KR102161728B1

KR102161728B1 - 다중 효소 결합체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 유기물 제조방법

Info

Publication number: KR102161728B1
Application number: KR1020190046513A
Authority: KR
Inventors: 권인찬; 조진환; 임성인
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2019-04-22
Filing date: 2019-04-22
Publication date: 2020-10-06
Also published as: KR20190045116A

Abstract

본 발명은 다중 효소 결합체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 유기물 제조방법에 관한 것으로서, 상세하게는 효소들에 클릭 반응이 가능한(clickable) 비천연 아미노산의 위치 특이적 결합과 호환 가능한(compatible) 두 클릭 반응을 이용하여, 자유 효소들 각각에 비해 향상된 촉매 효능을 보이는 다중 효소 결합체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 유기물의 제조방법을 제공할 수 있다.

Description

다중 효소 결합체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 유기물 제조방법{Enzyme conjugate, the process thereof, a process of preparing organic compound by using the same}

본 발명은 다중 효소 결합체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 유기물 제조방법에 관한 것이다.

자연적으로, 한 대사경로 내의 여러 효소들은 중간 채널링 효과(intermediate channelling effect)를 통한 단계적 연쇄반응(cascade reaction)을 효율적으로 촉진시키기 위하여 효소결합체를 종종 형성한다. 마찬가지로, 다중 효소의 공유결합 커플링은 부가가치가 높은 화학약품의 생산을 위한 효소 반응 효율 향상을 위한 매우 유망한 전략으로 간주된다(비특허문헌 1).

아민 또는 티올 그룹을 이용하여 효소의 공유결합 커플링 및 유전적 융합이 다중 효소 결합체를 형성하기 위해 활용되어 왔지만(비특허문헌 2), 이러한 기술들은 연결 부위 및 가교 공정에 대한 조절이 어려웠다. 여러 부위에서의 커플링은 다양한 구성을 갖는 효소 결합체의 혼합물을 필연적으로 생성시킨다(비특허문헌 3). 게다가, 효소 활성 부위의 결합은 필시 촉매 활성을 절충시킨다. 연결 부위와 효소 결합체 구조에 대한 조절을 향상시키기 위하여, DNA 골격(scaffold)의 공동 고정화(co-immobilization), 비천연 아미노산의 잔기 특이적 결합(residue-specific incorporation), 및 효소 매개 결합과 같은 몇 가지 명쾌한 접근법이 개발되어 왔다(비특허문헌 1; 4; 5). 그러나, 여전히 연결 부위 선택에서 몇몇의 제한이 남아있는 실정이다.

따라서, 본 발명자는 효소들에 클릭 반응이 가능한(clickable) 비천연 아미노산의 위치 특이적 결합과 호환 가능한(compatible) 두 클릭 반응을 이용하여, 자유 효소들 각각에 비해 향상된 촉매 효능을 보이는 다중 효소 결합체를 제조할 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

비특허문헌 1. S. Schoffelen and J. C. van Hest, Curr. Opin. Struct. Biol., 2013, 23, 613??621. 비특허문헌 2. A. H. Elcock and J. A. McCammon, Biochemistry, 1996, 35, 12652??12658. 비특허문헌 3. E. Steen Redeker, D. T. Ta, D. Cortens, B. Billen, W. Guedens and P. Adriaensens, Bioconjugate Chem., 2013, 24, 1761??1777. 비특허문헌 4. J. Shimada, T. Maruyama, M. Kitaoka, H. Yoshinaga, K. Nakano, N. Kamiya and M. Goto, Chem. Commun., 2012, 48, 6226??6228. 비특허문헌 5. S. Schoffelen, J. Beekwilder, M. F. Debets, D. Bosch and J. C. M. v. Hest, Bioconjugate Chem., 2013, 24, 987??996.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 고려하여 안출된 것으로, 효소들에 클릭 반응이 가능한(clickable) 비천연 아미노산의 위치 특이적 결합과 호환 가능한(compatible) 두 클릭 반응을 이용하여, 자유 효소들 각각에 비해 향상된 촉매 효능을 보이는 다중 효소 결합체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 유기물의 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.

위와 같은 과제 해결을 위해서, 본 발명은 제1 효소-링커와 제2 효소-링커의 결합체를 포함하는 다중 효소 결합체를 제공한다.

또한 본 발명은 제1 효소-링커와 제2 효소-링커를 결합시키는 단계를 포함하는 다중 효소 결합체의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 다중 효소 결합체를 이용하여 다중 효소 연쇄단계(cascade) 반응을 수행하는 단계를 포함하는 유기물 합성방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 효소들에 클릭 반응이 가능한(clickable) 비천연 아미노산의 위치 특이적 결합과 호환 가능한(compatible) 두 클릭 반응을 이용하여, 자유 효소들 각각에 비해 향상된 촉매 효능을 보이는 다중 효소 결합체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 유기물의 제조방법을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 위치 특이성을 갖는 다중 효소 결합체의 결합 과정을 나타낸 모식도로, 도 1A는 두 직교성(orthogonal) 화학 반응인, SPAAC(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition) 및 IEDDA(an inverse electrondemand Diels-Alder reaction) 과정을 나타낸 모식도, 도 1B는 상기 도 1A의 두 직교성 화학 반응을 통하여 다중 효소 결합체를 형성하는 과정을 나타낸 모식도, 도 1C는 FDH(formate dehydrogenase, 개미산전환요소) 및 MDH(mannitol dehydrogenas, 만니톨전환효소)를 이용한 연쇄단계 반응을 나타낸 모식도이다.
도 2의 도 2A는 AZF(p-아지도-L-페닐알라닌)의 유전적 융합에 대한 모식도로서, 도 2A의 왼쪽 모식도에서 보조인자(cofactor, 파란색)를 함유하는 결합체 내의 FDH 이량체는 단백질 정보은행(PDB ID: 3WR5)으로부터 유래되었고, AZF 결합 부위인 V237(237번 위치의 발린)은 마젠타색으로 표시하였다. 도 2A의 오른쪽 모식도에서 보조인자(cofactor, 파란색)를 함유하는 결합체 내의 MDH는 단백질 정보은행(PDB ID: 1LJ8)으로부터 유래되었고, AZF 결합 부위인 V417(417번 위치의 발린)은 마젠타 색으로 표시하였다. 도 2B는 야생형 FDH(FDH-WT), 야생형 MDH(MDH-WT), 및 이들의 변종(FDH-AZF, MDH-AZF)에 대한 말디-도프(MALDI-TOF) 질량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3으로부터 합성된 FDH-MDH 결합체의 형성 과정 및 본 발명의 실시예 3으로부터 합성된 FDH-MDH 결합체와 실시예 1로부터 제조된 야생형 FDH(FDH-WT), 야생형 MDH(MDH-WT)의 크기 특성에 관한 것으로, 도 3A는 AZF 및 DBCO 유래 이기능성 링커의 화학적 구조를 나타낸 모식도, 도 3B는 IEDDA를 통하여 생성된 FDH-MDH 결합체의 구조를 나타낸 모식도, 도 3C는 크기배제 크로마토그래피를 통하여 FDH-MDH 결합체, 야생형 FDH(FDH-WT) 및 야생형 MDH(MDH-WT)의 크기를 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 3으로부터 합성된 FDH-MDH 결합체의 효소 활성에 관한 것으로, 도 4A는 AZF 결합이 본래 활성(native activity)에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 변종들을 야생형 효소와 비교하여 효소활성 분석한 결과 그래프, 도 4B는 FDH-MDH 결합체 및 자유효소에 대한 D-만니톨 (mannitol) 생산 활성을 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 FDH(FDH-WT), 야생형 MDH(MDH-WT), 및 이들의 변종(FDH-AZF, MDH-AZF)의 DBCO-PEG4-카복시로다민 반응에 대한 인-젤 형광(in-gel fluorescence) 분석 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 3으로부터 합성된 FDH-MDH 결합체(FDH monomer to MDH), 불순물(impurity), MDH 및 FDH 단량체(monomer)의 SDS-PAGE 분석 결과 그래프이다[레인 1: 결합반응 혼합물; 레인 2: 정제 FDH-MDH 복합체].
도 7은 본 발명의 실시예 3으로부터 합성된 FDH-MDH 결합체, 자유 FDH, 및 자유 MDH 존재하의 만니톨 농도 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실시예 3으로부터 합성된 FDH-MDH 결합체 및 자유 효소(free enzymes)에 의한 만니톨 생산 결과를 나타낸 그래프이다. 도 8A는 3 nM MDH 활성 또는 자유 FDH 및 MDH(3.3 nM 이량체 FDH 및 3 nM MDH)의 유사량에 상응하는 FDH-MDH 복합체를 500 μM NAD+ 및 50 mM의 포름산염과 D-프룩토스 (fructose, 과당) 존재 하에 다중-효소 단계적 연쇄반응을 시킨 후, d-만니톨 생산물의 농도를 반응 시작 3 및 6 시간 후에 측정한 결과 그래프, 도 8B는 10 nM MDH 활성 또는 자유 FDH and MDH(11 nM 이량체 FDH 및 10 nM MDH)의 유사량에 상응하는 FDH-MDH 복합체의 동일한 다중-효소 단계적 연쇄 반응을 시킨 후 만니톨 생산물의 농도를 반응 시작 3 및 6 시간 후에 측정한 결과 그래프이다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현 예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

