PT86075B

PT86075B - Proceso para a estabilizacao de composicoes que contem um factor de crescimento de polipeptideo

Info

Publication number: PT86075B
Application number: PT86075A
Authority: PT
Inventors: Amy L Finkenaur
Original assignee: Ethicon Inc
Priority date: 1986-11-05
Filing date: 1987-11-04
Publication date: 1990-11-07
Also published as: DE3781509T2; JPH11255663A; PT86075A; JPS63152324A; DK579787A; DK579787D0; KR880005935A; DE3781509D1; JPH10167980A; SG104292G; JP2988925B2; AU8064187A; AU614941B2; EP0267015A2; MX171861B; CA1322328C; ES2044952T3; JP2942227B2; EP0267015B1; EP0267015A3

Description

A presente invenção refere-se aos meios para estabilizar composições que contêm polipeptídos, e em particular factores de crescimento de polipeptído tais como o factor de crescimento da epiderme.

factor de crescimento da epiderme huma na (EGF) ê um factor de crescimento de polipeptído de 53 aminoácidos com actividade mitogénica para diversas espécies de células, incluindo as células epiteliais e do mesenquima. Têm sido assinaladas variantes do polipeptído EGF humano tais como a gama-urogastrona de 52 aminoãcidos.

factor de crescimento da epiderme apresenta actividade promotora de crescimento da epiderme e

R.

actividade inibidora de secreção do ácido gástrico, sendo por isso, útil como medicamento. Descobriu-se que o factor de cres cimento da epiderme perde actividade biológica na presença de humidade. Isto constitui uma desvantagem porque tal perda de actividade torna impraticável o armazenamento de preparações aquosas de factor de crescimento da epiderme durante longos pe ríodos de tempo. A presente invenção proporciona um meio para reduzir a perda de actividade dos factores de crescimento de polipeptido, incluindo o factor de crescimento da epiderme, na presença de humidade.

A presente invenção proporciona um método para estabilizar as composições medicinais que contenham factores de crescimento, contra a perda da actividade biológica na presença de humidade. 0 método consiste em incorporar nas referidas composições, um polissacarido solúvel em água, tal como um derivado de celulose.

A utilização de composiçoes farmacêuticas e químicas contendo derivado de celulose está descrita na literatura. Por exemplo, Errede e outros, na patente dos Estados Unidos ηθ. 4373519 descreve um revestimento para ferimentos que inclui um produto absorvente tal como o material de celulo se (o qual pode ser carboxi-metil-celulose), em que o revestimento para ferimentos pode conter diversos medicamentos tais como o factor de crescimento da epiderme.

Hess e outros, na patente dos Estados Unidos ηθ. 3923599, descreve formulações de enzimas de plantas que podem englobar um derivado de celulose. Straub, na patente dos Estados Unidos ηθ. 3927209, descreve uma composição pa ra-influênça-3-vírus que pode englobar metil-celulose como agente dispersante. Dworschack e outros, a patente dos Estados Unidos ηθ. 3933588 descreve enzimas imobilizados sobre um derivado de celulose (celulose DEAE) contendo um composto de amónio quaternário como estabilizador. Diehl e outros, na paten te dos Estados Unidos ηθ. 4011169 descreve uma composição detergente contendo enzima, a qual contem um amido aminado ou ce lulose como estabilizador.

Straub, na patente dos Estados Unidos ηθ. 4188375 descreve preparações de vacinas aquosas que podem con2

ter metil-celulose como agente dispersante. Os polissacaridos estão descritos como estabilizadores, mas não está des^ crito o problema de instabilidade para o qual se adicionam os estabilizadores.

Akagi e outros, na publicação da patente europeia n°. 0150067, descreve um interferão gama estabilizado com dextrano ou amido de hidroxi-etilo.

Jacobsen e outros, na patente dos Estados Unidos n°. 4540506, descreve formulações para limpeza de drenos contendo enzimas, as quais podem conter hidroxi-etil-celu lose como espessante.

Arakawa e Timasheff, em Biochesmistry 1982, Vol. 21, páginas 6536-6544, descrevem a utilização de açúcares para estabilizar proteínas em meio aquoso. Gekko, K. e outros, descrevem em J. Biochem (1918) 90 : 30 - 60, que os álcoois de açúcar tais como o glicerol, sorbitol e manitol sao agentes estabilizadores para as proteínas.

A publicação da patente europeia n2. 140998 descreve uma preparação oftálmica contendo o factor de crescimento da epiderme humana e um diluente tal como uma solu ção tampão ou uma base de unguento. A preparação está descrita como sendo eficaz para curar a ceratite, a erosão da cárnea, a infiltração da cárnea ou as úlceras da cárnea.

SUMÃRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona uma composição medicinal aquosa contendo um factor de crescimento de polipeptido que possui actividade mitogénica humana e um poli£ sacarido solúvel em água suficiente para estabilizar o factor de crescimento de polipeptido contra a perda de actividade biç? lágica. Num aspecto preferencial, o factor de crescimento é o factor de crescimento da epiderme. Ê preferível que o polissacarido seja um polímero de celulose. Um método para estabilizar uma composição medicinal aquosa contendo o factor de crescimento de polipeptido como ingrediente activo consiste em incorporar na composição uma quantidade de polissacarido solúvel em água suficiente para estabilizar o factor de crescimento

contra a perda de actividade biológica na presença de água.

