DK164282B - Biologisk aktive fragmenter af human antihaemofilisk faktor viii:c, anvendelse af fragmenterne og fremgangsmaade til fremstilling af dem - Google Patents
Biologisk aktive fragmenter af human antihaemofilisk faktor viii:c, anvendelse af fragmenterne og fremgangsmaade til fremstilling af dem Download PDFInfo
- Publication number
- DK164282B DK164282B DK085786A DK85786A DK164282B DK 164282 B DK164282 B DK 164282B DK 085786 A DK085786 A DK 085786A DK 85786 A DK85786 A DK 85786A DK 164282 B DK164282 B DK 164282B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- thr
- arg
- factor viii
- tyr
- daltons
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- E—FIXED CONSTRUCTIONS
- E02—HYDRAULIC ENGINEERING; FOUNDATIONS; SOIL SHIFTING
- E02D—FOUNDATIONS; EXCAVATIONS; EMBANKMENTS; UNDERGROUND OR UNDERWATER STRUCTURES
- E02D31/00—Protective arrangements for foundations or foundation structures; Ground foundation measures for protecting the soil or the subsoil water, e.g. preventing or counteracting oil pollution
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/829—Blood
- Y10S530/83—Plasma; serum
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/10—Factor VIII, AHF; related peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Structural Engineering (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Civil Engineering (AREA)
- Paleontology (AREA)
- Mining & Mineral Resources (AREA)
- Hydrology & Water Resources (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
m
DK 164282 B
é
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte, biologisk aktive fragmenter af den humane antihæmofiliske faktor VIII:C, anvendelse af fragmenterne og en fremgangsmåde til fremstilling af dem.
5 Fragmenterne er ifølge opfindelsen ejendommelige ved det i krav 1-6' kendetegnende del angivne og vil blive forklaret nærmere senere i beskrivelsen.
Hæmofili er en arvelig sygdom som har været kendt 1 århundrede, men det er kun inden for de .sidste 3 tiår at 10 det er blevet muligt at skelne mellem de forskellige for mer: hæmofili A, hæmofili B og hæmofili C. Hæmofili A er den hyppigste og angriber kun mænd, i en hyppighed på 1- 2 individer pr. 10.000 mænd. Sygdommen forårsages af stærkt nedsat mængde af eller fravær af den biologisk ak- **5 tive koagulationsfaktor VIII:C eller, som den også er blevet kaldt, antihæmofilifaktoren. Faktor VIII:C er et protein som normalt er til stede i plasma. Det kliniske udtryk for haemofi-li A er en stærk tendens til blødning, og før man begyndte behandlingen med koncentrater af faktor VIII:C var den gennemsnitlige alder for døden hos patienter med hæmofili under 20 år. Koncentrater af faktor VIII:C opnået fra plasma har været til rådighed til behandling af hæmofili A i omkring tyve år. Dette har forbedret situationen for hæ-mofilipatienter væsentligt og givet de fleste af dem mu-25 lighed for at leve et normalt liv. Der er imidlertid visse pro blemer knyttet til koncentraterne og anvendelsen deraf.
De koncentrater der for tiden er til rådighed er nemlig u-rene, med en specifik aktivitet på under 2 enheder faktor VIII:C/mg : protein og indeholdende < 1% faktor VIII-pro-3^ tein og er desuden ganske dyre fordi udgangsmaterialet, plasma, er dyrt og ved de anvendte rensningsprocesser giver lave udbytter af produkter med lav renhed. Der er også risiko for overførsel af hepatitis B-virus og andre infektioner. Desuden udvikler ca. en tiendedel af pati-enterne med alvorlig hæmofili A antistoffer mod faktor VIII:C og det bliver derfor meget vanskeligt at behandle dem ef 2 i
DK 164282 B
tersom den injicerede faktor VIII:C neutraliseres og inhi-beres af antistofferne.
Der er behov for højrensede præparater indeholdende faktor VIII:C. Nærværende beskrivelse beskriver sådanne høj-5 rensede præparater. Ved opfindelsen er der også tilveje bragt nye, definerede fragmenter af faktor VIII:C, der har forbedrede egenskaber i forhold til eksisterende præparater deraf, navnlig højere specifik aktivitet og længere halveringstid i blod. Klinisk anvendelse af ren-10 sede, biologisk aktive fragmenter af faktor VIII:c kan med føre visse fordele i sammenligning med de for tiden anvendte koncentrater af denne. Den høje rensningsgrad er en fordel eftersom der dermed indgives meget små mængder forureningsproteiner til patienten, og desuden er ri-sikoen for overførsel af hepatitis B stærkt nedsat. En længere halveringstid er en stor fordel eftersom der opnås forlænget virkning og der dermed behøves indgift af mindre mængder. For hæmofili A-patienter, der udvikler eller har risiko for at udvikle antistoffer mod faktor VIII;c, er 20 det sandsynligvis en fordel at indgive en mindre del af dennes ' molekyle, eftersom det er sandsynligt at det ville være mindre udfordrende for immumsystemet. Som det fornyeligt er rapporteret (J. Gitschier et al., Nature 312, 330-337, 1984; J. Toole et al., Nature 312, 342-347, 25 1984) kan intakt faktor VIII:C fremstilles i cellekultur under udnyttelse af rekombinant-DNA-teknikker. En yderligere fordel ved aktive fragmenter af faktor VIII:C er, at sådanne fragmenter sandsynligvis kan fremstilles lettere og mere effektivt ved rekombinant-DNA-cellekultur-20 teknik end hele faktor VIII:Crmolekylet,· da disse'frag menter er mindre og derfor kan anses for at være særligt fordelagtigt at fremstille ved denne teknik.
Der har været gjort mange forsøg på at rense human faktorVIII: C. Hidtil er det imidlertid ikke lykkedes nogen 55 at isolere en defineret enkelt proteinkomponent med faktor VIII:C-aktivitet. Der har været anvendt kommercielle koncentrater som udgangsmateriale, hvor faktor 3
DK 164282 B
VIII:C er til stede som et kompleks med et andet protein, nemlig von Willebrand-faktor. De anvendte teknikker som har ført til frembringelse af de reneste produkter af faktor VIII er immunoadsorbent-kromatografering med matrix-5 bundne antistoffer mod von Willebrands faktor, kombineret med kromatografering på aminohexyl-agarose {C.A. Fulcher og T.S. Zimmerman, Proc. Natl. Acad. Sci. T9_, 1648-1652, 1982; T.S. Zimmerman og C.A. Fulcher, EP patentbeskrivelse nr. 0123945 af 1984) og kromatografering på agarose i 10 nærværelse af CaCl2 til adskillelse af faktor VIII fra von Willebrands faktor, kombineret med kromatografering på QAE-cellulose (P.J. Fay et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
79, 7200-7204, 1982; S.I. Chavin og P.J. Fay, EP patentskrift nr. 0104356, 1984). Fulcher og Zimmerman fandt et 15 faktor VIII-materiale med en specifik aktivitet på 2.294 enheder/mg, der indeholdt et antal komponenter som påvist ved elektroforese på natriumdodecylsulfatpolyakrylamid. Hovedparten og de mest dominante af komponenterne havde molekylvægte under 92.000 daltons. Deres data viste imid-20 lertid ikke hvilke peptider af hvilken kombination af pep tider som var nødvendig for aktiviteten. Fay et al. beskrev et faktor VIII:C-produkt med specifik aktivitet 4.900 enheder/mg samt at materialet vandrede som en enkelt hovedkomponent på 100.000 daltons ved natriumdodecylsul-25 fatpolyakrylamid-elektroforese i reducerende medier. Der konstateredes imidlertid også svagere bånd ved >220.000 daltons. De forskellige resultater der opnåedes af forskellige grupper viser den store usikkerhed med hensyn til den biokemiske karakter af faktor VIII:C. Fornylig er men-30 neskets gen for faktor VIII:C karakteriseret, og human fak tor Vni:C-akt£vitet er blevet udtrykt (expressed) ved kom-binant-DNA-teknik (J. Gitschier et al., Nature 312, 330-337, 1984; J. Toole et al.. Nature 312, 337-347, 1984).
