DE69003061T2

DE69003061T2 - Protein enthaltende wässerige Lösungen.

Info

Publication number: DE69003061T2
Application number: DE90310287T
Authority: DE
Inventors: Hisahiro Ishiwari; Nobuhiro Kawashima; Kiyoshi Sakai; Yukio Shimazaki; Ryo Tanaka; Yasuhito Tanaka; Miki Yoshioka
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc; Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1989-09-21
Filing date: 1990-09-20
Publication date: 1993-12-16
Anticipated expiration: 2010-09-21
Also published as: BR9004693A; CA2025315C; EP0419251A1; EP0419251B1; DE69003061D1; KR930004598B1; ATE93731T1; AU6246690A; JPH03106898A; CN1050327A; AU627621B2; ES2060057T3; KR910005884A; DK0419251T3; CA2025315A1; NO904120D0; FI98891C; FI98891B; FI904618A0; CN1049356C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Protein enthaltende wässrige Lösungen, Verfahren zur Erhöhung der Protein-Konzentration, eine Protein-Zubereitung und Techniken, die zur Herstellung von Pharmazeutika für die klinische Verwendung unter Verwendung von aktiven Proteinen anwendbar sind.
Wenn ein Protein als homogene Komponente verwendet wird, ist es ausgesprochen wichtig, das Protein in einem Lösungsmittel zu lösen. Wenn zum Beispiel eine bestimmte Menge eines Proteins aus einer dieses Protein enthaltenden Zusammensetzung fraktioniert oder wenn das Protein analysiert wird, muß garantiert sein, daß die das Protein enthaltende Zusammensetzung homogen ist. Außerdem muß das Protein vollständig gelöst werden, wenn es zur Verabreichung als Pharmazeutikum wie eine Zubereitung zur Injektion in Wasser gelöst wird.
Im allgemeinen wird die Löslichkeit von Proteinen in einem wässrigen Lösungsmittel stark von hydrophilen oder hydrophoben Resten auf der Oberfläche des Proteins und durch Ladungen des Proteins beeinflußt. Wenn das Protein nur wenig löslich ist, da auf der Oberfläche des Proteins hydrophobe Reste sitzen, ist es möglich, die Löslichkeit durch Zusatz von oberflächenaktiven Stoffen (Surfactand) zu erhöhen.
Wenn der pH eines wässrigen Lösungsmittels nahe dem isoelektrischen Punkt des Proteins, das gelöst werden soll, ist, was leicht die isoelektrische Präzipitätion verursachen kann, kann die Löslichkeit des Proteins andererseits dadurch erhöht werden, daß die Salzkonzentration und die Ionenstärke des wässrigen Lösungsmittels erhöht werden. In diesem Fall trägt ein oberflächenaktiver Stoff zur Erhöhung der Löslichkeit des Proteins nicht bei. Wenn der pH eines wässrigen Lösungsmittels nahe dem isoelektrischen Punkt eines Proteins und die Salzkonzentration gering ist, ist das Protein nur in relativ geringer Konzentration löslich. Um das Protein in relativ hoher Konzentration zu lösen, wird deshalb entweder ein Verfahren verwendet, bei dem der pH vom isoelektrischen Punkt verschieden ist, oder es wird ein Verfahren verwendet, bei dem die Salzkonzentration erhöht ist.
In manchen Fällen ist es jedoch nötig, ein Protein bei einem pH nahe dem isoelektrischen Punkt in ausreichend hoher Konzentration zu lösen, ohne die Salzkonzentration zu erhöhen. Ein Beispiel ist, wenn ein physiologisch aktives Protein mit einem isoelektrischen Punkt nahe dem neutralen pH in Form einer Lösung mit einem pH nahe dem Neutralpunkt einem Patienten verabreicht wird, dessen Salzaufnahme so gering wie möglich gehalten werden sollte. In diesem Fall sind die bislang bekannten, einzig möglichen Techniken entweder die Verwendung von Protein in niedrigerer Konzentration oder die Verabreichung von Salz. Es waren daher bei der Formulierung von Protein enthaltenden, aktiven Pharmazeutika ernsthafte Probleme zu lösen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine hochkonzentrierte, wässrige Protein-Lösung bereitzustellen. Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, bei dem ein Protein in hoher Konzentration in einer wässrigen Lösung gelöst werden kann. Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Protein-Zubereitung mit ausgezeichneter Löslichkeit bereitzustellen.