A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica para utilização oftálmica. A composição oftálmica é constituída pelo factor de crescimento da epiderme numa concentração compreendida entre 1,0 e 1000 microgramas/mililitro e um polímetro solúvel em agua, oftalmica mente compatível, para manter a viscosidade compreendida entre 1-5000 centipoise (cps). De preferência a viscosidade estará compreendida entre 1-100 cps. Um método para aumentar a veloci dade para curar um ferimento no olho de um paciente consiste em fazer contactar o ferimento com uma quantidade eficaz para curar ferimentos, de uma composição oftálmica da presente invenção .

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

A presente invenção consiste em proporcio nar composições estabilizadas contendo factores de crescimento de polipeptido, de preferência o factor de crescimento da epiderme (hEGF). 0 factor de crescimento da epiderme (EGF) e hEGF são composições conhecidas isoladas a partir de fontes naturais ou produzidas utilizando técnicas de ADN recombinante. As referências seguintes descrevem o factor de crescimento de epiderme, hEGF, e/ou os processos para os isolar a partir de fontes naturais ou para os produzir a partir de técnicas rADN:

Cambie et al., U.S. Patent n°. 3,917,824 Cohen et al., U.S. Patent n° 3,948,875 Nishimura et al., Patent ηθ. 4,528,186, U.S. Bell, Publicação do pedido de patente PCT WO 85/00369 Urdea etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 7461-7465 (1983)

Hollenberg, Epidermal Growth Factor-Urogastrone, A Polypeptide Acquiring Hormonal Status, Acad. Press, Inc.,

N.Y. (1979) pp. 90-132

Carpenter, Epidermal Growth Factor em: Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 57, Baserga, ed. Lawn et al., Cell (1978) 15: 1157-1174

Savage et al., J. Biol. Chem. (1972) 247:7612-7621

va, factor de crescimento da epiderme engloba a classe de pçj lipeptidos que possui actividade biológica idêntica à apresentada pelo polipeptido do factor de crescimento da epiderme humana natural conforme medida em bio-ensaios reconhecidos, tal como o ensaio de ligação do receptor EGF adiante descrito, e que conservam alguns resíduos de aminoácido e um posicionamen to comum de ligações di-sulfeto, conforme o estudo de Carpen ter e outros em Epidermal Growth Factor, Its Receptor, and Re lated Proteins, Experimental Cell Research 164, (1986) 1-10. Deste modo, factor de crescimento da epiderme engloba o hEGF produzido pelas técnicas de ADN recombinante descritas por Bell, obra anteriormente citada, o EGF de rato (mEGF) isolada a par tir das glândulas submaxilares do rato (ver por exemplo Cohen e outros, obra anteriormente citada), o EGF da ratazana, e o factor de crecimento da epiderme humana natural, o qual se pode isolar a partir da urina humana conforme descrito por Nishi. mura e outros, obra anteriormente citada, e derivados bioactivos e polipeptidos relacionados, de qualquer dos factores atrás referidos, incluindo os percursores que são transformados em factor de crescimento da epiderme activo in situ por processamento proteolítico. Para utilização na presente invenção é pre ferível o factor de crescimento da epiderme humana, incluindo o hEGF produzido por técnicas de ADN recombinante.

O factor alfa de crescimento transformante (TGF-ck), um polipeptido de 50 aminoácidos, e o factor de crescimento de vírus de vacina (VGF), um polipeptido de 140 aminoácidos, são ambos mitogénicos e possuem uma substancial ho mologia de sequência em relação ao factor de crescimento da epiderme e pensa-se que os três se ligam e activam um receptor de tirosina-quinase comum. Devido à sua natureza polipeptidica, actividade mitogénica e substancial homologia de sequência entre estas moléculas, verifica-se que o TGF-X e VGF também podem ser estabilizados na composição da presente invenção. Adicionalmente, prevê-se que qualquer outro factor de crescimento do polipeptido que possua actividade mitogénica também será estabilizado na composição da presente invenção.

Esses factores de crescimento de polipeptido englobam o factor de crescimento de fibroblasto alcalino (b-FGF), o factor de crescimento de fibroblasto ácido (a-FGF), o factor beta de crescimento transformante (TGF-B), angiogenina, factor de crescimento do nervo (NGF), factor I de crescimento semelhante à insulina (IGF-I), factor II de crescimento semelhante à insulina (IGF-II) e factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF). Os factores de crescimento de fibroblastos e a angiogenina, assim como os factores de crescimento transformante e o factor de crescimento da epiderme, também possuem actividade angiogénica. Ê preferível que o factor de crescimento seja pre parado por técnicas de ADN recombinante. Conforme se utiliza aqui, a frase factor de crescimento não engloba os designados factores de crescimento hematopoiéticos tais como a eritropoie tina e os factores estimulantes de colónias.

Os polissacaridos solúveis em água que se podem utilizar na presente invenção englobam os derivados de celulose, amido, agar, ácido alginico, goma arábica, dextranos, fructanos, inulina,mananos,xilanos,arabinanQsphitosanos, glicogêne os e glucanos. Ê preferível utilizar derivados de celulose.

Os estabilizadores de celulose que se uti lizam na invenção são derivados de celulose eterificados solúveis em água tais como alquil-celuloses, hidroxi-alquil-celu loses e alquil-hidroxi-alquil-celuloses, por exemplo metil-celulose, hidroxi-etil-celulose, carboxi-metil-celulose, hidroxi -propil-metil-celulose, e hidroxi-propil-celulose. São preferi veis os derivados de metil-celulose e de hidroxi-alquil-celul<> se tais como hidroxi-propil-celulose, hidroxi-etil-celulose e hidroxi-propil-metil-celulose.

