KR20120104459A - 페길화된 엑센딘-4 이량체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 - Google Patents

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이성권
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이슬기
김태형
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Abstract

본 발명은 페길화된 엑센딘-4 이량체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 엑센딘-4의 이량화에 의해 GLP-1 수용체 결합 친화력이 높아져 혈당강하 효과가 향상되고, 페길화에 의해 생체이용률이 높아져 혈당강하 지속력이 향상되므로, 제2형 당뇨병 치료제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

페길화된 엑센딘-4 이량체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물{Mono-PEGylated dimeric exendin-4, preparation method thereof and pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient}
본 발명은 혈당저하 효과 및 저혈당 지속 효과가 향상된 페길화된 엑센딘-4 이량체에 관한 것이다.
글루카곤-유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1, 이하 GLP-1)은 인슐린 분비 자극, 글루카곤 분비 억제, 위 공복 억제, 위 운동 또는 장 운동 억제, 글루코스 사용 증진 및 체중 감량 유도와 같은 다양한 생물학적 효과를 유도한다. 또한, GLP-1은 제 2형 당뇨병인 인슐린 비-의존성 진성 당뇨병(Type Ⅱ diabetes, Non-insulin dependence diabetes mellitus, NIDDM)이 진행됨에 따라 유발되는 췌장 β-세포 퇴화의 예방 및 신생 β-세포의 생성촉진에 의한 인슐린 분비능의 회복 등의 작용을 할 수 있는 것으로 알려져 있다. 특히, GLP-1의 현저한 특성은 인슐린 요법, 또는 인슐린 발현 증가에 의해 작용하는 경구 용법 및 몇몇 유형을 이용하는 경우에 나타나는 저혈당증 관련 위험을 수반하지 않고 인슐린 분비를 자극하는 능력에 있다. 뿐만 아니라, 혈당 강하제인 술폰요소제(sulfonylurea) 등의 장기 복용에 따른 췌장 내 β-세포의 사멸 및 괴사 등의 부작용을 수반하지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서 제 2형 당뇨병의 치료에 있어서 매우 유효한 물질로 생각된다.
그러나, GLP-1 자체의 활성이 불충분하고, 2가지의 절단된 자연 발생 펩티드인 GLP-1(7-37)OH 및 GLP-1(7-36)NH2가 생체 내에서 빠르게 제거되어 생체 내 반감기가 매우 짧다는 사실에 의해 GLP-1 펩티드가 관여하는 요법의 유용성이 제한되어 왔다. 특히, 내생적으로 생성된 디펩티딜 펩디다제 IV(dipeptidyl peptidase-Ⅳ, 이하 DPP-Ⅳ)는 N-말단 히스티딘(7번) 및 알라닌 잔기(8번)를 제거함으로써 GLP-1 펩티드를 불활성화시키며, 이것이 짧은 생체 내 반감기에 대한 주요 원인인 것으로 알려져 있다.
이에, DPP-IV 저해제를 사용하여 GLP-1의 분해를 억제하거나(P93/01, NVP-LAF237, NVP-DPP728, 815541A, 823093, MK-0431 등) GLP-1 수용체 작용물질 또는 GLP-1 유도체를 이용해(엑센딘, 리라글루타이드, GLP-1/CJC-1131 등) 생물학적 활성을 유지하면서 GLP-1 펩티드의 소실 반감기를 연장시키거나, 신체로부터 펩티드 제거율을 감소시키기 위한 다양한 접근법이 시도되고 있다.
한편, 엑센딘은 독도마뱀 또는 구슬도마뱀의 독에서 발견되며 엑센딘-3은 멕시코 구슬도마뱀인 헬로더마 호리덤(Heloderma horridum)의 독에 존재하고, 엑센딘-4는 아메리칸 독도마뱀인 헬로더마 서스펙텀(Heloderma suspectum)의 독에 존재한다. 엑센딘-4는 2번 및 3번 위치에서만 엑센딘-3과 상이하다. 포유동물류에서 DPP-IV에 의한 분해에 대해 저항성을 가지며 DPP-IV에 대해 2분 이하의 반감기를 갖는 GLP-1보다 더 긴 반감기를 갖고 있고, In vivo 실험에서는 2~4시간의 반감기를 나타내며 1일 2~3회 복강투여로 충분한 혈중 농도에 도달할 수 있음이 밝혀진 바 있다. 또한, 엑센딘-4는 위장관 운동성을 조절하고 음식섭취를 감소시켜주며 혈장 글루카곤을 억제한다고 알려져 있는데(미국 등록특허 제6858576호, 제6956026호 및 제6872700호), 엑센딘-4의 혈당조절작용과 관련하여 엑센딘-4 단일요법뿐만 아니라 술포닐우레아 또는 메트포민 등의 항당뇨병 치료제와의 병용요법 모두에서 28일간의 투여 후 1% 범위 내에서 혈액 내 포도당과 결합한 혈색소(헤모글로빈)의 양을 의미하는 당화혈색소(HbA1C)의 수치를 낮추었다고 보고되었다. 최근에는 Byetta™라는 상표로 합성 엑센딘-4가 미국 식품의약품안전청으로부터 시판 허가되었다.
하지만, 엑센딘-4는 생체내 반감기가 4~6시간으로 짧기 때문에 고용량 엑센딘-4의 잦은 투여가 발생하게 되며, 4200 이하의 낮은 분자량 때문에 빠른 시간 안에 배설이 일어나게 되는 문제가 있다.
따라서, 단백질 및 펩티드 약물 방출의 서방화 및 약물의 물리화학적 특성을 변화시켜 지속형 약물을 제조하려는 다양한 시도가 현재 지속적으로 이루어지고 있다. 약물에 화학적 접합을 가하지 않고 서방성을 도입하기 위하여 가장 활발히 이루어지고 있는 기술은 약물을 미립구, 하이드로젤 및 다양한 장치에 도입한 후 이러한 매질로부터 약물이 일정한 속도로 방출하게 하는 것들을 들 수 있다.
