ES2710313A2

ES2710313A2 - Composicion para la prevencion de la trombogenesis y procedimiento para fabricacion de la misma

Info

Publication number: ES2710313A2
Application number: ES201790037A
Authority: ES
Inventors: Leslie Roy Berry; Attilio Difiore; Anthony Kam Chuen Chan
Original assignee: Attwill Medical Solutions Inc
Current assignee: Attwill Medical Solutions Inc
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2016-04-15
Publication date: 2019-04-24
Anticipated expiration: 2036-04-15
Also published as: AU2016249391A1; CA2982832A1; WO2016168710A1; US20190030066A1; JP2018513217A; GB2554296A; ES2710313R1; ES2710313B1; GB201718876D0; US20170020911A1

Abstract

Se propone una composición y un procedimiento para prevención de la trombogénesis que pueden incluir antitrombina y heparina. En un ejemplo, puede estar presente un conjugado de antitrombina y heparina donde al menos un 50% en peso de la heparina se conjuga con antitrombina. Asimismo, en un ejemplo, al menos un 98% en peso de la heparina de la composición tiene un peso molecular superior a 3.000 Daltons.

Description

DESCRIPCION

Composicion para la prevencion de la trombogenesis y procedimiento para fabricacion de la misma.

Antecedentes

La heparina es un sacarido polisulfatado que consiste en buena medida en una 5 secuencia alternante de hexacido uronico y 2-amino-2-desoxi-D-glucosa. La heparina y un compuesto relacionado, el dermatan sulfato, tienen una gran importancia como anticoagulantes de uso clmico, para la prevencion de la trombosis y enfermedades afines. Ambos son miembros de la familia de los glicosiaminoglicanos, (GAGs), que consisten en cadenas lineales de unidades repetitivas de disacaridos sulfatados que contienen una 10 hexosamina y un acido uronico. La anticoagulacion a traves de los GAGs (como la heparina y el dermatan sulfato) tiene lugar a traves de su catalisis de inhibition de las enzimas coagulantes (siendo la mas importante la trombina) mediante inhibidores de la serina proteasa (serpinas) como la antitrombina III (a la que en el presente documento se denominara simplemente “antitrombina” o "AT”) y el cofactor II de la heparina (HCII). La 15 union de las serpinas por los catalizadores es fundamental para su action, y tiene lugar mediante secuencias espedficas a lo largo de la cadena lineal de carbohidrato del glicosiaminoglicano (GAG). La heparina actua enlazandose a la AT a traves de una secuencia de pentasacaridos, potenciando de este modo la inhibicion de diversas enzimas coagulantes (en el caso de la trombina, la heparina tambien se une a la enzima). La 20 heparina tambien puede potenciar la inhibicion de la trombina enlazandose a la serpina HCII. El dermatan sulfato actua uniendose espedficamente al HCII a traves de una secuencia de hexasacaridos, potenciando asi tan solo la inhibicion de la trombina. Dado que los glicosiaminoglicanos (y concretamente, la heparina) pueden unirse a otras moleculas in vivo o perderse de su emplazamiento de accion a causa de diversos mecanismos, resultaria 25 ventajoso mantener el GAG permanentemente asociado a la serpina mediante un enlace covalente. De forma mas detallada, seria deseable proporcionar conjugados covalentes de la heparina u otros glicosiaminoglicanos afines que mantengan una elevada actividad biologica (por ejemplo, su actividad anticoagulante) y unas mejores propiedades farmacocineticas, y cuyo procedimiento de preparation resulte sencillo.

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Breve descripcion de las figuras

La figura 1 es un grafico que muestra la absorcion (A215 vs. H2O) de cada fraccion de heparina eluida a partir de una columna de cromatografia Sephadex® G-200,

La figura 2 es un grafico que muestra la absorcion de las fracciones de AT conjugada con heparina y las fracciones de AT en solitario eluidas a partir de una columna de 5 cromatografia Sephadex® G-200,

La figura 3 es un grafico que muestra la absorcion (A405 vs. H2O) de mezclas de reaccion de cuatro reacciones diferentes con las que se investigaba un complejo covalente antitrombina-heparina.

La figura 4 es un grafico que muestra la absorcion (A405 vs. H2O) de mezclas de 10 reaccion de tres reacciones diferentes con las que se investigaba un complejo covalente antitrombina-heparina que se hada liofilizado a partir de una solucion de elevada salinidad (concentrada).

Ha de ponerse de relieve que las figuras constituyen meros ejemplos de diversas realizaciones, y que no pretenden introducir ningun tipo de limitacion al alcance de la 15 presente invencion.

DESCRIPCION DETALLADA

A continuacion se hara referencia a una serie de ejemplos de realization, y se 20 utilizara un lenguaje espedfico para la descripcion de los mismos. No obstante, ha de entenderse que ello no pretende introducir limitacion alguna al ambito de lo revelado en este documento. Las alteraciones y posteriores modificaciones de las caracteristicas de la invention que se describen en este documento, asi como las aplicaciones adicionales de los principios de la tecnologia descrita en el mismo, que se le ocurririan a cualquier experto en 25 la materia que estuviese en posesion de lo aqu divulgado, han de considerarse incluidas en el ambito de lo divulgado. Asimismo, antes de divulgar y describir realizaciones espedficas, ha de entenderse que lo aqu divulgado no se limita al proceso y materiales espedficos que aqu se revelan, ya que pueden variar en cierta medida. Tambien debe entenderse que la terminologia utilizada en el presente documento se utiliza con el fin exclusivo de las 30 realizaciones espedficas, y que no pretende ser limitativa, dado que el alcance de lo que aqu se divulga vendra definido exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.

A la hora de describir y reivindicar la presente tecnologia, se utilizara la siguiente terminologia.

35 Las formas en singular "un,” "una,” y "el” incluyen referencias al plural, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. De este modo, por ejemplo, la referencia a "un aditivo” incluye loa referencia a uno o mas de dichos componentes, "una solucion” incluye la referencia a uno o mas de dichos materiales, y una "etapa de mezclado” se refiere a una o mas de dichas etapas.

Tal y como se utiliza en este documento, "sustancial” , cuando se utiliza en referencia 5 a una cantidad de un material, o a una caracteristica espedfica del mismo, se refiere a una cantidad que resulte suficiente para proporcionar el efecto que dicho material o caracteristica deberia proporcionar. El grado exacto de desviacion permisible puede depender en ciertos casos del contexto espedfico.

Tal y como se utiliza en el presente documento, "en torno a” se refiere a un grado de 10 desviacion basado en el error experimental ripico de la propiedad espedfica identificada. El grado de amplitud del termino "en torno a” dependera del contexto y de la propiedad espedficos, y podra ser identificado facilmente por cualquier experto en la materia. El termino "en torno a” no pretende ampliar ni limitar el grado de equivalentes que podrian atribuirse a un valor espedfico. Ademas, y a menos que se indique otra cosa, el termino "en 15 torno a” incluira expresamente "exactamente,” en lmea con las observaciones efectuadas mas adelante en relacion con los rangos y datos numericos.

Las concentraciones, dimensiones, cantidades y otros datos numericos pueden presentarse en este documento en formato de rango. Ha de entenderse que dicho formato de rango se utiliza exclusivamente por comodidad y deberia interpretarse de manera 20 flexible, de forma que incluya no solo los valores numericos explicitamente indicados como limites del rango, sino todos los valores numericos individuales o sub-rangos incluidos dentro del rango, como si se mencionase explicitamente cada uno de dichos valores numericos y sub-rangos. Por ejemplo, un rango situado entre 1 y en torno a 200 deberia interpretarse de forma que no solo incluya los limites explicitamente indicados de 1 y 200, 25 sino que tambien incluya tamanos individuales como 2, 3, 4, y sub-rangos como de 10 a 50, de 20 a 100, etc.

Tal y como se utiliza en el presente documento, una pluralidad de elementos, elementos estructurales, elementos compositivos y/o materiales puede presentarse por comodidad en una lista comun. No obstante, dichas listas habran de interpretarse como si 30 cada elemento de la lista se identificase individualmente como un numero independiente y singular. De este modo, no debera interpretarse ninguno de los elementos individuales de dicha lista como un equivalente de facto a cualquier otro elemento de la misma lista, basandose exclusivamente en su presentacion en un grupo comun, a menos que se indique lo contrario.

35 Tal y como se utiliza en el presente documento, "hexosa” se refiere a un carbohidrato (C6H12O6) que contiene seis atomos de carbono. Las hexosas pueden ser aldohexosas como, por ejemplo, glucosa, manosa, galactosa, idosa, gulosa, talosa, alosa y altrosa, cuya forma de cadena abierta contiene un grupo aldehido. Alternativamente, las hexosas pueden ser cetosas como la fructosa, sorbosa, alulosa y tagatosa, cuya forma de cadena abierta contiene un grupo cetona.

5 Tal y como se utiliza en el presente documento, “acido uronico” se refiere al acido carboxflico formado por la oxidacion del grupo hidroxilo primario de un carbohidrato, y normalmente toman su nombre del carbohidrato a partir del cual se obtienen. Por lo tanto, la oxidacion del grupo hidroxilo C6 de la glucosa da lugar al acido glucuronico, la oxidacion del grupo hidroxilo C6 de la galactosa da lugar al acido galacturonico y la oxidacion del grupo 10 hidroxilo C6 de la idosa da lugar al acido iduronico.

Tal y como se utiliza en este documento, “hexosamina” se refiere a un derivado de la hexosa en el que al menos un grupo hidroxilo, normalmente el grupo hidroxilo C2, ha sido sustituido por una amina. La amina puede ser opcionalmente alquilada, acilada (por ejemplo, con acido muramico), normalmente a traves de un grupo acetilo, sulfonada, (O o N-15 sulfatada), sulfonilada, fosforilada, fosfonilada y similares. Entre los ejemplos representativos de las hexosaminas se encuentran la glucosamina, galactosamina, tagatosamina, fructosamina, sus analogos modificados y similares.