Bei der Herstellung konzentrierter, Protein enthaltender Lösungen fanden die Erfinder der vorliegenden Erfindung zunächst, daß bei Bindung eines Proteins an einen Ionenaustauscher bei einem geeigneten pH die Bindung des Proteins an den Ionenaustauscher bei geringer Salzkonzentration zu erfolgen tendiert, und daß es deshalb möglich ist, ein Protein zu lösen, indem hydrophobe Reste eines oberflächenaktiven Stoffs, der verwendet wird, um ein hydrophobes Protein zu lösen, durch anionische Reste ersetzt werden. Dies erfolgt auf Basis desselben Mechanismus wie bei Verwendung eines oberflächenaktiven Stoffs.
Auf der Grundlage dieser Erfindung erkannten die Erfinder der vorliegenden Erfindung außerdem im Laufe weiterer Untersuchungen, daß anionische Polymere oder deren Salze den oben erwähnten, günstigen Effekt ausüben, wodurch die vorliegende Erfindung vollendet wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Protein enthaltende, wässrige Lösung bereit, die außerdem ein anionisches Polymer oder dessen Salz enthält; sie stellt ein Verfahren zur Erhöhung der Protein-Konzentration einer Protein enthaltenden, wässrigen Lösung bereit, die außerdem ein anionisches Polymer oder dessen Salz enthält; sie stellt schließlich eine ein anionisches Polymer oder dessen Salz sowie Protein enthaltende Zubereitung bereit.
Eine ein Saccharid, eine Art von anionischem Polymer wie Polysulfat oder einen sulfonierten Zucker und tPA (Gewebe-Plasminogen-Aktivator) enthaltende pharmazeutische Zubereitung ist in der Japanischen Offenlegungsschrift 236730/1986 beschrieben. Die beschriebene Technik dient jedoch der Verbesserung der Aktivität des tPA und ist, bezogen auf die technologische Idee, grundsätzlich verschieden von der Technik gemäß der vorliegenden Erfindung, die breiter ist und der Verbesserung der Löslichkeit von Proteinen im allgemeinen dient.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Protein enthaltende, wässrige Lösung mit hohen Protein-Konzentrationen bereit, die mittels konventioneller Verfahren niemals erhältlich gewesen sind; insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Protein enthaltende, wässrige Lösungen mit geringer Salzkonzentration bei einem pH nahe dem isoelektrischen Punkt bereit.
Gewöhnlicherweise ist, um ein Protein bei einem pH nahe dem isoelektrischen Punkt des Proteins zu lösen, es nötig, (1) die Protein-Konzentration deutlich zu senken oder (2) die Salzkonzentration deutlich zu erhöhen. Die resultierende Protein- Lösung ist extrem ungeeignet, wenn einem Patienten, dessen Salzaufnahme beschränkt ist, ein physiologisch aktives Protein in Form einer Lösung mit einem pH nahe dem isoelektrischen Punkt des Proteins verabreicht werden muß. Um das Protein zu lösen, ohne die Salzkonzentration zu erhöhen, ist es notwendig, einen pH auszuwählen, der von dem pH nahe dem isoelektrischen Punkt des Proteins verschieden ist, selbst wenn der ausgewählte pH für die Verwendung in Pharmazeutika wie Injektionen oder anderen parenteral zu verabreichenden Dosierungsformen unerwünscht ist.
Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, wie in der US 4 857 320 beschrieben, dar das Protein tPA in wässrigen Medien nicht leicht löslich ist. Verschiedene Versuche zur Verbesserung seiner Löslichkeit sind bisher unternommen worden, darunter sind zu erwähnen die Verwendung von TWEEN 80 plus der Ausweg, die Ionenkonzentration einer Kochsalzlösung zu erhöhen. Um die Löslichkeit von tPA weiter zu erhöhen, lehrt die US 4 857 320, daß Arginin oder ein nicht-toxisches Salz von Arginin der TWEEN 80 enthaltenden Kochsalzlösung zugesetzt werden sollten.
Im Gegensatz dazu können Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung bei einem pH nahe dem isoelektrischen Punkt des Proteins gelöst werden, ohne die Salzkonzentration zu erhöhen, so daß eine Protein enthaltende, wässrige Lösung mit geringer Salzkonzentration bei einem pH nahe dem isoelektrischen Punkt des Proteins bereitgestellt werden kann. Die vorliegende Erfindung stellt im Vergleich zu den konventionellen Techniken eine vorteilhafte Technik bereit.
