JP5057648B2 - 安定化されたタンパク組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、安定なタンパク組成物、詳しくは温血動物由来の血清アルブミンおよびカルニチンを配合せず、かつ少なくとも、インターロイキン−２、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、上皮増殖因子のいずれか１種、糖および／または糖アルコール（ソルビトールを除く）、アミノ酸（グリシンおよびヒスチジンを除く）を含むタンパク組成物（但し、アラニンおよびスクロースを配合した組成物、塩酸リジンおよびスクロースを配合した組成物を除く）、要すれば酸および塩基、さらに要すれば界面活性剤を含んだタンパク組成物に関するものである。
インターロイキン−２（以下、ＩＬ−２と略す）は、Ｔ細胞やナチュラルキラー細胞を増殖させる生理活性を有するタンパク質であり、種々の癌、特に血管肉腫や腎癌、また免疫不全の治療薬として大きな期待が寄せられている。また、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療薬としても大きな期待が持たれている。また、ＩＬ−２と同様に抗腫瘍作用を有するタンパクとして、インターフェロン（以下、ＩＦＮと略す）があり、ウイルス・二本鎖ＲＮＡ・レクチンなどによって動物細胞から誘発される抗ウイルス作用も有する。さらに、上皮増殖因子（以下、ＥＧＦと略す）は、上皮細胞の分化・増殖を促進させる作用をもち、細胞内タンパク質のリン酸化を亢進させる。
上記、ＩＬ−２、ＩＦＮ、ＥＧＦのようなタンパク成分は、通常の保存状態では不安定な物質であるために、種々の安定化方法が試みられている。例えば、安定化剤としてヒト血清アルブミンを配合したＩＬ−２を含む溶液に、塩基および酸を加え、中性とすることによりＩＬ−２の組成物を得ているもの（例：特開昭６２−１６４６３１）や還元物質さらにはヒト血清アルブミンを配合することによってＩＬ−２組成物を得ているもの（例：特開昭６０−２１５６３１）がある。また、アミノ酸であるグリシンおよび糖であるスクロースを含み、ヒスチジン（塩基）またはクエン酸（酸）のいずれかでｐＨ５〜６．５に調整されたＩＬ−２組成物を得ているもの（例：ＷＯ０２／００２４３）やアルギニンとカルニチン（４−トリメチルアミノ−３−ヒドロキシ酪酸、別名ビタミンＢＴ）の混合物、スクロースおよびクエン酸を含んだＩＬ−２組成物を得ているもの（例：ＷＯ９０／００３９７）がある。上記、ＩＬ−２、ＩＦＮ、ＥＧＦ以外のタンパクを含む製剤には、糖およびアミノ酸でタンパク質を安定化させて製剤を得ているものがある（例：特表平８−５０４７８４、ＷＯ９６／４１６４２、特表２００１−５０３７８１）。
しかしながら、上記ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等の温熱動物由来の血清アルブミンは、最近、ウイルス感染や狂牛病などの危険性が指摘されており、ＨＳＡのような特定生物由来製品は製剤処方に含まれないことが望まれている。また、ＩＬ−２は水に比較的難溶性であり、通常中性付近で凝集反応が生じ溶解度が低下するために、一旦塩基または酸を添加してＩＬ−２を溶解した後、酸または塩基を添加して中性付近にする必要がある。このため、上記ＷＯ０２／００２４３に記載されているように、酸または塩基のいずれかしか配合しなければ、凝集反応が生じ、ＩＬ−２の溶解度が低下する恐れがある。さらに、上記ＷＯ９０／００３９７に開示されている安定化剤としてのカルニチンは、甲状腺阻害剤であり、その添加量によっては、副作用を生じる恐れがある。また、タンパク質の安定化方法については、一般的にタンパク質の種類が異なれば、必ずしも同様に安定化できるとは限らないことが文献に記載されており［Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１ ８５、１２９−１８８（１９９９）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３、１−６０（２０００）］、上記ＩＬ−２やＩＦＮと異なるタンパク成分を安定化できる組成物でも、当該タンパク成分を安定化できるとは限らない。このように、タンパク成分として、安全性が高く、しかも保存性のよい組成物が望まれていた。
上記、ＩＬ−２、ＩＦＮ、ＥＧＦのようなタンパク成分は、通常の保存状態では不安定な物質であるために、種々の安定化方法が試みられている。例えば、安定化剤としてヒト血清アルブミンを配合したＩＬ−２を含む溶液に、塩基および酸を加え、中性とすることによりＩＬ−２の組成物を得ているもの（例：特開昭６２−１６４６３１）や還元物質さらにはヒト血清アルブミンを配合することによってＩＬ−２組成物を得ているもの（例：特開昭６０−２１５６３１）がある。また、アミノ酸であるグリシンおよび糖であるスクロースを含み、ヒスチジン（塩基）またはクエン酸（酸）のいずれかでｐＨ５〜６．５に調整されたＩＬ−２組成物を得ているもの（例：ＷＯ０２／００２４３）やアルギニンとカルニチン（４−トリメチルアミノ−３−ヒドロキシ酪酸、別名ビタミンＢＴ）の混合物、スクロースおよびクエン酸を含んだＩＬ−２組成物を得ているもの（例：ＷＯ９０／００３９７）がある。上記、ＩＬ−２、ＩＦＮ、ＥＧＦ以外のタンパクを含む製剤には、糖およびアミノ酸でタンパク質を安定化させて製剤を得ているものがある（例：特表平８−５０４７８４、ＷＯ９６／４１６４２、特表２００１−５０３７８１）。
しかしながら、上記ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等の温熱動物由来の血清アルブミンは、最近、ウイルス感染や狂牛病などの危険性が指摘されており、ＨＳＡのような特定生物由来製品は製剤処方に含まれないことが望まれている。また、ＩＬ−２は水に比較的難溶性であり、通常中性付近で凝集反応が生じ溶解度が低下するために、一旦塩基または酸を添加してＩＬ−２を溶解した後、酸または塩基を添加して中性付近にする必要がある。このため、上記ＷＯ０２／００２４３に記載されているように、酸または塩基のいずれかしか配合しなければ、凝集反応が生じ、ＩＬ−２の溶解度が低下する恐れがある。さらに、上記ＷＯ９０／００３９７に開示されている安定化剤としてのカルニチンは、甲状腺阻害剤であり、その添加量によっては、副作用を生じる恐れがある。また、タンパク質の安定化方法については、一般的にタンパク質の種類が異なれば、必ずしも同様に安定化できるとは限らないことが文献に記載されており［Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１ ８５、１２９−１８８（１９９９）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３、１−６０（２０００）］、上記ＩＬ−２やＩＦＮと異なるタンパク成分を安定化できる組成物でも、当該タンパク成分を安定化できるとは限らない。このように、タンパク成分として、安全性が高く、しかも保存性のよい組成物が望まれていた。
上記事情に鑑み、本発明者らは、温血動物由来の血清アルブミンおよびカルニチンを含まず、医薬上許容されうる糖および／または糖アルコール、アミノ酸ならびに要すれば、酸および塩基、さらに要すれば、界面活性剤等を配合することによって、ＩＬ−２、ＩＦＮであるＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、またはＥＧＦの安定性を高めた組成物を見出し、以下に示す本発明を完成した。
（１）温血動物由来の血清アルブミンおよびカルニチンを配合せず、かつ少なくとも以下の成分
１）インターロイキン−２、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γまたは上皮増殖因子のいずれか１種、
２）糖および／または糖アルコール（ソルビトールを除く）、ならびに、
３）アミノ酸（グリシンおよびヒスチジンを除く）
を含むことを特徴とする、タンパク組成物（但し、アラニンおよびスクロースを配合した組成物、塩酸リジンおよびスクロースを配合した組成物を除く）。
（２）更に酸および塩基を含むことを特徴とする、上記（１）に記載の組成物。
（３）更に界面活性剤を含むことを特徴とする、上記（１）に記載の組成物。
（４）糖および／または糖アルコールがマルトース、マンニトール、ラクトースおよびスクロースから選ばれる１または２以上である上記（１）から（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）糖および／または糖アルコールがマルトースおよび／またはスクロースである上記（４）に記載の組成物。
（６）アミノ酸がアラニン、塩酸リジンおよびアルギニンがら選ばれる１または２以上である上記（１）から（３）のいずれかに記載の組成物。
（７）アミノ酸がアルギニンである上記（６）に記載の組成物。
（８）糖および／または糖アルコールがマルトースおよび／またはスクロースであり、アミノ酸がアルギニンである上記（１）から（３）のいずれかに記載の組成物。
（９）糖および／または糖アルコールとアミノ酸の組合せがメイラード反応を生じないものである上記（１）から（３）のいずれかに記載の組成物。
（１０）凍結乾燥品である上記（１）から（３）のいずれかに記載の組成物。
