CZ294676B6

CZ294676B6 - Farmaceutický přípravek obsahující růstový faktor pocházející z krevních destiček

Info

Publication number: CZ294676B6
Application number: CZ19981024A
Authority: CZ
Inventors: John Cini; Amy Finkenaur
Original assignee: Ethicon, Inc.
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1996-09-24
Publication date: 2005-02-16
Also published as: BR9610790A; HU223880B1; DK0859596T3; WO1997012601A2; HUP9803002A3; ZA968398B; NO981539L; PL187174B1; CN1142791C; ATE209900T1; NO981539D0; AU706806B2; CN1211191A; US5705485A; JP4001382B2; ES2167611T3; WO1997012601A3; HUP9803002A2; KR19990064041A; EP0859596A2

Abstract

Farmaceutický přípravek obsahující a) růstový faktor pocházející z krevních destiček, PDGF, v množství účinném pro léčbu poranění; b) farmaceuticky přijatelný polymer celulózy; a c) farmaceuticky přijatelnou chemickou látku, nesoucí elektrický náboj, vybranou ze skupiny sestávající z kladně nabitých aminokyselin zvolených z lysinu, argininu, histidinu, kyseliny asparagové, kyseliny glutamové, alaninu, methioninu, prolinu, serinu, asparaginu a cysteinu, kladně nabitých polyaminokyselin, protaminu, aminoguanidinu a iontů zinku a hořčíku, přičemž tento přípravek má při teplotě místnosti formu vodného gelu s viskozitou 1000 až 500 000 mPa.s.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález popisuje farmaceutický přípravek obsahující růstový faktor pocházející z krevních destiček vykazující v organismu člověka mitogenní a angiogenní aktivitu.

Dosavadní stav techniky

Lidské polypeptidové růstové faktory jsou molekuly, které regulují růst normálních lidských buněk. Dosud bylo identifikováno množství lidských polypeptidových růstových faktorů a u těchto faktorů byla stanovena chemická struktura. Mezi takové faktory patří: epidermální růstový faktor (EGF-faktor), kyselý a bazický růstový faktor fibroblastů (FGF-faktor), růstový faktor pocházející z krevních destiček (PDGF-faktor), transformující růstový faktor-alfa (TGF-alfa), transformující růstový faktor-beta (TGF-beta), růstové faktory podobné insulinu (IGF-I a IGF-II) a růstový faktor neuronů (NGF-faktor). Vzhledem ke schopnosti stimulovat růst buněk, bylo u lidských polypeptidových růstových faktorů navrženo jejich využití při urychlení procesu léčby (hojení) poranění.

Doposud nebyly popsány žádné vhodné systémy pro aplikaci jakéhokoliv růstového faktoru za účelem léčby poranění. Je zvláště žádoucí vytvořit takové aplikační systémy, které řídí uvolňování daného růstového faktoru do místa poranění, a které přilnou nebo se dokáží udržet v místě poranění po delší časový úsek, čímž je zajištěna delší doba kontaktu zmíněného růstového faktoru s tímto místem poranění. Tento vynález popisuje aplikační systémy ve formě gelů obsahujících růstové faktory. Biokompatibilní materiály gelů mohou být použity k přísunu růstového faktoru do místa poranění a výhodou použití těchto materiálů je řízený profil přísunu daného růstového faktoru a zvlhčení okolí poranění.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je farmaceutický přípravek obsahující

a) růstový faktor pocházející z krevních destiček, PDGF, v množství účinném pro léčbu poranění;

b) farmaceuticky přijatelný polymer celulózy; a

c) farmaceuticky přijatelnou chemickou látku, nesoucí elektrický náboj, vybranou ze skupiny sestávající z kladně nabitých aminokyselin zvolených z lysinu, argininu, histidinu, kyseliny asparagové, kyseliny glutamové, alaninu, methioninu, prolinu, šeřinu, asparaginu a cysteinu, kladně nabitých polyaminokyselin, protaminu, aminoguanidinu a iontů zinku a hořčíku. Podstata tohoto přípravku spočívá v tom, že má při teplotě místnosti formu vodného gelu s viskozitou 1000 až 500 000 mPa.s.

Výhodná provedení zahrnují přípravky, kde

- PDGF je homodimer PDGF-B;

- koncentrace PDGF-faktoru je v rozmezí 1,0 pg až 1000 pg na gram přípravku;

- polymerem celulózy je karboxymethylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza nebo methylcelulóza;

-1 CZ 294676 B6

- koncentrace polymeru celulózy je 1,5 až 3,0 % hmotnostního a jeho molekulová hmotnost je v intervalu 450 000 až 4 000 000;

- koncentrace látky nesoucí elektrický náboj je v rozmezí od 0,1 do 3,0 % hmotnostního;

- viskozita přípravku je v intervalu 50 000 až 150 000 mPa.s;

- přípravek navíc obsahuje konzervační látku, jako je methylparaben, propylparaben a mkresol;

- PGDF je homodimer lidského PDGF-B, polymer celulózy je karboxymethylcelulóza a chemická látka nesoucí elektrický náboj na lysin.

V obzvláště výhodném provedení přípravek obsahuje v gramech na 100 gramů gelu

0,01 g rhPDGF-B; 2,40 g sodné soli karboxymethylcelulózy; 0,81 g chloridu sodného; 0,157 g trihydrátu octanu sodného; 0,0065 g ledové kyseliny octové; 0,162 g methylparabenu; 0,018 g propylparabenu; 0,09 g m-kresolu; 0,5 g L-lysinu ve formě hydrochloridu a 100 g vody na injekce, přičemž viskozita tohoto přípravku při 37 °C je 20 000 až 200 000 mPa.s; nebo

0,1 g rhPDGF-B; 23,103 g sodné soli karboxymethylcelulózy; 7,748 g chloridu sodného; 1,511 g trihydrátu octanu sodného; 0,0624 g ledové kyseliny octové; 4,813 g L-lysinu ve formě hydrochloridu; a 962,63 g vody na injekce, přičemž viskozita tohoto přípravku při 37 °C je 1000 až 15 000 mPa.s.

Předmětem vynálezu je také přípravek uvedený výše při použití pro léčení poranění, při němž se poranění pacienta uvede do styku s tímto přípravkem.

Vynález popisuje vodné gelové přípravky nebo viskózní roztoky použitelné k řízenému uvolňování růstových faktorů v místě poranění. Přesné složení použitého přípravku bude záviset na druhu požadované aplikace. Do rozsahu vynálezu spadají tři odlišná použití těchto přípravků, a to jmenovitě gely pro léčbu povrchových nebo hlubokých poranění, gely pro léčbu poranění v přední komoře oka a vodné přípravky o nízké viskozitě použitelné pro aplikace, u kterých je žádoucí použití tekutějšího přípravku s vyšším obsahem vody.

Vodné gelové přípravky pro léčbu povrchových nebo hlubokých poranění zahrnují množství nějakého polypeptidového růstového faktoru vykazujícího v organizmu člověka mitogenní nebo angiogenní aktivitu, účinné pro léčbu poranění. Tyto přípravky navíc obsahují farmaceuticky přijatelné polymemí sloučeniny rozpustné ve vodě, které zajišťují viskozitu daného přípravku v intervalu 1000 až 12 000 000 mPa.s (milipascal x sekunda). Měření viskozity jsou obvykle prováděna za pokojové teploty nebo při teplotách vyšších. Vodné gelové přípravky pro léčbu poranění v přední komoře oka obsahují polymemí sloučeniny (přijatelné pro použití v oku) rozpustné ve vodě, kdy tyto polymery zajišťují viskozitu daného přípravku při teplotě v místnosti intervalu 1000 až 100 000 mPa.s. Vodné přípravky o nízké viskozitě obsahují farmaceuticky přijatelné (nebo přijatelné pro použití v oku) polymemí sloučeniny rozpustné ve vodě, kde tyto polymery zajišťují viskozitu daného přípravku při pokojové teplotě v intervalu 1 až 5000 mPa.s. Přípravky o nízké viskozitě se ve výhodných provedeních používají při léčbě poranění oka. Tyto přípravky mohou být nicméně rovněž použity při léčbu jiných typů poranění, zvláště pak, jsou-li použity k impregnaci obvazů umístěných na místo poranění.

Výhodou gelových přípravků podle vynálezu je jejich schopnost přilnout k místu poranění a přizpůsobit se nepravidelným konturám těla nebo místa poranění. Zmíněné gely mohou být aplikovány přímo do místa poranění nebo mohou být aplikovány spolu s vhodným porézním nebo mikroporézním substrátem například ve formě obkladu aplikovaného na místo poranění.

-2CZ 294676 B6

Dalšími výhodami těchto gelů je jejich vysoký obsah vody (který udržuje vlhkost v místě poranění), schopnost absorbovat exsudát (zánětlivou tekutinu) z poranění, snadná aplikace do místa poranění a snadné odstranění omytím. Jsou-li tyto gely aplikovány do místa poranění navozují zde chladivý pocit, čímž přispívají ktomu, aby se pacient cítil lépe, a jsou pacienty lépe přijímány, zvláště pak u citlivých poranění.

Gelové přípravky podle vynálezu rovněž slouží jako systémy pro řízené uvolňování růstových faktorů v místě poranění. Jako řízené uvolňování je označováno uvolňování léčiva (účinné látky) udržující terapeutickou hladinu daného léčiva v delším časovém úseku - až 24 hodin nebo déle. Bylo zjištěno, že k dosažení podstatného zvýšení rychlosti hojení poranění je nezbytné prodloužení doby kontaktu růstových faktorů s místem poranění. Gelové přípravky podle vynálezu prodlužují dobu kontaktu růstových faktorů s místem poranění a slouží jako dávkovači forma pro řízené uvolňování. To je důležité výhodou, protože je umožněno podávání daného přípravku do místa poranění s menší frekvencí, a tudíž dochází k menšímu dráždění místa poranění a buněčných komponent, zvláště pak v různých fázích mitózy.

Vodné gely podle vynálezu mohou mít, v závislosti na požadované aplikaci gelu, rozdílné viskozity. Viskozita je mírou odporu kapaliny k tomu a je definována jako poměr smykového napětí a gradientu rychlosti. Smykové napětí je odpor kapaliny vůči toku vyvolanému působením vnější síly, tj. odpor molekul uvnitř kapaliny vůči vnější síle. Smykové napětí je definováno jako poměr síly působící na smykovou plochu. Je-li kapalina vystavena působení smykového napětí, pak za předpokladu laminámího toku se jednotlivé vrstvy kapaliny pohybují rozdílnými rychlostmi. Relativní poměr rychlostí pohybu těchto jednotlivých vrstev je pouze jedním faktorem gradientu rychlosti. Druhým faktorem je vzdálenost mezi jednotlivými smykovými plochami. Viskozita je udávána v jednotkách dyn x sekunda x cm². Tato jednotka je označována jako Poise. V této přihlášce je viskozita (není-li řečeno jinak) udávána v jednotkách mPa.s (milipascal x sekunda; ImPa.s = lcPs (centipoise)), jak je měřena Brokfieldovým viskozimetrem. Není-li řečeno jinak, jsou všechny hodnoty viskozity udávány pro teplotu místnosti, tj. 22 až 25 °C.