Die vorliegende Erfindung ist besonders für die Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen geringen Salzgehaltes für die Injektion eines physiologisch aktiven Proteins mit einem isoelektrischen Punkt nahe dem Neutralpunkt geeignet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine wässrige Lösung mit einer erhöhten Konzentration an Protein bereitgestellt, wobei diese Lösung dieses Protein und ein anionisches Polymer oder dessen Salz enthält, wobei die Konzentration dieses Proteins in der Lösung höher ist als die maximale Konzentration ohne dieses anionische Polymer, und wobei die Lösung einen pH im Bereich innerhalb von +/- 2 pH-Einheiten vom isoelektrischen Punkt des Proteins und eine Ionenstärke von 0,05 Mol/l oder weniger aufweist.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit, um die Protein-Konzentration in einer wässrigen Lösung zu erhöhen. Das Verfahren umfaßt die Zugabe eines anionischen Polymers oder dessen Salz zu dieser Lösung, wobei die Menge des anionischen Polymers ausreichend ist, um das Protein in einer Konzentration zu lösen, die größer ist als die in Abwesenheit des anionischen Polymeren erhältliche Konzentration, und wobei die Lösung einen pH im Bereich innerhalb von +/- 2 pH-Einheiten vom isoelektrischen Punkt des Proteins und eine Ionenstärke von 0,05 Mol/l oder weniger aufweist.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein anionisches Polymer oder dessen Salz und ein Protein mit bei einem pH-Wert im Bereich um den isoelektrischen Punkt geringer Löslichkeit enthält, wobei die Menge dieses anionischen Polymers ausreichend ist, um eine wässrige Lösung zu erhalten, die eine größere Menge Protein als die in Abwesenheit des anionischen Polymeren erhältliche maximale Menge enthält, und wobei die Lösung einen pH im Bereich innerhalb von +/- 2 pH-Einheiten vom isoelektrischen Punkt des Proteins und eine Ionenstärke von 0,05 Mol/l oder weniger aufweist.
Beispiele für Proteine, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen physikochemisch einfache Proteine, konjugierte Proteine, induzierte Proteine sowie Proteine mit relativ hohen Anteilen hydrophober Gruppen. Insbesondere wird die vorliegende Erfindung geeigneterweise bei Proteinen wie Globulin oder tPA angewandt, die die Tendenz aufweisen, ihre Löslichkeit bei einem pH im Bereich um den isoelektrischen Punkt drastisch zu reduzieren. Beispiele umfassen Proteine mit einem isoelektrischen Punkt fern dem extrem sauren Bereich, vorzugsweise pH 4 oder höher und wünschenswerterweise pH 5 oder höher. Diese Proteine können mittels Extraktion und Reinigung aus natürlicherweise vorkommenden biologischen Körpern oder Teilen davon, mittels chemischer Synthese oder unter Verwendung von rekombinanter DNA- Technologie aus Zellkulturen erhalten werden. Das wie oben erwähnt erhaltene Protein kann nach Modifikation verwendet werden. Beispiele für diese Proteine umfassen die Gamma-Globuline wie die Immungloguline A, G und E, Lactoglobulin, Urokinase, Pro-Urokinase und Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA). Insbesondere ist die vorliegende Erfindung für Proteine mit physiologischen Aktivitäten speziell angepaßt.
Die Proteine können allein oder im Gemisch von zwei oder mehreren Proteinen oder verschiedenen Sorten von Proteinen verwendet werden.
Beispiele für anionische Reste der anionischen Polymere, wie sie gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen Carboxyl-, Carboxymethyl-, Schwefelsäure- und Phosphorsäure-Gruppen. Beispiele für Polymer-Hauptgerüste (polymer backbone) der anionischen Polymere umfassen: Zucker wie Zukkeralkohol, Cellulose und Amylose; Aminosäuren und Nukleinsäurebasen, vorzugsweise solche mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 1 000 000 als anionisches Polymer. Beispiele für die anionischen Polymere mit anionischen Resten und Polymer-Hauptgerüsten sind die Carboxymethyl-Ionenaustauscher wie Carboxymethylamylose, Carboxymethylcellulose, saure Polysaccharide wie Argininsäure, Mucosaccharidsulfate wie Dextransulfat, Chondroitinsulfat, Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat B, Chondroitinsulfat C, Chondroitinsulfat D, Chondroitinsulfat E, Heparin, Keratinsulfat (kerato sulfate), Keratansulfat und Heparitinsulfat, saure Polyaminosäuren wie Poly-L-Glutaminsäure und Nukleinsäuren. Beispielhafte Salze für diese anionischen Polymere umfassen Natrium, Kalium und Calcium.
