KR20200100588A - 재조합 폴리펩티드에서의 조작된 o-당화 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 O-글리칸(들)(태그)에 공유적으로 연결된 조작된 O-결합 아미노산(AA) 당화 서열(모티프)을 갖는 재조합 폴리펩티드 치료제에 관한 것이다. 재조합 O-당화 폴리펩티드는 대사성 표지화를 통해 천연 또는 비-천연 O-글리칸 구조를 나타내도록 포유동물 세포에서 생성될 수 있다.

Description

재조합 폴리펩티드에서의 조작된 O-당화 및 이의 용도
전자적으로 제출된 자료의 참조를 통한 결합
2017년 12월 21일에 생성된 "OGLYC-100-US-PSP-SequenceListing.TXT"를 명칭으로 하는 하나의 11,891 바이트의 ASCII(텍스트) 파일로 확인되고, 동시에 이에 의해 제출되는 컴퓨터 판독 가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록이 그 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 O-글리칸(들)(태그)에 공유적으로 연결된 조작된 O-결합 아미노산(AA) 당화 서열(모티프)을 갖는 재조합 폴리펩티드 치료제에 관한 것이다. 재조합 O-당화 폴리펩티드는 대사성 표지화를 통해 천연 또는 비-천연 O-글리칸 구조를 나타내도록 포유동물 세포에서 생성될 수 있다. 이러한 방법에 의해 생성된 폴리펩티드는 추가 기능, 가장 주목할만한 것은 조작된 O-글리칸에 대한 화학적 컨쥬게이션에 의해 기능성 모이어티를 첨가할 가능성을 제공하는 조작된 O-글리칸 구조로부터 이익을 얻을 수 있다.
단백질 당화는 일반적이고, 매우 다양한 번역 후 변형(PTM)이다. 진핵생물 세포에서, 상기 변형은 N-결합 당화 및 O-결합 당화의 두 가지의 넓은 범주로 나뉠 수 있다. 전형적으로, 세포외인 N-결합 당화에서, 올리고당류는 아스파라긴에 공유적으로 부착되는 반면, O-결합 당화에서, 부착은 일반적으로 세린 또는 티로신의 하이드록실기에서 발생한다.
분비된 당단백질 및 세포 표면 관련 당단백질에서 발견되는 O-결합 뮤신-타입 글리칸에 대한 당화 반응에 의해 생성된 구조에는 큰 다양성이 존재하며, 이러한 변화는 분비 경로(특히, 골기 기관)에 상주하는 특정 트랜스페라제 효소의 활성에 의해 발생된다. 이들은 폴리펩티드 N-아세틸갈락토사미닐트랜스페라제(ppGalNAc-T) 동종효소의 작용에 의해 자체 배치된 전구체 N-아세틸갈락토사민(O-GalNAc, Tn 항원)에 대한 순차적 단당류 축합/이를 넘어서는 순차적 단당류 축합을 통해 O-글리칸의 성숙을 촉매한다. 영양소 이용 가능성 및 세포 활성과 함께 O-당화 서열 모티프와 올리고당류 트랜스페라제 발현의 독특한 상호작용에 의해 종종 정교하게 제어되는, 글리칸 구조 자체의 수준 및 단백질 백본에 대한 O-글리칸의 부착 위치에서 다양성이 존재한다. 이러한 과정의 세부사항은 현재 막연하게만 이해되어 있다.
사실상, O-글리칸은 수화/전하, 단백질-단백질 상호작용, 백본 노출/접근성 및 표면 에피토프/인지와 같은 상기 특성에 의해 제공되는 다수의 바람직한 효과를 부여한다. 예를 들어, 폴리펩티드 내의 O-글리칸의 존재는 장벽/윤활(대량으로(en masse)), 증가된 반감기(프로테아제/분해 내성), 활성 감쇠(단백질 트래피킹(protein trafficking), 수용체 신호전달) 및 단백질 폴딩/응집 상태와 같은 특징을 부여할 수 있다. 비-천연 O-글리칸은 추가의 바람직한 특성을 제공할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 내의 O-글리칸의 존재는 개선된 약학적 거동, 예를 들어, 제형, 반감기 연장 또는 변경된 면역원성을 부여할 수 있다. 추가의 발전에서, 폴리펩티드 내의 비-천연 O-글리칸 조성(또는 위치)의 조작이 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, 클릭(click) 화학 컨쥬게이션과 같은 후속 화학 반응이 수용된다. 이들 많은 특성은 조작된 치료 폴리펩티드에서 이용될 수 있다.
O-결합 당화는 폴리펩티드에 도입되어 O-글리칸의 하나 이상의 특성을 이용할 수 있다. 그러나, 모든 폴리펩티드가 이들의 아미노산 서열의 일부로서 O-결합 당화 서열을 갖는 것은 아니다. 또한, 기존 O-결합 당화 서열의 O-당화는 효율적으로 진행되지 않을 수 있고/있거나, 기존 O-결합 당화 서열의 당화를 통해 제공되는 O-글리칸은 이용에 최적이 아닐 수 있다. 따라서, O-당화 부위를 폴리펩티드로 조작하는 것이 필요하다.
US 9,187,532호는 외인성 당화 부위의 BMP-7, NT-3 및 FGF-21과 같은 단백질로의 통합에 관한 것이다. US 9,187,532호의 방법론에 따르면, 외인성 O-결합 당화 서열을 갖는 돌연변이체 단백질이 E. 콜리 세포에서 발현되고 정제되었다. 이후, 당화는 정제된 단백질로의 GalNAc의 시험관 내 첨가에 의해 시도되었다.
상기 및 다른 곳(Invitrogen Click-IT 기술 참조)에 기재된 바와 같이 단백질로의 O-글리칸의 도입을 위한 방법이 존재하나, 이들은 (i) 이들이 특이적으로 및 재현 가능하게 O-당화되도록 하는 O-당화 모티프의 위치에 대한 제어, (ii) 상업적으로 실행 가능한 수율로 O-글리칸 태그를 갖는 폴리펩티드의 고효율 생산 및 (iii) O-글리칸 태그를 변형시켜 추가의 기능성을 제공할 잠재성에 대한 필요를 만족스럽게 해결하지 못한다. 본 발명은 O-글리칸 태그를 재조합 폴리펩티드에 통합시키는 신뢰성 있고 효과적인 수단에 대한 필요성을 유일하게 해결하는 발현 '시스템'을 제공함으로써 이들 문제에 대한 해법을 제공한다.
본 발명은 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 및 이의 컨쥬게이트를 생성시키기 위한 방법에 관한 것이다. 이와 관련하여, 본 발명은 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드, O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트, 이를 포함하는 약학적 조성물, 및 치료 방법을 포함하는 이의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 숙주 치료 폴리펩티드로부터 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드를 생성시키기 위한 O-당화 및 이러한 과정을 추가로 촉진시킬 수 있는 세포주 변형을 위한 시약을 포함하는 세포 배양 배지의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 양태 및 구현예는 첨부된 청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 이들 및 다른 양태 및 구현예가 또한 본원에 기재된다.
본 발명의 개시의 구현예는 이제 첨부 도면을 참조로 하여 단지 예로서 설명될 것이다:
도면 설명
도 1은 O-당화 부위에서의 TB4 펩티드의 주석이 달린 리본 구조 및 아미노산 서열을 제시한다.
도 2는 질량분광법에 의한 상이한 글리코형(glycoform)의 특징화를 제시한다.
도 3은 SEC-MALS를 이용한 체류 시간에 대한 O-당화의 영향을 제시한다.
도 4는 hGLP-1R 세포에서 HTFR cAMP 검정에 의해 측정된 설치류 PK 모델에서의 반감기 연구 결과를 제시한다.
도 5는 hGLP-1R에 대한 펩티드 활성을 제시한다.
도 6은 사료 고갈된 일시적 발현에서의 GalNAz의 농도 증가가 표지 통합과 관련이 있음을 제시한다.
도 7은 통합된 O 글리칸 태그를 통해 작용기를 컨쥬게이션시키기 위해 클릭 화학을 이용한 결과를 제시한다.
도 8은 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc) 및 이의 유도체의 존재 또는 부재하에서 CHO K1 (a) 또는 CHO K1 GALE KO (b)에서 발현된 Fc-PTAEPG의 O-당화 프로파일. MS 피크 강도를 기초로 하여 O-글리칸 비함유 및 O-당화 종의 상대량을 계산하였다.
도 9은 50μM Ac4GalNAz의 부재 또는 존재하에서 HEK293F GALE KO에서 발현된 IgG1-A-PTAEPG(패널 a) 및 Fc-PTAEPG(패널 b), 및 이어서 GalNAz-표지된 Fc로의 AF488-DBCO 시약의 구리-비함유 "클릭" 화학 첨가(패널 b)의 O-당화 프로파일.
도 10은 GalNaz의 존재하에서 HEK293F KO 세포주를 이용하여 생성되고, 클릭-화학을 이용하여 AF488로 표지된, 수용체 A에 특이적인 IgG1(IgG-A-PTAEPG)을 이용한 수용체 A에 양성(+A) 및 음성(-A)인 세포의 FACS 분석. 유사한 방식으로 표지된 Fc-PTAEPG를 음성 대조군으로 사용하였다.