Jako polypeptidové růstové faktory jsou ve vynálezu označovány faktory, které v organizmu člověka vykazují mitogenní nebo angiogenní aktivitu, a které jsou vybrány ze skupiny zahrnující EGF-faktor, kyselý FGF-faktor, bazický FGF-faktor, PDGF-faktor, TGF-alfa, TGF-beta, angiogenin, NGF-faktor, IGF-I, IGF-II a jejich směsi. Do rozsahu vynálezu rovněž spadá použití biologicky aktivních fragmentů nebo chemicky syntetizovaných derivátů těchto růstových faktorů namísto celých přirozeně se vyskytujících molekul zmíněných růstových faktorů. U EGF-faktoru, kyselého a bazického FGF-faktoru, TGF-alfa a TGF-beta byla mimo mitogenní aktivity pozorována rovněž aktivita angiogenní. Ve výhodných provedeních budou růstové faktory produkovány s využitím rekombinantních technik.

Termínem „lidský EGF-faktor“ je v této přihlášce označován EGF-faktor o aminokyselinové sekvenci nebo podstatné části sekvence popsané v publikaci Urdea a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80:7461 až 7465, 1983. Termínem „lidský EGF-faktor“ je rovněž označována jakákoli přirozeně se vyskytující varianta EGF-faktoru, jako například gama-urogastron. Epidermální růstový faktor, lidský epidermální růstový faktor a rovněž jiné růstové faktory mohou být izolovány z přírodních zdroj, produkovány s využitím rekombinantních technik nebo připraveny chemickou syntézou.

Termín „EGF-faktor“ používaný v této přihlášce označuje třídu polypeptidů, jejich biologická aktivita je podobná aktivitě, kterou vykazuje přirozeně se vyskytující lidský EGF-faktor, tak, jak je měřena v uznávaných biologických stanoveních, jako například ve stanovení sledujícím vazbu EGF-faktoru na receptor opsaném v přihlášce US 4717717. Zmíněná třída polypeptidů má rovněž konzervovány určité aminokyselinové zbytky a stejné umístění disulfídových vazeb, jak je popsáno v publikaci Carpenter a další, „Epidermal Growth Factor, its receptor and related proteins“, Experimental Cell Research, 164: 1 až 10, 1986. Termín, EGF-faktor tudíž zahrnuje EGF-faktor produkovaný rekombinantními technikami, myší EGF-faktor izolovaný z podčelist

-3 CZ 294676 B6 nich žláz myší, EGF-faktor potkanů a přirozeně se vyskytující lidský EGF-faktor, který může být izolován z lidské moči, a biologicky aktivní deriváty a příbuzné polypeptidy jakéhokoliv z výše uvedených EGF-faktorů, včetně prekurzorů, které jsou na aktivní epidermální růstový faktor přeměněny proteolýzou in šitu.

PDGF-faktor je klíčovým mitogenem vyskytujícím se v séru a tento faktor stimuluje in vitro proliferaci buněk odvozených z mesenchymu, jako například fíbroblast, gliových buněk a buněk hladkého svalstva. Data o aminokyselinové sekvenci tohoto faktoru ukázala, že PDGF-faktor je tvořen dvěma rozdílnými, ale homogenními, polypeptidovými řetězci, a to řetězcem A a řetězcem B. Bylo zjištěno, že tyto dva řetězce vytvářejí dimery PDGF-faktor-AA, PDGF-faktor-Bd a PDGF-faktor-AB. Aminokyselinové sekvence řetězce A a B PDGF-faktoru byly stanoveny a sekvence řetězce B je popsána v publikaci Johnsson a další, EMBO J. 3:921 až 928, 1984. Termín „rhPDGF-B“ používaný v této přihlášce označuje homodimer B-B PDGF-faktoru připravený rekombinantními technikami.

Množství polypeptidového růstového faktoru účinné k léčbě poranění se, pro účely použití podle této přihlášky, pohybuje v intervalu přibližně 0,01 až přibližně 1000 mikrogramů na mililitr. Ve výhodném provedení je koncentrace daného růstového faktoru v rozmezí přibližně 1 až 500 mikrogramů/ml a ještě výhodněji pak 1 až 100 mikrogramů/ml. Gely podle vynálezu jsou schopny zajistit prodloužené uvolňování příslušného polypeptidového růstového faktoru.

Materiály vytvářející gel podle vynálezu mohou být polymery rozpustné ve vodě se schopností vytvářet viskózní vodné roztoky nebo ve vodě nerozpustné polymery, které ve styku s vodou bobtnají (například kolagen), a tak rovněž vytvářejí viskózní roztoky. Bobtnajícími polymery jsou polymery, které ve styku s vodou tuto vodu absorbují, místo aby se v ní rozpouštědly. Do rozsahu tohoto vynálezu tedy spadají zesíťované formy polymerů. Termín „zesíťování“ označuje kovalentní spojení řetězců příslušného polymeru nějakým bifunkčním činidlem, jako například glutaraldehydem. Odborníkům je rovněž zřejmé, že určité polymery musí být, za účelem dosažení rozpustnosti ve vodě, použity ve formě solí nebo částečně neutralizovány. Kyselina hyaluronová je například, aby bylo dosaženo její rozpustnosti ve vodě, používána ve formě hyaluronátu sodného.

Polymery použité ve vodných gelových přípravcích pro léčbu povrchových nebo hlubokých poranění mohou být vybrány ze skupiny zahrnující vinylové polymery, kopolymery polyoxyethylen/polyoxypropylen, polysacharidy, proteiny, polyethylenoxid, akrylamidové polymery a deriváty a soli těchto polymerů. Je zřejmé, že termín polyethylenoxid zahrnuje polyethylenglykol. Jako polymery použité v gelových přípravcích pro léčbu poranění v přední komoře oční mohou být využity stejné polymery zmíněné výše, s výjimkou kopolymerů polyoxyethylen/polyoxypropylen nebo polyethylenoxidu, které v těchto přípravcích nejsou s výhodou využívány. Ve výhodném provedení jsou polymery použité v přední komoře oční rovněž biologicky degradovatelné, tzn., že zmíněné polymery mohou být rozloženy na neškodné složky, které mohou být z přední komory oční vyplaveny nebo zde mohou být metabolizovány. Jako polymery tvořící gel použité ve vodných přípravcích o nízké viskozitě pro léčbu poranění oka mohou být využity stejné polymery zmíněné u přípravků pro léčbu povrchových nebo hlubokých poranění, s výjimkou polyethylenoxidu, který v těchto přípravcích není s výhodou využíván.

Vinylové polymery (rovněž známé jako substituované polyethyleny) použitelné v této přihlášce mohou být vybrány ze skupiny zahrnující kyselinu polyakrylovou, kyselinu polymetakrylovou, polyvinylpyrrolidon a polyvinylalkohol. Polysacharidy použitelné v této přihlášce mohou být vybrány ze skupiny zahrnující celulózu nebo deriváty celulózy, glykosaminoglykany, agar, pektin, kyselinu alginovou, dextran, škrob a chitosan. Ve výhodném provedení se jedná o aamylózu, která je ve vodě více rozpustná. Glykosaminoglykany mohou být vybrány ze skupiny zahrnující kyselinu hyaluronovou, chondroitin, chondroitin-4-sulfát, chondroitin-6-sulfát, dermatansulfát, keratansulfát, heparansulfát a heparin. Glykosaminoglykany mohou být použity k urychlení léčby poranění ve směsi s jakýmkoliv jiným polymerem tvořícím gel. Proteiny

-4CZ 294676 B6 použitelné v této přihlášce mohou být vybrány ze skupiny zahrnující kolagen, želatinu a fibronektin. Akrylamidovými polymery mohou být polyakrylamidové nebo polymetakrylamidové polymery. Ve výhodném provedení se jedná o biologicky kompatibilní polyakrylamidové polymery.

Viskozita gelových přípravků pro léčbu povrchových nebo hlubokých poranění může při pokojové teplotě spadat do intervalu 1000 až 12 000 000 mPa.s. Ve výhodném provedení leží viskozita v intervalu 1000 až 2 000 000 mPa.s., výhodněji pak v intervalu 1000 až 500 000 mPas. a nej výhodněji v rozmezí 1000 až 150 000 mPa.s. V jednom výhodném provedení vynálezu může gelový přípravek pro topickou aplikaci obsahovat 0,1 až 5 hmotnostních procent karboxymethylcelulózy (CMC) nebo sodné soli karboxymethylcelulózy (NaCMC) s molekulovou hmotností 450 000 až 4 000 000. Ve výhodném provedení je použita CMC s molekulovou hmotností 450 000 až 4 000 000 v koncentraci 1,5 až 4 % (hmotnostně). Hodnota pH gelu na bázi CMC by měla spadat do intervalu 4,5 až 8 a ve výhodném provedení pak do intervalu 5 až 7.

V jiném provedení vynálezu mohou gely podle vynálezu pro léčbu povrchových nebo hlubokých poranění obsahovat 15 až 60 % (hmotnostně) blokové kopolymery polyoxyethylen/polyoxypropylen s molekulovou hmotností v intervalu přibližně 500 až 50 000. Ve výhodném provedení je zmíněný blokový kopolymer přítomen v množství 15 až 40 % (hmotnostně) a má molekulovou hmotnost v intervalu přibližně 1000 až 15 000. Tyto blokové kopolymery, používané ve vynálezu, jsou běžně označovány názvem Pluronic. Ve výhodném provedení jsou používány Pluronic F88 a Pluronic F127.

V dalším provedení vynálezu mohou gely podle vynálezu pro léčbu povrchových nebo hlubokých poranění s molekulovou hmotností v intervalu 500 000 až 8 000 000. Ve výhodném provedení je kyselina hyaluronová přítomna v množství 1,5 až 6,0% (hmotnostně) a její molekulová hmotnost je vyšší než 1 000 000.

Polymery akrylamidu mohou být užitečné při léčbě všech typů poranění, zvláště pak poranění v přední komoře oční. Absorbovatelný polymer akrylamidu, jako například polyakrylamid, může být vhodnou náhražkou nosičů, jakými je například kyselina hyaluronová, používaných v současnosti v očních přípravcích. Polymery akrylamidu mohou mít molekulovou hmotnost v rozmezí 1 000 000 až 13 000 000, ve výhodném provedení pak 4 000 000 až 6 000 000. Procentuální zastoupení (hmotnostně) polymeru akrylamidu v daném gelu může být 2 až 5 %, výhodněji pak 3,5 až 4,5 %. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají substituované polymery akrylamidu, jako například polymery substituované methylovými a alkylovými skupinami.