한편, 이량화 결합은 종종 자연스럽게 리간드-수용체 결합을 증가시키기 때문에 많은 연구자들이 관심을 가지고 있다. 결과적으로, 몇몇 연구실에서 리간드 및 표적세포 결합이 증진된 물질을 이미 개발하였다. Goel 외 연구자들은 방사능이 표지된 이량화, 사량화 mAb를 개발하였고 이 방사능이 표지된 면역접합체의 분자영상화 능력을 분석했다. 마찬가지로, 이량화 인터페론 - α2b 및 이량화 방사선 치료 항체의 연구도 역시 시도되었다.
또한, 폴리에틸렌글리콜(PEG)는 HO-(-CH2CH2O-)n-H의 구조를 갖는 고분자 화합물로, 친수성이 강하기 때문에 의약 단백질에 결합시켜 그 용해도를 증가시킬 수 있다. 또한 적절하게 결합시키면 효소활성, 수용체 결합과 같은 주요 생물학적 기능들을 유지하면서 수식된 단백질의 분자량을 증가시킴으로써, 신장여과를 감소시키고 외부항원을 인식하는 세포와 항체로부터 단백질을 보호하며 분해효소에 의한 단백질의 분해도 감소시킬 수 있다. 이와 같이 단백질에 결합 가능한 폴리에틸렌글리콜의 분자량 범위는 대략 1,000~100,000으로, 분자량이 1,000 이상일 경우에는 독성이 상당히 낮은 편으로 알려져 있다. 상기 폴리에틸렌글리콜의 분자량 범위가 1,000~6,000인 것은 전신에 분포하고 신장을 통해 대사되면, 특히 분자량 40,000인 폴리에틸렌글리콜은 혈액과 간을 포함한 기관들에 분포되고 대사는 간에서 이루어지는 것으로 알려져 있다.
일반적으로, 비경구(parenteral) 경로를 통해 투여되는 의학적, 약리학적으로 유용한 단백질들은 생체 내에서 항원성을 가지며, 대체로 수용성이 좋지 않고 체내 잔존기간이 짧다는 단점이 있어 이를 극복하고자 하는 연구가 수행되고 있다. 미국 등록특허 제4179337호에서는, 폴리에틸렌글리콜과 결합된 단백질 및 효소 등을 치료제로 사용할 경우, 폴리에틸렌글리콜이 갖는 장점인 항원성의 감소, 수용성의 증가, 체내 잔류 기간 증가 등의 효과를 얻을 수 있음을 개시하고 있다. 이 특허 이후, 생리활성 단백질을 폴리에틸렌글리콜과 결합시켜 그 단점을 극복하고자 하는 시도가 이루어져 왔다. 예를 들면, 베로네즈 등을 리보뉴클레아제(ribonuclease)와 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)를 PEG와 결합시켰으며(Veronese et al., 1985), 미국 등록특허 제4766106호 및 미국 등록특허 제4917888호에서는 단백질들에 PEG를 포함한 폴리머를 결합시켜 단백질의 수용성을 증가시킨 내용을 개시하고 있다. 또한 미국 등록특허 제4902502호에서는 폴리에틸렌글리콜 또는 다른 폴리머들을 재조합 단백질에 결합시켜 항원성을 줄이고 체내 잔존기간을 증가시키는 것에 대해서 개시하고 있다.
본 발명자들은 상술한 엑센딘-4의 단점, 생체내 반감기가 짧고, 배설이 빠르게 일어나는 문제를 해결하기 위하여 연구하던 중, 엑센딘-4의 이량화에 의해 GLP-1 수용체 결합 친화력이 높아져 혈당강하 효과가 향상되고, 페길화에 의해 생체이용률이 높아져 혈당강하 지속력이 향상되는 것을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 혈당강하 효과 및 혈당강하 지속 효과가 향상된 페길화된(PEGylated) 엑센딘-4 이량체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 페길화된 엑센딘-4 이량체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 페길화된 엑센딘-4 이량체를 함유하는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 일반식 1로 표시되는 페길화된 엑센딘-4 이량체를 제공한다:
[일반식 1]
Figure pat00001
(상기 일반식 1에서,
Ex4는 C 말단 부위의 세린(serine) 다음에 시스테인이 도입된 합성 또는 재조합 엑센딘-4이고,
PEG는 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체이고,
L은 상기 Ex4에 도입된 시스테인의 -SH기 및 PEG와 결합할 수 있는 삼분지형 링커(linker)이다).
또한, 본 발명은 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체와 링커를 용매에 첨가하고 반응시켜 페길화된 링커를 제조하는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 제조한 페길화된 링커와 합성 또는 재조합 엑센딘-4를 1:2 반응비로 반응시켜 페길화된 링커에 엑센딘-4 이량체를 결합시키는 단계(단계 2)를 포함하는 상기 페길화된 엑센딘-4 이량체의 제조방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 페길화된 엑센딘-4 이량체를 유효성분으로 함유하는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 페길화된 엑센딘-4 이량체는, 엑센딘-4의 이량화에 의해 GLP-1 수용체 결합 친화력이 높아져 혈당강하 효과가 향상되고, 페길화에 의해 생체이용률이 높아져 혈당강하 지속력이 향상되므로, 제2형 당뇨병 치료제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 이량체 엑센딘-4의 크기 배제 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 PEG 접합 이량체 엑센딘-4의 크기 배제 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 유도체의 크기 배제 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 유도체의 분자량을 MALDI-TOF MS로 측정한 그래프이다.
도 5는 엑센딘-4 유도체들의 GLP-1 수용체 결합친화력을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 유도체들이 신장 현탁액에서 가수분해되는 시간을 역상 크로마토그래피로 측정한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 유도체들이 혈장에서 가수분해되는 시간을 역상 크로마토그래피로 측정한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 유도체들의 혈중 농도 변화를 시간에 따라 측정한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 유도체의 항고혈당 효과를 측정한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 이량체 엑센딘-4의 혈당강하 효과를 측정한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 유도체들의 혈당강하 효과 및 혈당강하 지속력을 측정한 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 유도체들의 혈당강하 효과 및 혈당강하 지속력을 특정범위에서 더욱 상세히 측정한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 일반식 1로 표시되는 혈당강하 효과 및 혈당강하 지속 효과가 향상된 페길화된 엑센딘-4 이량체를 제공한다.