본 발명은 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드를 생성시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은,
a. 적어도 하나의 조작된 O-결합 당화 서열이 재조합 치료 폴리펩티드에서 O-글리칸에 공유적으로 결합되도록 세포 배양 배지의 존재하에서 숙주 세포에서 조작된 치료 폴리펩티드를 발현시키는 단계로서,
i. 조작된 치료 폴리펩티드가 적어도 하나의 O-결합 당화 서열을 포함하고,
ii. 세포 배양 배지가 O-당화를 위한 시약을 포함하는, 단계; 및
b. 선택적으로, 재조합 치료 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함한다.
세포 배양 배지에 O-당화를 위한 특정 시약을 첨가함으로써, 본 발명자는 발현된 조작된 치료 폴리펩티드가 조작된 O-결합 당화 서열의 부위에서 O-글리칸으로 효율적이고 일관되게 당화될 수 있음을 발견하였다. O-당화의 증가된 효율은 상업적으로 생산하기에 가능한 수율로 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드를 생산할 가능성을 처음으로 제공한다. 따라서, 본 발명은 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드를 생성시키기 위한 개선된 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은,
a. 적어도 하나의 조작된 O-결합 당화 서열을 포함하는 조작된 치료 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터를 획득하는 단계; 및
b. 숙주 세포를 발현 벡터로 형질감염시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 조작된 치료 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포로부터 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드를 생성시키기 위한 O-당화를 위한 시약을 포함하는 세포 배양 배지의 용도를 제공하며,
a. 조작된 치료 폴리펩티드는 적어도 하나의 조작된 O-결합 당화 서열을 포함하고;
b. 재조합 치료 폴리펩티드는 적어도 하나의 O-글리칸에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 조작된 O-결합 당화 서열을 포함한다.
O-결합 당화 서열은 치료 폴리펩티드에 대해 내인성일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 치료 폴리펩티드에 대해 외인성일 수 있다. 천연 및 비-천연 O-결합 당화 서열 둘 모두는 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 치료 폴리펩티드로 조작될 수 있다.
따라서, 조작된 O-결합 당화 서열에는 (i) 숙주 세포에서 발현된 조작된 치료 폴리펩티드 및 (ii) 본원에 기재된 본 발명의 방법에 의해 생성된 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 둘 모두가 존재한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 방법에 따라 생성된 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드를 추가로 제공한다. 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 방법에 따라 생성될 수 있는 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드를 추가로 제공한다. 상기 정의된 방법에 따라 생성된 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드의 특징을 갖는 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 또한 본 발명의 범위 내이다.
본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 단백질로 조작된 O-결합 당화 서열 및 조작된 O-결합 당화 서열에 공유적으로 결합된 O-글리칸의 존재로 인해 천연 발생 당화 단백질과 비교하여 변형된 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 O-결합 당화 서열에 공유적으로 결합된 O-글리칸의 대사적 첨가로 인해 당화 서열을 포함할 수 있는 조작된 치료 폴리펩티드와 비교하여 변형된 것으로 이해될 것이다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 생성된 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 조작된 O-결합 당화 서열과 별개로 단백질이 세포에서 발현된 조작된 치료 폴리펩티드의 당화로부터 발생하는 당화 패턴을 달리 가질 것이라는 사실에 의해 확인될 수 있음이 이해될 것이다. 특정 배양 조건(세포 유형, 글루코스 이용 가능성, 스트레스, 효소 KO)이 존재하는 글리칸의 유형에 영향을 미칠 것이다.
따라서, 본 발명은 적어도 하나의 O-글리칸에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 O-결합 당화 서열을 포함하는 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드를 제공하며, 재조합 치료 폴리펩티드는 천연 또는 비-천연 당화 패턴/구성을 포함한다.
본원에 기재된 조작된 O-결합 당화 서열은 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드에 유리한 특성을 부여할 수 있다. 예를 들어, 구조 및 기능(유연성, 접근성, 생체활성), 물리화학적 및 생체물리학적 특성(pI, 용해도, 유체역학적 반경), 단백질-단백질 상호작용의 조절(감소된 자가-회합, 응집 및 프로테아제 내성을 포함함), 면역원성(차폐 에피토프), 생성물 분화, 및 생물공정(bioprocessing). 특정 예에서, 조작된 O-결합 당화 서열의 존재는 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드의 단백질분해를 감소시킬 수 있다. 차례로, 조작된 O-결합 당화 서열의 존재는 조작된 O-결합 당화 서열이 없는 치료 폴리펩티드와 비교하여 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드의 반감기를 증가시킬 수 있다. 본원에 기재된 조작된 O-결합 당화 서열은 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드의 O-글리칸 변형을 정확하게 표적화 하는 능력을 제공한다.
또 다른 양태에서, 추가 분자가 O-글리칸에 부착되어 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 어디에 정의된 바와 같은 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드를 포함하는 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트를 제공하며, 추가 분자 M은 O-글리칸에 공유적으로 결합된다.
또 다른 양태에서, 추가 분자가 O-글리칸에 부착되어 하기 식을 포함하는 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트를 형성할 수 있다:
P-(O-글리칸)-M
상기 식에서, P는 조작된 재조합 치료 폴리펩티드를 나타내고, M은 P에 부착되기에 바람직한 분자를 나타낸다. 따라서, O-글리칸은 P와 M 사이의 연결기로 작용한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 식을 포함하는 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트를 생성시키기 위한 방법을 제공한다:
P-(O-글리칸)-M
상기 식에서, P는 본 발명의 조작된 재조합 치료 폴리펩티드를 나타내고, M은 P에 부착되기에 바람직한 분자를 나타낸다. 상기 방법은,
(i) 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드를 제공하는 단계; 및
(ii) O-글리칸과 M을 반응시켜 O-글리칸에 M을 연결시키는 단계를 포함한다.
O-글리칸은 M 및 O-글리칸을 연결시키기 위해 M의 반응성 기와 반응할 수 있는 반응성 기를 가져야 하는 것이 이해될 것이다. 일 구현예에서, 연결은 공유 연결일 수 있다.
일 구현예에서, 반응은 아지드-알킨 커플링 반응을 포함한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 방법에 따라 생성된 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 방법에 따라 생성될 수 있는 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트를 추가로 제공한다. 상기 정의된 방법에 따라 생성된 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트의 특징을 갖는 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트는 또한 본 발명의 범위 내이다.
본 발명은 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드를 환자에 투여하는 단계를 포함하는 환자의 질병을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트를 환자에 투여하는 단계를 포함하는 환자의 질병을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 수용 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 및 본 발명의 컨쥬게이트를 생성시키기 위해 공동 투여되는 기질 M을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 환자의 질병을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 언급된 생성물의 제2의 의학적 용도를 제공한다.
O-당화 재조합 치료 폴리펩티드
일 구현예에서, 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 30kDa 미만의 분자량을 갖는다. 일 구현예에서, 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 약 30 kDa 이상의 분자량을 갖는다. 일 구현예에서, 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 약 65 kDa 이상의 분자량을 갖는다. 일 구현예에서, 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 약 100 kDa 이상의 분자량을 갖는다. 일 구현예에서, 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 약 150 kDa 이상의 분자량을 갖는다.
본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 제공된 O-결합 당화 서열을 갖는 것이 바람직한 임의의 치료 폴리펩티드일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일 구현예에서, 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 Fc 단백질이다.
일 구현예에서, 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 Tn3 스캐폴드, 다르핀(Darpin), scFv, 어피바디(Affibody) 또는 도메인 항체이다.
조작된 O-결합 당화 서열의 위치
조작된 O-결합 당화 서열은 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 상의 어느 곳이나 존재할 수 있으나, 단, 단백질은 생물학적 활성이 조작된 O-결합 당화 서열이 없는 상응하는 재조합 치료 폴리펩티드의 생물학적 활성으로부터 변경되더라도 여전히 생물학적으로 활성이어야 한다. 단백질 구조/기능에 대한 조작된 O-당화 서열의 효과를 결정하기에 적합한 실험은 사용되는 특정 치료 폴리펩티드에 대해 당업자에게 공지될 것이다.
O-글리칸이 조작된 치료 폴리펩티드에 연결되기 위해서는, 조작된 O-결합 당화 서열의 표적 아미노산(S/T/Y)이 일차 당화 효소(예를 들어, ppGalNAc-Ts)에 입체형태적으로 접근 가능해야 한다. 일 구현예에서, 조작된 O-결합 당화 서열은 골기 기관에서 번역 후 변형 동안 치료 폴리펩티드의 용매 노출 표면에서 접근 가능해야 한다. 당업자는 번역 후 변형을 위한 적절한 세포주 및 조건의 선택이 O-당화의 효율에 영향을 미칠 수 있으나, 효율을 최적화하기 위한 상기 세포주 및 조건의 선택은 일상적인 최적화의 문제라는 것을 인지할 것이다.
