KR20050042032A

KR20050042032A - 사이토카인 유도 재료 및 사이토카인 유도 용구

Info

Publication number: KR20050042032A
Application number: KR1020047006523A
Authority: KR
Inventors: 가즈오 신무라; 요시꼬 아베; 기요시 구리야마
Original assignee: 세키스이가가쿠 고교가부시키가이샤
Priority date: 2001-11-02
Filing date: 2002-10-31
Publication date: 2005-05-04
Also published as: EP1449540A1; CN1582167A; RU2004116692A; WO2003037375A1; CA2464889A1; EP1449540A4; US20050013791A1

Abstract

본 발명은 사이토카인 유도 요법 등에 사용되는 사이토카인 유도 재료, 및 유도 용구에 관한 것이다.

구체적으로는 BCG 등의 사이토카인 유도제와, 고분자 재료 등을 포함하는 물에 불용성인 유도 증강제를 포함하는 것을 특징으로 하는 사이토카인 유도 재료, 및 동 유도 재료를 용기 내에 수납하여 이루어지는 사이토카인 유도 용구를 제공하는 것이다. 이 유도 재료를, 예를 들면 혈액 또는 혈액 성분과 접촉시킴으로써 종래와 비교하여 보다 유효한 사이토카인 유도가 실현된다.

Description

사이토카인 유도 재료 및 사이토카인 유도 용구{Cytokine-Inducing Material and Cytokine-Inducing Instrument}

본 발명은 사이토카인 유도 요법 등에 사용되는 사이토카인 유도 재료 및 유도 용구에 관한 것으로, 특히 사이토카인을 효과적으로 유도할 수 있는 사이토카인 유도 재료 및 유도 용구에 관한 것이다.

사이토카인은 여러 종류의 다양한 세포간 정보 전달 인자의 총칭이다. 사이토카인으로서는, 예를 들면 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ (IFN-γ), 인터루킨-1 내지 인터루킨-18, 종양 괴사 인자-α (Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α), 종양 괴사 인자-β (Tumor Necrosis Factor-β), 트랜스포밍 증식 인자-α (Transforming Growth Factor-α), 트랜스포밍 증식 인자-β (Transforming Growth Factor-β, TGF-β), 및 각종 세포 증식 인자 등을 들 수 있다 (임상 면역 제27권 특별 증간호 1995년 "사이토카인의 모든 것" 과학 평론사, 임상 면역 제36권 39-44, 2001년).

사이토카인은 생체 내에서 여러 가지 활성을 가지며, 여러 가지 질환에 관여하는 것이 알려져 있다. 이러한 사이토카인의 활성을 생체 내에서 야기하여 질환 치료를 행하는 사이토카인 유도 요법이 종래부터 행해져 왔다. 사이토카인 유도 요법에서는 환자에게 사이토카인 유도제를 투여하고, 생체 내에서 사이토카인 유도를 야기한다. 이러한 사이토카인 유도 요법에 사용되는 사이토카인 유도 물질로서 여러 가지 물질이 알려져 있다. 예를 들면, 미생물에서 유래된 OK-432, BCG (Bacillus Callete Guerin), 베스타틴, 마루야마 백신, 또는 로무르타이드 등이 알려져 있으며, 담자균류에서 유래된 사이토카인 유도 물질로서 크레스틴, 렌티난 또는 시조피란 등이 알려져 있다.

예를 들면, OK-432나 BCG 등은 혈액 등으로부터 인터루킨-1이나 인터페론-γ 등의 사이토카인을 유도하는 것이 알려져 있다 (기후 대학 의대 리포트 43: 166-177, 1995년, Molecular medicine Vol.36, 임시 증간호, 220-229, 1999년).

상술한 사이토카인 유도 요법에서는 생체 내에서 사이토카인을 유도할 수는 있지만, 충분량의 사이토카인을 유도하는 것이 곤란하여 강한 효력을 발휘하기 어렵다는 문제가 있었다. 또한, 사이토카인을 효과적으로 유도하기 위해 사이토카인 유도제의 투여량이 많아지고 부작용이 커져 치료를 유효하게 행할 수 없다는 문제도 있었다.

일본국ㆍ특허 공개 (소)60-120821호에는 불용성 담체에 자극제가 공유 결합되어 있는 악성 종양 치료용 백혈구 자극재가 기재되어 있다. 또한, 일본국ㆍ특허 공개 (소)61-277628호에는 인터루킨-1, OK-432, 유전자 재조합 인터루킨-2, 또는 γ-인터페론을 불용성 담체에 공유 결합으로 결합하여 이루어지는 암치료용 백혈구 자극재가 개시되어 있다. 이들은 종양 장해성 세포를 유도하는 것으로, 이들 선행 기술에서는 사이토카인 유도에 대해서는 전혀 기재되어 있지 않다.

도 1은 표면 조도를 설명하기 위한 모식도이며, 요철 "피크"를 설명하기 위한 도면이다.

도 2는 표면 조도에서의 요철 평균 간격 Sm치를 설명하기 위한 도면이다.

도 3은 본 발명에 관한 사이토카인 유도 용구의 일례를 나타내는 모식적인 단면도이다.

본 발명의 목적은 상술한 종래 기술의 현상을 감안하여 종래의 사이토카인 유도 요법과 비교하여 보다 유효한 사이토카인 유도 요법을 실현 가능하게 하는 신규한 사이토카인 유도 재료 및 사이토카인 유도 용구를 제공하는 데 있다.

본 발명의 사이토카인 유도 재료는 사이토카인 유도제와 물에 불용성인 유도 증강제를 포함한다.

본 발명자들은 사이토카인 유도제와 함께 물에 불용성인 유도 증강제를 포함하는 사이토카인 유도 재료, 또는 사이토카인 유도제가 고정화된 불용성 유도 증강제를 포함하는 사이토카인 유도 재료가 현저히 높은 사이토카인 유도량을 나타낸다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 사이토카인 유도 용구는 용기와, 용기 내에 수납된 본 발명에 따라 구성된 사이토카인 유도 재료를 갖는 사이토카인 유도 용구이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에서 상기 유도 증강제는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 물에 불용성인 금속, 유기물 또는 무기물 등을 포함하며, 바람직하게는 유기물 재료, 보다 바람직하게는 고분자 재료를 포함한다.

상기 금속을 포함하는 유도 증강제로서는, 금 또는 금 합금, 은 또는 은 합금, 티탄 또는 티탄 합금, 또는 스테인레스 등의 금속을 들 수 있다.

상기 무기물을 포함하는 유도 증강제로서는 활성탄, 유리 또는 유리 유도체, 실리카계 조성물, 알루미나, 히드록시 아파타이트 등을 들 수 있다.

상기 유기물 및 고분자 재료를 포함하는 유도 증강제로서는 셀룰로오스계, 아가로스계, 덱스트란계, 폴리스티렌계, 아크릴에스테르계, 폴리에틸렌 테레프탈레이트계, 나일론계, 폴리비닐알코올계, 폴리술폰계, 폴리아미드계, 폴리아크릴로니트릴계, 폴리에틸렌계, 폴리우레탄계, 폴리프로필렌계, 폴리에스테르계 등을 들 수 있다.