A solubilidade dos derivados de celulose determina-se pelo grau de substituição (G.S.) dos grupos éter, e os derivados estabilizadores úteis na presente invenção deverão possuir uma quantidade suficiente de tais grupos éter por unidade de anidroglicose na cadeia da celulose para tornar os de rivados solúveis em água. Geralmente é suficiente um grau de substituição de grupos éter (g.S.) de pelo menos 0,35 grupos éter por unidade de anidroglicose. Em adição, os derivados de celulose podem estar na forma de sais de metal alcalino, por exemplo, sais de Li, Na, K ou Cs.

As composições estabilizadas e as formulações oftálmicas da presente invenção podem conter outros factores de crescimento de polipeptido em mistura com o EGF. Em particular, o EGF pode combinar-se com um ou vários dos factores seguintes; factor de crescimento de fibroblastos alcalinos, factor de crescimento de fibroblastos ácidos, factor beta de crescimento transforman te, factor alfa de crescimento transformante, factor de cresci, mento de vacina, angiogenina, factor de crescimento dos nervos, factor de crescimento semelhante a insulina e factor de cresci mento derivado das plaquetas. Do mesmo modo, as composições e formulações podem conter um ou vários polissacaridos solúveis em água para estabilizar os factores de crescimento contra a perda de actividade biológica.

As composições que são estabilizadas de acordo com a presente invenção contêm um factor de crescimento de polipeptido, tal como o EGF, quer numa composição medicinal aquosa tal como um gel, solução, suspensão, quer numa dispersão, em que se dissolve uma quantidade eficaz do polissacarido solúvel em água, tal como um derivado de celulose. A quantidade exacta do polissacarido que se utiliza nos casos específicos variará de acordo com factores tais como a presença ou ausência de outros materiais na formulação, a natureza específica do factor de crescimento particular utilizado, a concentração do factor de crescimento, o tipo de formulação e semelhantes.

Expressa em termos de uma formulação aquosa contendo EGF (quer se trate de uma formulação inicial ou de uma formulação que tenha sido reconstituída após desidratação) e um derivado de celulose, a quantidade eficaz desse deri. vado de celulose será normalmente de pelo menos 0,05% em peso, com base no peso da composição global. A quantidade máxima uti. lizada não é crítica e será parcialmente determinada pelo tipo de formulação. Por exemplo, uma formulação aquosa de gotas para os olhos utilizará normalmente uma quantidade de derivado de celulose compreendida entre cerca de 0,05 e 3% em peso. Num gel, em que se pode utilizar uma quantidade de água relativamente pequena, o derivado de celulose pode ser o constituinte principal de formulação, e em alguns casos, pode ir por

exemplo até 90Z em peso de formulação. Ê preferível que o derivado de celulose numa formulação de gel esteja compreendido entre 1-20Z em peso. 0 factor importante consiste em utilizar pelo menos a quantidade mínima de derivado de celulose que possua o efeito estabilizador.

As composições estabilizadas da invenção são úteis em formulações de gotas para os olhos, bálsamos para curar feridas, formulações de gel, espumas e semelhantes. Nas composições estabilizadas da presente invenção podem utilizar-se materiais adicionais tais como tampões, conservantes, agentes para ajustar a tonicidade, anti-oxidantes, outros polímeros (utilizados por exemplo para ajustar a viscosidade ou como expansores), e excipientes. Os exemplos ilustrativos específicos de tais materiais englobam os tampões de fosfato, ci trato, ou borato, timerosal, ácido sórbico, metil-ou propil-pa rabens, e conservantes de cloro-butanol, cloreto de sódio e/ou açucares para ajustar a tonicidade, álcool polivinilico, ácido poliacrilico ou os seus sais, polivinil-pirrolidona, manitol, lactose, sacarose, etileno-diamina, ácido tetra-acético e semelhantes .

A concentração do factor de crescimento na composição estabilizada da presente invenção constitui uma quantidade eficaz para curar ferimentos compreendida entre cerca de 0,01 e 1000 microgramas por mililitro de formulação aquosa (isto é, quer se trate da formulação aquosa inicial quer de uma formulação que tenha sido reconstituída após desidratação) . De preferência, a concentração do factor de crescimento é de 1-500 microgramas/mililitro e mais preferencialmente está compreendida entre 1-100 microgramas/mililitro.

Os produtos que podem incluir o estabilizador de polissacarido da presente invenção para estabilizar uma preparação de factor de crescimento englobam as gotas para os olhos, os geles para os olhos, os cremes para os olhos, as formulações de lipossoma ou de micela, hidrogeles e cremes para curar ferimentos tais como os utilizados no tratamento de queimaduras, veículos aquosos para embeber revestimentos de gaze, revestimentos para queimaduras, pele artificial, reves timentos de suturas e produtos para indicações gastrointestinais, tal como se utiliza para inibir a secreção do ácido gástrico.

Outro produto que pode englobar a composi. ção da presente invenção é uma formulação de leite humano. A formulação de leite humano pode utilizar-se como um substitu to para o leite da mãe para alimentar crianças. Sabe-se que o leite humano contem elevadas concentrações de EGF (Read, L.C. e outros, Ped. Res. 18: 133-139 (1984). Também se sabe que o EGF humano recombinante não se distingue do EGF que ocorre naturalmente em leite materno (Read, L.C. e outros, J. Endocrin. 109: 245-250 (1986). Acredita-se que o EGF presente no leite materno estimula o crescimento das células da criança e a sua diferenciação.

