PT98779B - Processo para a preparacao de uma composicao anticoagulante contendo inibidor sulfatados e metodos para a sua utilizacao - Google Patents

Description

An tec ed en tes d ο I n ver, to

Este invento diz respeito a uma combinação anticoagulante as Lal»X e polxssacarxdos sulfatados s, sisis particularmente, a uma combinação de LAC1 e heparina ou tais polissacáridos sulfatados anticoagulantes, semelhantes, que exercem uma acção anticosqulante sinérqica no plasma total.

contacto que envolve a

A coagulação do sangue pode ser activada através da via intrínseca ou extrínseca. A via intrínseca começa com a fase de interacção do factor XII, calicreína, quininogénio de elevado peso molecular, uma superfície estranha e (Σ , converte o a ·

-Ç -H. MM X ·_ - — ϊ <='.<_ uOr	Λ	7 2. «	0	produto desta	reacção, o factor
fac tor	1	V	no	factor IX , que a	su bsquen temen te h i
ao fac	tor	y ct	na presença de	factor VIII activad·
cálcio	n	Al	ter	nativamente.. a	vis extrínseca é

factor VII./VII plasmático se liqa ao f-actor do

s.

Tromboplastina) para formar um complexo que activa mente os factores IX e X,

Tormado o iniciada quando o tecido (TF;, sr o teo 1 i t i c a—

-ΞΙ *' extrínseca.

através da via intrínseca quer através da via pode liqar o factor V , fosfolípido, e cálcio para formar complexo protrombina.se que converte protrombina em tronsbins. F o

'or último, a trombina yrovuca a furmacãu :oáaulo de fibrina,

A heparina tem sido largamente utilizada como um anticoaguXante em condições clínicas, 0 efeito antícoagulante da heparina è em larga escala uma consequência directa da sua acção catalítica na inibição da trombina por antitrombina III, e am menor escala da sua acção catalítica na inibição por antitrombina iii de outras proteases ds coagulação incutindo factores XI1 , XI„, I-”\, X e calicreína í1-4). Na ausência de heparina, a

i ·?' V antitrombina III não inibe o factor VII (5—tí) >= Na. presença de beparina, o factor VII foi descrito ser resistente à inibição * ct (6) ou é inibido a 50% por antitrombina ϊϊI em íí min (7), 75-8® min (8) ou b horas C5), Assim, a velocidade de inibição do factor

VII que por antitrombina III ê tão lenta, que é pouco provável antitrombina 1ΙΪ seja, um regulador fisiológico da. via do TF/factor VII na. presença ou na ausência de beparina. (9) » Adicional mente è. inibição dependente da antitrombina III de proteases da. via intrínseca, a beparina pode também exercer acção anticoagulante por substituição do factor X e protrombina -a partir do complexo protrombinase de uma maneira independente da antitrombina 111 ( i V , í i ΐ II

Nos últimos anos, a evidência mostrou que a regulação da via. extrínseca pode envolvei”· principal mente uma proteína derivada do plasma denominada inibidor de coagulação associada a lipoproteína ÍLACI) (12). Esta proteína foi também referida como inibidor da via extrínseca CEPI) (13), ou inibidor do factor do tecido CTFI) (14), 0 inibidor é capaz de se complexar directamenJl complexo TF/factor VII /factor X _/Ca ’/inibidor, inerte (12), A

5. í=*.

seguir à purificação do inibidor aparentemente relacionado do hepatoma Hep 62 (14), o cDNA que codifica a proteína, foi subsousn temente clonado (15). Recentemente, a expressão d·;

recombinante gerou grandes quantidades de proteína par; ção in vitro e in vivo.

proteína utilisa0 isolamento tíe LACI dos meios condicionados de células Hep S2, células SK-Hep-Í, e células de fígado Chang é também descrito no pedido de Patente Europeia EP 3@@ 988, publicado a. 25 de Janeiro de Í9S9, e a clonagem do cDNA cus

;·α

L.ACI έ também descrita no pedido de Patente Europeia Eh 318 451 publicado a 31 de Maio de 186=8.

As referências aqui citadas por números em parêntesi; são registadas abaixo.

Breve Descrição do Invento presente invento refere—se a uma nova combinação anticoaguXante de inibidor da coagulação associada a 1ipoproteína (LACI) e polissacáridos sulfatados. Descobriu—se, mente, que esta combinação exerce uma acção sinergias no plasma total.

su r preen d en te— án t icoaqu 1 an te

Numa concretização preferida do invento» o LACI e a heparina provocam uma anticoagulação grandemente aumentada comparada com quer a do LACI quer a da heparina, sósinhos» Muitos polissacáridos sulfatados relacionados, tendo actividade anticoa— gulante conhecida, mostraram também aumentar a inibição dependente do LACI da coagulação induzida pelo TF. As potências relativas destes compostos estão na seguinte ordem, em pesos heparina de baixo peso molecular í ’M ’r o íô®/ > heparina não fraccionada > ρο1i ssu1f a to heparina de baixo peso molecular CM = 3 7©·©} pentosano > sulfato de dermatano > sulfato de dextrano > sulfato de neparano» inibição d

F‘or causa do mecanismo único e capacidade do LACI na pelo TF, o LACI tem sido até coagu1ação induzida agora descrito como uma proteína terapêutica potencial para tratamento/prevenção de doenças trombóticas» A utilização sinér qica da heparina e LACI em combinação» como aoui descrito» para

aplicações terapêuticas ê assim altamente atractiva. pelas sequintes razõess primeiro, a beparina está largamsnte disponível e pode reduzir a. quantidade ds LACI requerida para o tratamento por potenciação da função do LACI? sequndo. a beparina o LACI em combinação inibem quer a via de coagulação intrínseca quer a extrínseca; e terceiro? a combinação pode ser eficaz em condições clínicas onde a beparina sózinha não é suficiente, por exemplo, coagulação intravascular disseminada onde o TF pode ser gerado em grandes Quantidades.