Aplikační systémy na bázi akrylamidových gelů pro použití v přední komoře oční mají následující charakteristiky: jakékoliv produkty rozpouštění nebo degradace matrice sloužící k řízenému uvolňování jsou netoxické a neucpávají trámčinu; daný gel je průhledný; a zmíněný gel může být ponechán v přední komoře oční, aniž by měl nežádoucí klinické účinky, jako například nepřijatelné zvýšení nitroočního tlaku.

Odborníkům bude samozřejmě zřejmé, že viskozity v požadovaném intervalu může být dosaženo změnou molekulové hmotnosti a procentuální koncentrace příslušného polymeru v daném přípravku. Gel o nízké viskozitě může být například připraven použitím polymeru o nízké molekulové hmotnosti nebo nízké procentuální koncentraci nebo kombinací obou zmíněných faktorů. Gel o vysoké viskozitě může být připraven použitím polymeru o vyšší molekulové hmotnosti nebo ve vyšším procentuálním zastoupení. Gely s viskozitou ležící mezi výše zmíněnými viskozitami mohou být připraveny odpovídajícími změnami v molekulových hmotnostech a procentuálních koncentracích použitých polymerů.

V gelových přípravcích, jmenovitě v přípravcích pro použití k léčbě poranění v přední komoře oční a nízkoviskozitních roztoků pro léčbu poranění oka, u kterých je žádoucí nižší hodnota viskozity ve srovnání s gely pro léčbu povrchových a hlubokých poranění, může být za účelem

-5 CZ 294676 B6 dosažení požadované viskozity měněno procentuální zastoupení příslušného polymeru a jeho molekulová hmotnost. Gel pro použití v přední komoře oční může například obsahovat 1 až 20 % (hmotnostně) polymeru celulózy s molekulovou hmotností 80 000 až 240 000. Ve výhodném provedení se jedná o koncentrace v intervalu 1 až 3 %. V jiném provedení může gel pro použití v přední komoře oční obsahovat kyselinu hyaluronovou s molekulovou hmotností 500 000 až 8 000 000 v koncentraci 0,5 až 5 % (hmotnostně). Ve výhodném provedení se jedná o kyselinu hyaluronovou s molekulovou hmotnostní 2 000 000 až 4 000 000 v koncentraci 0,5 až 2,0 % (hmotnostně). Ve výhodném provedení spadá viskozita gelu používaného v přední komoře oční do intervalu 1000 až 100 000 mPa.s.

Roztoky o nízké viskozitě mohou obsahovat 0,1 až 2 % (hmotnostně) kyseliny polyakiylové s molekulovou hmotností 100 000. Ve výhodném provedení je tento polymer zastoupen v koncentraci 0,05 až 0,5 %. V jiném provedení mohou tyto zředěné viskózní roztoky obsahovat 2 až 40 % (hmotnostně) kopolymerů polyoxyethylen/polyoxypropylen s molekulovou hmotností v intervalu přibližně 500 až 50 000. Ve výhodném provedení se jedná o koncentraci 2 až 20 % a molekulovou hmotnost 1000 až 15 000. V jiném provedení může daný zředěný viskózní roztok obsahoval polymer celulózy o molekulové hmotnosti přibližně 80 až 240 000 v koncentraci 1 až 20 %. Ve výhodném provedení se jedná o koncentrace v intervalu 1 až 10 %. V dalším provedení vynálezu může zředěný viskózní roztok obsahovat kyselinu hyaluronovou s molekulovou hmotností 500 000 až 8 000 000 v koncentraci 0,5 až 5 % (hmotnostně). Ve výhodném provedení se jedná o kyselinu hyaluronovou s molekulovou hmotností 1 000 000 až 6 000 000 v koncentraci 0,5 až 2,0 % (hmotnostně). Bude-li zředěný viskózní roztok použit ve formě očních kapek, bude ve výhodném provedení jeho viskozita v intervalu 1 až 1000 mPa.s. Jestliže bude tento roztok použit v jiným aplikacích, jako například k impregnaci obvazů, pak by měl mít ve výhodném provedení viskozitu spadající do intervalu 1,0 až 5000 mPa.s.

Polymery celulózy používané v gelech podle vynálezu jsou schopny chránit polypeptidové růstové faktory před ztrátou aktivity ve vodných roztocích. Použití polymerů celulózy ke stabilizaci EGF-faktoru, (chránící tento faktor před ztrátou aktivity) je popsáno v přihlášce US4717717. Polymery celulózy používané podle této přihlášky jsou etherifíkované polymery celulózy jako například alkylové deriváty celulózy, hydroxyalkylové deriváty celulózy a alkylhydroxyalkylové deriváty celulózy, například methylcelulóza, hydroxyethylcelulóza, karboxymethylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza a hydroxypropylcelulóza. Ve výhodném provedení jsou používány methylcelulóza a hydroxyalkylové deriváty celulózy jako například karboxymethylcelulóza, hydroxypropylcelulóza, hydroxyethylcelulóza a hydroxypropylmethylcelulóza.

Stabilita gelových přípravků na bázi polymerů celulózy obsahujících PDGF-faktor může být podstatně zvýšena přídavkem nabitých chemických sloučenin, jako například nabitých aminokyselin nebo iontů kovů. Mezi aminokyseliny, které mohou být s výhodou použity, patří lysin, arginin, histidin, kyselina asparagová, kyselina glutamová, alanin, methionin, prolin, serin, asparagin a cystein. Dále mohou být rovněž použity aminoguanidin a protamin. Mezi ionty kovů, které mohou být v gelových přípravcích s výhodou použity, patří ionty zinku a hořčíku. Zmíněné aminokyseliny mohou být použity jako volné kyseliny nebo ve formě solí, jako například solí kyseliny chlorovodíkové. Termín „stabilita“ používaný v přihlášce označuje ochranu PDGFfaktoru před ztrátou jeho mitogenní aktivity v gelu nebo zvýšení množství PDGF-faktoru uvolňovaného z daného gelu. Předkládaná přihláška popisuje gelové přípravky s PDGF-faktorem, které jsou vhodné pro léčbu poranění.

Zvýšení stability PDGF-faktoru v gelech na bázi CMC (karboxymethylcelulózy) může být dosaženo minimalizací interakcí nábojů mezi jednotlivými molekulami PDGF-faktoru nebo minimalizací interakcí mezi PDGF-faktorem a redukujícími konci CMC. Této minimalizaci interakcí může být dosaženo přídavkem kompletujících kladně nebo záporně nabitých protiiontů. Během formulace je výhodné přidat k danému přípravku nějaké konzervační činidlo nebo tento přípravek sterilizovat, a to například filtrací nebo zahřátím na teplotu přibližně 122 °C při tlaku do přibližně 0,1 MPa po dobu několika minut.

-6CZ 294676 B6

Gelové přípravky podle vynálezu mohou být použity k impregnaci vláken absorbující obvazové gázy, čímž je vytvořena bandáž, která může být následně přiložena na místo poranění. Pro zmíněnou aplikaci jsou ve výhodném provedení používány přípravky o nízké viskozitě. Bandáž pro léčbu poranění může být připravena namočením obvazové gázy ve vodném gelovém roztoku obsahujícím lidský polypeptidový růstový faktor vykazující mitogenní aktivitu. Tato bandáž může být následně přiložena na místo poranění tak, aby vlákna obvazové gázy pokrytá zmíněným roztokem byla v kontaktu s místem poranění, stimulovala růst buněk a tím urychlila léčbu (hojení) daného poranění.

Gely podle vynálezu jsou použitelné v přípravcích ve formě očních kapek, roztoků k výplachu očí, mastí pro léčbu poranění a podobně. Poranění, která mohou být léčena s využitím přípravků podle vynálezu, jsou poranění, která vznikají náhodně nebo následkem lékařského zákroku, kdy je poškozena vrstva epithelu. Takovými poraněními jsou například poranění oka, která jsou důsledkem vředů rohovky, radiokeratotomie, transplantací rohovky, epikeratopakie a jiných poranění oka navozených chirurgickým zákrokem; a kožní poranění jako například popáleniny, řezné rány, poranění dárcovského místa kožních transplantátů a vředy (kožní, dekubitální (proleženiny), při žilním městnání a diabetické). Termínem „léčba poranění oka“ je v přihlášce označována léčba poranění v přední komoře oční a rovněž léčba podspojivkových poranění. Gely podle vynálezu mohou být rovněž použity jak k léčbě vnitřních řezných ran, tak i léčbě vnitřních poranění jako například žaludečních vředů.

V případech, kdy je gel aplikován na vnitřní poranění nebo do řezné rány, jsou s výhodou používány gely na bázi degradovatelných polymerů. Obvykle degradovatelnými polymery jsou přirozeně se vyskytující polymery. Příkladem takových polymerů jsou kolagen, glykosaminoglykany, želatina a škrob. Polymery na bázi celulózy a rovněž syntetické polymery, jako například vinylové polymery, degradovatelné nejsou. Odborníkům je biologická degradovatelnost polymerů popsaných v této přihlášce dobře známa.

Následující příklady jsou uvedeny za účelem ilustrace provedení vynálezu. Rozsah vynálezu není těmito příklady nikterak omezen, jedinými omezeními jsou připojené patentové nároky.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Gely na bázi karboxymethylcelulózy

Gely na bázi karboxymethylcelulózy (CMC nebo NaCMC) byly připraveny postupy podle vynálezu. Jako sodná sůl karboxymethylcelulózy je ve výhodném provedení použita CMC (NaCMC) označována jako CMC farmaceutické kvality 7H3SFHP. Do vody na injekce (WFI - Water for injection) o hmotnosti 226,2 kg a teplotě 80 °C byly, ve směšovací nádobě Fryma o objemu 350 litrů, přidány následující složky: 1946,3 chloridu sodného, 1203,5 g L-lysinu ve formě soli s kyselinou chlorovodíkovou. Směs byla míchána po dobu 10 minut. Při spuštěném interním homogenizátoru (přibližně 2850 otáček za minutu) bylo do této směsi přidáno (v čase kratším než 5 minut) 5776,8 NaCMC. Po 10 minutách byl homogenizátor vypnut. Směs byla míchána při frekvenci 44 otáček za minutu a ochlazena na 25 °C. Po dosažení teploty 25 °C byl tlak nad touto směsí upraven na hodnotu 80 kPa (kilopascalů) a směs byla sterilizována po dobu 20 minut při teplotě 122 C.

