CN1050327A - 含蛋白质的水质溶液 - Google Patents

Abstract

含蛋白质的水质溶液，其中借助于向该溶液中加 入一种阴离子聚合物或其盐而可在接近该种蛋白质 的等电点的pH条件下将该蛋白质溶解并达到高浓 度。应用此方法可制备具生理活性蛋白质的药物配 制剂。

Description

本发明涉及含有蛋白质的水溶液、增高蛋白质浓度的方法以及一种蛋白质配制剂，还涉及应用生理活性蛋白质制备临床用药物所用的技术。

在应用蛋白质作为均质组分的场合中，将蛋白质溶解于一种溶剂中是十分重要的。例如，在把一定量的蛋白质从含有该蛋白质的组合物中分离的场合，或在分析所制造的蛋白质的场合，必须保证含有该蛋白质的组合物是均质的。此外，当把蛋白质溶解在水中并作为例如注射液来给药时，该蛋白质必须是完全溶解的。

一般，蛋白质在水质溶剂中的溶解度受该蛋白质表面存在的亲水或疏水性残基的很大影响，也受蛋白质上的电荷很大影响。

当由于在蛋白质表面存在疏水性残基而使该蛋白质只是微溶之时，借助于加入表面活性剂是不可能增高其溶解度的。

另方面，当水质溶剂的pH值接近于要溶解的蛋白质的容易发生等电沉淀作用的等电点时，则借助增高该水质溶剂中盐的浓度和离子强度而增高该蛋白质的溶解度。在此情况下，表面活性剂并不能使该蛋白质的溶解度增高。此外，当水质溶剂的pH值接近于蛋白质的等电点并且盐的浓度很低时，所溶解的蛋白质只能达到较低浓度。因此，为了使溶解的蛋白质达到较高浓度，通常采用的方法可以是使所用的pH值远离其等电点，或者是增高盐的浓度。

但是，在某些情况下，要求不增高盐的浓度并在在靠近等电点的条件下使溶解的蛋白质达到足够高的浓度。实例之一是在患者需要保持盐的摄取量尽可能低的条件下、以近于中性pH的溶液形式将等电点接近中性pH的生理活性蛋白质为患者给药。在此情况下，唯一可行的办法是使用低浓度的蛋白质，或者不可避免地使患者摄取盐，这是在药物活性蛋白质制剂方面亟需解决的重要实际问题。

本发明的目的是提供一种高浓度的蛋白质水质溶液。另一目的是提供一种将蛋白质溶解在水质溶液中达到高浓度的方法。另一目的是提供一种具优良溶解性的蛋白质制剂。

在配制含蛋白质的浓溶液方面，本发明者首次发现当一种蛋白质在适当的pH结合于一种离子交换物质时，该蛋白质与该离子交换物质的结合在盐浓度低时即易发生，还发现因此而可借助于用阴离子残基未取代用于溶解疏水性蛋白质的表面活性剂的疏水性残基而使蛋白质溶解，所依据的是与使用表面活性剂时相同的作用机制。

基于上述的发现，本发明者在进一步的深入研究中，还确定了阴离子聚合物或阴离子聚合物的盐类能产生有利的如上述的效应，从而完成了本发明。

本发明提供一种含蛋白质的水质溶液，其中共存有一种阴离子聚合物或它的盐，提供一种方法使含蛋白质和阴离子聚合物或其盐的水质溶液的蛋白质浓度增高，以及提供含有蛋白质和一种阴离子聚合物或其盐的制剂。

在JPLO236730/1986中披露了一种药物制剂，其中含有一种糖化物即一种类型的阴离子聚合物，例如多硫酸化或多磺化的糖，还含有t-PA（组织型血纤维蛋白溶酶原活化剂）。但其中所披露内容与本发明的技术构思是根本不同的，本发明是要增高蛋白质的溶解度。

本发明提供一种含蛋白质的水质溶液，其中的蛋白质浓度提高到采用常规技术从来未能达到的高浓度，特别是所提供的含蛋白质水质溶液中盐的浓度低，pH值接近其等电点。

按常规方式，为了在接近蛋白质等电点的pH条件下溶解蛋白质，必须（1）显著降低蛋白质浓度，或（2）显著增高盐的浓度。当需要将生理活性的蛋白质以溶液形式在近于该蛋白质等电点的pH值为限制摄取盐的患者给药时，用如此制备的蛋白质溶液是十分不方便的。为了使蛋白质溶解同时不增高盐的浓度，必须选择远离该蛋白质等电点的pH值，即使所选pH值并不适于药物用途例如注射或其他非肠道给药方式，也要那样作。