Admite-se que se possa preparar um suplemento de leite dietético ou um substituto do leite materno para crianças incorporando do EGF humano derivado recombinante numa formulação de leite materno. A formulação pode apresentar-se na forma líquida ou em pó seco. Se estiver na forma líquida, a formulação é estabilizada pelos estabilizadores da presente in venção. A concentração de EGF numa formulação líquida pode estar compreendida entre 0,01-100 microgramas/mililitro, de preferência entre 0,1 e 10 microgramas/mililitro. A formulação também pode conter quantidades nutritivas de proteína, hidra tos de carbono e gorduras. A proteína deve ser susceptível de proporcionar os 20 aminoácidos essenciais para a nutrição huma na. A proteína pode derivar de leite de vaca, por exemplo ca seína, ou pode obter-se a partir de grãos de soja.

As composições aquosas da presente invenção podem utilizar-se em métodos para tratar ferimentos. Tais métodos consistem em incorporar a composição aquosa estabiliza da numa formulação de creme ou em embeber uma compressa normalizada com uma solução aquosa, e depois aplica-se o creme ou a gaze embebida ao local do ferimento, tal como uma queimadura, ferimento local do doador, úlcera ou qualquer tipo de ferimento cutâneo. Em adição as suturas podem ser revestidas ou embebidas com as composições aquosas estabilizadas e utilizadas para fechar uma ferida aberta.

A presente invenção proporciona uma formulação oftálmica estável contendo EGF. 0 EGF está presente na formulação oftálmica numa concentração compreendida entre cerca de 1 e 1000 microgramas/mililitro. Ê preferível que a concentração de EGF esteja compreendida entre 10-500 microgra mas/mililitro e mais preferencialmente que a concentração esteja compreendida entre 1-100 microgramas/mililitro. Adiciona^ mente a formulação contem um polímero solúvel em água, oftalmicamente compatível, para manter a viscosidade de formulação compreendida entre 1-1000 cps. A viscosidade da formulação dependerá do polímero, da concentração do polímero do sistema solvente e da velocidade de corte. A manipulação desses factores pode ser realizada facilmente para se conseguir a viscosidade desejada. A viscosidade pode medir-se com um viscosimetro de Brookfield, o qual mede a força necessária para cortar” um líquido. 0 método de Brookfield permite as interacções en tre polímeros (por exemplo, os entrelaçamentos de cadeia) e utiliza-se normalmente para medir a viscosidade de soluçoes de polímeros viscosas em que as interacções entre polímeros desem penham uma função significativa na viscosidade observada. Os resultados de tal medição apresentam-se normalmente como uma dada velocidade de corte (segundos^-^). Quando a velocidade não está especificada para o valor de viscosidade admite-se geralmente que a velocidade tenha sido extrapolada para 0 (zero). Foi o que se fez com os valores 1-1000 cps aqui representados. Os valores de viscosidade aqui referidos consideram-se à temperatura ambiente, por exemplo, 22-252C.

É importante utilizar concentrações eleva das de EGF na formulação oftálmica porque as soluções aquosas simples que contém EGF são rapidamente drenadas através do canal nasolacrimal quando colocadas no olho de um paciente. A utilização de uma concentração elevada de EGF aumenta o tempo de permanência de uma concentração eficaz do EGF no local do ferimento no olho. Do mesmo modo, a utilização de polímeros para aumentar a viscosidade da formulação aumenta o tempo de permanência ou o tempo de contacto do EGF no olho reduzindo a velocidade de drenagem.

Os polímeros para aumentar a viscosidade podem ser um ou vários dos polissacaridos estabilizadores da presente invenção ou podem ser outros polímeros oftalmicamente compatíveis e s£ lúveis em água que possuam propriedades para melhorar a visco sidade. Quando se utiliza um derivado de celulose para propor cionar uma viscosidade compreendida entre 1-5000 cps, o peso molecular deverá estar compreendido entre 80000 e 240000.

polímero pode estar presente na formula ção com uma concentração aproximada entre 0,057 e 3,07 (p/v). Pode utilizar-se qualquer polímero oftalmicamente compatível e solúvel em água que seja susceptível de manter a viscosidade da formulação no intervalo compreendido entre 1-1000 cps. Os polímeros adequados englobam os polissacaridos tais como os derivados de celulose, polímeros de vinilo tais como o álcool polivinilico e polivinil-pirrolidona, poli-aminoácidos, tais como poli-lisina, e polietileno-glicol. Ê preferível que o polímero seja um dos derivados de celulose estabilizadores da presente invenção e adicionalmente pode conter álcool polivini lico ou polivinil-pirrolidona. Contudo, se se pretender estabi. lizar a formulação contra a perda de actividade biológica, então o polímero deverá ser um dos polissacaridos estabilizado res da presente invenção.

A formulação oftálmica pode conter adici£ nalmente um conservante, numa concentração compreendida entre 0,00027 e 2,57 (p/v) aproximadamente. Os conservantes adequados são o timerosal (0,00027 - 0,017), o ácido sórbico (0,05 - 2,57), cloro -butanol (0,05 - 0,67), e EDTA (0,01 - 0,17).

A formulação oftálmica também pode conter um ou vários expansores solúveis em água para liofilização, com uma concentração de 0,1-6,07 (p/v) aproximadamente.

Os expansores adequados são o manitol, sacarose, lactose e gli cina. Uma vez que o EGF não cristaliza e não aglomera bem por si próprio na forma liofilizada, devem adicionar-se os expansores no sentido de aumentar a aglomeração do EGF liofilizado numa massa sólida.

A formulação oftálmica também pode conter um tampão para manter o pH da solução oftálmica entre 5,0 e

8,0 aproximadamente, de preferência entre 7,0-8,0. Os tampões adequados são os seleccionados entre o grupo constituído por tampões de fosfato, tampões de citrato, tampões de borato e tampões de acetato.