[일반식 1]
Figure pat00002
상기 일반식 1에서,
Ex4는 C 말단 부위의 세린(serine) 다음에 시스테인이 도입된 합성 또는 재조합 엑센딘-4이고,
PEG는 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체이고,
L은 상기 Ex4에 도입된 시스테인의 -SH기 및 PEG와 결합할 수 있는 삼분지형 링커(linker)이다.
상기 페길화된 엑센딘-4 이량체는 일반 엑센딘-4에 비하여, 이량화 결합에 따라 인슐린 분비를 촉진하는 GLP-1 수용체(Glucagon Like Peptide-1 receptor) 결합 친화력이 향상되어 혈당강하 효과가 향상되고, 페길화에 따른 생체이용률이 향상되어 혈당강하 지속 시간이 연장되는 효과가 있는 것이다.
본 발명에 따른 페길화된 엑센딘-4 이량체에 있어서, 상기 일반식 1의 Ex4는 C 말단 부위의 세린(serine) 다음에 시스테인이 도입된 합성 또는 재조합 엑센딘-4(Exendin-4)를 사용할 수 있는데, 이에 제한하지 않는다. 여기서, 상기 Ex4는 인슐린 분비를 촉진하는 GLP-1 수용체에 결합하여 혈당을 강하시키는 역할을 한다. 이때, 엑센딘-4에 도입된 시스테인은 링커의 말레이미드기와 결합하는 역할을 하는데, 시스테인의 -SH기와 말레이미드기의 고리내 이중결합이 끊어지며 결합하게 되는 것이다(하기 화학식 1 및 2 참조). 또한, 엑센딘-4의 C 말단 부위의 세린 다음에 시스테인을 도입한 이유는 엑센딘-4의 N 말단 부위가 인슐린 분비를 촉진하는 GLP-1 수용체에 결합하는 부위라 이를 피하기 위해서이다.
본 발명에 따른 페길화된 엑센딘-4 이량체에 있어서, 상기 일반식 1의 PEG는 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체를 사용할 수 있는데, 엑센딘-4와 함께 링커에 결합하여 생체이용률을 향상시키는 역할을 한다. 상기 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체는 선형 또는 분지형인 것을 사용할 수 있고, 상기 분지형 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체는 1 이상의 측쇄를 갖는 다분지형인 것을 사용할 수 있으며, 상기 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체의 분자량은 15~90 kDa인 것을 사용할 수 있다. 이때, 상기 분자량이 15 kDa 미만인 경우에는 혈당강하 효과 지속력이 크게 향상되지 못하는 문제가 있고, 90 kDa을 초과하는 경우에는 GLP-1 수용체 결합친화력이 저하되어 생물학적 활성이 저하되는 문제가 있다.
구체적으로, 상기 폴리에틸렌글리콜 유도체는 메톡시폴리에틸렌글리콜 숙신이미딜카보네이트, 메톡시폴리에틸렌글리콜 숙신이미딜프로피오네이트, 메톡시폴리에틸렌글리콜 N-히드록시숙신이미드, 메톡시폴리에틸렌글리콜 프로피온알데히드, 메톡시폴리에틸렌글리콜 말레이미드 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 폴리에틸렌글리콜 유도체는 메톡시폴리에틸렌글리콜 숙신이미딜카보네이트이다.
본 발명에 따른 페길화된 엑센딘-4 이량체에 있어서, 상기 일반식 1의 L은 상기 Ex4에 도입된 시스테인의 -SH기 및 PEG와 결합할 수 있는 삼분지형 링커(linker)를 사용할 수 있는데, Ex4 이량체와 PEG를 연결하는 역할을 한다. 상기 링커는 2개의 말레이미드기와 1개의 아민기로 구성되는 하기 화학식 2로 표시되는 비스-말레이미드 아민을 사용하는 것이 바람직하다.
Figure pat00003
상기 화학식 2의 비스-말레이드 아민은 비스-말레이드 아민, TFA 염 형태로 시판되는 것을 사용할 수 있으나 이에 제한하지 않는다.
본 발명에 따른 페길화된 엑센딘-4 이량체에 있어서, 상기 일반식 1로 표시되는 페길화된 엑센딘-4 이량체는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이 가장 바람직하다.
Figure pat00004
상기 화학식 1에서,
Ex4는 화학식 2에서 정의한 바와 같고,
n은 300~2100의 정수이다.
또한, 본 발명은 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체와 링커를 용매에 첨가하고 반응시켜 페길화된 링커를 제조하는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 제조한 페길화된 링커와 합성 또는 재조합 엑센딘-4를 1:2 반응비로 반응시켜 페길화된 링커에 엑센딘-4 이량체를 결합시키는 단계(단계 2)를 포함하는 상기 페길화된 엑센딘-4 이량체의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 하기 반응식 1을 참조로 하여, 단계별로 상세히 설명한다.
[반응식 1]
Figure pat00005

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 1의 용매는 디메틸아미노피리딘이 포함되어 있는 디메틸설폭시드와 디메틸포름아미드 혼합 용매를 사용하는 것이 바람직하나 특별한 제한이 없으며, 당해 기술분야에서 사용되는 완충용액을 사용되는 PEG의 종류에 따라 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 단계 1의 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체는 합성 또는 재조합 엑센딘-4와 함께 링커에 결합되어 생체이용률을 향상시키는 역할을 한다. 상기 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체는 선형 또는 분지형인 것을 사용할 수 있고, 상기 분지형 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체는 1 이상의 측쇄를 갖는 다분지형인 것을 사용할 수 있으며, 상기 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체의 분자량은 15~90 kDa인 것을 사용할 수 있다. 이때, 상기 분자량이 15 kDa 미만인 경우에는 혈당강하 효과 지속력이 크게 향상되지 못하는 문제가 있고, 90 kDa을 초과하는 경우에는 GLP-1 수용체 결합친화력이 저하되어 생물학적 활성이 저하되는 문제가 있다.