（１１）溶液状態でインターロイキン−２、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γまたは上皮増殖因子のいずれかの濃度が１〜２２０μｇ／ｍＬとなるように調製された上記（１）から（３）のいずれかに記載の組成物。
（１２）溶液状態でｐＨが６．１〜９を示すように調製された上記（１）から（３）のいずれかに記載の組成物。
（１３）シリコーンコーティングされた容器に収容された上記（１）から（３）のいずれかに記載の組成物。
（１４）温血動物由来の血清アルブミンおよびカルニチンを配合せず、かつ少なくとも以下の成分
１）インターロイキン−２、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γまたは上皮増殖因子のいずれか１種、
２）糖および／または糖アルコール（ソルビトールを除く）、ならびに、
３）アミノ酸（グリシンおよびヒスチジンを除く）
を含んだ溶液を凍結乾燥する工程を含むことを特徴とする、タンパク組成物（但し、アラニンおよびスクロースを配合した組成物、塩酸リジンおよびスクロースを配合した組成物を除く）の製造方法。
（１５）該溶液のインターロイキン−２、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γまたは上皮増殖因子のいずれかの濃度が１〜２２０μｇ／ｍＬである上記（１４）に記載の製造方法。
（１６）該溶液がインターロイキン−２を含むものであり、該溶液に塩基を加えてｐＨ８〜１１とした後、速やかに酸を加えて中和するか、または該溶液に酸を加えてｐＨ２〜６とした後、速やかに塩基を加えて中和する工程を含むことを特徴とする、上記（１４）または（１５）に記載の製造方法。
（１７）該溶液が更に界面活性剤を含むことを特徴とする、上記（１６）に記載の製造方法。
（１８）温血動物由来の血清アルブミンおよびカルニチンを配合せず、かつ少なくとも糖および／または糖アルコール（ソルビトールを除く）、ならびにアミノ酸（グリシンおよびヒスチジンを除く）を配合することを特徴とする、インターロイキン−２、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γまたは上皮増殖因子のいずれかを安定化する方法。
（１９）更に酸および塩基、ならびに界面活性剤を配合することを特徴とする、上記（１８）に記載の方法。
（１）温血動物由来の血清アルブミンおよびカルニチンを配合せず、かつ少なくとも以下の成分
１）インターロイキン−２、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γまたは上皮増殖因子のいずれか１種、
２）糖および／または糖アルコール（ソルビトールを除く）、ならびに、
３）アミノ酸（グリシンおよびヒスチジンを除く）
を含むことを特徴とする、タンパク組成物（但し、アラニンおよびスクロースを配合した組成物、塩酸リジンおよびスクロースを配合した組成物を除く）。
（２）更に酸および塩基を含むことを特徴とする、上記（１）に記載の組成物。
（３）更に界面活性剤を含むことを特徴とする、上記（１）に記載の組成物。
（４）糖および／または糖アルコールがマルトース、マンニトール、ラクトースおよびスクロースから選ばれる１または２以上である上記（１）から（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）糖および／または糖アルコールがマルトースおよび／またはスクロースである上記（４）に記載の組成物。
（６）アミノ酸がアラニン、塩酸リジンおよびアルギニンがら選ばれる１または２以上である上記（１）から（３）のいずれかに記載の組成物。
（７）アミノ酸がアルギニンである上記（６）に記載の組成物。
（８）糖および／または糖アルコールがマルトースおよび／またはスクロースであり、アミノ酸がアルギニンである上記（１）から（３）のいずれかに記載の組成物。
（９）糖および／または糖アルコールとアミノ酸の組合せがメイラード反応を生じないものである上記（１）から（３）のいずれかに記載の組成物。
（１０）凍結乾燥品である上記（１）から（３）のいずれかに記載の組成物。
（１１）溶液状態でインターロイキン−２、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γまたは上皮増殖因子のいずれかの濃度が１〜２２０μｇ／ｍＬとなるように調製された上記（１）から（３）のいずれかに記載の組成物。
（１２）溶液状態でｐＨが６．１〜９を示すように調製された上記（１）から（３）のいずれかに記載の組成物。
（１３）シリコーンコーティングされた容器に収容された上記（１）から（３）のいずれかに記載の組成物。
（１４）温血動物由来の血清アルブミンおよびカルニチンを配合せず、かつ少なくとも以下の成分
１）インターロイキン−２、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γまたは上皮増殖因子のいずれか１種、
２）糖および／または糖アルコール（ソルビトールを除く）、ならびに、
３）アミノ酸（グリシンおよびヒスチジンを除く）
を含んだ溶液を凍結乾燥する工程を含むことを特徴とする、タンパク組成物（但し、アラニンおよびスクロースを配合した組成物、塩酸リジンおよびスクロースを配合した組成物を除く）の製造方法。
（１５）該溶液のインターロイキン−２、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γまたは上皮増殖因子のいずれかの濃度が１〜２２０μｇ／ｍＬである上記（１４）に記載の製造方法。
（１６）該溶液がインターロイキン−２を含むものであり、該溶液に塩基を加えてｐＨ８〜１１とした後、速やかに酸を加えて中和するか、または該溶液に酸を加えてｐＨ２〜６とした後、速やかに塩基を加えて中和する工程を含むことを特徴とする、上記（１４）または（１５）に記載の製造方法。
（１７）該溶液が更に界面活性剤を含むことを特徴とする、上記（１６）に記載の製造方法。
（１８）温血動物由来の血清アルブミンおよびカルニチンを配合せず、かつ少なくとも糖および／または糖アルコール（ソルビトールを除く）、ならびにアミノ酸（グリシンおよびヒスチジンを除く）を配合することを特徴とする、インターロイキン−２、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γまたは上皮増殖因子のいずれかを安定化する方法。
（１９）更に酸および塩基、ならびに界面活性剤を配合することを特徴とする、上記（１８）に記載の方法。
本発明のＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γまたはＥＧＦを含む組成物は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γまたはＥＧＦのいずれか一種および下記の添加物を溶解した溶液（例：注射剤）として用いることができるが、該溶液の液媒体を乾燥し、固形剤（例：凍結乾燥製剤）にする場合もある。固形剤であるならば、組成物を長期保存することも可能である。
本発明では、ＩＬ−２の場合、天然由来または遺伝子組換えＩＬ−２の全てを用いることができるが、特に遺伝子組換えヒトＩＬ−２が好ましい。ＩＦＮ−α、β、γの場合、天然由来または遺伝子組換えヒトＩＦＮ−α、β、γの全てを用いることができるが、特に遺伝子組換えヒトＩＦＮ−α、β、γが好ましい。また、ＥＧＦの場合、天然由来または遺伝子組換えヒトＥＧＦの全てを用いることができるが、特に遺伝子組換えヒトＥＧＦが好ましい。
組成物中のＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの濃度が低くても、当該薬物の容器壁面への吸着が少ないことが大きな特徴であり、本発明の組成物を溶液として使用する場合、溶液１ｍＬ中にＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦは、０．１〜５００μｇ、好ましくは０．５〜３００μｇ、より好ましくは１〜２２０μｇ配合すればよい。また、本発明の組成物を固形剤として使用する場合、固形剤全量に対しＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦは、０．００１〜５ｗ／ｗ％、好ましくは０．００２５〜２．５ｗ／ｗ％、より好ましくは０．００３〜１ｗ／ｗ％配合すればよい。ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦ含量が前記配合量よりも少なければ、薬効が十分に発揮されない可能性がある。前記配合量よりも多ければ、溶液中にＩＬ−２等の薬物が完全に溶解しない恐れがある。
本発明において、糖および／または糖アルコールは、単糖類、二糖類、多糖類あるいは水溶性グルカン類を意味し、生理的に許容されるものであれば使用できる。糖および／または糖アルコールは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定化のために添加されるが、溶解補助剤、賦形剤あるいは等張化剤としても添加されうる。糖として、具体的にはグルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、フルクトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、カルボキシメチルセルロース−Ｎａ等が挙げられる。また、糖アルコールとしてはＣ４〜Ｃ８の糖アルコールが好ましく、具体的には、マンニトール、イノシトール、ズルシトール、キシリトール、アラビトール、ラフィノース、エリスリトール、マルチトール、ラクチトール、パラチニット、トレハロース等が挙げられる。前記糖および／または糖アルコールの中で、好ましくはマルトース、マンニトール、ラクトース、スクロースおよびソルビトールであり、さらに好ましくはマルトース、マンニトール、ラクトースおよびスクロースであり、特に好ましくはマルトース、スクロースである。
