특징 - 클릭화학 작용기를 포함하는 비천연 아미노산]

[구조 (II)]

본 출원의 GLP-1 유사체 내의 비천연 아미노산은 클릭화학 작용기(또는 클릭화학 핸들)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이 때, 클릭화학 작용기는 비천연 아미노산의 R 그룹에 포함될 수 있다.

구조 (II)의 상기 D는 2가 링커(Bivalent linker), 상기 AA1과 상기 AA2는 비천연 아미노산과 결합되어 있는 아미노산이고, 이 때, 상기 H'은 클릭화학 작용기(click-chemistry functional group)를 포함함을 특징으로 하는 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드를 제공한다.

일 예로, GLP-1 유사체는 비천연 아미노산 내 클릭화학 작용기와 특이적으로 반응할 수 있는 클릭화학 작용기를 포함하는 물질, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 결합 또는 연결될 수 있다.

일 구체예로, 클릭화학 작용기를 포함하는 링커와 특이적으로 결합될 수 있다.

본 출원의 GLP-1 유사체는 하기의 반응에 참여할 수 있는 작용기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함한다.

이때, 상기 H'은 클릭화학 작용기이다. 상기 클릭화학 작용기는 말단 알킨, 아자이드, 스트레인된 알킨, 다이엔, 친다이엔체, 알켄, 티올, 노르보넨, 디벤조시클로옥신-아민 및 테트라진 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드를 제공한다.

일 구체예로, 비천연 아미노산의 R그룹은 클릭화학(click chemistry)에 관여하는 작용기(functional group)을 포함한다. 이 때, 상기 비천연 아미노산의 R그룹 내 포함된 클릭화학 작용기는 O-propargly-L-tyrosine(oPa), L-Homopropargylglycine(HPG), 4-Ethynyl-L-phenylalanine hydrochloride(pEthF), p-Azido-L-phenylalanine(AzF), p-ethynyl-phenylalanine(pEPA), O-propargly-L-tyrosine(oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine(pPa) 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.

클릭화학(Click-Chemistry)

용어 "클릭화학반응 (click-chemistry)"은 Scripps Research Institute의 K. Barry Sharpless에 의하여, 두 개의 분자가 빠르고 안정적으로 공유 결합을 형성하도록 설계된 상보적인 화학작용기 및 화학 반응을 설명하기 위해 도입된 화학적 개념이다. 클릭화학반응은 특정한 반응을 의미하는 것이 아니라, 이러한 빠르고 안정적인 반응의 개념을 의미한다. 어떤 실시예에서, 클릭화학반응은 모듈화되고, 범위가 넓고, 높은 수율을 갖고, 부산물이 중대하지 않고, 입체특이적이고, 생리학적으로 안정하고, 열역학적으로 큰 원동력을 갖고 (예컨데, >84 kJ/mol), 또한/또는 높은 원자 경제성을 가져야 한다. 몇 가지 반응들이 상기 조건들을 만족하는 것으로 알려져있다.

본 출원에서 사용된 용어 "클릭화학작용기 (click-chemistry functional group)"는 클릭화학반응에 관여하는 작용기를 의미한다. 예를 들어, 스트레인된 알킨, 예컨데 시클로옥틴은 클릭화학작용기에 해당한다. 일반적으로 클릭화학반응은 서로 상보적인 클릭화학작용기를 각각 포함하는 적어도 두 개의 분자를 필요로 한다. 이렇게 서로 반응성을 갖는 클릭화학작용기의 쌍은 종종 본 출원 내에서 "파트너 클릭화학작용기 (partner click-chemistry functional group)"로 언급된다. 예를 들어, 아자이드와 시클로옥틴의 스트레인-유도 고리화첨가 반응 (strain-promoted cycloaddition)에 있어 아자이드는 시클로옥틴 및 기타 다른 알킨들의 파트너 클릭화학작용기이다. 본 출원에서 사용되는 예시적인 클릭화학작용기는 말단 알킨 (terminal alkyne), 아자이드 (azide), 스트레인된 알킨 (strained alkyne), 다이엔 (diene), 친다이엔체 (dienophile), 트랜스 시클로옥틴 (trans-cyclooctene), 알켄 (alkene), 티올 (thiol), 및 테트라진 (tetrazine)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 그밖의 클릭화학작용기는 당업자에게 알려져있다.

제1 예시: 휴이스겐 1,3-이극성 고리화첨가

휴이스겐 1,3-이극성 고리화첨가 (Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition) (예시적으로, Cu(I)-촉매 고리화첨가 반응을 포함하며, 종종 "클릭 반응 (click reaction)"으로 일반화되어 지칭됨; Tornoe et al., Journal of Organic Chemistry (2002) 67: 3057-3064 등 참조): 구리 또는 루테늄이 일반적으로 촉매로 사용된다;

[휴이스겐 1,3-이극성 고리화첨가의 모식도]

제2 예시: 디엘스-알더 반응 (Diels-Alder reaction)

디엘스-알더 반응 (Diels-Alder reaction), 예를 들어 정상 전자-요구 디엘스-알더 반응 (normal electron-demand Diels-Alder reaction) 및 역 전자-요구 디엘스-알더 반응 (inverse electron-demand Diels-Alder reaction)을 포함하나 이에 한정되지 않는 고리화첨가 반응 (예시적으로, 스트레인 유도 고리화첨가 (strain-promoted cycloaddition; SPAAC));

[디엘스-알더 반응 모식도]

[디엘스-알더 반응의 예시; TCO와 테트라진]

제3 예시: 스트레인된 고리 (strained ring)에 대한 친핵성 첨가 반응

[스트레인 유도 고리화첨가반응의 모식도]

[스트레인 유도 고리화첨가반응의 예시; 아자이드와 DBCO]

제4 예시: 활성화된 카르보닐기 (activated carbonyl group)에 대한 친핵성 첨가 반응

제5 예시: 탄소-탄소 이중결합 또는 삼중결합에 대한 첨가 반응.

[티올과 알켄의 첨가반응]

상기에서 살펴본 바와 같이 비천연 아미노산의 종류에 따라서 클릭화학 반응의 종류가 달라질 수 있다. 또한, 비천연 아미노산의 종류에 따라서 특이적으로 반응할 수 있는 작용기가 달라질 수 있다.

일 예로, 비천연 아미노산을 포함하는 GLP-1 유사체와 클릭화학 작용기를 포함하는 링커를 특이적으로 연결하는 경우에 각각 포함하는 작용기는 서로 페어(pair)를 이루어야만 클릭화학 반응이 발생할 수 있다.

일 구체예로, 비천연 아미노산으로서 p-Azido-L-phenylalanine을 사용하고 strain-promoted alkyne-azide cycloaddition(SPAAC)을 통해 링커를 연결하는 경우, cycloalkyne이 포함되어 있는 링커와 특이적으로 반응할 수 있다.

일 구체예로, 비천연 아미노산으로서 p-ethynyl-phenylalanine이나 p-propargyloxyphenylalanine을 사용하고 coppercatalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) 반응을 통해 링커를 연결하는 경우, azide그룹을 가지고 있는 링커와 특이적으로 반응할 수 있다.

일 구체예로, 비천연 아미노산으로서 p-Azido-Lphenylalanine을 사용하고 strain-promoted alkyne-azide cycloaddition(SPAAC) 반응을 통해 연결하는 경우, cyclooctyne이 포함되어 있는 DBCO-PEG4-MAL를 링커와 특이적으로 반응할 수 있다.

다만, 이에 제한되지 않고, GLP-1 유사체는 클릭-화학 반응할 수 있는 모든 클릭화학 작용기를 포함할 수 있다.

[GLP-1 유사체의 선택적 구성 - 융합 단백질 파트너(fusion protein partner)]

GLP-1 유사체는 인공적으로 in vitro 상에서 인위적으로 제조되어 제공될 수 있고, 자연 그대로의 GLP-1을 인위적으로 변형 또는 조작하여 제공될 수 있다.

GLP-1 유사체는 숙주세포(host cell) 내에서 발현되어 제공될 수 있다.

이 때, 상기 펩티드는 작은 분자량으로 이루어져 있으므로, 숙주 세포 내에서 제대로 발현되지 않거나, 발현 정도가 낮을 수 있기 때문에, 융합 단백질 파트너(fusion protein partner)와 융합된 형태로 발현시킬 수 있다. 상기 융합 단백질 파트너는 일정량의 분자량을 가지는 단백질로서, 본 출원의 펩티드와 융합시켜 발현시키는데 어려움이 없는 단백질이라면 크게 제한이 없다.