Diese anionischen Polymere können allein oder in Kombination von zwei oder mehreren Typen verwendet werden.
Die Menge des anionischen Polymeren oder dessen Salz ist vorzugsweise 1/40 oder mehr (w/w), besonders bevorzugt 1/10 oder mehr und 100 oder weniger, von dem zu lösenden Protein. Wenn die Menge des anionischen Polymers nicht ausreichend ist, kann die gewünschte Menge an Protein-Auflösung nicht erreicht werden; wenn die Menge zu groß ist, ist die relative Menge des zu lösenden Proteins reduziert, was die bedeutsame Verwendung der Protein enthaltenden, wässrigen Lösung verhindert. Da anionische Polymere und deren Salze sich bezüglich ihrer anionischen Reste, der Fähigkeit zum Austausch von Kationen, der Molekulargewichte und dergleichen voneinander unterscheiden, können die Mengen der anionischen Polymere und deren Salze an Hand der physikalischen Eigenschaften des zu formulierenden Proteins bestimmt werden.
Die Konzentration des Proteins in einer Protein enthaltenden, wässrigen Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung wird an Hand der Löslichkeit des zu lösenden Proteins bestimmt und ist für jedes Protein einzigartig und kann somit nicht verallgemeinert werden. Es ist jedoch im allgemeinen möglich, eine wässrige Lösung mit einer Protein-Konzentration von 0,1 mg/ml oder mehr zu erhalten, da die Löslichkeit, insbesondere die Löslichkeit im pH-Bereich nahe dem isoelektrischen Punkt, im Vergleich zu der üblicherweise erhaltenen Löslichkeit in entsprechenden Protein enthaltenden, wässrigen Lösungen wesentlich verbessert ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es normalerweise möglich, eine wässrige Protein-Lösung mit einer Protein-Konzentration von etwa 0,01 bis 10 mg/ml zuzubereiten.
In der vorliegenden Erfindung ist der pH-Bereich der wässrigen Lösung nicht speziell eingeschränkt. Jedoch ist die vorliegende Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß die Löslichkeit des Proteins bei einem pH nahe dem isoelektrischen Punkt des Proteins erhöht werden kann, ohne die Salzkonzentration zu erhöhen. Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß die isoelektrischen Punkte der Proteine meist im Bereich zwischen schwach sauren und alkalischen pH-Werten liegen, ist die vorliegende Erfindung von besonderer Bedeutung, wenn der pH der wässrigen Lösung im Bereich der schwach sauren, neutralen, schwach alkalischen oder alkalischen pH-Werte liegt. Insbesondere liegt der pH der wässrigen Lösung im Bereich von -2 bis +2, bevorzugterweise -1 bis +1, pH-Einheiten vom isoelektrischen Punkt des Proteins entfernt.
In der vorliegenden Erfindung ist der isoelektrische Punkt des zu formulierenden Proteins der mittels Elektrophorese bestimmte isoelektrische Punkt. Im Fall von Proteinen ist der isoelektrische Punkt darüber hinaus gelegentlich nicht auf einen Punkt konvergiert, sondern zeigt sich bei Bestimmung mittels Elektrophorese als eine Bande eines bestimmten pH-Bereichs; in einem solchen Fall bezeichnet der pH-Bereich den isoelektrischen Punkt. In einem Gemisch von mehr als zwei Proteinen, die beide verschiedene isoelektrische Punkte besitzen, bezeichnet ein pH-Bereich, der die isoelektrischen Punkte aller Proteine abdeckt, den isoelektrischen Punkt des Gemisches.
Die Ionenstärke einer ein Protein und ein anionisches Polymer oder dessen Salz enthaltenden, wässrigen Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung beträgt 0,05 Mol/l oder weniger, bevorzugterweise 0,02 Mol/l oder weniger, und besonders bevorzugterweise 0,01 Mol/l oder weniger. Wenn die Ionenstärke 0,05 Mol/l übersteigt, wird die Wirkung der vorliegenden Erfindung leicht vermindert. Dies beruht wahrscheinlich darauf, daß eine Wechselwirkung zwischen den anionischen Resten des anionischen Polymers und dem Protein in der Lösung mit hohen Ionenstärken kompensiert wird.