조작된 O-결합 당화 서열의 접근성은 일반적으로 3차원 구조를 거의 또는 전혀 갖지 않지만 O-결합 당화 서열의 접근성을 개선시킬 링커(L1/2)의 사용에 의해 도움을 받을 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 구조 모티프가, 예를 들어, Cys 브릿지 또는 프롤린 풍부 서열의 존재를 통해 '비틀린(kinked)' 구조를 형성하도록 촉진하는 것을 도울 수 있다. 링커는 조작된 O-결합 당화 서열의 한면 또는 양면에 존재할 수 있다:
-(L1)m-(조작된 O-결합 당화 서열)-(L2)n-
상기 식에서, m 및 n은 독립적으로 0 또는 1이다. 그리고, L1은 L2와 동일할 수 있거나, 두 개는 상이할 수 있다. L1 및/또는 L2는 바람직하게는 천연 단백질을 최소로 파괴하기 위해 짧으나, 접근성에 대해 타협하기 위해 길이가 다양할 것이다. 링커는 1개 내지 30개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1개 내지 10개, 가장 바람직하게는 1개 내지 5개의 아미노산 잔기일 수 있다.
적합한 펩티드 링커는 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, Gly4S 링커, A/P 링커, 하전된 링커, PolyP 및 PolyA 링커. 링커는 추가의 구조 또는 기능을 추가할 수 있으며, 일 구현예에서, 이는 프로테아제 절단 부위 또는 태그를 포함할 수 있다.
조작된 O-결합 당화 서열은 O 당화될 수 있는 천연 발생 잔기에 인접하거나 근접하지 않는 것이 일반적으로 바람직하다. (예를 들어, 조작된 O-결합 당화 서열에 Ser, Thr 또는 Tyr이 근접하여 존재하는 경우, 이는 이차 O-당화 부위를 제공할 수 있다). 이와 같이, 상기 부위는 단백질 외부에서 조작될 필요가 있거나, 조작된 O-결합 당화 서열이 천연 발생 잔기에 비해 상이한 위치에 위치될 필요가 있을 것이다. 이는 O-결합 당화 부위의 완전한 재배치에 의해 또는 적합한 링커의 삽입에 의해 달성될 수 있다. 당화를 전파하는 능력을 갖지 않는 렉틴-도메인 트렁케이션된 ppGalNAc-Ts의 사용 또는 렉틴 도메인 인지/이에 의한 연장을 방지하는 실제로 변형된 당류 통합을 포함하여 상기 현상을 제어하기 위한 대안적 방법이 존재한다.
상기에도 불구하고, 인접한 잔기의 추가 O-당화가 바람직한 예가 있을 수 있다. 어떤 경우에, S/T가 풍부한 링커 또는 자극 부위로부터의 적절한 간격 제공은 최적의 이차 O 당화 사건을 제공한다.
다운스트림 또는 업스트림 Ser 또는 Thr은, 예를 들어, 약 10개의 아미노산 거리만큼 조작된 당화 부위로부터 떨어져 있을 필요가 있으나, 아미노산의 정확한 수는 펩티드에 따라 변할 수 있고, 예를 들어, 5개 내지 15개의 아미노산과 같이 상기 값보다 크거나 작을 수 있다.
조작된 O-결합 당화 서열은 조작된 치료 폴리펩티드에서 임의의 적합한 위치에 존재할 수 있다. 따라서, 조작된 O-결합 당화 서열은 조작된 치료 폴리펩티드의 C-말단에 있을 수 있음이 이해될 것이다. 조작된 O-결합 당화 서열은 조작된 치료 폴리펩티드의 N-말단에 있을 수 있다. 이러한 의미에서, 조작된 O-결합 당화 서열은 치료 폴리펩티드 서열 내에 있지 않을 수 있고, 오히려 C- 또는 N-말단으로의 상기 서열의 연장(선택적으로, 링커를 이용함)일 수 있음이 이해될 것이다. 조작된 O-결합 당화 서열은 조작된 치료 폴리펩티드의 C-말단과 N-말단 사이(즉, 조작된 치료 폴리펩티드 내)에 있을 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 조작된 치료 폴리펩티드의 C-말단 근처(예를 들어, 10개의 아미노산 내)에 있을 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 조작된 치료 폴리펩티드의 N-말단 근처(예를 들어, 10개의 아미노산 내)에 있을 수 있다. 조작된 서열은 치료제의 2개의 별개의 성분 사이, 예를 들어, Fc-펩티드 융합체의 스캐폴드와 펩티드 영역 사이에 있을 수 있다.
일 구현예에서, 조작된 O-결합 당화 서열은 조작된 치료 폴리펩티드의 루프 도메인에 위치된다. 상기 위치는 일반적으로 폴리펩티드의 비구조화된 영역 내에서 발생하는 천연 당화 부위와 일치한다. 당분야의 조작 방법은 초기에 부적합한 위치가 채택될 수 있게 하며, 예를 들어, 링커 도메인의 사용은 구형 도메인으로부터 O-당화 서열을 밀어낸다.
기존 기술은 단백질의 연구(예를 들어, 아미노산 서열, 질량분광법 및 공지된 결정 구조를 이용함)가 기존 O-당화 부위를 특징으로 하고/하거나 조작된 O-결합 당화 서열의 도입에 가장 적합한 도메인을 확인하는 것을 가능하게 한다.
따라서, 조작된 O-결합 당화 서열에 유망한 위치는 상기 모두를 고려함으로써 도달될 수 있다.
O-결합 당화 서열을 치료 폴리펩티드로 조작하는 것은 당 분야에 공지되어 있고, 따라서 조작된 O-결합 당화 서열의 위치에 관한 추가 정보가 당 분야에서 이용 가능한 것이 추가로 이해될 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 항체 또는 이의 단편이며, 조작된 O-결합 당화 서열은 항체의 힌지 영역에 존재한다. 세포독소와 같은 기능성 모이어티는, 예를 들어, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 제조하기 위해 상기 부위를 통해 항체에 컨쥬게이션될 수 있다.
O-글리칸의 수
본 발명에 따른 재조합 치료 폴리펩티드는 O-당화되는 적어도 하나의 잔기를 갖도록 조작되었다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 조작된 O-결합 당화 서열은 서열 내의 하나의 위치에서 당화된다. 또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 조작된 O-결합 당화 서열은 서열 내의 다수(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 위치에서 당화된다.
하나 초과의 조작된 O-결합 당화 서열을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 치료 폴리펩티드는, 예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 조작된 O-결합 당화 서열을 갖는다. 하나 초과의 조작된 O-결합 당화 서열이 있는 경우, 각각의 조작된 O-결합 당화 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 하나 초과의 글리칸이 존재할 수 있으나, 이들 O-글리칸 중 하나 이상은 조작된 O-당화 서열 외부에 있을 수 있다. ppGalNAc-Ts의 전파 특성은 상기 당화 패턴을 달성하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 치료 폴리펩티드는 더 큰 발현 생성물의 구성요소로서 발현되고, 이후 번역 후 트렁케이션될 수 있다. 상기 번역 후 변형은 전파적 당화가 개시되는 경우에 사용하기에 적합할 수 있으나, 조작된 서열로 제한되지는 않는다. 예를 들어, Fc-펩티드-S/T-펩티드-절단 부위-글리칸모티프 → Fc-펩티드-S/T-펩티드.
조작된 O-결합 당화 서열
조작된 O-결합 당화 서열은 규정된 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 O-결합 당화에 대한 표적이 되기에 충분한 길이여야 하나, 단백질의 구조/기능에 대한 최소의 방해 또는 방해 없음을 제공하기 위해 충분히 짧은 길이어야 한다.
조작된 O-결합 당화 서열은 약 5개의 아미노산 내지 25개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 적어도 5개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 적어도 6개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 7개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 8개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 9개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 10개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 11개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 12개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 13개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 14개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 15개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 16개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 17개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 18개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 19개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 20개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 21개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 22개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 23개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 24개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 최대 약 25개의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 O-결합 당화 서열은 약 5개의 아미노산 또는 약 6개의 아미노산 길이이다.
특정 구현예에서, O-결합 당화 서열은 천연 발생 폴리펩티드 서열로 삽입되는 외인성 아미노산으로 구성될 수 있다. 다른 구현예에서, O-결합 당화 서열은 자연 발생 폴리펩티드의 서열 내의 잔기 및 외인성 잔기를 포함할 수 있으며, 외인성 잔기는 본원에 개시된 바와 같은 O-결합 당화 서열을 형성하도록 상기 위치에 삽입된다. 보다 상세하게는, 상기 O-결합 당화 서열은 내인성 및 외인성 잔기 둘 모두로 구성될 수 있으며, 상기 잔기는 연속적이거나 연속적이지 않을 수 있다(예를 들어, ...XXXPAAEKXXX...(SEQ ID NO:42)의 숙주 서열은 A에 대한 T 및 K에 대한 P의 치환에 의해 ...XXXPTAEPXXX...(SEQ ID NO:43)로 변형될 수 있다).
조작된 O-결합 당화 서열은 약 5개의 아미노산 내지 15개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 약 5개의 아미노산 내지 10개의 아미노산 길이일 수 있다. 조작된 O-결합 당화 서열은 약 5개의 아미노산 내지 6개의 아미노산 길이일 수 있다.