일 예로, 상기 융합 단백질 파트너는 말토오스-결합 단백질(Maltose-binding protein) 또는 글루타티온 S- 트랜스퍼레이즈(glutathione S-transferase)일 수 있다.

일 예로, 상기 융합 단백질 파트너는 형광 단백질(fluorescent protein)일 수 있다. 일 구체예로, 녹색 형광 단백질(GFP), sfGFP(superfolder green fluorescent protein), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 또는 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질일 수 있다.

일 예로, 상기 융합 단백질 파트너는 유비퀴틴(Ubiquitin) 또는 SUMO(small ubiquitin-related modifier) 단백질일 수 있다. 다만, 이에 한정되지 않는다.

GLP-1 유사체와 융합 단백질 파트너는 아미노산 연결 모이어티를 통하여 서로 연결되어 융합체를 형성할 수 있다.

일 구체예로, 상기 아미노산 연결모이어티는 아미노산 서열 GGKKKKKGG 을 포함할 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.

본 출원은 [융합 단백질 파트너]-[아미노산 연결모이어티]-[GLP-1 유사체] 의 구조를 가지는 펩타이드를 제공할 수 있다.

본 출원의 GLP-1 유사체는 [융합 단백질 파트너]-[아미노산 연결모이어티]-[GLP-1 유사체] 구조를 가지는 펩타이드에 효소를 처리하여 제공될 수 있다. 일 예로, 상기 처리되는 효소는 단백질분해효소(Protease)일 수 있다.

일 예로, 연결 모이어티가 아미노산 서열 IEGR을 포함하는 경우, Factor Xa 효소를 처리하여 GLP-1 유사체를 제공할 수 있다.

일 예로, 융합 단백질 파트너가 Ubiquitin인 경우, USP-1 효소를 처리하여 GLP-1 유사체를 제공할 수 있다

일 예로, 융합 단백질 파트너가 SUMO인 경우, SUMO protease를 처리하여 GLP-1 유사체를 제공할 수 있다.

세포 내에서 GLP-1 유사체와 융합 단백질 파트너가 서로 연결되어 발현됨으로써, 즉, 일정 크기이상의 융합체를 형성함으로써

GLP-1 유사체 단독으로 발현될 때와 비교하면 더 높은 발현률을 가지게 되고, 또한, GLP-1 유사체 단독과 반응시킬 때와 비교하면 본 출원의 클릭화학 작용기를 포함하는 링커와도 더 높은 효율로 클릭화학 반응을 하는 기술적 특징이 있다..

[GLP-1 유사체의 태양]

본 출원은 인슐린 분비 활성(insulinotropic activity)을 갖는 펩타이드를 제공한다.

일 예로, 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드로서, (i) 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나, 또는 이와 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열, 및 (ii) 상기 (i)의 아미노산 서열의 10번째, 13번째 또는 22번째 위치에 구조 (II)의 비천연 아미노산(non-natural amino acid)를 포함하고, - 이 때, 상기 D는 2가 링커(Bivalent linker), 상기 AA1과 상기 AA2는 비천연 아미노산과 결합되어 있는 아미노산이고, 이 때, 상기 H'은 클릭화학 작용기(click-chemistry functional group)를 포함함을 특징으로 하는 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드를 제공할 수 있다.

[구조 (II)]

일 예로, 상기 클릭화학 작용기는 말단 알킨, 아자이드, 스트레인된 알킨, 다이엔, 친다이엔체, 알켄, 티올, 노르보넨, 디벤조시클로옥신-아민 및 테트라진 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드를 제공할 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.

일 예로, 상기 클릭화학 작용기는 O-propargly-L-tyrosine(oPa), L-Homopropargylglycine(HPG), 4-Ethynyl-L-phenylalanine hydrochloride(pEthF), p-Azido-L-phenylalanine(AzF), p-ethynyl-phenylalanine(pEPA), O-propargly-L-tyrosine(oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine(pPa) 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드를 제공할 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.

[GLP-1 유사체 제조방법]

본 출원은 비천연 아미노산을 포함하는 GLP-1 유사체의 제조방법을 제공한다. 본 출원에서 제공되는 GLP-1 유사체에 대한 내용은 전술하였다.

본 출원의 비천연 아미노산을 포함하는 GLP-1 유사체는 Suppressor 방법을 통하여 제공될 수 있다. Suppressor 방법 자체는 종결코돈을 이용한 비천연 아미노산 치환법을 의미하며 In vitro 또는 in vivo상에서 수행될 수 있다(보다 구체적으로는 특허 공개공보 US 2003/0108885, US 2003/0082575, US 2004/0265952, US 2005/0208536 및 US 2006/0234367 등 관련 특허 참조).

tRNA는 아미노산과 결합한 뒤 리보솜에서 번역되고 있는 mRNA의 코돈에 결합해 단백질을 합성하며, 이 때 tRNA에 올바른 아미노산을 결합시켜 주는 것이 아미노아실-tRNA 결합 효소(Aminoacyl-tRNA synthase)이다. 각 코돈에는 한 가지의 tRNA가 대응되고, 각 tRNA는 각각의 아미노산에 대응되는 효소 짝에 의해 한 종류만의 아미노산과 결합한다.

생체 내에서, mRNA의 64가지 코돈 중 UAA, UAG. UGA의 세 가지 종결 코돈에 대응하는 tRNA가 없으며, 대신 방출인자(Release Factor)가 결합해 번역 과정을 종결시킨다. 따라서, 한 종결코돈에 결합하는 방출인자를 없애고 해당 종결코돈에 대응하는 tRNA/synthase pair을 만들어 넣어주면 해당 종결코돈에서 번역이 끊기는 것이 아니라 원하는 아미노산이 합성되도록 할 수 있다. 이 때 종결 코돈에 결합하는 tRNA를 종결 코돈을 억제(suppress)한다는 의미로 suppressor tRNA라고 부른다. 보다 구체적으로 UAG, UAA, 그리고 UGA의 종결 코돈을 해독할 수 있도록 한 tRNA의 안티코돈 뮤턴트를 각각 amber, ochre, opal suppressor tRNA라 한다.

이런 특이성을 이용하여 비천연 아미노산(non-natural amino acids, NNAAs)을 타겟 단백질에 위치 특이적으로, 어떠한 위치에든지 포함시키는 것이 가능해졌으며, 이는 E. coli, yeast 또는 CHO 세포주 등 다양한 발현 균주에서 모두 가능하다.

일 실시예로, tRNA synthetase GLP1_HSA 제조공정을 제공할 수 있다.

보다 구체적으로 도20에 제조공정을 간략히 도시하고 있다. 도20의 도식은 하나의 예시에 불과하다.

일 구현예로, GLP-1 생산을 위한 발현벡터의 제작은 GLP-1의 C 말단에 Factor Xa cleavage site(IEGR)와 연결된 링커(GGKKKKKGG)를 삽입하여 융합 단백질 파트너와 연결된 GLP-1 유사체를 발현할 수 있는 플라스미드를 제공할 수 있다. 일 구체예로, 상기 플라스미드는 특정 아미노산 위치의 코돈이 UAG, UAA 또는 UGA로 치환된 것 일 수 있다. 일 실험예로, pQE80-sfGFP-GLP1.Amb일 수 있다(도 20참조).

본 출원의 파트너 단백질과 연결된 GLP-1 유사체는 균주 내에서 발현되어 제공될 수 있다. 일실험예로, pEVOL-pAzF와 pQE80-sfGFP-GLP1.Amb가 도입된, 즉 형질전환된 균주 내에서 본 출원의 파트너 단백질과 연결된 GLP-1 유사체가 제공될 수 있다. 이 때, 상기 균주는 대장균일 수 있다..Co E.Coli.C321.A.exp.에 Co-transformation 진행하여 발현 균주를 제작하였다(도 20참조).

상기 형질전환된 균주로부터 GLP-1의 특정 아미노산 AzF로 변경된 GLP-1 유사체가 제공될 수 있다. 상기 형질전환된 균주로부터 GL:P-1의 특정 아미노산이 AzF로 변경되고, 융합 단백질 파트너와 연결되어 있는 GLP-1 유사체가 제공될 수 있다(도 20참조).

일 구체예로, 하기의 구조를 가진 GLP-1 유사체가 제공될 수 있다.