En la forma en que se utiliza en este documento, “glicosiaminoglicano” se refiere a cadenas lineales de unidades de disacaridos largamente repetitivas que contienen una 20 hexosamina y un acido uronico. La identidad precisa de la hexosamina y del acido uronico puede variar ampliamente, y en las anteriores definiciones se facilitan ejemplos representativos de cada uno. El disacarido puede modificarse opcionalmente mediante alquilacion, acilacion, sulfonacion (O- o N-sulfatada), sulfonilacion, fosforilacion, fosfonilacion y similares. El grado de dicha modification puede variar, y puede llevarse a cabo en un 25 grupo hidroxilo o en un grupo amino. Por lo general, el grupo hidroxilo C6 y la amina C2 estan sulfatados. La longitud de la cadena puede variar y el glicosiaminoglicano puede tener un peso molecular superior a 200.000 Daltons, normalmente de hasta 100.000 Daltons, y mas normalmente, inferior a 50.000 Daltons. Los glicosiaminoglicanos suelen encontrarse como mucopolisacaridos. Entre sus ejemplos mas representativos se encuentran la 30 heparina, el dermatan sulfato, el heparan sulfato, la condroitina-6-sulfato, condroitina-4-sulfato, el queratan sulfato, la condroitina, el acido hialuronico, polimeros que contienen N-acetil monosacaridos (como el acido N-acetilneurammico, la N-acetil glucosamina, la N-acetil galactosamina, y el acido N-acetil muramico) y similares, asi como gomas, como la goma arabiga, la goma de tragacanto y similares.

35 Tal y como se utiliza en el presente documento, “protema” incluye, entre otras, albuminas, globulinas (como las inmunoglobulinas), histonas, lectinas, protaminas, prolaminas, glutelinas, fosfolipasas, protemas antibioticas y escleroprotemas, as ^ como protemas conjugadas como fosfoprotemas, cromoprotemas, lipoprotemas, glicoprotemas y nucleoprotemas.

Tal y como se utiliza en el presente documento, “serpina” se refiere a un inhibidor de 5 la serina proteasa y entre sus ejemplos se encuentran especies como la antitrombina y el cofactor II de la heparina.

Tal y como se utiliza en el presente documento, “amina” se refiere a aminas primarias, RNH2, aminas secundarias, RNH(R'), y aminas terciarias, RN(R')(R").

Tal y como se utiliza en el presente documento, “amino” se refiere al grupo NH o 10 NH2.

Tal y como se utiliza en el presente documento, “imina” se refiere al grupo C=N y las sales del mismo.

Tal y como se utiliza en el presente documento, los terminos “tratar” o “tratamiento” de una enfermedad o de una dolencia en un mamifero significa: prevenir la dolencia o 15 enfermedad, es decir, evitar todo tipo de smtomas clmicos de la enfermedad; inhibir la dolencia o enfermedad, es decir, detener el desarrollo o avance de los smtomas clmicos; y/o aliviar la dolencia o enfermedad, es decir, provocar la regresion de los smtomas clmicos. Tratamiento tambien incluye la utilization de las composiciones reveladas en este documento asociada a un procedimiento medico, administrandose antes, durante o despues 20 del procedimiento medico.

De acuerdo con todo ello, el presente documento se refiere a composiciones y procedimientos para la preparation de conjugados de heparina y antitrombina, asi como al tratamiento de pacientes con las composiciones del presente documento. En un ejemplo, una composition para prevenir la trombogenesis puede comprender antitrombina y 25 heparina, donde al menos el 50% en peso de la heparina esta conjugada con antitrombina, y donde al menos el 98% en peso de la heparina de la composicion tiene un peso molecular superior a 3.000 Daltons.

En otro ejemplo, un procedimiento para la fabrication de una composicion para prevenir la trombogenesis puede comprender las fases de conjugar antitrombina con 30 heparina fuera del cuerpo del paciente para formar un conjugado de antitrombina-heparina;

la preparacion del conjugado de antitrombina-heparina en una solution; y la liofilizacion del conjugado de antitrombina-heparina. En este ejemplo, el conjugado de antitrombinaheparina puede encontrarse en una solucion formada unicamente por agua, por agua y alanina 0,01-0,09 molar, o por agua y manitol, por ejemplo.

35 En otro ejemplo, una composicion para prevenir la trombogenesis puede incluir una solucion acuosa de conjugado de antitrombina-heparina, en la que el conjugado de antitrombina-heparina se encuentra presente a una concentration de 9-11 mg/mL con respecto al volumen total de la solution. El conjugado de antitrombina-heparina puede formarse conjugando la antitrombina con heparina fuera del cuerpo del paciente.

En un ejemplo adicional, un procedimiento para la fabrication de una composition 5 para prevenir la trombogenesis puede incluir antitrombina con heparina fuera del cuerpo de un paciente, para formar un conjugado de antitrombina-heparina, donde el rendimiento del conjugado de antitrombina-heparina se define de tal forma que al menos se hace reaccionar un 60% en peso de la antitrombina inicial y se conjuga con heparina (es decir, se utiliza para obtener el conjugado de antitrombina-heparina).

10 En otro ejemplo adicional, una composicion para prevenir la trombogenesis puede incluir antitrombina, heparina y conjugado de antitrombina-heparina, donde el conjugado de antitrombina-heparina se encuentra presente con un rendimiento de al menos un 60% en peso de la antitrombina inicial utilizada para obtener el conjugado de antitrombina-heparina.

En otro ejemplo, un procedimiento para el tratamiento de una dolencia o enfermedad 15 puede incluir la administration de un conjugado de antitrombina-heparina preparado de acuerdo con los ejemplos de la tecnologia de la invention a un mamifero que precise de la misma. De forma mas detallada, estos tratamientos pueden llevarse a cabo administrando los conjugados de heparina y antitrombina de la presente invencion a un paciente, por ejemplo, humano, que precise dicho tratamiento. Entre las dolencias y enfermedades que 20 pueden tratarse utilizando las composiciones de conjugados que se describen en el presente documento se encuentran el infarto de miocardio y una amplia variedad de estados tromboticos. Estos incluyen la formation de depositos de fibrina asociada al smdrome de dificultad respiratoria neonatal, smdrome de dificultad respiratoria en adultos, carcinoma pulmonar primario, linfoma no Hodgkin, alveolitis fibrosante y trasplantes pulmonares, por 25 mencionar tan solo algunos. Asimismo, con las composiciones de la presente invencion pueden tratarse situaciones de deficiencia adquirida de AT, como el smdrome de dificultad respiratoria neonatal, deficiencia inducida por L-asparaginasa, deficiencia inducida por bypass cardiopulmonar, sepsis o situaciones de deficiencia congenita de AT. En el caso de la deficiencia congenita de AT, pueden darse complicaciones tromboticas potencialmente 30 mortales, con niveles de AT inferiores a 0,25 unidades/ml en heterozigotos que requieran AT mas heparina en hasta 1 o 2 ninos cada ano en los EE.UU. Las dolencias y enfermedades tratadas mediante la presente invencion incluyen aquellas que se caracterizan por un exceso de generation o de actividad de la trombina. Dichas situaciones suelen producirse cuando un paciente se ha visto expuesto a un trauma, por ejemplo en el caso de los 35 pacientes quirurgicos. El trauma provocado por las heridas o la cirugia provoca danos vasculares y la activation secundaria de la coagulation de la sangre. Estos efectos no deseados pueden ocurrir tras una intervention de tirug^a general u ortopedica, tirug^a ginecologica, tirug^a cardiaca o vascular, u otras intervenciones quirurgicas. Un exceso de trombina tambien puede complicar la evolution de las enfermedades naturales, como la arterioesclerosis, lo que puede provocar ataques cardiacos, derrames cerebrales o 5 gangrena de los miembros. Por lo tanto, los procedimientos y composiciones de la te c n o ^ a actual se pueden utilizar para tratar, prevenir o inhibir una serie de importantes complicaciones cardiovasculares, incluyendo angina inestable, infarto agudo de miocardio (ataque cardiaco), accidentes cerebro-vasculares (derrame cerebral), embolismo pulmonar, trombosis venosa profunda, trombosis arterial, etc. Las composiciones y procedimientos de 10 la tecnologia pueden utilizarse para reducir o prevenir la coagulation durante la dialisis y reducir o prevenir la coagulacion intravascular durante una intervencion quirurgica a corazon abierto. Adicionalmente, en algunos aspectos de la invention, se facilitan procedimientos y composiciones para impedir o inhibir la generation de trombina o su actividad en pacientes con un mayor riesgo de desarrollar trombos debido a situaciones clmicas que alteran la 15 hemostasis (por ejemplo, enfermedades arteriales coronarias, arterioesclerosis, etc.). En otro aspecto, se facilitan procedimientos y composiciones para aquellos pacientes que presentan un mayor riesgo de desarrollar un trombo con posterioridad a un tratamiento medico, como cirugia cardiaca, cirugia vascular o intervenciones coronarias percutaneas. En una realization, los procedimientos y las composiciones de la presente invencion se utilizan 20 en intervenciones de bypass cardiopulmonar. Las composiciones pueden administrarse antes, durante o despues de la intervencion.

Volviendo ahora a las diversas realizaciones y detalles relacionados con la presente invencion, se sabe que la heparina esta facilmente disponible en una forma no fraccionada, que contiene moleculas con un amplio rango de pesos moleculares. Al eliminar la mayoria o 25 la totalidad de de las moleculas de heparina con pesos moleculares inferiores a 3.000 Daltons con anterioridad a la conjugation de la heparina con la antitrombina, puede mejorarse la actividad del conjugado de antitrombina-heparina. En una realizacion adicional, las moleculas de heparina con un peso molecular inferior a 5.000 Daltons pueden eliminarse en su mayoria o en su totalidad.

30 Los conjugados de antitrombina-heparina formados utilizando heparina a partir de la cual se han eliminado las moleculas de heparina de bajo peso molecular son diferentes en su composition de otros conjugados de antitrombina-heparina. Las cadenas de heparina de bajo peso molecular pueden eliminarse de la heparina con anterioridad a su reaction con la AT para sintetizar el conjugado de antitrombina-heparina (ATH). Por lo tanto, la ATH queda 35 desprovista de cadenas de heparina de bajo peso molecular conjugadas con la AT.