Data for nukleotidsekvensen i genet viser>at den intakte 35 faktor VIII:C har en molekylvægt på ca. 300.000 daltons.
4
DK 164282B
I en artikel, "Structure of human factor VIII" af Vehar et al- i Nature, bind 312 (1947), side 337-342, beskrives der tryptiske fragmenter med molekylvægte på 240, 220, 210, 170, 150, 120, 100, 80 og 70 kD. Intet 5 i artiklen antyder imidlertid forekomst af et kompleks af to peptidkæder, og som det vil forstås af den følgende nærmere beskrivelse af de foreliggende fragmenter af faktor VIII:C består de netop af hver to peptidkæder.
I en artikel af G. Kuo et al., "Studies of 10 the molecular structure of human factor VIII:C", i
Thrombosis and Hemostasis, bind 50 (1983), side 162, er der nævnt nogle proteinfragmenter af faktor VIII:C, bl.a. et med en molekylvægt på 240 kD, men heller ikke her er der nævnt noget fragment, der består af et kompleks af 15 to peptidkæder.
De biologisk aktive fragmenter af faktor VIII:C ifølge den foreliggende opfindelse afviger således væsentligt fra kendt teknik, idet det overraskende har vist sig at et kompleks af to peptidkæder er nødvendigt 20 for at opnå faktor VIII-C-aktivitet.
I den følgende del af beskrivelsen bruges der en række forkortelser, produktbetegnelser og prøvemetoder. Nedenstående liste viser disse betegnelser og giver forklaring derpå: 25 1 35
DK 164282 B
5
Forkortelser^
Diisopropylfluorfosfat - DFP Ætylendinitrotetraeddikesyre - EDTA Faktor VIII-koaguleringsaktivitet - VIII:C 5 Faktor VIII-koaguleringsantigen - VIII;C-ag Faktor VIII-beslægtet antigen - VIIIRsAg Højt ydende væskekromatografering - HPLC
Natriumdodecylsulfatpolyakrylamid-elektroforese - SDS-PAGE Trikloreddikesyre - TCA
10
Produktbetegnelser: "Mono'® Q gel - anionbytter fra Pharmacia bestående af en hydrofil polymer med de ioniske grupper - CHoN+(CH,)0 i§) ^ 3 0 "Octonativ,kiy - et kommercielt faktor VIII :C-koncentrat med 15 høj renhed fra KabiVitrum AB, fremstillet ud fra et kryo-precipitat ved affinitetskromatografering "TSK DEAE" 5 PW - anionbytter fra Toyosoda, bestående af en hydrofil polymer med ioniske grupper C^CH-jN (OF^CH^^ "TSK 4000 SW" - en silikabaseret gel med hydrofil over- 20 flade funktionalitet af OH-grupper, til størrelsesudluk-kelseskromatografering, fra Toyosoda.
Prøver:
Koagulerende virkning af faktor VIII:C: 25
Den koagulerende aktivitet af faktor VIII:C blev som regel målt ved en et-trins blodstørkningsbestemmelse (M. Mikaelsson og U. Oswaldsson, Standardization of VIII:C assays: A manufacturer's view; i: Factor VIII concentrates and their clotting activity. I.M. Nilsson, T.W. Barrowclif- 30 fe and K. Schimpf (red.), Scand.J.Haematol.Suppl. 33, 79-86, 1984). Som substratplasma brugtes der et kunstigt FVIII:C deficient reagens (D. Nyman, Thromb.Diath.Haemorrh.
23, 306-311, 1979). Prøven og kalciumkloridopløsning sættes samtidig til en i forvejen inkuberet blanding af VIII:C 35 deficient plasma, ellaginsyre og fosfolipid. Der brugtes et halvautomatisk koagulometer (LODE) til at bestemme blodstørkningstiden.
DK 164282B
6 VIII:C i plasmaprøver fra hæmofiliske hunde bestemtes ved en kromogenisk metode for VIII:C, beskrevet af S. Rosén, U. Oswaldsson, M. Blombåck, M. Larrieu, I.M. Nilsson og H. Vinazzer, Scand. J. Haematol, 331, suppl.
5 40, 139-145, 1984.
Faktor VIII:C-koagulerende antigen:
Det faktor-koagulerende antigen (VIIICiAg) bestemtes ved en fast fase - immunoradiometrisk bestemmelsesmetode (L.
10 Holmberg, L. Borge, R. Ljung og I.M. Nilsson, Scand. J. Haematol, 23^, 17-24, 1979). Antistoffet var leveret af professor I.M. Nilsson, Malmø, Sverige.
von Willebrands faktor: 15 von Willebrands faktor eller faktor VIII-beslsgtet antigen (VIIIR:Ag) måltes ved en kvantitativ elektroimmuno-bestemmelse (C.B. Laurell, Scand.J.Clin.Lab.Invest. 29 (suppl. 124), 21-37, 1972). Der brugtes gedeantiserum fra Atlantic-antistoffer. VIIIR:Ag-bestemmelserne blev stan-20 dardiseret mod First British Standard for Blood Coagulation Factor VIII related Antigen Human for Immunoassay (66/ 355).
Natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gelelektroforese: 25 Natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) udførtes i henhold til Laemmli under anvendelse af en sammenhobningsgel (stacking gel) på T=4% (total poly-akrylamidkoncentration) og en adskillelsesgel (separating gel) på T=6% eller 7,5%. I alle tilfælde var tværbindings-30 graden 3,3%. Prøverne behandledes med 5% merkaptoætanol og 2% natriumdodecylsulfat. Elektroforesen skete ved 20 mA i fire timer. Gelerne blev farvet for protein ved hjælp af en sølvfarvningsteknik beskrevet af Tunon og Johansson (U.K. Laemmli, Nature 227, 680685, 1970; P. Tunon 35 og K.E. Johansson, J.Biochem.Biophys. Methods £, 171-179, 1984).
7
DK 164282 B
Proteinbedømmelse:
Proteinet i VIII:C-materialet vundet ved "Mono'^-Q-gel-trinnet blev kvantificeret ved aminosyreanalyse. Hydrolyse med 6N HC1 udførtes i 22 timer ved 110°C i evakuerede 5 glasrør. Hydrolysatet bestemtes med en Beckman ΙΖΙΜ-ana-lysator.
************************
Som nævnt angår opfindelsen også anvendelse af de 1Q omhandlede fragmenter og faktor VIII:C ifølge opfindelsen; denne anvendelse er ejendommelig ved det i krav 8 angivne. Desuden omfatter opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af de omhandlede fragmenter, og denne fremgangsmåde er ifølge opfindelsen ejendommelig ved det i krav 1's 25 kendetegnende del angivne.
Det har ifølge opfindelsen vist sig,at det rensede materiale indeholder flere forskellige peptidkæder som påvist ved SDS-PAGE, de fleste af dem med højere molekylvægt end tidligere rapporteret. Peptiderne er blevet ad-20 skilt, karakteriseret og defineret. De konstaterede data viser,at alle peptiderne er beslægtede med faktor VIII:C og at visse kombinationer af peptider er nødvendige for faktor VIII:C-aktivitet. Disse nye peptider udgør en del af opfindelsen.