조작된 O-결합 당화 서열은 규정된 서열을 가질 수 있다. 이와 관련하여, O-결합 당화 서열은 당분야에 공지되어 있다. 그러나, O-당화의 자연적 제어는 복잡하고, 모든 환경/상황에서 임의의 제공된 OLGS와 O-당화의 존재 사이에 직접적인 상관 관계는 없다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, OLGS의 자유-OH 제시 기에 대한 단순한 요구사항을 넘어서 숙주 환경(예를 들어, 특이적 ppGalNAc-T 발현, 영양소 이용 가능성 등)과 복잡한 단백질 특징의 미세한 상호작용이 존재하는 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, 하나 이상의 Pro 잔기에 근접한 Ser, Thr 또는 Tyr의 존재를 특징으로 하는 조작된 O-결합 당화 서열은 OH 기에 대한 접근성이 증가된 비틀린 구조의 형성의 결과로서 증가된 O-당화를 발생시키는 것으로 보인다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, -1 및 +3의 위치(Ser/Thr에 비함)가 A.A. 선택(특정 잔기를 선호함)에 특히 민감한 것으로 보이며, 당업자는 다른 위치가 또한 최적화에 중요하고, 치환이 다른 서열 위치에 대해 의존적 및 독립적일 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명은 특히 효율적인 O-당화를 제공하는 신규한 O-결합 당화 서열을 제공한다.
이와 같이, 본 발명은 O-결합 당화 서열을 포함하는 신규한 폴리펩티드를 제공하며, 상기 O-결합 당화 서열은 표 1에 제시된 것들로부터 선택된 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 조작된 O-결합 당화 서열은 표 1에 제시된 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 조작된 O-결합 당화 서열은 표 1에 제시된 서열을 본질적으로 포함한다. 일 구현예에서, 조작된 O-결합 당화 서열은 표 1의 SEQ ID NO:2 내지 14에 제시된 서열 중 어느 하나로 구성된다.
[표 1] O-결합 당화 서열(밑줄)
Figure pct00001
표 1에 기재된 O-결합 당화 서열은 O-글리칸 태그의 표지화/변형에 의해 제공되는 특성을 통해 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드에 유리한 특성을 부여할 수 있다.
본 발명자는 조작된 O-결합 당화 서열의 존재가 단백질분해성 절단을 억제하는 O-글리칸의 존재를 통해 조작된 O-결합 당화 서열이 없는 치료 단백질과 비교하여 본 발명의 O-당화 재조합 치료 단백질의 반감기를 증가시킬 잠재성을 갖는 것을 제시하였다(실시예 2 참조).
조작된 O-결합 당화 서열의 존재는 대안적으로 또는 추가적으로 O-글리칸 태그의 존재를 통해 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드의 유체역학적 직경에 대한 변화를 발생시킬 수 있다.
본원에 기재된 조작된 O-결합 당화 서열은 숙주 치료 폴리펩티드 활성에 대한 실질적인 유해 효과를 갖지 않으면서 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드의 O-글리칸 변형을 정확하게 표적으로 하는 능력을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 O-결합 당화 서열을 포함하는 O-당화 폴리펩티드를 제공하며, 상기 O-결합 당화 서열은 표 1에 제시된 것들로부터 선택/유래된 서열을 포함하고, 후속 O-결합 당화 서열은 O-글리칸에 공유적으로 결합된다. 일 구현예에서, O-당화 폴리펩티드는 본원의 어디에든 정의된 바와 같은 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드의 특징을 갖는다. 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드의 컨쥬게이트 형태에 관한 하기 논의는 본 발명의 O-당화 폴리펩티드와 동일하게 적용될 수 있다.
O-당화를 위한 시약
O-당화를 위한 시약은 전형적으로 (i) 글리칸 및 (ii) 촉매 트랜스페라제효소를 포함한다. (i) 및 (ii)의 상이한 유형은 전형적으로 상이한 결과적인 글리칸 구조를 생성하기 위해 조합되며, 많은 글리칸은 성숙을 달성하기 위해 (i) 및 (ii) 중 하나 초과의 유형을 필요로 한다. 세포 유형에 의해 제공되는 글리칸의 특징은 (i) 및 (ii)의 이용 가능성/발현에 의해 제어된다. 이러한 환경은 당업자에 의해 변화될 수 있다. 예를 들어, CHO 세포는 전형적으로 코어 1 글리칸 구조를 제공하나, 이는 글리칸 고갈 또는 촉매 트랜스페라제 과발현 또는 넉아웃(knockout)에 의해 변경될 수 있다.
촉매 트랜스페라제 효소는 치료 폴리펩티드에 포함된 조작된 O-결합 당화 서열로의 글리칸의 전달이 발생하는 O-당화 반응을 촉매하는 것이 이해될 것이다. 일부 상황에서, 글리칸은 탈보호, 에피머화 및/또는 활성화(예를 들어, 인산화/뉴클레오티드 커플링) 효소를 필요로 할 수 있음이 이해될 것이다.
일 구현예에서, 글리칸은 세포 흡수를 촉진하는 GalNAc 또는 GalNac 유도체, 예를 들어, Ac4GalNAc이다. GalNAc은 이의 매우 우선적 사용으로 인해 O-글리칸 가공에 유리하다.
일 구현예에서, 글리칸은 GlcNAc, 푸코스, 자일로스, 갈락토스, 시알산 또는 만노스이다. 특정 글리칸의 적합성은 존재하는 트랜스페라제를 결정하는 세포주 및 그것이 유래되는 종에 좌우될 것이다. 특정 트랜스페라제가 결여된 세포주에서, 이들은, 예를 들어, 재조합 기술을 이용하여 외인성으로 도입될 수 있다.
일 구현예에서, O-글리칸은 작용기의 첨가 또는 치환에 의해 변형된다. 이러한 작용기는 후속 반응, 예를 들어, 클릭-화학 반응에서 사용될 수 있는 반응성 기를 제공할 수 있다. 일 구현예에서, O-글리칸은 아지드 작용기로 표지된다. 또 다른 구현예에서, 작용기는 직접적인 이점을 제공할 수 있고, 이러한 작용기는 이러한 효과를 전달한다. 일 구현예에서, O-글리칸은 추가의 사슬 연장을 방지하도록 보호된다. 자연 구제 경로 및 ppGalNAc-Ts를 여전히 수용하는 일부 성공적인 O-GalNAc 유도체의 세부사항이 발견될 수 있다(dx.doi.org/10.1021/cb200511t).
하나 이상의 O-글리칸의 표지화는 임의의 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 아지드는 세포의 글리칸 생합성 경로, 예를 들어, 만노스를 NANA로 전환시키기 위한 시알산 경로를 이용함으로써 변형된 폴리펩티드의 하나 이상의 O-글리칸으로 통합될 수 있다(예를 들어, ManNAz를 공급하는 것은 아지드 표지된 시알산 잔기를 발생시킬 것이다). GalNAc(또는 GlcNAc) 경로의 중간물에 대해 유사한 접근법이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, GalNAc의 아지도 유사체, 예를 들어, N-아지도아세틸갈락토사민(GalNAz), 또는 GlcNAc의 아지도 유사체, 예를 들어, N-아지도아세틸글루코사민(GlcNAz)이 세포 배양 배지(테트라 아세틸화 형태)로 첨가될 수 있다. 상기 구현예에서, 세포는 아지도 함유 잔기를 치료 폴리펩티드로 조작된 하나 이상의 O-글리칸 태그에 통합시킨다.
일 구현예에서, 아지드 표지화는 아지드 함유 화합물을 세포 배양 배지에 첨가함으로써 수행될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 아지드 함유 전구체, 예를 들어, Ac4GalNAz 또는 Ac4GlcNAz가 세포 배지에 첨가될 수 있다. 상기 기질은 세포의 구제 경로를 통해 처리되는데, 이는 O-글리칸 가공에 대해 더 큰 특이성을 가지고, 이에 따라 더 나은 세포-성장 및 단백질 품질/수율을 발생시키므로 바람직하다.
일 구현예에서, 유도체화된 글리칸은 Ac4GalNAz이다. 따라서, 일부 구현예에서, 적어도 150 μM, 적어도 200 μM, 적어도 250 μM, 적어도 300 μM, 적어도 350 μM, 적어도 400 μM, 적어도 450 μM, 적어도 500 μM, 적어도 550 μM, 적어도 600 μM, 적어도 650 μM, 적어도 700 μM, 적어도 750 μM, 적어도 800 μM, 적어도 850 μM, 적어도 900 μM, 적어도 950 μM, 적어도 1000 μM, 적어도 2000 μM, 적어도 3000 μM, 적어도 4000 μM, 또는 적어도 5000 μM의 Ac4GalNAz가 세포 배양 배지에 첨가된다.
일 구현예에서, 촉매 트랜스페라제 효소는 폴리펩티드 N-아세틸갈락토사미닐트랜스페라제이다.
일 구현예에서, 촉매 트랜스페라제 효소는 ppGalNAc 트랜스페라제 패밀리의 구성원, 예를 들어, ppGalNAc-T2이다. 다른 GalNAc 트랜스페라제 효소는 GalNAc-T4, GalNAc-T7 및 GalNAc-T10을 포함한다. 이들 촉매 트랜스페라제 효소는 변형될 수 있고, 예를 들어, 렉틴 도메인 결실되거나, 렉틴 도메인 변형될 수 있다. 이들 촉매 트랜스페라제 효소는 외인성 또는 내인성일 수 있다. 원하는 활성에 따라, 이들은 과발현되거나 넉아웃될 수 있다.
세포주 조작 및 세포 배양 조건 둘 모두는 방법의 최적화와 관련된 것으로 간주된다. 최적화는 단백질에 통합된 변형된 당의 높은 상동성 수율로 재조합 단백질의 발현을 개선시키는 것이다.