Las cadenas de heparina de bajo peso molecular pueden eliminarse de la heparina disponible a nivel comercial antes de hacer reaccionar la heparina con la AT para obtener ATH. Esto produce un ATH cuya composition difiere de la del ATH formado a partir de heparina no fraccionada sin eliminar la heparina de bajo peso molecular antes de reaccionar 5 con la AT. Adicionalmente, la formation de ATH a partir de heparina no fraccionada y la posterior elimination del ATH de bajo peso molecular, no produce el mismo producto que el ATH de la presente invention. Sin atenerse a ninguna teoria particular, se cree que las cadenas de heparina de bajo peso molecular (como las de menos de 3.000 Daltons o menos de 5.000 Daltons) compiten con las heparinas de cadena mas larga para conjugarse con la 10 AT. Las cadenas de heparina de muy bajo peso molecular tienen una elevada proportion de aldosa terminal que puede reaccionar con la AT. Por tanto, las cadenas de heparina de muy bajo peso molecular tienden a conjugarse con la AT con mayor rapidez, desplazando a las cadenas de heparina con un peso molecular mas elevado. No obstante, una vez que las cadenas de heparina de muy bajo peso molecular se enlazan con la AT, las cadenas no 15 contienen suficientes posiciones ni longitud para los enlaces de la trombina y del Factor Xa, una enzima que participa en la cascada de la coagulation. La actividad inhibidora frente al factor Xa y la trombina desciende de forma dramatica en el rengo de las moleculas de heparina de mas bajos pesos moleculares. De este modo, los ATH formados a partir de estas cadenas de heparina de muy bajo peso molecular tienen esencialmente cero actividad 20 para prevenir la trombogenesis. Aunque la heparina comercial contiene un porcentaje relativamente pequeno de cadenas de heparina por debajo de 5.000 Daltons, estas cadenas de heparina de muy bajo peso molecular tienen una reactividad tan elevada con la AT que una importante cantidad del ATH formado contiene cadenas de heparina de muy bajo peso molecular.

25 Si no se elimina en primer lugar la heparina de muy bajo peso molecular con anterioridad a la conjugation, una proporcion mas elevada de terminales reactivos de esta poblacion, en comparacion con la de la heparina de mayor peso molecular, tendera a desplazar a las demas moleculas de heparina en diversas medidas a lo largo de todo el espectro de pesos moleculares (dado que la proporcion de terminales de aldosa varia 30 continuamente a lo largo de todo el rango de pesos moleculares de la heparina). Esto puede tener efectos adversos sobre el ATH final. En primer lugar, el ATH contendra una importante poblacion de moleculas de ATH que contienen cadenas muy pequenas de heparina sin actividad. En segundo lugar, el resto de moleculas de ATH (aparte de este rango de ATH de muy bajo peso molecular) contendra una poblacion de heparina con una reducida proporcion 35 de cadenas de heparina con unos rangos discretos de peso molecular con menos aldosas terminales para competir con las cadenas de heparina de bajo peso molecular inactivas.

Esta heparina baja en aldosa tiende a encontrarse en las cadenas mucho mas largas, pero no esta enteramente definida por una relacion directa entre la longitud de la cadena de heparina y los terminales de aldosa requeridos para su enlace con la AT.

Ademas, la heparina con al menos 18 unidades de monosacaridos tambien puede 5 resultar mas eficaz a la hora de inhibir la trombina. Al menos se utilizan 18 unidades de monosacaridos para enlazar la antitrombina y la trombina. El mecanismo mediante el cual la heparina se une a la antitrombina y la trombina se denomina plantilla o mecanismo de puente. La heparina puede ejercer su efecto mediante la activacion conformacional mediante el enlace con la AT y la conversion alosterica de la AT en una forma estructural 10 que resulte mucho mas reactiva a las proteasas de la coagulacion. Alternativamente, la heparina puede actuar como una plantilla mediante su enlace con el inhibidor y con la enzima, localizando de este modo las moleculas para la reaccion. En este mecanismo, se produce la activacion de conformation de la AT mediante la heparina, pero se consigue mejorar el ritmo de la reaccion mediante enlaces simultaneos de heparina a la enzima, 15 colaborando asi en la aproximacion del factor de coagulacion hacia el inhibidor activado. La longitud de cadena minima concreta de 18 monosacaridos puede explicar por que se produce una caida muy abrupta de la actividad frente a la trombina dentro de la fraction de heparina de bajo peso molecular. Partiendo de la estructura correspondiente a un acido uronico monosulfatado-disacarido bisulfatado de glucosamina heparina, es decir, sin el sodio 20 u otros de los iones que se encuentran en una sal, el peso molecular de una cadena de 18 sacaridos (9 disacaridos) estaria en torno a 4500 Daltons.

Las cadenas de heparina con un peso molecular algo mas bajo pueden resultar utiles en la inhibition del factor Xa. Una secuencia concreta de pentasacarido de la heparina puede enlazar con la AT y activar la AT para la inhibicion del factor Xa. Esta secuencia 25 espedfica de pentasacarido se encuentra disponible por si misma como el farmaco

“Fondaparinux,” pero la secuencia tambien puede darse en cadenas de heparina. La secuencia de los monosacaridos se muestra en la formula I:

De este modo, las cadenas de heparina con menos de 18 monosacaridos que contienen 5 esta secuencia de pentasacarido pueden ser capaces de activar la AT para inhibir el factor Xa aun cuando las cadenas no sean lo suficientemente largas como para unir la AT y la trombina.

Las cadenas de heparina de mayor longitud pueden presentar en algunos casos la actividad inhibidora mas elevada. No obstante, algunas cadenas de heparina de rango 10 medio y mas bajo peso molecular pueden enlazarse de forma significativamente menos indeseable a otras protemas del plasma y plaquetas. Por lo tanto, estas cadenas de heparina de rango medio pueden ser mas selectivas a la hora de inhibir la trombina y el factor Xa sin causar efectos secundarios no deseados, como la disfuncion de las plaquetas que dejan de unirse a las plaquetas y se unen a otros materiales.

15 El aislamiento del ATH con mayor peso molecular tras la conjugation, para obtener un ATH de cadena muy larga proporciona un producto distinto y menos deseable en comparacion con la tecnologia de la presente invention, que separa (sustancialmente o en su totalidad) la heparina con anterioridad a la conjugacion. Por ejemplo, la proportion de moleculas de elevada actividad con 2-pentasacaridos en esta subpoblacion puede alterarse 20 debido a una capacidad diferencia de estas cadenas de elevada actividad para competir por la conjugacion con las heparinas de muy bajo peso molecular. Adicionalmente, el aislamiento del ATH de elevado peso molecular tras la conjugacion elimina las moleculas de ATH con cadenas de heparina de rango medio y menor tamano, que tambien se encuentran activas y presentan otras caracteristicas deseables, como la reduction de los enlaces no 25 selectivos con las protemas y plaquetas del plasma.

Alternativamente, es probable que los intentos de reaction de todas las cadenas de heparina con aldosas terminales con AT incrementando la proporcion de AT frente a heparina en la mezcla de reaccion no tengan exito, debido a que muchos experimentos han demostrado que tan solo se obtiene un maximo de conversion de AT en ATH de hasta un 60% en peso aun cuando la aldosa contenga heparina en forma de multiplos y a las concentraciones practicas mas elevadas. La reduction adicional de la proportion de heparina frente a AT tan solo reducira aun mas el rendimiento del ATH sin ninguna garantia 5 de que todas las cadenas activas mas largas vayan a incorporarse al producto.

En algunas realizaciones, una composition para la prevention de la trombogenesis puede contener ATH formado a partir de heparina comercial de la que se han eliminado sustancialmente todas las cadenas de heparina con a peso molecular inferior a 3.000 Daltons (por ejemplo, al menos un 98% en peso del resto de las cadenas de heparina 10 pueden tener un peso molecular superior a 3.000 Daltons). En otras realizaciones, las cadenas de heparina con un peso molecular inferior a 5.000 Daltons pueden eliminarse o eliminarse sustancialmente. De este modo, el producto ATH puede contener cadenas de heparina cuyo peso molecular varia desde los 3.000 Daltons (o 5.000 Daltons) hasta los pesos moleculares mas elevados que contiene la heparina comercial. En algunos ejemplos, 15 este rango de pesos moleculares puede oscilar entre 3.000 Daltons y 50.000 Daltons, o entre 5.000 Daltons y 50.000 Daltons. En ejemplos adicionales, al menos una portion de las cadenas de heparina puede estar dentro de la gama media de pesos moleculares. Por ejemplo, al menos una porcion de las cadenas de heparina del ATH pueden tener un peso molecular que oscile entre 3.000 Daltons y 30.000 Daltons, entre 3.000 Daltons y 20.000 20 Daltons, entre 3.000 Daltons y 15.000 Daltons, entre 3.000 Daltons y 10.000 Daltons, entre 5.000 Daltons y 30.000 Daltons, entre 5.000 Daltons y 20.000 Daltons, entre 5.000 Daltons y 15.000 Daltons, o entre 5.000 Daltons y 10.000 Daltons. De este modo, el ATH puede estar desprovisto o sustancialmente desprovisto de cadenas de heparina con un peso molecular por debajo de 3.000 Daltons o de 5.000 Daltons.

25 La heparina comercial puede contener tipicamente una gama de cadenas de heparina con pesos moleculares que oscilen entre 1.000 Daltons o menos y 50.000 Daltons o mas. La fraction de peso molecular mas bajo, como las cadenas cuyos pesos moleculares se encuentran por debajo de 3.000 o 5.000 Daltons, pueden eliminarse mediante cualquier procedimiento que resulte adecuado. Entre los ejemplos no limitativos de elimination de 30 cadenas de bajo peso molecular se encuentra la dialisis, la diafiltracion, filtration mediante gel y electroforesis. La dialisis o diafiltracion puede llevarse a cabo en condiciones de elevada salinidad. Por ejemplo, las condiciones de elevada salinidad para dialisis o diafiltracion pueden incluir concentraciones de sal variables entre aproximadamente NaCl 1 M y aproximadamente NaCl 4 M. Tambien pueden utilizarse otras sales distintas del NaCl.

35 La elevada concentration de sal puede colaborar en el desplazamiento de las cadenas pequenas a traves de unas membranas con el tamano de poro adecuado. El filtrado mediante gel puede llevarse a cabo utilizando un medio adecuado para la separation de moleculas en funcion de su tamano. En un ejemplo concreto, el filtrado mediante gel puede efectuarse en Sephadex® G-200, que es un medio de gel para la separacion de moleculas con pesos moleculares variables entre 1.000 y 200.000 Daltons. La heparina comercial 5 puede filtrarse mediante gel en una columna de gel, pudiendo eluirse una serie de fracciones con las primeras fracciones que contengan las cadenas de mayor peso molecular y con las siguientes fracciones con unos pesos moleculares progresivamente inferiores. Pueden determinarse los pesos moleculares de la heparina de cada fraction, pudiendo agruparse las fracciones que tengan los pesos moleculares deseados. Mediante este 10 procedimiento se pueden excluir aquellas fracciones que contengan heparina con pesos moleculares situados por debajo del umbral de 3.000 o 5.000 Daltons. Si asi se desea, las cadenas de heparina que se encuentren por encima de un determinado umbral tambien pueden excluirse. Por ejemplo, pueden excluirse, si asi se desea, las fracciones que contengan heparina por encima de 50.000 Daltons, 30.000 Daltons, 20.000 Daltons, 15.000 15 Daltons, o 10.000 Daltons. Las fracciones agrupadas que tengan el rango deseado de pesos moleculares pueden entonces utilizarse para la smtesis del ATH.