25 Som udgangsmateriale for rensningspro ceduren bruges der en opløsning af koncentrat af faktor VIII:C med høj renhed. Et sådant velegnet koncentrat er "octonativ". Det første trin ved rensningen er adsorption af faktor VIII:C -von Willebrands faktor-kompleks, som er 30 til stede i faktorkoncentratet, til en kolonne indehol dende antistoffer mod von Willebrands faktor kovalent koblet til en gelmatrix såsom agarose. Fortrinsvis bruges der polyklonale antistoffer, men der kan også bruges mono-klonale antistoffer. De fleste andre proteiner som er til 35 stede i opløsningen passerer lige akkurat gennem denne kolonne. Faktor VIII dissocieredes derefter fra von Willebrands faktor og elueres af kolonnen ved at man lader en 2+ + opløsning indeholdende Ca eller Na ioner passere gennem
DK 164282 B
8 2+ + kolonnen. Koncentrationen af Ca eller Na ioner vælges på en sådan måde at faktor VIII:C adskiltes fra von Wille-brands faktor og elueres. Egnede koncentrationsområder for Ca2+ er 0,15-1,0 M, fortrinsvis 0,2-0,5 M. Egnede kon-5 centrationscmråder for Na+ er 0,5-2,0 M, hensigtsmæssigt 1,0 M. Det foretrækkes at bruge kalciumioner. Hensigtsmæssigt bruges der CaCl^ eller NaCl. Det eluerede faktor VIII-materiale er meget stærkt renset i sammenligning med udgangsmaterialet, men stadig ikke rent. Den endelige rens-10 ning opnås ved HPLC ved pH 6-8 på en anionbytter adsorbent såsom "Mono'®Q-gel (Pharmacia) eller "TSK DEAE" 5 PW gel (Toyosoda). Faktor VIII-materiale elueres i en natriumklorid- eller kalciumklorid-saltgradient. Dette materiale har en specifik aktivitet på 5.000-9.000 enheder/mg protein, 15 og der er følgelig opnået en 360.000-640.000 ganges rensning fra plasma. Det ved den ovenfor beskrevne rensningsproces vundne materiale indeholdt både intakte og delvis fragmenterede former af faktor VIII.
For at vinde fragmenter af faktor VIII blev det 20 rensede materiale eller det delvis rensede materiale inkuberet med en meget lav koncentration (10 ^-NIH enheder/ enhed faktor VIII) af koagulationsenzymet thrombin, hensigtsmæssigt ved 37°C i 10-300 minutter og fortrinsvis 60-90 minutter. Efter denne behandling viste det meste af 25 faktor VIII-aktiviten sig senere i HPLC-elueringskurven; svarende til hvad der er blevet kaldt den faktor VIII-ak-tive Top II se fig. 3. Analyse af dette materiale ved SDS-PAGE i reducerende medier viste tilstedeværelse af 2 peptidkæder med molekylvægtene 90.000 og 80.000 daltons.
30 Udvikling af fragmenter af faktor VIII kunne også opnås på en simplere, men mindre præcis kontrolleret måde ved, at man lod en opløsning af delvis renset faktor VIII indeholdende tilsat Ca2+ ioner henstå ved 4-37°C i over 1 time og indtil ca. 24 timer. Spormængden af thrombin og 35 muligvis andre tilstedeværende proteaser såsom kallikrein var tilstrækkelige til at bevirke fragmentering under disse betingelser. Fraskillelse af dette materiale ved HPLC på en anionbytter viste to hoved-aktive områder af faktor
DK 164282B
9 VIII/ Top I og II, se fig. 3. Top I var ikke en enkelt top, men indeholdt fire eller fem delvist opløste toppe. Analyse af de forskellige underfraktioner ved SDS-PAGE i reducerende medier, viste at alle indeholdt et peptid med en mole-5 kylvægt på 80.000 dalton og foruden den første frontfraktion et peptid med molekylvægt 180.000 dalton,i front-og midter-fraktioner peptider med molekylvægt 160.000 og 150.000 dalton og i de bageste fraktioner peptider med molekylvægt 130.000 og 115.000 dalton. Yderligere opdeling 10 af komponenter opnåedes ved HPLC-gelfiltrering på "TSK" 4.000 SW af underfraktionerne i Top I. Hovedkomponenterne af de forskellige underfraktioner påvistes alle at have faktor VIII:C-aktivitet.‘ Top Il-materialet indeholdt kun to peptidkæder med molekylvægten 90.000 dalton og 80.000 dal- 15 ton. HPLC-gelfiltrering på "TSK" 4.000 SW af Top I og Ilmateriale i nærværelse af EDTA til binding af metalioner resulterede i aktivitetstab og i adskillelse af peptiderne på 180.000, 160.000, 150.000, 130.000 og 115.000 daltons fra peptidet på 80.000 daltons i Top I, og i disso-20 ciation af peptidet på 90.000 dalton fra peptidet på 80.000 dalton i Top II. Dette viser at faktor VIII-pepti-derne holdes sammen af en eller flere metalionbroer.
En anden metode til udvinding af de nye faktor VIII;C-fragmenter ifølge opfindelsen består i at man adskiller 25 et fragmenteret faktor VIlirC-holdigt materiale ved hjælp af et gelmatrix indeholdende antistoffer mod von Wil-lebrands faktor som beskrevet foran.
I konklusion resulterer fragmentering af faktor VIII ved hjælp af små mængder thrombin eller spormængder af 30 andre proteaser i dannelse af følgende seks aktive nye fragmenter: en sammensat af en peptidkæde på 180.000 dalton og en på 80.000, en sammensat af en peptidkæde på 160.000 dalton og en på 35 80.000, og en sammensat af en peptidkæde på 150.000 dalton og en på 80.000, og en sammensat af en peptidkæde på 130.000 dalton og en Då
DK 164282 B
10 80.000 dalton, og en sammensat af en peptidkæde på 115.000 dalton og en på 80.000 dalton, og en sammensat af en peptidkæde på 90.000 dalton og en på 5 80.000 dalton.
De to nye kæder i de forskellige fragmenter holdes sandsynligvis sammen af metalionbroer. Således omfatter hvert fragment et par på to peptidkæder.
Karakterisering af de forskellige peptidkæder ud-10 førtes ved aminosyreanalyse, bestemmelse af den aminoter-minale aminosyresekvens og immunologiske teknikker. De fundne data viste at peptidkæder på 180.000, 160.000, 150.000, 130.000, 115.000 og 90.000 dalton alle havde samme aminoterminale aminosyresekvens, nemlig Ala-Thr-Arg-Arg-15 Tyr-Tyr-. De i aktive komponenter tilstedeværende peptider på 80.000 dalton viste sig at have samme aminoterminale sekvens, nemlig Glu-Ile-Thr-Arg-Thr-Thr-, så det er det samme peptid i de forskellige komponenter. Dette bekræftedes også af immonulogiske undersøgelser.
20 For at undersøge om de forskellige fragmenter af faktor VIII:C havde antihæmofilisk aktivitet in vivo / blev der udført en række forsøg hvor hæmofili-hunde blev infunderet med de forskellige præparater og den hæmosta-tiske virkning og halveringstiden for den antihæmofiliske 25 aktivitet fulgtes. Det viste sig overraskende at alle fragmenterne havde antihæmofilisk aktivitet in vivo og en halveringstid sammenlignelig med faktor VIII: C,, og for det mindste fragment, materiale fra Top II, var halveringstiden længere. Således kan visse fragmenter af faktor VIII, der 30 indeholder så lidt som totrediedele af det intakte faktor VIII-molekyle, have fuld antihæmofilisk aktivitet in vivo og normal eller endog forlænget halveringstid. Tidligere har det ikke været kendt, at det var muligt at opnå fuld biologisk aktivitet og normal eller forlænget halverings-35 tid i blodkredsløbet med mindre end det fulde faktor VIII:C-molekyle. Det er imidlertid fastslået at der kan optræde aktivering af faktor VIII:C véd at det udsættes for aktiveret faktor X eller thrombin. I modsætning til hvad
DK 164282 B
11 der er tilfældet med fragmenterede faktor VIII: C-molekyler, beskrevet i forbindelse med nærværende opfindelse, har den aktiverede faktor VIII:C meget kort halveringstid, og dens sammensætning kendes endnu ikke med sikkerhed.