按本发明则与前不同，可在不增高盐浓度和近于该蛋白质等电点的pH值条件下使蛋白质溶解，于是可以提供盐浓度低和pH接近蛋白质等电点的含该蛋白质的水质溶液。与常规技术相比，本发明提供了具优越性的技术。

本发明特别适用于制备盐浓度低和等电点接近中性的生理活性蛋白质的注射液。

用于本发明的蛋白质实例包括物化简单的蛋白质、结合蛋白质和诱导蛋白质，以及具有较多疏水性基团的蛋白质。本发明特别适用于诸如球蛋白或t-PA等蛋白质，这些蛋白质在接近其等电点的pH条件下溶解度大大降低，实例为等电点远离极酸条件的蛋白质，一般为pH＝4或更高，更多是pH＝5或更高。这些蛋白质可以从自然生物体提取而得，利用化学合成或应用基因重组体DNA技术从各种培养物获得。如上述所得的蛋白质可以在修饰之后应用。这些蛋白质的实例包括γ-球蛋白，例如免疫球蛋白A、G和E，乳球蛋白，尿激酶（Urokinase），前尿激酶（Prourokinaes）以及组织型血纤维蛋白溶酶原活化剂（t-PA）。本发明特别适用于具生理活性的蛋白质。

这些蛋白质可以单独使用，或使用两种或多种蛋白质的混合物，或不同类型蛋白质的混合物。

用于本发明的阴离子聚合物的阴离子残基例如有：羧基、羧甲基、硫酸根以及磷酸根。该等阴离子聚合物的主链例如有糖类如糖醇、纤维素、直链淀粉、氨基酸以及核酸的碱，优选的是分子量为1000至1000000的阴离子聚合物。具有阴离子残基和聚合物主链的阴离子聚合物例如有羧甲基离子交换物质，如羧甲基直链淀粉和羧甲基纤维素;酸性多糖如精氨酸;硫酸粘多糖如硫酸葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸软骨素  A、硫酸软骨素  B、硫酸软骨素  C、硫酸软骨素  D、硫酸软骨素  E、肝素、硫酸角质、硫酸角质素以及硫酸类肝素，酸性多氨基酸如多L-谷氨酸以及核酸。这些阴离子聚合物的盐类可以有钠盐、钾盐、钙盐等等。

这些阴离子聚合物可以单独使用或者两种或多种组合使用。

阴离子聚合物或其盐的优选用量为准备要溶解的蛋白质的1/40（重量/重量）或更多，更好是1/10（重量/重量）或更多，以及100或少于100。若所用阴离子聚合物的量不足，可能达不到所要求的蛋白质溶解量;若其用量过多，可溶解的蛋白质相对量减少，使含蛋白质水质溶液不能有效应用。由于阴离子聚合物及其盐的阴离子残基类型、交换阳离子的能力、分子量等等都互不相同，阴离子聚合物及其盐的用量可以根据要配制的蛋白质的物理性质来决定。

按本发明的含蛋白质水质溶液中该蛋白质的浓度是根据要溶解的那种蛋白质的溶解度而定，并且每种蛋白质各有其独特情况，所以不能一般性规定;但一般可以得到蛋白质浓度0.1毫克1/毫升或更高的水质溶液，因为其溶解度，特别是在近于其等电点的pH值范围的溶解度，要比常规的含相同蛋白质的水质溶液所达到的溶解度高得多。当然，本发明并不排除蛋白质浓度低于此浓度的溶液。实际上，按本发明，即使在稀溶液中也不会发生蛋白质沉淀。按本发明，通常可以制备蛋白质浓度约0.01至10毫克/毫升的蛋白质水质溶液。

在本发明中，该水质溶液的pH值范围并无特别限定。但是，本发明的特征在于在靠近该蛋白质等电点的pH条件下可以在不增高盐浓度的情况下使蛋白质溶解度增高;鉴于蛋白质的等电点大多在弱酸至碱性pH范围，所以当该水质溶液是在弱酸性、中性、弱碱性或碱性pH时，本发明是特别有价值的。特别是，该水质溶液的pH值最好在距离该蛋白质的等电点-2至+2范围内，更好是在-1至+1范围内。

在本发明中，准备配制用的蛋白质的等电点是用电泳法测定的。此外，有一些蛋白质在用电泳法测定时等电点时常不是集中在一个点，而是某一pH范围的带，在此情况下由此pH范围代表其等电点。再者，如果是多于两种的具不同等电点的蛋白质的混合物，由覆盖所有蛋白质的等电点的pH范围代表该混合物的等电点。

按本发明的含蛋白质和阴离子聚合物或其盐的水质溶液的离子强度优选为0.05摩尔/升或更低，更好是0.02摩尔/升或更低，最好是0.01摩尔/升或更低。若离子强度超过0.05摩尔/升，本发明的效果显著下降。这可能是由于该阴离子聚合物的阴离子残基与该蛋白质的相互作用在高离子强度的溶液中被抵消。