LACI e polissacáridos sulfatados utilizados para inibição da coagulação são, preferivelmente? quantidades pequenas mas eficazes na produção de um resultado de anticoagulação sinérgica» A utilização de cerca de 0,1 a cerca de 4 unidades de beparina por ml de plasma em combinação com de cerca de pg a cerca de 5 pg de LACI por ml de plasma é preferida para a actividade anticoagulante sinérgica. Outros polissacáridos ser utilizados em várias quantidades s proporções com LACI para produzir efeitos anticoagulantes sinérsulfatados podem também u-r-Oír

gicQS» A utilização	das quantidades j
destes outros polissa	oáridos sulfatadi
de 5 μα de LACI é	preferida para
sinérgicas
<3 52—2 gg/ml ds	he ρβ. r i n e. d- e ha
100) 5
1-10 pgZml de	beparina ds ba
70Θ5 „
4,5—45 pgZml de	poIíssu1f a to de
34—34Θ p.gZmI de	sulfata ds dsrma
5O-500 pg/ml de	su 1 f a t ce d e d e x t r

com cerca de ®„1 a cerca ic t i v i d a d e an t icoaq u 1 an te

100—i 000 p.q/ml de sulfato de heparano» tomo aqui utilizado, o LAUl O definido para u íniuidur da coagulação associada a lipoprotsína médio como descrito por

Wun

t.

J.

6001-6004 (í9Sts). 0 L.CAI pode ser isolado a partir de várias fontes conhecidas, por exemplo, dos meios condicionados de células de fígado em cultura tais como células Hep B2_? células de hepatoma SK. e células de fígado Chang ou produzido polos procedimes!

DNA recosíDinan -..e_; tiBDora sejam aqui ceseritos os processos escecxTic de i so1amen to ou produção do LACI, dever-se-á entender que o invento não está limitado a uma qualquer fonte particular do LACI.

li-;

para uma unidade U.S.P. (United States Pharmacopeia) média. A unidade U.S.P. de heparina é aquela quantidade que irá actuar durante uma hora após a adição de €*,2 ml de uma solução de CaCl,-, a is 1000» A heparina é geralmente obtida por^- isolamento a partir de tecidos de mamíferos contendo células mastócito tais como o fígado e c pulmão» Como aqui utilizado, o termo heparina” os soaio.

psrtende-se também que inclua, os seus s farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, exemplos adequados de produtos de sódio de heparina comerciaimenP P ta disponíveis são Lipo-Hspin” CRiksr Laboratories), Liquaemin soiUveis em áoua

Os

Sodium (Organon), banhe (Abbott Laboratories)

Descrição Petalhada da ϊnvento cmoors a especificação concli ;osh a= ^:ÍVÍ; idÍCSt,Q apontando particularmente e reivindicando dsst. in tamente o assunto

no que se refere à formação do presente invento, pensa—se que o invento só será melhor compreendido a partir das concretizações t

preferidas seguintes tomadas em conjução com os desenhos anexos que são representações gráficas em que;

FIG» 1 mostra o efeito da heparina no tempo parcial de tromboplastina activada (ΑΡΊ de um plasma normal e do. plasma isento de LACI endógeno» Foi descongelado um plasma congelado e utilizado sem pré-tratamento ou utilizado após imunoadsorção com uma Sepharose 4B anti-LACI-Ig para eliminar c LACI endógeno. Os plasmas foram suplementados com várias concantrações ds heparina e foi determinado o APTT como descrito nos PROCESSOS, abaixo,

Plasma original plasma isento da LAC .rapolações para além ds €?,6 unidades de beparina/ml de plasma foram baseadas nos resultados de que ambos os plasmas permaneceram não coagulados durante mais do que lha 0,8 unidades de heparina/mi de ρ1asma.

FI(3» 2 mostra o efeito da heparina no tempo de protromfaina (PT) de um plasma normal e ds um plasmai isento de LACI a várias concentrações de factor do tecido (TF), Os plasmas utilizados foram ou não tratados C-o-5 ou isentos de antigénio de LACI endógeno <—^—) por imunoadsorção como descrito nos PROCESSOS, abaixo, 0 reagente de TF foi diluído a 1;10©0 (gráfico A), ísl©© (gráfico B) ou IslO (gráfico C) para a determinação do PT» As linhas a tracejado nos gráficos A e B foram extrapolações baseadas nos resultados de que os plasmas permaneceram não coagulados durante mais do que lha 0,5 (gráfico A) e 2 (gráfico 3) unida— des de heparina/ml de ρ1asma, respectivamente»

FIG. 3 mostra o efeito do LACI exogenamente adicionado no PT de um plasma induzido para coagular a várias concentrações de TF» Gráfico A, d reaoente foi diluído a lsl€>000 (-D-), 1:1000 ·-) para a determinação do PT» Gráfico B, reagente de TF foi utilizado numa diluiçãoa 1:10,

FIG: 4 mostra um teste de sinergia entre a heparina s o LACI no prolongamento do PT de um plasma isento de LACI» (A) Efeito do LACI neparma uma combinação de LACI s heparina no PT de um plasma isento de LACI» Um plasma isento de LACI foi suplementado com LACI í-x-), heparina G-> ou uma combinação de LACI e hepsrini

A—} g foram determinados os seus

PTs Cuma descrito nos PRDCESSGS, abaixo, utilizando 90 μΐ de diluição a Is100 do reagente de TF»