폴리스티렌계 재료로서는 디비닐벤젠-스티렌 공중합체, 아크릴에스테르계로서는 폴리메틸메타크릴레이트 또는 폴리히드록시에틸메타크릴레이트 등을 들 수 있다. 특히, 폴리스티렌계, 아크릴에스테르계, 나일론계, 폴리에스테르계, 셀룰로오스계, 폴리비닐알코올계의 고분자 재료가 바람직하다.

유도 증강제는 무극성이며, 소수성일 수도 있고, 이 경우 유도 증강제로서는 폴리스티렌계 고분자 재료 등을 사용할 수 있다. 또한, 이들 유도 증강제에는 표면 수식 (modification)이나 표면 코팅 등에 의해 표면에 친수성을 부여할 수도 있다.

상기 유도 증강제로서의 형상으로서는 특별히 한정되지 않지만, 섬유상, 부직포상, 스폰지상, 입자상, 막상, 중공사상 등의 공지된 형상을 사용할 수 있다.

유도 증강제의 크기로서는 입자상에서는 50 ㎛ 이상 2 mm 이하인 것이 바람직하고, 섬유상에서는 섬유 직경이 10 ㎛ 이하, 특히 5 ㎛ 이하인 것이 바람직하다. 또한, 섬유상의 경우에는 부직포를 포함하는 유도 증강제가 바람직하며, 특히 섬유 직경이 3 ㎛ 이하인 것이 바람직하다.

특히, 유도 증강제는 백혈구를 흡착하는 재료인 것이 바람직하며, 백혈구 흡착 재료로서 폴리스티렌계, 아크릴에스테르계, 폴리에스테르계, 나일론계, 폴리비닐알코올계 또는 아세트산 셀룰로오스 등의 셀룰로오스계 재료를 포함하는 고분자 재료나 유리계 재료 등을 사용할 수 있다.

또한, 유도 증강제로서 표면 조도가 부여된 재료를 사용하는 것이 바람직하며, 그 중심선 평균 조도 Ra치가 0.2 ㎛ 내지 10 ㎛이고, 요철 평균 간격 Sm치가 5 ㎛ 내지 200 ㎛의 범위에 있는 요철을 표면에 갖는 재료인 것이 바람직하다.

또한, 상기 Ra치란 JIS B0601-1982에 있어서의 중심선 평균 조도이다. 또한, 상기 요철 평균 간격 Sm치는 이하와 같이 정의되는 값이다.

요철 평균 간격 Sm치

현재의 JIS 규격에서는 표면 조도의 높이 방향의 정보에 대해서는 규정되어 있지만, 면 방향의 정보에 대해서는 규정되어 있지 않다. 그러나, 본 발명에 있어서의 요철은 요철의 면 방향에서의 간격에 의해서도 후술하는 실시예로부터 명확하게 한계가 지어져 있다. 따라서, 본 발명에서는 요철 평균 간격 Sm치를 사용함으로써 요철의 면 방향의 범위를 규정하였다.

상기 요철의 평균 간격 Sm치는 이하와 같이 하여 구할 수 있다.

우선, 도 1에 나타낸 조도 곡선 A의 중심선 B에 대하여, 각각 일정한 높이 및 깊이에 해당하는 위치에 상측 카운트 레벨 C 및 하측 카운트 레벨 D를 그린다. 이어서, 하측 카운트 레벨 D와 조도 곡선 A가 교차하는 2점 사이에서 상측 카운트 레벨과 조도 곡선이 교차하는 점이 1회 이상 존재할 때, 하나의 피크로서 "피크"를 정의한다.

그리고, 요철 평균 간격 Sm치는 도 2에 나타낸 바와 같이, 기준 길이 L 사이에 있는 피크의 간격을 Smi라고 했을 때, 하기 수학식 1로 정의되는 값이다.

즉, 요철 평균 간격 Sm치란, 기준 길이 L 사이에 있는 피크들끼리의 간격의 평균치를 나타낸다. 이와 같이 하여 요철의 평균 간격 Sm치에 의해 요철의 면 방향의 조건이 정의된다.

표면 조도는 다공성 등으로부터 유래하는 것일 수도 있다. 유도 증강제로서 바람직한 다공성 고분자 재료로서는 폴리스티렌계, 아크릴에스테르계, 폴리에스테르계, 나일론계, 셀룰로오스계, 폴리비닐알코올계 등을 들 수 있다.

표면 조도는 섬유 형상으로부터 유래하는 것일 수도 있으며, 섬유상 또는 부직포상 재료가 유도 증강제로서 바람직하다. 특히 섬유상ㆍ부직포상 고분자 재료 등이 유도 증강제로서 바람직하며, 폴리스티렌계, 아크릴에스테르계, 폴리에스테르계, 나일론계, 셀룰로오스계, 폴리비닐알코올계 등의 섬유상ㆍ부직포상 고분자 재료를 들 수 있다.

유도 증강제 표면에 Ra치가 0.2 ㎛ 이상인 조도를 부여함으로써 현저하게 사이토카인의 유도가 증강되며, 백혈구의 크기가 10 ㎛ 내지 20 ㎛인 것을 고려하면, 상기 유도 증강제의 Ra치가 0.2 ㎛ 내지 10 ㎛인 것이 바람직하다. 또한, 이 표면 조도의 사이토카인 유도 증강 작용은 백혈구와 비교하여 상기 Ra치가 매우 작기 때문에 단순히 접촉 표면적 증대에 의한 것은 아니라고 여겨진다.

상기 사이토카인 유도제로서는, 예를 들면 BCG, BCG-CWS, PPD, 노카르디아-CWS, OK-432, 무라밀디펩티드 등의 세균류나 그의 성분; PSK, 렌티난, 시조피란 등의 다당류; 또는 폴리 I:C, 폴리 A:U 등의 중합체; 또는 레바미솔, DNCB, 아지멕슨, 티로론, 베스타틴 등의 화학 물질을 들 수 있다. 또한, 상기와 같은 생리 활성 물질로 한정되지 않으며, 균체, 균체 성분, 펩티드류, 핵산류, 단백질, 당 성분, 지질 등의 여러 가지 물질도 사이토카인 유도제로서 사용될 수 있다.

이들 사이토카인 유도제 중에서도 균체 및 그 균체 유래 성분이 사이토카인 유도제로서 바람직하다.

또한, 항산균과 항산균 유래 성분이 사이토카인 유도제로서 바람직하며, 그 중에서도 결핵균이나 결핵균 유래 성분이 사이토카인 유도제로서 특히 바람직하다. 우형 결핵균 약독주 (弱毒株)인 BCG와 그 유래 성분도 특히 바람직하다.

또한, 사이토카인 유도제로서는 용련균 (hemolytic streptococcal)과 용련균 유래 성분이 바람직하다.

또한, 사이토카인 유도제로서는 방선균 (actinomycetes)과 방선균 유래 성분이 바람직하다.