일 구체예로, 본 출원의 GLP-1 유사체는 GLP-1_H7AzF, GLP-1_A8AzF, GLP-1_E9AzF, GLP-1_G10AzF, GLP-1_T11AzF, GLP-1_F12AzF, GLP-1_T13AzF, GLP-1_S14AzF, GLP-1_D15AzF, GLP-1_V16AzF, GLP-1_S17AzF, GLP-1_S18AzF, GLP-1_Y19AzF, GLP-1_L20AzF, GLP-1_E21AzF, GLP-1_G22AzF, GLP-1_Q23AzF, GLP-1_A24AzF, GLP-1_A25AzF, GLP-1_K26AzF, GLP-1_E27AzF, GLP-1_F28AzF, GLP-1_I29AzF, GLP-1_A30AzF, GLP-1_W31AzF, GLP-1_L32AzF, GLP-1_V33AzF, GLP-1_R34AzF, GLP-1_G35AzF, GLP-1_R36AzF 또는 GLP-1_G37AzF일 수 있다.

일 구체예로, 본 출원의 GLP-1 유사체는 sfGFP_GLP-1_H7AzF, sfGFP_GLP-1_A8AzF, sfGFP_GLP-1_E9AzF, sfGFP_GLP-1_G10AzF, sfGFP_GLP-1_T11AzF, sfGFP_GLP-1_F12AzF, sfGFP_GLP-1_T13AzF, sfGFP_GLP-1_S14AzF, sfGFP_GLP-1_D15AzF, sfGFP_GLP-1_V16AzF, sfGFP_GLP-1_S17AzF, sfGFP_GLP-1_S18AzF, sfGFP_GLP-1_Y19AzF, sfGFP_GLP-1_L20AzF, sfGFP_GLP-1_E21AzF, sfGFP_GLP-1_G22AzF, sfGFP_GLP-1_Q23AzF, sfGFP_GLP-1_A24AzF, sfGFP_GLP-1_A25AzF, sfGFP_GLP-1_K26AzF, sfGFP_GLP-1_E27AzF, sfGFP_GLP-1_F28AzF, sfGFP_GLP-1_I29AzF, sfGFP_GLP-1_A30AzF, sfGFP_GLP-1_W31AzF, sfGFP_GLP-1_L32AzF, sfGFP_GLP-1_V33AzF, sfGFP_GLP-1_R34AzF, sfGFP_GLP-1_G35AzF, sfGFP_GLP-1_R36AzF 또는 sfGFP_GLP-1_G37AzF일 수 있다.

본 명세서에 의해 개시되는 발명의 일 태양은 키트(kit) 또는 이를 이용한 펩타이드-알부민 컨주게이트의 제조방법이다.

’키트‘란 영어 단어 'kit'의 한글 음역으로서 '조립을 해서 무엇을 바로 만들 수 있도록 부품들을 모아 놓은 것, 특정한 목적용 도구, 장비 세트'를 의미한다. 본 출원에서 제공하는 키트는 “~~컨주케이트”를 제조할 수 있도록 GLP-1 유사체, 링커 및 알부민을 포함하는 장비세트를 통칭하여 의미한다.,

본 출원에서 제공되는 키트는 유효성분으로 GLP-1 유사체, 링커 및 알부민을 포함하고, 컨쥬게이트를 제조하는데 필요한 공지의 물질 또는 성분들을 함께 포함한다.

본 출원의 명세서에서 (i) GLP-1 유사체, (ii) 링커 및 (iii) 알부민 또는 이의 변이체를 포함하는 키트를 제공할 수 있다.

본 출원의 명세서에 (i) GLP-1 유사체 및 (ii) 링커와 결합된 알부민 또는 이의 변이체를 포함하는 키트를 제공할 수 있다.

본 출원의 명세서에 (i) 알부민 또는 이의 변이체 및 (ii) 링커와 결합된 GLP-1을 포함하는 키트를 제공할 수 있다.

GLP-1 유사체 및 알부민에 대해서는 전술한 바와 동일하다. 다만, 이에 제한되지 않으며 본 기술분야의 통상의 기술자의 입장에서 자명한 사항도 포함된다.

[링커(linker)]

본 출원에서 제공하는 키트의 일 구성요소인 링커는 (i) 링커 그 자체 또는 (ii) 알부민 또는 GLP-1 유사체 중 어느 하나와 결합된 것일 수 있다.

본 출원에서 제공하는 링커는 클릭화학 작용기(click-chemistry functional group) 또는 알부민 반응기(albumin reacting group) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

링커의 제1 구성 - 클릭화학 작용기

본 출원에서 제공하는 링커는 클릭화학 작용기(또는 클릭화학 핸들이라 칭함)를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 때, 클릭화학 작용기는 링커의 어느 말단에 포함될 수 있다.

따라서, 클릭화학 작용기를 포함하는 링커는 상기 이와 페어(pair)를 이루는 클릭화학 작용기를포함하는 GLP-1 유사체와 특이적으로 반응함으로써 서로 연결될 수 있다.

일 예로, 링커 내 클릭화학 작용기(functional group)는 상기 클릭화학 작용기는 말단 알킨, 아자이드, 스트레인된 알킨, 다이엔, 친다이엔체, 알켄, 티올, 노르보넨, 디벤조시클로옥신-아민 및 테트라진 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.

일 예로, 링커 내 클리고하학 작용기는 O-propargly-L-tyrosine(oPa), L-Homopropargylglycine(HPG), 4-Ethynyl-L-phenylalanine hydrochloride(pEthF), p-Azido-L-phenylalanine(AzF), p-ethynyl-phenylalanine(pEPA), O-propargly-L-tyrosine(oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine(pPa) 중 선택된 어느 하나일 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.

링커의 제2 구성 - 알부민 반응기(albumin reacting group)

본 출원에서 제공하는 링커는 알부민 반응기를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 때, 알부민 작용기는 링커의 어느 말단에 포함될 수 있다.

상기 알부민 반응기는 알부민 내 시스테인(Cys) 또는 라이신(Lys) 잔기와 반응할 수 있다. 또한, 상기 반응에 의하여 링커는 알부민에 연결될 수 있다.

일 예로, 상기 알부민 반응기는 Thiol 그룹과 반응할 수 있다. 일 구체예로, 상기 알부민 반응기는 서열번호 16의 34번째 위치의 Cys 내 thiol 그룹과 반응 할 수 있다.

일 구체예로, 상기 알부민 반응기는 말레이미드(Maleimide), 피리딜 다이설파이드(Pyridyl disulfides), APN(3-arylpropiolonitriles) 또는 비닐술폰(Vinyl sulfone) 일 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.

링커의 선택적 구성 - PEG

본 출원에서 제공하는 링커는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol, PEG)를 선택적으로 포함할 수 있다.

본 출원에서 제공하는 링커는 하기의 단위체를 포함할 수 있다.

이 때, 상기 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 이상의 정수일 수 있다.

본 출원에서 제공하는 링커는 (C₂H₄O)_n 을 포함할 수 있다.

상기 PEG는 탄화수소 체인, C-8 내지 C-20 지방산(fatty acid) 중 어느 하나 이상으로 대체될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 기술분야에서 통상의 기술자가 쉽게 선택하고 이용할 수 있는 모든 것을 포함한다.

링커의 구체 예

본 출원에서 제공하는 링커는 양 말단에 알부민 반응기 및 클릭화학 작용기를 각각 포함하고, 상기 알부민 반응기와 상기 클릭화학 작용기 사이에 하나 이상의 PEG를 포함하는 것일 수 있다.

일 예로, 본 출원에서 제공하는 링커는

[알부민 반응기]-[PEG]_n-[클릭화학 작용기] 또는 [클릭화학 작용기]-[PEG]_n-[알부민 반응기] 일 수 있다.

일 구현예로, 본 출원에서 제공하는 링커는 [DBCO]-[PEG]_n-[Maleimide(MAL)] 일 수 있다.

일 구현예로, 본 출원에서 제공하는 링커는 [DBCO]-[PEG]_n-[3-arylpropiolonitriles(APN)] 일 수 있다.

일 구현예로, 본 출원에서 제공하는 링커는 [trans-cyclooctene(TCO)]-[PEG]_n-[MAL] 일 수 있다.

일 구현예로, 본 출원에서 제공하는 링커는 [TCO]-[PEG]_n-[APN] 일 수 있다.

일 구현예로, 본 출원에서 제공하는 링커는 [Tetrazine]-[PEG]_n-[MAL] 일 수 있다.

일 구현예로, 본 출원에서 제공하는 링커는 [Tetrazine]-[PEG]_n-[APN] 일 수 있다.

일 구현예로, 본 출원에서 제공하는 링커는 [BCN]-[PEG]_n -[MAL] 일 수 있다.

일 구현예로, 본 출원에서 제공하는 링커는 [BCN]-[PEG]_n -[APN] 일 수 있다.

본 출원에서 제공하는 링커는 말단에 알부민 반응기를 포함하고, GLP-1 유사체와 연결되고, 상기 알부민 반응기와 상기 GLP-1 사이에 하나 이상의 PEG를 포함하는 것일 수 있다.