일 구현예에서, 고전적인 레르와르(Leloir)/데 노보(de novo) 경로를 통하기보다는 구제 경로를 통해 O-당화가 진행되도록 촉진/강제하기 위해 배양 조건 및 공급물이 조작될 수 있다. 구제 경로의 이용은 생성되는 O-당화 치료 펩티드 사이에서 높은 수준의 균질성을 제공한다. 다수의 수단에 의한 구제 경로를 통해 반응을 강제할 수 있다. 세포를 글루코스에 대해 고갈시키면 기질의 고전적인 경로를 박탈시키고, 구제 경로를 활성화시킬 수 있다. 또 다른 구현예에서, 구제 경로를 촉진시키는 것은 고전 경로를 구제 경로에 연결시키는 것을 담당하는 효소(예를 들어, GALE와 같은 이성화효소)의 넉아웃 또는 억제에 의해 달성될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 구제 경로를 촉진시키는 것은 숙주 단백질(예를 들어, 전달체, 인산화효소 및 우리딜 트랜스페라제 효소)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 구제 경로의 RDS를 과발현시킴으로써 달성될 수 있다.
당 구조의 신장
일 구현예에서, 도입된 O-글리칸은 글리칸 구조의 신장을 가능하게 한다. 글리칸 구조의 신장은 전체적/부분적으로 시알리드화(sialidated)될 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 일반적인 뮤신-타입 글리칸 구조(예를 들어, 코어 1)를 생성할 수 있다. 대안적으로, 도입된 O-글리칸은 신장을 방지하거나, 특정 글리칸 구조의 형성을 촉진하기 위해, 예를 들어, 코어 1 구조로의 Tn 항원의 성숙을 방지하거나, 코어 1 에피토프의 시알리드화(변형된 GalNAc 또는 Gal 공급물로부터)를 방지하기 위해 차단기를 통합시키도록 변형될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 글리칸의 신장의 방지가 바람직한 경우, 세포 효소는 신장이 방지되도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 시알산 트랜스페라제(및 다른 특정 트랜스페라제)의 넉아웃에 의함. 대안적으로, 세포에 의한 임의의 당의 사용을 글리칸 성숙보다는 유지 및 성장으로 전환시키기 위해, 예를 들어, 글루코스 공급을 감소시킴으로써 당 구조의 신장을 촉진하지 않도록 세포 배양 배지에 대한 제어가 수행될 수 있다. 상기 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
발현 조건(세포 환경, 예를 들어, 자원/스트레스 및 세포 상속(cell heritage), 예를 들어, 세포-유형/종)은 상이한 성숙 O-글리칸 구조를 발생시키는 것으로 공지되어 있으며, 예를 들어, 글루코스 배지가 공급된 CHO 세포는 디시알리드화된 코어 1 뮤신-타입 O-글리칸을 유리하게 통합시킨다. 당업자는 조작된 O-당화 서열에 통합될 수 있는 상이한 O-글리칸 구조를 생성시키기 위해 상이한 세포 배양 환경이 적합화될 수 있고/있거나, 세포주가 조작될 수 있음을 인지할 것이다. 상이한 일차 트랜스페라제(예를 들어, 상이한 균주 또는 종으로부터의 ppGalNAc-Ts)는 상이한 서열 인지 및 다른 초기 사건(예를 들어, 증식)을 유도할 수 있음이 또한 인지될 것이다. 세포주/조건은 단백질 기능성을 구축(예를 들어, 아미드화 개선 또는 N-당화 제한)하기 위한 다른 목적으로 조작될 수 있음이 또한 예상된다.
O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트
또 다른 양태에서, 추가 분자가 O-글리칸에 부착되어 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 어디에 정의된 바와 같은 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드를 포함하는 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트를 제공하며, 추가 분자 M은 O-글리칸에 공유적으로 연결된다.
또 다른 양태에서, 추가 분자가 O-글리칸에 부착되어 하기 식을 포함하는 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트를 형성할 수 있다:
P-(O-글리칸)-M
상기 식에서, P는 조작된 재조합 치료 폴리펩티드를 나타내고, M은 P에 부착되기에 바람직한 분자를 나타낸다. 따라서, O-글리칸은 P와 M 사이의 연결기로 작용한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 식을 포함하는 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드 컨쥬게이트를 생성시키기 위한 방법을 제공한다:
P-(O-글리칸)-M
상기 식에서, P는 본 발명의 조작된 재조합 치료 폴리펩티드를 나타내고, M은 P에 부착되기에 바람직한 분자를 나타낸다. 상기 방법은,
(i) 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드를 제공하는 단계;
(ii) O-글리칸과 M을 반응시켜 O-글리칸에 M을 공유적으로 연결시키는 단계를 포함한다.
O-글리칸은 M 및 O-글리칸을 연결시키기 위해 M의 반응성 기와 반응할 수 있는 반응성 기를 가져야 하는 것이 이해될 것이다. 상기 연결은 클릭 화학 반응을 통해 형성될 수 있다. 클릭 화학은 우수한 선택성, 효율 및 쌍직교 적합성(biorthogonal compatibility)을 제공한다(일부 일반 클릭 화학에 대해서는 10.1039/B613014N 참조). 일 구현예에서, 반응은 아지드-알킨 커플링 반응을 포함한다(쌍직교 반응으로서 Cu-비함유 클릭의 예에 대해 10.1021/ar200148z 참조).
반응 단계에 대한 다른 적합한 커플링 반응은 바이오컨쥬게이션 분야에서 공지된 것, 예를 들어, 친핵성 치환(예를 들어, 아민 및 알콜과 아실 할라이드, 활성 에스테르의 반응), 친전자성 치환(예를 들어, 에나민 반응) 및 탄소-탄소 및 탄소-헤테로원자 다중 결합에 대한 첨가(예를 들어, 마이클 반응(Michael reaction), 디엘스-알더 첨가(Diels-Alder addition))를 포함한다. 커플링 반응에 참여하기 위해, 하기 열거되는 것과 같은 반응성 기가 존재하는 것이 바람직하다:
(a) N-하이드록시숙신이미드 에스테르, N-하이드록시벤즈트리아졸 에스테르, 산 할라이드, 아실 이미다졸, 티오에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 방향족 에스테르를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 카르복실기 및 이의 다양한 유도체;
(b) 예를 들어, 에스테르, 에테르, 알데하이드 등으로 전환될 수 있는 하이드록실기.
(c) 할라이드가, 예를 들어, 아민, 카르복실레이트 음이온, 티올 음이온, 카르반이온, 또는 알콕시드 이온과 같은 친핵성 기로 이후에 치환되어 할로겐 원자의 작용기에서 새로운 기의 공유 부착을 발생시킬 수 있는 할로알킬기;
(d) 예를 들어, 말레이미도 기와 같은 디엘스-알더 반응에 참여할 수 있는 친디엔체 기;
(e) 예를 들어, 이민, 하이드라존, 세미카르바존 또는 옥심과 같은 카르보닐 유도체의 형성, 또는 그리냐르 첨가 또는 알킬리튬 첨가와 같은 상기 메커니즘을 통해 후속 유도체화가 가능하도록 하는 알데하이드 또는 케톤 기;
(f) 예를 들어, 설폰아미드를 형성시키기 위한 아민과의 후속 반응을 위한 설포닐 할라이드 기;
(g) 예를 들어, 디설파이드로 전환되거나, 아실 할라이드와 반응될 수 있는 티올 기;
(h) 예를 들어, 아실화되거나, 알킬화되거나, 산화될 수 있는 아민 또는 설프하이드릴 기;
(i) 예를 들어, 고리화첨가, 아실화, 마이클 첨가 등을 겪을 수 있는 알켄; 및
(j) 예를 들어, 아민 및 하이드록실 화합물과 반응할 수 있는 에폭시드.
M은 임의의 컨쥬게이션 가능한 분자, 예를 들어, 또 다른 치료 폴리펩티드, Fc 도메인, 세포독소, 표지, 예를 들어, 형광단, 지질, 소분자, 예를 들어, PEG, 또는 나노입자를 포함할 수 있다.
M은 O-글리칸과의 커플링 반응에 참여하기에 적합한 반응성 기(예를 들어, 알킨 기)를 가질 필요가 있음이 이해될 것이다. 분자 M에 대한 알킨과 같은 반응성 기의 첨가는 당업자의 능력 내인 것으로 간주된다.
컨쥬게이션은 가교제의 사용을 포함할 수 있다. 바람직한 가교 시약은 다양한 제로-길이 및 비-제로-길이(예를 들어, PEGx 스페이서), 동종-이기능성 및 이종-이기능성 가교 시약으로부터 유래된다. 바람직한 동종- 및 이종-이기능성 시약은 아지드, 아미노, 설프하이드릴, 구아니디노, 인돌 또는 비특이적 기 등에 반응성일 수 있고, 일반적으로 O-글리칸 부위에서 더 넓은 범위의 잠재적 화학의 사용을 가능하게 할 수 있는 2개의 동일하거나 2개의 상이한 부위를 각각 함유한다.