구체적으로, 상기 폴리에틸렌글리콜 유도체는 메톡시폴리에틸렌글리콜 숙신이미딜카보네이트, 메톡시폴리에틸렌글리콜 숙신이미딜프로피오네이트, 메톡시폴리에틸렌글리콜 N-히드록시숙신이미드, 메톡시폴리에틸렌글리콜 프로피온알데히드, 메톡시폴리에틸렌글리콜 말레이미드 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 폴리에틸렌글리콜 유도체는 메톡시폴리에틸렌글리콜 숙신이미딜카보네이트이다.
나아가, 상기 단계 1의 링커는 상기 단계 2의 합성 또는 재조합 엑센딘-4의 C 말단 부위의 세린(serine) 다음에 도입된 시스테인의 -SH기 및 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체와 결합할 수 있는 삼분지형 링커(linker)를 사용할 수 있는데, 합성 또는 재조합 엑센딘-4 이량체와 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체를 연결하는 역할을 한다. 상기 링커는 2개의 말레이미드기와 1개의 아민기로 구성되는 상기 화학식 2로 표시되는 비스-말레이미드 아민을 사용하는 것이 바람직하다. 한편, 링커는 비스-말레이드 아민, TFA 염 형태로 시판되는 것을 사용할 수 있으나 이에 제한하지 않는다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 2의 합성 또는 재조합 엑센딘-4는 인슐린 분비를 촉진하는 GLP-1 수용체에 결합하여 혈당을 강하시키는 역할을 한다. 상기 합성 또는 재조합 엑센딘-4를 상기 단계 1에서 제조한 페길화된 링커에 결합시키기 위하여, 엑센딘-4의 C 말단 부위의 세린(serine) 다음에 시스테인을 도입한 것을 사용할 수 있는데, 이에 제한하지 않는다. 이것은 엑센딘-4의 N 말단 부위가 인슐린 분비를 촉진하는 GLP-1 수용체에 결합하는 부위라 이를 피하기 위해서이며, 상기 엑센딘-4에 도입된 시스테인은 링커의 말레이미드기와 결합하는 역할을 하는데, 시스테인의 -SH기와 말레이미드기의 고리내 이중결합이 끊어지며 결합하게 되는 것이다. 또한, 엑센딘-4의 C 말단 부위에 시스테인을 도입한 이유는 엑센딘-4의 N 말단 부위가 인슐린 분비를 촉진하는 GLP-1 수용체에 결합하는 부위라 이를 피하기 위해서이다.
본 발명에 따른 페길화된 엑센딘-4 이량체의 제조방법은 상기 단계 2의 과정 이후에, 미반응물의 제거를 위하여 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법을 추가로 수행할 수 있다. 예를 들면, PBS(phosphate buffered saline) 등과 같은 적당한 완충용액을 사용하여 투석법(dialysis) 등에 의해 미반응물을 제거할 수 있다. 나아가, 분리 정제의 과정을 추가로 수행할 수도 있는데, 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피, 역상 고성능 액체크로마토그래피 등을 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
나아가, 본 발명은 상기 페길화된 엑센딘-4 이량체를 유효성분으로 함유하는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 페길화된 엑센딘-4 이량체는, 엑센딘-4의 이량화에 의해 GLP-1 수용체 결합 친화력이 높아져 혈당강하 효과가 향상되고, 페길화에 의해 생체이용률이 높아져 혈당강하 지속력이 향상되므로, 제2형 당뇨병 치료제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 페길화된 엑센딘-4 이량체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상 투여 시에 하기의 다양한 경구 또는 비경구로 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구투여용 제형으로는 예를 들면, 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
비경구투여용 제형으로는 예를 들면, 피하주사, 정맥주사, 복강내 주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 일반식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양화될 수 있지만, 일반적으로 1주 내지 2주에 수회 투여로도 유효 투여량의 투여가 가능하다. 또한 1일 유효투입량 범위 내에서 하루 한번 또는 여러 번에 나누어 경구 또는 비경구 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서 인용하는 표 및 도면에서,
"Ex4"는 일반 엑센딘-4 단량체이고,
"Ex4-linker"는 링커와 결합된 엑센딘-4 단량체이고,
"Di-Ex4"는 링커와 결합된 엑센딘-4 이량체이고,
"PEG-Ex4"는 페길화된 링커에 결합된 엑센딘-4 단량체이고,
"PEG-Di-Ex4"는 페길화된 링커에 결합된 엑센딘-4 이량체이다.
< 실시예 1> 페길화된 엑센딘 -4 이량체의 제조
시스테인이 도입된 엑센딘-4(엑센딘-Cys, 분자량: 4290.7)는 (주)애니젠(한국, 광주)에서 구입하여 사용하였고, 비스-말레이미드 아민(bisMal-NH2, 분자량: 660.64)는 미국 Quanta Biodesign(Powell, Ohio)에서 구입하여 사용하였으며, 숙시니미딜 활성화 모노메톡시 PEG(분자량: 20 kDa)는 Nektar Therapeutics(Huntsville, AL)에서 구입하여 사용하였다.
하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, PEG 접합 이량체 엑센딘-4는 bisMal-NH2, 엑센딘-4, 그리고 PEG를 결합 반응하는 방법으로 제조하였다.
[반응식 1]
Figure pat00006
구체적으로, 10 mg PEG와 0.3 mg bisMal-NH2를 0.3% 디메틸아미노피리딘이 포함되어 있는 디메틸설폭시드/디메틸포름아미드(70:30) 용액 5 mL에 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 굴절률 차이 물질 검출계와 HPLC를 이용하여 bisMal-PEG와 미반응 bisMal과 PEG를 각각 분리하였다. 그 후 분리된 bisMal-PEG를 pH 7.5 조건으로 맞춘 다음 2 mg의 엑센딘-4-Cys를 넣은 후 1시간 동안 실온 반응시켰다. 그 후 반응을 5 mL 반응종결용액(1% TFA가 들어있은 증류수)으로 종결시켰다. 반응액을 세파덱스 G-25 탈염 컬럼(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA)으로 분리한 후 첫 피크를 Centricon-10으로 농축하였다. 농축된 용액을 Biosep SEC-S2000 컬럼(300×7.8 mm, 5μm, Phenomenex, Torrance, CA)에서 유속 0.75 mL/min으로 분리하였다. 제조된 각 물질은 크기 배재 크로마토그램과 질량분석기로 분석하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
< 비교예 1> 엑센딘 -4 이량체의 제조
시스테인이 도입된 엑센딘-4 및 비스-말레이미드 아민은 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 것을 사용하였다.