前記の糖および／または糖アルコールは、単独または混合物で用いることができる。配合量は特に限定されるものではなく、組成物の溶液に溶解可能でＩＬ−２の安定性を高める量であればよい。ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦに対する糖および／または糖アルコールの配合割合は重量比で１〜２００００倍、好ましくは５〜１７５００倍、より好ましくは２０〜１５０００倍であればよい。また、本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に糖および／または糖アルコールを５〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇ、より好ましくは２０〜２００ｍｇ添加すればよい。前記配合量よりも少なければ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦを安定化することができない恐れがあり、多ければ、組成物全量に対するＩＬ−２含量が相対的に低下し、多量のＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの組成物を投与しなければ、薬効が生じない可能性がある。
本発明において、アミノ酸は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定化のために添加されるが、賦形剤としても添加されうる。アミノ酸とは、分子内にアミノ基とカルボキシル基とをもつ化合物を意味するが、プロリンおよびヒドロキシプロリンのようなイミノ酸も含まれ、生理的に許容されるものであれば使用できる。アミノ酸としては、中性アミノ酸、酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸が挙げられる。具体的には中性アミノ酸として、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、ジヨードチロシン、スルナミン、トレオニン、セリン、プロリン、ヒドロキシプロリン、トリプトファン、チロキシン、メチオニン、シスチン、システイン、α−アミノ酪酸等が挙げられる。酸性アミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン等が挙げられる。塩基性アミノ酸としては、リジン、塩酸リジン、アルギニン、ヒドロキシリジン等が挙げられる。前記アミノ酸のうち、好ましくはアラニン、塩酸リジン、アルギニンであり、より好ましくはアルギニンである。
前記のアミノ酸は、単独または混合物で用いることができる。添加量は特に限定されるものではなく、組成物の溶液に溶解可能でＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定性を高める量であればよい。ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦに対するアミノ酸の配合割合は重量比で１〜１００００倍、好ましくは１０〜７５００倍、より好ましくは２０〜５０００倍であればよい。また、本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中にアミノ酸を０．１〜２５０ｍｇ、好ましくは０．５〜１２５ｍｇ、より好ましくは１〜１００ｍｇ添加すればよい。前記添加量よりも少なければ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦを安定化できない恐れがあり、多ければ、組成物全量に対するＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの含量が相対的に低下し、多量のＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦを含有する組成物を投与しなければ、薬効が生じない可能性がある。
本発明組成物は、前記したように、糖および／または糖アルコール、ならびにアミノ酸を配合しているために、固体状態でも液体状態でもメイラード反応を生じる場合がある。メイラード反応とは、アミノ酸、ペプチド、タンパク質のアミノ基とケトン、アルデヒド、特に還元糖が反応して褐色色素を生成するものである。しかし、本発明の組成物においては、特に糖および／または糖アルコールがマルトース、マンニトール、ラクトース、スクロース、好ましくはマルトース、スクロースであり、アミノ酸がアラニン、塩酸リジン、アルギニン、好ましくはアルギニンとの組合せの場合には、例えば４０℃で３０日間程度、該組成物を保存してもメイラード反応は生じる恐れが少なく、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの含量が低減する可能性も少ない。但し、アラニンおよびスクロースを配合した組成物、塩酸リジンおよびスクロースを配合した組成物は、凍結乾燥品が融解し、当該乾燥品は製造することができなかった。
上記、糖および／または糖アルコールとアミノ酸の含量の比率は、糖および／または糖アルコールに対し、重量比でアミノ酸が０．０１〜４倍、好ましくは０．０２５〜３倍、より好ましくは０．０５〜２倍である。なお、タンパク質製剤の場合、添加物が同じでも主薬であるタンパク質が異なれば、メイラード反応の有無も異なるので、メイラード反応を生じないようにするためには、タンパク質の種類によって製剤中の添加物の種類、量等を検討する必要がある。
本発明において、要すれば酸を配合してもよい。酸としては、生理的に許容される酸を全て用いることができる。例えば、酢酸、乳酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン等の有機酸や、塩酸、リン酸等の無機酸が挙げられ、単独でも、２種以上の混合物で用いてもよく、好ましくはクエン酸、酒石酸である。また、これらの薬理学的に許容される塩であってもよい。酸の添加量は用いる酸の種類によっても異なるが、所望のｐＨに調整できる必要量を添加すればよい。一般的には、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦに対する酸の配合割合は重量比で５〜１２０００倍、好ましくは１０〜６０００倍、より好ましくは２５〜３０００倍であればよい。本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に酸を０．２５〜５０ｍｇ、好ましくは０．５〜２０ｍｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ添加すればよい。また、前記量よりも少なければｐＨは塩基性となり、また多ければｐＨが酸性となり、いずれの状態でもＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦを安定化できない恐れがある。
なお、有機酸のうち、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンは、構成成分中の酸であると同時にアミノ酸でもありうる。
本発明において、要すれば塩基を配合してもよい。塩基としては、生理的に許容される塩基を全て用いることができる。例えば、Ｎ−メチルグルカミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミン等のアルコールアミン、モノ、ジまたはトリエチルアミン等のアルキルアミン、アルギニン、リジン、塩酸リジン等の塩基性アミノ酸、ならびに炭酸ナトリウム等の無機塩基等が用いられ、これらは単独でも、２種以上の混合物で用いてもよい。炭酸ナトリウム等の無機塩基を用いる際には、上記アミン等との併用が好ましい。好ましい塩基としては、Ｎ−メチルグルカミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、アルギニンであり、より好ましくは、ジエタノールアミン、アルギニンである。前記塩基は、単独でも、２種以上の混合物で用いてもよい。塩基の添加量は用いる塩基の種類によっても異なるが、所望のｐＨに調整できる必要量を添加すればよい。一般的には、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦに対する塩基の配合割合は重量比で２〜１００００倍、好ましくは５〜５０００倍、より好ましくは１０〜４５００倍であればよい。本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に酸を０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．２５〜１００ｍｇ、より好ましくは１〜５０ｍｇ添加すればよい。また、本発明組成物を固形剤として使用する場合、前記量よりも少なければ、溶液のｐＨが酸性となり、また多ければ、溶液のｐＨが塩基性となり、いずれの状態でもＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦを安定化できない恐れがある。