일부 경우에, 예를 들어, O-글리칸에 M을 커플링시키기 위해 필요한 반응성 기를 제공하기 위해 먼저 M을 링커 기와 반응시키는 것이 필요할 수 있다:
단계 1: M' + 말레이미드-링커-알킨 → M'-링커-알킨
단계 2: M'-링커-알킨 + P-(O-글리칸) → P-(O-글리칸)-링커-M
다른 경우에, 예를 들어, 링커를 통해 M에 P-(O-글리칸)을 커플링시키기 위해 필요한 반응성 기를 제공하기 위해 먼저 P-(O-글리칸)을 링커 기와 반응시키는 것이 필요할 수 있다:
단계 1: P-(O-글리칸)' + 알킨-링커-말레이미드 → P-(O-글리칸)'-링커-말레이미드
단계 2: P-(O-글리칸)'-링커-말레이미드 + M) → P-(O-글리칸)-링커-M
상이한 GalNX 공급물의 사용을 통해 링커의 사용을 피하는 것이 바람직할 것으로 예상되지만, 링커의 사용은 세포가 공급물 비-천연 글리칸을 처리할 필요가 없으므로 수율 및 효율의 증가를 잠재적으로 가능하게 한다. 링커의 사용은 또한 생물정화(biopurification) 또는 공동-정제 동안 컨쥬게이션시킬 수 있는 장점을 제공할 수 있다.
일 구현예에서, P는 항체를 포함하고, M은 세포독소를 포함하여 P-(O-글리칸)-M은 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 나타낸다. 일 구현예에서, 하나 초과의 조작된 당화 서열은 ADC가 식 P-[(O-글리칸)-M]z(여기서, z는 1 초과임)을 갖도록 O-당화 치료 폴리펩티드에 존재한다. z는 약 2, 약 4, 약 6 또는 약 8일 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 화학 합성 반응과 같은 추가 반응을 위한 기질로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 클릭 화학 반응에 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "클릭 화학"은 열역학적 구동력이 높고, 부산물/폐기물 또는 가역성이 거의 없는 기질을 결합시키는 반응의 부류를 나타내는 데 사용된다. 클릭 화학 반응은 "하나의 포트", "구리 비함유" 반응에서 높은 수율의 반응 생성물을 제공할 수 있으며, 이는 신속하고 높은 반응 특이성으로 발생할 수 있다. 클릭 화학의 생체적합성은 산업에서 특히 중요하며, 가벼운 반응 조건 및 낮은 수용자 독성을 포함한 추가 장점을 제공한다. 조작된 부위에서 발생하도록 설계된 클릭 반응의 특이성 및 선택성은 부위 외 숙주 반응성을 방지한다.
클릭 화학은 아지드 작용기와 알킨 작용기를 컨쥬게이션시키는 데 사용될 수 있다. 이는 고전적으로 Cu(I) - CuAAC에 의해 촉매되는 휘스겐(Huisgen) 1,3-쌍극 고리화첨가(Cu-촉매된 아지드 알킨 고리화첨가)를 포함한다. 보다 최근에, 이는 감소된 세포독성으로 인해 보다 생체적합성인 Cu가 없는 반응(Cu-less reaction)을 포함하도록 발달되었다. 예로는 CuAAC와 거의 동일한 반응성 및 안정성의 협력된 [3+2] 고리화첨가인 계통 촉진 아지드-알킨 고리화첨가(Strain Promoted Azide Alkyne Cycloaddition; SPAAC)를 포함한다. 추가의 반응성 클릭 화학이 이용 가능하고, 새로이 발견된 클릭 화학이 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다(상이한 컨쥬게이션 효율의 우수한 입증에 대해 dx.doi.org/10.1021/cr400355w 참조).
예를 들어, 가능한 약물 전달 메커니즘으로서 생체 내 클릭 반응은 테트라진-TCO 커플링과 같은 더 높은 반응성 화학에 의존할 수 있다(dx.doi.org/10.1021/cr400355w 참조). 또 다른 구현예에서, 본 발명의 범위는 효소적 대사 과정을 통해 O-당화 서열에 통합될 수 있는 임의의 기; 천연 숙주 효소, 또는 변경된 특성을 예상하여 도입되거나 조작된 비-천연 효소를 포함한다. 예를 들어, 비-클릭 화학 또는 이미 기능성 기. 상기 구현된 설계에는 신규한 효소가 필요하다.
아지드 모이어티로 표지되는 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 클릭 화학 반응에 적합할 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 하나 이상의 O-글리칸에 대한 아지드 작용기의 부착에 의해 변형될 수 있다. 상기 단백질은 알킨 작용기를 함유하는 기질과 클릭 화학 반응을 겪을 수 있다. 상기 컨쥬게이션은 매우 특이적이며 비가역적이다.
따라서, 아지드 작용기로 표지되는 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드는 알킨 작용기를 함유하는 기질과 반응될 수 있다. 알킨 작용기를 함유하는 기질은 본 발명의 O-당화 재조합 치료 폴리펩티드에 컨쥬게이션시키기에 바람직한 임의의 기질일 수 있다. 대안적으로, 이러한 배열은 역전될 수 있고, O-글리칸은 유리 알킨을 제공할 수 있고, 기질은 유리 아지드를 제공할 수 있다.
숙주 세포주
임의의 적합한 숙주 세포가 조작된 치료 폴리펩티드의 발현에 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 조작된 치료 폴리펩티드는 포유동물 세포주에서 발현된다. 예를 들어, 조작된 치료 폴리펩티드는 CHO 세포주 또는 HEK 세포주에서 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, CHO 세포주가 사용된다. 다른 구현예에서, HEK293F 또는 HEK293T와 같은 HEK 세포주가 사용된다.
특히 적합한 세포주는 UDP-GalNAc의 데 노보 합성을 담당하는 에피메라제의 넉아웃을 함유하고, 이에 따라 구제 경로를 선호하는 CHO ldlD 세포일 것이다.
또 다른 특히 적합한 세포주는 UDP-갈락토스-4-에피메라제(GALE) 유전자의 넉아웃을 함유하는 HEK 세포일 것이다. 예를 들어, 문헌[Termini et al. (2017) PLoS ONE 12(6): e0179949]에 기재된 바와 같은 HEK293T GALE KO 세포.
세포주가 포유동물 세포주가 아닌 구현예에서, 다른 생성 시스템(예를 들어, 곤충 세포, E. 콜리)이 사용될 수 있다. 이들은 상기 세포 유형을 적합한 O-글리칸 제공 시스템으로 형질전환시키기 위해 외인성 효소 공동-발현을 필요로 할 수 있음이 인지될 것이다. 상기 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다.
숙주 세포주는 재조합 벡터로 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염될 수 있음이 이해될 것이다.
질병 치료 또는 예방
본 발명은 본 발명의 상기 언급된 생성물 중 임의의 생성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 환자의 질병을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 상기 언급된 생성물 중 임의의 생성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 상기 언급된 생성물의 제2의 의학적 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 상기 언급된 생성물 중 임의의 생성물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 구현예는 예시적인 예로서 이해되어야 한다. 추가의 구현예가 예견된다. 임의의 하나의 구현예와 관련하여 기재된 임의의 특징은 단독으로 또는 기재된 다른 특징과 조합하여 사용될 수 있고, 또한 임의의 다른 구현예의 하나 이상의 특징, 또는 임의의 다른 구현예의 임의의 조합과 조합하여 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 상기 기재되지 않은 동등물 및 변형이 또한 첨부된 청구범위에 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 이용될 수 있다.
본 발명의 개시의 맥락에서, 본원에 기재된 장치 및 방법의 다른 예 및 변형은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예 및 변형은 첨부된 청구범위에 제시된 바와 같은 본 발명의 개시의 범위 내에 있다.
실시예
실시예 1: O-결합 당화 서열의 개발
티모신-β4 단백질로부터의 짧은 아미노산 서열은 티모신-β4:링커:Fc-융합 단백질로서 N-말단에 존재하는 경우 O-당화를 발생시키는 것으로 밝혀졌다. 융합 단백질 내의 티모신-β4 아미노산 서열은 하기와 같다:
GSDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES (SEQ ID NO. 1)
이후, 티모신-β4 서열의 마지막 19개의 아미노산(밑줄로 표시됨)을 GLP-1:Fc-융합 단백질에 통합시키고, 존재하는 O-글리칸의 양을 측정하였다. 이후, 분자를 최적화시켰다. 최적화는 아미노산 잔기의 수 감소, 및 아미노산 잔기의 교환을 포함하였다. 최적화된 서열 및 이의 결과는 표 2에 제시되며, 야생형 TB4, 서열 PLPTAE(SEQ ID NO:9)를 함유하는 융합 단백질 및 서열 ATAEP(SEQ ID NO:13)를 함유하는 융합 단백질의 당화 프로파일은 도 1에 제시된다.
표 2 및 도 1로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 다수의 서열은 고도의 O-당화를 발생시켰으며, 융합 단백질은 주로 단일 글리칸(예를 들어, PLPTAE(SEQ ID NO:9)) 또는 다수의 글리칸(예를 들어, ATAEP(SEQ ID NO:13))을 함유하나, O-결합 당화 부위에 대한 변경의 효과는 완전히 예측 가능하지 않다.
[표 2] GLP-1:Fc 융합 단백질의 O-당화(분자 어디에나 글리칸을 갖는 O-당화 분자의 %)
Figure pct00002
실시예 2: O- 글리칸 특징화
이후, 추가로 실시예 1로부터의 서열의 선택을 특징으로 하였다.
글리코형 및 시알리드화의 수준
CHO 또는 HEK 세포에서 발현된 경우 융합 단백질에서의 존재하는 글리코형 및 시알리드화의 수준을 결정하기 위해 질량분광법을 이용하였다. 결과는 도 2에 제시된다.