하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이, 이량체 엑센딘-4는 bisMal-NH2 가교제(crosslinker)와 엑센딘-4-Cys를 유기용매에서 결합 반응시키는 방법으로 제조하였다.
[반응식 2]
Figure pat00007
구체적으로, 100 μL의 bisMal-NH2(0.3% TEA, DMSO, 1.5 mg/mL)을 100 μL의 엑센딘-4-Cys(0.3% TEA, DMSO, 10 mg/mL)을 반응비 1:2로 실온에 1시간 동안 반응시킨 후 반응을 100 μL 반응종결용액(1% TFA가 들어있은 증류수)으로 종결시켰다. 이량체 엑센딘-4는 반응액을 Capcell-pak RP-18 컬럼(250×10 mm, 5 μm, 시쉐이도, 일본)을 유속 5.0 mL/min으로 하여 자외선 파장 215 nm에서 모니터링하며 역상크로마토그램으로 분리하였다. 이동상은 0.1% TFA 증류수(이동상 A)와 0.1% TFA 아세토니트릴(이동상 B)을 선형 그라디언트법(36-42% B over 30분)을 이용하여 분리하였다. 분리된 피크는 각각 따로 모은 후, 기체 질소를 이용하여 아세토니트릴을 제거하였고, 제거된 용액을 Centricon-10(Mw cut off 3000, Millipore Corp., Billerica, MA)을 이용하여 농축하였다. 제조된 물질은 크기 배재(size-exclusion) 크로마토그램과 질량분석기로 분석하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
< 실험예 1> 엑센딘 -4 이량체 및 페길화된 엑센딘 -4 이량체의 동정
비교예 1 및 실시예 1에서 제조한 엑센딘-4 이량체와 페길화된 엑센딘-4 이량체가 잘 합성되었는지 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 하였다.
구체적으로, 엑센딘-4 유도체들은 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 200 HR 10/30 column, 300×10 mm, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA)로 분석하였으며, 10 mM PBS(pH 7.4)로 0.6 mL/min, 215 nm의 분리 조건에서 실시하였고, 분자량은 MALDI-TOF MS(PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA)로 확인하였다. 더욱 구체적으로, 샘플-매트릭스 1 μL 샘플 용액과 2 μL 매트릭스 용액을 혼합하는 방법으로 준비하였고, 매트릭스 용액은 α-시아노히드록시신남산(α-CHCA)을 0.1%(v/v) TFA를 함유한 물/ACN(50:50) 용액에 용해시키는 방법으로 제조하였다. 준비한 1 μL의 샘플-매트릭스 용액은 샘플 플레이트에 올린 뒤 진공 상태에서 건조시킨 후 분석하였다.
엑센딘-4 이량체의 크기 배제 크로마토그램을 도 1에 나타내었고, 페길화된 엑센딘-4 이량체의 크기 배제 크로마토그램을 도 2에 나타내었다. 도 3에는 각 엑센딘-4 유도체의 크기 배재 크로마토그램을 함께 나타내었다. 도 4에는 각 엑센딘-4 유도체의 정확한 분자량을 MALDI-TOF MS로 측정한 결과를 나타내었다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 이량체의 크기 배제 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 페길화된 엑센딘-4 이량체의 크기 배제 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 유도체의 크기 배제 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 유도체의 분자량을 MALDI-TOF MS로 측정한 그래프이다.
도 1~4에 나타난 바와 같이, 크기 배재 크로마토그램을 통한 각 엑센딘-4 유도체의 정제는 98.5% 이상의 높은 순도를 나타냄을 알 수 있었다.
< 실험예 2> 엑센딘 -4 유도체들의 GLP -1 수용체 결합친화력 분석
비교예 1 및 실시예 1에서 제조한, 엑센딘-4 이량체 및 페길화된 엑센딘-4 이량체의 GLP-1 수용체 결합친화력을 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로, GLP-1 수용체(GLP-1R, Glucose like peptide-1 receptor)를 많이 발현하는 RIN-m5F 세포(ATCC, Manassas, VA)를 12 well 판에 분주한 48시간 후 바인딩 버퍼(120 mM NaCl, 1.2 mM MgSO4, 13 mM sodium acetate, 5 mM KCl, 1.2 g/L Tris, 2 g/L bovine serum albumin, 1.8 g/L glucose, pH 7.6)로 두 번 씻은 후, 표지하지 않은 엑센딘-4 유도체들(최종 농도 범위: 0.001~1000 nM)과 30 pM 농도의 I-125(9-39, PerkinElmer, Boston, MA)로 표지된 엑센딘-4 유도체들을 동시에 처리하였다. 두 시간 경과 후, 1 mg/mL 농도의 소혈청 알부민을 함유한 PBS로 충분히 세척하고, 세포는 세포분해 버퍼(0.5 N NaOH with 1% SDS)로 15 분 동안 충분히 분해시킨 다음, γ카운터 장치로 I-125 방사능 정도를 측정하여 엑센딘-4 유도체들의 GLP-1 수용체 결합친화력을 분석하였다.
상기의 실험 방법에서, 방사성 요오드화시킨 엑센딘-4 유도체들은 IODO-GEN 방법을 약간 수정한 방법으로 준비하였다. 먼저, 100 μL의 수용성 Bolton-Hunter 시약(N-sulfosuccinimidyl-3-4-hydroxyphenyl propionate; 0.13 mg/mL, 36 nmol)을 10 mM PBS(pH 7.0)에 용해시킨 다음 150 μL의 엑센딘-4 용액을(0.5 mg/mL, 18 nmol) 추가한 후 상온 조건에서 90분 동안 충분히 반응시켰으며, 투석하는 방법으로 미반응 시약을 제거하였다. 별도로, 메틸렌클로라이드(0.5 mg/mL)에 용해시킨 100 μL의 IODO-GEN(Pierce, Rockford, IL)을 깨끗한 튜브에 각기 분주한 후 기체 질소를 이용하여 증발시켰다. 그 다음 각각의 샘플 50 μL과 10 mM PBS(pH 7.4) 버퍼로 희석한 50 μCi의 I-125(Perkin-Elmer, Boston, MA)를 추가하였다. 5분간 반응을 시킨 후, 상층액은 10 mM의 PBS로 충진된 세파덱스 G-25 탈염 컬럼(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)으로 분리하였다. I-125는 γ카운터(CobraTM Series Auto-Gamma Counting System, Packard Instruments Co., Groningen, 네덜란드)로 측정하였다. 방사성 요오드화 표지된 샘플 특유의 방사능 범위는 4.8~5.9×105 cpm/μg 이다. 도 5에 상기 실험의 결과를 나타내었다.