Um ingrediente opcional para a formulação oftálmica é um agente de tonicidade para tornar a solução aquo sa isotónica e isosmótica. 0 agente de tonicidade pode estar presente numa concentração atê 1,8 % (p/v) aproximadamente. Os agentes de tonicidade adequados são os cloretos, tais como o cloreto de sódio, e o cloreto de potássio. Os expansores atrás referidos tais como o manitol também podem funcionar como agentes de tonicidade para além de serem expansores e por isso o agente de tonicidade pode ser omitido da formulação e pode adicionar-se mais expansor para se conseguir o desejado efeito de tonicidade. Um método para aumentar a velocidade de cura de um ferimento num olho de paciente consiste em fazer contactar o ferimento com uma quantidade eficaz para curar ferimentos de uma formulação oftálmica da presente invenção. Os pacientes adequados são os primatas, tais como o homem. A formulação oftá_l mica pode utilizar-se na forma de gotas para os olhos para aumentar a velocidade de cura e a maturação das células do epitélio da córnea. A formulação também se pode utilizar para estimular o crescimento das células do mesotélio no olho.

A aplicação tópica da formulação oftálmica em gotas para os olhos pode utilizar-se para o tratamento de epiceratofacite, úlceras da córnea, ceratotomia radial, transplantações da córnea e outros ferimentos induzidos cirurgicamente no olho.

No Exemplo I apresentado a seguir, determinou-se a actividade biológica das formulações aquosas de fac tor de crescimento da epiderme estabilizadas e não estabilizadas, pelo método de ensaio de ligação ao receptor, de Savage e outros, Analytical Biochem., 111, páginas 195 e seguintes (1981). Em alternativa, a estabilidade também se pode medir por qualquer método de HPLC adequado. Resumidamente, o procedimento de ensaio de ligação ao receptor consiste no seguinte:

ensaio de ligação ao receptor baseia-se na capacidade do EGF humano para competir com o factor de

125 crescimento da epiderme do rato marcado com I para ligaçao

dos sítios em células humanas. A ligação efectuou-se em monocamadas confluentes de células A431 de carcinoma da epiderme humana fixas em formalina [Ref. - Fabricant et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 74, p. 565 (1977), Haigler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 75, p. 3317 (1978), e Ullrich et al., Nature, Vol. 309, p.418 (1984)] as quais possuem 10-5° vezes mais receptores de EGF à sua superfície do que a maioria dos outros tipos de células. Utilizou-se o factor de crescimento da epiderme de rato marcado obtido em Amersham.

Utilizaram-se pratos múltiplos contendo uma diversidade de reservatórios. Cada reservatório tinha liga da ao fundo uma monocamada confluente de células A431 de carci noma da epiderme humana fixas em formalina. Primeiro adicionou -se a cada reservatório 80 microlitros de diluente PBS (solução salina tamponada com fosfato contendo 0,1% em peso de albumina de soro de bovino e glicina 0,2 M) contendo o factor de cresci, mento de epiderme conhecido normalizado, a amostra a ensaiar, ou um elemento de controlo que não continha o factor de cresci mento da epiderme. Utilizou-se normalmente as diluições em série dos reagentes normalizados e da amostra. A seguir Adicio - 125 nou-se a cada reservatório 20 microlitros de I-EGF de actividade e concentração em PBS conhecidas. (Ê importante que as adições de reagente sejam feitas na sequência apresentada). Taparam-se os reservatórios e fez-se a sua incubação a 37°C du rante cerca de 1-1/ 4 a 2-1/2 horas.

Fez-se a aspiração da mistura de reação de cada reservatório para eliminar o líquido, lavou-se cada re servatório duas vezes com PBS, e eliminou-se o líquido de lava gem. Adicionou-se a cada reservatório uma centena de microli tros de NaOH 0,1 N, e 1% em peso de dodecil-sulfato de sódio. Fez-se a incubação dos reservatórios a 372C durante 10 minutos e depois transferiu-se as amostras individualmente para fras cos de um contador de raios gama. Colocou-se o frasco com a amostra no contador de raios gama e fez-se a contagem dos raios gama durante 1 minuto. Em alternativa é possível utilizar pra- 13 -

tos múltiplos contendo reservatórios removíveis, e nesse caso, remove-se o próprio reservatório e coloca-se no contador de raios gama para contagem.

Num gráfico do tipo log-log registam-se as contagens de uma diluição de série de um EGF normalizado conhecido recentemente preparado, em função da concentração de EGF, apresentando-se as contagens por minuto no eixo dos Y e a concentração no eixo dos X. As contagens por minuto são inversamente proporcionais à concentração do factor de crescimen to de epiderme conhecido. As curvas encontradas para as amos tras desconhecidas em diluições conhecidas compararam-se com a curva resultante para um padrão conhecido recentemente prepa rado para se determinar a concentração do EGF activo (em micro gramas por mililitro) em cada amostra desconhecida. Os valores obtidos a partir dos duplicados e das diluições de série foram ponderados para melhorar a precisão.