なお、塩基性アミノ酸であるアルギニン、リジン、塩酸リジン等は、構成成分の塩基であると同時にアミノ酸でもありうる。
本発明において、更に要すれば界面活性剤を添加することも可能である。界面活性剤としては、生理的に許容される界面活性剤であればよく、該界面活性剤の添加により、固形剤調製における乾燥前の組成物溶液調製時または固形剤を蒸留水に再溶解する時のＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの溶解性改善ならびに、組成物溶液の液媒体を乾燥した時におけるＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定性を向上（特に乾燥時におけるＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの容器壁面の吸着を防止して、組成物中のＩＬ−２含量の低下を抑制する）するなどの効果が得られる。界面活性剤として、組成物の溶液に溶解または懸濁でき、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定性を高めるものであればよいが、好ましくは非イオン性界面活性剤であり、具体的にはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等が挙げられる。ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油として具体的には、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油２０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０等がある。ポリエチレングリコールとして具体的には、マクロゴール２００、マクロゴール３００、マクロゴール４００、マクロゴール６００、マクロゴール１０００、マクロゴール１５００、マクロゴール１５４０、マクロゴール２０００、マクロゴール４０００、マクロゴール６０００、マクロゴール２００００等がある。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールとして具体的には、ポリオキシエチレン（１０５）ポリオキシプロピレン（５）グリコール、ポリオキシエチレン（１２０）ポリオキシプロピレン（４０）グリコール［プルロニックＦ８７］、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール［プルロニックＦ６８］、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール［プルロニックＰ１２３］、ポリオキシエチレン（５４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール［プルロニックＦ８５］、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール［プルロニックＦ１２７］、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（２０）グリコール［プルロニックＬ４４］等がある。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとして具体的には、ポリソルベート２０［Ｔｗｅｅｎ２０］、ポリソルベート４０［Ｔｗｅｅｎ４０］、ポリソルベート６０［Ｔｗｅｅｎ６０］、ポリソルベート６５［Ｔｗｅｅｎ６５］、ポリソルベート８０［Ｔｗｅｅｎ８０］等がある。より好ましくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、特に好ましくはポリソルベート８０［Ｔｗｅｅｎ８０］である。
界面活性剤の配合量は用いる界面活性剤の種類によっても異なるが、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦに対する界面活性剤の配合割合は重量比で１〜３００倍、好ましくは２．５〜２５０倍、より好ましくは５〜２００倍であればよい。本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ〜１５ｍｇ、好ましくは０．０７５ｍｇ〜７．５ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜４ｍｇを添加すればよい。また、本発明組成物を固形剤として使用する場合、前記添加量よりも少なければ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの溶解性が改善せず、またＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定性が低下する恐れがあり、逆に多ければ、調製の際、泡立ちにより組成物溶液の調製が困難となる可能性がある。
本発明では、固形剤調製における乾燥前の組成物溶液製造時または固形剤を蒸留水に再溶解する時のｐＨ変動を最小限にするために緩衝剤を用いることが好ましい。緩衝剤としては、生理的に許容される緩衝剤であればよく、例えば、リン酸系またはクエン酸系の緩衝剤が挙げられる。
緩衝剤の添加量は用いる緩衝剤の種類によっても異なるが、所望のｐＨ、すなわち、組成物の溶液のｐＨを６．１〜９に保持するのに必要な量を用いればよい。具体的には、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦに対する緩衝剤の配合割合は重量比で２０〜１００００倍、好ましくは５０〜８０００倍、より好ましくは１００〜６０００倍あればよい。本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に緩衝剤を１〜１００ｍｇ、好ましくは２．５〜７５ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇ添加すればよい。前記量よりも少なければ、組成物溶液製造時または固形剤を蒸留水に再溶解する時のｐＨ変動が大きくなる恐れがあり、多ければ、組成物全量に対するＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの含量が相対的に低下し、多量のＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの組成物を投与しなければ、薬効が生じない可能性がある。
本発明の製剤は、製剤の形態に応じ、製剤学上許容される添加物を含有しうる。例えば、注射剤の場合、フェノール、クレゾール等の保存剤、亜硫酸塩、ピロ亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸等の酸化防止剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール等の無痛化剤、塩化ナトリウム、グリセリン等の等張化剤を添加してもよい。
安定化剤として、温血動物由来の血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ブタ血清アルブミン等を配合した場合、前述した様に副作用を生じる可能性があるが、アルブミンであっても遺伝子組換えアルブミンであれば、上記副作用を生じる可能性が低く、組成物の添加剤として配合する場合もありうる。遺伝子組換えアルブミンの添加は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定性低下の防止に有用である。ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦに対する遺伝子組換えアルブミンの配合割合は、重量比で１〜４０００倍、好ましくは２．５〜２０００倍、より好ましくは５〜１０００倍であればよい。本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．２５ｍｇ〜５０ｍｇ、より好ましくは０．５ｍｇ〜２５ｍｇを添加すればよい。