또한, 상기 사이토카인 유도제만으로는 사이토카인 유도능을 충분히 발휘할 수 없는 것이라도, 상기 불용성 유도 증강제와 조합하여 사용함으로써 사이토카인 유도 활성을 발휘시킬 수도 있으며, 따라서 본 발명에서의 사이토카인 유도제로서는 종래부터 사용되고 있는 사이토카인 유도 물질 외에 여러 가지 물질을 사용할 수 있다.

사이토카인 유도제를 유도 증강제 표면에 고정화하는 경우에는 물리 흡착, 공유 결합, 이온 결합 등의 공지된 방법을 이용할 수 있다. 또는, 공유 결합 등의 경우에는, 필요에 따라 사이토카인 유도제와 유도 증강제의 결합부에 임의의 길이를 갖는 스페이서를 도입하는 것이 바람직하다.

균체 등을 포함하는 사이토카인 유도제는, 필요에 따라 고정화하기 전에 균체의 세정 조작이나 파쇄 조작, 성분 분획 조작 등의 여러 가지 전처리를 실시할 수도 있다. 또한, 생균 (生菌) 등의 사이토카인 유도제는 필요에 따라 고정화하기 전, 고정화와 동시에, 고정화 후 중 어떠한 때라도, 가열 처리ㆍ약품 처리ㆍ방사선 처리ㆍ가스 멸균 처리 등의 여러 가지 방법에 의해 사균화될 수도 있다. 가열 처리로서는 오토클레이브 처리를, 약품 처리로서는 글루타르알데히드 처리, 포르말린 처리, 또는 에탄올 처리를, 방사선 처리로서는 γ선 처리를, 가스 멸균 처리로서는 에틸렌옥시드 가스 처리 등을 들 수 있다.

또한, BCG와 같은 미생물을 포함하는 사이토카인 유도제를 유도 증강제에 고정화하는 경우에는, 균체 표면 외벽 성분의 아미노산이나 당 성분 등을 통해 유도 증강제의 카르복실기, 아미노기 및(또는) 에폭시기 등의 관능기에 결합시킬 수 있다. 이 때, 필요에 따라 여러 가지 쇄장 (chain length)이나 구조의 스페이서를 도입할 수도 있다.

BCG와 같은 미생물 균체 외층이 지질 등에 의해 덮여 있는 경우에는, 필요에 따라 지질을 세정 제거한 후 결합할 수도 있다.

또한, 고정화 방법으로서는 물리 흡착법이 바람직하다. 사이토카인 유도제를 물리 흡착법에 의해 유도 증강제에 고정화할 수도 있다. 특히, 소수성 표면을 갖는 유도 증강제에 BCG와 같은 사이토카인 유도제를 물리 흡착 작용에 의해 고정화할 수 있다. 또는, 사이토카인 유도제가 미생물이나 그 성분을 포함하는 경우 등에는, 그 표면이 전하를 띠는 경우에도 그 반대극 전하를 표면에 갖는 유도 증강제에 물리 흡착 작용에 의해 고정화할 수 있다.

또한, 상기 유도 증강제의 사용 비율은 특별히 한정되지 않지만, 통상 입자상의 유도 증강제로서 사용하는 경우에는 혈액 용적에 대한 유도 증강제의 부피 체적량으로서 0.02 ％ 내지 80 ％ 정도가 되며, 바람직하게는 0.1 ％ 내지 50 ％ 정도이다.

또한, 상기 사이토카인 유도제의 사용 비율은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 BCG의 경우에는 혈액에 첨가되는 농도로서 건조 중량으로 0.001 mg 내지 10 mg/mL가 바람직하다. 또한, 예를 들면 OK-432의 경우에는 혈액에 첨가되는 농도로서 0.0001 KE 내지 10 KE/mL가 바람직하다.

본 발명에 관한 사이토카인 유도 용구에서는 상기 유도 증강제와 사이토카인 유도제를 포함하는 사이토카인 유도 재료가, 용기 내에서 혈액 또는 혈액 성분 등과 접촉되며, 그에 따라 혈액 또는 혈액 성분 등에서 사이토카인이 효과적으로 유도된다. 이 경우, 접촉 온도를 15 내지 42 ℃의 범위로 하는 것이 바람직하며, 그에 따라 사이토카인의 유도를 보다 효과적으로 야기할 수 있다.

또한, 상기 유도 증강제 및 사이토카인 유도제는 미리 혼합되어 혈액과 접촉될 수도 있고, 또는 개별적으로 혈액 또는 혈액 성분 등과 접촉될 수도 있다.

또한, 본 발명에서는 사이토카인 유도 재료를 수납하고 있는 용기의 구조는 특별히 한정되지 않지만, 도 3에 모식적으로 나타낸 바와 같이 혈액 등의 도입부 (1)과 사이토카인 유도 재료와 접촉된 혈액 (4) 등을 용기 밖으로 유도하는 도출부 (2)가 구비되어 있는 용기 (3)이 바람직하다.

사이토카인 유도 재료를 수납하여 이루어지는 용기로서는 칼럼상의 용기나 혈액백상의 용기 등이 특히 바람직하다.

이 사이토카인 유도 용구에는 사이토카인 유도 재료와 접촉시킨 혈액 등을 용기 밖으로 유도하는 경우, 사이토카인 유도 재료가 혈액에 혼입되지 않도록 사이토카인 유도 재료 유출 방지 기구가 구비되어 있는 것이 보다 바람직하다.

도 3에 모식적으로 나타낸 바와 같이, 사이토카인 유도 재료 유출 방지 기구 (5)는 사이토카인 유도 재료가 미리 이탈하지 않도록 수납 용기 내부에 고정화될 수도 있으며, 유출 방지용 분리막이나 분리 필터가 구비될 수도 있다. 또한, 원심 조작 등에 의해 혈액과 분리할 수도 있다.

또한, 필요에 따라서는 사이토카인 유도 재료와 접촉시킨 혈액 등으로부터 혈장이나 혈청 성분 등을 분리하여 치료 등에 이용할 수 있다.

구체적인 구성으로서 도입부와 도출부를 갖는 혈액백에 입자상ㆍ섬유상ㆍ부직포상 등의 유도 증강제를 포함하는 사이토카인 유도 재료를 충전하고, 여기에 혈액 또는 혈액 성분 등을 도입한다. 필요에 따라 사이토카인을 유도한 혈액 또는 혈액 성분 등을 도출부로부터 꺼내어 이용할 수 있다. 이러한 혈액백의 용량으로서는 50 mL 내지 1000 mL, 특히 100 mL 내지 400 mL가 바람직하다. 이러한 혈액백은 입자상이나 섬유상, 부직포상의 사이토카인 유도 재료를 수납하는 사이토카인 유도 용구인 것이 바람직하다.

상기한 사이토카인으로서 특히 중요한 것으로 인터페론-γ(IFN-γ), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-10 (IL-10), 인터루킨-12 (IL-12), 종양 괴사 인자-α (TNF-α) , 트랜스포밍 증식 인자-β (TGF-β)를 들 수 있다. 예를 들면, IFN-γ는 류마티스 등의 면역 질환, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 암 등의 여러 가지 질환에서 매우 중요한 역할을 담당하는 사이토카인이며, 이들 질환에 대한 치료 효과를 기대할 수 있다.