본 발명의 일 측면은 제1 효소-링커와 제2 효소-링커의 결합체를 포함하는 다중 효소 결합체로서; 상기 제1 효소-링커는 제1 개질 효소와 제1 링커의 결합체이고, 상기 제1 개질 효소는 (i) 제1 효소와 (ii) 제1-1 클릭 반응기를 포함하는 제1 비천연 아미노산(non-natural amino acids, NNAAs)을 하나 이상 포함하고, 상기 제1 비천연 아미노산은 상기 제1 효소의 제1 효소 잔기에 위치 특이적으로 결합되어 있으며, 상기 제1 링커는 제1-2 클릭 반응기와 제2-1 클릭 반응기를 포함하고, 상기 제1 효소-링커는 제1 개질 효소의 상기 제1-1 클릭 반응기와 상기 제1 링커의 상기 제1-2 클릭 반응기가 제1 클릭 반응하여 결합된 결합체이며; 상기 제2 효소-링커는 제2 개질 효소와 제2 링커의 결합체이고, 상기 제2 링커는 제2-2 클릭 반응기와 제3-1 클릭 반응기를 포함하고, 상기 제2 개질 효소는 (i) 제2 효소와 (ii) 제3-2 클릭 반응기를 포함하는 제2 비천연 아미노산을 하나 이상 포함하고, 상기 제2 비천연 아미노산은 상기 제2 효소의 제2 효소 잔기에 위치 특이적으로 결합되어 있으며, 상기 제2 효소-링커는 상기 제2 링커의 상기 제3-1클릭 반응기와 상기 제2 개질 효소의 상기 제3-2 클릭 반응기가 제3 클릭 반응하여 결합된 결합체이며; 상기 제1 효소-링커와 상기 제2 효소-링커의 결합체는 상기 제1 링커의 상기 제2-1 클릭 반응기와 상기 제2 링커의 상기 제2-2 클릭 반응기가 제2 클릭 반응하여 결합된 결합체인 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체에 관한 것이다.

본 발명에서 효소 사이에 링커를 위치시킴으로써 효소 사이의 거리를 조절할 수 있고, 링커의 길이와 그 특성을 변화시킴으로써 전체 결합체의 유연성, 용해도, 가역성(reversibility)을 조절할 수 있는 장점이 있다.

본 발명에 있어서, "효소 잔기에 위치 특이적으로 결합"된다는 의미는 해당 효소 잔기에만 결합되고 다른 부위에는 결합되지 않는다는 의미이다.

일 구현예에 따르면, 제1 효소 반응과 제2 효소 반응을 포함하고 상기 제1 효소 반응의 생성물이 상기 제2 효소 반응의 반응물로 사용되는 다중 효소 연쇄단계 반응에서, 상기 제1 효소는 상기 제1 효소 반응의 생촉매로 작용하고, 상기 제2 효소는 상기 제2 효소 반응의 생촉매로 작용한다.

본 발명에 적용 가능한 다중 효소 연쇄단계 반응은 특별히 한정되지 않으며, 출원 전 공지 문헌인 Ricca, Emanuele, Birgit Brucher, and Joerg H. Schrittwieser. "Multi??enzymatic cascade reactions: overview and perspectives." Advanced Synthesis & Catalysis 353.13 (2011): 2239-2262 등에 기재되어 있는 반응들을 포함한다.

다른 구현예에 따르면, 상기 제1 효소와 상기 제2 효소는 각각 FDH와 MDH, MDH와 FDH; FDH와 ADH, ADH와 FDH; NOX와 ADH, ADH와 NOX; LDH와 HSDH, HSDH와 LDH; GDM와 7β-HSDH, 7β-HSDH와 GDM; ADH와 할로히드린 디할로제나제, 할로히드린 디할로제나제와 ADH; GDH와 케토리덕타제, 케토리억타제와 GDH; BVMO와 ADH, ADH와 BVMO; LDH와 AlaDH, AlaDH와 LDH; FDH와 PheDH, PheDH와 FDH; NOX와 LeuDH, LeuDH와 NOX; FDH와 LeuDH, LeuDH와 FDH; GOT와 TA, TA와 GOT; FDH와 AlaDH, AlaDH와 FDH; FDH와 GluDH, GluDH와 FDH 중에서 선택된 1쌍이다.

본 발명에 있어서, FDH(formate dehydrogenase)는 개미산 전환효소를 의미하고, MDH(mannitol dehydrogenas)는 만니톨 전환효소를 의미하며, ADH(alcohol dehydrogenase)는 알코올 분해 효소를 의미하고, NOX는 NADH 옥시다제를 의미하며, LDH(Lactate Dehydrogenase)는 아세트알데히드 분해 효소를 의미하고, HSDH (hydroxysteroid dehydrogenase)는 히드록시스테로이드 탈수소 효소를 의미하며, GDM(glutamate dehydrogenase)는 글루탐산탈수소효소를 의미하고, GDH(glucose dehydrogenase)는 포도당 분해 효소를 의미하며, BVMO는 Baeyer-Villiger 모노옥시제나제를 의미하고, AlaDH는 알라닌 디하이도로제나제를 의미하며, PheDH는 페닐알라닌 디하이드로제나제를 의미하고, LeuDH는 L-루신 디하이드로제나제를 의미하며, TA는 α-트랜스아미나제를 의미한다.

특히, 상기 HSDH는 7α-HSDH 또는 12α-HSDH이고, 상기 TA는 (4-AB:2-KG)TA이다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 제1 효소 잔기와 상기 제2 효소 잔기는 서로 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 페닐알라닌, 트립토판, 발린 중에서 선택된 1종 이상의 소수성 측쇄를 포함한다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 제1 효소 잔기와 상기 제2 효소 잔기는 용매 접근도가 0.4 내지 1이다. 본 발명에 있어서, "용매 접근도"는 ASA-View web-based program으로 측정되는 ASA 값을 의미한다. 만일 용매 접근도가 0.4 미만이면 링커의 결합률이 낮을 수 있어 바람직하지 않다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 제1-1 클릭 반응기를 포함하는 제1 비천연 아미노산과 상기 제3-2 클릭 반응기를 포함하는 제2 비천연 아미노산은 서로 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 p-아지도-L-페닐알라닌(AzF), p-에티닐-페닐알라닐(pEthF), p-프로파르길록시페닐알라닌(pPa) 중에서 선택된다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 제1 효소와 상기 제2 효소는 각각 FDH와 MDH이고, 상기 제1 효소 잔기와 상기 제2 효소 잔기는 각각 237번 위치의 발린과 417번 발린이다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 제2 클릭 반응은 상기 제1 클릭 반응과도 서로 직교성(orthogonal) 화학 반응이고, 상기 제3 클릭 반응과도 서로 직교성 화학 반응이다.