Außerdem ist der Gehalt an anderen Salzen als dem anionischen Polymeren oder dessen Salz vorzugsweise kleiner als 0,1 Mol pro 1 mg Protein. In einer Lösung mit hoher Natriumchlorid- Konzentration kann der Effekt beispielsweise auf Grund des anionischen Polymers blockiert sein.
Um den Lösungsvorgang gemäß der vorliegenden Erfindung auszuführen, kann das folgende Verfahren angewandt werden. Zunächst wird ein Protein bei einem pH entfernt von dem isoelektrischen Punkt gelöst; dann wird die resultierende Protein-Lösung mit einer Lösung versetzt, die ein anionisches Polymer oder dessen Salz enthält; der pH wird derart eingestellt, daß er nahe dem isoelektrischen Punkt ist, um eine Lösung herzustellen, in der das Protein und das anionische Polymer oder dessen Salz nebeneinander vorliegen. Ein anderes Verfahren, das Anwendung finden kann, ist ein Verfahren, bei dem vorab eine ein Protein und ein anionisches Polymer oder dessen Salz enthaltende Lösung mit einem pH entfernt vom isoelektrischen Punkt des Proteins hergestellt wird, und dann der pH der Lösung wieder auf nahe dem isoelektrischen Punkt zurückjustiert wird.
In noch einem anderem Verfahren wird eine ein Protein und ein anionisches Polymer enthaltende Zubereitung hergestellt und dann aufgelöst. Um eine derartige Zubereitung herzustellen, kann jedes beliebige herkömmliche Verfahren verwendet werden. Zum Beispiel wird ein Protein bei einem pH entfernt vom isoelektrischen Punkt in einer verdünnten Lösung gelöst, und dann wird eine Lösung eines anionischen Polymers dieser Lösung zugesetzt. Nach Einstellen des pH wird der Lösung ein Träger und dergleichen zugesetzt, und die resultierende Lösung wird filtriert und auf Fläschen verteilt, die lyophilisiert werden müssen, um eine pharmazeutische Zubereitung zur Injektion zu erhalten. Alternativ kann die wässrige Protein-Lösung mit einem anionischen Polymer versetzt werden, so daß ein Komposit aus dem Protein und dem anionischen Polymer gebildet wird. Das resultierende Komposit wird aus der Lösung ausgefällt, indem der pH auf den isoelektrischen Punkt des Komposits eingestellt wird. Dann wird es getrocknet und in Fläschchen verteilt, nachdem Formulations-Additive zugesetzt worden sind, so daß eine Zubereitung erhalten wird. Der Protein-Gehalt dieser Zubereitungen liegt normalerweise bei 0,01 bis 50 Gew.%.
Um die Polymerisation der Proteine und ihre Adhäsion an die Behälter zu verhindern, können der Protein-Lösung oder dem lyophilisierten Produkt neben einem anionischen Polymer oder dessen Salz nötigenfalls ein öberflächenaktiver Stoff wie Tween 80, ein chelierendes Agens wie EDTA (um den Effekt der Metallionen auf das Protein zu eliminieren), ein Agens zum Stabilisieren physiologisch aktiver Proteine und außerdem ein Träger wie Mannitol und Laktose (wirksam bei Verwendung in einer lyophilisierten Zubereitung) zugesetzt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Protein bei einem pH nahe dem isoelektrischen Punkt wirksam gelöst werden, ohne die Salzkonzentration oder die Ionenstärke zu erhöhen. Herkömmliche Techniken waren nie in der Lage, dieses zu erreichen. Die vorliegende Erfindung geht über das allgemeinbe Wissen auf dem herkömmlichen Gebiet der Lösungs-Techniken hinaus und wird als bedeutsamer Fortschritt auf diesem Gebiet angesehen. Der Mechanismus der Lösungs-Wirkung ist nicht völlig klar; es wird jedoch vermutet, daß, wenn ein anionisches Polymer oder dessen Salz bei einem pH nahe dem isoelektrischen Punkt eines Proteins einer Lösung zugesetzt wird, wobei die Löslichkeit des Proteins per se sehr niedrig ist, das Protein und das anionische Polymer, insbesondere bei geringer Ionenstärke, wechselwirken, was zu einem enormen Anstieg der Löslichkeit führt.