Ha de tenerse en cuenta que los procedimientos de elimination de las cadenas de heparina de muy bajo peso molecular descritos anteriormente son tan solo ejemplos y no deben considerarse limitativos. En la presente invention puede utilizarse cualquier 20 procedimiento de tratamiento de la heparina comercial para la eliminacion de las cadenas de heparina situadas por debajo de un determinado umbral de peso molecular.

El ATH puede formarse mediante la conjugation de la AT con la heparina, a la que se ha desprovisto de las cadenas con muy bajo peso molecular. Los ejemplos de procedimientos de conjugacion de heparina con AT se describen en la Patente de los 25 EE.UU. N° 7.045.585, que queda incorporada al presente documento por referencia. Estos procedimientos pueden aplicarse a la formation del ATH utilizando heparina de la que se han eliminado las cadenas con muy bajo peso molecular, como se describe en este documento. La heparina puede conjugarse con la AT mediante un sencillo proceso de una etapa, que proporciona la union covalente de la amina de una amina que contenga 30 fracciones (incluyendo, entre otras, aminas que contengan oligo(poli)sacaridos, aminas que contengan lipidos, protemas, acidos nucleicos y cualquier amina que contenga xenobioticos) con un residuo de aldosa terminal de una cadena de heparina. Para la formacion del ATH, la amina que contiene fracciones se encuentra presente en la AT, aunque pueden conjugarse otras protemas utilizando los mismos procedimientos. Los medios suaves no destructivos 35 que se facilitan en este documento permiten la maxima retention de la actividad biologica de la protema y permiten el enlace directo de la protema sin necesidad de grupos separadores intermedios.

En una realization, la heparina se incuba con AT a un pH adecuado para la formation de iminas entre la amina y la aldosa terminal o el residuo de cetosa de la 5 heparina. Por lo general existen la aldosa terminal y los residuos de cetosa como un equilibrio entre la forma semiacetal o semicetal dclica cerrada en anillo y los correspondientes equivalentes de aldehido o cetona de anillo abierto. En general, las aminas son capaces de reaccionar con la forma en anillo abierto para obtener una imina (base de Schiff). Normalmente, las aldosas son mas reactivas porque los correspondientes 10 aldehidos de la forma abierta en anillo son mas reactivos frente a las aminas. Por lo tanto, la formacion del conjugado covalente entre aminas y residuos de aldosa terminal de la heparina proporciona un procedimiento para enlazar la AT que contiene una amina a la heparina.

La reaction suele llevarse a cabo a un pH de entre aprox. 4,5 a aprox. 9, y mas 15 normalmente, de entre aprox. 5 y aprox. 8, a incluso mas tipicamente de entre aprox. 7 y aprox. 8. La reaccion suele tener lugar en medio acuoso. No obstante, los medios organicos, y especialmente los disolventes organicos polares hidrofilos, como los alcoholes, eteres y formamidas y similares pueden utilizarse en proporciones de hasta un 40% aproximadamente para aumentar la solubilidad o reactividad de los reactivos, en caso 20 necesario. Tambien pueden utilizarse tampones no nucleofflicos, como fosfato, acetato, bicarbonato y similares.

En ciertos casos, las iminas formadas mediante condensation de las aminas de la AT con los residuos de aldosa terminal de la heparina se reducen a las aminas correspondientes. Esta reduction puede llevarse a cabo simultaneamente con la formacion 25 de la imina o posteriormente. Puede utilizarse una gran variedad de agentes reductores, como agentes reductores de hidruros, incluyendo borohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio. En un ejemplo, puede utilizarse cualquier agente reductor que no reduzca los enlaces de disulfuro.

Alternativamente, si no se desea la reduccion de la imina intermedia, la imina se 30 puede incubar durante un periodo de tiempo suficiente, normalmente de entre aproximadamente 1 dia a 1 mes, mas normalmente de entre 3 dias y 2 semanas, para permitir que tenga lugar la transposition de Amadori de la imina intermedia. Los residuos de aldosa terminal de las heparinas conjugadas mediante los procedimientos facilitados en esta invention suelen poseer grupos hidroxilos C2 en el residuo de aldosa terminal, es decir, una 35 fraction 2-hidroxi carbonil que se ha convertido en una 2-hidroximina por condensacion con la amina de la AT que se conjuga con la heparina. En la transposicion de Amadori, que resulta muy frecuente en los carbohidratos, la a-hidroximina (imina en C1, hidroxi en C2) formada por la condensation inicial puede transponerse para formar una (a-cetoamina por enolizacion y reprotonacion (ceto en C2, amina en C1)). La a-carbonilamina resultante se ve termodinamicamente favorecida con respecto a la a-hidroximina precursora, facilitando de 5 este modo un aducto estable, con una minima perturbation de la cadena de heparina. De este modo, en esta realization, la tecnologia facilita una cadena de heparina conjugada covalentemente en el C1 del residuo de aldosa terminal de la heparina con una amina que contiene AT mediante un enlace amina. Si se desea, el conjugado resultante puede reducirse o etiquetarse mediante reduction del grupo carbonil C2 con un reactivo 10 etiquetador (por ejemplo, NaB3H4), o conjugarse con una segunda amina que contenga especies, como una etiqueta fluorescente.

Aunque la anterior description se centra en la heparina y la AT, pueden conjugarse diversas especies que contienen aminas con una serie de glicosiaminoglicanos mediante los procedimientos que se describen en este documento. La amina primaria puede encontrarse 15 en una molecula pequena, como por ejemplo, un farmaco o etiqueta fluorescente o cromoforica, o una macromolecula, como por ejemplo, una protema (anticuerpos, enzimas, receptores, factores de crecimiento y similares), un polinucleotido (ADN, ARN y mezclas de polimeros de dichos acidos) o un polisacarido. En general, cuando las protemas se conjugan con glicosiaminoglicanos, los enlaces tendran lugar a traves de los grupos £-amino de los 20 residuos de lisina. Alternativamente, los enlaces tambien pueden llevarse a cabo mediante el grupo a-amino del residuo de aminoacido N-terminal. Ademas, pueden utilizarse otros muchos procedimientos conocidos por cualquier experto en la materia para introducir la funcionalidad amina en una macromolecula.

Concretamente, la tecnologia de la presente invention puede aplicarse a una 25 diversidad de protemas terapeuticamente utiles, cuando resulten importantes las consideraciones relativas a la vida media y a la coagulation de la sangre. Dichas protemas incluyen las enzimas de la sangre, anticuerpos, hormonas y similares, asi como los activadores plasminogenicos relacionados, como la estreptocinasa y sus derivados. Concretamente, esta tecnologia facilita conjugados de heparina o dermatan sulfato con 30 antitrombina, con el cofactor II de la heparina (HCII) o con analogos del cofactor II de la heparina.

Los procedimientos descritos en la presente invencion facilitan conjugados de glicosiaminoglicano con una retention maxima de la actividad biologica. Concretamente, se facilitan conjugados de heparina o dermatan sulfato con AT o con HCII, que poseen > 60 % 35 en peso, normalmente > 90% en peso, mas frecuentemente > 95% en peso, y mas tipicamente > 98% en peso de actividad intacta de heparina y antitrombina no conjugadas.

Los procedimientos de la presente tecnologia facilitan moleculas intactas de heparina conjugadas con antitrombina o con el cofactor II de la heparina. De este modo, se evita la perdida de actividad biologica asociada a la fragmentation u otro tipo de modification de la heparina con anterioridad a la conjugation. Los conjugados de heparina segun esta 5 tecnologia mantienen su actividad anticoagulante debido a que se han preparado a partir de heparina intacta. Por lo tanto, los procedimientos descritos en este documento se pueden utilizar para preparar conjugados activos de heparina uniendo en primer lugar grupos de enlace y separadores a las especies que se desea conjugar con la heparina (o el glicosiaminoglicano en cuestion que se utilice) uniendolo posteriormente a la heparina. En el 10 Inmunotechnology Catalog and Handbook, de Pierce Chemical Company (1990), que queda incorporado a este documento por referencia, se describen numerosos procedimientos de incorporation de grupos amino reactivos a otras moleculas y soportes solidos. Por lo tanto, cualquier especie que posea grupos amino reactivos o que sea capaz de ser modificada para contener dichos grupos amino mediante cualquier procedimiento conocido en la 15 actualidad o que pueda conocerse en el futuro puede conjugarse covalentemente a glicosiaminoglicanos como la heparina, mediante los procedimientos descritos en este documento, y la totalidad de dichos conjugados queda contemplada en la presente invention.

Tal y como se ha descrito anteriormente, la tecnologia de la presente invencion se 20 aprovecha de la circunstancia de que la heparina nativa (aislada de la mucosa intestinal), asi como el dermatan sulfato, ya contiene moleculas con aldosas terminales que existirian en equilibrio entre el hemiacetal y las formas de aldehido. De este modo, la heparina o el dermatan sulfato pueden conjugarse con serpinas antitrombinas mediante la reduction de la base de Schiff unica formada espontaneamente entre el aldehido de la aldosa terminal de la 25 heparina o dermatan sulfato y un amino de la serpina. La heparina o dermatan sulfato permanece inalterada (sin reduccion de la actividad) con anterioridad a la conjugacion, y se une en un emplazamiento espedfico en un extremo de la molecula, sin que se den grupos de activation no bloqueados o reticulation de la serpina.

En otro aspecto de la presente invencion, pueden producirse complejos covalentes 30 mezclando simplemente heparina y AT en una solution tampon y dejando que se forme espontaneamente una cetoamina mediante una transposition de Amadori entre la aldosa terminal de la heparina y un grupo amino de la AT. De este modo, esta tecnologia facilita procedimientos de utilization de la transposicion de Amadori para elaborar conjugados de glicosiaminoglicanos con especies que contienen amina, especialmente las protemas. Este 35 procedimiento de conjugacion resulta especialmente simple y sencillo, y minimiza la modification del glicosiaminoglicano, elevando de este modo al maximo la conservation de su actividad biologica.