Po sterilizaci byla směs ochlazena na 25 °C. Byly smíchány následující složky: 11,712 litrů WFI (voda na injekce), 377,9 g trihydrátu octanu sodného a 15,6 g kyseliny octové. Takto připravená směs byla asepticky, přefiltrováním přes sterilizační filtr přidána ke gelu připravenému postupem

-7CZ 294676 B6 popsaným výše. Výslední směs byla míchána po dobu 30 minut a poté do ní byl za stálého míchání asepticky přidán roztok rhPDGF-B (25 g) ve 2500 ml WFI. Poté následovalo promytí 250 ml WFI. Takto připravený gel byl míchán po dobu 2 hodin a poté přenesen do přepravní nádoby z nerezové oceli. Gel byl připraven do plnicího zařízení a naplněn do nádob, které byly 5 následně tepelně zataveny. Při teplotě 37 °C měl tento gel viskozitu 2883 mPa.s.

Příklad 2

Gely na bázi karboxymethylcelulózy

Gely na bázi karboxymethylcelulózy byly připraveny následujícím způsobem:

K 1900 g vody o vysoké čistotě zahřáté na teplotu 70 až 80 °C bylo přidáno 3,24 g methyl15 parabenu a 0,36 g propylparabenu a směs byla míchána dokud byly pozorovány nerozpuštěné částice. Po rozpuštění parabenů bylo do tohoto roztoku přidáno 3,14 g octanu sodného a 8,086 g chloridu sodného a byl odstraněn zdroj tepla. Po rozpuštění přidaných látek byl roztok ochlazen na 15 až 30 °C. K ochlazenému roztoku bylo přidáno 136 μΐ kyseliny octové a 1,74 ml mkresolu. Po dokonalém promíchání byla změřena hodnota takto připraveného pufru (pH = 5,63) 20 a objem byl přídavkem vody upraven na výslednou hodnotu (přibližně 2 litry). Hodnota pH výsledného roztoku byla 5,60. K 585,5 g takto připraveného roztoku pufru umístěnému v plastové lahvi o objemu 1 litr byly přidány 3,0 g L-lysinu ve formě soli s kyselinou chlorovodíkovou a vzniklá směs byla míchána dokud byly pozorovány nerozpuštěné částice. Za stálého míchání mixerem Lightning Labmaster (1300 otáček za minutu) bylo k výše zmíněnému roztoku pufru 25 přidáno, s využitím upravené násypky a v času kratším než 30 sekund, 14,4 g CMC Aqualon kvality 73H3SFHP. Takto připravený byl míchán celkem 90 minut a výsledná koncentrace CMC byla 2,4 %.

Do tohoto gelu byl přidán roztok léčivé látky rhPDGF-B (koncentrace rhPDGF-B byla stano30 véna z hodnoty optické hustoty měřené při vlnové délce 280 nm) na výslednou koncentraci

100 pg rhPDGF-B na gram gelového základu, a to následovně: Ke 2,4 % CMC gelu bylo za použití injekční stříkačky přidáno 6 g roztoku rhPDGF-B (OD =10 mg/ml) tak, že byl zmíněný roztok léčivé látky vstříknut do gelového základu na několika místech. Gel byl ručně míchán několik minut a poté po dobu 1 hodiny mísičem Heidolph při 300 otáček za minutu pod 35 atmosférou dusíku filtrovaného přes filtr s průměrem pórů 0,2 pm. Následně byl gel po dobu hodiny válcován při nízké rychlosti na válcovém mlýnu. Poté byl gel rhPDGF-B/CMC naplněn do laminátových tub Teledyne (přibližně 10 gramů/tuba) a tuby byly zataveny pomocí strojové pro tepelné svařováni Kalix. Celkový výtěžek byl 55 tub.

Příklad 3

Gely na bázi karboxymethylcelulózy

Gely na bázi karboxymethylcelulózy (gely CMC nebo NaCMC) byly připraveny postupem podle tohoto vynálezu. Jako sodná sůl karboxymethylcelulózy je ve výhodném provedení použita CMC (NaCMC) označována jako CMC farmaceutické kvality 7H3SFHP. Do vody o hmotnosti 28,4 kg a teplotě 80 °C bylo, ve směšovací nádobě Fryma o objemu 50 litrů, přidáno 48,6 g methylparabenu a 5,4 g propylparabenu a směs byla míchána po dobu 1 hodiny. Poté byla směs 50 ochlazena na 30 °C a za stálého míchání kotvovým mísičem (16 otáček za minutu) do ní byly přidány následující pomocné látky: 47,1 g octanu sodného, 242,6 g chloridu sodného, 150 g Llysinu ve formě soli s kyselinou chlorovodíkovou a 2,0 g ledové kyseliny octové. Po vypnutí kotvového mísiče a při otáčkách kotouče v rozpouštěcí nádobě nastavených na hodnotu 1300 až 1600 otáček za minutu bylo do víru kapaliny přidáno, v čase kratším než 1 minuta, 720 g

-8CZ 294676 B6 práškové CMC. Po přidání CMC byl kotvový mísič spuštěn a celá směs byla míchána po dobu 1 hodiny. Po šesti minutách byl kotouč v rozpouštěcí nádobě vypnut.

Po uplynutí jedné hodiny byla směs sterilizována po dobu 20 minut při teplotě 122 °C a po sterilizaci byla směs ochlazena na teplotu místnosti. K této směsi bylo přidáno 27 g m-kresolu a vzniklá směs byla míchána po dobu 1 hodiny. Poté byl do tohoto sterilního gelu asepticky přidán PDGF-faktor a gel byl následně míchán po dobu 1 hodiny. Výsledná viskozita měřená při 37 °C byla 8200 mPa.s.

Příklad 4

Gely na bázi karboxymethylcelulózy

Gely na bázi karboxymethylcelulózy (gely CMC nebo NaCMC) byly připraveny postupem podle tohoto vynálezu. Pro přípravu byla použita sodná sůl karboxymethylcelulózy farmaceutické kvality (7H3SFHP). Do směšovací nádoby Turbo Emulsifier o objemu 350 litrů bylo umístěno 247,4 kg purifíkované vody. Při vnitřním homogenizátoru zapnutém na maximum (1400 otáček za minutu) byly do vody ve směšovací nádobě přidány následující složky: 405 g methylparabenu a 45 g propylparabenu. Směs byla homogenizována po dobu 5 minut a poté míchána při 16 otáčkách za minutu při teplotě zvyšující se na 60 °C. Po dosažení 60 °C byla směs míchána po dobu 1 hodiny. Poté byl roztok ochlazen na 30 °C a do tohoto roztoku byly přidány následující složky: 2020 g chloridu sodného, 392 g trihydrátu octanu sodného, 1250 g L-lysinu ve formě soli s kyselinou chlorovodíkovou, 16,25 g kyseliny octové a 225 g m-kresolu. Výsledná směs byla míchána po dobu 15 minut. Následně byl tento roztok přenesen do zásobníku tanku a do násypky homogenizátoru Flashblend bylo vpraveno 6000 g sodné soli karboxymethylcelulózy. Ze zásobníku tanku byl roztok přes homogenizátor Flashblend přepumpován zpět do směšovací nádoby Turbu Emulsifier a do zmíněného roztoku pufru byla přidána CMC.

Vzniklý gel byl míchán po dobu 2 hodin. K tomuto gelu byl přidán roztok 26,05 g rhPDGF-B ve 2631 g vody a poté následovalo promytí 100 g vody. Tento gel byl míchán po dobu 2 hodin. Ze směšovací nádoby byl odčerpán vzduch a namísto toho zde byl přiveden dusík.

Gel byl naplněn do 15 g tub. Výsledná viskozita měřená při 37 °C byla 75 812 mPa.s.

Příklad 5

Gely na bázi kyseliny polyakrylové

Gely na bázi kyseliny polyakrylové (Carbopol) byly připraveny postupem podle tohoto vynálezu. Ve výhodných provedeních jsou použity třídy kyseliny polyakrylové označované jako Carbopol 934 P a Carbopol 940 v koncentracích 0,02 g 1,5 %. Čím vyšší je koncentrace kyseliny polyakrylové, tím je pomalejší uvolňování EGF-faktoru. Viskozita gelů na bázi kyseliny polyalkrylové je stabilní v intervalu pH 6 až 10, ve výhodném provedení pak v rozmezí pH 6,5 až 7.5.

V kádince o objemu 4 litry byly smíchány následující složky: 6,3 g methylparabenu, 0,7 g propylparabenu a 177,5 g manitolu ve 3500 ml vody. Tento roztok byl míchán lopatkovým míchačem dokud nebyly pevné částice rozpuštěny. Za stálého míchání při 1000 otáčkách za minutu byla do zmíněného roztoku přes síto propustné pro částice do velikosti 0,147 mm (40 mesh) přidána kyselina polyakrylová (17,5 g, Carbopol 940, BF Goodrich). Tímto byly částice kyseliny polyakrylové dispergovány a nabobtnány. Roztok byl neutralizován (na hodnotu pH 7,0) přídavkem 7,6 g pevného NaOH ve formě 10% roztoku. Z této šarže bylo odebráno 900 g gelu a tato část byla sterilizována autoklávováním. Zbylá část postupu byla prováděna v místnosti třídy 100. Zásobní roztok EGF-faktoru o koncentraci 1,18 miligramů/ml (12 ml) byl

-9CZ 294676 B6 přefiltrován přes filtr o velikosti pórů 0,22 mikrometrů do sterilní zkumavky a filtr byl následně promyt 5 ml vody (do stejné zkumavky). Obsah této zkumavky byl pomocí injekční stříkačky přenesen do gelu. Pro dosažení stejnoměrné disperze EGF-faktoru byl gel důkladně promíchán lopatkovým mísičem. Poté byl gel umístěn do sterilní tlakové nádoby. Tlakem dusíku byl gel skrze sterilní hadičku z tlakové nádoby vypuzen do injekčních stříkaček o objemu 10 ml. U vzorků byla testována aktivita a bylo zjištěno, že obsahují 15,6 mikrogramů EGF-faktoru na mililitr vzorku. 10 gramů vzorku bylo s negativním výsledkem testováno na přítomnosti mikroorganizmů. Viskozita připravených gelů se pohybovala v rozmezí 490 000 až přibližně 520 000 mPa.s. Tento gelový přípravek byl použit na modelu částečné excize vrstvy kůže u prasat a morčat a u těchto pokusných živočichů bylo prokázáno, že zmíněný gel stimuluje a zlepšuje léčbu poranění.

Příklad 6

Gelové přípravky na bázi Pluronic

Jelikož blokové kopolymery polyoxyethylenu/polyoxypropylenu (Pluronic) vykazují vratné teplotní gelovatění, mají dobré charakteristiky při uvolňování léčiv a rovněž jsou málo toxické, mají tyto vysoký potenciál pro použití v systémech pro řízené uvolňování léčiva aplikovaných místně. Polyoly Pluronic o nízké molekulové hmotnosti nevytvářejí s vodou gely v žádné koncentraci. Pluronic F-68 vytváří při teplotě místnosti gely při minimální koncentraci 50 až 60 %. Pluronic F-68 vytváří při teplotě místnosti gely při koncentraci 40 % a Pluronic F-108 při koncentraci 40 %. Pluronic F-127 vytváří při 25 °C gely při koncentraci pouze 20 %. Gely na bázi Pluronic F-68, F-88, F-108 a F-127 mohou být použity pro řízené uvolňování EGF-faktoru při léčbě popálenin a jiných poškození. Připravený gel byl měl být izotonický a ve výhodném provedení by se jeho hodnota pH měla pohybovat v intervalu 6 až 8, výhodně pak v rozmezí 6,5 až 7,5.