ÍB) Análise isobolar da interseção LACI/heparina. As concentrações de LACI e heparina, sózinhos, e LACI/heparins em combinação que dão os mesmos PTs (tempos de coagulação isoeficazes de SO, 100, 120, 140, 160, 180 e 200 seg) foram determinadas a partir das curvas no gráfico (A)» Da e Db são as concentrações de LACI e heparina, separadamente, que são isoeficazes com a combinação de LACI/heparina a concentrações de da. e db, respectivamen— te» Os valores de da/Da + db/Dfa reflectem se os dois agentes interagem» Uíte valor =1 sugere zero de interseção; um valor >1 indica antagonismo; e um valor <í mostra sinergia, heparina e da combinação de LACI e heparina no PT de um plasma isento de LACI endógeno. 0 plasma estava isento ds LACI endógeno por imunoadsorção rtuflia coluna de Sepharose 4B anti-LACI—Ig. □ PT foi determinado como descrito nos PROCESSOS, abaixo, utilizando 90 μΐ de diluição ·_

-'s a 1:10© do reagente TF» 0 plasma isento de LACI foi suplementado com várias quantidades de LACI ( —x—), heparina <—O-) e LACI em combinação cora 0,5/(-·-), Ι,β (-A-) g 2,0 (-Δ—) unidades de heparina por ml de plasma, respectivamente. São mostradas as equações e coeficientes de correlação da análise de regressão linear»

FIG» ó mostra o efeito dos polissacáridos sulfatados no PT do plasma normal» 0 PT foi determinado como descrito nos PROCESSOS, abaixo, utilizando SO μΐ ds diluição

1:100 do reagente TF, 1© μΐ de polissacáridos sulfatados, í@® μΐ de um plasma, reunido e 100 μΐ ds CaCl_o 25 mM» Os polissacàridos sulfatados utilizados são LMWH51©® (heparina ds baixo peso molecular,

- 5Í0Õ); LÍFH (heparina não fraccionada); LMWH37O0 (heparina ds t

baixo peso molecular, M = 37®®); PPS (polissulfato de pentosano) DS (sulfato de dermatano)? DXS (sulfato de dextra.no, M = 6000---8000): e HS (sulfato de heparanq).

FISs 7 mostra o efeito dos polissacáridos sulfatados, LACI e da combinação de polissacàridos sulfatados/LACI no PT de um plasma reunido, □ PT foi determinado como descrito nos PROCESSOS, abaixe, utilizando 7® p.l de diluição a 1:10® do reagente TF, 1® p.I de polissacárido sulfatado, LACI, ou uma combinação dos dois às concentrações indicadas, 10® μΐ ds um plasma reunido e 10® μΐ de CaCl^, 25 mM. Os compostos utilizados foram os mesmos ó» LACI sózinho (-X-); polissacárido daqueles da FIG,

Sozxnno <-*->„ (-D —); uma combinação de LACI e pol issacárido sulfatado sulfatado

A nova combinação antícoagulante de LACI e polissacári— dos sulfatados é aqui, adicionalmente, ilustrada em detalhe por

uma combinação de LACI recombinante CrLAUl) expresso em células CÍ27 de ratinho e heparina e polissscáridos sulfatados relaciona—

LACI aqui empregue è um conhecido inibidor derivado do plasma que inibe a coagulação induzida pelo factor do teci— doCTF)/factor VII de uma forma dependente do factor X , Os papeis do LACI plasmático endógeno e do LACI exogenamente adi;

□nano e da heparina na regulação da coagulação iniciada pelas vias intrínseca e extrínseca foram testados empregando um ensaio do tempo parcial de trombopisstina activada (APíT) e um ensaio de tempo de protrombina (PT) modificado. Tais ensaios são convencionais no campo de. hematologia para medir o efeito da heparina; nos tempos de coagulação sanguínea. Ver, por exemplo. Patente dos E.U.A» 3 486 981.. 0 plasma isento de LACI e o plasma normal tinham idênticos APTTs e prolongamentos semelhantes do APTT em resposta à heparina? e são ambos completamente anticoagulados Carbitrariamente definido como tempos de coagulação superiores a 1 h> a semelhantes concentrações de heparina» Este-=. resultados indicam heparina ê um anticoagulante muito eficaz quando a.

coagulação ê iniciada pela via intrínseca e que o LACI endógeno não está significativamente envolvido na regulação desta vi-a, D PT do plasma normal só é marginalmente mais longo do que aquele do plasma isento de LACI na ausência de heparina, sugerindo que o LACI plasmático endógeno tem uma capacidade muito limitada para inibir a coagulação induzida pelo TF» Contudo, na presença de heparina, os PTs do plasma; isento de LACI ε o PT do plasma normal são muito diferentes» 0 prolongamento do PT só ocorreu moderadamente e linearmente com o aumento das concentrações de heparina no plasma isento de LACI, em contraste, o plasma normal mostrou uma maior extensão de prolongamento do PT na resposta ã heparina il

ε o plasma tornou-se completamente anticoagulado a um-a certa, concentracão limiar. Estes resultados sugerem que o LACI serve loítig us« LOisuLor para, ; coagulação induzida, oel· heoarina e aumenta muito a inibição da p í tíSfíia mentado com LACI recombinante purificado, heparina ou uma combinação dos dois e foram testados os seus efeitos na. coagulação induzida pelo TF. Descobriu-se inesperadamente que o LACI a a heparina, em combinação, causaram uma anticoagulação muito aumentada quando comparada à do LACI hepsrxna, —-’._í £. .i, PI I