EXEMPLO 1

Estudos de Estabilidade

Os polímeros com o grau de pureza farmacêutica obtiveram-se nas fontes seguintes:

Alcool-polivinilico - Gelvatol 40/20 - M.onsanto (PVA) } Metilcelulose - Methocel A4M - Dow (MC)

Hidroxi-propil-metil-celulose - Methocel E4M-Dow(HPMC) Polivinil-pirrolidona - Plasdone C15 - GAF (PVP)

Prepararam-se quatro soluções de polímeros para proporcionar viscosidades idênticas às correntemente utili zadas nas formulações oftálmicas. As solucções também continham 0,01Z em peso de timerosal para inibir o crescimento bacteriano e 0,9% em peso de NaCl para as tornar isotónicas. As soluções foram filtradas através de um filtro de polissulfona de 0,2 micra para as esterilizar. As soluções filtradas armazenaram-se em frascos de vidro esterilizados. Adicionou-se a cada fra_s co factor de crescimento da epiderme produzido conforme descri • to por Bell, W0 85/00369, para proporcionar uma solução de 12 microgramas por mililitro. Também se utilizou duas soluções para controlo; uma continha o factor de crescimento da epider me em água pura destilada, e a outra continha o factor de cre£ cimento da epiderme em água destilada contendo apenas o timerc) sal mais NaCl. A Tabela 1 apresenta as concentrações e viscosi dades intrínsecas a 252C para as quatro soluções de polímeros. Utiliza-se a viscosidade intrínseca para definir a viscosidade de uma solução diluida e normalmente mede-se num viscosimetro de Ubbelohde. A viscosidade intrínseca depende do peso molecular do polímero e do solvente.

Tabela 1

Viscosidade

Polímero__Concentração, % em peso intrínseca, dl/gm

PVA	1.4	0.24
MC	0.25	6.86
HPMC	0.25	6.20
PVP	1.4	0.16

As actividades do factor de crescimento da epiderme das seis soluções determinaram-se pelo procedimen to de ensaio de ligação ao receptor atrás descrito, para as soluções recentemente preparadas, e após 6, 21 e 48 dias de preparação . As soluções foram armazenadas durante o ensaio em frascos a 372C.

A Tabela 2 seguinte apresenta actividades (expressas em microgramas de factor de crescimento da epiderme activo por mililitro) para as seis soluções, preparadas como anteriormente e com 6, 21, e 48 dias de intervalo, e a percentagem remanescente de actividade original decorridos 48 dias.

Tabela 2

Actividade de ligação ao Receptor

Z de actividade original, decorri

Solução	actividades	dos 48 dias
Água	Dia 0 Dia 6 Dia 21 Dia 48 10.6+1.0 10.5+1.5 10.6+1.2 6.6+0.5	62

Timerosal/

NaCl	12.3+0.7	15.3+4.0	12,8+1.2	6.8+2.1	55
PVA	16.1+3.5	14.3+1.1	4.3+2.4	7.6+0.4	47
MC	18.6+5.0	12.3+2.3	-	16.8+0.6	90
HPMC	17.4+6.0	-	-	21.4+4.0	100
PVP	12.3+4.0	10.9+0.1	6.1+0.02	5.0+1.4	41

Alguns polímeros originaram que os valores de concentração de EGF medidos fossem artificialmente ele vados. Portanto, os valores de concentração nao deverão ser comparados entre polímeros diferentes. Os valores de concentra ção devem comparar-se entre o Dia 0 e o Dia 48 para cada polímero individual. Conforme pode concluir-se pelos resultados anteriormente apresentados, as soluções aquosas de factor de crescimento da epiderme que contem os dois derivados de celulose não perdem nenhuma da sua actividade biológica (no inter valo do erro experimental admissível) após armazenagem decorridos 48 dias, ao passo que outras perdem aproximadamente metade da sua actividade biológica decorridos o mesmo período de tempo.

EXEMPLO 2

Avaliação das Formulações de EGF Oftálmicas nos Primatas

Este exemplo demonstra o efeito do EGF humano para acelerar a regeneração epitelial das córneas dos primatas. A formulação de teste utilizada continha EGF humano produzido por métodos recombinantes (Chiron Corp., Emeryville, CA) numa concentração de 100 microgramas/mililitro.

A formulação utilizada preparou-se a pH 5,5 com cloro-butanol (Clorobutanol 8A) como conservante e com a formulação seguinte:

Ingredientes 7»(p/v)

NaCl0.46

Cloro-butanol0.50

Ácido cítrico0.26

Citrato de Na (H20)0.57

Manitol1.0

HPMC0.25

Água100

Utilizaram-se três primatas fêmeas adultas Macaca fascicularis pesando entre 5 e 7 kilogramas. A estrutura anatómica das córneas dos primatas e humanas é bas_ tante idêntica, constituindo os primatas um modelo bem aceite para os estudos de regeneração epitelial.

Cada animal foi anastesiado com cetamina (5 mg/lb) e Rompum (1 mg/lb). Também se lhes administrou sulfa to de atropina (0,5 mg/lb) para reduzir a salivação. Inseriu-se no olho um espelho de pálpebra e ligou-se ã córnea um trépano de vácuo em aço inoxidável com 8 mm de diâmetro. Encheu-se a parte central do trépano com n-heptanol, durante 45 segundos, para se remover o epitélio. Depois removeu-se o n-heptanol por aspiração e irrigou-se a córnea com 30 ml de uma solução salina tamponada com fosfato. Removeu-se o epitélio até ao limbo limpando suavenhrate a superfície com um aplicador de ponta en volvida em algodão. A remoção epitelial foi confirmada por qo loração com fluorescina. Os animais foram tratados com duas gotas de solução quatro vezes por dia, ãs 09:00, 12:00, 1300 e 18:00 horas. 0 olho esquerdo serviu como controlo e apenas recebeu veículo (isto é, todos os ingredientes excepto EGF) enquanto o olho direito recebeu veículo contendo EGF. Os primatas foram anestesiados diariamente conforme atrás descrito e as suas córneas foram coradas com fluorescina e depois fotografadas com película de côr para diapositivos.