Otro aspecto de la presente tecnologia facilita conjugados covalentes de glicosiaminoglicanos, y concretamente, de heparina, etiquetados en su extremo con una 5 amina que contiene especies en el residuo de aldosa terminal del glicosiaminoglicano. Por ejemplo, la heparina y la AT pueden unirse entre si directamente, de forma que la secuencia activa de pentasacarido correspondiente a la AT de la heparina se encuentra muy cercana para su enlace. Este es uno de los motivos fundamentales para la realization de un complejo covalente heparina-AT, ya que la heparina acelera la inhibition a traves de la AT 10 unicamente si la AT puede enlazar la secuencia activa. Es notable que el ATH tenga la propiedad exclusiva de que la H (heparina) del conjugado activa estequiometricamente la AT endogena, al tiempo que activa por catalisis la AT exogena. Normalmente, una amina que contenga especies se unira a cada glicosiaminoglicano. Sin embargo, sera evidente que la proportion de amina que contiene especies frente al glicosiaminoglicano puede reducirse 15 por debajo de uno, ajustando las proporciones molares de los reactivos o el tiempo de reaction.

Los glicosiaminoglicanos estan disponibles en diversas formas y pesos moleculares. Por ejemplo, la heparina es un mucopolisacarido, aislado a partir de intestinos de cerdo o de pulmon de res, y es heterogenea en relation con su tamano molecular y estructura quimica.

20 Consiste basicamente en residuos de (1-4) 2-amino-2-desoxi-a-D-glucopiranosil, y a-L-acido idopiranosiluronico enlazado con una cantidad relativamente pequena de residuos de p-D-acido glucopiranosiluronico. Los grupos hidroxilo y amino se derivan en diversos grados mediante sulfatacion y acetilacion.

Las moleculas de heparina tambien se pueden clasificar en base a su contenido de 25 pentasacarido. Alrededor de una tercera parte de la heparina contiene cadenas con una unica copia del unico pentasacarido con una elevada afinidad por la AT, mientras que una proporcion mucho mas pequena (calculada en aproximadamente el 1% del total de heparina) consiste en cadenas que contienen mas de una copia del pentasacarido con elevada afinidad. El resto (aproximadamente el 66%) de la heparina no contiene el 30 pentasacarido. De este modo, la denominada "heparina estandar” constituye una mezcla de las tres especies, la heparina de "baja afinidad”, que carece de una copia del pentasacarido, la heparina de "alta afinidad” que esta enriquecida para las especies que contienen al menos una copia del pentasacarido, y la heparina de "muy alta afinidad” que se refiere al aproximadamente 1% de moleculas que contienen mas de una copia del pentasacarido.

35 Estas tres especies pueden separarse entre si utilizando procedimientos rutinarios de cromatografia, como la cromatografia sobre una columna de afinidad de antitrombina.

Una ventaja de la formacion de un conjugado entre la heparina y una especie que contenga al menos un grupo amino primario (por ejemplo, AT) utilizando el proceso de glicacion lenta que se describe en este documento, es la seleccion aparente de cadenas de heparina que contengan dos pentasacaridos. De este modo, por ejemplo, el ATH preparado 5 mediante el procedimiento de la presente invencion parece enriquecido para la especie de heparina que contiene dos pentasacaridos. Cuando se utiliza heparina estandar (que contiene aproximadamente un 1% de heparina con dos pentasacaridos) como matral de partida, generalmente mas del 10% del ATH resultante comprende heparina de dos pentasacaridos, mas frecuentemente mas de un 20%, frecuentemente mas de un 35%, y 10 con mayor frecuencia mas de un 50% del ATH, aproximadamente, comprende heparina con dos pentasacaridos.

Este enriquecimiento puede ser el responsable de una serie de propiedades utiles del ATH. El ATH de la presente tecnologia activa estequiometricamente la AT con la que se ha conjugado, pero activa por catalisis la AT exogena. De este modo, la heparina situada en 15 el interior del complejo ATH actua catalrticamente cuando el ATH se administra como anticoagulante sistemico y cuando el ATH se utiliza para el revestimiento de superficies para convertirlas en no trombogenicas. El procedimiento de la tecnologia produce un complejo ATH con una muy elevada actividad espedfica anti-factor IIa. Ademas, la segunda cadena de pentasacaridos del complejo ATH puede interactuar con las moleculas exogenas de AT 20 permitiendo de este modo que la heparina conjugada muestre actividad catalrtica. Ademas, la heparina del complejo ATH puede orientarse de tal forma que el pentasacarido este disponible para enlazar y activar la circulation de las moleculas de AT cuando el complejo ATH se une a la superficie protesica.

Se observara que un conjugado de heparina de interes (por ejemplo, ATH) tambien 25 puede obtenerse incubando una especie que contenga al menos un grupo amino primario (por ejemplo, AT) con heparina purificada de muy elevada actividad (es decir, que contenga dos grupos pentasacaridos) o una fraction enriquecida para una heparina de muy alta afinidad.

Aunque esta tecnologia se ha ejemplificado basicamente en relation con la heparina, 30 es evidente que todos los glicosiaminoglicanos, independientemente de su peso molecular y de su derivatizacion, pueden conjugarse mediante los procedimientos que aqu se describen, siempre que posean un residuo de aldosa terminal. Los conjugados de todos estos glicosiaminoglicanos y su preparation mediante los procedimientos que aqu se describen se encuentran dentro del ambito de lo revelado por esta invencion. Por ejemplo, 35 los conjugados de heparina derivados con fosfatos, sulfonatos y similares, asi como los glicosiaminoglicanos con pesos moleculares inferiores o superiores a los pesos moleculares de la heparina se encuentran dentro del ambito de la presente invention.

En un aspecto adicional de la presente invencion, un procedimiento de fabrication de una composition para prevenir la trombogenesis puede incluir el conjugar la AT con 5 heparina fuera del cuerpo de un paciente para obtener un conjugado de antitrombinaheparina, donde la cantidad de antitrombina obtenida en el conjugado de antitrombinaheparina es superior a un 60% en peso, superior a un 65% en peso, superior a un 75% en peso, superior a un 85% en peso, superior a un 90% en peso, superior a un 95% en peso, o superior a un 99% en peso en funcion de la antitrombina utilizada inicialmente en la smtesis.

10 El rendimiento se puede incrementar a traves de diversos procedimientos. En un ejemplo, la AT puede conjugarse con heparina mediante los procedimientos anteriormente descritos. Tras la conjugation, cualquier AT no enlazada puede reciclarse y utilizarse en otra reaction de conjugacion con heparina. Tras cada etapa de incubation de AT con heparina, la AT no enlazada puede reciclarse y utilizarse para obtener ATH adicional.

15 En otro ejemplo, el rendimiento del ATH puede aumentarse utilizando un catalizador en la transposition de Amadori. Entre algunos de los ejemplos de catalizadores que pueden aumentar el ritmo de la transposicion de Amadori se encuentran la 2-hidroxipiridina, sales de amina terciarias, malonato de etilo, fenilacetona y acido acetico, asi como otros acidos. En un ejemplo concreto, la AT y la heparina pueden reaccionar entre si en presencia de 2-20 hidroxipiridina mientras se calientan en agua o en disolventes muy anfifflicos, como la formamida. En otros ejemplos, la AT y la heparina pueden reaccionar entre si en presencia de trimetilamina o de sales de trimetilamina.

La velocidad de la transposicion de Amadori tambien puede aumentarse mediante sistemas de disolventes que aceleran la transposicion de Amadori. Entre algunos de los 25 ejemplos de estos disolventes se incluyen las mezclas de agua con formamida, dimetilformamida, dioxano, etanol, dimetilsulfoxido, piridina, acido acetico, trimetilamina, trietilamina, y sus combinaciones. La heparina y la AT pueden hacerse reaccionar en estos sistemas disolventes para acelerar la transposicion de Amadori para formar ATH.

Un procedimiento adicional para aumentar la velocidad de conjugacion de la aldosa 30 heparina con una molecula que contenga aminas implica la utilization de un agente de enlace. El agente de enlace puede ser un agente heterobifuncional, con un grupo que reacciona frente a la aldosa de la heparina en un extremo y frente a un grupo diferente en el otro extremo, que puede utilizarse para enlazarse a una AT o a un agente de enlace secundario que puede unirse entonces a una AT. En un ejemplo concreto, el agente de 35 enlace puede contener hidracina en un extremo y un grupo amino en el otro, como 2-aminoetilhidracina. Este agente de enlace puede reaccionar con la heparina para formar hidracina con el aldehido aldosa de la heparina. El producto puede dializarse o diafiltrarse mediante membranas que permitan eliminar las cadenas de heparina con menos de 3.000 o 5.000 Daltons de peso molecular, junto con cualquier agente de enlace que no haya reaccionado. A continuation, el producto heparina-hidrazona puede hacerse reaccionar con 5 una gran cantidad del exceso de agente de enlace secundario. El agente de enlace secundario puede ser un reactivo homobifuncional que posea grupos carboxilos activados en cada extremo, como acido succmico di(N-hidroxisuccinimida) un ester (obtenido mediante esterification del acido succmico con N-hidroxisuccinimida utilizando agentes de condensation como carbonildiimidazol o una carbodiimida) de forma que el grupo amino del 10 agente de enlace de la hidracina reacciona precisamente con uno de los carboxilos activados en el agente de enlace secundario. La mezcla de la reaction puede dializarse o diafiltrarse para eliminar el agente de enlace secundario sin reaccionar. En este punto, el producto sera heparina modificada por el agente de enlace amino-hidracina asi como el agente de enlace secundario. Este producto puede incubarse con AT en una solution 15 tampon de H2O de forma que el grupo amino de la AT reaccione con el segundo grupo carboxilo activado en el agente de enlace secundario para formar un conjugado AT-Heparina, conde la AT y la heparina estan enlazadas mediante el agente de enlace y el agente de enlace secundario.

Una vez formado el ATH, el ATH puede liofilizarse (desecacion por congelation) para 20 su almacenamiento. En una realization, el ATH puede prepararse en una solucion que contenga tan solo agua, liofilizandose a continuacion. En otra realizacion, el ATH puede prepararse en una solucion con agua y alanina a una concentration variable entre 0,01-0,09 molar, y liofilizarse a continuacion. En otra realizacion adicional, el ATH puede prepararse en una solucion que contenga agua y manitol, liofilizandose a continuacion. Cada uno de estos 25 procedimientos puede utilizarse independientemente, y cada uno de los procedimientos presenta sus propias ventajas. Tras la liofilizacion mediante cualquiera de estos procedimientos, el ATH puede reconstituirse y mantener una importante cantidad de su actividad de inhibition de la trombina, en comparacion con su actividad anterior a la liofilizacion. En algunos casos, el ATH puede retener al menos el 50%, al menos el 60%, al 30 menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, o al menos el 98% de su actividad de inhibicion de la trombina. Se ha demostrado que la utilization de otros procedimientos de liofilizacion del ATH, como la preparation del ATH en una solucion que contenga una sal mas de 1 molar con anterioridad a la liofilizacion puede destruir la actividad del ATH.