또한, 상기 사이토카인 유도 재료 및 사이토카인 유도 용구는 혈액 또는 혈액 성분 등으로 한정되지 않으며, 골수계 세포, 표피 세포, 섬유아 세포, 간 세포, 골아 세포, 혈액간 세포, 배성간 세포 등의 조직으로부터 채취한 세포나 배양 세포, 주화 세포 등, 사이토카인을 생산하는 여러 가지 세포로부터도 사이토카인을 유도할 수 있다.

이하, 본 발명의 비한정적인 실시예를 설명함으로써, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 또한, 본 발명은 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.

또한, 인간 및 래트 (rat) 혈장 중의 IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-10, IL-12의 측정은 R&D 시스템사 제조의 ELISA 키트, 엔도겐 (ENDOGEN)사 제조의 ELISA 키트, 젠자임ㆍ테크네사 제조의 ELISA 키트로 행하였다. 인간 혈장 중의 TGF-β의 측정은 프로메가사 제조의 ELISA 키트로 행하였다.

<실시예 1>

유도 증강제 1 (방향족계 합성 흡착제, 미쯔비시 가가꾸사 제조, 상품명: 다이어이온 HP-50)을 정제수 (오쯔까 세야꾸사 제조)로 데칸테이션에 의해 세정하고, 그 후 메탄올 (와꼬 쥰야꾸사 제조, HPLC용)로 데칸테이션함으로써 세정하였다. 이어서, 주사용 생리 식염수 (오쯔까 세야꾸사 제조)로 유도 증강제 1을 데칸테이션에 의해 세정하고, 입자 부피 체적으로 50 ㎕의 유도 증강제 1을 멸균된 튜브(다이아트론사 제조, 에펜도르프 튜브 1.5 mL용)에 충전하였다.

건강한 사람으로부터 채혈하여 헤파린 15 IU/mL 함유 정맥혈을 얻었다. 혈액에 1 mg/mL의 농도가 되도록 BCG (닛본 BCG 제조사 제조)를 첨가하였다. 또한, BCG는 생리 식염수로 제조하였다. 이 때, 생리 식염수의 체적이 혈액에 대하여 1.25 ％가 되도록 하였다.

상기 BCG가 첨가된 혈액 약 1.45 mL를 상기 유도 증강제 1을 충전한 튜브에 첨가하였다.

이어서, 튜브를 거꾸로 흔들어 혼화하여 혈액을 교반하고, 회전식 믹서 (타이테크 (TAITEC)사 제조)에 부착하여 6 rpm으로 회전시키면서 37 ℃에서 24 시간 항온조 중에서 배양하였다. 배양 후의 혈액을 4 ℃에서 3500 rpm (도미 세꼬사 제조, 미량 고속 원심기 MRX-150)으로 15 분간 원심 (centrifuge)하고, 그 후 혈장을 채취하여 -20 ℃에서 이 혈장을 동결 보존하였다. 이어서, 보존된 혈장을 융해하고, 인간 IFN-γ ELISA 키트 (R&D 시스템사 제조 또는 엔도겐사 제조)로 혈장 중의 IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

<비교예 1>

유도 증강제 1을 사용하지 않고 실시예 1과 동일하게 하여 BCG를 첨가한 혈액 1.5 mL를 사용하고, 이하 실시예 1과 동일하게 하여 혈장을 채취하여 IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

<비교예 2>

BCG를 혈액에 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 하여 INF-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

<실시예 2>

37 ℃에서 배양하는 시간을 24 시간에서 4 시간으로 변경한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 하여 동결 보존된 혈장을 얻었다. 이어서, 보존된 혈장을 융해하고, 인간 TNF-α ELISA 키트 (R&D 시스템사 제조)로 혈장 중의 TNF-α 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

<비교예 3>

유도 증강제 1을 사용하지 않은 것과 BCG 첨가 혈액을 1.5 mL 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일하게 하여 TNF-α 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

<비교예 4>

BCG를 혈액에 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일하게 하여 TNF-α 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

<실시예 3>

유도 증강제 1의 부피 체적을 50 ㎕에서 5 ㎕로 변경하고, 혈액의 첨가량을 1.495 mL로 한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 하여 혈장 중의 INF-γ를 측정하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

<실시예 4>

유도 증강제 1의 부피 체적을 50 ㎕에서 10 ㎕로 변경하고, 혈액의 첨가량을 1.49 mL로 한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 하여 혈장 중의 INF-γ를 측정하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

<실시예 5>

유도 증강제 1의 부피 체적을 50 ㎕에서 20 ㎕로 변경하고, 혈액의 첨가량을 1.48 mL로 한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 하여 혈장 중의 INF-γ를 측정하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

<실시예 6>

실시예 1과 동일하게 하여 혈장 중의 INF-γ를 측정하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

<실시예 7>

유도 증강제 1의 부피 체적을 50 ㎕에서 200 ㎕로 변경하고, 혈액의 첨가량을 1.3 mL로 한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 하여 혈장 중의 INF-γ를 측정하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

<비교예 5>

유도 증강제 1을 사용하지 않은 것과 BCG 첨가 혈액을 1.5 mL 사용한 것을 제외하고는, 실시예 3과 동일하게 하여 IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

<비교예 6>

BCG를 혈액에 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 3과 동일하게 하여 INF-γ의 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

<비교예 7>

BCG를 혈액에 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 4와 동일하게 하여 INF-γ의 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

<비교예 8>

BCG를 혈액에 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 5와 동일하게 하여 INF-γ의 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

<비교예 9>

BCG를 혈액에 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 6과 동일하게 하여 INF-γ의 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

<비교예 10>

BCG를 혈액에 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 7과 동일하게 하여 INF-γ의 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

<실시예 8>

실시예 1과 동일하게 하되, 단 유도 증강제 1이 부피 체적으로 20 ㎕ 충전된 튜브를 준비하였다.

BCG 대신에 피시바닐 (쥬가이 세야꾸사 제조, OK-432)을 0.1 KE/mL의 농도가 되도록 각 혈액에 첨가하였다. 또한, OK-432는 RPMI 배지에서 제조된 것이며, RPMI 배지가 혈액에 대하여 20 ％가 되도록 제조하였다. OK-432가 첨가된 혈액을 유도 증강제 1이 부피 체적으로 20 ㎕ 충전된 상기 튜브에 튜브 눈금이 1.5 mL가 되도록 첨가하였다. 즉, 혈액을 약 1.48 mL 첨가하였다.

이하, 실시예 1과 동일하게 하여 IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

<실시예 9>

유도 증강제 1의 부피 체적을 50 ㎕로 하고, OK-432 첨가 혈액을 1.45 mL 사용한 것을 제외하고는, 실시예 8과 동일하게 하여 IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

<실시예 10>

유도 증강제 1의 부피 체적을 100 ㎕로 하고, OK-432 첨가 혈액을 1.40 mL 사용한 것을 제외하고는, 실시예 8과 동일하게 하여 IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

<비교예 11>

유도 증강제 1을 사용하지 않고, OK-432 첨가 혈액을 1.5 mL 사용한 것을 제외하고는, 실시예 8과 동일하게 하여 INF-γ의 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

<비교예 12>

피시바닐 (OK-432)를 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 8과 동일하게 하여 IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

<비교예 13>

피시바닐 (OK-432)를 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 9와 동일하게 하여 IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

<비교예 14>

피시바닐 (OK-432)를 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 10과 동일하게 하여 IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

<실시예 11>

유도 증강제 1 대신에, 유도 증강제 2 (아크릴에스테르계 합성 수지, 오가노사 제조, 품번: 앰버라이트 XAD-7)을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 하여, 혈장의 IFN-γ 유도량을 측정한 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.