BEISPIELE

Die vorliegende Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher beschrieben.

Beispiel 1

Das verwendete Protein war menschlicher Gewebe-Plasminogen- Aktivator (tPA), der erhalten worden war unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken durch Expression des tPA-Strukturgens in der Zellkultur und anschließende Reinigung und Anreicherung aus dem Kulturmedium erhalten worden war. Das tPA wurde in einer 60 mM Natriumphosphat-Lösung, die auf Grund ihres pH-Werts (4,2) für Natriumdihydrogenphosphat gehalten wurde, aufgelöst. 1 mg tPA und 0 bis 1 mg des Calciumsalzes von Heparin wurden in einen aus Cellulose hergestellen Dialyseschlauch gegeben. Dann wurde das Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml gebracht. Dialyse erfolgte für 3 Stunden gegen 1000 ml einer 1 mM Citratpuffer-Lösung. Die Flüssigkeit im Dialyseschlauch wurde in ein kleines Polypropylen-Teströhrchen transferiert, bei 15 000 U/min 10 Minuten zentrifugiert, und dann wurde die Löslichkeit von tPA bestimmt, indem die Absorption des Überstands bei 280 nm gemessen wurde. Der isoelektrische Punkt des tPA beträgt etwa 6,5 - 7,5. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt, aus der klar wird, daß die Löslichkeit des tPA durch den Zusatz von Calcium-Heparin insbesondere bei pH-Werten nahe dem isoelektrischen Punkt verbessert war. Tabelle 1 zugesetztes Heparin (Ca-salz) a) (mg) Die Spalten geben die Löslichkeit des tPA (mg/ml) wieder a) Zugegebene Menge pro 1 mg tPA b) pH, der dem isoelektrischen Punkt von tPA entspricht