本発明の組成物は、少なくともＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦのうちいずれか１種、糖および／または糖アルコール、アミノ酸、要すれば酸ならびに塩基、さらに要すれば界面活性剤、またｐＨの調節のために緩衝剤等の配合成分を含む。これら組成物の配合成分の好ましい組合せとして、ＩＬ−２の場合、１）ＩＬ−２、マルトース、アルギニン、クエン酸、ジエタノールアミン（場合によっては、ジエタノールアミンを配合しない場合もある）、要すればポリソルベート８０およびリン酸緩衝液、および２）ＩＬ−２、スクロース、アルギニン、クエン酸、ジエタノールアミン（場合によっては、ジエタノールアミンを配合しない場合もある）、要すればポリソルベート８０およびリン酸緩衝液の組合せの組成物である。これら好ましい組合せの配合成分の配合量について、ＩＬ−２は、固形剤全量に対し０．００１〜５ｗ／ｗ％、好ましくは０．００５〜２．５ｗ／ｗ％、より好ましくは０．０１〜１ｗ／ｗ％、ＩＬ−２に対するマルトースまたはスクロースの配合割合は重量比で１〜１００００倍、好ましくは５〜５０００倍、より好ましくは２０〜４０００倍、ＩＬ−２に対するアルギニンの配合割合は重量比で１〜５０００倍、好ましくは１０〜２５００倍、より好ましくは２０〜２０００倍、ＩＬ−２に対するクエン酸の配合割合は重量比で５〜２０００倍、好ましくは１０〜１０００倍、より好ましくは２５〜５００倍、ＩＬ−２に対するジエタノールアミンの配合割合は重量比で１０〜５０００倍、好ましくは２５〜２５００倍、より好ましくは５０〜２０００倍（場合によっては、ジエタノールアミンを配合しない場合もある）、ＩＬ−２に対するポリソルベート８０の配合割合は、重量比で１〜３００倍、好ましくは２．５〜２５０倍、より好ましくは５〜２００倍、リン酸緩衝液を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的にはＩＬ−２に対する緩衝剤の配合割合は、重量比で２０〜２０００倍、好ましくは５０〜１５００倍、より好ましくは１００〜１０００倍であればよい。本発明の組成物を溶液として使用する場合、ＩＬ−２は、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜５００μｇ、好ましくは０．５〜２５０μｇ、より好ましくは１〜１００μｇ、マルトースまたはスクロースは、組成物の溶液１ｍＬ中に５〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇ、より好ましくは２０〜２００ｍｇ、アルギニンは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜２５０ｍｇ、好ましくは０．５〜１２５ｍｇ、より好ましくは１〜１００ｍｇ、クエン酸は、組成物の溶液１ｍＬ中に０．２５〜５０ｍｇ、好ましくは、０．５〜２０ｍｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ、ジエタノールアミンは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．２５〜１００ｍｇ、より好ましくは１〜５０ｍｇ（場合によってはジエタノールアミンを配合しない場合もある）、ポリソルベート８０を添加するならば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ〜１５ｍｇ、好ましくは０．０７５ｍｇ〜７．５ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜４ｍｇ、リン酸緩衝液を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的には組成物の溶液１ｍＬ中に１〜１００ｍｇ、好ましくは２．５〜７５ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇ添加すればよい。本発明の組成物を固形剤として使用する場合、また、マルトースとアルギニン、およびスクロースとアルギニンとの含量の比率は、マルトースまたはスクロースに対し、重量比でアルギニンが０．０１〜４倍、好ましくは０．０５〜３倍、より好ましくは０．１〜２倍である。
ＩＦＮ−αの場合、組成物の配合成分の好ましい組合せとして、１）ＩＦＮ−α、マルトース、アルギニン、要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、さらに要すればポリソルベート８０、２）ＩＦＮ−α、スクロース、アルギニン、要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、さらに要すればポリソルベート８０の組合せの組成物である。これら好ましい組合せの配合成分の配合量について、ＩＦＮ−αは、固形剤全量に対し０．０００１〜５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０００５〜２．５ｗ／ｗ％、より好ましくは０．００１〜１ｗ／ｗ％、ＩＦＮ−αに対するマルトースまたはスクロースの配合割合は重量比で１〜２００００倍、好ましくは５〜１７５００倍、より好ましくは２０〜１３０００倍、ＩＦＮ−αに対するアルギニンの配合割合は重量比で１〜５０００倍、好ましくは１０〜４５００倍、より好ましくは２０〜４０００倍、要すればＩＦＮ−αに対する塩酸の配合割合は重量比で５〜６０００倍、好ましくは１０〜３０００倍、より好ましくは２５〜１５００倍、リン酸緩衝剤を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的にはＩＦＮ−αに対する緩衝液の配合割合は、重量比で２０〜１００００倍、好ましくは５０〜８０００倍、より好ましくは１００〜６０００倍である。さらにポリソルベート８０を要すれば、ＩＦＮ−αに対するポリソルベート８０の配合割合は、重量比で１〜３００倍、好ましくは２．５〜２５０倍、より好ましくは５〜２００倍であればよい。本発明の組成物を溶液として使用する場合、ＩＦＮ−αは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜５００μｇ、好ましくは０．５〜２５０μｇ、より好ましくは１〜１００μｇ、マルトースまたはスクロースは、組成物の溶液１ｍＬ中に５〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇ、より好ましくは２０〜２００ｍｇ、アルギニンは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜２５０ｍｇ、好ましくは０．５〜１２５ｍｇ、より好ましくは１〜１００ｍｇ、塩酸を添加するならば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．２５〜１００ｍｇ、好ましくは、０．５〜４０ｍｇ、より好ましくは１〜２０ｍｇ、リン酸緩衝液を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的には組成物の溶液１ｍＬ中に１〜１００ｍｇ、好ましくは２．５〜７５ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇ添加すればよい。さらにポリソルベート８０を要すれば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ〜１５ｍｇ、好ましくは０．０７５ｍｇ〜７．５ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜４ｍｇ添加すればよい。本発明の組成物を固形剤として使用する場合、また、マルトースとアルギニン、およびスクロースとアルギニンとの含量の比率は、マルトースまたはスクロースに対し、重量比でアルギニンが０．０１〜４倍、好ましくは０．０５〜３倍、より好ましくは０．１〜２倍である。
ＩＦＮ−βの場合、組成物の配合成分の好ましい組合せとして、１）ＩＦＮ−β、マルトース、アルギニン、要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、さらに要すればポリソルベート８０、２）ＩＦＮ−β、スクロース、アルギニン、要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、さらに要すればポリソルベート８０の組合せの組成物である。これら好ましい組合せの配合成分の配合量について、ＩＦＮ−βは、固形剤全量に対し０．０００１〜５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０００５〜２．５ｗ／ｗ％、より好ましくは０．００１〜１ｗ／ｗ％、ＩＦＮ−βに対するマルトースまたはスクロースの配合割合は重量比で１〜２００００倍、好ましくは５〜１７５００倍、より好ましくは２０〜１００００倍、ＩＦＮ−βに対するアルギニンの配合割合は重量比で１〜５０００倍、好ましくは１０〜４５００倍、より好ましくは２０〜４０００倍、要すればＩＦＮ−βに対する塩酸の配合割合は重量比で５〜６０００倍、好ましくは１０〜３０００倍、より好ましくは２５〜１５００倍、リン酸緩衝剤を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的にはＩＦＮ−βに対する緩衝液の配合割合は、重量比で２０〜１００００倍、好ましくは５０〜８０００倍、より好ましくは１００〜６０００倍であればよい。さらにポリソルベート８０を要すれば、ＩＦＮ−βに対するポリソルベート８０の配合割合は、重量比で１〜３００倍、好ましくは２．５〜２５０倍、より好ましくは５〜２００倍であればよい。本発明の組成物を溶液として使用する場合、ＩＦＮ−βは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜５００μｇ、好ましくは０．５〜２５０μｇ、より好ましくは１〜１００μｇ、マルトースまたはスクロースは、組成物の溶液１ｍＬ中に５〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇ、より好ましくは２０〜２００ｍｇ、アルギニンは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜２５０ｍｇ、好ましくは０．５〜１２５ｍｇ、より好ましくは１〜１００ｍｇ、塩酸を添加するならば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．２５〜１００ｍｇ、好ましくは、０．５〜４０ｍｇ、より好ましくは１〜２０ｍｇ、リン酸緩衝液を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的には組成物の溶液１ｍＬ中に１〜１００ｍｇ、好ましくは２．５〜７５ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇ添加すればよい。さらにポリソルベート８０を要すれば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ〜１５ｍｇ、好ましくは０．０７５ｍｇ〜７．５ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜４ｍｇ添加すればよい。本発明の組成物を固形剤として使用する場合、また、マルトースとアルギニン、およびスクロースとアルギニンとの含量の比率は、マルトースまたはスクロースに対し、重量比でアルギニンが０．０１〜４倍、好ましくは０．０５〜３倍、より好ましくは０．１〜２倍である。