일 예로, 본 출원에서 제공하는 링커는

[알부민 반응기]-[PEG]_n-[GLP-1 유사체] 일 수 있다.

본 출원에서 제공하는 링커는 말단에 클릭화학 작용기를 포함하고, 알부민과 연결되고, 상기 클릭화학 작용기와 알부민 사이에 하나 이상의 PEG를 포함하는 것일 수 있다.

일 예로, 본 출원에서 제공하는 링커는

[알부민]-[PEG]_n-[클릭화학 작용기] 일 수 있다.

본 출원에서 제공되는 키트를 이용하여 펩타이드-알부민 컨주게이트를 제조할 수 있다.

[제1 공정 - 링커와 GLP-1 유사체 간의 연결을 유도함]

링커와 제1 클릭화학 작용기를 포함하는 GLP-1을 준비한다.

이 때, 상기 링커는 (i) 알부민 반응기 및 제2 클릭화학 작용기를 포함하는 링커 또는 (ii) 제2 클릭화학 반응기를 포함하고, 알부민과 결합된 것일 수 있다.

일 예로, 상기 GLP-1 유사체의 제1 클릭화학 작용기와 상기 링커의 제2 클릭화학 작용기는 서로 특이적으로 반응할 수 있다.

일 예로, 상기 GLP-1 유사체의 제1 클릭화학 작용기와 상기 링커의 제2 클릭화학 작용기는 서로 페어링 될 수 있다. 즉 상기 제1 클릭화학 작용기와 상기 제2 클릭화학 작용기는 페어이다.

일 예로, 상기 GLP-1 유사체의 제1 클릭화학 작용기는 상기 링커의 제2 클릭화학 작용기의 파트너 클릭화학 작용기일 수 있다.

일 예로, 상기 링커의 제2 클릭화학 작용기는 상기 GLP-1 유사체의 제1 클릭화학 파트너 클릭화학 작용기일 수 있다.

상기 GLP-1 유사체의 제1 클릭화학 작용기와 상기 링커의 제2 클릭화학 작용기는 하기의 반응에 의하여 서로 페어링을 형성할 수 있다. 이로써 상기 GLP-1 유사체와 상기 링커는 서로 연결될 수 있다.

일 예로, 휴이스겐 1,3-이극성 고리화첨가 반응, 디엘스-알더 반응 (Diels-Alder reaction), 스트레인된 고리 (strained ring)에 대한 친핵성 첨가 반응, 활성화된 카르보닐기 (activated carbonyl group)에 대한 친핵성 첨가 반응, 제탄소-탄소 이중결합 또는 삼중결합에 대한 첨가 반응 중 어느 하나의 클릭화학 반응 결과 본 출원의 GLP-1 유사체와 본 출원의 링커는 서로 연결될 수 있다.

일 예로, 본 출원의 GLP-1 유사체의 제1 클릭화학 작용기와 본 출원의 링커의 제2 클릭화학 작용기는 서로 특이적으로 반응하여 하기의 구조를 통하여 서로 연결될 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.

(a)

, (b)

,

(c)

, (d)

,

(e)

, (f)

,

(g)

, (h)

,

(i)

, (j)

,

(k)

, (l)

,

(o)

, 및 (p)

[제2 공정 - 링커와 알부민 간의 연결을 유도함]

링커와 제1 클릭화학 작용기를 포함하는 GLP-1을 준비한다.

이 때, 상기 링커는 (i) 알부민 반응기 및 제2 클릭화학 작용기를 포함하는 링커 또는 (ii) 알부민 반응기를 포함하고, GLP-1 유사체와 결합된 것일 수 있다.

상기 링커 내 알부민 반응기는 상기 알부민의 자유 티올기(free thiol)와 반응함으로써 서로 연결될 수 있다. 이 때, 서열번호 16 또는 이와 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열의 HSA의 아미노산 34번 위치의 Cys 내 자유 티올기와 결합함으로써 서로 연결될 수 있다.

일 구현예로, 하기의 반응을 통하여 링커와 알부민이 서로 연결될 수 있다.

이 때, 본 출원의 알부민은 상기 리간드 그룹(Ligand group)을 포함할 수 있다.

이 때, 본 출원의 링커는 surface group 내 어느 하나를 포함할 수 있다.

상기 리간드 그룹 및 surface group 간에 반응함으로써 알부민과 링커는 상기 복합구조(Complex structure)를 통하여 서로 연결될 수 있다.

이 때, 제1 공정에 의하여 링커는 GLP-1 유사체와 연결될 수 있다. 보다 구체적으로, GLP-1 유사체 내 비천연 아미노산의 제1 클릭화학 작용기와 링커의 제2 클릭화학 작용기 간의 특이적인 반응을 통하여 링커는 GLP-1 유사체에 연결될 수 있다.

이 때, 제2 공정에 의하여 링커는 알부민에 연결될 수 있다. 보다 구체적으로, 알부민의 시스테인 또는 라이신 잔기와 링커의 알부민 반응기 간의 반응을 통하여 링커는 알부민에 연결될 수 있다. 일 구체예로, 알부민의 시스테인 잔기에 연결될 수 있다.

이 때, 상기 제1 공정 및 제2 공정의 결과 펩타이드-알부민 컨주게이트가 제공될 수 있다. 다만 상기 두 공정은 동시에, 또는 제1 공정 후 제2 공정, 또는 제2 공정 후 제1 공정의 순서로 진행될 수 있다. 상기 제1 공정만 또는 상기 제2 공정만 진행될 수 있다.

[키트의 구체 예]

일 예로, 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트로서 상기 키트는 (i) 전술한 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드 또는 GLP-1 유사체, 이 때, 상기 펩타이드는 제1 클릭화학 작용기를 포함함 -;

(ii) 알부민 또는 이의 변이체; 및 (iii) 제2 클릭화학 작용기 및 알부민 반응기를 포함하는 링커를 포함하고, 이 때, 상기 제2 클릭화학 작용기는 제1 클릭화학 작용기와 특이적으로 반응가능하고 이 때, 상기 알부민 반응기는 알부민과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있음을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트일 수 있다.

일 구체예로, 상기 상기 링커는 다음의 화학식 (II)를 포함하고,

화학식 (II)

이 때, 상기 H''은 클릭화학 작용기이고, 상기 L은 연결 모이어티이고, 및 상기 A는 알부민 반응기인 것을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트일 수 있다.

출원에서 사용되는 예시적인 클릭화학작용기 H''은 말단 알킨 (terminal alkyne), 아자이드 (azide), 스트레인된 알킨 (strained alkyne), 다이엔 (diene), 친다이엔체 (dienophile), 트랜스 시클로옥틴 (trans-cyclooctene), 알켄 (alkene), 티올 (thiol), 및 테트라진 (tetrazine)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 그밖의 클릭화학작용기는 당업자에게 알려져있다.

일 예로, 상기 링커의 클릭화학 작용기 H''는 본 출원의 GLP-1 유사체의 클릭화학 작용기 H'과 특이적으로 반응할 수 있다.

이 때, 상기 링커와 상기 알부민은 알부민의 시스테인 잔기를 통하여 서로 연결될 수 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트일 수 있다.

이 때, 상기 알부민 반응기는 Maleimide(MAL) 또는 3-arylpropiolonitriles(APN) 인 것을 특징으로 하는 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트일 수 있다.

일 예로, 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트로서, 상기 키트는 (i) 제11 항 내지 제15항 중 어느 한 항의 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드, 이 때, 상기 펩타이드는 제1 클릭화학 작용기를 포함함 -;

(ii) 제2 클릭화학 작용기를 포함하는 링커와 연결된 알부민 또는 이의 변이체, 이 때, 상기 제2 클릭화학 작용기는 제1 클릭화학 작용기와 특이적으로 반응가능함을 포함하는 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트일 수 있다.

[펩타이드-알부민 컨주게이트 제조방법 - 구체 예]

본 출원은 펩타이드-알부민 컨주게이트의 제조방법을 제공한다.

일 예로, (i) 제1 클릭화학 작용기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 GLP-1 유사체, (ii) 제2클릭화학 작용기 및 알부민 반응기를 포함하는 링커, 및 (iii) 알부민을 준비함, (ii) 상기 링커의 알부민 반응기와 상기 알부민간의 반응을 유도함, 이 때, 상기 반응을 통하여 링커와 알부민이 연결됨; 및 (iii) 상기 GLP-1 유사체의 제1 클릭화학 작용기와 상기 링커의 제2 클릭화학 작용기의 반응을 유도함을 통하여 [GLP-1 유사체]-[링커]-[알부민] 순서대로 연결된 펩타이드-알부민 컨주게이트가 제공될 수 있다.