Muitos polissacáridos sulfatados mostraram também aumentar a inibição dependente do LACI da coagulação induzida pelo TF. Osintervalos eficazes destes compostos sãos heparina de baixo peso molecular CM_p. = 5 1®0), a 0,2—2 pg/ml; heparina não fraccionada, a 0,1-4 unidades/mlg heparina de baixo peso molecular CM = 3 /W)₅ a i —l£j pg/ml, polxssultato d© psntosano, a 4.5—45 pg/ml;

sulfato de dermatano, μ g/ ml, s u 1 f a t o de d e x t r a η o

3-000 pg/ml; e sulfato de hepara.no, a 100-1000 pg/ml, Com base nos resultados acima, concluiuque o uALi e um cotactor para a di heparina na coagulação induzida pelo í’F sacé.ridos sulfatados exercem uma acc-ão no plasma total.

e qu.e o LACi e os pulis—

Os exemplos seguintes irão ilustrar, adicionalmente, c invento, embora se deva compreender que o invento não est« limitado a estes exemplos específicos ou aos detalhes neles,

EXEMPLOS

A tromboplastina ds cérebro ds coelho (factor do tecido, TF) foi obtida a partir ds Ortho Diagnostic» 0 reagente de cefaloplastina activada de Dade para a determinação do tempo parcial ds tromboplastina activada CAPTT) foi adquirido a partir de American Scisntific Product» A heparina não fraccionada (UFH, lote 038078) το:

de baixo peso molecular (LMWH) 5100 e 3700 eram ds Calfaiochem» de Elkin-Sínn Inc» As heparinas com um peso molecular médio de

Polissulfato de #P8275), sulfato ds densatano de mucosa de bovino (DS, #02413) _? e sulfato de heparano ds mucosa intestinal de bovino CHS., #H76Í4)_P eram ds Sigma» □ sulfato de dextrano (DXF, M — 7000—8000) foi fornec ide- ocr ICfM BicK~hcnii.c-3.ls» 0 plâs/ns. humsnQ foi 'fornecido pela American Red Cross (St.. Louis), Quatro unidades de plasma foram reunidas e armazenadas, congeladas, em alícotas a —80°C até utilização» 0 factor X d-e bovino e Spsctro; s.

de American Diagnostica» rufam obtidos

PROCESSOS

Expressão e Purificação do rLAuI rLACX foi expresso em célula C12Z de ratinho utilizando um vector de vírus do papiloma de bovino e a linha ds células produtora de rLACX foi deixada crescer numa cultura de paf a uOiheita do meio condicionaoo como se sbqubs ce í uιas

vector â base de virus ds papiloma de bovino=_; pM0N1123, que consiste num qenoma ds vírus de ρ-apiloms de bovino completo clonado no derivado pBR322 ds pML.2, foi utilizado para expressar o LAO. Este vector utiliza o promotor ds metalotionina ϊ de ratinho e sítio de adição de poli A 394¾) Late para dirigir a

ex ρressão de	proteínas que codificam	os fragmentos de DNA	inse	ri—
dos num Gnicc	3 sítio de BamHI» A util	ização dos processos	de	DNA
rec om bi n ante	que utlizam um DNA do	vírus de papiloma c	;omo	um

-J vector para a replicação e expressão de genes exógenos em células eucariótas é uma prática convencional como se pode observar a partir da Patente dos E.U.A» 4 419 446Para a expressão do cDNA de LAO ₅ o pMON'1123 foi digerido com BamHI e as extremidades 5' pendentes foram preenchidas com fragmento Klenow, (Boehringer Mannheim» Indianapolis, IN) e desoxinucleótídos (dNTPs). Similarmente_η o uDNA de LAO tqi isuiadu cuiso o iraqmento EuuKI e extremidades foram tornada·?

-snc hxfnsn ~*~o com

Klenow. 0 fragmento de LACI foi ligado no pMuNíl23 para dar o plasmídeo pNON145ó. As· células cl27 de ratinho foram deixadas utsscsr e co—transTectaoas com priuNiéSõ e p8Vneo peio procedimen— Ramabhadran st al., Proc. Natl»

L>

w como previamente assento por Acad. Sei. USA 91, 670í C1984>» biótico G418 ((ieneticina 1 as colónias resistentes foram repica

A seguir à selecção com o ant cada cavidade foram então ensaiados ρ ?x pressão do LAd rsuoaiDiiiauts (rL.HUI) por um ensaio Qh xtuunossorçãu con* enzima ligado CtLIÍíA/» Um clone, 1453—15, que expressa aproximadamente 1 a 2 p.g de LftCI/10'^J células/24 h, foi expandido para isolamento do rLttCl„

A linha, de células produtoras de rLACI 1455-15 toí cultivada em Meio ds Eagle Modificado por Dulbecco contendo soro de feto de bovino a ÍOX., frascos de Xbí? cm

rélulas foram deixadas crescer em •LU! i f lufei IC J.!

usoa ents.c tripsinizado e utilizado para semear um tubo ds ensaio de 850 ω*”. Após confluência_? as células· de cada tubo de ensaio ’ 5. (Ti

utilizadas para semear uma cultura de cm~ 5 tílBLO Laboratories_g Grsnd Island, NY ) » Ao chegarem fluência, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato e incubadas num meio livre de soro consistindo em Meio de Espie Modificado por Dulbecco, suplementado com 0,2 p.g/ml de menadiona, 2,5 mmole/1 de butirato de sódio e 50 U/ml de aprotinina, 0 meio condicionado livre de soro foi recolhido de 2 em 2 dias e substituído com meio fresco» células de 10 câmaras (6000 “CTí~ meio condicionado livre de soro foi ajustado a (NH,,) -₌S0,, 5© mM, filtrado através de um filtro ds 0,2 μ e concentrado 30 vezes utilizando um concentrador de carga radial Amicon YM30, 0 concentrado foi submetido a precipitação com sulfato de amónio» As proteínas precipitadas entre 23-80% de saturação de sulfato de amónio foram recolhidas e dialisadas contra solução niR= 0 detergente salina tamponada com fosfato contendo Na„SO_á i