Zajímavou vlastností gelů na bázi Pluronic je jejich schopnost gelovatět v závislosti na teplotě o koncentraci polymeru. Ke tvorbě gelu dochází, je-li roztok Pluronic zahřát. Gel je tudíž při pokojové teplotě roztok o nízké viskozitě, ale jakmile se dostane do kontaktu s lidským tělem a je zahřát na tělesnou teplotu, viskozita se zvýší a roztok zgelovatí. EGF-faktor může být smíchán s Pluronic v kapalném stavu a poté aplikován na místo poranění. Na tomto míst dojde k vytvoření gelu a tím k účinnému snížení rychlosti uvolňování EGF-faktoru do místa poranění. Tato skutečnost umožní prodloužení doby kontaktu mezi EGF-faktorem a vrstvou epitelu v místě poranění. Zmíněný gel může být aplikován ve formě kapaliny nebo spolu s obvazem (impregnovaný tímto roztokem), který zajišťuje mechanickou podporu. Mezi výhody využití gelů na bázi Pluronic patří možnost využití filtračních metod ke sterilizaci těchto gelů a prodloužená doba kontaktu EGF-faktoru s místem poranění.

Gel na bázi Pluronic F-127 obsahujíc EGF-faktor byl připraven smícháním následujících složek: 1,8 g monohydrátu fosforečnanu sodného, 5,48 g heptahydrátu hydrogenfosforečnanu sodného a 40,9 g manitolu ve 1000 ml destilované vody. pH bylo upraveno na hodnotu 7,0 a roztok byl ochlazen na teplotu 4 °C. K takto ochlazenému roztoku byl za stálého míchání lopatkovým mísičem přidáván Pluronic F-127 (200 g; BASF). Roztok byl míchán přibližně 30 minut a přes noc uskladněn při teplotě 4 °C. Vodný roztok EGF-faktoru může být k výše zmíněnému roztoku přidán před přídavkem Pluronic F-127 nebo může být do tohoto roztoku přídavkem Pluronic F-127 nebo může být do tohoto roztoku přimíchán až po rozpuštění Pluronic F-127. Aby bylo dosaženo koncentrace EGF-faktoru 100 mikrogramů/ml, bylo ke 23,188 g 20 % gelu na bázi Pluronic F-127 přidáno 1,812 ml roztoku EGF-faktoru (1,38 mg/ml). Vzniklý roztok měl vlastnosti kapaliny. Viskozita tohoto roztoku se při zahřívání na 35 °C zvyšovala, což je vidět z údajů v Tabulce 1.

-10CZ 294676 B6

Tabulka 1

Teplota °C	Viskozita (mPa.s)
0-16	nedetekovatelná
18	4000
19	250 000
21	500 000
28	655 000
30	685 000
37	650 000

Byly rovněž připraveny další přípravky na bázi Pluronic s viskozitami v intervalu 1 000 000 až 12 000 000. Byla testována kinetika uvolňování EGF-faktoru z přípravku (ll,5xl0⁶ mPa.s) a bylo zjištěno, že za jednu hodinu bylo z přípravku uvolněno 85 % EGF-faktoru.

Příklad 7

Gelové přípravky na bázi HPMC

Bylo připraveno několik gelů na bázi HPMC. Tyto gely byly připraveny z HPMC o různých molekulových hmotnostech (škála od HPMC o nízké molekulové hmotnosti až po HPMC o vysoké molekulové hmotnosti). Ve výhodném provedení se jedná o molekulové hmotnosti v intervalu 80 000 až 240 000. Při použití polymerů o velmi nízké molekulové hmotnosti (Methocel E15LV) je třeba k vytvoření gelu použít HPMC v koncentracích 10 až 20 %. Při použití polymerů o velmi vysoké molekulové hmotnosti (methocel K100M) mohou být gely vytvořeny z 1 až 3% roztoku. Za účelem stadia kinetik uvolňování léčiva byly připraveny gely z různých typů HPMC v různých koncentracích. U každého gelu bylo pH upraveno na hodnotu 7,2. Rychlost uvolňování EGF-faktoru byla přímo úměrná viskozitě rozpustného gelu.

V kádince o objemu 1500 ml bylo smícháno 0,83 g heptahydrátu hydrogenfosforečnanu sodného, 6,22 g NaCl a 500 ml sterilní vody k výplachům. Směs byla za účelem rozpuštění pevných složek míchána magnetickým míchadlem a pH bylo upraveno na hodnotu 7,2. Za stálého míchání byl roztok zahřát na teplotu 80 °C a přes síto propustné pro částice do velikosti 0,147 mm (40 mesh) do něj bylo přidáno 30 g HPMC (Methocel klOOM; Dcw). Poté byl odstaven zdroj tepla a míchání probíhalo dalších 10 minut. Zbylých 500 g vody bylo přidáno ve formě ledu. Když se viskozita směsi začala zvyšovat bylo míchání prováděno ručně. Směs byla ponechána ochladnout na pokojovou teplotu a poté byla přes noc ochlazena na 4 °C. Část o hmotnosti 130 g byla odebrána as využitím lopatkového mísiče smíchána s 13,4 ml sterilního roztoku EGF-faktoru o koncentraci l,12mg/ml čímž bylo dosaženo výsledné koncentrace 104 mikrogramů EGFfaktoru na mililitr.

Viskozity připravených gelů se při pokojové teplotě pohybovaly v intervalu 54 000 až 950 000 mPa.s. Uvolňování EGF-faktoru z různých gelových přípravků na bázi HPMC je popsáno v Tabulce 2.

-11 CZ 294676 B6

Tabulka 2

Vzorek	Viskozita měřená Brookfieldovým viskozimetrem (mPa.s)	Uvolňování EGFfaktoru
	25 °C	37 °C
2085-91-1-E4M 4%	112x10³	102x1O³	75% za 5 hodin
2085-92-2 E4M 5%	274x1O³	300x1O³	75% za 5 hodin
2085-92-2 E4M 6%	652x10^J	946xl0³	50% za 5 hodin
2085-91-2 F4M 4%	112xl0³	286x1O³	75% za 5 hodin
2085-93 K15M 3%	102xl0³	70x10³	75% za 5 hodin
2085-91-3 K4M 4%	92x1O³	54xl0³	75% za 5 hodin

Příklad 8

Gelové přípravky na bázi kyseliny hyaluronové

Kyseliny hyaluronová (HA) je jedním z mukopolysacharidů s nerozvětveným řetězcem složeným z opakujících se disacharidových jednotek tvořených TV-acetylglukosaminem a kyselinou glukuronovou. V přírodě se kyselina hyaluronová nalézá v mikroorganizmech a v kůži a pojivové tkáni lidí a živočichů. Molekulová hmotnost kyseliny hyaluronové se, v závislosti na zdroji, způsob přípravy a metodách stanovení, pohybuje v intervalu 50 000 až 8 000 000. Vysoce viskózní roztoky kyseliny hyaluronové mají lubrikační vlastnosti a výborné zvlhčující účinky. Kyselina hyaluronová se naléhá v synoviální tekutině kloubů, sklivci oka, pupečníkové šňůře, kůži, krevních cévách a chrupavkách. Pozoruhodně dobře funguje jako lubrikant a látka obsahující nárazy, což je pravděpodobně důsledkem její schopnosti zadržovat vodu a její afinity k určitým specifickým proteinům. Předpokládá se, že je to velmi „bezpečná“ molekula pro použití uvnitř lidského těla. Kyselina hyaluronová může být tudíž použita při léčbě vnitřních poranění, jako například při léčbě kloubů nebo přední komory oční. S 1% roztokem kyseliny hyaluronové (molekulová hmotnost 4 000 000; MedCHem) byl smíchán EGF-faktor na výslednou koncentraci 100 mikrogramů/ml. Viskozita tohoto 1% roztoku kyseliny hyaluronové byla 44 000 mPa.s. Přípravek na bázi kyseliny hyaluronové obsahující EGF-faktor byl připraven postupem podle tohoto vynálezu a bylo prokázáno, že tento přípravek stimuluje obnovu endothelu v přední komoře oční.

Příklad 9

Kinetika uvolňování EGF-faktoru z aplikačních forem

V buněčném systému in vitro byla měřena účinnost jednotlivých aplikačních forem pro řízené uvolňování EGF-faktoru a byly určeny hodnoty T₂₅ a T₅o. Uvolňování EGF-faktoru je důsledkem jednak difúze EGF-faktoru z gelu a jednak rozpouštěním gelové matrix. Jestliže tyto dva mechanizmy přijmeme jako mechanizmy, které in vivo zajišťují biologickou dostupnost EGFfaktoru, pak gely na bázi HPMC prodlužují uvolňování EGF-faktoru nejvíce, a to s hodnotami 1,2 (pro T₂₅) a 5,9 (pro T₅₀). Získané výsledky naznačují, že pro prodloužení hodnot H je důležitější molekulová struktura daného polymeru než jeho koncentrace. Gely, které byly připraveny v odsoleném médiu (destilované vodě) a studovány za rovnovážných podmínek, vykazovaly nízké hodnoty T. Tato skutečnost může být důsledkem kombinace rychlejšího rozpouštění a nižší viskozity gelů bez přídavku solí. Ve výhodném provedení vynálezu se tudíž jedná o gely, které obsahují soli. Předpokládá se, že hodnoty T pro gely podle vynálezu mohou být zvýšeny modifikací použitých polymerů. Mezi takové modifikace například patří zavedení hydrofobních nebo hydrofilních postranních řetězců, skupin iontových párů, iontů kovů, zesíťovadel, funkčních

-12CZ 294676 B6 skupin s afinitou k EGF-faktoru, kde tyto modifikace vedou k řízenému uvolňování EGF-faktoru z takto připraveného produktu.

V tabulce 3 jsou shrnuta kinetická data uvolňování EGF-faktoru zjednotlivých aplikačních forem. Písmena následující za textem „HPMC“ označují v této tabulce procento substitucí za textem „HPMC“ označují v této tabulce procento substitucí vdaném polymeru. Například K=2208, nebo-li methylovaný ze 22 % a z 8 % substituovaný hydroxypropylovou skupinou; F=2906; a E2910. Číselná hodnota po těchto písmenech (tj. například číslo 100 následující po „K“) označují viskozitu 2% roztoku ve vodě vyjádřenou v tisících mPa.s. Písmena „AQ“ označují gely připravené v roztoku bez obsahu solí. Všechny ostatní gely byly připraveny ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanovým pufrem (PBS) o hodnotě pH přibližně 7,0. Hodnoty T jsou uvedeny v hodinách.