이 때, 상기 (ii) 공정과 (iii) 공정은 동시에 진행될 수 있고, (ii) 공정이 진행된 뒤 (iii) 공정이 진행될 수 있고, (iii) 공정이 진행된 뒤 (ii) 공정이 진행될 수 있다.

이 때, 상기 (ii) 공정은 생체 외(in vitro)에서 진행될 수 있다.

이 때, 상기 (iii) 공정은 생체 외(in vitro)에서 진행될 수 있다.

일 구체예로, 혈당강하용 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조방법으로서, (i) 제11 항 내지 제15 항 중 어느 하나의 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드, (ii) 알부민 또는 이의 변이체 및 (iii) 링커를 준비함(preparing), 이 때, 상기 펩타이드는 제1 클릭화학 작용기를 포함하고, 이 때, 상기 제2 클릭화학 작용기는 제1 클릭화학 작용기와 특이적으로(complementary to) 반응가능하고, 이 때, 상기 알부민 반응기는 알부민과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있음 -; 상기 펩타이드의 상기 제1 클릭화학 작용기와 상기 링커의 제2 클릭화학 작용기가 특이적으로 반응하여 상기 펩타이드와 상기 링커가 서로 연결되도록, 상기 알부민과 상기 링커의 상기 알부민 반응기가 반응하여 상기 알부민과 상기 링커가 서로 연결되도록 유도함(inducing), 이로써, 펩티드, 링커 및 알부민이 순차적으로 연결된 펩타이드-알부민 컨주게이트가 형성됨 -; 상기 펩타이드-알부민 컨주게이트를 포함하는 반응 혼합물(a reation mixture)을 얻음(obtaining)을 포함하는 혈당강하용 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조방법을 제공할 수 있다.

상기 제공된 펩타이드-알부민 제조용 키트 및 상기의 펩타이드-알부민 제조방법을 이용하여 본 출원에서 제공하는 펩타이드-알부민을 제공할 수 있다.

[키트를 이용한 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조방법 - 구체 예]

일 예로, 혈당강하용 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조방법으로서, 본 출원의 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드, (ii) 알부민 또는 이의 변이체 및 (iii) 링커를 준비함(preparing), 이 때, 상기 펩타이드는 제1 클릭화학 작용기를 포함하고, 이 때, 상기 제2 클릭화학 작용기는 제1 클릭화학 작용기와 특이적으로(complementary to) 반응가능하고, 이 때, 상기 알부민 반응기는 알부민과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있고, 상기 펩타이드의 상기 제1 클릭화학 작용기와 상기 링커의 제2 클릭화학 작용기가 특이적으로 반응하여 상기 펩타이드와 상기 링커가 서로 연결되도록, 상기 알부민과 상기 링커의 상기 알부민 반응기가 반응하여 상기 알부민과 상기 링커가 서로 연결되도록 유도함(inducing), 이로써, 펩티드, 링커 및 알부민이 순차적으로 연결된 펩타이드-알부민 컨주게이트가 형성되고, 상기 펩타이드-알부민 컨주게이트를 포함하는 반응 혼합물(a reation mixture)을 얻음(obtaining)을 포함하는 혈당강하용 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조방법을 제공할 수 있다.

일 예로, 상기 제조된(prepared) 펩타이드는 상기 아미노산 서열에 융합 단백질 파트너(a fusion protein partner)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 혈당강하용 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조방법을 제공할 수 있다.

일 예로, 상기 링커가 상기 펩타이드 및 상기 알부민 모두에 연결되도록 유도한 뒤 상기 반응 혼합물을 프로테이즈(protease)로 처리함을 추가로 포함하고, 이 때, 상기 프로테이즈는 상기 아미노산 서열과 상기 융합 단백질 파트너 사이의 펩타이드 결합(peptide bond)를 절단가능하고, 상기 융합 단백질 파트너를 포함하지 않는 펩타이드-알부민 컨주게이트를 얻음을 포함하는 혈당강하용 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조방법을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

sfGFP-GLP-1-HSA 제조 및 실험결과

실시예 1. sfGFP-GLP-1-HSA 제조를 위한 준비

p-아지도-L-페닐알라닌(AzF)는 Chem-Impex International (Wood Dale, IL)로부터, Nickel-nitrilotriacetic acid(Ni-NTA) agarose와 propylene 컬럼은 Qiagen (Valencia, CA, USA)로부터, dibenzocyclooctyne-PEG4-maleimide (DBCO-PEG4-MAL)와 dibenzocyclooctyne-PEG4-carboxyrhodamine 110 (DBCO-PEG4-carboxyrhodamine)은 Click Chemistry Tools LLC (Scottsdale, AZ, USA)로부터, Disposable PD-10 desalting columns, HiTrap Q HP anion exchange columns, HiTrap SP HP cation exchange columns은 GE Healthcare (Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)로부터, Vivaspin centrifugal concentrators (MWCO 10 kDa)은 Sartorius (Weender Landstraße, Gttingen, Germany)로부터, Anti-GLP-1 monoclonal antibody는 Thermo Fisher Scientific (Waltham MA, USA)로부터, Fetal bovine serum과 antibiotic-antimycotic은 Gibco (Gaithersburg, MD, USA)로부터, X-tremeGENE HP DNA transfection reagent는 Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Germany)로부터, cAMP Parameter Assay Kit는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)로부터, Iscove's modified Dulbeco's medium과 그 외 모든 화학 시약은 Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, GLP1_C peptide는 GenScript (Piscataway NJ, USA)로 합성하여 사용하였다.

실시예 2. sfGFP-GLP-1 생산을 위한 발현벡터의 제작

sfGFP-GLP-1 발현 벡터는 GLP-1의 C 말단에 Factor Xa cleavage site(IEGR)와 연결된 모이어티(GGKKKKKGG)를 삽입하여 pQE80-sfGFP-GLP-1 벡터를 제작하였다.

위치 특이적으로 비천연아미노산을 삽입하기 위해 GLP-1의 V16, Y19, F28 위치에 site-directed mutagenesis PCR 기법을 통해 amber codon(TAG)로 염기서열을 바꾸었다. 또한, dipeptidyl peptidase IV에 의해 분해되는 것을 막기 위해 GLP-1의 8번 위치 알라닌(Ala)을 글라이신(Gly)으로 site-directed mutagenesis PCR 기법을 이용하여 치환하였다. 이 때, 사용한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 염기서열은 다음 [표 1]과 같다.

Primer Name	Oligonucleotide Sequence(5' → 3')	Generated Plasmid
V16AzF_F	AAGGCACCTTTACCAGCGATTAGAGTAGCTATCTGGAAGG(서열번호 17)	pQE80-sfGFP-GLP-1_16AzF
V16AzF_R	CCTTCCAGATAGCTACTCTAATCGCTGGTAAAGGTGCCTT(서열번호 18)	pQE80-sfGFP-GLP-1_16AzF
V19AzF_F	GCGATGTGAGTAGCTAGCTGGAAGGTCAGGC(서열번호 19)	pQE80-sfGFP-GLP-1_19AzF
V19AzF_R	GCCTGACCTTCCAGCTAGCTACTCACATCGC(서열번호 20)	pQE80-sfGFP-GLP-1_19AzF
V28AzF_F	GTCAGGCGGCCAAAGAATAGATTGCCTGGCTGGTGC(서열번호 21)	pQE80-sfGFP-GLP-1_28AzF
V28AzF_R	GCACCAGCCAGGCAATCTATTCTTTGGCCGCCTGAC(서열번호 22)	pQE80-sfGFP-GLP-1_28AzF
A8G_F	GCATCGAAGGTAGGCATGGTGAAGGCACCTTTACCAG(서열번호 23)
A8G_R	CTGGTAAAGGTGCCTTCACCATGCCTACCTTCGATGC(서열번호 24)

비천연 아미노산을 삽입할 수 있는 pEvol-pAzFRS.1.t1 벡터는 Addgene(Cambridge, MA)로부터 구입하여 사용하였다. 상기 벡터는 AzF 특이적인 engineered pair를 포함하며, 상기 pair는 Methanococcus jannaschii 유래의 tyrosyl-tRNA synthetase 및 amber suppressor tRNA로 구성된다. 구입한 벡터는 추가적인 조작없이 그대로 사용하였다.