<실시예 12>

유도 증강제 2의 부피 체적의 사용량을 50 ㎕에서 200 ㎕로 변경한 것 및 BCG 첨가 혈액을 1.3 mL 사용한 것을 제외하고는, 실시예 11과 동일하게 하여, IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.

<비교예 15>

유도 증강제 2를 사용하지 않은 것 및 BCG 첨가 혈액을 1.5 mL 사용한 것을 제외하고는, 실시예 11과 동일하게 하여, IFN-γ의 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.

<비교예 16>

BCG를 혈액에 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 11과 동일하게 하여, IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.

<비교예 17>

BCG를 혈액에 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 12와 동일하게 하여, IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.

다음으로, 래트 혈액에서의 사이토카인 유도에 대한 실시예 및 비교예를 설명한다.

<실시예 13>

실시예 1과 동일하게 하여, 부피 체적 50 ㎕의 유도 증강제 1을 충전한 멸균된 튜브를 얻었다.

위스터 래트 (7 주령, 수컷, 닛본 SLC사로부터 구입)로부터 헤파린 15 IU/mL 함유 정맥혈을 얻었다. 이 혈액에, 0.1 KE/mL 농도가 되도록 피시바닐 (주가이 세야꾸사 제조, OK-432)를 첨가하였다. 또한 OK-432는 RPMI 배지에서 제조된 것이고, RPMI 배지가 혈액에 대하여 20 ％가 되도록 제조하였다. OK-432가 첨가된 혈액을 상기 유도 증강제 1이 충전된 튜브에, 눈금이 1.5 mL가 되도록 첨가하였다.

이하, 실시예 1과 동일하게 하여 혈장을 채취하고, 래트 IFN-γ 정량 키트 (젠자임ㆍ테크네사 제조)를 사용하여 IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

<실시예 14>

유도 증강제 1의 부피 체적의 양을 500 ㎕로 한 것 및 OK-432 첨가 혈액의 양을 1.0 mL로 한 것을 제외하고는, 실시예 13과 동일하게 하여, IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 6에 나타내었다.

<비교예 18>

유도 증강제 1을 사용하지 않은 것 및 OK-432 첨가 혈액을 1.5 mL 사용한 것을 제외하고는, 실시예 13과 동일하게 하여, IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 6에 나타내었다.

<비교예 19>

OK-432를 혈액에 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 13과 동일하게 하여, IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 6에 나타내었다.

<비교예 20>

OK-432를 혈액에 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 14와 동일하게 하여, IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 6에 나타내었다.

<실시예 15>

위스터 래트 (7 주령, 수컷, 닛본 SLC사로부터 구입)으로부터 채혈하여, 헤파린 15 IU/mL 함유 정맥혈을 얻었다. 이 래트의 혈액에, 1 mg/mL의 농도가 되도록 BCG를 첨가하였다. BCG는 생리 식염수로 제조하였다. 이 때, 생리 식염수의 체적이 혈액에 대하여 1.25 ％가 되도록 하였다. BCG가 첨가된 혈액을 상기 유도 증강제 1이 충전된 튜브에 1.45 mL 첨가하였다.

이하, 실시예 1과 동일하게 하여 혈장을 채취하고, 래트 IFN-γ 정량 키트 (젠자임ㆍ테크네사 제조)를 사용하고, IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 7에 나타내었다.

<실시예 16>

유도 증강제 1의 사용 부피 체적량을 50 ㎕에서 500 ㎕로 변경한 것 및 BCG 첨가 혈액을 1.0 mL 사용한 것을 제외하고는, 실시예 15와 동일하게 하고, IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 7에 나타내었다.

<비교예 21>

유도 증강제 1을 사용하지 않은 것 및 BCG 첨가 혈액을 1.5 mL 사용한 것을 제외하고는, 실시예 15와 동일하게 하여 IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 7에 나타내었다.

<비교예 22>

혈액에 BCG를 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 15와 동일하게 하여 IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 7에 나타내었다.

<비교예 23>

혈액에 BCG를 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 16과 동일하게 하여 INF-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 7에 나타내었다.

<실시예 17>

37 ℃에서 배양하는 시간을 24 시간에서 4 시간으로 변경한 것을 제외하고는 실시예 15와 동일하게 하여 혈장을 채취하여, 래트 종양 괴사입자-α정량 키트 (젠자임ㆍ테크네사 제조) 키트를 사용하여, TNF-α유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 8에 나타내었다.

<비교예 24>

유도 증강제 1을 사용하지 않은 것과 BCG 첨가 혈액을 1.5 mL 사용한 것을 제외하고는, 실시예 17과 같이 하여 혈장을 채취하고, TNF-α 유도량을 실시예 17과 동일하게 측정하였다. 결과를 하기의 표 8에 나타내었다.

<비교예 25>

BCG를 혈액에 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 17과 동일하게 하여 TNF-α 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 8에 나타내었다.

<실시예 18 내지 23>

유도 증강제 3: CA 필름 (아트플러스사 제조, 아세트산셀룰로오스 필름, 상품명: 아세티 필름 VR-R)을 사용하여, 필름 표면을 메틸알코올로 24 시간, 속실렛 (Soxhlet) 추출하여 가소제를 추출하고, 필름을 꺼낸 후, 15 시간 공기-건조 (air-dried) 후, 추가로 80 ℃에서 5 시간 건조하였다. 그 후, 스트뤼스사 (덴마크) 제조 자동 연마기 (상품명: 플라노폴 페데막스)에, 220, 500, 1200, 2400 및 4000 메쉬의 샌드페이퍼를 부착한 것을 사용하여, 상기 CA 필름을 연마하여, 양측의 표면에 표면 조도를 갖는 연마된 CA 필름을 제조하였다. 이 필름을 메틸알코올로 세정 후, 2.5 mm×2.5 mm의 크기로 세편화하여, 부피 체적으로 약 200 ㎕가 되도록 측정하여 취했다. 이들 세편을 주사용 생리 식염수로 세정 후, 1.5 mL용 멸균된 튜브에 충전하였다.

건강한 사람으로부터 채혈하여, 헤파린 15 IU/mL 함유 정맥혈을 얻었다. 혈액에 1 mg/mL의 농도가 되도록, BCG (닛본 BCG 제조사 제조)를 첨가하고 혈액 약 1.3 mL를 상기 충전 튜브에 첨가하여, 실시예 1과 동일하게 하여 IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 9에 나타내었다.