ＩＦＮ−γの場合、組成物の配合成分の好ましい組合せとして、１）ＩＦＮ−γ、マルトース、アルギニン、Ｌ−システイン、要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、さらに要すればポリソルベート８０、２）ＩＦＮ−γ、スクロース、アルギニン、Ｌ−システイン、要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、さらに要すればポリソルベート８０の組合せの組成物である。これら好ましい組合せの配合成分の配合量について、ＩＦＮ−γは、固形剤全量に対し０．００１〜５ｗ／ｗ％、好ましくは０．００５〜２．５ｗ／ｗ％、より好ましくは０．０１〜１ｗ／ｗ％、ＩＦＮ−γに対するマルトースまたはスクロースの配合割合は重量比で１〜５０００倍、好ましくは５〜２５００倍、より好ましくは２０〜１０００倍、ＩＦＮ−γに対するアルギニンの配合割合は重量比で１〜２５００倍、好ましくは１０〜１０００倍、より好ましくは２０〜５００倍、ＩＦＮ−γに対するＬ−システインの配合割合は重量比で０．１〜５倍、好ましくは０．２〜４倍、より好ましくは０．３〜３倍、要すればＩＦＮ−γに対する塩酸の配合割合は重量比で５〜２０００倍、好ましくは１０〜１０００倍、より好ましくは２５〜５００倍、ＩＦＮ−γに対するポリソルベート８０の配合割合は、重量比で１〜３００倍、好ましくは２．５〜２５０倍、より好ましくは５〜２００倍、リン酸緩衝液を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的にはＩＦＮ−γに対する緩衝液の配合割合は、重量比で１０〜２０００倍、好ましくは２０〜１５００倍、より好ましくは４０〜１０００倍であればよい。さらにポリソルベート８０を要すれば、ＩＦＮ−γに対するポリソルベート８０の配合割合は、重量比で１〜３００倍、好ましくは２．５〜２５０倍、より好ましくは５〜２００倍であればよい。本発明の組成物を溶液として使用する場合、ＩＦＮ−γは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜１０００μｇ、好ましくは０．５〜７５０μｇ、より好ましくは１〜５００μｇ、マルトースまたはスクロースは、組成物の溶液１ｍＬ中に５〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇ、より好ましくは２０〜２００ｍｇ、アルギニンは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜２５０ｍｇ、好ましくは０．５〜１２５ｍｇ、より好ましくは１〜１００ｍｇ、Ｌ−システインは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０１〜５ｍｇ、好ましくは０．０５〜３ｍｇ、より好ましくは０．１〜２．５ｍｇ、塩酸を添加するならば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．２５〜１００ｍｇ、好ましくは、０．５〜４０ｍｇ、より好ましくは１〜２０ｍｇ、ポリソルベート８０を添加するならば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ〜１５ｍｇ、好ましくは０．０７５ｍｇ〜７．５ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜４ｍｇ、リン酸緩衝液を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的には組成物の溶液１ｍＬ中に１〜１００ｍｇ、好ましくは２．５〜７５ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇ添加すればよい。さらにポリソルベート８０を要すれば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ〜１５ｍｇ、好ましくは０．０７５ｍｇ〜７．５ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜４ｍｇ添加すればよい。本発明の組成物を固形剤として使用する場合、また、マルトースとアルギニン、およびスクロースとアルギニンとの含量の比率は、マルトースまたはスクロースに対し、重量比でアルギニンが０．０１〜４倍、好ましくは０．０５〜３倍、より好ましくは０．１〜２倍である。
ＥＧＦの場合、組成物の配合成分の好ましい組合せとして、１）ＥＧＦ、マルトース、アルギニン、要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、さらに要すればポリソルベート８０、２）ＥＧＦ、スクロース、アルギニン、要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、さらに要すればポリソルベート８０の組合せの組成物である。これら好ましい組合せの配合成分の配合量について、ＥＧＦは、固形剤全量に対し０．００１〜５ｗ／ｗ％、好ましくは０．００５〜２．５ｗ／ｗ％、より好ましくは０．００７５〜１ｗ／ｗ％、ＥＧＦに対するマルトースまたはスクロースの配合割合は重量比で１０〜５０００倍、好ましくは５０〜４５００倍、より好ましくは１００〜４０００倍、ＥＧＦに対するアルギニンの配合割合は重量比で１〜２５００倍、好ましくは１０〜２０００倍、より好ましくは２０〜１７５０倍、要すればＥＧＦに対する塩酸の配合割合は重量比で５〜２０００倍、好ましくは１０〜１０００倍、より好ましくは２５〜５００倍、リン酸緩衝液を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的にはＥＧＦに対する緩衝液の配合割合は、重量比で１０〜３０００倍、好ましくは２０〜２５００倍、より好ましくは４０〜２０００倍であればよい。さらにポリソルベート８０を要すれば、ＥＧＦに対するポリソルベート８０の配合割合は、重量比で１〜３００倍、好ましくは２．５〜２５０倍、より好ましくは５〜２００倍であればよい。本発明の組成物を溶液として使用する場合、ＥＧＦは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜１０００μｇ、好ましくは０．５〜５００μｇ、より好ましくは１〜１００μｇ、マルトースまたはスクロースは、組成物の溶液１ｍＬ中に５〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇ、より好ましくは２０〜２００ｍｇ、アルギニンは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜２５０ｍｇ、好ましくは０．５〜１２５ｍｇ、より好ましくは１〜１００ｍｇ、塩酸を添加するならば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．２５〜１００ｍｇ、好ましくは、０．５〜４０ｍｇ、より好ましくは１〜２０ｍｇ、リン酸緩衝液を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的には組成物の溶液１ｍＬ中に１〜１００ｍｇ、好ましくは２．５〜７５ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇ添加すればよい。さらにポリソルベート８０を添加するならば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ〜１５ｍｇ、好ましくは０．０７５ｍｇ〜７．５ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜４ｍｇ添加すればよい。本発明の組成物を固形剤として使用する場合、また、マルトースとアルギニン、およびスクロースとアルギニンとの含量の比率は、マルトースまたはスクロースに対し、重量比でアルギニンが０．０１〜４倍、好ましくは０．０５〜３倍、より好ましくは０．１〜２倍である。
本発明溶液から固形剤を製造する際の溶液の乾燥法としては、組成物溶液の液媒体を乾燥しさえすればよいが、好ましくは凍結乾燥法、流動層乾燥法、噴霧乾燥法、より好ましくは凍結乾燥法がある。凍結乾燥法によって固形状にした凍結乾燥品は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦのようなタンパク成分を含む製剤の場合、熱等のストレスがかからず、安定なタンパク製剤を製造することができる。