E. coli C321.A.exp(addgene (Cambridge, MA))에 [pEVOL-pAzF]와 [pQE80-sfGFP-GLP-1_Amb plasmid] 플라스미드를 도입하여 발현 균주를 제작하였다.

실시예 3. sfGFP-GLP-1_Variant 발현 및 정제

종 배양은 100 ㎍/mL 암피실린(ampicillin)과 35 ㎍/mL 클로람페니콜(chloramphenicol)이 들어있는 LB 배지 3 mL에서 37℃ 및 210 rpm의 조건으로 15시간 이상 진행되었다. 본 배양은 1L 삼각플라스크에 200mL 2xYT배지를 제조한 뒤, 종 배양을 접종하였다. 그 후 37℃ 및 210 rpm의 조건에서 OD600 값이 0.4에 도달하면 p-Azido-L-phenylalanine(AzF)를 1 mM가 되도록 넣었다. 이로부터 30분후 1 mM의 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 및 0.2% arabinose를 첨가하여 25℃로 온도를 낮추고 15시간 이상 배양하였다. 그 후 6,000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 뒤 펠렛은 -80℃에서 보관하거나 정제하였다.

sfGFP-GLP-1_AzF의 분리정제는 NI-NTA 레진을 이용한 affinity 크로마토그래피를 통해 수행하였다. 펠렛을 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5), 300 mM NaCl 및 10 mM imidazole, 0.5 mg/mL lysozyme로 구성된 용해 버퍼에 녹인 후 초음파 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 그 후, 12,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였고, 상층액을 분리하여 Ni-NTA 레진과 40분 동안 혼합하였다. 이후 폴리프로필렌 컬럼(polypropylene column)에 부어 용액을 흘려준 뒤, 50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.5), 300 mM NaCl, 20 mM imidazole로 구성된 세척용 버퍼로 세척하고, 50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.5), 300 mM NaCl, 250 mM imidazole로 구성된 용출 버퍼를 흘려주어 분리된 단백질을 수득하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, A는 IPTG 유도 전(BI)에 비해 IPTG 유도 후(AI)에서 목적 단백질의 밴드(32kDa)가 나타나는 것을 확인하였다. 또한 Ni-NTA를 통해 sfGFP-GLP1_16AzF가 분리되었음을 확인하였다.

이후, Tris 버퍼(pH 8.0)으로 HiTrap Q HP 컬럼을 이용하여 음이온교환 크로마토그래피를 수행하였으며, 고순도의 sfGFP-GLP-1_V16AzF을 얻을 수 있었다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 4 에 나타난 바와 같이, F3와 F4 분획의 SDS-PAGE 밴드가 32kDa인것으로 보아 고순도의 sfGFP-GLP1_16AzF임을 확인하였다.

또한, sfGFP-GLP1_16AzF의 비천연아미노산 도입여부를 확인하기 위해 DBCO-PEG4-carboxyrhodamine을 이용하여 상온에서 2시간 반응 후 SDS-PAGE를 확인하였으며, 형광분석은 Bio-Rad ChemiDocTM XRS+ system (Hercules, CA, USA)을 사용하여 분석하였다. 그 결과 도 5에 나타내었다.

도 5 에 나타난 바와 같이, 형광 dye(DBCO-PEG4-carboxyrhodamin)를 첨가하여 반응할 경우 형광에서 밴드가 확인되었다. 이는 GLP1_16AzF에 비천연아미노산의 도입이 되었음을 알 수 있다.

GLP-1_variant(GLP-1_16AzF, GLP1_19AzF, 및 GLP-1_28AzF)의 분자량을 MALDI-TOF (MALDI-TOF; Bruker Daltonics, Bremen, Germany)을 이용하여 분석 하였다. GLP-1_variant를 1:1 (v:v) 비율로 TA30(30% acetonitrile과 0.1% trifluoroacetic acid)용액에 포화된 α-cyano-4-hydroxy cinnamic acid (HCCA)를 혼합하고 steel plate 도포 후 분석하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, GLP1_C와 Recombinant GLP1-C의 분자량이 각각 3382.7와 3382.8 m/z로 동일한 분자량이 검출되었다. GLP-1_16AzF, GLP1_19AzF, 및 GLP-1_28AzF의 분자량은 각각 3430.5, 3367.5, 3383.3 m/z로 나타났다. 이는 예측값인 3431.6, 3367.6, 3383.6 m/z와 유사한 수치를 보였다.

실시예 4. HSA와 sfGFP-GLP-1_16AzF의 위치 특이적 결합 반응 및 GLP-1-PEG4-HSA 정제

동결건조된 HSA을 20 mM bis-Tris (pH7.0)에 용해한 후 음이온 교환크로마토그래피를 수행하여 고분자량의 불순물을 제거하였다. 정제된 HSA는 DBCO-PEG4-MAL과 몰비율 1:3으로 3시간 반응 시킨 후 20mM Tris (pH8.0)로 미반응 DBCO-PEG4-MAL를 제거하였다. 20uM sfGFP-GLP-1_16AzF와 HSA-DBCO는 몰비율 1:2로 상온에서 overnight 반응시켰다. 이 후 버퍼를 20 mM sodium phosphate (pH 6.0)으로 변경한 뒤, HiTrap SP-HP 칼럼을 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피를 통하여 sfGFP-GLP-1_16HSA를 정제하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, F2 분획에서 sfGFP-GLP1_16HSA가 분리되었으며, F3 분획에서 미반응된 sfGFP-GLP1_16AzF가 분리되었다.

정제된 sfGFP-GLP-1_16HSA를 PD-10 컬럼을 이용하여 20mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM NaCl 및 2mM CaCl2로 구성된 버퍼로 변경한 뒤 500:1 몰수비로 효소 Factor Xa를 넣고 상온에서 서로 반응하도록 유도하였다. 18시간 후, 상기 반응을 종결하기 위하여 억제제(Dansyl-Glu-Gly-Arg-chloromethylketone)를 넣었다. 그 후, GLP-1_16HSA를 정제하기 위하여 버퍼를 20mM bis-tris(pH 6.0)로 변경한 뒤, HiTrap Q-HP 칼럼을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 진행하였다. 그 결과 도 9 에 나타내었다. F2 분획에서 GLP1_16HSA이 분리되었으며, F1 분획에서는 절단된sfGFP가 분리되었다. 또한, GLP1_16HSA, GLP1_19HSA, GLP1_28HSA 모두 70 kDa의 밴드를 확인하였다(도 10 내지 도 12 참조).

단백질 정량은 Synergy™microplate reader (BioTek, Winooski, VT, USA)을 이용하여 흡광도 280nm에서 측정하였다. 몰흡광계수는 ε280 = (5500 × ε+ (1490 × ε+ (125 × εbond)) + (2620 × ε)같이 산출하였다. sfGFP-GLP-1의 단백질 정량은 Pierce™BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)을 이용하여 구하였다.

SEC-HPLC를 이용하여 최종 분리된 GLP-1_16HSA의 순도를 분석하였다. 이 때, SEC 컬럼으로서 Advanced Bio SEC column (300Å, 2.7 μm, 7.8x300 mm)을, HPLC 장비는 Agilent 1260 Infinity Ⅱ을, 용매는 150 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0)를 사용하여 분석하였다. 또한, IEF-PAGE Precast Gel (pH 3 ~ 10) (KOMABIOTECH)를 이용하여 GLP-1_16HSA의 PI를 분석하였다. 그 결과를 도 13 내지 도 14에 나타내었다.

도 13에 나타난 바와 같이, SEC-HPLC 분석결과 GLP1_HSA의 분자량이 약 70kDa로 나타났으며, sfGFP-GLP1-16AzF는 약 32kDa으로 나타났다.

도 14에 나타난 바와 같이, GLP1-HSA의 PI는 5.0으로 나타났으며, sfGFP-GLP1_16AzF의 PI는 5.4로 나타났다.

GLP-1_HSA의 분자량 분석은 flexControl autoflex TOF/TOF software (Bruker Daltonics, Bremen Germany)을 이용하였다. GLP1_16HSA, GLP1_19HSA, 및 GLP1_28HSA 를 1:1 (v:v)로 DHB matrix (20 mg/mL 2,5-dihydroxybenzoic acid in TA30)와 혼합 후 steel plate에 도포 하여 분석하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15에 나타난 바와 같이, GLP1_16HSA, GLP1_19HSA, GLP1_28HSA의 분자량은 각각 70653.7, 70563.0, 70658.7 m/z로 나타났다. 이는 예측값인 70606.8, 70542.8, 70558.8 m/z 와 유사한 수치를 보였다.