<실시예 24 내지 29>

유도 증강제 4: PET 필름 (유니티카사 제조, 폴리에틸렌테레프탈레이트 필름, 상품명: 엠블레트 S-75)를 사용하여, 필름 표면을 메틸알코올로 세정하였다. 그 후, 스트뤼스사 (덴마크) 제조 자동 연마기 (상품명: 플라노폴 페데막스)에, 220, 500, 1200, 2400 및 4000 메쉬의 샌드페이퍼를 부착한 것을 사용하여, PET 필름을 연마하여, 양측의 표면에 표면 조도를 갖는 연마된 PET 필름을 제조하였다. 이 필름을 메틸알코올로 세정 후, 2.5 mm×2.5 mm의 크기로 세편화하여 부피 체적으로 약 200 ㎕가 되도록 측정하여 얻었다. 이러한 세편을 주사용 생리식염수로 세정 후, 1.5 mL용 멸균된 튜브에 충전하였다. 건강한 사람으로부터 채혈하여 헤파린 15 IU/mL 함유 정맥혈을 얻었다. 혈액에 1 mg/mL의 농도가 되도록, BCG (닛본 BCG 제조사 제조)를 첨가하고, 혈액 약 1.3 mL를 상기 충전 튜브에 첨가하여, 실시예 1과 동일하게 하여 IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 10에 나타내었다.

<실시예 30 내지 35>

유도 증강제 5: 폴리스티렌 필름 (미쯔비시 몬산토사 제조, 상품명: 산토클리아)을 사용하여, 필름 표면을 정제수로 세정하였다. 그 후, 스트뤼스사 (덴마크) 제조 자동 연마기 (상품명: 플라노폴 페데막스)에, 220, 500, 1200, 2400 및 4000 메쉬의 샌드페이퍼를 부착한 것을 사용하여, 폴리스티렌 필름을 연마하여, 양측의 표면에 표면 조도를 갖는 연마된 폴리스티렌 필름을 제조하였다. 이 필름을 정제수로 세정 후, 2.5 mm×2.5 mm의 크기로 세편화하여, 부피 체적으로 약 200㎕가 되도록 측정하여 얻었다. 이러한 세편을 주사용 생리 식염수로 세정 후, 1.5 mL용 멸균된 튜브에 충전하였다. 건강한 사람으로부터 채혈하여 헤파린 15 IU/mL 함유정맥혈을 얻었다. 혈액에 1 mg/mL의 농도가 되도록 BCG (닛본 BCG 제조사 제조)를 첨가하고, 혈액 약 1.3 mL를 상기 충전 튜브에 첨가하여, 실시예 1과 동일하게 하여 IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 11에 나타내었다.

<실시예 36>

아세트산셀룰로오스 펠릿 (아트플러스사 제조, 가소제로서 아세틸시트르산트리에틸 30 ％ 함유)를 사출 성형하고, 직경 2.5 mm의 구형 비드를 제조하였다. 이 비드 50 g을 메탄올 300 mL에 의해, 50 ℃에서 24 시간 속실렛 추출하여, 가소제를 추출하였다. 그 후, 가소제가 추출된 비드를 스테인레스제 배트에 꺼내어, 15 시간 공기-건조한 후, 추가로 80 ℃에서 5 시간 건조시켰다.

폿트 밀 (도요엔지니어링사 제조, 상품명; 51-세라믹 폿트밀 BP-5)에, 상기 비드 200 mL 및 동일 용량의 연마제; WHITE ABRAX (WA) #34 (닛본 연마재 공업사 제조)를 투입하고, 추가로 세라믹 폿트 밀용 볼 (도요엔지니어링사 제조, 상품명; BB-13) 수개를 투입하여, 볼 연마기 (닛또 가가꾸샤 제조 폿트 밀, 상품명; AN-3S)에 의해 5 시간 연마하였다. 이렇게 하여, Ra치 1.36 ㎛ 및 Sm치 97.2 ㎛의 비드를 얻었다 (유도 증강제 6).

얻어진 비드를 메탄올로 3회 세정하고, 주사용 생리 식염수로 5회 세정하였다. 그 후, 부피 체적으로 400 ㎕를 실시예 1과 동일하게 하여 멸균된 1.5 mL용 튜브에 넣고, 혈액을 1.1 mL 첨가한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여, IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 12에 나타내었다.

<실시예 37>

실시예 36과 동일하게 하되, 단 비연마의 Ra치 0.186 ㎛, Sm치 298.7 ㎛의 유도 증강제 6을 제조하였다. 실시예 36과 동일하게, 혈액과 접촉시켰다. 결과를 하기의 표 12에 나타내었다.

<비교예 26>

유도 증강제 6을 사용하지 않은 것과 BCG 첨가 혈액을 1.5 mL 사용한 것을 제외하고는, 실시예 36과 동일하게 하여, IFN-γ 유도량을 측정하였다. 결과를 하기의 표 12에 나타내었다.

<실시예 38 내지 42>

유도 증강제 1 (방향족계 합성 흡착제, 미쯔비시 가가꾸사 제조, 상품명: 다이어이온 HP-50), 유도 증강제 2 (아크릴에스테르계 합성 수지, 오가노사 제조, 품번: 앰버라이트 XAD-7), 유도 증강제 7 (방향족계 합성 수지, 오가노사 제조, 품번: 앰버라이트 XAD-2), 유도 증강제 8 (방향족계 합성 수지, 오가노사 제조, 품번: 앰버라이트 XAD-4), 또는 유도 증강제 9 (방향족계 합성 수지, 오가노사 제조, 품번: 앰버라이트 XAD-16 HP)를 사용하고, 실시예 1과 동일하게 행하였다. 결과를 하기의 표 13에 나타내었다.

<비교예 27>

유도 증강제를 사용하지 않은 것과 BCG 첨가 혈액 1.5 mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 38과 동일하게 행하였다. 결과를 하기의 표 13에 나타내었다.

<실시예 43>

BCG를 생리 식염수에 현탁하여, 인산 완충액으로 희석하여, 4000 RPM에서 15분간 원심 조작하였다. 상청 (supernatant liquid)을 버리고 다시 인산 완충액으로 현탁하여 4000 RPM (토미 세이코사 제조, 미량 고속 원심기 MRX-150)으로써 15 분간 원심 조작하였다. 이것을 3 회 행하고, 이어서 50 ％ 에탄올 함유 인산 완충액으로 현탁하여, 4000 RPM에서 15 분간 원심 조작하였다. 다음으로 에탄올로써 현탁하여 4000 RPM에서 15 분간 원심 조작하였다. 이것을 2 회 행하고, 다시 인산 완충액으로 3 회 세정하였다. 이 처리된 BCG 2 mg을 카르복실기를 도입한 유도 증강제 1 (부피 체적 1 mL)에 카르보디이미드법에 의해 공유 결합하였다. 남은 반응기를 에탄올아민으로 반응시키고, 인산 완충액으로 세정 후, 인산 완충액에 현탁하였다. 이렇게 하여 얻어진 유도 증강제 100 ㎕를 멸균된 튜브에 충전하였다.

BCG만의 첨가가 없는 것, 혈액 첨가량을 1.4 mL로 한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조작을 행하여, IFN-γ의 유도량을 측정하였다. 결과를 표 14에 나타내었다.