Tabulka 3

Souhrn kinetických dat pro uvolňování EGF-faktoru zjednotlivých aplikačních forem

Polymer		Viskozita (mPa.s)	T₂₅	T_so
HPMC K100M (Mw 240 000)	1%	-	0,0854	1,000
2%	287x10^J	0,4687	1,9172
3,5%	116x10⁶	1,2270	5,8528
4,0%	-	0,8536	4,1386
5,0%	3,07xl0^b	0,8807	3,5808
HPMC K-15M (Mw 120 000)	3%	122x1O³	0,857	2,0635
4AQ%	“ 331xl0³	0,2727	1,6900
HPMC K-4M (Mw 86 000)	4%	96x1O³	1,0476	2,6349
HPMC F-4M (Mw 86 000)	4%	122x10³	0,7619	1,8730
HPMC E-4M (Mw 86 000)	4%	128xl0³	1,0159	2,2657
5%	312x20³	0,8615	1,8462
HPMC E-4M (Mw 86000)	5AQ%	240x1O³	0,3211	1,6044
6AQ%	680x10³	0,6944	3,0040
Carbopol 934P (Mw 3x10⁶)	0,5%	494x10³	0,2727	0,7300
Pluronic F-127 (Mw 12 000)	20%	Ι,ΙχΙΟ⁶	0,1936	0,3548

Příklad 10

Gelové přípravky na bázi polyakrylamidu

Gelové přípravky na bázi polyakrylamidu obsahující EGF-faktor byly připraveny za použití polyakrylamidů Cyanamer N-300 a Cyanamer N-300 LMW (oba komerčně vyrobené společností Američan Cyanamid). Cyanamer N-300 měl molekulovou hmotnost mezi 5 až 6 miliony a Cyanamer N-300 LMW měl molekulovou hmotnost přibližně 13 milionů.

Polyakrylamidové gely následujících složení byly připraveny přidáním polymeru polyakrylamidu do předpřipravených roztoků soli. Takto připravené gely byly následně použity k testování uvolňování EGF-faktoru.

-13 CZ 294676 B6

Tabulka 4

Složení	Hmotnostní zlomek (v procentech)
	2085-140A	2085-140B
Cyanamer N-300	4,0	—
Cyanamer N-300 LMW	-	4,0
Chlorid sodný	0,049	0,049
Chlorid draselný	0,075	0,075
Chlorid vápenatý	0,048	0,048
Chlorid hořečnatý	0,080	0,080
Octan sodný	0,890	0,890
Dihydrát citronanu sodného	0,170	0,170
Sterilní voda	94,688	94,688
Viskozita (mPa.s)	552x10³	132x1O³

K 1,809 g gelu na bázi polyakrylamidu Cyanamer N-300 (2085-140A) bylo přidáno 72,4 mikrolitrů směsi EGF-faktoru a EGF-faktoru značeného izotopem ¹²⁵I a tato směs byla promíchána ve dvou injekčních stříkačkách o objemu 3 mililitry. 300 až 400 miligramů tohoto gelu bylo umístěno jedné („dárcovské“) komory Franzovy difúzní cely. V předem určených časových intervalech byly na detektoru záření gama analyzovány alikvoty sběrného pufru o objemu 50 μΐ. Sběrný pufr se skládal z 3,5 ml PBS, pH 7,2, obsahujícího 0,4 % BSA (bovinní sérový albumin) a 0,02 % azidu sodného. Obdobným způsobem bylo k 1,11 g gelu na bázi polyakrylamidu Cyanamer N300 a LMW (2085-140B) přidáno 44,5 mikrolitrů směsi EGF-faktoru a EGF-faktoru značeného izotopem ¹²⁵I a u této směsi bylo analyzováno uvolňování EGF-faktoru.

Byl rovněž připraven další polyakrylamidový gel (2085-138C) o následujícím složení.

Tabulka 5

Složení	2085-138C
Cyanamer N-300	7,0 g
Thimerosal	0,2 g
Sterilní voda	192,8 g
Viskozita	258xl0³
pH	7,54

Gel 2085-138C byl použit k přípravě gelu obsahujícího EGF-faktor v koncentraci lOmikrogramů/ml. Do ampulky o objemu 8 ml bylo naváženo 5 gramů gelu 2085-138C a 50 mikrogramů EGF-faktoru o koncentraci 1 mg/ml (1,41 mg/ml na základě stanovení proteinů).

EGF-faktorem byl impregnován obvaz rány a byly získány přijatelné charakteristiky jeho uvolňování. Obvaz rány byl film gelu na bázi směsi polyakrylamid/agar (Geliperm, GeistlichPharma; Wolhusen, Švýcarsko). Na obvaz byl EGF-faktor nanesen tak, že byl obvaz impregnován vodným roztokem EGF-faktoru. Za přibližně 24 hodin bylo z obvazu uvolněno asi 70 % EGF-faktoru.

Gelové přípravky na bázi celulózy obsahující stabilizovaný GDNF-faktor

Gely na bázi karboxymethylcelulózy (CMC) byly připraveny postupy podle tohoto vynálezu. Při těchto experimentech byla použita sodná sůl karboxymethylcelulózy farmaceutické kvality (Aqualon Co., Wilmington, DE) o molekulové hmotnosti v intervalu 900 000 až 2 000 000 daltonů a koncentraci 2,4 %. Gely na bázi karboxymethylcelulózy byly formulovány s rhPDGF-BB (Chiron Corpoation, Emeryville, Kalifornie). Bylo zjištěno, že stabilita gelů na bázi polymerů

- 14CZ 294676 B6 celulózy může být podstatně zvýšena přídavkem nabitých chemických sloučenin, jako například nabitých aminokyselin nebo iontů kovů, do těchto přípravků. Termín „stabilita“ používaný v přihlášce označuje ochranu PDGF-faktoru před ztrátou jeho mitogenní aktivity v gelu nebo zvýšení množství PDGF-faktoru uvolňovaného z daného gelu. Předkládaná přihláška popisuje gelové přípravky s PDGF-faktorem, které jsou vhodné pro léčbu poranění.

Účinnost při léčbě poranění byla u přípravku testována in vivo na modelu částečné excize vrstvy kůže morčat.

U morčat použitých jako model částečně excize vrstvy kůže byla na každém jedinci (4 až 8 pokusných zvířat ve skupině) za použití dermatomu vytvořena příslušná poranění. Na poranění o rozměrech 3 x 1 cm (obvykle hluboká 0,4 až 0,8 mm) bylo po dobu prvních pěti dnů (dny 0 až 4) jednou denně nanášeno 0,3 ml gelu a poranění byla překryta sterilním absorbujícím polštářkem. Tyto polštářky byly překryty obvazem a převázány ochrannou vrstvou obinadla. Po sedmi dnech byla místa poranění zkoumána histologickými metodami. Průměrná tloušťka lůžka granulované tkáně byla měřena projekcí tkáňových řezů (při 50-ti násobném zvětšení) barvených Gomoriho Trichromanem na planimetr připojený k počítači. Hodnota tloušťky byla získána záznamem plochy granulované tkáně lůžka poranění o standardní délce a následným dělením touto délkou. Z každého poranění byly měřeny tři tkáňové řezy a měření ze dvou poranění na jednom morčeti byla zprůměrována. Výsledkem je jedna hodnota pro každého pokusného živočicha.

U tohoto modelu indukoval PDGF-faktor v koncentracích 10 až 300 pg/“g gelu na bázi CMC“ 2- až 3-násobné (nebo vyšší) zvětšení tloušťky granulované tkáně lůžka poranění. Granulovaná tkáň je nově vytvořená pojivová tkáň s cévami a je hlavní složkou při hojení poranění. Granulovaná tkáň navíc poskytuje bohatou zásobu krve, která je potřebná pro růst epidermis přes povrch poranění. Granulovaná tkáň je tudíž nezbytnou složkou při hojení poranění.

Tabulky ukazují (1) účinnost PDGF-faktoru v gelu na bázi CMC, (2) absenci vlivu lysinu na účinnost PDGF-faktoru v čerstvě připravených vzorcích (Tabulka 6), (3) zachování účinnosti přípravků stabilizovaných přídavkem lysinu po dobu 30 měsíců (sladováno při 2 až 8 °C, tabulka 7) a (4) zachování účinnosti PDGF-faktoru ve sterilním přípravku bez přítomnosti konzervačních látek na bázi CMC (s lysinem) (tabulka 8).

Tabulka 6

Vliv PDGF-faktoru a lysinu na tloušťku granulované tkáně v modelu částečné excize vrstvy kůže morčat

Působení	Tloušťka granulované tkáně (mm) Průměr ± směrodatná odchylka	N(pokusných zvířat)
Samotná CMC	63,3 ± 15,9	7
PDGF (30 pg/g) v CMC	161,9 ±25,4*	7
CMC + 0,1% lysin	64,4 ± 8,9	7
PDGF (30 pg/g) v CMC + 0,1% lysin	162,6 ±23,5*	8
CMC + 0,5% lysin	59,9 ± 5,6	8
PDGF (30 pg/g) v CMC + 0,5% lysin	144,6 ±21,8*	7

Statisticky významný rozdíl oproti kontrolnímu vehikulu (p<0,05)

Získaná data ukazují, že rekombinantní lidský faktor pocházející z krevních destiček (typ BB) je, v gelu na bázi CMC, účinný při stimulaci růstu granulované tkáně v experimentálně navozených

- 15 CZ 294676 B6 poranění u morčat (2,5-násobné zvětšení tloušťky granulované tkáně). Tato data rovněž ukazují, že lysin, až do koncentrace 0,5%, neovlivňuje účinnost PDGF-faktoru v přípravku na bázi CMC.

Tabulka 7

Vliv dříve připraveného PDGF-faktoru v gelu na bázi CMC stabilizovaného lysinem na tloušťku granulované tkáně v modelu částečné excize vrstvy kůže morčat

Působení	Tloušťka granulované tkáně (mm) Průměr ± směrodatná odchylka	N(pokusných zvířat)
CMC*	81,4 ± 15,5	6
PDGF (30 pg/g) v CMC, vzorek připravený před 30 měsíci	311,3 ±32,4**	6
PDGF (30 pg/g) v CMC, čerstvě připravený vzorek	217,3 ±22,3**	6

* Všechny přípravky obsahují lysin v koncentraci 0,5 % ** Rozdíl oproti kontrolnímu vehikulu (p<0,05)

Tato data ukazují, že přípravek obsahující lysin v koncentraci 0,5 % si po dobu přinejmenším 30 měsíců zachovává svou účinnost při stimulaci tvorby granulované tkáně u experimentálně navozených poranění.