SEC-MALS
융합 단백질의 물리화학적 특성을 SEC-MALS를 이용하여 측정하였다. 결과는 도 3에 제시된다.
설치류 PK 연구
융합 단백질의 약동학 특성을 작제물 반감기를 결정하기 위해 hGLP-1R 세포와 함께 HTFR cAMP 검정을 이용하여 래트에서 측정하였다. 도 4로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 서열 PLPTAE(SEQ ID NO:9)를 함유하는 융합 단백질은 야생형보다 약간 낮은 반감기를 가졌으며, 서열 ATAEP(SEQ ID NO:13)를 함유하는 융합 단백질은 야생형보다 긴 반감기를 가졌다.
펩티드 활성
최종적으로, 다수의 융합 단백질에 대한 펩티드 활성을 측정하였다. 결과는 도 5에 제시된다. 도면으로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 변경된 서열의 존재는 기능에 대한 영향이 낮다.
실시예 3: O-글리칸-태깅된 펩티드의 아지드 표지화
PTAEPG(SEQ ID NO:41) O-당화 서열을 갖는 재조합 Fc 단백질을 일시적으로 발현하는 CHO 세포를 Ac4GalNAz를 함유(및 보충 없이 계대배양 잔류 글로코스만 함유)하는 배양 배지에서 72시간 동안 37℃에서 배양하였다. 증가하는 농도의 Ac4GalNAz에서 배양된 세포에서 글리칸 GalNAc 및 GalNAz의 점유 백분율을 측정하였고, 결과는 도 6에 제시된다. 도 6으로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 융합 단백질을 일시적으로 발현하는 CHO 세포의 Ac4GalNAz 공급은 높은 수준의 GalNAz 통합을 발생시킨다.
추가 실험에서, 세포를 상이한 환경 조건(수확까지의 시간 및 온도) 하에서 인큐베이션하고, O-글리칸 프로파일을 측정하였다. 표지된 당이 유리하게 통합되도록 배양 과정을 추가로 최적화시키기 위한 수단이 여기서 관찰된다. 이는 글루코스-고갈 성장 상태에서 구제 경로의 사용을 선호하는 세포에 기인할 수 있다. 글루코스가 고갈된 세포 및 표지화 제제는 O-글리칸을 불량하게 발현하며, 이는 글리칸 가공(예상된 필수적 공정으로의 글루코스의 전환)에 대한 영양소 이용 가능성의 필수적 역할을 나타낸다. 또한, 이들 결과는 온도와 같은 세포 배양 조건을 변화시킴으로써 GalNAz 표지화를 조절하는 것이 가능한 것을 입증한다. 본 발명자는 또한 구제 경로 이용에 대한 CHO 세포의 선호를 관찰하였다(특정 조건 하 - 예를 들어, 글루코스 고갈). 그리고, 또한 CHO 세포의 특징적인 발현 패턴(예를 들어, 코어 1 발현에 대해서만 선호, 이는 세포가 글루코스 회수에 의한 스트레스 하에 있는 경우 시알리드화되지 않은 형태로 제한된다).
실시예 4: 클릭 화학: 알킨 기의 첨가
Fc 단백질로의 GalNAz 표지의 성공적인 통합 후, 알킨기를 함유하는 모이어티(예를 들어, DBCO 또는 DIBO)를 GalNAz-표지된 단백질에 "클릭"하기 위한 실험을 수행하였다.
도 7의 첫 번째 패널에서, 글리칸이 통합되지 않은 Fc, O-글리칸을 갖는 Fc("표지되지 않음") 및 GalNAz 통합된 Fc("표지됨")에 해당하는 3개의 피크가 존재한다.
도 7의 두 번째 패널은 링커의 첨가 후의 피크를 제시하고, 세 번째 패널은 알킨기를 함유하는 모이어티의 첨가 후의 피크를 제시한다. GalNAz를 함유하지 않는 Fc 및 GalNAz-표지된 Fc에 해당하는 피크에 더하여, 알킨기를 함유하는 모이어티의 알킨기로 "클릭"된 GalNAz-표지된 Fc에 해당하는 피크가 또한 존재한다.
실시예 5: 클릭 화학: 이기능성 가교제와의 컨쥬게이션
이종이기능성 가교제; Fc-스캐폴드 + 펩티드 컨쥬게이션
컨쥬게이션은 이종이기능성 가교제(DBCO-말레이미드 및 DBCO-PEG4-말레이미드)의 사용을 포함하였다. 정제 없이 하나의 포트 방식으로 SPAAC와 함께 말레이미드 보충 펩티드(유리-티올을 제시함)를 사용하였다(1:4:16의 아지드/알킨-말레이미드/유리-티올). 이는 우수한 수준의 컨쥬게이션 효율을 제공하였다.
동종이기능성 가교제; Fc-스캐폴드 이량체
컨쥬게이션은 동종이기능성 가교제(DBCO-PEG4-DBCO)를 통한 O-GalNAz를 제시하는 Fc-스캐폴드의 이량체화를 포함하였다. SPAAC는 과도한 링커가 존재하고, 고정화가 없더라도 성공적으로 컨쥬게이션된 종을 생성하였다.
실시예 6: CHO K1 GALE KO에서의 O- 글리칸 태깅된 펩티드의 아지드 표지화
CHO K1 GALE 넉아웃 세포를 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 이용하여 생성시켰다. CHO UDP-글루코스 4-에피메라제 유전자(GALE; NW_003622938.1)를 표적으로 하는 CRISPR 가이드 RNA(gRNA)를 작제하였다. 간단히, 5'- ccacacggtactggagctgc-3' (엑손2), 5'- gtactggagctgctggaggc - 3' (엑손2) 및 5'- cggcgggtccaggaactgac - 3' (엑손3)의 3개의 gRNA를 HAM F12 배지에서 성장된 CHO K1 세포로 공동 형질감염시켰고, 이러한 플라스미드는 또한 CRISPR 형질감염된 세포의 확인을 위한 RFP 리포터 유전자를 발현한다. RFP-양성 세포를 FACS-기반 분류에 의해 단일 세포 클론으로 분류하였다. 이후, 클론을 웨스턴 블롯 분석에 의해 GALE KO에 대해 스크리닝하였다.
CHO K1 GALE KO Fc-PTAEPG-발현 세포를 Fc-PTAEPG-함유 렌티바이러스 입자를 이용한 CHO K1 GALE KO 세포의 형질도입에 의해 생성시켰다. Fc-PTAEPG 렌티바이러스 입자를 상업적으로 이용 가능한 3세대 통합 렌티바이러스 벡터를 이용하여 생성시켰다. Fc-PTAEPG 단백질을 포유동물 선택 제제 퓨로마이신에 대한 내성을 인코딩하는 유전자를 공동 발현하는 렌티바이러스 벡터의 발현 카세트로 클로닝하였다. 둘 모두의 유전자는 고 발현 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 제어 하에 있었다. Fc-PTAEPG-발현 세포의 푸울(pool)을 2주 동안 10 ㎍/㎖ 퓨로마이신에서의 세포 선택 후에 분리시켰다. Fc-PTAEPG 단백질의 표지화를 위해, CHO K1 Fc-PTAEPG 세포를 4일 동안 보충물을 함유하지 않은 혈청 비함유 배지 또는 75μM의 GalNAc 또는 GalNAz를 함유하는 혈청 비함유 배지에서 인큐베이션하였다. 상기와 같이 생성된 CHO K1wt Fc-PTAEPG 세포 푸울을 대조군으로 제공하였다. 세포 배지로부터 단백질을 정제하였다. 단백질을 PNGaseF를 이용하여 탈-N-당화시킨 후, 디설파이드 환원시키고, UPLC 및 QToF 질량분광법을 이용하여 LC-MS로 분석하였다(도 8).
실시예 7: HEK 293F GALE KO에서의 Fc 및 IgG 융합과 관련한 O- 글리칸 태깅된 펩티드의 아지드 표지화
HEK293F 세포주는 현탁 배양물에서 성장하고, 일시적 형질감염 후에 높은 세포 밀도 및 높은 재조합 단백질 수율을 달성할 수 있는 HEK293 세포의 클론 변이체이다. 효율적인 CRIPSR/Cas9-매개 유전자 넉아웃을 달성하는 것은 현탁 배양에서 난제이다. 따라서, 높은 수준의 유전자 넉아웃을 보장하는 하기 절차가 고안되었다. HEK293F 세포를 폴리-D-리신 처리된 세포 배양 플레이트에서 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 FreeStyle 293 발현 배지(Thermo Fisher)에서 세포를 배양함으로써 부착성으로 만들었다. 이후, 부착성 HEK293F 세포를 인간 UDP-글루코스 4-에피메라제 유전자(GALE; NC_000001.11)를 표적으로 하는 CRISPR/Cas9 플라스미드로 형질감염시켰다. 간단히, 5'- gtactggagctgctggaggc - 3' (엑손3) 및 5'- cggcgggtccaggaactgac - 3' (엑손4)의 2개의 gRNA를 HEK293F 세포로 공동 형질감염시켰고, 이러한 플라스미드는 또한 CRISPR 형질감염된 세포의 확인을 위한 RFP 리포터 유전자를 발현한다. RFP-양성 세포를 FACS-기반 분류에 의해 단일 세포 클론으로 분류하였다. 클론을 웨스턴 블롯 분석에 의해 GALE KO에 대해 스크리닝하였다. HEK293F GALE KO 클론을 확인한 후, 세포를 현탁 배양에 재적합화시켜 최종 현탁액 HEK293F GALE KO 세포주를 생성시켰다. 배양 배지의 FBS 농도를 1주일의 기간에 걸쳐 10%에서 5%, 5%에서 2%로 순차적으로 낮춤으로써 현탁 배양에 대한 신속한 재적합화를 달성하였고, 이후 세포를 일상적인 배양을 위한 FreeStyle 배지 중 1 x 106 세포/㎖로 진탕 플라스크 배양물에 직접 시딩하였다.