另外，除阴离子聚合物或其盐之外的盐的含量优选为低于每1毫克蛋白质0.1摩尔。例如，在NaCl高含量的溶液中，该阴离子聚合物可能被闭锁。

在实施本发明的溶解步骤时，可采取以下方法。首先，在远离该等电点的pH条件下将蛋白质溶解，然后向所得蛋白质溶液中加入含有阴离子聚合物或其盐的溶液，并将其pH值调节到其等电点附近，于是制成蛋白质与阴离子聚合物或其盐共存的溶液。另一个可用的方法是在远离该蛋白质等电点的pH条件下先制备含蛋白质和阴离子聚合物或其盐的水质溶液，然后把该溶液的pH值再调节到接近该蛋白质的等电点。

还有一种方法，先制备含有蛋白质和阴离子聚合物的配制剂，然后把该配制剂溶解。制备此配制剂可采用任何常规方法。例如，在远离蛋白质等电点的pH条件下将蛋白质溶解于稀溶液中，然后向此溶液中加入阴离子聚合物。经过调节pH之后，向该溶液中加入赋形剂或类似物，将所得溶液过滤并分装入小瓶，然后将之冻干而制成注射用药物制剂。另一方式，向蛋白质的水质溶液中加入阴离子聚合物，形成蛋白质与阴离子聚合物的复合物，将pH值调节至该复合物的等电点使所成复合物从溶液中沉淀，将之干燥并在加入配制用添加剂之后将之分装入小瓶，制成制剂。该制剂的蛋白质含量一般为0.01至50%（重量）。

若需要，为防止蛋白质发生聚合和粘附到容器上，向蛋白质溶液或冻干制剂中除加入阴离子聚合物或其盐之外，还可以加入一种表面活性剂如吐温80（Tween80）;一种螯合剂如EDTA以避免金属离子对蛋白质的作用;一种稳定蛋白质生理活性的药剂;以及赋形剂甘露糖醇和乳糖（当采用冻干制剂时是有用的）。

按本发明，可以在接近等电点的pH条件下不必增高盐的浓度或离子强度而可将蛋白质有效地溶解。这一点已超出了常规的溶解蛋白质技术的知识范围，是本技术领域的一项显著进步。溶解效应的机制还未完全明确;但是，可假定当把阴离子聚合物或其盐加入到处于接近其电点的pH的蛋白质溶液中，并且该蛋白质本身的溶解度又是很低，该蛋白质和阴离子聚合物互相作用，特别在低的离子强度条件下，结果使溶解度大幅度增加。

由以下实施例对本发明作更具体说明：

实例1

所用蛋白质是来自人类的组织型血纤维蛋白溶酶原活化剂（t-PA），它的制得是通过基因重组体技术将t-PA的结构基因表达在细胞培养物中，然后将之纯化并从培养液中浓缩。该t-PA是溶解于60mM的磷酸钠溶液中，从其pH值（4.2）来看，可以认为它是磷酸二氢钠。在一个纤维素制的渗析管中放入1毫克t-PA和0至1毫克肝素钙盐，然后加入蒸馏水使其总体积达1.0毫升。用1000毫升1mM的柠檬酸盐缓冲溶液进行渗析3小时。将渗析管中的液体转移到小的聚丙烯试管中，以15000转/分钟离心分离10分钟，然后在280毫微米测量上清液的吸光率来测定t-PA的溶解度。t-PA的等电点约为6.5-7.5。所得结果示于表1，很明显，加入肝素钙之后t-PA的溶解度增高，特别是当其pH值接近于等电点时。

表1

加入的肝素钙盐量^a），毫克

pH  0  0.04  1.0

4.0  0.95  -  0.10

4.8  0.33  -  0.43

5.5  0.03  -  0.56

6.0  0.02  -  0.99

7.0^b）0.04 - 0.99

7.5^b）0.01 0.89 -

8.0  0.03  0.86  -

表内所示为t-PA溶解度，毫克/毫升

a）每1毫克t-PA的加入量

b）pH值相当于t-PA的等电点。

实例2

按实例1的相同方式考察t-PA的溶解度，不同之处是使用表2所示的各种阴离子聚合物和阳离子聚合物来替代肝素，其量为0.1-0.2毫克。该溶液的pH值调节到7左右。结果示于表2。