도 5는 엑센딘-4 유도체들의 GLP-1 수용체 결합친화력을 나타내는 그래프이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 비교예 1에서 제조한 엑센딘-4 이량체(IC50=0.02±0.12 nM)는 종래의 엑센딘-4(IC50=0.07±0.05 nM) 단량체에 비해 3.5배 높은 GLP-1 수용체 친화력을 나타내었다. 또한, 실시예 1에서 제조한 페길화된 엑센딘-4 이량체(IC50=1.34±0.19 nM)는 페길화된 엑센딘-4 단량체(IC50=4.15±0.14 nM)에 비해 3.1배 높은 GLP-1 수용체 친화력을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 페길화된 엑센딘-4 이량체는 인슐린 분비를 촉진하는 GLP-1 수용체에 잘 결합하므로 당뇨병 치료를 위한 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
< 실험예 3> 엑센딘 -4 유도체들의 가수분해 안정성 평가
비교예 1 및 실시예 1에서 제조한 엑센딘-4 유도체들의 가수분해 안정성을 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 하였다.
구체적으로, 엑센딘-4 유도체들의 가수분해 안정성은 37 ℃, 항온 조건에서 랫트 신장 현탁액과 혈장에서 분해하는 정도를 역상 크로마토그래피로 측정하는 방법으로 평가하였다. 도 6에 랫트의 신장 현탁액에서 엑센딘-4 유도체들의 가수분해에 걸리는 시간을 나타내었고, 도 7에 랫트의 혈장에서 엑센딘-4 유도체들의 가수분해에 걸리는 시간을 나타내었다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 유도체들이 신장 현탁액에서 가수분해되는 시간을 역상 크로마토그래피로 측정한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 유도체들이 혈장에서 가수분해되는 시간을 역상 크로마토그래피로 측정한 그래프이다.
도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 일반 엑센딘-4 단량체의 랫트 신장 현탁액에서 반감기는 1.88±0.04 min으로 급속히 분해되는 반면, 비교예 1에서 제조한 엑센딘-4 이량체는 이보다 약 4.99배 더 안정한 9.38±2.31min의 반감기를 보였으며, 실시예 1에서 제조한 페길화된 엑센딘-4 이량체는 약 57.06배 더 안정한 107.29±11.99 min의 반감기를 나타내었다. 또한, 혈장에서의 엑센딘-4 유도체들의 분해 경향은 신장 현탁액과 비슷한 경향을 나타내었다.
따라서, 본 발명에 따른 페길화된 엑센딘-4 이량체는 가수분해에 걸리는 시간이 일반 엑센디-4에 비하여 현저히 향상되므로 당뇨병 치료를 위한 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
< 실험예 4> 엑센딘 -4 유도체들의 혈중 농도 평가
비교예 1 및 실시예 1에서 제조한 엑센딘-4 유도체들의 혈중 농도가 얼마나 유지되는지 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 하였다.
구체적으로, 실험예 2에서 방사성 요오드화 반응을 시킨 엑센딘-4 유도체들을 ICR 마우스에 2 μg 이하, 25 nmol/kg 이하의 농도로 복강 내 투여하여 진행하였다. 혈중 약물의 방사능을 측정하기 위하여 마우스를 예정된 시간에 희생시키고, 혈액을 심장으로부터 펑크를 내어 채취하였다. 채취한 0.2 mL의 혈액 샘플들을 γ카운터 장치를 이용하여 약물의 혈중 농도를 측정하였다. 측정된 약동학적 파라미터로써 혈중약물농도곡선하면적(AUCinf), 전신 제거율 (Cl/F, systemic clearances) 및 순환 반감기(t 1 /2)는 WinNolin Ver. 1.1 프로그램을 사용하여 확인하였다. 특히, 혈중약물농도곡선하면적(AUCinf) 값은 컴퓨팅 면적 방법, 즉, 영으로부터 무한대에 이르는 사다리꼴 법칙으로 계산하였다. 그 결과를 하기 표 1 및 도 8에 나타내었다.
엑센딘-4 유도체들의 ICR 마우스 내에서의 약동학적 거동
약동학적 파라미터 Ex4 Di-Ex4 PEG-Ex4 PEG-Di-Ex4
AUCinf(ng/mL×h) 109.8±28.4 433.7±36.2 779.1±42.7 1893.7±152.4
Cl/F(mL/h) 9.1±1.7 2.3±0.4 1.2±0.2 0.4±0.1
t 1 /2(h,β) 2.1±0.3 5.6±1.3 11.8±2.7 28.7±2.4
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 유도체들의 혈중 농도 변화를 시간에 따라 측정한 그래프이다.
표 1 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 일반 엑센딘-4 단량체는 순환 반감기(t1 /2)가 2.1±0.3 h으로 빠른 속도로 소실되는 반면에, 비교예 1에서 제조한 엑센딘-4 이량체는 2.66배 증가된 순환 반감기를 나타내었다(t1 /2=5.6±1.3 h). 특히, 실시예 1에서 제조한 페길화된 엑센딘-4 이량체의 순환 반감기는 28.7±2.4 h으로 나타나 일반 엑센딘-4 단량체에 비하여 13.67배나 증가 되는 것으로 나타났다. 또한, 페길화된 엑센딘-4 이량체의 혈중약물농도곡선하면적(AUCinf) 값은 1893.7±152.4 ng/mL×h으로 나타났는데 이는 일반 엑센딘-4 단량체에 비하여 17.25 배나 증가된 것으로 나타났다. 나아가, 엑센딘-4 이량체와 페길화된 엑센딘-4 이량체의 전신 제거율(systemic clearances (Cl/F))은 각각 2.3±0.4, 0.4±0.1 mL/h로 나타났는데, 이는 일반 엑센딘-4(9.1 ± 1.7 mL/h) 단량체에 비하여 3.96배, 22.75배나 감소된 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명에 따른 페길화된 엑센딘-4 이량체는 약동학적 거동이 일반 엑센딘-4 단량체 및 엑섹딘-4 이량체에 비하여 현저히 향상되므로 당뇨병 치료를 위한 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
< 실험예 5> 항고혈당 평가
비교예 1 및 실시예 1에서 제조한 엑센딘-4 유도체들의 항고혈당 효능을 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 하였다.