HEK293F GALE KO 세포를 PTAEPG(SEQ ID NO:41) O-당화 서열을 갖는 Fc 또는 IgG 단백질을 발현하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 50μM Ac4GalNaz로 조건부로 보충된 FreeStyle 배양 배지에서 5일 동안 37℃에서 배양하였다. 단백질을 세포 배지로부터 정제하고, GalNAz 함유 단백질을 실온에서 PBS 중의 2배 몰 과량의 AF488-DBCO(Click Chemistry Tools #1278)를 이용하여 클릭-화학 반응에 적용시켰다. 단백질을 실시예 6에 기재된 바와 같이 LC-MS를 이용하여 분석하였다(도 9a 및 도 9b).
FACS 분석을 위해, 세포 수용체 A를 표적으로 하는 인간 IgG1 항체(IgG-A-PTAEPG)를 이용하였다. FACS 분석을 위한 세포의 면역형광 염색을 다음과 같이 수행하였다: Fc 수용체 차단 mAb 및 10% FBS의 용액에서 세포를 인큐베이션시킴으로써 수용체 A를 발현하는 세포에 대한 비특이적 결합을 차단하였다. 이후, 차단된 세포를 20분 동안 10 ㎍/㎖의 농도로 "클릭" 화학에 의해 생성된 수용체 A-특이적 IgG1-A-PTAEPG-AF488 또는 클릭 화학에 의해 생성된 대조군 Fc-PTAEPG-AF488과 함께 인큐베이션하였다. 과량의 염색을 세척하고, 세포에서의 수용체 발현의 FACS 분석을 표준 프로토콜을 이용하여 수행하였다(도 10).
SEQUENCE LISTING <110> MedImmune Limited <120> ENGINEERED O-GLYCOSYLATION IN RECOMBINANT POLYPEPTIDES AND USES THEREOF <130> OGLYC-100-US-PSP <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> i0 <400> 1 Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr 20 25 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> i1 <400> 2 Lys Asn Pro Leu Pro Thr Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala 1 5 10 15 Gly Glu Ser <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> i1+10T <400> 3 Lys Asn Pro Leu Pro Thr Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Thr 1 5 10 15 Gly Glu Ser <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> i2 <400> 4 Lys Asn Pro Leu Pro Thr Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> i1-11T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(6) <223> X is any amino acid <400> 5 Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Asn Pro Leu Pro Thr Lys Glu Ala Ile 1 5 10 15 Glu Gln Glu Lys 20 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> i3 <400> 6 Lys Asn Pro Leu Pro Thr Lys Glu Thr Ile Glu 1 5 10 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> i4 <400> 7 Lys Asn Pro Leu Pro Thr Lys Glu Thr 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> i6 <400> 8 Pro Leu Pro Thr Lys Glu 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> i6 +1A <400> 9 Pro Leu Pro Thr Ala Glu 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> i6 +3P <400> 10 Pro Leu Pro Thr Lys Glu Pro 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> i6 dbl <400> 11 Pro Leu Pro Thr Ala Glu Pro 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> i7 dbl <400> 12 Pro Thr Ala Glu Pro 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> i8 P-1A <400> 13 Ala Thr Ala Glu Pro 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT 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protein <400> 20 Lys Gly Lys Asn Pro Leu Pro Thr Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Gly Glu Ser Ala Ala Ala Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala 20 25 30 Thr <210> 21 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> O-glycosylation of GLP-1:Fc fusion protein <400> 21 Lys Gly Lys Asn Pro Leu Pro Thr Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys 1 5 10 15 Gln Thr Gly Glu Ser Ala Ala Ala Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala 20 25 30 Thr <210> 22 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> O-glycosylation of GLP-1:Fc fusion protein <400> 22 Lys Gly Lys Asn Pro Leu Pro Thr Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys 1 5 10 15 Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr 20 25 <210> 23 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> O-glycosylation of GLP-1:Fc fusion protein <400> 23 Lys Gly Lys Asn Pro Leu Pro Thr Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys 1 5 10 15 Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr 20 25 <210> 24 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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<220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(11) <223> X is any amino acid <400> 43 Xaa Xaa Xaa Pro Thr Ala Glu Pro Xaa Xaa Xaa 1 5 10

Claims (20)

  1. O-당화 재조합 치료 단백질을 생성시키기 위한 방법으로서,
    a. 적어도 하나의 O-결합 당화 서열이 재조합 치료 단백질에서 O-글리칸에 공유적으로 결합되도록 세포 배양 배지의 존재하에서 숙주 세포에서 조작된 치료 단백질을 발현시키는 단계로서,
    i. 조작된 치료 단백질이 적어도 하나의 조작된 O-결합 당화 서열을 포함하고;
    ii. 세포 배양 배지가 O-당화를 위한 시약을 포함하는, 단계; 및
    b. 선택적으로, 재조합 치료 단백질을 정제하는 단계를 포함하는,
    방법.
  2. 제1항에 있어서,
    a. 적어도 하나의 조작된 O-결합 당화 서열을 포함하는 조작된 치료 단백질을 인코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터를 획득하는 단계; 및
    b. 숙주 세포를 발현 벡터로 형질감염시키는 단계를 추가로 포함하는,
    방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 배양 배지가 O-글리칸이 아지드로 표지되도록 아지드 함유 화합물을 포함하는 방법.
  4. 제4항에 있어서, 아지드 함유 화합물이 GalNAz인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 O-당화 재조합 치료 단백질.
  6. 적어도 하나의 O-글리칸에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 조작된 O-결합 당화 서열을 포함하는 O-당화 재조합 치료 단백질로서, 천연 당화 패턴을 추가로 포함하는, O-당화 재조합 치료 단백질.
  7. 제6항에 있어서, O-글리칸이 아지드 작용기로 표지되는 O-당화 재조합 치료 단백질.
  8. O-결합 당화 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 O-결합 당화 서열이 표 1에 제시된 것들로부터 선택된 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  9. O-결합 당화 서열을 포함하는 O-당화 폴리펩티드로서, 상기 O-결합 당화 서열이 표 1에 제시된 것들로부터 선택된 서열을 포함하고, 상기 O-결합 당화 서열이 O-글리칸에 공유적으로 결합된, O-당화 폴리펩티드.
  10. 조작된 치료 단백질을 발현하는 숙주 세포로부터 O-당화 재조합 치료 단백질을 생성시키기 위한 O-당화를 위한 시약을 포함하는 세포 배양 배지의 용도로서,
    a. 조작된 치료 단백질이 적어도 하나의 조작된 O-결합 당화 서열을 포함하고;
    b. 재조합 치료 단백질이 적어도 하나의 O-글리칸에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 조작된 O-결합 당화 서열을 포함하는,
    용도.
  11. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 O-당화 재조합 치료 단백질 또는 제8항 또는 제9항에 따른 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  12. 약제로서 사용하기 위한 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 O-당화 재조합 치료 단백질 또는 제8항 또는 제9항에 따른 폴리펩티드.
  13. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 O-당화 재조합 치료 단백질 또는 제8항 또는 제9항에 따른 폴리펩티드를 환자에 투여하는 단계를 포함하는 환자의 질병을 치료하거나 예방하는 방법.
  14. O-당화 재조합 치료 단백질 컨쥬게이트를 생성시키기 위한 방법으로서,
    a. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 O-당화 재조합 치료 단백질 또는 제8항 또는 제9항에 따른 폴리펩티드를 제공하는 단계; 및
    b. O-글리칸과 재조합 치료 단백질에 부착되는 것이 바람직한 분자의 반응성 기를 반응시켜 O-글리칸에 분자를 공유적으로 연결시키는 단계를 포함하는,
    방법.
  15. 제14항에 있어서, 반응이 아지드-알킨 커플링 반응을 포함하는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항의 방법에 따라 생성된 O-당화 재조합 치료 단백질 컨쥬게이트.
  17. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 O-당화 재조합 치료 단백질 또는 제8항 또는 제9항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 O-당화 재조합 치료 단백질 컨쥬게이트로서, 재조합 치료 단백질에 부착되기에 바람직한 분자가 O-글리칸에 공유적으로 연결되는, O-당화 재조합 치료 단백질 컨쥬게이트.
  18. 제16항 또는 제17항에 따른 O-당화 재조합 치료 단백질 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  19. 약제로서 사용하기 위한 제16항 또는 제17항에 따른 O-당화 재조합 치료 단백질 컨쥬게이트.
  20. 제16항 또는 제17항에 따른 O-당화 재조합 치료 단백질 컨쥬게이트를 환자에 투여하는 단계를 포함하는 환자의 질병을 치료하거나 예방하는 방법.
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