본 발명에 있어서 "직교성 화학 반응(orthogonal chemical reactions)"이란 서로의 반응에 전혀 영향을 미치지 않고 서로 독립적으로 일어나는 반응을 의미한다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 제1 클릭 반응과 상기 제2 클릭 반응은 각각 SPAAC와 IEDDA, IEDDA와 SPAAC; SPAAC와 카르보닐 리게이션, 카르보닐 리게인션과 SPAAC; IEDDA와 카르보닐 리게이션, 카르보닐 리게이션과 IEDDA; 카르보닐 리게인션과 광활성 리게이션, 광활성 리게이션과 카르보닐 리게이션 등과 같이 서로 직교성인 반응 쌍 중에서 선택된 1쌍이다.

또 다른 구현예에 따르면, SPAAC는 스트레인 프로모티드된 아지드-알킨 고리 첨가 반응(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition)을 의미하고, IEDDA는 역 전자-요구 디엘스-알더 반응(reverse electron-demand Diels-Alder reaction)을 의미하며, CuAAC는 구리 촉매 아지드-알킨 고리 첨가 반응을 의미한다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 제1-1 클릭 반응기와 상기 제1-2 클릭 반응기; 제3-1 클릭 반응기와 상기 제3-2 클릭 반응기는 각각 아지도기(N₃)와 스트레인 프로모티드된(strain-promoted) 알킨기(C≡C), 스트레인 프로모티드된 알킨기와 아지도기; 아지도기와 알킨기, 알킨기와 아지도기; 테트라진기와 trans-시클로옥텐, trans-시클로옥텐과 테트라진기; 알데하이드와 아미노옥시, 아미노옥시와 알데하이드; 알데하이드와 하이드라진, 하이드라진과 알데하이드; 케톤과 아미노옥시, 아미노옥시와 케톤; 케톤과 하이드라진, 하이드라진과 케톤; 테트라졸과 알킨기, 알킨기와 테트라졸 중에서 선택된 1쌍이다.

제2-1 클릭 반응기와 상기 2-2 클릭 반응기는 미리 선택된 제1-1 클릭 반응, 제1-2 클릭 반응기, 제3-1 클릭 반응기, 제3-2 클릭 반응기와 결합력이 없는 반응기여야 되는데 각각 아지도기(N₃)와 스트레인 프로모티드된(strain-promoted) 알킨기(C≡C), 스트레인 프로모티드된 알킨기와 아지도기; 아지도기와 알킨기, 알킨기와 아지도기; 테트라진기와 trans-시클로옥텐; trans-시클로옥텐과 테트라진기; 알데하이드와 아미노옥시; 아미노옥시와 알데하이드; 알데하이드와 하이드라진; 하이드라진과 알데하이드; 케톤과 아미노옥시; 아미노옥시와 케톤; 케톤과 하이드라진; 하이드라진과 케톤; 테트라졸과 알킨기; 알킨기와 테트라졸 중에서 선택된 1쌍이다.

또 다른 구현예에 따르면, 스트레인 프로모티드된 알킨기는 시클로옥틴기이다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 제1-1 클릭 반응기와 상기 제1-2 클릭 반응기는 각각 테트라진기 및 trans-시클로옥텐 (trans-시클로옥텐 및 테트라진기)이고; 상기 제3-1 클릭 반응기와 상기 제3-2 클릭 반응기는 각각 테트라진기 및 trans-시클로옥텐 (trans-시클로옥텐 및 테트라진기)이며; 상기 제2-1 클릭 반응기와 상기 2-2 클릭 반응기는 각각 아지도기 및 알킨기(C≡C) (또는 알킨기 및 아지도기)이다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 제1-1 클릭 반응기와 상기 제1-2 클릭 반응기는 각각 아지도기 및 알킨기(C≡C) (또는 알킨기 및 아지도기)이고; 상기 제3-1 클릭 반응기와 상기 제3-2 클릭 반응기는 각각 아지도기 및 알킨기(C≡C) (또는 알킨기 및 아지도기)이며; 상기 제2-1 클릭 반응기와 상기 2-2 클릭 반응기는 각각 테트라진기 및 trans-시클로옥텐 (trans-시클로옥텐 및 테트라진기)이다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 제1-1 클릭 반응기와 상기 제1-2 클릭 반응기는 각각 아지도기 및 알킨기이고; 상기 제3-1 클릭 반응기와 상기 제3-2 클릭 반응기는 각각 알킨기 및 아지도기이며; 상기 제2-1 클릭 반응기와 상기 2-2 클릭 반응기는 각각 테트라진기 및 trans-시클로옥텐이다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 제1 개질 효소는 FDH-AzF이고, 상기 제1 링커는 양 말단이 DBCO와 테트라진이며, 상기 제2 링커는 양 말단이 DBCO와 TCO이고, 상기 제2 개질 효소는 MDH-AzF이다.

본 발명에 있어서, DBCO는 디벤조시클로옥틴을 의미하며, TCO는 trans-시클로옥텐을 의미한다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 제1 링커는 하기 구조의 화합물이고,

상기 제2 링커는 하기 구조의 화합물이다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 다중 효소 결합체는 하기 구조를 갖는다.