Triton Χ-1Θ0 foi adicionado a. uma concentração final de 0,05% e a solução foi clarificada por centrifugação a 40000 x g durante i h„ 0 sobrenadante foi cromatografado numa coluna de anidrotripsi— na-Sepharose 48 CÍ2 ml de gel, preparado de acordo com o processo descrito na ref» 17) equilibrada em solução salina tamponada com fosfato contendo Na^SCç. 20 mM, Triton X-100 a 0,05% (tampão A), A coluna foi lavada com 80 ml de tampão A e 80 ml do mesmo tampão sem Triton X-Í00» A proteína ligada foi eluída com NaSCN 1,5 M em três volumes de col urna» A proteína eluída foi concentrada e dialisada contra uma solução contendo NaCl 0,15 M e Ma.__tSO. 20 mM» -d 4·

A recuperação do L.AC1 i Ui US erca de

A coiuna de

anidrotripsina-Sepharose 4B preparada, recenteroents, tinha uma capacidade de cerca de mg de LACI/rol de qel = Após várias utilizações, a capacidade diminuiu para cerca de 0,2 mg/ml de gel. A electroforese em qel de dodecilsulfato de sódio—poliacril— amida (SDS-PAGE) da proteína eluída mostra uma banda maior de

M 3800® correspondente ao LACI coro vestígios- ds contaminantes de r ' elevado oes-o molecular. Os contaminam tes foram removidos- por adsorção com fenil-Sepharose 4B«

Caracterização do rLACI Purificado

A proteína isolada e u LACI substauuiaimísrnte puro peloscritérios- seguinte

SDS-PAGE mostra, nc ial men te, uma.

banda simples.; (b) a análise de aminoâcidos e a sequenciação da proteína equipara, a composição e sequência derivadas da sequência de cuNA de LACI; e (c) a estequioroetrxa da inibição do factor X__t num ensaio de substrato amidolítico ê de aproximadamente Isl (ver abaixo).

A concentração de LACI foi quantificada po? aminoâcidos. A concentração de sítio activo do fa.c medida por titulação com p'-guanidinobenzoato ds p-nitrofenilo de acoroo com Lna.se e Shaw κ .t&} A accividade aroioolítica do Tsctor X e a actividade anti-factor X_ de LACI foram determinadas como •~*· ol se seques Dez μΐ de factor X_ de bovino (0,0S4 emole de molécula activa) foram misturados com 10 μΐ de tampão TBB (solução análise v

de foi sã Λ IHo.

sali tamponada com íris contendo 5 mg/ml de albumina de soro de bovino e mg/ml de qama. qlobulma de bovino) ou ÍO p.l de LACI apro— priadamente diluído em tampão TBB numa cuvste removível durante 5 min a temperatura ambiente. Após adição ds 0,22 ml ds um tampão =nsaio CTRIS/HC1 0,1 M= pH 8,4, Triton Χ-1ΘΘ a 0, τ ft

de Spectrozyme X_ <12,5 mM), a velocidade da mudança de absorvãncia a 405 nm foi medida a 37°C» 0 controlo deu uma mudança de absorvância ds 0,0233 por min por 0,1 pmole de factor X_ activo a cd.

405 nm. Na mistura reaccional contendo LACI, a actividade anti-X

a.

foi calculada com base no decréscimo da actividade do factor X„ cafiiparads com a tío controlo. Utilizando os ensaios descritos acima, 2,6 ng ds LACI purificado (baseado na análise da aminoácidos; equivalente a 0,068 pmole assumindo que M = 38000) mostraram inibir 0,066 pmole de factor X„. Assim, a estequiometria da interseção entre o LACI e o factor X parece ser ísí»

Tempo Parcial de Tromboplastina Activada (APTi)

reagente de cefaloplastina activado de Dade foi utilizado para determinar o APTT do plasma utilizando um instrumento temporizador de coagulação Fibrometer. Noventa μΐ de plasma foram misturados com 10 p.X de polissacârido sulfatado ou tampão de controlo e 100 μΐ de reagente ds cefaloplastina activada durante, exactamente, 2 min a 37*0« Uma solução de cálcio (10© ul de CaCl_? 25 mM) foi adicionada à mistura e foi registado o tempo ds coagulação. 0 ensaio foi observado durante 1 hora. Por razões práticas, o plasma é referido, arbitrariamente, como “completamente anticoagulsdo quando a coagulação não ocorre em 1 h.

IefflgQ-áe-E^ptr.ombijiia........(PT).

A tromboplastina do cérebro de coelho C>F« Drtho Diagnostic) foi diluída a is 10, IsiOO, 1;100© ou 1:10000 numa solução salina contendo 1 mg/ml de albumina de soro de bovino para a determinação de PT. Cem μΐ de plasma foram misturados com 10 p.l de tampão ds controlo, solução de LACI ou solução de

polissacárido sulfatada e 90 μΐ ds um TF diluido na cavidade

?· Α ν'

Fibromater a 37°C durante 2 min» Foram adicionados cem ul de

CaCl_ 25 mM a foi determinado trações dos

uhd í_(Zí-í?.Ç|LX 1 -5ttj.-zd.L_5 _

LAUl referem-se às ;-u i τ a έ a o o s quantidades destes compostos por ml de plasma não diluído (não íção d media ds 2—8 determinações dependendo da duração do tempo de cusyuid^tiUa uuando o tempo os coagulação toí curto -.·--. seg?,

-as variações entre as determinações foram pequenas e foram feitos 2-3 ensaios e determinada? a? média para cada? ponto de dados» Quando o tempo de coagulação foi lonqo O 100 seq) e as variações foram maiores devido à utilização do TF diluído ou de concentraíolissacáridos sulfatados, foram feitas poi issacáridos concentração da mistura final)» Os PTs aqui registados são a ções elevadas ds LACI 4-8 determinações e i determinada a média para cada ponto ds