5
Eksempel 1
Fremstilling af renset faktor VIII
Et koncentrat af faktor VIII med høj renhed, ,n "octonativ"® (KabiVitrum AB) blev opløst i sterilt vand indeholdende 1 mM DFP. Mængden af opløst "octonativ"^ svarede til 60.600 enheder af faktor VIII-aktivitet. Opløsningen overførtes til en kolonne indeholdende polyklo-nale gedeantistoffer mod von Willebrands faktor, koblet til "Sepharose1® CL-2B gel. Mængden af koblet antistof var ca 6 mg IgG/ml gel. Kolonnen vaskedes derefter med 0,05 M natriumacetat, 0,15 M NaCl, 1 mM DFP puffer pH 7,3 efterfulgt af 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 2 mM CaCl2 puffer pH 7,35 og til slut med 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,1 M 20 CaCl2 puffer pH 7,35. Eluering af faktor VIII udførtes ved anvendelse af en 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl puffer pH 7,35 indeholdende 0,5 M CaCl2. Elueringsdiagrammet er vist i fig. 1. Det faktor VIII-indeholdende eluat blev derefter koncentreret ca. 40 gange i en "Amicon" celle med et 2g "Diaflo" PM 10 membran, og pufferen udskiftedes med en 0,02 M Tris, 0,05 M CaCl0 puffer pH 6,8 ved hjælp af en "Sephadex,My G-25 kolonne. Denne opløsning underkastedes /β\ HPLC under anvendelse af "Mono"^ Q som ionbytteradsorbent. Elueringen udførtes med en saltgradient på 0 til 1,5 M 30 NaCl.
Faktor VIII:C-aktiviteten elueredes sent (Top I position) som én bred top. Tabel I giver en oversigt over rensningsprocessen.
35
DK 164282B
12
Tabel I
Skema over rensning af faktor VIII fra "Octonativ'®
Rensnings- Protein VIII:C VIIIC:Ag VIIIR:Ag VIII;C(IU) VIII:C 5 trin_mg, tot, tot. (IU) tot. (U) tot. (U) protein,mg_udbytte,% "Octanotativ 74.624 60.670 69.426 279.825 1,23 100 anti-vWF- eluat 43,4 24.680 29.311 0 569 41
"Mono,,R-Q
geleluat 1,6 10.391 10.074 0_€-494 17 10
Eksempel 2
Fremstilling af fragmenter af faktor VIII;c
De i eksempel 1 vundne materialer dialyseredes 15 mod 0,02 M Tris, 2 mM CaCl2 puffer pH 6,8 og der tilsatte renset humant thrombin (specifik aktivitet 2.800 en- _3 heder/mg) til en slutkoncentration på 10 NIH-enheder pr. enhed faktor VIII. Efter 60 min. inkubering ved 37°C standsedes reaktionen ved tilsætning af thrombin-inhibitoren I-20 2581, og materialet underkastedes højtryks væskekromatogra- fering på "Mono'^-Q gel under anvendelse af saltgradient-eluering som foran. Nu elueredes hoveddelen af det faktor VIII-aktive materiale senere end det skete før (Top II position). Dette materiales specifikke aktivitet var 7.300 25 enheder/mg protein og SDS-PAGE i nærværelse af merkapto-ætanol viste,at det indeholdt to hovedkomponenter, se fig.
2, en peptidkæde med molekylvægt 90.000 dalton og en med molekylvægt 80.000 dalton. Eluering af materialet fra poly-akrylamidgelerne kunne gennemføres og aminosyresammensæt-30 ningen såvel som den aminoterminale aminosyresekvens i de to peptider blev bestemt. Aminosyresammensætningen er vist i tabel II i eksempel 3. Den aminoterminale aminosyresekvens bestemtes ved hjælp af en gasfase-sekvensbestemmmer. Peptidkæden på 90.000 dalton havde den aminoterminale ami-35 nosyresekvens Ala-Thr-Arg-Arg-Tyr-Tyr-, og peptidkæden på 80.000 dalton Glu-Ile-Thr-Arg-Thr-Thr-.
Faktor VIIl:C-aktiviteten af det materiale der elueredes fra "Mono'®-Q gel kunne inhiberes ved tilsætning af
DK 164282B
13 antistoffer mod faktor VIII, opnået fra en hæmofili-pati-ent, så vel som ved hjælp af et monoklonalt antistof fremstillet ved immunisering af mus med renset faktor VIII. Immunostørkning af de fraskilte peptidkæder viste at an-5 tistofferne fra hæmofili-patienten og de monoklon'ale antistoffer reagerede med kæden på 80.000 dalton.
Eksempel 3
Fremstilling af af fragmenter af faktor VIII;C Et kommercielt koncentrat med høj renhed, "Octonativ"® (KabiVitrum AB) svarende til 67.000 enheder faktor VIII:C opløstes i sterilt vand indeholdende 1 mM DFP. Opløsningen overførtes til en kolonne indeholdende polyklonal gedeantistoffer mod von Willebrands fak- 15 (Kl tor koblet til "Sepharose"^ CL-2B gel. Kolonnen vaskedes og fraktionen med faktor VIII-aktiviteten elueredes som beskrevet i eksempel 1. Det faktor VIII:C-indeholdende elu-at, koncentreredes ca. 45 gange i en "Amicon" celle med en "Diaflo" PM 10 membran og pufferen udskiftedes med 0,02 ^ M Tris, 0,05 M CaC^ puffer pH 6,8 på en "Sephadex*^1 G-25 kolonne. Denne opløsning henstod ved 8°C i 18 timer og underkastedes derefter HPLC på ,,Mono"®-Q adsorbent som beskrevet i eksempel 1. Det opnåede elueringsdiagram er vist i fig. 3. Her konstateredes to hovedtoppe med 25 faktor VIII-aktivitet, Top I og Top II. Top I er ikke homogen men indeholder sandsynligvis fire eller fem delvis opsplittede komponenter. For at undersøge dette blev Top I delt i fem fraktioner og hver af disse fraktioner underkastedes HPLC samt gelfiltrering på "TSK" 4000 SW. Der ^ fandtes en hovedkomponent med faktor VIIl:C-aktivitet i alle fraktionerne, men molekylstørrelserne, som de fremgik af elueringspositionerne, var en smule forskellige. SDS-PAGE i nærværelse af merkaptoætanol af topfraktionerne viste,at fraktion 1 hovedsageligt indeholdt to komponenter, den ene 35 med molekylvægt 180.000 daltons og den anden med molekylvægt 80.000 daltons. Fraktion 2 indeholdt hovedsageligt to komponenter med molekylvægtene henholdsvis 160.000 og 80.000 daltons. Fraktion 14
DK 164282 B
3 indeholdt hovedsagelig to hovedkomponenter med molekylvægtene henholdsvis 150.000 og 80.000 daltons. Fraktion 4 indeholdt hovedsageligt to komponenter med molekylvægtene henholdsvis 130.000 og 80.000 daltons. Fraktion 5 indeholdt 5 hovedsageligt to komponenter med molekylvægtene henholdsvis 115.000 og 80.000 daltons. Eluering af materiale fra polyakrylamidgelerne kunne gennemføres og aminosyresammen-sætningen såvel som den aminoterminale aminosyresekvens blev'bestemt. Aminosyresammensætningen er'vist i tabel 2.