실시예 5. GLP-1_HSA variant의 in vitro 활성

GLP-1R가 고발현되는 HEK-293 세포를 이용하여 생성되는 cAMP량을 분석함으로써 GLP-1_HSA variant의 in vitro 활성을 측정하였다. 세포는 48 well plate에 5x10⁵ cells/well 를 깔고 Iscove's modified Dulbeco's medium(10% fetal bovine serum와 1% antibiotic-antimycotic)배지를 첨가하여 16시간 배양 후 DNA transfection reagent를 이용하여 pcDNA3.1-GLP-1R_tango (Addgene, Cambridge, MA, USA) 플라스미드를 transfection 시켰다. 48시간 후 GLP1_C과 GLP1_HSA variants 를 처리하고 cAMP Parameter Assay Kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 cAMP를 측정하였다. EC₅₀은 OriginPro (OriginLab, Northampton, Massachusetts, USA) 프로그램을 이용하여 산출하였다. 그 결과 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타난 바와 같이, GLP_C, GLP1_16HSA, GLP1_19HSA, GLP1_28HSA의 EC₅₀은 각각 1.4 nM, 0.7 uM, 1.91 uM, 6.85 uM을 보였다.

결국 위치 특이적 알부미네이션된 본 출원의 펩타이드-알부민 컨주게이트는 종래의 알부미네이션 또는 페길레이션된 치료제와 비교할 때 펩타이드의 활성이 상대적으로 적게 감소됨을 확인하였다. 그 중에서도 GLP1_16HSA의 경우가 가장 높은 활성을 가짐을 확인하였다.

실시예 6. GLP-1_HSA의 약동학적(PK) 평가

GLP-1_HSA의 약동학적 평가를 위해 8주령의 암컷 BALB/c mice을 이용하였다. 모든 절차는 GIST 동물윤리위원회에서 승인한 실험지침을 따라 진행하였다. GLP-1_HSA Variants 10 nmol/kg을 꼬리를 통해 정맥주사하였으며, 0.16, 1, 2, 4, 8, 12, 24신간 채혈 후 2,500rpm, 10분동안 원심분리하여 -20℃에 보관하였다. 혈액내 GLP-1_HSA는 ELISA를 이용하여 분석하였다. polyclonal anti-albumin rabbit antibody를 immunoplate에 4°C, overnight 코팅한 후 5% skim milk를 이용하여 37°C에서 1 시간 blocking 하였다. 채취한 혈액시료를 희석하여 처리하고 monoclonal anti-GLP-1 mouse antibody를 상온에서 2시간 처리하였다. anti-mouse IgG antibody-horseradish peroxidase (HRP)를 상온에서 1시간 처리한 후 기질 100 uL를 5분간 처리하고 2M H2SO4를 처리하여 반응을 정지시켰다. 이후 Synergy™ microplate reader (BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 450nm에서 측정하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다.

도 17에 나타난 바와 같이 GLP1_16HSA, GLP1_19HSA, GLP1_28HSA의 반감기는 각각 8.4, 7.4, 8.0 시간으로 나타났다. 이는 GLP1-WT의 반감기(3 분)보다 160배 증가한 수치이다.

결국, 이러한 결과를 통해서 본 출원의 펩타이드-알부민 컨주게이트는 위치 특이적으로 알부민이 펩타이드에 연결된다는 신규한 구조를 가짐으로써 펩타이드 자체보다 향상된 반감기를 가짐을 확인하였다. 향상된 반감기를 가지는 펩타이드-알부민 컨주게이트를 치료제로 사용하면 질병을 치료하기 위한 약물의 투여주기가 현저하게 길어짐을 확인하였다. 더 나아가, 알부민이 펩타이드에 부착되면 펩타이드의 활성이 다소 감소되지만 반감기가 현저하게 길어지므로 종래의 치료제와 비교할 때 동등 또는 그 이상의 효과를 가짐을 확인하였다. 즉, 본 출원의 펩타이드-알부민 컨주게이트는 펩타이드의 활성은 종래 치료제보다 상대적으로 현저하게 적게 감소됨과 동시에 반감기는 현저하게 증가된다는 특징을 가진다.

실시예 7. GLP-1_HSA의 복강내 당부하 실험(IPGTT)

C57BL6/J(n=6) male mice에 GLP-1_HSA를 피하주사로 투여하여 시간에 따른 혈당 변화를 분석하였다. 보다 구체적으로 7주령의 C57BL6/J 마우스를 순환기간을 1주일 거쳐 시험물질 투입 3시간 전부터 공복을 유지하였다. GLP-1_HSA(GLP1-16HSA, GLP1-19HSA, GLP1-28HSA)를 100 nmol/kg를 S.C. 투여하였다. 비교군으로 GLP-1_C 투여하여 결과를 비교하였다. 약물투여 1시간 후 glucose(1.5 g/kg dose) 를 복강 투여하였다. 투여 후 꼬리로부터 채혈하여 혈당검사기(Accu-check, Roche)를 이용하여 혈당을 측정하였다. 그 결과를 도 18 및 도 19에 나타내었다.

도 18 및 도 19에 나타난 바와 같이, GLP1_C와 GLP1_28HSA은 혈당 변화는 유사한 형태를 보였으며, GLP1_16HSA와 GLP1_19HSA는 혈당 변화가 유사한 형태를 보였으나, 곡선하면적(AUC)는 GLP1_16HSA가 낮은 수치를 보였다. GLP1_C의 낮은 당부하능은 그의 짧은 반감기(3분)에 기인한 것으로 보이며, 높은 당부하능을 보인 GLP1_16HSA와 GLP1_19HSA는 상대적으로 긴 반감기(7.4~8.4시간)에 의한 것이다.

향상된 반감기 및 펩타이드의 높은 활성을 가지는 펩타이드-알부민 컨주게이트를 포함하는 약학적 조성물은 본 실험의 결과를 통하여 혈당강하 용도, 당뇨병 치료 용도, 비만 치료 또는 예방 용도로 사용될 수 있음을 화인하였다.

<110> ProAbtech Co., Ltd. Gwangju Institute of Science and Technology <120> GLP-1 with albumin linked to a specific site <130> CP20-073 <150> KR 10-2020-0042715 <151> 2020-04-08 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDD <400> 1 His Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Thr Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 1 5 10 15 Gln Ala Ala Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Gly Arg Xaa 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> This sequence is as follows within the specification of this application. H-X2-X3-X4-X5-F-T-S-X9-X10-X11-X12-X13-L-X15-X16-Q-A-A-X20-X21-X2 2-I-X-24-X25-L-X26-X27-G-R-X31 <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Glx Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificially modified GLP-1 analogue <400> 3 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Glx Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificially modified GLP-1 analogue <400> 4 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Glx Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificially modified GLP-1 analogue <400> 5 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Glx Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificially modified GLP-1 analogue <400> 6 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Glx Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificially modified GLP-1 analogue <400> 7 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Glx Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificially modified GLP-1 analogue <400> 8 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Glx Ser Ser Glx Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificially modified GLP-1 analogue <400> 9 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Glx Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Glx Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 10 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificially modified GLP-1 analogue <400> 10 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Glx Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Glx Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificially modified GLP-1 analogue <400> 11 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Glx Ser Ser Glx Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificially modified GLP-1 analogue <400> 12 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Glx Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Glx Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificially modified GLP-1 analogue <400> 13 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Glx Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Glx Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 14 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificially modified GLP-1 analogue <400> 14 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Glx Ser Ser Glx Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Glx Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 15 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificially modified GLP-1 analogue <400> 15 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Glx Ser Ser Glx Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Glx Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 16 <211> 585 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 16 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 aaggcacctt taccagcgat tagagtagct atctggaagg 40 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ccttccagat agctactcta atcgctggta aaggtgcctt 40 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gcgatgtgag tagctagctg gaaggtcagg c 31 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gcctgacctt ccagctagct actcacatcg c 31 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gtcaggcggc caaagaatag attgcctggc tggtgc 36 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gcaccagcca ggcaatctat tctttggccg cctgac 36 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gcatcgaagg taggcatggt gaaggcacct ttaccag 37 <210> 24 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ctggtaaagg tgccttcacc atgcctacct tcgatgc 37

Claims

화학식 (I)을 포함하는 펩타이드-알부민 컨주게이트:

[화학식 (I)]
상기 P1은 GLP-1 유사체(GLP-1 analogue), 상기 B는 결합구조, L은 연결 모이어티(linking moiety) 및 상기 P2는 알부민 또는 이의 변이체이고,
- 이 때, 상기 GLP-1 유사체는
(i) 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나, 또는 이와 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열, 및
(ii) 상기 (i)의 아미노산 서열의 10번째, 13번째 또는 22번째 위치에 구조 (I)의 비천연 아미노산(non-natural amino acid)를 포함하고,