Beispiel 2

Die Löslichkeit des tPA wurde wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht, mit der Ausnahme, daß verschiedene anionische Polymere und kationische Polymere, die in Tabelle 2 dargestellt sind, an Stelle von Heparin in Mengen von 0,1 - 0,2 mg verwendet wurden. Der pH der Lösung wurde auf etwa 7 eingestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
Die Löslichkeit des tPA wurde in allen Fällen mit anionischen Polymeren drastisch erhöht; es wurde jedoch mit keinem der kationischen Polymeren ein Anstieg der Löslichkeit beobachtet. Darüber hinaus wurde auch keine ausreichende Löslichkeit bei Zusatz von Natriumchlorid in hohen Konzentrationen erzielt. Tabelle 2 Zusätze Name Menge (mg/ml t-PA) Löslichkeit (mg/ml) Keine anionisches Polymer Poly-L-Glutaminsäure (Na-salz) DNA (bakteriellen Ursprungs) Dextran sulfat (Ca-salz) Heparin (Ca-salz) Chondroitin sulfat (Na-salz ) Argininsäure (Na-salz) Kationisches Polymer Protaminsulfat Poly-L-Lysin Salz Natriumchlorid

Beispiel 3

Die Löslichkeit des tPA wurde wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht, mit der Ausnahme, daß Chondroitinsulfat A und Heparansulfat bei einem pH von etwa 7 in Mengen, die in Tabelle 3 dargestellt sind, an Stelle von Heparin verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Die Studie zeigte, daß die Löslichkeit des tPA insbesondere dann verbessert wurde, wenn die Menge an Chondroitinsulfat A und Heparansulfat, bezogen auf das Gewicht, 1/40 oder mehr betrug. Tabelle 3 Zusätze zugesetzte Menge (Gew.-Verhältnis zu tPA) Löslichkeit (mg/ml) Chondroitin sulfat A (Na-salz) Heparansulfat (Na-salz)

Beispiel 4

Die pH-Werte der wässrigen Lösungen wurden auf den isoelektrischen Punkt der jeweiligen Proteine (tPA und β-Laktoglobulin) eingestellt, und die Löslichkeiten der Proteine wurden mit oder ohne Zusatz von Natrium-Chondroitinsulfat bestimmt, wobei dessen Menge ein Zehntel der Menge eines jeden Proteins betrug. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Protein β-Laktoglobulin isoelektrische Punkte pH der Lösung Löslichkeit (mg/ml) Chondroitin sulfat

Beispiel 5

tPA 100 mg
Natrium-Chondroitinsulfat 10 mg
Laktose 500 mg
Diese Zutaten wurden in 25 ml einer 5 mM Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,0) gelöst. Nach der Sterilisation durch Filtration wurde die resultierende Lösung zu je 2,5 ml in Fläschchen abgefüllt und dann lyophilisiert, so daß eine tPA-Zubereitung erhalten wurde. Diese tPA-Zubereitung konnte erneut in einer 5% Glucose-Infusion oder in destilliertem Wasser für die Injektion gelöst werden.

Beispiel 6

tPA 100 mg
Heparin (Natriumsalz) 10 mg
Laktose 500 mg
Diese Zutaten wurden in 25 ml einer 5 mM Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,0) gelöst. Nach der Sterilisation durch Filtration wurde die resultierende Lösung zu je 2,5 ml in Fläschchen abgefüllt und dann lyophilisiert, so daß eine tPA-Zubereitung erhalten wurde. Diese tPA-Zubereitung konnte erneut in einer 5% Glucose-Infusion oder in destilliertem Wasser für die Injektion gelöst werden.