10 Peptiderne på 180.000, 160.000, 150.000, 130.000 og 115.000 daltons havde alle samme aminoterminale sekvens nemlig Ala-Thr-Arg-Arg-Tyr-Tyr-. Peptidkæden på 80.000 daltons havde den aminoterminale sekvens Glu-Ile-Thr-Arg-Thr-Thr-. Top II analyseredes ved hjælp af SDS-PAGE i nærvæ- 15 relse af merkaptoætanol og viste sig at indeholde to peptidkæder med molekylvægte på henholdsvis 90.000 og 80.000. Aminosyreanalysen og den aminoterminale sekvens viste at de to peptidkæder var identiske med de peptider der er beskrevet i eksempel 1.
20 FaktorVIII:C-aktiviteten af alle de forskellige frak tioner kunne inhiberes ved tilsætning af antistoffer mod faktor VIII:C vundet fra en hæmofili-patient såvel som med et monoklonalt antistof fremstillet ved immunisering af mus med renset faktor VIII. Immunostørkning viste at begge an- 25 tistoffer reagerede med peptidkæden på 80.000 daltons i alle fraktionerne.
Aminosyresammensætningen af de forskellige fraktioner er vist i nedenstående tabel II, udtrykt i molprocenter.
30 35
DK 164282 B
15
Tabel II
Aminosyresammensætning af de forskellige peptidkæder i faktor VIII:C______ 5 180 kD 160 kD 150 kD 130 kD 115 kD 90 kD 80 kD Cys 0,8 0,8 0,8 1,0 1,1 1,4 1,3
Asp 5,7 5,8 6,0 6,5 6,7 6,8 4,7 ^ ^ Asn 5,8 5,9 5,7 5,0 4,5 4,2 4,5
Thr 6,6 6,5 6,2 6,3 6,2 5,3 6,1
Ser 10,0 9,6 9,7 10,0 9,4 7,8 8,3
Glu 6,2 6,3 6,3 5,9 5,8 6,1 5,7
Gin 4,2 4,0 3,8 3,3 3,5 3,2 5,7 15 Pro 5,7 5,5 5,8 5,8 6,1 5,4 4,5
Gly 5,3 5,6 5,6 5,6 5,6 5,8 5,7
Ala 4,5 4,4 4,4 4,6 4,8 5,0 4,8
Val 5,3 5,5 5,7 5,5 5,8 6,8 5,4
Met 2,4 2,6 2,7 2,6 2,6 2,6 3,5 20 Ile 4,4 4,1 4,3 4,4 4,4 4,7 5,7
Leu 10,0 10,0 10,1 10,3 9,9 9,6 7,7
Tyr 3,2 3,3 3,3 3,8 4,3 5,1 4,4
Phe 4,4 4,5 4,4 4,5 4,7 4,9 5,7
Trp 1,2 1,3 1,4 1,5 1,5 1,8 2,2 ^ Lys 6,9 6,8 6,6 5,9 5,4 5,5 5,4
His 3,2 3,2 3,3 3,3 3,4 3,4 3,5
Arg_4,3_4,2_4,0_4,3 4,4_4,7_5,0 1 35
DK 164282 B
16
Biologiske forsøg A._Overlevelse in vivo af renset faktor VIII:C i normale ___hunde_______________________________________________
In vivo overlevelse af de rensede faktor VIII frak-5 tioner beskrevet i eksemplerne 2 og 3 undersøgtes på normale hunde.
Til undersøgelserne i normale hunde blev Top I-ma- teriale og Top Il-materiale fra "Mono"®-Q geltrinnet mær-* * 125 ket med I ved hjælp af lodogenmetoden. Det mærkede pro-10 tein skiltes fra ikke-kovalent bundet jod ved gelfiltre- Æ) ring på "Sephadex,iiy G-25. Dens specifikke aktivitet var 5,3 yCi/yg og 3,8 UCi/yg for henholdsvis Top I og Top II. Faktor VIII mærket med denne metode bevarede 50-100% af sin størkningsaktivitet (klumpningsaktivitet). SDS-PAGE i nær-15 værelse af merkaptoætanol viste at det havde de samme elektroforetiske egenskaber som umærket materiale.
Tre hunde fik hver en intravenøs injektion på 4 g 125 I-mærket Top I-materiale (--^20 yCi). En af hundene fik også et tidobbelt overskud (^40 yg) af umærket faktor VIII 20 for at undersøge en mulig dosis afhængig plasmaeliminering. Efter tre uger, da plasmaradioaktiviteten var vendt til=-bage til basislinie niveauerne, fik to af hundene en yder-ligere injektion på 4 yg (^15 yCi) I-mærket Top Il-materiale. Der opsamledes blodprøver på 2 ml med visse tids-25 mellemrum (fra 1 minut til 56 timer) ved hjælp af "Venoject1® vakuumbeholderrør indeholdende 0,2 ml 0,13 M natriumcitrat.
Blodprøverne blev straks talt med hensyn til radioaktivitet.
3 25
Nedbrydningshastigheden for I-faktor VIII:C til metabolitter og frit jod analyseredes ved gelfiltrering af 30 plasma opsamlet 1,5, 26 og 51 timer efter injektionen, på en "Sephadex"^ G-25 kolonne. Den blev også analyseret ved fældning af plasma med TCA. 1 ml plasma fældedes med 1 ml 20%s TCA. Efter centrifugering i 10 minutter ved 1500 g blev radioaktiviteten talt i bundfaldet og den ovenstående 35 væske.
125
Resultaterne viste at faktor VIII:C-bundet I-radio-aktivitet blev elimineret med en halveringstid på 7,6 ti- 17 mer + 0,2 (n=3) og 10,0 timer + 0,2 (n=2) for henholds vis Top I og II. Den bioeksponentielle nedgang af radio-mærket Top I-materiale og Top Il-materiale fremgår af fig.
4 og fig. 5.
5 B._Hæmostatisk virknina οσ overlevelse in vivo i hæmofili-___hunde__________________________________________
Den hæmostatiske virkning af faktor VIII:C-frektionerne blev afprøvet i hæmofili-A hunde ved hjælp af den mo-10 del som er beskrevet af A.R. Giles, S. Tinlin og R. Greenwood (Blood 60, 727-730, 1982). Der fremkaldtes blødning hos let anæsteserede dyr ved afskæring af spidsen af klooverhuden ved hjælp af et skæreapparat. Hos normale hunde hører blødningen op efter 2-8 minutter hvis den størknede 15 blodklump ikke forstyrres. Det hæmofiliske dyr udviste derimod et ganske anderledes mønster. Blødningen standsede lejlighedsvis sponstant i løbet af samme tidsrum som konstateret for de normale hunde, men den begyndte altid på ny og fortsatte til der blev taget forholdsregler for at 20 standse blødningen.
To hæmofili-A hunde som var alvorlig deficiente med hensyn til faktor VIII:C «1%) deraf i forhold, til det normale niveau) anvendtes i undersøgelsen og fik intravenøse injektioner af henholdsvis Top I-materiale og Top II-mate-25 nåle, vundet i henhold til eksemplerne 2 og 3. Mængden af injiceret faktor VIII:C' var beregnet til at være tilstrækkeligt til at give et initialt plasmaniveau på 2 enheder faktor VIII:C-aktivitet/ml (200% af det normale niveau hos mennesker ). Der opsamledes blodprøver på 5 ml med mellemrum 30 fra 2 min. til 96 timer efter injektionen. Prøverne blev straks centrifugeret ved 2000 g i 20 min. for at tilvejebringe plasma med ringe indhold af blodplader. Plasmaet blev bestemt med hensyn til faktor VIII:C.