<비교예 28>

처리된 BCG가 공유 결합되지 않은 것을 제외하고는, 실시예 43과 동일한 조작을 행하여, IFN-γ의 유도량을 측정하였다. 결과를 표 14에 나타내었다.

<비교예 29>

유도 증강제의 첨가가 없는 것과 BCG 첨가 (1 mg/mL) 혈액을 1.5 mL 사용한 것을 제외하고는 실시예 43과 동일한 조작을 행하여 IFN-γ의 유도량을 측정하였다. 결과를 표 14에 나타내었다.

<실시예 44>

폴리스티렌-디비닐벤젠 공중합체의 유도 증강제 8 (오가노사 제조, 앰버라이트 XAD-4) 부피 체적 1 mL와 BCG (10 mg/mL)를 1 mL 생리 식염 중에서 37 ℃에서 20 시간 혼화하여, BCG를 입자 표면에 물리 흡착시켰다. 혼화 후, 이 입자를 생리 식염수로 충분히 세정하고, 다시 생리 식염수에 현탁하였다. 이렇게 하여 얻어진, 부피 체적 100 ㎕ 유도 증강제를 멸균된 튜브에 충전하였다.

이하, BCG만의 첨가가 없는 것 및 혈액을 1.4 mL 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조작을 행하여, 건강한 사람 2명의 혈액에 의해 IFN-γ의 유도량을 측정하였다. 결과를 표 15에 나타내었다.

<비교예 30>

BCG를 첨가하지 않고 실시예 44와 동일한 조작을 하여 제조한 입자를 얻고, 실시예 44와 동일하게 하여 IFN-γ의 유도량을 측정하였다. 결과를 표 15에 나타내었다.

<비교예 31>

유도 증강제의 첨가가 없는 것과 BCG 첨가 (1 mg/mL) 혈액을 1.5 mL 사용한 것을 제외하고는 실시예 44와 동일하게 하여 IFN-γ를 측정하였다. 결과를 표 15에 나타내었다.

<실시예 45>

폴리스티렌-디비닐벤젠 공중합체인 유도 증강제 8의 부피 체적 1 mL를 BCG (10 mg/mL)와 1 mL의 1 ％ 포르말린액 (중성 완충 포르말린액, 와꼬 쥰야꾸 고교사 제조) 함유 생리 식염 중에서 4 ℃에서 20 시간 혼화하여, BCG를 입자 표면에 물리 흡착시켰다. 혼화 후, 이 입자를 생리 식염수로 충분히 세정한 후, 부피 체적으로 100 ㎕를 멸균된 튜브 (다이아트론사 제조, 1.5 mL용)에 충전하였다.

BCG만의 첨가가 없는 것 및 혈액을 1.4 mL 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조작을 행하여, IFN-γ의 유도량을 측정하였다. 결과를 표 16에 나타내었다.

<비교예 32>

BCG를 첨가하지 않고, 실시예 45와 동일하게 하여 IFN-γ의 유도량을 측정하였다. 결과를 표 16에 나타내었다.

<비교예 33>

유도 증강제 8을 사용하지 않은 것과 BCG 첨가 (1 mg/mL) 혈액을 1.5 mL 사용한 것을 제외하고는 실시예 45와 동일하게 하여 IFN-γ를 측정하였다. 결과를 표 16에 나타내었다.

<실시예 46>

실시예 45와 동일하게 제조한 BCG를 입자 표면에 물리 흡착시킨 유도 증강제 8을 부피 체적으로 4 mL를 혈액백 (데루모사 제조, 분리 백 200 mL용)에 충전하였다. 건강한 사람으로부터 채혈하여 얻은 헤파린 15 IU/mL 함유의 정맥혈 50 mL를 이 혈액백에 도입하였다. 이 혈액백을 37 ℃에서 24 시간, 부드럽게 교반하면서 배양하였다. 이 혈액 중의 IFN-γ를 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 결과를 표 17에 나타내었다.

<비교예 34>

BCG를 물리 흡착 처리를 하지 않은 유도 증강제 8을 사용한 것 이외에는 실시예 46과 동일하게 하여 행하였다. 결과를 표 17에 나타내었다.

<비교예 35>

유도 증강제 8을 사용하지 않은 것 및 BCG의 1 mg/mL 첨가 혈액 50 mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 46과 동일하게 하여 IFN-γ를 측정하였다. 결과를 표 17에 나타내었다.

<실시예 47>

혈액 중의 인터루킨 2, 인터루킨 12를 측정한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 행하였다. 결과를 표 18에 나타내었다.

<비교예 36>

BCG를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 실시예 47과 동일하게 하였다. 결과를 표 18에 나타내었다.

<비교예 37>

유도 증강제 1을 첨가하지 않은 것 및 BCG 첨가 혈액 1.5 mL를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 47과 동일하게 행하였다. 결과를 표 18에 나타내었다.

<실시예 48>

BCG의 농도를 0.1 mg/mL로 하여, 혈액 중의 TGF-β를 측정한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 행하였다. 결과를 표 19에 나타내었다.

<비교예 38>

유도 증강제 1을 첨가하지 않은 것 및 BCG 첨가 혈장 1.5 mL를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 48과 동일하게 행하였다. 결과를 표 19에 나타내었다.

<실시예 49>

BCG를 대신하여 OK-432를 0.1 KE/mL로 사용한 것 이외에는 실시예 48과 동일하게 행하였다. 결과를 표 20에 나타내었다.

<비교예 39>

유도 증강제 1을 첨가하지 않은 것, 및 OK-432 첨가 혈액 1.5 mL를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 49와 동일하게 행하였다. 결과를 표 20에 나타내었다.

<실시예 50>

BCG를 대신하여 OK-432를 0.01 KE/mL로 사용한 것 및 IL-10을 측정한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 행하였다. 결과를 표 21에 나타내었다.

<비교예 40>

유도 증강제 1을 첨가하지 않은 것 및 OK-432 첨가 혈액 1.5 mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 50과 동일하게 행하였다. 결과를 표 21에 나타내었다.

<실시예 51, 52>

BCG의 농도를 0.1 mg/mL 및 1 mg/mL의 2 용량으로 한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 행하였다. 결과를 표 22에 나타내었다.

<비교예 41>

BCG를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 실시예 51과 동일하게 행하였다. 결과를 표 22에 나타내었다.

<비교예 42>

유도 증강제 1을 첨가하지 않은 것 및 BCG 첨가 (0.1 mg/mL) 혈액을 1.5 mL 사용한 것을 제외하고는 실시예 51과 같이 행하였다. 결과를 표 22에 나타내었다.

<비교예 43>

유도 증강제 1을 첨가하지 않은 것 및 BCG 첨가 (1 mg/mL) 혈액을 1.5 mL 사용한 것을 제외하고는 실시예 52와 동일하게 행하였다. 결과를 표 22에 나타내었다.

<실시예 53, 54>

BCG를 대신하여 OK-432의 농도를 0.01 KE/mL의 2 용량으로 한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 행하였다. 결과를 표 23에 나타내었다.