Tabulka 8

Vliv PDGF-faktoru ve sterilním gelu na bázi CMC (bez přídavku konzervačních látek) na tloušťku granulované tkáně v modelu částečné excize vrstvy kůže morčat

Působení	Tloušťka granulované tkáně (mm) Průměr ± směrodatná odchylka	N(pokusných zvířat)
Sterilní CMD** (bez přídavku konzervačních látek)	150,1 ±48,5	4
PDGF (100 pg/g) ve sterilním gelu na bázi CMC (bez přídavku konzervačních látek)	652,6 ±58,6***	4
PDGF (100 pg/g) ve sterilním gelu na bázi CMC (s přídavkem konzervačních látek)	635,1 ±73,5***	4
PDGF (100 pg/g) v nesterilním gelu na bázi CMC (s přídavkem konzervačních látek)	752,2 ±79,5***	4

* Tento experiment byl prováděn v jiné laboratoři a na daleko hlubších poraněních než tomu bylo u experimentu sledujícím vliv lysinu, a proto je tloušťka granulované tkáně při použití kontrolního vehikula větší * Všechny přípravky obsahují lysin v koncentraci 0,5 % ** Rozdíl oproti kontrolnímu vehikulu (p<0,05)

-16CZ 294676 B6

Získaná data ukazují, že sterilní PDGF/CMC (s lysinem v koncentraci 0,5 %; bez přídavku konzervačních látek) je účinný při stimulaci tvorby granulované tkáně v místě poranění.

Mechanizmus, kterým mohou nabité chemické sloučeniny (částice) stabilizovat přípravky na bázi celulózy obsahující PDGF-faktor, není znám. Je možné předpokládat, že příčinou stabilizačních účinků může být kompetice nabitých chemických sloučenin (částice) a lysinů přítomných v PDGF-faktoru vzhledem k redukujícím koncovým skupinám celulózy a/nebo možné snížení intenzity vzájemného působení nábojů mezi volnými karboxylovými skupinami celulózy a lysinu přítomnými v PDGF-faktoru. V naší laboratoři bylo prokázáno vzájemné působení nábojů mezi PDGF-faktorem a polymery celulózy (jako například CMC). Nabité chemické sloučeniny (částice) schopné kompetovat s kladnými nebo zápornými náboji mohou snižovat intenzitu interakcí nábojů mezi PDGF-faktorem a polymery celulózy, a tudíž zvyšovat stabilitu PDGF-faktoru. U kladně nabitých protiiontů byla testována jejich schopnost zvyšovat množství opětovně získaného PDGF-faktoru z gelu na bázi CMC.

Pro odpověď na otázku stability PDGF-faktoru v gelu na bázi celulózy je nejprve nutné porozumět tomu, jak může PDGF-faktor ztrácet v přítomnosti CMC svou aktivitu. Jedním z možných mechanizmů vedoucích ke ztrátě aktivity je adsorpce a zachycení PDGF-faktoru v CMC matrix. Podstatou této adsorpce je zachycení silně kladně nabitého homodimeru PDGF-faktoru B (obsahujícího 22 argininových zbytků a 14 lysinových zbytků) negativně nabité CMC matrix obsahující velké množství volných karboxylových skupin. Naše studie obsahující PDGF-faktor v polymeru CMC prokázaly ztráty mitogenní aktivity a snížení uvolňování proteinu v případech, kdy bylo ve směsi přítomno pouze malé množství (nebo žádné) protiiontů, které by kompenzovaly toto vzájemné působení nábojů.

Zvýšení stability PDGF-faktoru v gelu na bázi CMC může být dosaženo minimalizací vzájemného působení nábojů mezi PDGF-faktory nebo minimalizací interakcí PDGF-faktoru s redukujícími konci CMC tím, že jsou od směsi přidány kladně nebo záporně nabitý protiionty. V jednom přiváděném experimentu zvýšila přítomnost lysinu (0,5 % hmotnostně) stabilitu PDGF-faktoru v CMC o více než 50 %. Jakákoliv sloučenina, která je schopna snížit intenzitu (nebo kompetovat) vzájemného působení nábojů PDGF-faktor/CMC nebo interakcí s redukujícími konci CMC, může zlepšit stabilitu PDGF-faktoru v gelu na bázi CMC. Je pochopitelné, že nabité chemické sloučeniny v přípravcích podle vynálezu jsou do těchto přípravku přidány ve formě solí. Následně tyto soli ve vodném prostředí gelu disociují za vzniku odpovídajících nabitých chemických sloučenin (částic). Termín „nabitá chemická sloučenina (částice)“ použitý v této přihlášce, zahrnuje farmaceuticky přijatelné verze následujících: soli, jako například chlorid zinečnatý nebo chlorid hořečnatý; pufry, jako například mono/diethanolamin, kyselinu fumarovou, citronan draselný a glukonát sodný; aminokyseliny, jako například lysin, arginin, histidin, kyselinu asparagovou, kyselinu glutamovou, alanin, methionin, prolin, serin, asparagin, cystein; aminoguanidin nebo protamin; iontově aktivní surfaktanty, jako například kyselinu olejovou a oleth 5; a syntetické polykationtové nebo iontové polymery jako například polyaminokyseliny. Termín „farmaceuticky přijatelný“, používaný v této přihlášce, znamená, že takto popsaný materiál může být použit k léčbě lidí nebo jiných savců, aniž by vykazoval nežádoucí účinky jako například toxicitu, zpuchýřování nebo vybělení sliznice nebo kůže.

Mimo experimenty popsané v dalším textu bylo zjištěno, že rovněž aminoguanidin v koncentraci 0,5 % zvyšuje množství opětovně získaného PDGF-faktoru z gelu na bázi polymerů celulózy. Aminoguanidin je, vzhledem k tomu, že je silným nukleofilem, při neenzymatické glukosylaci lepším kompetičním činidlem než lysin.

Do rozsahu vynálezu spadají přípravky, které obsahují polymery celulózy nebo jakékoliv jiné polymery s potenciálními redukujícími konci a farmaceuticky přijatelné nukleofilní protiionty, jako například lysin nebo aminoguanidin.

- 17CZ 294676 B6

Příklad I

Použitými vzorky byly rhPDGF-B smíchaný se samotnou CMC (připravený před 0,5 hodinou) a rhPDGF-BB v CMC (připravený před 60 dny a uchovávány při 4 °C). Tabulka 9 ukazuje vliv koncentrace Zn⁺² na množství opětovně získaného PDGF-faktoru. Při stejné koncentraci Zn⁺²vykazoval čerstvě připravený vzorek (v porovnání se vzorkem připraveným před 60 dny) vyšší procento opětovně získaného PDGF-faktoru. Tato data naznačují, že se PDGF-faktor iontově váže kCMC, a že za delší čas tato vazba pravděpodobně zesíťovává CMC, takže k uvolnění PDGF-faktoru je třeba více iontů Zn⁺².

Množství opětovně získaného PDGF-faktoru bylo stanovováno s využitím HPLC na koloně s reverzní fází C4 (velikost částic 300 x 10’¹⁰ m) elucí gradientem acetonitrilu (s přídavkem 0,1% TFA) v intervalu 10 až 70 %.

Tabulka 9

Opětovně získaný rhPDGF-faktor (v procentech)

Molární koncentrace Zn	čerstvě připravený	připravený před 60 dny
0,075	84	71
0,15	88	81
0,3	97	90

Tabulka 10 ukazuje vliv koncentrace jiných nabitých sloučenin na množství PDGF-faktoru opětovně získaného z gelu na bázi CMC. V 10 ml vody s přídavkem 0,01 % BSA (tento roztok byl použit jako kontrola) bylo rozpuštěno 0,5 gramu vzorku PDGF-faktoru (připravený před 60 dny) a ke každému vzorku byla přidána sloučenina ze seznamu.

Tabulka 10

Opětovně získaný rhPDGF-faktor (v procentech)

	% PDGF
A kontrola	50
B 0,2M NaCl (mono+)	42
C 0,2M CaCl₂ (di++)	64
D 0,2M CaCl₂ (di++)	63
E 0,2M MgCl₂ (di++)	69
F 0,5% lysin (+, obojetný ion)	64
G 0,5% glycerin (obojetný ion)	50

Získaná data naznačují, že kladně nabité částice s vyšším nábojem (Zn, Ca a Mg) a lysin mohou minimalizovat vzájemné působení nábojů PDGF-faktoru a CMC. Tato data rovněž naznačují, že PDGF-faktor může být zachycen nebo zadržen v CMC matrici.

-18CZ 294676 B6

Příklad II

Tato sada experimentů byla použita k testování vlivu různých aminokyselin na množství PDGFfaktoru opětovně získaného z CMC. Použitými vzorky byly PDGF-faktor v koncentraci 100 pg na gram CMC, pufr obsahujíc 0,1 mM NaCl a přídavek aminokyseliny v koncentraci 0,5 %, pH 6,0. Tyto vzorky byly po dobu 2 dnů inkubovány při teplotě 46 °C v polypropylenových zkumavkách a následně analyzovány pomocí RP-HPLC (postupem popsaným výše).

Data srovnávající vliv nepolárních a polárních aminokyselin na množství PDGF-faktoru opětovně získaného z CMC jsou znázorněna v tabulce 11. U všech přípravků obsahujících více nabité aminokyseliny (lysin, kyselinu galutamovou a kyselinu asparagovou) bylo zjištěno největší množství opětovně získaného PDGF-faktoru. Všechny aminokyseliny jsou při pH blízkém hodnotě 7,0 ve formě obojetných iontů. Tyto aminokyseliny tudíž budou, v závislosti na náboji postranního řetězce, mít pozitivní vliv na množství opětovně získaného PDGF-faktoru. Čím větší bude náboj postranních skupin (například lysin), tím větší bude stabilizující účinek.

Tabulka 11

Vliv různých tříd aminokyselin na množství PDGF-faktoru opětovně získaného z CMC

Vzorky	Množství opětovně získaného PDGF-faktoru (v %, vzhledem ke kontrole v čase 0)
Kontrola, čas 0	100,0
CMC + žádná aminokyselina	37,3
Nepolární postranní řetězce
Glycin	43,4
Alanin	37,5
Methionin	40,8
Prolin	40,2
Nenabité polární postranní řetězce
Serin	48,7
Asparagin	39,9
Tyrosin	45,5
Cystein	42,0
Nabité polární postranní řetězce
Lysin pK9	64,0
Kyselina asparagová pK4	70,4
Kyselina glutamová pK4	58,2

Byl rovněž stanovován vliv různých jiných nabitých sloučenin na množství PDGF-faktoru opětovně získaného v CMCM a získané výsledky jsou uvedeny v Tabulce 12. Při těchto experimentech bylo použito 100 pg PDGF-faktoru v 1 gramu CMC. Získaná data ukazují, že při zvyšování koncentrace NaCl z 0M na 1,13 M se rovněž zvyšuje procento PDGF-faktoru opětovně získaného z CMC (z 32 % až 96 %). Při použití iontů Mg⁺² v koncentraci 0,1 M bylo množství PDGF-faktoru opětovně získaného z CMCM 94,8 % původního množství.