[구조 (I)]
이 때, 상기 D는 2가 링커(Bivalent linker), 상기 AA1과 상기 AA2는 비천연 아미노산과 결합되어 있는 아미노산이고,
이 때, 상기 B는 클릭-화학(click-chemistry)에 의해 형성된 결합구조이고,
이 때, 상기 연결 모이어티는 상기 B를 통하여 상기 GLP-1 유사체와 공유적으로 연결됨-;
을 특징으로 하는,
펩타이드-알부민 컨주게이트.
제1 항에 있어서,
상기 D는 결합(a bond), 알킬렌(alkylene), 치환된 알킬렌(substituted alkylene), 헤테로알킬렌(heteroalkylene), 치환된 헤테로알킬렌(substituted heteroalkylene), 아릴렌(arylene), 치환된 아릴렌(substituted arylene), 헤테로아릴렌(heteroarlyene), 치환된 헤테로아릴렌(substituted heteroarylene), 알카릴렌(alkarylene), 치환된 알카릴렌(substituted alkarylene), 헤테로알카릴렌(heteroalkarylene), 치환된 헤테로알카릴렌(substituted heteroalkarylene), 아랄킬렌(aralkylene), 치환된 아랄킬렌(substituted aralkylene), 헤테로아랄킬렌(heteroaralkylene), 및 치환된 헤테로아랄킬렌(substituted heteroaralkylene) 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는,
펩타이드-알부민 컨주게이트.
제1 항에 있어서,
상기 B는

,
,
,
,
,
및
중 선택된 어느 하나이고,
이 때, 상기 A1 또는 상기 A2는 각각 상기 L 또는 상기 D에 연결됨을 특징으로 하는,
펩타이드-알부민 컨주게이트.
제3 항에 있어서,
상기 B는
인 것을 특징으로 하는,
펩타이드-알부민 컨주게이트.
제1 항에 있어서,
상기 연결 모이어티 및 상기 알부민 또는 이의 변이체는 알부민의 시스테인 잔기를 통해 연결된 것을 특징으로 하는,
펩타이드-알부민 컨주게이트.
제1 항에 있어서,
상기 (i)의 아미노산 서열은 서열번호 1이고,
이 때, 상기 X2는 글라이신, 세린 및 D-알라닌 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는,
펩타이드-알부민 컨주게이트.
제6 항에 있어서,
상기 X2는 Gly이고, 및
상기 X10, 상기 X13 및 상기 X22 중 어느 하나는 비천연 아미노산인 것을 특징으로 하는,
펩타이드-알부민 컨주게이트.
제1 항에 있어서,
상기 연결 모이어티는 (C₂H₄O)_n를 포함하고,
이 때, 상기 n은 1 이상의 정수인 것을 특징으로 하는,
펩타이드-알부민 컨주게이트.
제1 항에 있어서,
상기 P2는 인간의 혈청 알부민(Human Serum Albumin, HSA)인 것을 특징으로 하는,
펩타이드-알부민 컨주게이트.
혈당강하용 약학적 조성물로서,
상기 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항의 펩타이드-알부민 컨주게이트, 및 약제학적으로 허용되는 부형제(excipient)를 포함하는,
혈당강하용 약학적 조성물.
인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드로서,
(i) 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나, 또는 이와 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열, 및
(ii) 상기 (i)의 아미노산 서열의 10번째, 13번째 또는 22번째 위치에 구조 (I)의 비천연 아미노산(non-natural amino acid)를 포함하고,

[구조 (I)]
- 이 때, 상기 D는 2가 링커(Bivalent linker), 상기 AA1과 상기 AA2는 비천연 아미노산과 결합되어 있는 아미노산이고,
이 때, 상기 H'은 클릭화학 작용기(click-chemistry functional group)를 포함함 -;
을 특징으로 하는,
인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드.
제 11항에 있어서,
상기 클릭화학 작용기는 말단 알킨, 아자이드, 스트레인된 알킨, 다이엔, 친다이엔체, 알켄, 티올, 노르보넨, 디벤조시클로옥신-아민 및 테트라진 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는,
인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드.
제11 항에 있어서,
상기 클릭화학 작용기는 O-propargly-L-tyrosine(oPa), L-Homopropargylglycine(HPG), 4-Ethynyl-L-phenylalanine hydrochloride(pEthF), p-Azido-L-phenylalanine(AzF), p-ethynyl-phenylalanine(pEPA), O-propargly-L-tyrosine(oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine(pPa) 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는,
인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드.
제11 항에 있어서,
상기 (i)의 아미노산 서열은 서열번호 1이고,
이 때, 상기 X2는 글라이신, 세린 및 D-알라닌 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는,
인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드.
제14 항에 있어서,
상기 X2는 Gly이고, 및
상기 X10, 상기 X13 및 상기 X22 중 어느 하나는 비천연 아미노산인 것을 특징으로 하는,
인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드.
펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트로서,
상기 키트는 (i) 제11 항 내지 제15항 중 어느 한 항의 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드,
-이 때, 상기 펩타이드는 제1 클릭화학 작용기를 포함함 -;
(ii) 알부민 또는 이의 변이체; 및
(iii) 제2 클릭화학 작용기 및 알부민 반응기를 포함하는 링커를 포함하고,
- 이 때, 상기 제2 클릭화학 작용기는 제1 클릭화학 작용기와 특이적으로 반응가능하고,
이 때, 상기 알부민 반응기는 알부민과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있음 -;
을 특징으로 하는,
펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트.
제16 항에 있어서,
상기 링커는 다음의 화학식 (II)를 포함하고,

[화학식 (II)]
이 때, 상기 H''은 상기 제2 클릭화학 작용기이고,
상기 L은 연결 모이어티이고, 및
상기 A는 알부민 반응기인 것을 특징으로 하는,
펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트.
제16 항에 있어서,
상기 링커와 상기 알부민은 알부민의 시스테인 잔기를 통하여 서로 연결될 수 있는 것을 특징으로 하는,
펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트.
제16 항에 있어서,
상기 알부민 반응기는 Maleimide(MAL) 또는 3-arylpropiolonitriles(APN) 인 것을 특징으로 하는,
펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트.
펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트로서,
상기 키트는 (i) 제11 항 내지 제15항 중 어느 한 항의 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드,
-이 때, 상기 펩타이드는 제1 클릭화학 작용기를 포함함 -; 및
(ii) 제2 클릭화학 작용기를 포함하는 링커와 연결된 알부민 또는 이의 변이체
-이 때, 상기 제2 클릭화학 작용기는 제1 클릭화학 작용기와 특이적으로 반응가능함 -;
을 포함하는,
펩타이드-알부민 컨주게이트 제조용 키트.
혈당강하용 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조방법으로서,
(i) 제11 항 내지 제15 항 중 어느 하나의 인슐린 분비 활성을 가진 펩타이드, (ii) 알부민 또는 이의 변이체 및 (iii) 링커를 준비함(preparing),
-이 때, 상기 펩타이드는 제1 클릭화학 작용기를 포함하고,
이 때, 상기 제2 클릭화학 작용기는 제1 클릭화학 작용기와 특이적으로 반응가능하고,
이 때, 상기 알부민 반응기는 알부민과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있음 -;
상기 펩타이드의 상기 제1 클릭화학 작용기와 상기 링커의 제2 클릭화학 작용기가 특이적으로 반응하여 상기 펩타이드와 상기 링커가 서로 연결되도록, 상기 알부민과 상기 링커의 상기 알부민 반응기가 반응하여 상기 알부민과 상기 링커가 서로 연결되도록 유도함(inducing),
- 이로써, 펩티드, 링커 및 알부민이 순차적으로 연결된 펩타이드-알부민 컨주게이트가 형성됨 -;
상기 펩타이드-알부민 컨주게이트를 포함하는 반응 혼합물(a reation mixture)을 얻음(obtaining)을 포함하는,
혈당강하용 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조방법.
제20 항에 있어서,
상기 제조된(prepared) 펩타이드는 상기 아미노산 서열에 융합 단백질 파트너(a fusion protein partner)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는,
혈당강하용 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조방법.
제21 항에 있어서,
상기 링커가 상기 펩타이드 및 상기 알부민 모두에 연결되도록 유도한 뒤,
상기 반응 혼합물을 프로테이즈(protease)로 처리함을 추가로 포함하고,
-이 때, 상기 프로테이즈는 상기 아미노산 서열과 상기 융합 단백질 파트너 사이의 펩타이드 결합(peptide bond)를 절단가능함 -;
상기 융합 단백질 파트너를 포함하지 않는 펩타이드-알부민 컨주게이트를 얻음을 포함하는,
혈당강하용 펩타이드-알부민 컨주게이트 제조방법.