Begge hundene blødte kraftigt fra de klippede tå-35 negle før injektionen af materialet. Den hund som modtog Top Il-materiale havde også udviklet en spontan og fatal blødning ved tungroden før injektionen. Ca. 30 min. efter
DK 164282B
18 injektionen standsede blødningen fuldstændigt fra tåhuden-af den hund som havde fået Top I-materiale. Blødningstiden korrigeredes til inden for det normale område som afprøvet efter ødelæggelse af blodklumpen. En lignende hæ-5 mostatisk virkning opnåedes hos den hund der havde fået
Top Il-materiale. Blødningen fra tåhuden såvel som fra tungen stoppede fuldstændigt inden for 30 min. efter injektionen. Derefter konstateredes der en normal blødningstid. Overlevelsen af den biologiske aktivitet in vivo måltes 10 ved den kromogeniske prøve for faktor VIIIjC- Resultaterne viste at faktor VIII gik ned med en halveringstid på 7,0 og 10,0 timer for henholsvis Top I og Top II. Disse resultater var således i overensstemmelse med dem der opnå-125 edes med I-mærket faktor VIII:C i normale hunde. Den bio-15 eksponentiale nedgang af aktiviteten efter injektion af Top I- og Top Il-materiale fremgår af fig. 4 og fig. 5. Udvindingen in vivo af injiceret faktor VIII-fragmenter var mellem 90 og 100%.
20 I klinisk praksis kan de nye faktor VIII-fragmenter ifølge opfindelsen indgives og bruges ved samme, indikationer som dem ved hvilke faktor VHI-præparater med høj renhed normalt bruges. Den mængde der skal indgives afhænger af den enkelte patients behov for at normalisere hæmosta-25 tis.
Tegningsforklaring
Fig. 1 immunoaffinitetskromatografering af faktor VIII:C-von Willebrand komplekset "Octonativ"^ på polyklona-30 le gedeantistoffer mod von Willebrand faktor koblet til "Sepharose'® CL-2B, fig. 2 gelelektroforese på natriumdodecylsulfat-polyakrylamid i nærværelse af merkaptoætanol af faktor VIII:C-eluat fra HPLC-"Mono"®-Q geltrinnet, 35 fig. 3 HPLC på "Mono'^-gel af det faktor VIIIjC- indeholdende eluat fra det i eksempel 3 beskrevne immunoaf f initetskromatograf er ingstr in, fig. 4 bioeksponentiel nedgang af radioaktiviteten .
125 19 i helblod fra normale hunde som har modtaget I-mærket fak tor VIIl-Top I (n=3? ·) og af faktor VIII:C-aktivitet i plasma fra én hæmofili-hund som har modtaget faktor VIII I (A)# og 5 fig. 5 den bioeksponentielle nedgang i radioaktivi- 125 teten i helblod fra normale hunde som har modtaget I-mærket faktor VIII: C -Top II (n=2;·) og af faktor VIII:C vitet i plasma fra én hæmofili-hund som har modtaget faktor- VIII: C Top 11(4 ).
10 I fig. 4 og 5 er den hurtige fordelingsfase (t=0/12 time) ikke vist.
For fig. 4 gælder det at radioaktiviteten i klumpen af TCA-fældet plasma efter korrektion for hæmotokrit fulg- 125 te de brudte linier. Dette viser at afbøjningen af I-15 aktivitetskurven efter 12 timer skyldes dannelse af radiomærkede lavmolekylære stofskifteprodukter og/eller frit 125 jod med længere halveringstid end faktor VIII:c. Halveringstiden for radioaktivitet stammende fra faktor VIII;C i normale hunde eller faktor VIII:C-aktivitet i hæmofili-hun-20 de bestemtes ved lineær regressionsanalyse efter omdrejning af faktor VIII:C (radio)aktivitet i henholdsvis blod og plasma til naturlige logaritmiske værdier.
Det samme gælder for fig. 5.
25 1 35
Claims (10)
1. Aktivt fragment af human faktor VIII :C, kende tegnet ved at det indeholder to peptidkæder med molekylvægt henholdsvis 90.000 daltons og 80.000 daltons, 5 med de aminoterminale aminosyresekvenser henholdsvis Ala-Thr-Arg-Tyr-Tyr- og Glu-Ile-Thr-Arg-Thr-Thr- og med amino-syresammensætningen 10 _90 kD 80 kD Cys 1,4 1,3 Asp 6,8 4,7 Asn 4,2 4,5 Thr 5,3 6,1
15 Ser 7,8 8,3 Glu 6,1 5,7 Gin 3,2 5,7 Pro 5,4 4,5 Gly 5,8 5,7
20 Ala 5,0 4,8 Val 6,8 5,4 Met 2,6 3,5 Ile 4,7 5,7 Leu 9,6 7,7
25 Tyr 5,1 4,4 Phe 4,9 5,7 Trp 1,8 2,2 ’ Lys ' 5,5 5,4 His 3,4 3,5
30 Arg 4,7 5,0 35
2. Met 3,5 2,6 Ile 5,7 4,4 Leu 7,7 10,3 Tyr 4,4 3,8 Phe 5,7 4,5
25 Trp 2,2 1,5 Lys 5,4 5,9 His 3,5 3,3 Arg 5,0 4,3 1 35 DK 164282 B
2. Aktivt fragment af human faktor VIII;c, kendetegnet ved at det indeholder to peptidkæder med molekylvægt henholdsvis 115.000 daltons og 80.000 daltons, med den aminoterminale sekvenser henholdsvis Ala-Thr-Arg-5 Arg-Tyr-Tyr- og Glu-Ile-Thr-Arg-Thr-Thr- og med aminosy-resammensætningen _80 kD 115 kD ·
10 Cys 1,3 1,1 Asp 4,7 6,7 Asn 4,5 4,5 Thr 6,1 6,2 Ser 8,3 9,4
15 Glu 5,7 5,8 Gin 5,7 3,5 Pro 4,5 6,1 Gly 5,7 5,6 Ala 4,8 4,8
20 Val 5,4 5,8 Met 3,5 2,6 Ile 5,7 4,4 Leu 7,7 9,9 Tyr 4,4 4,3
25 Phe 5,7 4,7 Trp 2,2 1,5 Lys 5,4 5,4 His 3,5 3,4 Arg 5,0 4,4 30 35 DK 164282 B
3. Aktivt fragment af human faktor VIII:C, kendetegnet ved at det indeholder to peptidkæder med molekylvægt henholdsvis 130.000 daltons og 80.000 daltons, med de aminoterminale aminosyresekvenser henholdsvis Ala-5 Thr-Arg-Arg-Tyr-Tyr- og Glu-Ile-Thr-Arg-Thr-Thr- ng med aminosyresammensætningen _80 kD 130 kD . Cys 1,3 1,0
10 Asp 4,7 6,5 Asn 4,5 5,0 Thr 6,1 6,3 Ser 8,3 10,0 Glu 5,7 5,9
15 Gin 5,7 3,3 Pro 4,5 5,8 Gly 5,7 5,6 Ala 4,8 4,6 Val 5,4 5,5
4. Aktivt fragment af human faktor VIII:C, kende tegnet ved at det indeholder to peptidkæder med molekylvægt henholdsvis 150.000 daltons og 80.000 daltons, med de aminoterminale sekvenser henholdsvis Ala-Thr-Arg-5 Arg-Tyr-Tyr- og Glu-Ile-Thr-Arg-Thr-Thr- og med aminosyre-sammensætningen _80 kD 150 kD Cys 1,3 0,8 10 ÅSP 4,7 6,0 Asn 4,5 5,7 Thr 6,1 6,2 Ser 8,3 9,7 Glu 5,7 6,3
15 Gin 5,7 3,8 Pro 4,5 5,8 Gly 5,7 5,6 Ala 4,8 4,4 Val 5,4 5,7
20 Met 3'5 2,7 Ile 5,7 4,3 Leu 7,7 10,1 Tyr 4,4 3,3 Phe 5,7 4,4
25 TrP 2,2 lf4 Lys 5,4 6,6 His 3,5 3,3 Arg 5,0 4,0 1 35 DK 164282 B
5. Aktivt fragment af human faktor VIII:C, kendetegnet ved at det indeholder to peptidkæder med molekylvægt henholdsvis 160.000 daltons og 80.000 daltons, med de aminoterminale sekvenser henholdsvis Ala-Thr-Arg-5 Arg-Tyr-Tyr- og Glu-Ile-Thr-Arg-Arg-Thr-Thr- og med amino-syresammensætningen _ 80 kD 160 kD -
10 Cys 1'3 0/8 Asp 4,7 5,8 Asn 4,5 5,9 Thr 6,1 6,5 Ser 8,3 9,6
15 Glu 5,7 6,3 Gin 5,7 4,0 Pro 4,5 5,5 Gly 5,7 5,6 Ala 4,8 4,4
20 Val 5,4 5,5 Met 3,5 2,6 Ile 5,7 4,1 Leu 7,7 10,1 Tyr 4,4 3,3
25 Phe 5,7 4,5 Trp 2,2 1,3 Lys 5,4 6,8 His 3,5 3,2 Arg 5,0 4,2 30 35
6. Aktivt fragment af human faktor VIII:C, k e n d e-tegnet ved at det indeholder to peptidkæder med molekylvægt henholdsvis 180.000 daltons og 80.000 daltons, med de aminoterminale aminosyresekvenser henholdsvis Ala-5 Thr-Arg-Arg-Tyr-Tyr- og Glu-Ile-Thr-Arg-Thr-Thr- og med aminosyresammensætningen __80 kD 180 kD '
10 Cys 1,3 0,8 Asp 4,7 5,7 Asn 4,5 5,8 Thr 6,1 6,6 Ser 8,3 10,0
15 Glu 5,7 6,2 Gin 5,7 4,2 Pro 4,5 5,7 Gly 5,7 5,3 Ala 4,8 4,5
20 Val 5,4 5,3 Met 3,5 2,4 Ile 5,7 4,4 Leu 7.7 10,0 Tyr 4,4 3,2
25 Phe 5,7 4,4 Trp 2,2 1,2 Lys 5,4 6,9 His 3,5 3,2 Arg 5,0 4,3 30 35 DK 164282B
7. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved at det som virksom bestanddel indeholder et fragment af faktor VIII ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6.