본 발명의 다른 측면은 (C) 제1 효소-링커와 제2 효소-링커를 결합시키는 단계를 포함하는 다중 효소 결합체의 제조방법으로서; 상기 제1 효소-링커는 제1 개질 효소와 제1 링커의 결합체이고, 상기 제1 개질 효소는 (i) 제1 효소와 (ii) 제1-1 클릭 반응기를 포함하는 제1 비천연 아미노산을 하나 이상 포함하고, 상기 제1 비천연 아미노산은 상기 제1 효소의 제1 효소 잔기에 위치 특이적으로 결합되어 있으며, 상기 제1 링커는 제1-2 클릭 반응기와 제2-1 클릭 반응기를 포함하고, 상기 제1 효소-링커는 제1 개질 효소의 상기 제1-1 클릭 반응기와 상기 제1 링커의 상기 제1-2 클릭 반응기가 제1 클릭 반응하여 결합된 결합체이며; 상기 제2 효소-링커는 제2 개질 효소와 제2 링커의 결합체이고, 상기 제2 링커는 제2-2 클릭 반응기와 제3-1 클릭 반응기를 포함하고, 상기 제2 개질 효소는 (i) 제2 효소와 (ii) 제3-2 클릭 반응기를 포함하는 제2 비천연 아미노산을 하나 이상 포함하고, 상기 제2 비천연 아미노산은 상기 제2 효소의 제2 효소 잔기에 위치 특이적으로 결합되어 있으며, 상기 제2 효소-링커는 상기 제2 링커의 상기 제3-1클릭 반응기와 상기 제2 개질 효소의 상기 제3-2 클릭 반응기가 제3 클릭 반응하여 결합된 결합체이며; 상기 (C) 단계는 상기 제1 링커의 상기 제2-1 클릭 반응기와 상기 제2 링커의 상기 제2-2 클릭 반응기를 제2 클릭 반응시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 (B1) 제1 개질 효소와 제1 링크를 결합시켜 제1 효소-링크를 수득하는 단계, (B2) 제2 개질 효소와 제2 링크를 결합시켜 제2 효소-링크를 수득하는 단계, (C) 상기 제1 효소-링커와 상기 제2 효소-링커를 결합시키는 단계를 포함하는 다중 효소 결합체의 제조방법으로서; 상기 제1 개질 효소는 (i) 제1 효소와 (ii) 제1-1 클릭 반응기를 포함하는 제1 비천연 아미노산을 하나 이상 포함하고, 상기 제1 비천연 아미노산은 상기 제1 효소의 제1 효소 잔기에 위치 특이적으로 결합되어 있으며, 상기 제1 링커는 제1-2 클릭 반응기와 제2-1 클릭 반응기를 포함하고, 상기 (B1) 단계는 상기 제1 개질 효소의 상기 제1-1 클릭 반응기와 상기 제1 링커의 상기 제1-2 클릭 반응기를 제1 클릭 반응시킴으로써 수행되며; 상기 제2 링커는 제2-2 클릭 반응기와 제3-1 클릭 반응기를 포함하고, 상기 제2 개질 효소는 (i) 제2 효소와 (ii) 제3-2 클릭 반응기를 포함하는 제2 비천연 아미노산을 하나 이상 포함하고, 상기 제2 비천연 아미노산은 상기 제2 효소의 제2 효소 잔기에 위치 특이적으로 결합되어 있으며, 상기 (B2) 단계는 상기 제2 링커의 상기 제3-1클릭 반응기와 상기 제2 개질 효소의 상기 제3-2 클릭 반응기를 제3 클릭 반응시켜 수행되며; 상기 (C) 단계는 상기 제1 링커의 상기 제2-1 클릭 반응기와 상기 제2 링커의 상기 제2-2 클릭 반응기를 제2 클릭 반응시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 (A1) 제1 효소의 하나 이상의 제1 효소 잔기를 제1-1 클릭 반응기를 포함하는 제1 비천연 아미노산으로 위치 특이적으로 대체하여 제1 개질 효소를 수득하는 단계, (A2) 제2 효소의 하나 이상의 제2 효소 잔기를 제3-2 클릭 반응기를 포함하는 제2 비천연 아미노산으로 위치 특이적으로 대체하여 제2 개질 효소를 수득하는 단계, (B1) 상기 제1 개질 효소와 제1 링크를 결합시켜 제1 효소-링크를 수득하는 단계, (B2) 상기 제2 개질 효소와 제2 링크를 결합시켜 제2 효소-링크를 수득하는 단계, (C) 상기 제1 효소-링커와 상기 제2 효소-링커를 결합시키는 단계를 포함하는 다중 효소 결합체의 제조방법으로서; 상기 제1 링커는 제1-2 클릭 반응기와 제2-1 클릭 반응기를 포함하고, 상기 (B1) 단계는 상기 제1 개질 효소의 상기 제1-1 클릭 반응기와 상기 제1 링커의 상기 제1-2 클릭 반응기를 제1 클릭 반응시킴으로써 수행되며; 상기 제2 링커는 제2-2 클릭 반응기와 제3-1 클릭 반응기를 포함하고, 상기 (B2) 단계는 상기 제2 링커의 상기 제3-1클릭 반응기와 상기 제2 개질 효소의 상기 제3-2 클릭 반응기를 제3 클릭 반응시켜 수행되며; 상기 (C) 단계는 상기 제1 링커의 상기 제2-1 클릭 반응기와 상기 제2 링커의 상기 제2-2 클릭 반응기를 제2 클릭 반응시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체 제조방법에 관한 것이다.

확장된 유전자코드는 단백질 연결에 있어 획기적인 전환점을 가져 왔는데, 이로 인해 비천연 아미노산을 타겟 단백질에 위치 특이적으로, 어떠한 위치에든지 포함시키는 것이 가능해졌으며, 이는 대장균, 효모 또는 동물 세포주 등 다양한 발현균주에서 모두 가능하다. 반응적인 비천연 아미노산은 화학적인 핸들로서 작용하는데, 이는 기원이 같은 작용기를 가진 분자가 다른 천연 아미노산과의 교차반응 없이 연결되는 것을 가능하게 해준다.

본 발명에서는 특수하게 조작된 직교성(orthogonal) tRNA/아미노아실-tRNA synthetase pair를 통해 비천연 아미노산을 원하는 특정 단백질 부위에 도입할 수 있다. 목표 단백질의 특정 한 부위에 비천연 아미노산을 도입하기 위해 일반적으로 Amber stop codon이 사용된다. 유전적으로 amber codon과 release factor 1이 제거된 대장균을 사용함으로써 우리가 원하는 위치에 amber codon을 넣어주면 그 위치에 비천연 아미노산이 도입될 수 있게 된다. 이와 관련한 구체적인 내용은 본 발명의 출원 전 공지된 Journal of Controlled Release 207 (2015) 93??100 ("Site-specific albumination of a therapeutic protein with multi-subunit to prolong activity in vivo") 등과 같은 문헌을 참고할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 다중 효소 결합체를 이용하여 다중 효소 연쇄단계(cascade) 반응을 수행하는 단계를 포함하는 유기물 합성방법으로서, 상기 다중 효소 연쇄단계 반응은 제1 효소 반응과 제2 효소 반응을 포함하고, 상기 제1 효소 반응의 생성물이 상기 제2 효소 반응의 반응물로 사용되며, 상기 다중 효소 결합체의 상기 제1 효소는 상기 제1 효소 반응의 생촉매로 작용하고, 상기 다중 효소 결합체의 상기 제2 효소는 상기 제2 효소 반응의 생촉매로 작용하는 것을 특징으로 하는 유기물 합성방법에 관한 것이다.

일 구현예에 따르면, 상기 제1 효소 반응과 상기 제2 효소 반응은 하기 반응 쌍 중에 선택된 1쌍이다.

[반응식 1a]

[반응식 1b]

[반응식 1c]

[반응식 1d]

[반응식 1e]

[반응식 1f]

[반응식 1g]

[반응식 1h]

[반응식 1i]

[반응식 1j]

[반응식 1k]

[반응식 1l]

[반응식 1m]

[반응식 1n]

[반응식 1o]

[반응식 1p]

다른 구현예에 따르면, 상기 제1 효소 반응은 하기 반응이고,

[반응식 1a]

상기 제2 효소 반응은 하기 반응이며,

[반응식 1b]

상기 유기물은 D-만니톨이다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.

참조예

p-아지도-L-페닐알라닌(AZF)는 Chem-Impex International(Wood Dale, IL)로부터 얻었다. DBCO-PEG4-카복시로다민, DBCO-PEG12-TCO(트렌스사이클로옥텐)는 Bioconjugate Technology Company (Scottsdale, AZ)로부터 구입하였다. Ni-니트릴로트리아세트산(NTA)아가로오스 및 pQE80 플라스미드는 Qiagen (Valencia, CA)로부터 구입하였다. ZipTip C18 및 50 kDa의 MWCO(분획분자량)을 보유한 Vivaspin 센트리퓨져 콘센트레이터는 각각 Millipore Corporation (Billerica, MA) 및 Sartorius Corporation (Bohemia, NY)로부터 구입하였다. Sequencing grade-modified 트립신은 Promega Corporation (Madison, WI)에서 구입하였다. UNO Q1 음이온 교환컬럼 및 바이오로직 듀오플로우 크로마토그래피 시스템은 Bio-Rad (Hercules, CA)에서 구입하였다. Superdex 200 10/300 GL 사이즈 배제컬럼, HiTrap SP HP 양이온 교환컬럼, 및 PD-10 탈염컬럼은 GE Healthcare (Piscataway, NJ)로부터 얻었다. 모든 화학물질은 다른 언급이 없으면 시그마-알드리치 사(St. Louis, MO)에서 구입한 것이다.