구체적으로, 18시간 동안 금식시킨 수컷 db/db 제2형 당뇨병 마우스(n=4/그룹, 8-9 주령)에서 경구 포도당 부하검사(OGTT)를 실시하였다. 먼저, 당뇨 마우스에 글루코오스(0.2 mL, 1.0 g/kg body wt.)(0 h)를 투여하기 한 시간 전에, 대조군에는 살린(saline)을, 약물투여 군에는 일반 엑센딘-4 단량체와 비교예 1에서 제조한 엑센딘-4 이량체(25 nmol/kg body wt.)를 각각 복강 내 투여하였다. 혈액 샘플은 각각 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2 및 3 시간 때 꼬리 정맥에서 채취하였으며, 혈중 글루코오스의 농도는 아큐첵 혈당 측정기(ACCU-CHEK® Sensor, Roche Diagnostics Corp., USA)로 측정하였고, 약물의 항고혈당 효능은 total hypoglycemic degrees(그래프에서의 전체 면적 값으로 계산을 하는데 이의 계산방법은 살린을 투여한 0시간부터 3시간까지의 대조군(Control) 그래프의 전체면적 값에서, 각각의 약물을 투여한 0시간부터 3시간까지의 약물투여군 그래프의 전체면적 값을 뺀 결과)의 측정으로 평가하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 유도체의 항고혈당 효과를 측정한 그래프이다.
도 9에 나타난 바와 같이, 혈중 당 농도는 약물을 투여하지 않은 대조군 에서는 글루코오스 투여한 0.25 h 뒤에 급속히 증가하여 28.2 ± 1.9 mmol/L을 나타내었고 그 후로는 천천히 감소되었다. 반면에, 일반 엑센딘-4 단량체와 엑센딘-4 이량체를 투여한 군에서는 대조군 보다 낮은 혈중 당 농도, 즉 일반 엑센딘-4 단량체는 16.3±0.7 mmol/L, 엑센딘-4 이량체는 11.5±0.5 mmol/L(P>0.3)를 나타내었다.
따라서, 본 발명에 따른 엑센딘-4 유도체는 항고혈당 효능이 있을 뿐만 아니라, 일반 엑센딘-4 에 비해 우수한 체내 생물학적 활성을 나타내므로 당뇨병 치료를 위한 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
< 실험예 6> 혈당강하 효과 및 혈당강하 지속력 평가
비교예 1 및 실시예 1에서 제조한 엑센딘-4 유도체들의 혈당강하 효과와 혈당강하 지속력을 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 하였다.
구체적으로, 일반 엑센딘-4 단량체와 엑센딘-4 이량체의 혈당강하 효과는 수컷 db/db 마우스(6-7 주령)를 평가 기간 동안 먹이와 물을 자유롭게 먹는 조건에서 키웠으며 두 가지 농도(5 및 25 nmol/kg)로 복강 내 투여한 것을 제외하고는 실험예 5와 동일한 방법으로 평가하였고, 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.
또한, 엑센딘-4 유도체들의 혈당강하 지속력 평가 방법은 일반 엑센딘-4 단량체, 엑센딘-4 이량체, 페길화된 엑센딘-4 단량체, 페길화된 엑센딘-4 이량체를 5, 25, 250 nmol/kg의 용량으로 복강 내 투여한 후 부동한 시간(0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 108 h)에 따라 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액을 채취한 것을 제외하고는 상기 혈당강하 효과 측정의 방법과 동일하게 실시하여 혈중 글루코오스의 정도를 측정하였고, 추가로 저혈당이 지속되는 시간을 도 12에서 혈당 글루코스 수치가 8.35 nmol/L까지 반등되는데 걸린 시간으로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2, 도 11 및 도 12에 나타내었다.
투여 용량에 따른 혈당강하 효과 및 혈당강하 지속력
약동학적 파라미터 Ex4 Di-Ex4 PEG-Ex4 PEG-Di-Ex4
HDtotal(5 nmol/kg)(mmol×h/L) 77.3±18.2 161.2±27.7 - -
HDtotal(25 nmol/kg)(mmol×h/L) 306.3±86.3 504.1±108.9 640.2±124.2 1427.6±187.4
HDtotal(250 nmol/kg)(mmol×h/L) - - - 1894.9±193.3
혈당강하유지시간(h)(25nmol/kg) 7.3 15.0 16.9 40.1
혈당강하유지시간(h)(250nmol/kg) - - - 76.3
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 이량체 엑센딘-4의 혈당강하 효과를 측정한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 유도체들의 혈당강하 효과 및 혈당강하 지속력을 측정한 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 엑센딘-4 유도체들의 혈당강하 효과 및 혈당강하 지속력을 특정범위에서 더욱 상세히 측정한 그래프이다.
표 2 및 도 10~12에 나타난 바와 같이, 엑센딘-4 이량체의 혈당 강하 효과는 낮은 농도인 5 nmol/kg로 투여하였을 시 가장 낮은 글루코스 수치가 8.7±0.5 mmol/L(P>0.2)로서 일반 엑센딘-4 단량체를 투여한 군 12.6±0.4 mmol/L보다 더 낮은 수치를 나타내어, 일반 엑센딘-4 단량체에 비해 비교예 1에서 제조한 엑센딘-4 이량체의 혈당강하 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 25 nmol/kg의 농도로 투여하였을 시 엑센딘-4 이량체와 페길화된 엑센딘-4 이량체의 HDtotal 값은 각각 504.1±108.9, 1427.6±187.4 mmol×h/L(P< 0.005)로서 이는 일반 엑센딘-4(306.3±86.3 mmol×h/L) 단량체에 비해 1.65, 4.66 배 낮은 혈당 수치를 나타내었다.