組成物溶液のｐＨを約６以上に調節すれば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦは安定に保たれ、かつ液媒体の乾燥操作中及び固形状製剤の再溶解時の液状も透明に保たれうる。従って、本発明目的のためには、特にｐＨの上限はないが、好ましくは最終的なｐＨ調節は溶液状態でｐＨ６．１〜９である。本発明組成物を注射剤として用いる場合には、該組成物を生理的なｐＨ領域付近に調整することが好ましく、この場合には最終的なｐＨ領域をｐＨ６．１〜８、さらに好ましくはｐＨ６．５〜７．５にすればよい。前記下限のｐＨよりも酸性側では、再溶解時の液状を透明に保つことが困難である恐れがあり、上限のｐＨよりも塩基性側では、組成物の安定性および溶液の透明性は満足されても、皮膚や血管等への刺激性が増す可能性があり、必ずしも好ましいものではない。
本発明において、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定性が増大した理由は必ずしも明らかではないが、１）ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの分解、２）ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦ同士の凝集、３）ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの容器への吸着等を抑制したためと考えられる。特に、製剤中の薬物濃度が低い場合、容器壁への薬物吸着の影響が大きいが、本発明処方であれば、乾燥時における容器へのＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの吸着等を抑制することが可能である。また、組成物製造直後のＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの含量は経時保存後、例えば４０℃、３０日間程度保存してもほとんど低下しない。ＩＬ−２の容器への吸着をさらに抑制するためには、種々の方法が考えられるが、その一つの方法として内壁をシリコーンでコーティングされた容器にＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦを含む組成物を収容すればよい。
本発明ＩＬ−２組成物の製法は、特に限定されないが、好ましくは以下のような方法で製造する。糖および／または糖アルコールならびに安定化剤であるアミノ酸の必要量を蒸留水に溶解した溶液に、ＩＬ−２原液および要すれば更に界面活性剤の適当量を加える。次いで塩基の適当量（アミノ酸として、塩基性アミノ酸を添加した場合、塩基を添加しない場合がある）を添加してｐＨ約８〜１１、好ましくはｐＨ約９〜１１、さらに好ましくはｐＨ約９．５〜１０．５とし、緩衝液を加えた後、速やかに酸を加えてｐＨ約７〜７．５とする。残りの蒸留水を加えて液量を調節し、組成物の溶液を製造後、無菌濾過、容器へ分注、次いで凍結乾燥させる。また、別法として、糖および／または糖アルコールならびに安定化剤あるアミノ酸の必要量を蒸留水に溶解した溶液に、ＩＬ−２および要すれば更に界面活性剤の適当量を加える。次いで酸の適当量（アミノ酸として、酸性アミノ酸を添加した場合、酸を添加しない場合がある）を添加して、一旦ｐＨ約２〜６、好ましくはｐＨ約２〜４、さらに好ましくはｐＨ約２〜３とし、緩衝液を加えた後、速やかに塩基を加えてｐＨ約７〜７．５とし、以下上記と同様の方法で組成物を製造する。該製造法のうち、ＩＬ−２の安定性の面から、前者の製造方法が好ましい。凍結乾燥は、上記調製した組成物の溶液を約−６０℃〜約−１０℃、好ましくは約−５０℃〜約−４０℃で急速凍結した後、要すれば、昇華熱を供給しながら、好ましくは４８〜７２時間、０．００５〜１ｍｂに保って所定含水量になるまで水分を昇華、除去し、要すれば窒素など不活性気体または乾燥空気を充填して、密栓する。
上記製造法中、塩基または酸を添加して所要のｐＨとした後、「速やかに」酸または塩基を添加しｐＨを約７〜７．５とするが、この「速やかに」酸または塩基を添加しはじめ、ｐＨを約７〜７．５とするまでの時間は、組成物の製造量によっても異なるが、約６０分間、好ましくは約４５分間、より好ましくは約３０分間以内であればよい。
本発明ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦ組成物の製法は、特に限定されないが、好ましくは以下のような方法で製造する。糖および／または糖アルコールならびに安定化剤であるアミノ酸の必要量を蒸留水に溶解した溶液に、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの原液および要すれば更に界面活性剤の適当量を加える。ＩＦＮ−γについては、さらにＬ−システインを添加する。次いで要すれば塩基（アミノ酸として、塩基性アミノ酸を添加した場合、塩基を添加しない場合がある）および塩基を添加した場合、酸を添加して、緩衝液を加え、ｐＨ約７〜７．５とした後、残りの蒸留水を加えて液量を調節し、組成物の溶液を製造後、無菌濾過、容器へ分注、次いで凍結乾燥させる。また、別法として、糖および／または糖アルコールならびに安定化剤あるアミノ酸の必要量を蒸留水に溶解した溶液に、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦおよび要すれば更に界面活性剤の適当量を加える。次いで酸（アミノ酸として、酸性アミノ酸を添加した場合、酸を添加しない場合がある）および酸を添加した場合、塩基を添加して、緩衝液を加え、ｐＨ約７〜７．５とし、以下上記と同様の方法で組成物を製造する。該製造法のうち、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定性の面から、前者の製造方法が好ましい。凍結乾燥は、上記調製した組成物の溶液を約−６０℃〜約−１０℃、好ましくは約−５０℃〜約−４０℃で急速凍結した後、要すれば、昇華熱を供給しながら、好ましくは４８〜７２時間、０．００５〜１ｍｂに保って所定含水量になるまで水分を昇華、除去し、要すれば窒素など不活性気体または乾燥空気を充填して、密栓する。
本発明組成物は、温血動物由来の血清アルブミンおよびカルニチンを配合せず、かつ少なくともＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦのいずれか１種、糖および／または糖アルコール、アミノ酸、要すれば酸および塩基の成分を配合し、さらに要すれば界面活性剤や緩衝剤等を配合することによって、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦを長期間、例えば４０℃３０日間程度にわたっても安定に保存することが可能である。さらに、本発明製剤によって、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの容器壁面の吸着を抑制することが可能である。
本発明組成物の使用方法は特に限定されるものではないが、非経口的に用いることが好ましい。注射剤として用いる際には、凍結乾燥された該組成物を注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖液、適当な点滴用輸液等に用時溶解して静脈内、筋肉内、皮下または皮内に投与する。また、本組成物に適当な担体、賦形剤等を加えて口、鼻、耳腔内投与等の局所投与製剤としてもよい。投与量としては、例えばＩＬ−２として一日あたり、３５万〜１４０万ＪＲＵ（国内標準単位）である。
本発明では、ＩＬ−２の場合、天然由来または遺伝子組換えＩＬ−２の全てを用いることができるが、特に遺伝子組換えヒトＩＬ−２が好ましい。ＩＦＮ−α、β、γの場合、天然由来または遺伝子組換えヒトＩＦＮ−α、β、γの全てを用いることができるが、特に遺伝子組換えヒトＩＦＮ−α、β、γが好ましい。また、ＥＧＦの場合、天然由来または遺伝子組換えヒトＥＧＦの全てを用いることができるが、特に遺伝子組換えヒトＥＧＦが好ましい。
組成物中のＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの濃度が低くても、当該薬物の容器壁面への吸着が少ないことが大きな特徴であり、本発明の組成物を溶液として使用する場合、溶液１ｍＬ中にＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦは、０．１〜５００μｇ、好ましくは０．５〜３００μｇ、より好ましくは１〜２２０μｇ配合すればよい。また、本発明の組成物を固形剤として使用する場合、固形剤全量に対しＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦは、０．００１〜５ｗ／ｗ％、好ましくは０．００２５〜２．５ｗ／ｗ％、より好ましくは０．００３〜１ｗ／ｗ％配合すればよい。ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦ含量が前記配合量よりも少なければ、薬効が十分に発揮されない可能性がある。前記配合量よりも多ければ、溶液中にＩＬ−２等の薬物が完全に溶解しない恐れがある。