실시예 1: 플라스미즈 제조 및 변종

Methanococcus jannaschii (Plasmid ID: 31186)로부터 유래된, 한쌍의 타이로실-tRNA 합성효소/앰버 억제 tRNA로 변형된 특정-AZF를 인코딩하는, 플라스미드 pEVOL-pAzF는 Addgene(Cambridge, MA)으로부터 획득하였고, 변형없이 사용하였다. fdh 유전자를 인코딩하는 pQE-80 TsFDH 플라스미드는 본래 Thiobacillus sp로부터 획득하였다. 추가적인 C??말단 히스티딘 서열을 보유하는 KNK65MA는 종전의 방법으로 제조하였다. 부위 특이적 변이물질 PCR은 237번 위치의 발린 코돈을 각각 앰버 코돈(UAG)로 변환하기 위한 템플릿으로서, pQE80-FDH를 가지고 수행하여 각각 pQE80-FDH-V237amb를 생성하였다.

E. coli TOP10를 야생형 FDH(FDH-WT)의 발현을 위해 pQE80-FDH로 형질변환하여, TOP10 [FDH-WT]를 생성하였다.

AZF 결합된 FDH (FDH-V237AZF)에 대한 발현 숙주로써, 유전적으로 변형된 E. coli C321.ΔA.exp는 Addgene(ID: 49018)로부터 획득하였고, pEVOL-pAzF 및 pQE80-FDH-V237amb로 각각 공동 형질변환하여, 각각 C321.ΔA.exp [FDHV237amb]를 생성하였다.

추가적으로 C-말단 히스티딘 서열을 포함하는, Pseudomonas fluorescens로부터 기원된 만니톨-2-탈수소효소를 부호화하는 mdh 유전자는 GenScript (Piscataway, NJ)에 의해 합성하였고, pQE80에 대한 서브클론(subclone)을 통해 pQE80-MDH을 생성하였고, 부위 특이적 변이물질 PCR은 417번 위치의 발린 코돈을 각각 앰버 코돈(UAG)로 변환하기 위한 템플릿으로서, pQE80-MDH를 가지고 수행하여, pQE80-MDH-V417amb를 생성하였다.

E. coli TOP10은 야생형 MDH (MDH-WT)의 발현을 위해 pQE80-MDH로 형질변환하여 TOP10 [MDH-WT]를 생성하였으며, AZF 결합된 MDH (MDH-AZF)에 대한 발현 숙주로서, 유전적으로 변형된 E. coli C321.ΔA.exp는 pEVOL-pAzF 및 pQE80-MDH-V417amb로 공동 형질변환하여, C321.ΔA.exp [MDH-V417amb]를 생성하였다.

본 발명에서 모든 DNA 클로닝은 제한효소를 사용하지 않는 클로닝 기법(restriction-free cloning technique)에 의해 수행하였다.

실시예 2: FDH 및 MDH 로 AZF 의 위치 특이적 결합

C321.ΔA.exp [FDH-V237amb or MDH-V417amb]의 포화배양물을 1:100 (v/v) 희석 상태에서, 100 μg/mL 암피실린 및 35 μg/mL 클로람페니콜을 포함하는 새로운 2ㅧYT 배지에 접종하였고, 37 ㅀC에서 220 rpm 속도로 강하게 교반해주었다.

OD600이 0.5가 되었을 때, AZF 용액을 최종농도 1 mM로 첨가하였다. 30 분 후, 온도를 30 ℃로 바꾸고, 단백질 발현을 1 mM IPTG and 0.2% (w/v) L-(+)-아라비노오스에 의해 유도하였고, 세포들은 12 시간 후에 채취하였고, 20 ℃에서 저장 전에, 15 분 동안 5000 rpm에서의 원심분리에 의해 펠릿화하였다.

AZF를 함유하는 FDH 또는 MDH를 추출하고 정제하기 위해, 세포 펠렛을 50mM 인산나트륨(PH7.5), 0.3 M 염화나트륨, 10 mM 이미다졸, l mg/ml 리소자임, DNase(DNA 가수분해 효소), RNase(리보뉴클레아제), 및 단백분해 효소 억제 칵테일로 구성된 라이시스 버퍼에 재부유하였고, 37 ℃에서 1 시간 동안 회전 후 2 시간 동안 4 ℃에서 회전하여 혼합하고, 30 분 동안 11,000 rpm의 속도로 원심분리 후에, 상층액을 걷어내고, 1 시간 동안 Ni-NTA 아가로오스와 혼합한 다음, 불순물을 제거하기 위해 중력 유동식 컬럼에서, 50 mM 인산나트륨(PH7.5), 0.3 M 염화나트륨, 20 mM 이미다졸로 구성된 세척완충액으로 세척하였다.

단백질을 50 mM 인산나트륨(PH7.5), 0.3 M 염화나트륨, 250 mM 이미다졸으로 구성된 용출완충액으로 용출시킨 다음, PD-10 컬럼을 이용해 저장완충액(PBS, pH 7.2)으로 전환하였으며, FDH-WT 또는 MDH-WT의 발현 및 정제는, TOP10 [FDH-WT 또는 MDH-WT]를 AZF 및 L-(+)-아라비노오스의 첨가없이 발현 숙주로써 사용한 점을 제외하고는 동일하게 수행하였다.

실시예 3: FDH - MDH 결합체의 합성

먼저, FDH-TET 및 MDH-TCO를 생성하기 위해 SPAAC 반응을 통해, 이기능성 헤테로 링커 DBCO-tetrazine 및 DBCO-PEG12-TCO를 FDH-AZF 및 MDH-AZF에 결합하였다. 두 번째로, IEDDA 반응을 통해 FDH-TET를 MDH-TCO에 결합시켰다. 마지막으로, FDH-MDH 결합체를 이온 교환 액체 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.

자세한 조건은 다음과 같다. FDH-AZF를 5% (v/v) DMSO를 함유하는 PBS 내에서 4 모랄 초과의 DBCO-테트라진과 혼합하고, 7 시간 동안 상온에서 반응시켰다. DBCO-테트라진 잔기를 제거하기 위해, 반응 혼합물은 PD-10 컬럼에서 탈염시키고, pH 6.0의 비스-트리스 완충액으로 전환하였다. MDH-AZF는 DBCO-tetrazine 대신 DBCO-PEG12-TCO를 사용한 점을 제외하고는 상기와 동일하게 수행하였다. 이렇게 하여 FDH-TET 및 MDH-TCO를 1:1 몰비로 혼합하여 획득하였고, 5 mg/ml의 총 단백질 농도로 농축하였으며, 1 시간 동안 상온에서 반응시켰다.

반응은 20 mM 비스-트리스 완충액(6.0pH)으로 사전-평형된, 음이온 교환 컬럼 UNO Q1에 투입하여 바로 혼합하였고, NaCl gradient를 적용하여 분석하였고, FDH-MDH 결합체를 함유하는 일부를 수집하여, 그의 크기 및 정제도를 평가하기 위하여, 사이즈 배제 크로마토그래피 Superdex 200에서 분석하였다.

실험예 1: MALDI - TOF 질량 분석

0.5 mg/ml의 저장완충액 내의 단백질을 하룻밤 동안 37 ℃에서 트립신에 의해 분해(소화)시킨 다음, 키트의 제조사 방법에 따라 ZipTip C18에서 탈염시켰다. DHB 매트릭스(10% 에탄올에 용해된 20 mg/L의 2,5-디히드록시벤조산 및 2 mg/mL 의 L(??)-푸코스)와 1:1(v/v)로 혼합된 정제 트립신 소화물은 Microflex MALDI-TOF M/S (Bruker Corporation, Billerica, MA)를 이용하여 질량 분석하였다.