A amplitude da regeneração epitelial mediu-se por planimetria assistida por computador de projecções ampliadas dos diapositivos de côr utilizando o programa Sigma-Scan exprimindo-se o resultado como a percentagem de cada córnea que foi re-epitelizada. Fez-se a análise da significância estatística dos resultados através de um teste T duplo. Humanamente fez-se a eutanásia dos primatas no fim da experiên cia e as suas córneas foram submetidas a um processamento histológico de rotina.

Os resultados da planimetria assistida por computador dos diapositivos de cór ampliados, apresentam-se na Tabela 3. Conforme pode observar-se, a formulação proporcionou uma área acrescida de regeneração epitelial 24 horas após o ferimento. A análise estatística dos resultados ao fim de 24 horas utilizando um teste T duplo de um ramo indicou um pequeno valor de p tal que 0,10>p>0,05. 0 primata ηθ. 11316 apresentou uma ligeira inversão da área epitelizada entre as 48 e as 72 horas (de 92,5% para 88,2%) a qual recuperou até a um defeito evidente nas 24 horas seguintes.

A avaliação histológica das córneas dos primatas n°s. 11314 e 10668 tratados com a formulação que continha EGF revelou um epitélio contínuo e espesso com camadas de espessura de 5-7 células aproximadamente. As células consti tuintes da camada basal eram cuboides e compactas. As células sobrepostas à camada basal apresentaram estratificação progressi^ va do epitélio escamoso. Por comparação, as córneas de controlo destes primatas tinham um epitélio muito rarefeito, aproximadamente 2-3 células de espessura com camada basal de algum modo enfraquecida e largamante espaçada e fraca estratificação das células sobrejacentes. 0 aspecto das duas córneas do prima ta nQ. 11316 era idêntico às córneas de controlo dos primatas n2s. 11314 e 10668.

Deste modo, facilmente se conclui que o tratamento dos defeitos epitêliais da córnea com formulações que contenham EGF acelerou antecipadamente a velocidade de regeneração epitelial relativamente ã comparação feita com o veí culo. Do mesmo modo, o aspecto histológico do epitélio regene rado foi superior ao das córneas tratadas com EGF. Deste modo, a formulação de EGF melhora simultaneamente a velocidade e a qualidade do epitélio regenerado neste modelo de primata.

Tabela 3

Planimetria assistida por Computador das Ãreas

Macaco	Re-epitelializadas a partir de fotografias
olho	0 Hr.	24 Hr.	48 Hr.	72 Hr.	96 Hr.
11314	E	0	49.5	90.4	100	100
	D	0	59.3	94.4	100	100
11316	E	0	31.4	75.6	96.2	100
	D	0	50.5	92.5	88.2	97.1
10668	E	0	48.6	88.1	95.2	100
	D	0	50.1	83.1	96.3	100

EXEMPLO 3

Para além da formulação de cloro-butanol 8A referida do exemplo 2 também se prepararam duas formulações diferentes.

A formulação 6 preparou-se a pH 7,0 e contem timerosal como conservante.

Ingredientes

NaCl

Timerosal

EDTA

NaH2P04.H20

Timecosal 6A I (p/v)

0.51%

0.004

0.1

0.18

Ingredientes

Timerosal 6A (p/v)

Na2H.P04. 7H200.54

Kanitol1.0

Hidroxi-propilo0.25

Metil-celulose E4ií

Água100

A formulação 7 preparou-se a pH 6,65 e contem ácido sórbico como conservante.

SórbiQO , 7A l (p/v)

NaCl0.50

Ácido sórbico0.20

EDTA0.1

Ácido cítrico0.26

Citrato de Na (2H20)0.57

Manitol1.0

HPííC0.25

Água100

A estabilidade das três formulações diferentes determinou-se durante um período de 292 dias para quatro temperaturas diferentes. Os resultados apresentam-se na Tabela 4.

TABELA 4

ESTABILIDADE DAS FORMULAÇÕES OFTÁLMICAS

A concentração de EGF destas amostras ajustou-se para 10 microgramas/mililitro.

TEMPO (DIAS)

Formulação	0	15	30	93	124	292
Timerosal - 6A
4C	7.68	8.54	10.1	8.5	10.2	9.4
22C	11	8.76	10.1	7.0	8,0	-
37C	Π	8.82	8.8	3.8	-	-
45C	Π	6.88	6.3	ND	-	-
Sorbico - 7A
4C	7.53	10.0	8.6	7.1	6.9	3.2
22C	11	6.72	7.4	4.1	-	-
37C	1!	4.94	5.2	ND	-	-
45C	11	3.12	2.7	ND	-	-
Cloro-butanol -	8A
4C	7.49	10.24	11.3	7.7	9.9	9.3
22C	II	8.14	9.8	2.6	-	-
21C	11	6.28	7.0	2.3	-	-
45L	Π	4.45	3.6	2.4	-	-

ND = não detectãvel

EXEMPLO 4

Considera-se contemplado o facto de a for mulação de leite humano poder ser preparada por incorporação de EGF humano produzido por um processo recombinante. Tal formulação pode preparar-se na forma líquida ou na forma de um pó seco. Na forma líquida é desejável que incorpore os estabiliza dores polissacaridos solúveis em água, da presente invenção, para estabilizar o EGF contra a perda de actividade biológica. Os estabilizadores aumentarão o tempo de armazenamento da formulação de leite humano.