35 Tanto si el ATH se ha liofilizado o no, el ATH puede prepararse en una solucion acuosa que contenga entre 9 y 11 mg/ml de ATH con respecto a la totalidad del volumen de la solucion. Se ha demostrado que la fabrication de soluciones con una concentration de ATH superior a 11 mg/ml puede provocar una agregacion del ATH que resulta dificil o imposible de revertir. No obstante, pueden elaborarse soluciones acuosas estables con concentraciones de ATH de entre 9 y 11 mg/ml. Esta solucion puede formularse para su 5 administration a un paciente para el tratamiento de cualquiera de las dolencias descritas en este documento. La solucion tambien puede incluir diversos aditivos, siempre que sean adecuados para su administracion a un paciente.

En la practica clmica, los conjugados de heparina de la presente invention pueden utilizarse en general de la misma forma y bajo la misma modalidad de preparation 10 farmaceutica que la heparina disponible en el comercio para su uso clmico. De este modo, los conjugados de heparina de la presente invencion pueden incorporarse a soluciones acuosas para su inyeccion (intravenosa, subcutanea o similar) o infusion intravenosa, o en preparaciones de balsamos para su administracion a traves de la piel y de las membranas mucosas. Puede practicarse cualquier tipo de terapia, tanto profilactica como curativa, 15 conocida en la actualidad o disponible en el futuro, para la cual se encuentre indicada la terapia con heparina, con los conjugados de heparina indicados en la presente invencion.

Las conjugados de heparina segun la presente invencion resultan especialmente utiles para el tratamiento del smdrome de dificultad respiratoria (RDS), neonatal y en adultos. Al contrario que el uso de complejos no covalentes heparina-AT, la utilization de 20 conjugados covalentes de heparina de la presente invencion impide la perdida de heparina en el espacio pulmonar al disociarse la AT. En este caso, una solucion de complejo covalente en una solucion tampon fisiologica puede facilitarse como una pulverization atomizada en las vias respiratorias, mediante un cateter o inhalador. Debido a su gran tamano, el ATH permanecera en los alveolos durante un periodo mas prolongado. El ATH 25 tambien es util para el tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopatica.

El uso a largo plazo en la circulation puede llevarse a cabo mediante inyeccion intravenosa o subcutanea del complejo en una solucion tampon fisiologica. Los conjugados covalentes de esta tecnologia tambien pueden utilizarse para el tratamiento de estados de deficiencia de AT adquirida caracterizados por complicaciones tromboticas como un bypass 30 cardiopulmonar, oxigenacion molecular extracorporea, etc. Ya que la mas larga vida media del complejo covalente permite realizar menos tratamientos con una menor monitorizacion. Adicionalmente, la presente invencion permite el tratamiento profilactico de pacientes adultos en situation de riesgo por trombosis venosa.

El conjugado de ATH segun esta tecnologia presenta numerosas ventajas frente a la 35 AT y la heparina estandar que no han formado complejos. Dado que la AT se une mediante enlace covalente a la heparina, el enlace no espedfico del ATH a las protemas del plasma se producira con menor frecuencia que en el caso de la heparina estandar, lo que tiene como resultado menos variaciones inter-individuales en la respuesta a la dosis con ATH que con la heparina estandar. La mas prolongada vida media del ATH tras su inyeccion intravenosa en seres humanos significa que puede obtenerse un efecto anticoagulante 5 sostenido administrando ATH con una frecuencia menor que la requerida en el caso de la AT y la heparina estandar sin formar complejos. El ATH es un desactivador de la trombina y del factor Xa mucho mas eficaz que el AT, y puede ser efectivo cuando se utiliza a unas concentraciones mucho mas bajas que las de AT en pacientes con deficiencia de AT. Asimismo, el ATH puede acceder a la trombina ligada a la fibrina e inhibirla. Por ultimo, al 10 unirse (por ejemplo, mediante un enlace covalente) a superficies protesicas (por ejemplo, injertos endovasculares), el ATH ha demostrado poseer una actividad antitrombotica in vivo mucho mayor que la de la AT, unida a la heparina mediante enlace covalente, o la hirudina unida mediante enlace covalente.

Los neonatos prematuros presentan una elevada incidencia del smdrome de 15 dificultad respiratoria (RDS), una grave enfermedad pulmonar que requiere tratamiento con ventilacion asistida. La ventilacion asistida a largo plazo lleva a la aparicion de displasia broncopulmonar (BPD) como resultado de la lesion pulmonar, lo que permite que las protemas de coagulacion del plasma se desplacen hacia los espacios alveolares del pulmon. Esto da como resultado la aparicion de trombina, y posteriormente, de fibrina. Se ha 20 observado frecuentemente la presencia de fibrina en el tejido pulmonar y los espacios aereos de ninos fallecidos por RDS. Este gel de fibrina en el interior del espacio aereo dificulta el transporte del fluido al exterior de los espacios aereos pulmonares, con el resultado de un edema pulmonar persistente. La presente tecnologia permite el tratamiento de dichas enfermedades del tejido pulmonar mediadas por fibrina, impidiendo la formation 25 de fibrina intra-alveolar, manteniendo un "entorno anti-trombotico” y/o mejorando la fibrinolisis en el interior del tejido pulmonar, reduciendo asi la carga de fibrina en los espacios aereos del pulmon.

Los conjugados de heparina pueden administrarse directamente en los espacios aereos del pulmon a traves de las vias respiratorias profilacticamente (antes de que el bebe 30 respire por primera vez). Esto garantiza que el agente antitrombotico este directamente disponible en el emplazamiento de los posibles depositos de fibrina y que se evite el riesgo de sangrado asociado a las terapias antitromboticas. Asimismo, el agente antitrombotico ya se encontrara presente en el pulmon con anterioridad al inicio del soporte respiratorio asociado a la lesion inicial, es decir, a diferencia de la administration sistemica de la 35 antitrombina cuando el cruce del farmaco administrado hacia el espacio aereo pulmonar no se produzca hasta despues de la lesion pulmonar. Como la heparina esta unida a la AT mediante enlace covalente, permanecera en los espacios aereos pulmonares. Tambien puede ser una terapia coadyuvante de los tensioactivos actualmente administrados para impedir el RDS y la BPD. “agente tensioactivo pulmonar” significa la sustancia jabonosa que se encuentra normalmente presente en los espacios aereos pulmonares, cuya funcion 5 principal consiste en impedir el colapso del espacio aereo, asi como colaborar en la transferencia de gas. Los conjugados tambien pueden administrate repetidamente a traves de un tubo endotraqueal o como un aerosol inhalado. Tambien puede practicarse como terapia coadyuvante con medicaciones para el asma mediante inhalador (por ejemplo, esteroides antiinflamatorios, como el dipropionato de beclometasona), otros antiasmaticos 10 como el cromolino sodico (sal bisodica de 1,3-bis(2-carboxichromo-5-iloxi)-2-hidroxipropano, (“INTAL”) y broncodilatadores como el sulfato de albuterol.

Pueden tratarse otras muchas enfermedades asociadas a una elevada actividad de la trombina y/o a la formation de depositos de fibrina mediante la administration de los conjugados de esta invention. Los procesos inflamatorios vinculados al smdrome de 15 dificultad respiratoria del adulto son basicamente similares a los presenciados con la RDS neonatal y pueden tratarse mediante la terapia antitrombotica descrita. Tambien se ha observado que la fibrosis pulmonar espontanea activa las cascadas de coagulacion/fibrinolrticas en los espacios aereos pulmonares. La enfermedad fibrotica del pulmon suele ser un efecto secundario asociado a la quimioterapia anticancerigena, y la 20 administracion antitrombotica de los conjugados de heparina covalentes segun esta tecnologia puede realizarse profilacticamente con anterioridad a la quimioterapia contra el cancer para impedir la fibrosis pulmonar. La administracion se repite tras la quimioterapia a fin de asegurarse de que no se forma fibrina. Tambien esta bien documentado un descenso de la actividad de la antitrombina y un aumento en la actividad de la trombina en la sepsis.

25 La sepsis es el factor de riesgo mas comun del desarrollo del RDS en adultos. De este modo, los conjugados de heparina segun la presente invencion pueden utilizarse para reducir la mortalidad asociada al choque septico.

Los conjugados segun la presente invencion pueden administrarse a una dosis terapeuticamente efectiva, es decir, en una cantidad que, al administrarse a un mamifero 30 que la precise, sea suficiente para efectuar el tratamiento, como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, reducir o tratar en otra forma la trombosis en mamiferos, o desactivar la trombina de los coagulos, o inhibir la acumulacion de trombos). La administracion de los compuestos activos y sales descritos en el presente documento puede llevarse a cabo a traves de cualquiera de los modos aceptados de administracion para 35 agentes que sirvan para propositos similares.

En general, una dosis diaria aceptable se encuentra en torno a entre 0,001 y 50 mg por kilogramo de peso corporal del receptor y por dia, en torno a entre 0,05 y 25 mg por kilogramo de peso corporal del receptor y por dia, o en torno a entre 0,01 y 10 mg por kilogramo de peso corporal y por dia. De este modo, para su administration a una persona 5 de 70 kg, el rango de dosis puede oscilar entre unos 0,07 mg y 3,5 g por dia, entre unos 3,5 mg y 1.75 g por dia, o entre unos 0,7 mg y 0,7 g por dia, dependiendo del individuo y del estadio de la enfermedad que se este tratando. En el caso del ATH, la prolongada vida media permite que el compuesto se administre con menor frecuencia que la heparina estandar (por ejemplo, una o dos veces por semana).