실험예 2: SPACC 에 의한 색소표지

저장완충액 내의 30 μm의 FDH-WT, MDH-WT 및 이들의 변종들을 각각 2시간동안 상온에서 100 μm의 DBCO-PEG4-카복시로다민과 반응시킨 다음, 바이오 스펙트럼 이미징시스템(UVP, Upland, CA)에서 젤 내 형광발광을 측정하기 위하여, SDS-PAGE에 투입하였고, λex = 480 nm의 조도에서, 510nm 이상의 발광을 캡쳐하였다.

실험예 3: 효소활성 분석

FDH-WT 및 이의 변종의 효소활성은 CO2로의 포름산염 산화로 측정하였다. 반응은 5 μL의 400 nM FDH-WT50 또는 이의 변종을 50mM 포름산염 및 PBS내의 300 μM of NAD⁺ 로 구성된 분석완충액 195 μL와 혼합하여 개시한 다음, A340 nm에서 관찰하였다.

MDH-WT 및 이의 변종의 효소활성은 d-만니톨로의 d-프룩토오스(과당)의 환원으로 측정하였다. 반응은 5 μL의 40 nM MDH-WT50 또는 이의 변종을 50mM d-프룩토오스 및 PBS내의 NADH 로 구성된 분석완충액 195 μL와 혼합하여 개시한 다음, A340 nm에서 관찰하였다.

모든 측정은 SynergyTM 4-멀티모드 마이크로플레이트 리더(BioTek, Winooski, VT)의 표준 96-웰 플레이트에서, 25 ℃에서 3회 수행하였으며, 1분 후의 흡수도의 변화를 효소활성의 측정값으로 하였다.

실험예 4: FDH - MDH 결합체의 몰 조성 측정

각각의 촉매활성을 기반으로 한 FDH-MDH 결합체의 몰 조성을 측정하는 검정곡선은 1분 동안 A340nm의 흡광도 변화를, 예를 들어, 효소작용의 개시하에 기울기는 효소 농도를 달리한 점(FDH 100, 200 및 400 nm; MDH 5, 10 및 20 nM)을 제외하고는 상기 묘사한 것과 동일하도록, 플로팅하여 작성하였다. 선형회귀를 A340nm 기울기의 일차함수로써 효소농도들을 표현하기 위해 적용하였다.

FDH-MDH 결합체 용액의 적정량은 각각 A340nm 기울기를 얻기 위해, 동일한 조건 하에, 효소 활성 모두를 측정하였다. A340nm 기울기는 일차함수에 맞춰 FDH 및 MDH의 몰농도를 측정하였다.

실험예 5: 효소 단계적 연쇄반응에서의 d- 만니톨의 측정

단계적 연쇄반응은 10 μL의 FDH-MDH 결합체(50 배 실험작용농도), 또는 야생형(wild-type) FDH(FDH-WT) 및 야생형(wild-type) MDG(MDH-WT)의 자유 효소 혼합물을 PBS 내에서 50 mM 포름산염, 50 mM D-프룩토오스 및 500 μM NAD⁺로 구성된 분석용액 490 μL와 혼합하여 개시하였다. 적정 시점에, 반응용액 150 μL를 분획튜브에 담고, 염산을 첨가하여 pH3.0으로 낮춘 후, 효소 및 잔여 보조인자들을 비활성화 시키기 위해, 샘플을 40 분 동안 80 ℃에서 가열하였다.

효소 d-만니톨 분석은 pH9.5로 완충된 탄산수소나트륨 내에서 50 nM MDH-WT 및 600 μM NAD⁺ 로 구성된 분석용액 40 μL 및 160 μL를 혼합하고, d-프록토오스로의 d-만니톤의 효소적 산화에 의해 부여된 A340 nm에서의 증가를 관찰을 통하여, 샘플에서의 d-만니톨의 양을 측정하여 수행하였다.

5 분 동안의 흡광도 변화를, 알려진 양의 d-만니톨(1.0, 2.5, 5.0 및 10 μM)을 사용하는 d-만니톨 분석 및 선형회귀에 의한 5 분 동안의 d-만니톨 농도에 대한 흡광도 변화의 연관을 통하여, 사전에 획득한 d-만니톨의 검정선으로 맞춘 샘플에서 d-만니톨 농도를 계산하는데 이용하였다[도 7]. 모든 측정은 3 회 수행하였다.

다음으로, 첨부된 도면을 참조하여 구체적으로 설명한다.

첫 번째로, 클릭 반응이 가능한 p-아지도-L-페닐알라닌(AZF)을 보유된(retained) 촉매 활성을 갖는 두 효소(효소 A, B)에 도입시켰다. 그 다음, 두 가지의 클릭 반응이 가능한 이기능성 헤테로 링커(HBL-1, HBL-2)를 제1 클릭 반응인 SPAAC(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition)을 통하여 두 개의 다른 효소에 결합시킨다. 마지막으로, 다중 효소 결합체 반응 시스템을 생성하기 위해, 상기 두 효소-링커 결합체를 제2 클릭 반응인 IEDDA(an inverse electrondemand Diels-Alder reaction)을 통하여 연결시켰다[도 1B 참조].

최근, 효소 결합은 허용되는 위치에서 생성될 수 있기 때문에, 효소들의 위치 특이적 결합은 많은 주목을 받고 있다. 일단, 클릭 반응 가능한 비천연 아미노산이 효소에 도입되면, CuAAC(copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition) 또는 SPAAC와 같은 클릭 반응을 이용하여 고체 표면 위로 효소들을 고정시키게 되고, 결합 부위가 신중히 선택되면, 효소는 결합 후에도 촉매 활성을 보유하게 된다. Bundy 등은 CuAAC 클릭 반응을 통하여 직접 단백질-단백질 연결을 위하여, 2 개의 클릭 반응 가능한 아미노산, 즉 p-프로파길옥시-L-페닐알라닌(p-propargyloxy-L-phenylalanine)과 p-아지도-L-페닐알라닌(p-azido-L-phenylalanine)을 두 단백질 내로 도입하는 기술에 대해 보고한 바 있다.

상기 반응의 간단함과 커플링의 위치 특이성에도 불구하고, 효소들에 대한 이 기술의 활용은 구리 이온에 의한 활성 손실의 잠재적 문제로 인하여 제한이 있다. 따라서, 본 발명에서는 효소 활성을 보유하면서 연결 부위의 완전한 위치 특이성을 확보하기 위하여, 연속적인 두 클릭 반응을 통해 다중 효소의 위치 특이적 결합을 달성하였다[도 1B 참조].

모델 시스템으로서, 한 쌍의 개미산 전환 효소(FDH)와 만니톨 전환 효소(MDH)를 선택하였다. FDH는 Thiobacillus sp. KNK65MA로부터 기원된, 하나의 싱글 서브유닛에 대해 45kDa의 분자량을 갖는 호모다이머이며, NAD⁺에서 NADH로의 보인자(cofactor)를 감소시켜, 개미산이 이산화탄소로 전환되는 것을 촉진시킨다. Pseudomonas fluorescens로부터 유래된 MDH는 55kDa의 분자량을 갖는 모노머이며, NADH의 소모에 의해 d-프록토오스(과당)에서 d-만니톨로의 환원을 촉진시킨다. FDH 및 MDH로 구성되는 단계적 연쇄 반응에서, NADH는 FDH가 촉매 작용을 하는 포름산염 산화반응에 의해 재생되며, 그렇게 함으로써 지속적으로 MDH가 촉매 작용을 하는 d-만니톨 생성에 기질을 제공한다. 두 효소를 위한 기질, 즉 포름산염과 d-프룩토오스가 과량 존재하는 경우, FDH의 활성 부위와 MDH의 활성 부위 사이에서 NADH의 이동은 전체적인 단계적 연쇄반응 효율을 결정한다[도 1C 참조].