나아가, 혈당강하 지속 시간 역시 일반 엑센딘-4 단량체에 비해 길었으며 8.35 mmol/L의 정상 혈당 수치까지 반등 되는데 걸리는 시간은 엑센딘-4 이량체와 페길화된 엑센딘-4 이량체가 각각 15.0 h 와 40.1 h로서 이는 일반 엑센딘-4 단량체를 투여한 군(7.3 h)에 비해 각각 2.05배, 5.49배 더 오래 정상 혈당 수치를 유지하는 것으로 나타났다. 특히, 페길화된 엑센딘-4 이량체를 고농도(250 nmol/kg)로 투여한 군에서 정상 혈당 수치까지 반등 되는데 걸리는 시간이 76.3 h로 나타나 페길화된 엑센딘-4 이량체의 투여로 혈중 글루코오스를 약 3일까지 안정하게 관리할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 페길화된 엑센딘-4 이량체는 일반 엑센딘-4 단량체에 비하여 혈당저하 효과가 우수할 뿐만 아니라, 혈당강하 지속시간 역시 더욱 연장되므로 당뇨병 치료를 위한 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 조성물을 이용한 제제예를 예시한다.
< 제제예 1> 산제의 제조
일반식 1의 화합물 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
< 제제예 2> 정제의 제조
일반식 1의 화합물 100 mg
옥수수 전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.
< 제제예 3> 캡슐제의 제조
일반식 1의 화합물 100 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
< 제제예 4> 주사액제의 제조
일반식 1의 화합물 10 ㎍/㎖
묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지
주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖
적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 일반식 1의 화합물을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

Claims (16)

  1. 하기 일반식 1로 표시되는 페길화된 엑센딘-4 이량체:
    [일반식 1]
    Figure pat00008

    (상기 일반식 1에서,
    Ex4는 C 말단 부위의 세린(serine) 다음에 시스테인이 도입된 합성 또는 재조합 엑센딘-4이고,
    PEG는 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체이고,
    L은 상기 Ex4에 도입된 시스테인의 -SH기 및 PEG와 결합할 수 있는 삼분지형 링커(linker)이다).
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체는 선형 또는 분지형인 것을 특징으로 하는 페길화된 엑센딘-4 이량체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 분지형 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체는 1 이상의 측쇄를 갖는 다분지형인 것을 특징으로 하는 페길화된 엑센딘-4 이량체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체의 분자량은 15~90 kDa인 것을 특징으로 하는 페길화된 엑센딘-4 이량체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 유도체는 메톡시폴리에틸렌글리콜 숙신이미딜카보네이트, 메톡시폴리에틸렌글리콜 숙신이미딜프로피오네이트, 메톡시폴리에틸렌글리콜 N-히드록시숙신이미드, 메톡시폴리에틸렌글리콜 프로피온알데히드 및 메톡시폴리에틸렌글리콜 말레이미드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 페길화된 엑센딘-4 이량체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 링커는 2개의 말레이미드기와 1개의 아민기로 구성되는 하기 화학식 2로 표시되는 비스-말레이미드 아민인 것을 특징으로 하는 페길화된 엑센딘-4 이량체:
    [화학식 2]
    Figure pat00009
    .
  7. 제1항에 있어서, 상기 일반식 1로 표시되는 페길화된 엑센딘-4 이량체는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 페길화된 엑센딘-4 이량체:
    [화학식 1]
    Figure pat00010

    (상기 화학식 1에서,
    Ex4는 제1항에서 정의한 바와 같고,
    n은 300~2100의 정수이다).
  8. 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체와 링커를 용매에 첨가하고 반응시켜 페길화된 링커를 제조하는 단계(단계 1);
    상기 단계 1에서 제조한 페길화된 링커와 합성 또는 재조합 엑센딘-4를 1:2 반응비로 반응시켜 페길화된 링커에 엑센딘-4 이량체를 결합시키는 단계(단계 2)를 포함하는 제1항의 페길화된 엑센딘-4 이량체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 단계 1의 용매는 디메틸아미노피리딘이 포함되어 있는 디메틸설폭시드와 디메틸포름아미드 혼합 용매인 것을 특징으로 하는 페길화된 엑센딘-4 이량체의 제조방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 단계 1의 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체는 선형 또는 분지형인 것을 특징으로 하는 페길화된 엑센딘-4 이량체의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 분지형 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체는 1 이상의 측쇄를 갖는 다분지형인 것을 특징으로 하는 페길화된 엑센딘-4 이량체의 제조방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체의 분자량은 15~90 kDa인 것을 특징으로 하는 페길화된 엑센딘-4 이량체의 제조방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 유도체는 메톡시폴리에틸렌글리콜 숙신이미딜카보네이트, 메톡시폴리에틸렌글리콜 숙신이미딜프로피오네이트, 메톡시폴리에틸렌글리콜 N-히드록시숙신이미드, 메톡시폴리에틸렌글리콜 프로피온알데히드 및 메톡시폴리에틸렌글리콜 말레이미드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 페길화된 엑센딘-4 이량체.
  14. 제8항에 있어서, 상기 단계 1의 링커는 2개의 말레이미드기와 1개의 아민기로 구성되는 하기 화학식 2로 표시되는 비스-말레이미드 아민인 것을 특징으로 하는 페길화된 엑센딘-4 이량체:
    [화학식 2]
    Figure pat00011
    .
  15. 제8항에 있어서, 상기 단계 2의 엑센딘-4는 C 말단 부위의 세린(serine) 다음에 시스테인이 도입된 합성 또는 재조합 엑센딘-4인 것을 특징으로 하는 페길화된 엑센딘-4 이량체의 제조방법.
  16. 제1항의 페길화된 엑센딘-4 이량체를 유효성분으로 함유하는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
KR1020110020934A 2011-03-09 2011-03-09 페길화된 엑센딘-4 이량체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 KR20120104459A (ko)

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