-dados» Q ensaio foi observado durante 1 hora» 0 plasma é referido como uDisp 1 et amei i te anficoagu i acio¹ eai 1 ha quando a cuaqulc^çãij não umo e

Rn Li-suro? antí-LHir

Iq Sapharose

Dois coelhos brancos New Zesland foi» cada um, imunizada por injecção intradérmica com um homogeneizado contendo 1 ml de adjuvante completo de Freund e 1 ml de LACI purificado C20@ pg de proteína LACI). Um ms's mais farde os coelhos foram reforçados com um homogeneizado contendo í ml de adjuvante incompleto de Freund e 1 ml do LACI purificado Ci@0 pg de proteína LACI)» Em seguida, o anfi—soro foi recolhido seraanalmsnte. A injeccSo de após três meses» A anti—LACI—Iq foi isolada a partir do anti—soro íor cromatograf ia em coluna ds pi sspnarose 4.tí= A an .ACI-Ig isolada foi acoplada a Sephaross 4B activada por brometí ds cianogénio a uma concentração de 10 mg de Ig/ml de gel pel<

procedimento recomendado por Pharmacia»

C¹

Preparação -de ί .Tijr.jYj-· Isento de LACI

O plasma congelado reunido (iôô ml> foi descongelado e passado 5 vezes através de uma coluna de anti—LACI—Ig Sepharose 4B (3 ml de gel contendo »„13· mg de Ig ligada) para eliminar o antigénio de LACI endógeno» 0 plasma imunoadsorvido foi essencial* mente eliminado de LACI endó-qeno uma vez que um imunoensaio (sensibilidade de U nq/ml) não detectou qualquer antigénio de

PFSULTADOS

Lfeito da Heparina na Coagulação Xntrínseca

No ensaio do ΑΡΙ í , as proteínas da fase de contacto activadas o gue conduz ao início da cascata ;eca. « τ *qura mostra o efeito da. heparina no APl I do plasma normal e do mesmo plasma isento do LACI endógeno» Foi observado um prolongamento moderado do tempo de coagulação (até 5 vezes) às concentrações de heparxna ds 0 a 0,0 unidades/mi de plasma» A 0»tí unidades de heparina/ml, o plasma permaneceu nao coagulado durante mais do que í hora carbitrariamente definido como “completamente anticoaqulado>= Não houve qualquer diferença significativa no APTT d-α plasma normal e tío plasma isento de LACI, sugerindo que o LACI plasmàtico endógeno não- desempenha um papel significativa na regulação da coagulação intrínseca na ou ausência de henarína. = presença

Ο Papel do LACI Plasmático endógeno na Kequlação de Coagulação

Os plasmas normais foram prê-incubados com anti—LACI-Ig ou Ig normal ds coelho e foram medidos os seus PTs para determinar o papel do LACI plasmático endógeno na regulação da coagulação extrínseca» Como mostrado na Tabela í, os PTs foram mais curtos para o plasma tratado com anti—LACI—Ig do que com o Ig normal» Contudo, as diferenças entre o { po e o controlo foram pequenas a diluicí

,sma	tratado	com antico?—
• QE	TF de Is	í 0 , 1510© e
ada	nos PTs	a u x i u xso
- seme 1 h-an tes	u t x 1 i z an d o

plasma não tratado e plasma isento de LACI endógeno por imuno™ adsorção com anti—LACI—Ig Sepharose 4Eí» Estes resultados sugerem que a capacidade e/ou a habilidade do LACI endógeno para inibir a coagulação induzida pelo TF é bastante pequena nestas condições»

Efeito da !

Heparina na Coagulação hxtrínseca plasma isento

LJ concentrações de TF» do a diluição de TF feito da heparina nos PTs do plasma normal © do mesmo utilizando várias os resultados utilizan—

A Tigura moscr say par isento de LACI <?>, concentrações aumentadas ds heparina (0-0,6 unidades/ml de plasma) prolongam progressivamente o PT de ama forma essscia1mente linear» No plasma contendo ^s—lmCí snuogsno \o/ a resposta da heparxna tox sxomoidal» A 0, í—fcí = ií unidades de heparina/ml de plasma, o PT foi o mesmo ou marginalmente maior do gue aquele no plasma isento de LACI» A @,3 e 0,4 unidades de heparina/ml de plasma, os PTs foram 1,5 e 2,ó= vezesmaiores do que aqueles no plasma isento de LACI» A 0,5 unidades heparina)» No plasma de he pariπ a/m1 a n t i c oa d u 1 ad o^:í» ρ χ asma _s

olasma tornou—se completamente

l· igura	Lí C B) ítíuzç- L· -s	□	resultado	utilizando <
TF de IsíOT	(PT=4 í seg	p>3 Γ~ ·?.	o contra	do sem hep.
sma isento de	LACI <?), o	PT	é também	1 inearmen te
í o aumento de	concentração	de	hepa rιπa	mas requer <

vezes maiut ©s concentrações de heparina pafa realizesr ο·=- ίη·.·=;·--πυ_·=ι PTs como aqueles na Figura 2 CA>. No plasma contendo LACI endógeno (o) a resposta da heparina foi também sigmoidal, mas a concentração Ithreshold) limiar de heparina requerida para realizar o estado completamente anticoagulado ocorreu a uma concentração maior do que 1,5 unidades de heparina/ml de plasma.

diluição de TF ds l:í© CF'i~24 a Usu Les-Le similar utilizando > seg para o controlo sem heparina)