FDH-MDH 결합체를 구성하기 위한 제1 단계로서, 부위 연결을 신중히 선택하였다. 이때, 몇몇 요소들이 고려된다. 첫째, 결합할 때 활성이 손실되는 것을 피하기 위해, 연결 부위는 원래 기능(native function)에 관여해서는 안 된다. 둘째, AZF의 결합에 의한 구조적 변화를 최소화하기 위해, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린과 같은 소수성 곁사슬을 갖는 잔기들이 강력한 후보물질로 선택된다. 셋째, 효율적인 연결을 달성하기 위하여, 상대적으로 높은 용매 접근성(solvent accessibility)을 갖는 잔기가 선택된다. 잔기의 용매 접근성은 0(no accessibility)부터 1(full accessibility)까지 ASA-View 웹베이스 프로그램에 의해 측정하였다.

본 발명 발명자의 종전 연구 결과에 따르면, ASA 값이 0.4 초과하는 잔기들이 결합부위로서 적당하였다. 이러한 기준에 기초하여, FDH(0.423ASA Index)의 237번 위치의 발린과 MDH(0.462 ASA index)의 417번 위치의 발린은 연결 부위로 결정하였다[도 2A 참조].

AZF의 위치-특이적 유전적 결합(incorporation)은 FDH를 코딩하는 유전자와 MDH를 코딩하는 유전자 FDH의 미리 결정된 부위로 앰버 코돈을 도입함으로써 수행하였다. 숙주 세포들은 배지에서 AZF 존재 하의 표적 유전자뿐만 아니라 앰버 억제 tRNA 및 tRNA 합성효소의 직교 쌍(orthogonal pair)을 발현하도록 유도하였다. AZF를 포함하는 FDH 및 MDH의 발현 수율은 각각 5 및 8 mgL-1이다. 정제된 FDH 및 MDH 변종은 생물직교(bioorthogonal) 반응도와 AZF의 위치 특이적 결합 각각을 입증하기 위하여, 염료표지 및 질량분석법을 통해 분석하였다. DBCO(dibenzocyclooctyne)-기능화된 형광 염료와 혼합되면 형광성을 보이지 않는 야생형(wild-type) FDH(FDH-WT) 및 야생형 WDH(MDH-WT)에 반해, 변종은 강한 형광성을 나타냈다[도 5 참조].

트립신 단편의 말디토프(MALDI-TOF) 질량 스펙트럼은 FDH 포지션237 및 MDH 포지션417에서의 앰버 코돈에 대하여 AZF의 고신뢰성 결합을 증명하였다[도 2B 참조]. AZF 결합이 본래 활성(native activity)에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 변종들을 야생형 효소와 비교하여, 효소활성 분석을 수행하였다[도 4A 참조]. AZF을 포함하는 두 변종(FDH-AZF 및 MDH-AZF)은 그들 각각의 야생형과 맞먹는 효소 활성을 보유함을 확인하였다.

*유전적으로 코딩된 AZF는 화학적으로 잘 정의된 위치에 위치해 있고 SPAAC에 대한 생물직교 활성을 갖는 것으로 밝혀졌기 때문에, FDH 및 MDH의 변종은 화학적 링커를 통하여 FDH-MDH 결합체를 생산하기 위한 모듈화된 플랫폼을 제공한다. FDH-AZF와 MDH-AZF를 가교결합시키기 위하여, FDH-TET를 생성하는 SPAAC를 통하여, FDH-AZF는 DBCO-테트라진 링커와 반응시키고, 잔류 링커들을 제거하기 위하여 탈염시켰다. 마찬가지로, MDH-AZF는 MDH-TCO를 생산하기 위해 DBCO-PEG12-TCO 링커에 연결하였다[도 3A 참조]. 또한, 효소 각각의 촉매 활성 대부분은 링커 결합에도 보유됨을 확인하였다[도 4A]. 다음으로, 두 번째 생물직교 반응인 IEDDA는 FDH-MDH 결합체를 생산하기 위해 FDH-TET를 MDH-TCO에 공유결합시켰다[도 3B 참조].

반응 혼합물의 SDS-PAGE 분석에서, 200kDa-표준 단백질보다 약간 더 높은 싱글밴드가 감지되었고[도 6 참조], 이는 FDH-TET가 MDH-TCO와 반응하여 FDH-MDH 결합체를 형성하였음을 나타낸다. FDH-MDH 결합체 모노머의 총 분자량 110kDa으로부터 기대된 것보다 더 느린 이동은 겔 매트릭스를 통해 이동 속도를 늦추는 길고 유연한 PEG 스페이서로부터 기인되었고, FDH-MDH 결합체는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 반응 혼합물로부터 분리하였다. SDS-PAGE에서 FDH 이량체가 분리되었기 때문에, 두 개의 별개의 밴드로 분리되었고, 그 중 낮은 밴드는 무변형 단량체성 FDH와 동일한 분자량을 보이는 반면, 높은 밴드는 MDH에 결합된 단량체성 FDH에 상응하는 결과를 보였다[도 6 참조]. FDH-MDH 결합체가 형성되었을 때 겉보기 크기의 증가는 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 이량체성 FDH와 이량체성 MDH를 비교하여 확인하였다[도 3C 참조]. 결합체는 불순물이 감지됨이 없이 그것의 모체 보다 더 이른 용출 시간으로 더 날렵하고 대칭적인 피크를 나타냈으며, 이는 높은 균질성과 순도를 보여준다. 결합체 합성 각 단계에서의 반응 수율을 표 1에 나타내었다.

Step	Purification	FDH (mg)	Yield (%)	MDH (mg)	Yield (%)
Bacterial expression	Ni-NTA affinity	2.0^a	1 0 0	2.0^b	1 0 0
Linker conjugation by SPAAC	Desalting	1.9^c	95	1.8^d	90
Protein conjugation by IEDDA reaction	Anion exchange	0.54^e	27	0.33^f	17

그러나, FDH의 이량체성 특성 때문에, FDH-MDH 결합체는 두 개의 다른 구조, 즉 이량체성 FDH의 서브 유닛에 결합된 싱글 MDH, 또는 두 서브 유닛에 결합된 더블 MDH에 결합된 싱글 MDH의 구조로 나타날 수 있다. 구조를 분석하기 위해서, FDH-MDH 결합체의 포름산염 산화 활성과 d-만니톨 환원 활성을 각각 측정한 다음, 효소 활성을 몰농도와 연관시키는 각각의 일차 함수들에 피팅시켰다. FDH-MDH 결합체 용액은 5.6 μM 농도의 단량체성 FDH-AZF에 상응하는, 즉 2.5 μM의 이량체성 MDH-AZF에 상응하는 포름산염 산화 활성을 갖고, 2.5 μM의 MDH-AZF에 상응하는 d-프룩토오즈 환원 활성을 보이는 것을 확인하였고, 이는 2:1 몰비 종(molar species), 즉 싱글 MDH-AZF에 가교결합된 이량체성 FDH-AZF가 1:1 몰비 종보다 우세하다는 것을 보여준다.