-19CZ 294676 B6

Tabulka 12

Vliv různých nabitých sloučenin na množství PDGF-faktoru opětovně získaného z CMC

Vzorky	Množství opětovně získaného PDGF-faktoru (v %, vzhledem ke kontrole v čase 0)
kontrola, čas nula	100,0
CMC + 0,0 M NaCl (pouze voda)	32,1
CMC + 0,0 M NaCl (pouze pufr)	27,6
CMC + 0,13 M NaCl	65,9
CMC + 0,33 M NaCl	82,8
CMC+ 0,63 MNaCl	90,7
CMC + 0,94 M NaCl	93,8
CMC + 1,13 MNaCl	96,8
CMC + 0,0 M NaCl + 0,1 M MgCl₂	94,8
CMC + 0,13 M NaCl + 0,5% Gly	76,7
CMC + 0,13 M NaCl + 0,5% Lys	85,5

Příklad III

V tabulce 13 jsou znázorněny data popisující mitogenní aktivitu vzorku rhPDGF-faktoru (30 pg/g) připraveného před jedním měsícem, a to s přídavkem lysinu nebo bez lysinu. Tato data byla stanovena na základě měření příjmu thymidinu fíbroblasty a jsou vyjádřena jako obsah měřeného rhPDGF-faktoru. Zmíněná data ukazují, že přítomnost lysinu v daném přípravku zvyšuje jeho mitogenní aktivitu.

Tabulka 13

rhPDGF-faktor (pg/g)
	Přípravek bez Lys (n=10)	Přípravek s Lys (n=4)
25 °C	16,8 ±4	31,2±7
30 °C	10,4 ±2	27,0 ± 0,5

Gelové přípravky na bázi polymeru celulózy obsahující rhPDGF-BB

Gelové přípravky na bázi polymeru celulózy obsahující rhPDGF-BB mohou být formulovány podle obecných postupů používaných při formulaci přípravků. Obecně řečené, jediným požadavkem je vytvoření „intimní“ (dobře promísené) směsi požadovaných složek. Termín „intimní směs“, používaný v přihlášce, označuje skutečnost, že požadované složky jsou ve směsi rozptýleny stejnoměrně a žádná z nich není koncentrována v jednom místě.

Směsi (přípravky) podle vynálezu obsahují PDGF-faktor „ve množství účinném pro léčbu poranění“, což je množství postačující ke zvýšení rychlosti hojení poranění. V lékařství je známo, že účinná množství léčivých látek se liší v závislosti na druhu použité látky, povaze léčeného onemocnění a pacientovi podstupujícímu léčbu. Z toho vyplývá, že účinná množství léčivých látek nemohou být definovány pro každou léčivou látku. Jako množství PDGF-faktoru účinné pro léčbu poranění je tudíž označováno množství, které ve směsi podle vynálezu dodává po požadovanou dobu do organizmu léčeného pacienta dostatečně množství PDGF-faktoru a je obvykle menší než množství běžně používané. Jeden gram typické směsi podle vynálezu může obsahovat přibližně 1,0 pg až 1000 pg PDGF-faktoru. Ve výhodném provedení může směs podle vynálezu obsahovat přibližně 1,0 pg až 300 pg PDGF-faktoru najeden gram přípravku.

-20CZ 294676 B6

V přípravcích (směsích) podle vynálezu mohou být použity i další látky jako například pufry, konzervační látky, antioxidanty, další polymery (použité například k úpravě viskozity nebo jako plniva) a pomocné látky. Specifickými ilustrativními příklady takových látek jsou fosforečnanový, citronanový nebo boritanový pufr; konzervační látky jako thimerosal, kyselina sorbová, methylparaben nebo propylparaben, m-kresol a chlorbutanol; látky k úpravě tonicity jako například chlorid sodný a/nebo cukry; polymery jako například polyvinylalkohol, kyselina polyakrylová a polyvinylpyrrolidon; a pomocné látky jako například manitol, laktóza sacharóza, kyselina ethylendiamintetraaminooctová a podobně.

Typické sloužení gelového přípravku na bázi polymeru celulózy obsahujícího rhPDGF-BB je popsáno v tabulce 14. Viskozita takového přípravku se při teplotě místnosti pohybuje v intervalu 1000 až 150 000 mPa.s.

Tabulka 14

Složka	Rozmezí koncentrací
rhPDGF-BB	1,0 až 1000 mg na gram gelu
polymer celulózy	1,5 až 3,0% (hmotnostně)
nabité chemické látky	0,1 až 3,0% (hmotnostně)
konzervační činidla	0,15 až 0,25% (hmotnostně)

Jednotlivé přípravky obsahující rhPDGF-BB jsou popsány v tabulkách 15,16 a 17.

Tabulka 15

Složka	Množství	Hmotnostní procento
Purifikovaná voda	100 g	96,02
	Množství g/100 g puntíkované vody
Methylparaben	0,1620 g	0,16
Propylparaben	0,0180 g	0,02
Trihydrát octanu sodného	0,1570 g	0,15
Lysin (ve formě soli s kyselinou chlorovodíkovou)	0,5000 g	0,48
Chlorid sodný	0,8086 g	0,78
m-kresol	0,0900 g	0,09
ledová kyselina octová	0,0065 g	0,01
CMC (sodná sůl)	2,4000g	2,30
	Množství g/100 g gelu
rhPGDF-B (ze zásobního roztoku)	0,0036 g

-21 CZ 294676 B6

Tabulka 16

Složka	Množství/dávka o hmotnosti 250 kg	Množství/g gelu
Kyselina octová	15,6 g	0,06 mg
Chlorid sodný	1946,3 g	7,70 mg
Trihydrát octanu sodného	377,9 g	1,51 mg
Lysin (ve formě soli s kyselinou chlorovodíkovou)	1203,5 g	4,81 g
voda na injekce	240700,0 g*	962,80 mg
CMC (sodná sůl)	57776,8 g	23,11 mg
rhPDGF-BB (ze zásobníku roztoku)	25,0 g	0,10 mg

* V celkovém množství WFI je zahrnuto 2500 g kapalného zásobníku roztoku léčiva.

Tabulka 17

Složka	g/lOOggelu
rhPDGF-BB	0,01
CMC (sodná sůl)	2,40
Chlorid sodný	0,8086
Trihydrát octanu sodného	0,1570
Ledová kyselina octová	0,0065
Methylparaben	0,1620
Propylparaben	0,0180
m-kresol	0,0900
Lysin (ve formě soli s kyselinou chlorovodíkovou)	0,5000
Voda na injekce	100,00

(Obsah jednotlivých složek je uveden v gramech na 100 g vody na injekce. Výjimkou je množství rhPDGF-B, které je uvedeno v gramech na 100 g gelu).

Vynález byl popsán s odkazem na určitá výhodná provedení a příklady. Je zřejmé, že odborníci budou schopni odvodit různé variace tohoto vynálezu. Odborník může být například schopen měnit molekulové hmotnosti a procentuální zastoupení jednotlivých polymerů tak, aby bylo dosaženo požadovaných hodnot viskozity. Odborník může být rovněž schopen nahradit jednotlivé polymery nebo růstové faktory odpovídajícími látkami popsanými v této přihlášce. Jelikož budou odborníci schopni odvodit různé variace tohoto vynálezu, je rozsah vynálezu omezen pouze připojenými patentovými nároky, nikoliv však výše uvedenými příklady.

Claims

1. Farmaceutický přípravek obsahující

a) růstový faktor pocházející z krevních destiček PDGF, v množství účinném pro léčbu poranění;

b) farmaceuticky přijatelný polymer celulózy; a

c) farmaceuticky přijatelnou chemickou látku, nesoucí elektrický náboj, vybranou ze skupiny sestávající z kladně nabitých aminokyselin zvolených z lysinu, argininu, histidinu, kyseliny asparagové, kyseliny glutamové, alaninu, methioninu, prolinu, šeřinu, asparaginu a cysteinu, kladně nabitých polyaminokyselin, protaminu, aminoguanidinu a iontů zinku a hořčíku, vyznačující se tím, že tento přípravek má při teplotě místnosti formu vodného gelu s viskozitou 1000 až 500 000 mPas.s.

2. Přípravek podle nároku 1,vyznačující se tím, že PDGF je homodimer PDGF-B.

3. Přípravek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že koncentrace PDGFfaktoru je v rozmezí 1,0 pg až 1000 pg na gram přípravku.

4. Přípravek podle některého z nároků 1 až 3,vyznačující se tím, že polymerem celulózy je karboxymethylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza nebo methylcelulóza.

5. Přípravek podle některého z nároků 1 až 3,vyznačující se tím, že koncentrace polymeru celulózy je 1,5 až 3,0% hmotnostního a jeho molekulová hmotnost je v intervalu 450 000 až 4 000 000.

6. Přípravek podle některého z nároků 1 až 5,vyznačující se tím, že koncentrace látky nesoucí elektrický náboj je v rozmezí od 0,1 až 3,0 % hmotnostního.

7. Přípravek podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že jeho viskozita je v intervalu 50 000 až 150 000 mPa.s.

8. Přípravek podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že navíc obsahuje konzervační látku jako je methylparaben, propylparaben a m-kresol.

9. Farmaceutický přípravek podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že PGDF je homodimer lidského PDGF-B, polymer celulózy je karboxymethylcelulóza a chemická látka nesoucí elektrický náboj je lysin.

10. Farmaceutický přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje v gramech na 100 gramů gelu 0,01 g rhPDGF-B; 2,40 g sodné soli karboxymethylcelulózy; 0,81 g chloridu sodného; 0,157 g trihydrátu octanu sodného; 0,0065 g ledové kyseliny octové; 0,162 g methylparabenu; 0,018 g propylparabenu; 0,09 g m-kresolu; 0,5 g L-lysinu ve formě hydrochloridu a 100 g vody na injekce, přičemž viskozita tohoto přípravku při 37 °C je 20 000 až 200 000 mPa.s.

11. Farmaceutický přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje v gramech na 100 gramů gelu 0,1 g rhPDGF-B; 23,103 g sodné soli karboxymethylcelulózy; 7,748 g chloridu sodného; 1,511 g trihydrátu octanu sodného; 0,0624 g ledové kyseliny octové;

-23CZ 294676 B6

4,813 g L-lysinu ve formě hydrochloridu; a 962,63 g vody na injekce, přičemž viskozita tohoto přípravku při 37 °C je 1000 až 15 000 mPa.s.

12. Přípravek podle některého z nároků 1 až 11 pro použití pro léčení poranění, při němž se 5 poranění pacienta uvede do styku s tímto přípravkem.