8. Anvendelse af et aktivt fragment af human faktor 5 VIII:C ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6 ved fremstilling af et medikament til behandling af hæmofili.
9. Anvendelse ifølge krav 8 af et aktivt fragment af human faktor VIII:C ved fremstilling af et medikament til' normalisering af haemostasis hos hæmofilipatienter.
10. Fremgangsmåde til fremstilling af et fragment af faktor VIII som angivet i et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at fragmenteret faktor VIII:C-indeholdende materiale renses under anvendelse af immuno-affinitets-kromatografering, eventuelt med indhold af kovalent bundne antistoffer mod von Wille-brand-faktor koblet til gelmatrixen, eluering af det rensede materiale, eventuelt efterfulgt af ionbytterkroma-tografering, hvorpå dette materiale fragmenteres ved hjælp af en meget lav koncentration af thrombin og faktor VIII:C-fragmenterne isoleres.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8501050 | 1985-03-05 | ||
| SE8501050A SE8501050D0 (sv) | 1985-03-05 | 1985-03-05 | Biologically active fragments of human antihemophilic factor and method for preparation thereof |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK85786D0 DK85786D0 (da) | 1986-02-25 |
| DK85786A DK85786A (da) | 1986-09-06 |
| DK164282B true DK164282B (da) | 1992-06-01 |
Family
ID=20359353
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK085786A DK164282B (da) | 1985-03-05 | 1986-02-25 | Biologisk aktive fragmenter af human antihaemofilisk faktor viii:c, anvendelse af fragmenterne og fremgangsmaade til fremstilling af dem |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4749780A (da) |
| EP (1) | EP0197901B1 (da) |
| JP (1) | JPS61205219A (da) |
| AT (1) | ATE65505T1 (da) |
| CA (1) | CA1341497C (da) |
| DE (1) | DE3680368D1 (da) |
| DK (1) | DK164282B (da) |
| HK (1) | HK15293A (da) |
| SE (1) | SE8501050D0 (da) |
| SG (1) | SG1893G (da) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5362854A (en) * | 1983-03-31 | 1994-11-08 | Scripps Clinic & Research Foundation | Factor VIII coagulant polypeptides: method of making |
| US7138505B1 (en) | 1984-01-12 | 2006-11-21 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Factor VIII:C nucleic acid molecules |
| SE8501050D0 (sv) * | 1985-03-05 | 1985-03-05 | Kabivitrum Ab | Biologically active fragments of human antihemophilic factor and method for preparation thereof |
| KR910006424B1 (ko) * | 1985-08-21 | 1991-08-24 | 인코텍스 비.브이 | 편성브리프(brief) 제조방법 |
| US5198349A (en) * | 1986-01-03 | 1993-03-30 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing factor VIII:C and analogs |
| FI98829C (fi) * | 1986-01-27 | 1997-08-25 | Chiron Corp | Menetelmä rekombinoidun proteiinikompleksin valmistamiseksi, jolla on humaanitekijä VIII:C-aktiivisuutta |
| US5422260A (en) * | 1986-05-29 | 1995-06-06 | Genetics Institute, Inc. -Legal Affairs | Human factor VIII:c muteins |
| EP0251843A1 (fr) * | 1986-06-06 | 1988-01-07 | Transgene S.A. | Procédé de préparation de facteur VIII à partir de cellules de mammifères |
| FR2613379B2 (fr) * | 1987-04-03 | 1990-04-06 | Transgene Sa | Procede de preparation de fragments du facteur viii a partir de cellules de mammiferes |
| EP0272304B1 (en) * | 1986-06-24 | 1994-01-26 | Novo Nordisk A/S | A process for producing a coagulation active complex of factor viii fragments |
| US4980456A (en) * | 1987-04-06 | 1990-12-25 | Scripps Clinic And Research Foundation | Recombinant factor VIIIC derived fragments |
| US6346513B1 (en) | 1987-06-12 | 2002-02-12 | Baxter Trading Gmbh | Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
| IL86693A (en) | 1987-06-12 | 1994-06-24 | Stichting Centraal Lab | Proteins that have the activity IIIV of the blood, a process for their preparation that uses cells are produced through genetic engineering and pharmaceutical preparations that contain them |
| DE69319628T2 (de) * | 1992-04-06 | 1998-11-05 | Pressmaster Tool Ab | Crimp-werkzeug |
| WO1994007510A1 (en) * | 1992-10-02 | 1994-04-14 | Kabi Pharmacia Ab | Composition comprising coagulation factor viii formulation, process for its preparation and use of a surfactant as stabilizer |
| US5576291A (en) * | 1993-09-13 | 1996-11-19 | Baxter International Inc. | Activated factor VIII as a therapeutic agent and method of treating factor VIII deficiency |
| SE9303601D0 (sv) * | 1993-11-01 | 1993-11-01 | Kabi Pharmacia Ab | Improved cell cultivation method and medium |
| US6288030B1 (en) | 1993-12-22 | 2001-09-11 | Amgen Inc. | Stem cell factor formulations and methods |
| IL113010A0 (en) * | 1994-03-31 | 1995-10-31 | Pharmacia Ab | Pharmaceutical formulation comprising factor VIII or factor ix with an activity of at least 200 IU/ml and an enhancer for improved subcutaneous intramuscular or intradermal administration |
| SE9403915D0 (sv) * | 1994-11-14 | 1994-11-14 | Annelie Almstedt | Process A |
| SE503424C2 (sv) * | 1994-11-14 | 1996-06-10 | Pharmacia Ab | Process för rening av rekombinant koagulationsfaktor VIII |
| SE9501189D0 (sv) * | 1995-03-31 | 1995-03-31 | Pharmacia Ab | Protein formulation |
| SE9503380D0 (sv) * | 1995-09-29 | 1995-09-29 | Pharmacia Ab | Protein derivatives |
| EP0910628B1 (en) | 1996-04-24 | 2006-03-08 | The Regents of The University of Michigan | Inactivation resistant factor viii |
| US8183344B2 (en) | 1996-04-24 | 2012-05-22 | University Of Michigan | Inactivation resistant factor VIII |
| US5851800A (en) * | 1996-05-14 | 1998-12-22 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for producing a protein |
| US6143179A (en) * | 1996-06-24 | 2000-11-07 | Kerckhoff-Klinik Gmbh | Method for the affinity-chromatographic purification of factor VIII |
| US6197526B1 (en) | 1999-01-04 | 2001-03-06 | Dyax Corp. | Polypeptides for binding human factor VIII and fragments of human factor VIII |
| US7112438B2 (en) | 1999-01-04 | 2006-09-26 | Dyax Corp. | Binding molecules for human factor VIII and factor VIII-like proteins |