Beispiel 7

tPA 100 mg
Dextrinsulfat (Natriumsalz) 10 mg
Laktose 500 mg
Diese Zutaten wurden in 25 ml einer 5 mM Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,0) gelöst. Nach der Sterilisation durch Filtration wurde die resultierende Lösung zu je 2,5 ml in Fläschchen abgefüllt und dann lyophilisiert, so daß eine tPA-Zubereitung erhalten wurde. Diese tPA-Zubereitung konnte erneut in einer 5% Glucose-Infusion oder in destilliertem Wasser für die Injektion gelöst werden.

Claims

1. Wässrige Lösung mit erhöhter Protein-Konzentration, umfassend dieses Protein und ein anionisches Polymer oder dessen Salz, wobei die Konzentration des Proteins in der Lösung größer ist als die maximale Konzentration in Abwesenheit des anionischen Polymers, und wobei die Lösung einen pH im Bereich von innerhalb +/- 2 pH-Einheiten vom isoelektrischen Punkt des Proteins und eine Ionenstärke von 0,05 Mol/l oder weniger aufweist.

2. Die wässrige Lösung nach Anspruch 1, bei der das anionische Polymer oder dessen Salz in einem Verhältnis zum Protein, bezogen auf das Gewicht, von 1:40 bis 100:1 vorliegt.

3. Die wässrige Lösung nach Anspruch 1 oder 2, bei der irgendwelche anderen Salze als das anionische Polymer oder dessen Salz in einer Konzentration von 0,1 Mol oder weniger pro 1 mg des Proteins anwesend sind.

4. Die wässrige Lösung nach Anspruch 1 oder 2, bei der das anionische Polymer wenigstens eine Sorte von anionischem Rest aufweist, der aus Carboxyl-, Carboxymethyl-, Schwefelsäure- und Phosphorsäure-Gruppen ausgewählt ist.

5. Die wässrige Lösung nach Anspruch 1 oder 2, bei der das Protein ein physiologisch aktives Protein ist.

6. Die wässrige Lösung nach Anspruch 1 oder 2, bei der der isoelektrische Punkt des Proteins einen pH-Wert von 4 oder mehr aufweist.

7. Verfahren zur Erhöhung der Protein-Konzentration in einer wässrigen Lösung, umfassend die Zugabe eines anionischen Polymers oder dessen Salzes zu dieser Lösung, wobei die Menge dieses anionischen Polymers ausreichend ist, um das Protein in einer Konzentration, die größer ist als die maximale, in Abwesenheit des anionischen Polymers erhältliche Konzentration, zu lösen, und wobei die Lösung einen pH im Bereich von innerhalb +/- 2 pH-Einheiten vom isoelektrischen Punkt des Proteins und eine Ionenstärke von 0,05 Mol/l oder weniger aufweist.

8. Das Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Protein ein physiologisch aktives Protein ist.

9. Das Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der isoelektrische Punkt des Proteins einen pH-Wert von 4 oder mehr aufweist.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein anionisches Polymer oder dessen Salz und ein Protein mit einer geringen Löslichkeit in einem pH-Bereich um seinen isoelektrischen Punkt, wobei die Menge dieses anionischen Polymers ausreichend ist, um eine wässrige Lösung zu erhalten, die das Protein in einer Menge enthält, die größer ist als die maximale, in Abwesenheit des anionischen Polymers erhältliche Menge, und wobei die Lösung einen pH im Bereich von innerhalb +/- 2 pH-Einheiten vom isoelektrischen Punkt des Proteins und eine Ionenstärke von 0,05 Mol/l oder weniger aufweist.

11. Die Zusammensetzung nach Anspruch 10, bei der das Protein ein physiologisch aktives Protein ist.

12. Die Zusammensetzung nach Anspruch 10, bei der der isoelektrische Punkt des Proteins einen pH-Wert von 4 oder mehr aufweist.