<비교예 44>

OK-432를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 실시예 53과 동일하게 행하였다. 결과를 표 23에 나타내었다.

<비교예 45>

유도 증강제 1을 첨가하지 않은 것과, OK-432 첨가 (0.01 KE/mL) 혈액을 1.5 mL 사용한 것을 제외하고는 실시예 53과 동일하게 행하였다. 결과를 표 23에 나타내었다.

<비교예 46>

유도 증강제 1을 첨가하지 않은 것과 OK-432 첨가 (0.1 KE/mL) 혈액을 1.5 mL 사용한 것을 제외하고는 실시예 54와 동일하게 행하였다. 결과를 표 23에 나타내었다.

<실시예 55>

유도 증강제 10으로서 나일론 울 (와꼬 쥰야꾸 고교사 제조)을 O.04 g (1.5 mL 튜브에 충전한 부피 체적으로서 약 300 ㎕)을 사용한 것 및 BCG 첨가 혈액을 1.2 mL 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 하였다. 결과를 표 24에 나타내었다.

<실시예 56>

유도 증강제 11로서 폴리에스테르 부직포 (니혼 바이린사 제조, 품명: EL-5600)를 O.04 g (1 cm×3 cm, 부피 체적으로서 약 300 ㎕)를 사용한 것 및 BCG 첨가 혈액을 1.2 mL 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 하였다. 결과를 표 24에 나타내었다.

<실시예 57>

유도 증강제 12로서 폴리에스테르 부직포 (니혼 바이린사 제조, 품명: EW-7180)을 0.04 g (1 cm×3 cm, 부피 체적으로서 약 220 ㎕)를 사용한 것 및 BCG 첨가 혈액을 1.28 mL 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 하였다. 결과를 표 24에 나타내었다.

<비교예 47>

BCG를 사용하지 않은 것을 제외하고 실시예 55와 동일하게 행하였다. 결과를 표 24에 나타내었다.

<비교예 48>

BCG를 사용하지 않은 것을 제외하고 실시예 56과 동일하게 행하였다. 결과를 표 24에 나타내었다.

<비교예 49>

BCG를 사용하지 않은 것을 제외하고 실시예 57과 동일하게 행하였다. 결과를 표 24에 나타내었다.

<비교예 50>

유도 증강제를 사용하지 않은 것 및 BCG 첨가 혈액을 1.5 mL 사용한 것을 제외하고 실시예 55와 동일하게 행하였다. 결과를 표 24에 나타내었다.

<실시예 58>

이화학 연구소로부터 입수한 방사균 S. 노빌리스 (JCM 4274)를, 효모 엑기스 O.2 ％가 첨가된 전분ㆍ암모늄 배지 100 mL 중에서 30 ℃에서 40 시간 진탕-배양 (shake cultured)하여, 균체를 얻었다. BCG를 대신하여 이 균체를 건조 중량으로 1 mg/mL가 되도록 혈액에 첨가하여, 실시예 1과 동일하게 하여, IFN-γ를 측정하였다. 결과를 표 25에 나타내었다.

<비교예 51>

방선균 균체를 사용하지 않은 것을 제외하고 실시예 58과 동일하게 행하였다. 결과를 표 25에 나타내었다.

<비교예 52>

유도 증강제 1을 사용하지 않은 것 및 방선균 첨가 혈액 1.5 mL를 사용한 것을 제외하고 실시예 58과 동일하게 행하였다. 결과를 표 25에 나타내었다.

<실시예 59>

유도 증강제 13 (폴리비닐알코올 겔입자, 입경 약 1 mm)으로서, 요꼬이 히로시 「PVA 및 PAA의 착체 겔」 (고분자 가공 Vo1. 40, No. 11, 1991 년)에 따라서, 폴리비닐알코올-Fe (III) 착체 (complex) 겔입자를 제조하였다. 유도 증강제 13을 생리 식염수에 현탁하고, 부피 체적으로 300 ㎕의 폴리비닐알코올-Fe (III) 착체 겔입자를 1.5 mL용 멸균 튜브에 충전하였다. 혈액 1.2 mL를 첨가한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 행하였다. 결과를 표 26에 나타내었다.

<비교예 53>

BCG를 첨가하지 않는 것을 제외하고 실시예 58과 동일하게 행하였다. 결과를 표 26에 나타내었다.

<비교예 54>

유도 증강제 13을 사용하지 않는 것 및 BCG 첨가 혈액을 1.5 mL 첨가한 것을 제외하고, 실시예 58과 동일하게 행하였다. 결과를 표 26에 나타내었다.

본 발명에 관한 사이토카인 유도 재료를 사용하면, 종래의 사이토카인 유도제에 비교하여 사이토카인을 보다 효과적으로 유도할 수가 있다. 따라서, 본 발명의 사이토카인 유도 재료를, 예를 들면 혈액 또는 혈액 성분과 접촉시킴으로써 사이토카인을 효과적으로 유도할 수가 있기 때문에, 본 발명에 관한 사이토카인 유도 재료 및 유도 용구는, 사이토카인의 유도가 유효한 여러 가지 질환의 치료에 바람직하게 사용된다.

Claims

사이토카인 유도제와 물에 불용성인 유도 증강제를 포함하는 것을 특징으로 하는 사이토카인 유도 재료.
제1항에 있어서, 상기 사이토카인 유도제가 상기 유도 증강제에 고정화되어 있는 사이토카인 유도 재료.
제2항에 있어서, 상기 사이토카인 유도제가 물리 흡착으로 상기 유도 증강제에 고정화되어 있는 사이토카인 유도 재료.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도 증강제가 고분자 재료를 포함하는 사이토카인 유도 재료.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도 증강제가 중심선 평균 조도 0.2 내지 10 ㎛의 표면을 갖는 사이토카인 유도 재료.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도 증강제가 폴리스티렌계, 아크릴에스테르계, 폴리에스테르계, 나일론계, 셀룰로오스계, 및 폴리비닐알코올계의 각 고분자 재료로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 고분자 재료를 포함하는 사이토카인 유도 재료.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인 유도제가 균체 및 균체 유래 성분인 사이토카인 유도 재료.
제7항에 있어서, 상기 사이토카인 유도제가 항산균 (acid fast bacterium) 및 항산균 유래 성분인 사이토카인 유도 재료.
제7항에 있어서, 상기 사이토카인 유도제가 용련균 (hemolytic streptococcal) 및 용련균 유래 성분인 사이토카인 유도 재료.
제7항에 있어서, 상기 사이토카인 유도제가 방선균 (actinomycetes) 및 방선균 유래 성분인 사이토카인 유도 재료.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인이 인터페론-γ, 인터루킨-2, 인터루킨-10, 인터루킨-12, 종양 괴사 인자-α, 및 트랜스포밍 증식 인자-β로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 사이토카인인 사이토카인 유도 재료.
용기와, 용기 내에 수납된 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 사이토카인 유도 재료를 갖는 것을 특징으로 하는 사이토카인 유도 용구.
제12항에 있어서, 용기 내에 수납된 사이토카인 유도 재료가 혈액 또는 혈액 성분과 접촉되는 것을 특징으로 하는 사이토카인 유도 용구.