d-프룩토오스와 포름산염 기질의 포화 양 존재 하에, FDH에 의해 생성된 NADH가 MDH의 활성 부위로 효율적으로 전달되는 단계가 d-만니톨의 효소 생산에서 속도 제한 단계이다[도 1C 참조]. NADH 수송에서 다중 효소 결합체의 중요성을 확인하기 위하여, 과량의 기질 및 NAD⁺뿐만 아니라 FDH-WT (5.5 nM 이량체) 및 MDH-WT (5 nM)의 자유 효소 혼합물이 존재하는 조건 또는 5 nM MDH-AZF에 상응하는 농도의 FDH-MDH 결합체가 존재하는 조건 하에서, 교반 없이, 다중 효소 단계적 연쇄반응을 수행하였다. 저농도의 효소 및 난류 혼합의 결여는, NADH의 효소 간 수송이 만니톨 생산 속도를 결정해야 하는, 국부적인 확산 율속 반응 시스템을 생성하게 되며, 이에 의해서 위치-특이적 효소 테더링에 의해 부여되는 향상된 촉매 성능의 관찰을 용이하게 한다. 반응 시작 3 시간 및 6 시간 후에, 샘플들은 반응 용액으로부터 분리하고, 340 nm 에서의 흡광도 변화들을 d-만니톨 농도의 내삽법에 의해 측정하여, d-만니톨 분석을 수행하였으며, 샘플들에서 실제 d-만니톨 농도는 도 4를 얻기 위해 희석인자인 5를 곱하여 획득하였다[도 7 참조]. 3 시간 동안 자유 효소 존재 하에 13 μM의 D-만니톨이 생성된 것과 비교하여, FDH-MDH 결합체의 존재 하에 25 μM의 D-만니톨이 생성되었다[도 4B 참조]. 6 시간 후에도, 비슷한 경향이 관찰되었다. FDH-MDH 결합체 및 자유 효소들의 존재 하에, 42 및 20 μM의 d-만니톨이 각각 감지되었다. 비복합 효소에 비해 FDH-MDH 결합체의 확연히 높은 반응 효율은, 반응 용액 내의 성분들을 완전히 혼합시키기 위한 교반을 하지 않을 때, 두 효소들 사이에서 NADH의 근접 채널링(proximity channelling)에 기인할 수 있다. 효소 농도에 상관없이, 결합된 FDH는 화학적 링커에 의해 설정된 공간 반경(spatial radius) 이내의 근접 거리에 후속 효소 MDH를 두게 된다. 자유 효소들과 비교하여, 효소 결합체에 의한 근접 효과는, 분자간 거리가 클 때 확연해지고[도 8A 참조], 효소들의 농도가 높을 때 감소된다[도 8B 참조]. 요약하면, 이러한 결과들에 의해서, 다중 효소들이 유지 활성을 갖는 상태에서 특정 위치에서 결합되며, 효소 결합체는 근접성이 향상된 NADH 프로세싱(processing)을 통하여 자유 효소들에 비해 향상된 촉매 효율을 나타낸다는 것이 명백히 증명하였다.

그러므로, 본 발명에서는 비천연 아미노산(AZF)의 위치-특이적 결합뿐만 아니라, 두 가지 직교 클릭반응(SPAAC 및 IEDDA)을 이용하여 다중-효소 반응 시스템을 형성하기 위한 방법을 완성하기에 이르렀다. FDH 및 MDH의 허용된 위치로 SPAAC-클릭 반응이 가능한 아지드기를 도입함으로써, IEDDA-클릭 반응이 가능한 링커 결합을 화학적으로 조절하는 역할을 한다. 그 다음, 두 효소-링커 결합체는 IEDDA 클릭 반응을 통하여 연결된다. 다중-효소 결합체(FDH-MDH 결합체)는 표준 크로마토그래픽 단백질 정제 과정을 통하여 성공적으로 분리하였다. FDH-MDH 결합체는 아마도 FDH와 MDH 사이의 보인자 이동으로 인해, 자유 FDH 및 MDH에 비하여, 향상된 D-만니톨 생성속도를 보여준 것으로 판단된다. 기술 및 방법이 매우 일반적으로 기술되었기 때문에, 촉매 활성 향상을 목적으로, 다른 다중-효소의 결합에 적용될 수 있을 것으로 사료되며, 더 폭 넓게는, 이러한 방법은 단백질 구조를 크게 교란하지 않고 용이하게 단백질-단백질 결합을 수행할 수 있게 할 것이다.

Claims

제1 효소-링커와 제2 효소-링커의 결합체를 포함하는 다중 효소 결합체로서;
상기 제1 효소-링커는 제1 개질 효소와 제1 링커의 결합체이고,
상기 제1 개질 효소는 FDH-AzF이고,
상기 제1 링커는 양 말단이 DBCO와 테트라진이며,
상기 제2 효소-링커는 제2 개질 효소와 제2 링커의 결합체이고,
상기 제2 링커는 양 말단이 DBCO와 TCO이고,
상기 제2 개질 효소는 MDH-AzF이고,
상기 제1 링커는 하기 구조의 화합물이고,

상기 제2 링커는 하기 구조의 화합물인 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체.
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제1항에 있어서, 상기 다중 효소 결합체는 하기 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체.
(C) 제1 효소-링커와 제2 효소-링커를 결합시키는 단계를 포함하는 다중 효소 결합체의 제조방법으로서;
상기 제1 효소-링커는 제1 개질 효소와 제1 링커의 결합체이고,
상기 제1 개질 효소는 FDH-AzF이고,
상기 제1 링커는 양 말단이 DBCO와 테트라진이며,
상기 제2 효소-링커는 제2 개질 효소와 제2 링커의 결합체이고,
상기 제2 링커는 양 말단이 DBCO와 TCO이고,
상기 제2 개질 효소는 MDH-AzF이고,
상기 제1 링커는 하기 구조의 화합물이고,

상기 제2 링커는 하기 구조의 화합물인 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체 제조방법.
(B1) 제1 개질 효소와 제1 링커를 결합시켜 제1 효소-링커를 수득하는 단계,
(B2) 제2 개질 효소와 제2 링커를 결합시켜 제2 효소-링커를 수득하는 단계,
(C) 상기 제1 효소-링커와 상기 제2 효소-링커를 결합시키는 단계를 포함하는 다중 효소 결합체의 제조방법으로서;
상기 제1 개질 효소는 FDH-AzF이고,
상기 제1 링커는 양 말단이 DBCO와 테트라진이며,
상기 제2 링커는 양 말단이 DBCO와 TCO이고,
상기 제2 개질 효소는 MDH-AzF이고,
상기 제1 링커는 하기 구조의 화합물이고,

상기 제2 링커는 하기 구조의 화합물인 것을 특징으로 하는 다중 효소 결합체 제조방법.
삭제
제1항 또는 제 14항 중 어느 한 항에 따른 다중 효소 결합체를 이용하여 다중 효소 연쇄단계(cascade) 반응을 수행하는 단계를 포함하는 유기물 합성방법으로서,
상기 다중 효소 연쇄단계 반응은 제1 효소 반응과 제2 효소 반응을 포함하고,
상기 제1 효소 반응의 생성물이 상기 제2 효소 반응의 반응물로 사용되며,
상기 다중 효소 결합체의 상기 제1 효소는 상기 제1 효소 반응의 생촉매로 작용하고,
상기 다중 효소 결합체의 상기 제2 효소는 상기 제2 효소 반응의 생촉매로 작용하는 것을 특징으로 하는 유기물 합성방법.
제18항에 있어서, 상기 제1 효소 반응과 상기 제2 효소 반응은 하기 반응 쌍 중에서 선택된 1쌍의 반응인 것을 특징으로 하는 유기물 합성방법:
[반응식 1a]

[반응식 1b]

[반응식 1c]

[반응식 1d]

[반응식 1e]

[반응식 1f]

[반응식 1g]

[반응식 1h]

[반응식 1i]

[반응식 1j]

[반응식 1k]

[반응식 1l]

[반응식 1m]

[반응식 1n]

[반응식 1o]

[반응식 1p]
제19항에 있어서, 상기 제1 효소 반응은 하기 반응이고,

상기 제2 효소 반응은 하기 반응이며,

상기 유기물은 D-만니톨인 것을 특징으로 하는 유기물 제조방법.