10 La administracion puede llevarse a cabo mediante cualquier via sistemica o local aceptada, por ejemplo, la via parenteral, intravenosa, nasal, inhalation bronquial (es decir, formulation en aerosol), vias transdermica o topica, en forma de dosis solidas, semisolidas o liquidas, como por ejemplo, tabletas, supositorios, pfldoras, capsulas, polvo, soluciones, suspensiones, aerosoles, emulsiones o similares, como formatos monodosis adecuados 15 para la administracion sencilla de dosis precisas. Por lo general, pueden utilizarse formulaciones acuosas. El conjugado puede formularse en un medio excipiente no toxico, inerte, farmaceuticamente aceptable, con un pH de alrededor de 3-8 o con un pH de alrededor de 6-8. Por lo general, la formulacion acuosa puede ser compatible con el cultivo o medio de perfusion. Las composiciones incluiran un excipiente farmaceutico convencional 20 o excipiente, y un conjugado del glicosiaminoglicano, y ademas, puede incluir otros agentes terapeuticos, agentes farmaceuticos, vehiculos, adyuvantes, etc. Los vehiculos pueden seleccionarse entre los diferentes aceites, incluyendo los derivados del petroleo, o los de origen animal, vegetal o sintetico, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de ajonjoli, y similares. Entre los ejemplos de excipientes liquidos adecuados 25 se encuentran el agua, la solution salina, la dextrosa acuosa o el manitol, asi como los glicoles, especialmente en el caso de las soluciones inyectables. Entre los vehiculos farmaceuticos adecuados se encuentran el almidon, la celulosa, el talco, glucosa, lactosa, sucrosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sflice, estearato magnesico, estearato sodico, monoestearato de glicerol, cloruro sodico, leche desnatada evaporada, glicerol, 30 propilenglicol, agua, etanol, y similares. Otros vehiculos farmaceuticos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin (1985).

Si asi se desea, la composition farmaceutica que va a administrarse tambien puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no toxicas, como agentes 35 humectantes o emulsificantes, agentes reguladores del pH y similares, como por ejemplo, acetato sodico, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina, etc.

Los compuestos de la presente invention pueden administrarse como una composition farmaceutica que comprende un excipiente farmaceutico en combination con un conjugado del glicosiaminoglicano. El nivel del conjugado en una formulation puede variar dentro del amplio rango utilizado por cualquier persona versada en la materia, por 5 ejemplo, entre aproximadamente 0,01 por ciento en peso (% p/p) y aproximadamente un 99,99% p/p del farmaco, basado en la formulacion total, y entre un 0,01% p/p y un 99.99% p/p de excipiente. En un ejemplo, la formulacion puede estar situada en torno a entre un 3,5 y un 60% en peso del compuesto farmaceuticamente activo, siendo el resto excipientes farmaceuticos adecuados.

10

Ejemplos

Los siguientes ejemplos muestran las realizaciones de la invencion que mejor se conocen en la actualidad. No obstante, ha de entenderse que cuanto sigue son tan solo 15 ejemplos que ilustran la aplicacion de los principios de la presente invencion. Las personas versadas en la materia pueden concebir numerosas modificaciones y composiciones alternativas, procedimientos y sistemas, sin alejarse del espmtu y del ambito de la presente invencion. Las reivindicaciones adjuntas tratan de cubrir dichas modificaciones y adaptaciones. De este modo, aunque la presente invencion se ha descrito anteriormente de 20 forma particular, los siguientes ejemplos facilitan detalles adicionales en relation con lo que en la actualidad se consideran realizaciones practicas de la invencion.

Ejemplo 1: Elimination de las cadenas de heparina de muy bajo peso molecular

25 La heparina (0,5 ml de 10.000 U.I./ml de Heparina Leo®) se filtro en una columna de cromatografia Sephadex® G-200 de 49 cm por 1 cm. La heparina se eluyo con NaCl 1 M y se recogieron fracciones de 20 gotas (1,27 g por fraction). Las absorbancias de cada fraction se indican en la tabla 1 y en la figura 1.

Tabla 1

Se agruparon las fracciones 24-30. Estas fracciones no incluyen las cadenas de 5 heparina con plasminogenicos pesos moleculares muy bajos (fracciones 31-40). Las cadenas de heparina con un mayor peso molecular de las fracciones 1-23 se excluyeron en aras de la facilidad de separacion del ATH de la heparina que no ha reaccionado en posteriores etapas. Las cadenas de heparina de las fracciones 24-30 tenian unos pesos moleculares tan elevados como unos 18.000 Daltons. La exclusion de las cadenas de 10 heparina mas largas garantizo que la heparina no se solapase con la AT y el ATH al purificar el producto. Sin embargo, las cadenas de heparina con mas alto peso molecular pueden incluirse en el producto en otros ejemplos.

Se llevo a cabo otro filtrado con gel de la heparina (0,5 ml de10.000 U.I./ml de Heparina Leo®) en la columna de cromatografia Sephadex® G-200 de 49 cm por 1 cm. Una 15 vez mas, la heparina se eluyo con NaCl 1 M y se recogieron fracciones de 20 gotas (1,23 g por fraccion) Las absorbancias de cada fraccion se muestran seguidamente en la tabla 2.

Tabla 2

Los resultados de la cromatografia mostrados en la tabla 2 eran similares en cuanto a su perfil de elucion a los de la primera filtracion con gel de la heparina de la tabla 1 que 5 antecede. Las fracciones 24-30 se agruparon y se combinaron con las fracciones agrupadas procedentes de la primera cromatografia, cuyos resultados se facilitan en la tabla 1. Las fracciones combinadas agrupadas se dializaron frente a H2O a 4° C y posteriormente se liofilizaron.

10 Ejemplo 2: Reaction de la heparina con la AT

Se dializo bajo presion AT humana hasta una concentration de 13,87 miligramos/ml y posteriormente se dializo una vez mas frente a fosfato 0,02 M NaCl 0,15 M pH 7,3 a 4° C, seguido de su almacenamiento a -60° C tras la dialisis. Se disolvieron 19,12 mg de las 15 fracciones de la heparina liofilizada del Ejemplo 1 anterior en 1 ml de fosfato bisodico 0,3 M NaCl 1 M pH 9,5 que se habian filtrado a traves de un acrodisco esteril con un tamano de poro de 0,2 micras. La solution resultante se deposito en un tubo de ensayo de plastico de 12 mm por 75 mm y se anadieron con la mezcla 72 microlitros de la AT humana. Se cerro el tubo con una tapa de plastico y se precinto el exterior de la tapa con parafilm. El tubo y sus 20 contenidos se calentaron en un bano de agua a 37° C durante 14 dias.

Tras su incubation durante 14 dias, la mezcla de heparina y AT se filtro con gel en una columna de cromatografia Sephadex® G-200 de 48,5 cm por 1 cm con NaCl 1 M y se recogieron fracciones de 20 gotas. Las absorbancias de cada fraction se muestran en la tabla 3 y en la figura 2. Con fines de comparacion, en la figura 2 tambien se muestra una cromatografia independiente de la AT en solitario, realizada en la misma columna de cromatografia Sephadex® G-200,

Tabla 3

Las fracciones 14-16 que contienen el producto ATH se agruparon y dializaron bajo presion frente a NaCl 0,15 M para obtener una masa final de 0,74832 g.

Ejemplo 3: Inhibition de la actividad de la trombina por parte del ATH

Se realizaron experimentos para evaluar la reaction de la trombina con las fracciones dializadas bajo presion y agrupadas de ATH del ejemplo 2. En cada reaccion, se mezclaron 114 microlitros del material que se estaba analizando con 5,83 microlitros de 20 U de IIa (trombina) bovina /ml de NaCl 0,15 M en un tubo plastico Eppendorf y se dejo a 23 °C durante 10 min. Tras el periodo de 10 minutos, se mezclaron 100 microlitros de la solution con una solucion de 875 microlitros de acetato sodico 0,036 M, barbital sodico 0,036 M, NaCl 0,145 M pH 7,4 y 25 microlitros de 3,125 mg S-2238/ml H2O en una cubeta a 23 °C al ponerse en marcha el cronometro. El S-2238 es el sustrato cromogenico de la trombina. La absorbancia frente a H2O a 405 nm de la solucion resultante se midio cada 10 segundos durante 5 minutos. Se llevaron a cabo las siguientes reacciones:

Reaccion 1 (control): se analizaron 114 microlitros de NaCl 0,15 M.

Reaccion 2: se analizaron 114 microlitros de ATH.

Reaccion 3: se analizaron 28,5 microlitros de ATH anadidos a 85,5 microlitros de NaCI 0,15 M.

Reaccion 4: se analizaron 11,4 microlitros de ATH anadidos a 102,6 microlitros de NaCI 0,15 M.

5 Las absorbancias a 405 nm son una medida directa de un producto escindido del sustrato S-2238 por cualquier trombina que permaneciese en la cubeta. Las absorbancias registradas cada 10 segundos para cada reaccion se muestran en la Tabla 4 y en la figura 3.

Tabla 4

Los datos obtenidos de estas cuatro reacciones muestran que incluso pequenos volumenes del concentrado de ATH son capaces de neutralizar la actividad de la trombina en comparacion con la reaccion de control (Reaccion 1) con tan solo NaCl 0,15 M.

5 Ejemplo 4: Tiempo de coagulation con ATH

Se mezclaron 10 microlitros de IIa bovina 20 U (trombina)/ml NaCl 0,15 M con: 90 microlitros de NaCl 0,15 M, 85 microlitros de NaCl 0,15 M mas 5 microlitros del concentrado de ATH del Ejemplo 2 anterior, o con 80 microlitros de NaCl 0,15 M mas 10 microlitros de 10 concentrado de ATH. Las mezclas se calentaron a 37° C durante 1 minuto en un tubo plastico. A continuation se mezclaron 100 microlitros de 0,2 g de fibrinogeno humano /100 ml de NaCl 0,15 M cuando se puso en marcha el cronometro. Se registro el momento de la primera aparicion de un coagulo en el extremo de una anilla de alambre utilizada como agitador. En los sucesivos ensayos, los 90 microlitros de NaCl 0,15 M puro arrojaron unos 15 tiempos de coagulacion de 26,2 segundos, 25,2 segundos, y 26,0 segundos. Los 85 microlitros de NaCl 0,15 M mas los 5 microlitros de concentrado de ATH arrojaron unos tiempos de coagulacion de 34,0 y 33,8 segundos. Los 80 microlitros de NaCl 0,15 M mas los 10 microlitros de concetrado de ATH arrojaron unos tiempos de coagulacion de 39,2 y 39,6 segundos. Los tiempos de coagulacion mas largos indican una reduccion en la actividad de 20 la trombina en las reacciones con el concentrado de ATH.