No plasma isento de LACI (7), os prolongamentos induzidos por heparina de PT foram muito menos do que aqueles na Figura 2 CA) e (»>. No plasma contendo LACI, o PT seg para 4 unidades/ml de plasma» persiansceu menos do qu“

Us resultados acima Lumados em cunjunto sugeres» que podem estar envolvidos vários mecanismos na regulação da coaqulsçao BxtrinsscSn Primeiro, a nepsrinâ pode prolongar, moderadsmen— te, a coagulação induzida pelo TF n-a ausência de LACI endógeno, segundo, o LACI plasmático endógeno possui um efeito de anticoagu1-ação fraco contra a coagulação induzida pelo TF na ausência de nep-cu ina, ^:_.er Ceir o, pat a la de uma cei· ua. concentração limite, a heparina aumenta dramaticamente a inibição da coagulação induzida pelo FF na presença de LACI plasmático, sugerindo que o LACI serve de co—factor para a heparina na reaccão inibidora.

L>

efeito do LfiCi exoqenamente adicionada no PT de plasma normal

Os testes descritos -acima estão restringidos ao plasma contendo ou isentos de LACI endoqeno. Os resultados sugerem gus o

LACI índógeno pode desempenhar um papel importante na inibição da coagulação induzida pelo sF quando a quantidade de jquado quando a quantidade de TF .rH «-K

X -=X <san«À G Λ U U Gf

e pequena, ias q r a n d e» P a r a	s pooe alargar
LACI endógeno	2Z1 *5
normal para o	™-í3Ll £?*f:
do um grande	xnlerva
çSes de TF a	i«1
1inearmente ã	concen

o a condiçoes onoe o ^adequado, tui adicionado LAl-I wxógeiio ao piasuis

Figura 3 CA) mostra que utilizan™

A concentração do LACI requerida com o aumento da concentração de ? e í s í ) _? os PTs estão f «1 acionados io LACI exógeno adicionado ao plasma.

para prolongação do PT aumenta

FF utilizado e ire fiecee-se no declive das curvas de resposta de concentração de PT~LAul uma conuBiitração elevada de Tb utilizado (diluição de TF a Isíts) a curva de resposta de concentração de PT-LACI não é linear como mostrado na Figura 3 <B).

Acção Anticoaqulante Sínerqística d?

testes acima demonstram que a adição ds hsparina ou de LAC extensão da potsnciaç<

do com hsparina, LACI

roduz inibi ção da	coagulação
£35 s S— j ί 5 j·*** jçj 235 j	Adicional-
ar a inibição da.	'coagulação
(Figura 2). Para qi	xantifiçar a
isento de LACI foi	suplementa-
uma comomação de	cãíF» l/gíS
q u 1 a n t e s. F i q u r a 4	CA) mostra

ο relacionamento do PT com as concentrações de LACI e heparina. exogenamente adicionados, A prolongação do PT com concentrações aumentadas de heparina (?) ou. LACI Co) sozinhos, e linear. Quando a heparina e o LACI estão,, simultaneamente» presentes no plasma (?) , o efeito total no tempo de coagulação varia com a concentração dos compostos utilizados, A baixas concentrações (por exemplo,. < 0,2 unidades de heparina/ml mais < 1 pç de LACI/ml 5, o tempo de coagulação não se desvia significativamente daquele esperado para os componentes individuais» A concentrações elevadas (maiores do que ®,3 unidades ds heparina/ml mais 1,5 ug de LACX/ml) o tempo de coagulação desvia—se de modo crescente daqueles esperados dos componentes individuais s o efeito de potenciação torna-se aparente. Por exemplo, 0,5 unidades de heparina/ml mais 2,5 μΐ ds

LACI/ml têm um PT de ? 1000 seq» enquanto que unidade de heparina/ml ou 5 pg de LACI/ml têm PTs de menos de 200 seg»

As interseções das drogas pode ser analisada, farmacologicamente, pelo processo (curva isosficaz) isobolar utilizando a. rabela de interaeção como um critério para diferencia interaeção nula, sinergismo ou antagonismo (18), A tabela interseção de droga è definido como da/Da + db/Dfa, onde da e são concentrações de A e B na combinação, respectivamente, e Da e Db são as concentrações de A e B, separadamente, que são isoeíica zes com a combinação» 0 valor da tabela de interaeções reflecte o

Ca de db

*. .-4.<1 indica sinerqismo; e um valor >1 mostra antaaonisisc. Com base no

Fiqura 4 c on c en trações xsoel :azes dos compostos listo e, LhL-I, heparina separadamente e suas combinações que dão os mesmos tempos tíe coagulação) podem ser obtidos para o cálculo das tabelas de interaeção» Fiqura 4 (B) mostra a xnteracçao como uma função do tempo de coaqulação» 0 tabela de

resu 1 tad o mos tra c 1 arassen t ε (tabe1a ds i nteracç So <1) devido à utilização combina e heparina#

A Heparina intensifica si Ir uma sinergia aumentada ou potenciação com aumento do tempo de coagulação ada de aumento de concentração de LACI f Xí :ão da Coagulação Induzida peio TF por LACI

Ds caicuxar potência reaativa

LALi

ausência a na presersça de hepar isento de LACI com várias cone foram determinados os seus PTs, função da concentração ds LACI presença de 0,5 <?}₅ 1,0 C?) e 5

-ina, foi suplementado um plasma :entraçoes de LACI e heparina s , Figura 5 mostra o PT como uma na ausência de heparina Cx), na í,0 (?) unidades de heparina/m1 de ρ1asma, respectivamsnte. potência, então a potêní relativa de LAcl aumenta 3,4, 8,5 e plasma, respectívamente, além disso BKogenamsnte adicionada» nidades de heparina/ml ds na. ausência de heparina

Lfeifces dos Polissacárid>;

1-· — F*í T -1... r« T __ ..