A formulação contem qualquer dos ingredientes nutritivos normalmente incorporados no leite ou nos subs_ titutos do leite humano. Tais ingredientes englobam quantidades nutritivas de proteína, carbidratos e gorduras, para proporcionar à criança os aminoácidos e as calorias essenciais. A proteína deverá ser susceptível de proporcionar todos os vin te aminoácidos que são essenciais à nutrição humana. A proteína pode derivar de leite de bovino, por exemplo, caseína, ou de grãos de soja numa formulação livre de proteína animal, quando desejado. Os carbidratos podem emglobar a lactose, ou se for desejável um produto livre de lactose, pode utilizar-se qualquer outro carbidrato adequado, tal como a sacarose ou a frutose.

A formulação também pode englobar quantidades nutritivas de compostos para proporcionar as vitaminas seguintes: A, B, K, E, co, ácido Pantoténico,

Niacina,

Biotina, Colina, e Inositol, ácido Fóli. quer isola damente quer em combinação.

Em adição, a formulação pode englobar quantidades nutritivas de compostos para proporcionar minerais tais como; cálcio, fósforo, magnésio, ferro, iodo, zinco, co bre, manganês, sódio, potássio, ou cloreto, quer isoladamente quer qualquer combinação.

Fez-se a descrição da invenção tomando co mo referência diversos aspectos e exemplos preferenciais. Contudo, uma vez que surgirão ao especialista na matéria varia ções evidentes, não se considera que a invenção fique limitada t

a esses exemplos, mas tão só pelas reinvindicações seguintes.

Claims

REIVINDICAÇÕES _ ia _

Processo para a estabilização de uma composição medicinal aquosa que contem como ingrediente activo um factor de crescimento de polipeptídeo com actividade mitogé nica, caracterizado por se incorporar na referida composição uma quantidade de um polissacarídeo solúvel em água suficiente para estabilizar o referido factor de crescimento contra a perda de actividade biológica na presença de água.

- 2ê -

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o factor de crescimento ser seleccionado do grupo que consiste em factor de crescimento da epiderme, factor de crescimento de transformação, factor beta de crescimento de transformação, factor de crescimento de fibroblasto básico, factor de crescimento de fibroblasto ácido, angiogenina, factor de crescimento de nervos, factor de crescimento derivado de plaquetas ou misturas correspondentes,

- 3ê -

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o factor de crescimento ser um factor de crescimento da epiderme.

_ 4a _

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacarídeo ser um derivado de celulose.

- 5ê -

Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o derivado de celulose referido ser hidroxi propil celulose, hidroxietil celulose, metilcelulose, hidroxipropil metilcelulose e misturas correspondentes.

- 6â -

Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o factor de crescimento da epiderme referido ser um factor de crescimento da epiderme humana.

- 7â -

Processo para a preparação de uma composi ção farmacêutica para utilização oftálmica de acordo com a rei. vindicação 1, caracterizado por se incorporar:

a) um factor de crescimento da epiderme (EGF) numa concentração de cerca de 1 a cerca de 1000 microgramas/ /ml; e

b) um polímero oftalmicamente compatível, solúvel em água para manter a viscosidade compreendida entre 1 e 5000 cps.

- 8â -

Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o polímero estar presente numa concentração de cerca de 0,05% e cerca de 3,0% (p/v).

- 9â -

Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a concentração de EGF estar entre cerca de 10 e cerca de 500 microgramas/ml.

- 10a Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por 0 polímero ser seleccionado entre o grupo que consiste em polissacarídeos, polímeros de vinilo, poli-aminoácidos, polietileno glicol e ácido hialurónico.

- lia 24 - caracterizado por o polissacarídeo ser um derivado de celulo- 12ê Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o polímero de vinilo ser álcool polivinílico ou polivinil pirrolidona.

-13ê -

Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por adicionalmente se incorporar um conservante.

-14§ -

Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a concentração do conservante estar compreendida entre cerca de 0,0002 Z e cerca de 2,5 Z (p/v).

-15â -

Processo de acordo com a reivindicação

13, caracterizado por o conservante ser seleccionado no grupo que consiste em timerosal, ácido sórbico, clorobutanol e EDTA e parabéns.

- 16§ -

Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por adicionalmente se incorporar um agente de tonicidade.

- 17a Processo de acordo com a reivindicação

16, caracterizado por a concentração do agente de tonicidade ser no máximo cerca de 1,8 Z (p/v).

- 18ê Processo de acordo com a reivindicação

16, caracterizado por o agente de tonicidade ser um cloreto.

- 19* -

Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por adicionalmente se incorporar um tampão para manter o pH entre cerca de 5,0 e cerca de 8,0.

- 20 Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o tampão ser seleccionado no grupo que consiste nos tampões de fosfato, de citrato, de borato e de acetato.

- 21* -

Processo para a preparação de um creme ou gel farmaceuticamente compatível,caracterizado por se incorporar uma composição preparada de acordo com a reivindicação 1.

- 22* Processo para a preparação de um revestimento de gase absorvente ou uma sutura caracterizado por os impregnar em composições preparadas de acordo com a reivindica ção 1.

- 23ê -

Processo para a preparação de um substitu to do leite materno caracterizado por se incorporar uma composição de acordo com a reivindicação 1.

- 24* -

Processo para a preparação de um substitu to do leite materno de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por se incorporar o factor de crescimento de epiderme humano recombinante e uma quantidade nutritiva de proteínas susceptível de proporcionar os amino ácidos essenciais para a nutrição humana.

- 25* -

Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a proteína ser derivada de leite bovino.

-26^a Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a proteína ser derivada do feijão de soja.

- 27^a -

Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por se incorporar adicionalmente quantidades nutricionais de hidratos de carbono.

- 28^a -

Processo para a preparação de um substitu to de leite materno liofilizado e/ou em pó caracterizado por se incorporar uma composição preparada de acordo com a reivindicação 1.