| EP1038959A1 (en) | 1999-03-17 | 2000-09-27 | Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung | Factor VIII without B-domain, comprising one or more insertions of a truncated intron I of factor IX |
| SE9901379D0 (sv) | 1999-04-19 | 1999-04-19 | Pharmacia & Upjohn Ab | Receptor structures |
| EP1233064A1 (en) | 2001-02-09 | 2002-08-21 | Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung | Modified factor VIII cDNA and its use for the production of factor VIII |
| AU2002310438B2 (en) | 2001-06-14 | 2008-05-01 | The Scripps Research Institute | Stabilized proteins with engineered disulfide bonds |
| EP1418810A4 (en) | 2001-08-03 | 2006-08-02 | Us Gov Health & Human Serv | TREATMENT OF HEMOPHILIA ORAL |
| US9359629B2 (en) | 2007-12-27 | 2016-06-07 | Baxalta Incorporated | Cell culture processes |
| WO2012151517A1 (en) * | 2011-05-05 | 2012-11-08 | Coordinated Program Development, Llc | Cochleate compositions and methods of making and using same |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4361509A (en) * | 1981-12-14 | 1982-11-30 | Scripps Clinic And Research Foundation | Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies |
| US4495175A (en) * | 1982-08-05 | 1985-01-22 | University Of Rochester | Preparation of highly purified human antihemophilic factor |
| EP0148843B2 (en) * | 1983-03-21 | 1994-05-04 | Novo Nordisk A/S | A concentrate of the antihemophilic factor viii and a process for producing it |
| IE80858B1 (en) * | 1983-03-31 | 1999-04-21 | Scripps Research Inst | New factor viii coagulant polypeptides |
| DE3586402T3 (de) * | 1984-01-12 | 2004-12-23 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Proteinzusammensetzung mit Koagulations-wirkung und Verfahren zu ihrer Herstellung. |
| US4710381A (en) * | 1984-05-22 | 1987-12-01 | The Blood Center Of Southeastern Wisconsin | Method for maintaining intact, non-degraded factor VIII/von-Willebrand factor during blood processing |
| US4543210A (en) * | 1984-10-04 | 1985-09-24 | Miles Laboratories, Inc. | Process for producing a high purity antihemophilic factor concentrate |
| SE8501050D0 (sv) * | 1985-03-05 | 1985-03-05 | Kabivitrum Ab | Biologically active fragments of human antihemophilic factor and method for preparation thereof |
-
1985
- 1985-03-05 SE SE8501050A patent/SE8501050D0/xx unknown
-
1986
- 1986-02-24 EP EP86850067A patent/EP0197901B1/en not_active Revoked
- 1986-02-24 DE DE8686850067T patent/DE3680368D1/de not_active Revoked
- 1986-02-24 AT AT86850067T patent/ATE65505T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-02-25 DK DK085786A patent/DK164282B/da unknown
- 1986-03-04 JP JP61045506A patent/JPS61205219A/ja active Granted
- 1986-03-04 CA CA000503239A patent/CA1341497C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-03-04 US US06/835,914 patent/US4749780A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-04-25 US US07/185,629 patent/US4877614A/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-01-05 SG SG18/93A patent/SG1893G/en unknown
- 1993-02-25 HK HK152/93A patent/HK15293A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK85786D0 (da) | 1986-02-25 |
| DE3680368D1 (de) | 1991-08-29 |
| HK15293A (en) | 1993-03-05 |
| JPS61205219A (ja) | 1986-09-11 |
| JPH0547524B2 (da) | 1993-07-19 |
| US4877614A (en) | 1989-10-31 |
| US4749780A (en) | 1988-06-07 |
| SG1893G (en) | 1993-06-11 |
| DK85786A (da) | 1986-09-06 |
| SE8501050D0 (sv) | 1985-03-05 |
| ATE65505T1 (de) | 1991-08-15 |
| EP0197901A1 (en) | 1986-10-15 |
| CA1341497C (en) | 2006-02-14 |
| EP0197901B1 (en) | 1991-07-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK164282B (da) | Biologisk aktive fragmenter af human antihaemofilisk faktor viii:c, anvendelse af fragmenterne og fremgangsmaade til fremstilling af dem | |
| JP3701028B2 (ja) | 高純度フォンビルブラント因子の入手方法 | |
| DK173859B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af et højrenset humant faktor IX koncentrat og andre plasmaproteiner | |
| AU622133B2 (en) | Plasma and recombinant protein formulations in high ionic strength media | |
| EP0294025B1 (en) | Peptides corresponding to the Factor VIII binding domain of the von Willebrand factor | |
| US4649132A (en) | Treatment of Factor VIII inhibitors | |
| EP0182372A2 (en) | New factor VIII coagulant polypeptides | |
| US6005077A (en) | Use of von willebrand factor and pharmaceutical formulation | |
| Reber et al. | Three abnormal fibrinogen variants with the same amino acid substitution (γ 275 Arg→ His): Fibrinogens Bergamo II, Essen and Perugia | |
| HU214905B (hu) | Eljárás VIII. faktor izolálására | |
| Nilsson | IN MEMORY OF ERIK JORPES: von Willebrand's Disease from 1926–1983 | |
| JPH0829089B2 (ja) | フアクタ−▲ｖｉｉｉ▼凝固因子ポリペプチド類 | |
| US5484890A (en) | Antihemophilic factor stabilization | |
| EP0201574B1 (en) | A preparation for the treatment of hemophilia a inhibitor patients and a process for producing such a preparation | |
| US4769336A (en) | Treatment of factor VIII inhibitors | |
| Cooper et al. | The cold-insoluble globulin of plasma and its relationship to factor VIII | |
| US6239101B1 (en) | Thrombin binding polypeptides | |
| EP0239644A1 (en) | Novel physiologically active substance having blood coagulation controlling activity | |
| Aiken et al. | Isolation and identification of a 23,000-dalton heparin binding fragment from the amino terminus of bovine thrombospondin | |
| Nilsson | Clinical characteristics of the factor VIII protein from various factor VIII concentrates | |
| Arrighi et al. | Factor VIII: c Concentrate Virus Inactivated: Progress in Purification by Using Classic Chromatographie Methods | |
| Osbahr | Structure-activity relationships of the vasopressor activity of canine peptide-A from fibrinogen | |
| Nieuwenhuizen et al. | CALCIUM-BINDING SITES AND ANTICLOTTING PROPERTIES OF HUMAN FIBRINOGEN AND FIBRIN (OGEN) FRAGMENTS | |
| Bouma et al. | Factor VIII Related Antigen in Normal Blood Platelets and in Platelets of Patients with von Willebrand’s Disease | |
| WO1995013301A1 (en) | Cross-linked factor viii |