Ejemplo 5: Tiempo de coagulacion con ATH

Se mezclaron 100 microlitros de 0,2 g de fibrinogeno humano /100 ml NaCl 0,15 M 25 con: 90 microlitros de NaCl 0,15 M, 85 microlitros de NaCl 0,15 M mas 5 microlitros del concentrado de ATH del Ejemplo 2 anterior, o con 80 microlitros de NaCl 0,15 M mas 10 microlitros de concentrado de ATH. Las mezclas se calentaron a 37° C durante 1 minuto en un tubo plastico. A continuacion se mezclaron 10 microlitros de 20 U de IIa bovina (trombina)/ml NaCl 0,15 M al ponerse en marcha el cronometro. Se registro el momento de 30 la primera aparicion de un coagulo en el extremo de una anilla de alambre utilizada como agitador. En los sucesivos ensayos, los 90 microlitros de NaCl 0,15 M puro arrojaron unos tiempos de coagulacion de 25,8 y 26,0 segundos. Los 85 microlitros de NaCl 0,15 M mas los 5 microlitros de concentrado de ATH arrojaron unos tiempos de coagulacion de 30,6 y 31,2 segundos. Los 80 microlitros de NaCl 0,15 M mas los 10 microlitros de concentrado de ATH 35 arrojaron unos tiempos de coagulacion de 37,2 y 35,2 segundos. Los tiempos de coagulacion mas largos indican una reduction en la actividad de la trombina en las reacciones con el concentrado de ATH.

Ejemplo 6: Liofilizacion en una solution con alto contenido en sal

5

Se preparo el ATH como se ha descrito en los ejemplos 1 y 2 anteriores. Las fracciones 13 - 16 (20 gotas por fraction, con un peso individual en torno a 1,2 g a 1,3 g) que contenian el ATH eluido a partir de la columna Sephadex® G-200 con NaCl 1 M se agruparon y liofilizaron. El material liofilizado se volvio entonces a suspender en 0,5 ml de 10 agua y se dializo en una solucion de NaCl 0,15 M. Despues se comprobo la inhibition de la actividad de la trombina en el ATH resuspendido. Se llevaron a cabo 3 reacciones, utilizando: una solucion tampon (acetato sodico 0,036 M, barbital sodico 0,036 M NaCl 0,145 M pH 7.4), el ATH resuspendido, una solucion de AT a 13,87 micrograms/ml de NaCl 0,15 M, una solucion de heparina (similar a la utilizada para producir el ATH) a 10 micrograms/ml 15 de NaCl 0,15 M, una solucion de S-2238 a 3,125 mg/ml H2O, y una solucion de IIa bovina (trombina) a 10 U IIa/ml NaCl 0,15 M.

Reaction 1: 114 microlitros de solucion tampon, 5.83 microlitros de IIa. Reaction 2: 104.5 microlitros de solucion tampon, 9.6 microlitros de ATH resuspendido, 5.83 microlitros de IIa.

20 Reaccion 3: 55,0 microlitros de solucion tampon, 32.9 microlitros de solucion de AT, 26,3 microlitros de solucion de heparina, 5.83 microlitros de IIa.

Se anadieron los ingredientes en el orden mostrado para cada una de las reacciones anteriores en un tubo plastico, mezclando despues de cada adicion. Tras 10 minutos de incubation a 23o C, se tomo una fraccion alicuota de 100 microlitros de la reaccion y se 25 mezclo en una solucion que contema 25 microlitros de S-2238 mas 875 microlitros de solucion tampon en una cubeta cuando se puso en marcha el cronometro. Se tomaron lecturas de absorbancia frente a H2O a 405 nm cada 10 segundos. Los resultados de las reacciones se muestran en la figura 4. Los resultados demuestran que, al contrario que en el caso de mezcla de AT mas heparina, el ATH resuspendido no fue capaz de inhibir la 30 trombina. No se produjo una reduccion significativa en la actividad de la trombina cuando el ATH resuspendido se mezclo con la trombina, en comparacion con la trombina por si sola (mostrado como cuadrados abiertos en la figura 4).

El mismo ATH resuspendido tambien se sometio a prueba combinando el ATH resuspendido con trombina y plasma humano. Un volumen de solucion reguladora, ATH y/o 35 una muestra de la fraccion de heparina (similar a la utilizada para producir el ATH), y un volumen de IIa bovino (trombina) se mezclaron en un tubo vidrio de borosilicato de 6 mm por 50 mm a 37° C. Al cabo de 1 minuto, se anadio un volumen de plasma humano (calentado a 23° C inmediatamente antes de su utilization) mezclandolo al ponerse en marcha el cronometro. Se registro el momento de la primera aparicion de un coagulo en el extremo del alambre utilizado como agitador. Para cada reaction, el volumen de IIa bovino fue de 10 microlitros de 15 U de 11a/ml de NaCl 0,15 My el volumen de plasma humano fue de 100 microlitros. Los volumenes del resto de componentes y los tiempos de coagulation se muestran en la tabla 5.

Tabla 5

Estos datos confirman que, aunque el ATH resuspendido no mostro por si mismo actividad de inhibition de la trombina, las cadenas de heparina del ATH resuspendido pudieron catalizar la inhibicion de la trombina a traves del AT exogeno encontrado en el plasma humano. Los tiempos de coagulacion de las reacciones que incluian el ATH aumentaron enormemente hasta los 120 segundos. Por lo tanto, habia claramente una cantidad suficiente de ATH presente para inhibir la trombina, pero el ATH no mostro ninguna actividad de inhibicion de la trombina por si misma. Esto datos sugieren que la actividad del ATH se destruyo liofilizando el ATH en una solucion salina (de alta concentracion).

Ejemplo 7: Reciclado de la AT

El ATH se sintetizo conjugando la AT y la heparina sin fraccionar. El rendimiento de esta preparation fue del 35,28%, definido como porcentaje de la AT inicial que se recupero como ATH. Esto dejo 100 - 35,28 = 64,72% de la AT original no incorporada al complejo. Tras la conjugation se separo el resto de AT no conjugada. Esa AT no conjugada se utilizo 5 a continuation en una smtesis adicional en la cual la AT reciclada se hizo reaccionar con heparina adicional para obtener el ATH. De la AT reciclada, un 58,59% se convirtio en ATH. Por lo tanto, del 64,72% de AT que no se incorporo al complejo en la primera preparacion de ATH, un 58,59% adicional se convirtio en ATH en la segunda smtesis de ATH. De este modo, se obtuvo como ATH un 64,72 x 58,59/100 = 37,92% adicional de la AT original 10 utilizada en la primera preparacion de ATH reciclando la AT no enlazada en una segunda smtesis de ATH. Por ultimo, al combinar los resultados de las 2 preparaciones de ATH, el rendimiento total de ATH en terminos de la AT original al inicio de la primera smtesis fue de 35,28 37,92 = 73,20%. Este rendimiento total del ATH es muy superior al rendimiento maximo del 60% que puede obtenerse mediante una unica smtesis de ATH. Ademas, puede 15 verse facilmente que la AT no conjugada recuperada de la smtesis del ATH con la AT reciclada podria utilizarse de nuevo para una tercera smtesis de ATH para elevar aun mas el rendimiento del conjugado en terminos de la AT original.

Debe entenderse que las preparaciones indicadas anteriormente tratan de ilustrar la aplicacion de los principios de la presente invention. De este modo, aunque la presente 20 invencion se ha descrito anteriormente en relation con los ejemplos de realization, sera evidente para cualquier experto en la materia que puede introducirse numerosas modificaciones y efectuarse configuraciones alternativas sin apartarse de los principios y conceptos de la invencion, tal y como se recogen en las reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composition para la prevention de la trombogenesis, que comprende: antitrombina y heparina, donde al menos un 50% en peso de la heparina esta conjugada con antitrombina, 5 y donde al menos un 98% en peso de la heparina de la composition, ya como heparina o en la heparina-antitrombina conjugada tiene un peso molecular superior a 3.000 Daltons.

2. Composition de la revindication 1, donde el peso molecular es superior a 5.000 Daltons.

10 3. Composition segun la revindication 1, donde la heparina incluye cadenas que contienen 18 monosacaridos o mas.

^{4. Composition segun la re}v^{indication 1, donde la heparina de la composition tiene un}peso molecular inferior a 30.000 Daltons.

15

^{5. Composition segun la re}v^{indication 1, donde la heparina de la composition tiene un}peso molecular inferior a 20.000 Daltons.

^{6. Composition segun la re}v^{indication 1, donde la composition incluye ademas un agente}20 de enlace y la heparina esta conjugada con la antitrombina mediante el agente de enlace.

^{7. Composition segun la re}v^{indication 1, donde la heparina de la composition tiene un}peso molecular superior a 3.000 Daltons e inferior a 30.000 Daltons.

25 8. Procedimiento de fabrication de una composition de acuerdo al menos una de las reivindicaciones precedentes que comprende:

la conjugacion de antitrombina con heparina en una solucion, donde la solucion incluye: i) agua, la antitrombina y la heparina,

ii) agua, alanina en una concentration de 0,01 a 0,09 molar, la antitrombina y la heparina, o 30 iii) agua, manitol, y la antitrombina y la heparina;

y donde al menos el 50% en peso del contenido de heparina es conjugada con la antitrombina y donde al menos una parte de la heparina con peso molecular menor de 3.000 Daltons es eliminada previamente a la etapa de conjugation de modo que al menos el 98% en peso de la heparina de la composicion, ya sea como heparina o antitrombina-heparina 35 conjugada, tiene un peso molecular mayor de 3.000 Daltons; y

la liofilizacion de la solucion para obtener un conjugado de antitrombina-heparina liofilizado donde la conjugation y la liofilizacion suceden fuera de un cuerpo de un sujeto.

9. Procedimiento segun la reivindicacion 8, donde la portion de la heparina se elimina 5 mediante un proceso seleccionado entre dialisis, diafiltrado, filtrado con gel, electroforesis, y combinaciones de los mismos.

10. Procedimiento de la reivindicacion 8 que comprende ademas la reconstitution del conjugado antitrombina-heparina liofilizado con un disolvente para formar una solucion 10 acuosa de conjugado de antitrombina-heparina, donde el conjugado de antitrombinaheparina se encuentra presente en una concentration de 9-11 mg/ml con respecto a la totalidad del volumen de la solucion acuosa.

11. Procedimiento de la reivindicacion 8 que tiene un rendimiento de, al menos, un 60% en 15 peso del conjugado de antitrombina-heparina, basandose en la concentracion inicial de antitrombina utilizada para la preparation del conjugado de antitrombina-heparina en el que dicho rendimiento de al menos un 60%, se consigue, al menos parcialmente, mediante reciclado de la antitrombina no conjugada y haciendo reaccionar dicha antitrombina no conjugada con heparina adicional.

20

12. Procedimiento segun la reivindicacion 8 donde la solucion es la solucion i) y donde el procedimiento comprende adicionalmente la introduction de un catalizador en transposition de Amadori, en la solucion i) y el calentamiento de la solucion.

25 13. Procedimiento segun la reivindicacion 12, donde el catalizador se selecciona entre los integrantes del grupo formado por la 2-hidroxipiridina, sales de amina terciarias, malonato de etilo, fenilacetona, acido acetico, y combinaciones de dichos productos.