ulfaiados s suas Combinações com LACJ

Tendo em vista a capacidade da nepanna na mioiçao coagulação induzida pelo TF de uma independente, foram também testados outros poiissacáridos sulfatados quanto ao seu efeito anticoagulante, Figura b mostra o efeito de vários poiissacáridos sulfatados no PT de plasma siian t- x ra L AC I —d epei d «n t<= normal, lodos os compostos teprolongar o tempo de coagulação várias concentrações» Por peso tadí ffiSí aí s exibiram a capacidade de este efeito foi observado a potências relativas destes compostos estão pela

mo1ecular C baixo peso sulfato de

Har a examinar

M = 5100) r molecular dermatano

seguinte ordems heparin > beparina não fraccion

H = 57 00) ’> oo l i ss í 1 f a r - · - - >

sulfato de dextrano > su de to de 1 fato baixo peso beparina de pentosano .·’* de hepa.ra.no» estes compostos também putenciam a actividade anticoagulante LACI—dependente, foram realis àqueles- descritos na Figura 4 (A)» Figuras efeito de LACI, políssacáridos sulfatados e PT de plasma normal» Todos os compostos te inibição da coagulação induzida pelo TF por çoksí muito diferentes» As concentrações sulfatados que potenciaram a actividade de itavam num intervalo similar .quele :Iliz potências relativas estão por peso n a d cs testes siuiil-sres 7 CA)-(F) mostram o suas combinações no stados potenciaram a

LACI, mas a concentrados po iissacáridos ’ anticoagulação LACI ado na rioura á e as ordem como acima»

ί

Tabela í: Efeito do Anti-LACI-Ig no tempo ds protrombina de um plasma normal»

Temno ds Protrombina Cseq) iluição pelo TF j —

Plasma + Ig” de coelho normal

Plasma + Anti, - - d •-LAUI — i Q

; 1® s 100 1 5 i®0€?

1;1000® o — 1 ώ» .· ς λ.

44,6

86,1 ~rcr cr

Os

b.

tempo de protrombina foi ensaiado como descrito em PROCESSOS» valores são médias de dois determinantes»

TF foi diluído em série numa solução salina contendo 1 mg/ml de albumina de soro de bovino»

Um plasma normal (1,95 ml) foi misturado com 0,5 ml ds Ig ds coelho normal (1,6 mg/ml) e incubado a 4° durante 3 h. antes do ensaio» ³“ 0 mesmo gue em c» com a excepção de que o anti—LACI—Ig foi utilizado em vez do Iq de coelho normal»

A combinação antícoagulante de LACI e polissacárido sulfatado pode ser utilizada para inibir quer a via intrínseca quer a via extrínseca de coagulação por administração -adequada a —-· tal como, por exemplo, como pode ser necessário para a. coaqulacão intravascular disseminada» A quantidade da combinação gue seria administrada, normalmente, é principalmente dependente das caracteristicas físicas do mamífero e da gravidade da condicão ,im mamífero de sangue quente em necessidade de tal tratamerr ps-tológío;

A quantidade deve >-.$=& r

que uma. quantidade que é med icamente benéfica para, inibir a coagulação, mas que não apresente efeitos tóxicos que se sobreponham às vantagens que acompanham a sua. utilização. A via. de administração preferida é a oral ou a parentérica. έ ilustrativa a administração da. combinação em solução com os diluentes e veículos convencionais, por exemplo, solução salina. Outras formulações adequadas da combinação activa em diluentes e veículos farmaosutícamen— te aceitáveis em dosagem terapêutica podem ser preparadas por referência aos testos gerais no campo farmacêutico tal como, por exemplo, Rsminqton's Pharmaceutical Sciences. -Etí. Arthur Osol, íóã ed., 198®, Mack Puhlishinq Co. , Easton, Pennsvlvania.

Vários uuurotj bfXt—mpjLOs seráu apart?**ues aqueles peritos na arfe, após leitura da presente descrição, sem sairem do espirito e âmbito do invento. Pretende—se que todos os outros exemplos sejam incluídos no âmbito das reivindicações- apensas.

Claims (5)

1. ís„ - Método para a inibição da coagulação do sangue num mamífero de sangue quente, caracterizado por compreender a administração ao referido mamífera de uma quantidade de anticoagulante sinérgics eficaz de inibidor de coagulação associado a lipoprotsína e de um polissacárido sulfatado anticoagulanter.
2. 2â. - processo tíe acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfatado ser seleccionado a partir do grupo consistindo em heparina, polissulfato de pentosano. sulfato de dermatano, sulfato de dextrano e sulfato de heparano.
3. 3ã» - Processo de acordo con? a reivindicação 1, caracterizado por compreender a administração de cerca de 0₅í a cerca de
4. 4 unidades de heparina e de cerca de 0,1 pg a cerca de 5 pg de LACI por ml de plasma tratado»

   42* - Processo para a preparação de uma composição, caracterizado por s© incluir na referida composição um inibidor de coagulação associado a lipoproteína e um polissacárido sulfatado anticoagulante em proporções que proporcionem um efeito de anticoagulação sinérgica após ad/uinistração a um mamífero de sangue quen te.
5. 5s» - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o polissacárido sulfatado ser seleccionado a partir do grupo consistindo em heparina, polissulfato de pentosano, sulfato de dermatano, sulfato de dextrano e sulfato de heparano» i i uc acor oc ί_ϊ„ϊϊίΐ a rsivijidicsi.^Q 4, carets.

   tsrizado por o inibidor de coagulação associado a lipoprol a heparina estarem em proporções de cerca de Θ,1 a cerca ds unidades ds heparina com de cerca de 0,1 p.g a cerca de 5 yq inibidor de coagulação associado a 1ipoproteína.