使用阴离子聚合物时都使t-PA的溶解度大大增高;但是，使用阳离子聚合物时没有一次能使溶解度增高。此外，加入氯化钠甚致达到高浓度，也不能使之得到足够高的溶解度。

表2

添加剂  溶解度

名称  用量

毫克/毫克t-PA  毫克/毫升

无  0  0

阴离子聚合物

多L-谷氨酸（钠盐）  0.1  1.02

DNA（来源于细菌）  0.18  0.99

硫酸葡聚糖（钙盐）  0.1  1.03

肝素（钙盐）  0.1  1.04

硫酸软骨素A（钠盐）  0.1  1.00

硫酸软骨素B（钠盐）  0.1  1.01

硫酸软骨素C（钠盐）  0.1  1.04

精氨酸钠  0.1  1.03

阳离子聚合物

硫酸鱼精蛋白  0.1  0.00

多L-赖氨酸  0.1  0.01

盐

氯化钠  200mM  0.31

实例3

按实例1的相同方式考察t-PA的溶解度，不同之处是在pH约为7的条件下，按表3所示由硫酸软骨素A和硫酸类肝素替代肝素。结果示于表3。

试验表明t-PA的溶解度得到增高，特别是当硫酸软骨素A和硫酸类肝素的用量按t-PA重量计为1/40或更高时。

表3

添加剂  加入量  溶解度

对t-PA的重量比  毫克/毫升

硫酸软骨素A（铀盐）  0  0.00

1/40  0.51

1/20  1.02

3/40  1.03

1/10  1.00

硫酸类肝素（钠盐）  0  0.00

1/40  0.20

1/20  1.06

3/40  1.05

1/10  1.05

实例4

将水质溶液的pH值调节到各该蛋白质（t-PA和β-乳球蛋白）的等电点，并在加入或不加入硫酸软骨素钠盐（其量为每种蛋白质的1/10）的情况下考察蛋白质溶解度。结果示于表4。

表4

蛋白质  t-PA  β-乳球蛋白

等电点  6.5-7.5  5.1

溶解度（毫克/毫升）  5

硫酸软骨素-  0.02  ＜1.06

硫酸软骨素+  0.8  5.8

实例5

t-PA  100毫克

硫酸软骨素钠  10毫克

乳糖  500毫克

将上列成分溶解于25毫升5mM磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）。过滤灭菌后，将溶液分装入小瓶中，分瓶2.5毫升，然后冻干制成t-PA制剂。此t-PA制剂可以溶解于5%葡萄糖输液溶液或注射用蒸馏水中。

实例6

t-PA  100毫克

肝素（钠盐）  10毫克

乳糖  500毫克

将上列成分溶解于25毫升5mM磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）。过滤灭菌后，将溶液分装入小瓶中，每瓶2.5毫升，然后冻干制成t-PA制剂。此t-PA制剂可以溶解于5%葡萄糖输液溶液或注射用蒸馏水中。

实例7

t-PA  100毫克

硫酸糊精（钠盐）  10毫克

乳糖  500毫克

将上列成分溶解于25毫升5mM磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）。过滤灭菌后，将溶液分装入小瓶中，每瓶2.5毫升，然后冻干制成t-PA制剂。此t-PA制剂可以溶解于5%葡萄糖输液溶液或注射用蒸馏水中。

Claims (14)

1、一种水质溶液，其中包含一种蛋白质和一种阴离子聚合物或该聚合物的一种盐。

2、按权利要求1的水质溶液，其中的阴离子聚合物或其盐的存在量按与该蛋白质的重量比率为1∶40或更多。

3、按权利要求1的水质溶液，该溶液的pH范围是在该蛋白质的等电点的-2至+2pH单位的范围内。

4、按权利要求1的水质溶液，该溶液的离子强度为0.05摩尔/升或更低。

5、按权利要求1的水质溶液，其中除所述阴离子聚合物或其盐之外的其他盐类的含量为每1毫克蛋白质0.1摩尔或更少。

6、按权利要求1的水质溶液，其中所述阴离子聚合物具有至少一种类型的选自羧基、羧甲基、硫酸根和磷酸根的阴离子残基。

7、一种使蛋白质水质溶液提高蛋白质浓度的方法，该方法包括将一种阴离子聚合物或该聚合物的一种盐加入到所述溶液中。

8、一种药物组合物，其中包含一种阴离子聚合物或其盐以及一种蛋白质。

9、按权利要求1至6中任一项的水质溶液，其中所述蛋白质是一种具生理活性的蛋白质。

10、按权利要求7的提高水质溶液中蛋白质浓度的方法，其中所述的蛋白质是一种具生理活性的蛋白质。

11、按权利要求8的组合物，其中所述蛋白质是一种具有生理活性的蛋白质。

12、按权利要求1至6中任一项的水质溶液，其中所述蛋白质的等电点是pH值为4或更高。

13、按权利要求7的提高水质溶液中蛋白质浓度的方法，其中所述蛋白质的等电点是pH值为4或更高。

14、按权利要求8的组合物，其中所述蛋白质的等电点是pH值为4或更高。