本発明において、糖および／または糖アルコールは、単糖類、二糖類、多糖類あるいは水溶性グルカン類を意味し、生理的に許容されるものであれば使用できる。糖および／または糖アルコールは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定化のために添加されるが、溶解補助剤、賦形剤あるいは等張化剤としても添加されうる。糖として、具体的にはグルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、フルクトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、カルボキシメチルセルロース−Ｎａ等が挙げられる。また、糖アルコールとしてはＣ４〜Ｃ８の糖アルコールが好ましく、具体的には、マンニトール、イノシトール、ズルシトール、キシリトール、アラビトール、ラフィノース、エリスリトール、マルチトール、ラクチトール、パラチニット、トレハロース等が挙げられる。前記糖および／または糖アルコールの中で、好ましくはマルトース、マンニトール、ラクトース、スクロースおよびソルビトールであり、さらに好ましくはマルトース、マンニトール、ラクトースおよびスクロースであり、特に好ましくはマルトース、スクロースである。
前記の糖および／または糖アルコールは、単独または混合物で用いることができる。配合量は特に限定されるものではなく、組成物の溶液に溶解可能でＩＬ−２の安定性を高める量であればよい。ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦに対する糖および／または糖アルコールの配合割合は重量比で１〜２００００倍、好ましくは５〜１７５００倍、より好ましくは２０〜１５０００倍であればよい。また、本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に糖および／または糖アルコールを５〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇ、より好ましくは２０〜２００ｍｇ添加すればよい。前記配合量よりも少なければ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦを安定化することができない恐れがあり、多ければ、組成物全量に対するＩＬ−２含量が相対的に低下し、多量のＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの組成物を投与しなければ、薬効が生じない可能性がある。
本発明において、アミノ酸は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定化のために添加されるが、賦形剤としても添加されうる。アミノ酸とは、分子内にアミノ基とカルボキシル基とをもつ化合物を意味するが、プロリンおよびヒドロキシプロリンのようなイミノ酸も含まれ、生理的に許容されるものであれば使用できる。アミノ酸としては、中性アミノ酸、酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸が挙げられる。具体的には中性アミノ酸として、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、ジヨードチロシン、スルナミン、トレオニン、セリン、プロリン、ヒドロキシプロリン、トリプトファン、チロキシン、メチオニン、シスチン、システイン、α−アミノ酪酸等が挙げられる。酸性アミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン等が挙げられる。塩基性アミノ酸としては、リジン、塩酸リジン、アルギニン、ヒドロキシリジン等が挙げられる。前記アミノ酸のうち、好ましくはアラニン、塩酸リジン、アルギニンであり、より好ましくはアルギニンである。
前記のアミノ酸は、単独または混合物で用いることができる。添加量は特に限定されるものではなく、組成物の溶液に溶解可能でＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定性を高める量であればよい。ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦに対するアミノ酸の配合割合は重量比で１〜１００００倍、好ましくは１０〜７５００倍、より好ましくは２０〜５０００倍であればよい。また、本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中にアミノ酸を０．１〜２５０ｍｇ、好ましくは０．５〜１２５ｍｇ、より好ましくは１〜１００ｍｇ添加すればよい。前記添加量よりも少なければ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦを安定化できない恐れがあり、多ければ、組成物全量に対するＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの含量が相対的に低下し、多量のＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦを含有する組成物を投与しなければ、薬効が生じない可能性がある。
本発明組成物は、前記したように、糖および／または糖アルコール、ならびにアミノ酸を配合しているために、固体状態でも液体状態でもメイラード反応を生じる場合がある。メイラード反応とは、アミノ酸、ペプチド、タンパク質のアミノ基とケトン、アルデヒド、特に還元糖が反応して褐色色素を生成するものである。しかし、本発明の組成物においては、特に糖および／または糖アルコールがマルトース、マンニトール、ラクトース、スクロース、好ましくはマルトース、スクロースであり、アミノ酸がアラニン、塩酸リジン、アルギニン、好ましくはアルギニンとの組合せの場合には、例えば４０℃で３０日間程度、該組成物を保存してもメイラード反応は生じる恐れが少なく、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの含量が低減する可能性も少ない。但し、アラニンおよびスクロースを配合した組成物、塩酸リジンおよびスクロースを配合した組成物は、凍結乾燥品が融解し、当該乾燥品は製造することができなかった。
上記、糖および／または糖アルコールとアミノ酸の含量の比率は、糖および／または糖アルコールに対し、重量比でアミノ酸が０．０１〜４倍、好ましくは０．０２５〜３倍、より好ましくは０．０５〜２倍である。なお、タンパク質製剤の場合、添加物が同じでも主薬であるタンパク質が異なれば、メイラード反応の有無も異なるので、メイラード反応を生じないようにするためには、タンパク質の種類によって製剤中の添加物の種類、量等を検討する必要がある。
本発明において、要すれば酸を配合してもよい。酸としては、生理的に許容される酸を全て用いることができる。例えば、酢酸、乳酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン等の有機酸や、塩酸、リン酸等の無機酸が挙げられ、単独でも、２種以上の混合物で用いてもよく、好ましくはクエン酸、酒石酸である。また、これらの薬理学的に許容される塩であってもよい。酸の添加量は用いる酸の種類によっても異なるが、所望のｐＨに調整できる必要量を添加すればよい。一般的には、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦに対する酸の配合割合は重量比で５〜１２０００倍、好ましくは１０〜６０００倍、より好ましくは２５〜３０００倍であればよい。本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に酸を０．２５〜５０ｍｇ、好ましくは０．５〜２０ｍｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ添加すればよい。また、前記量よりも少なければｐＨは塩基性となり、また多ければｐＨが酸性となり、いずれの状態でもＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦを安定化できない恐れがある。
なお、有機酸のうち、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンは、構成成分中の酸であると同時にアミノ酸でもありうる。
本発明において、要すれば塩基を配合してもよい。塩基としては、生理的に許容される塩基を全て用いることができる。例えば、Ｎ−メチルグルカミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミン等のアルコールアミン、モノ、ジまたはトリエチルアミン等のアルキルアミン、アルギニン、リジン、塩酸リジン等の塩基性アミノ酸、ならびに炭酸ナトリウム等の無機塩基等が用いられ、これらは単独でも、２種以上の混合物で用いてもよい。炭酸ナトリウム等の無機塩基を用いる際には、上記アミン等との併用が好ましい。好ましい塩基としては、Ｎ−メチルグルカミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、アルギニンであり、より好ましくは、ジエタノールアミン、アルギニンである。前記塩基は、単独でも、２種以上の混合物で用いてもよい。塩基の添加量は用いる塩基の種類によっても異なるが、所望のｐＨに調整できる必要量を添加すればよい。一般的には、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦに対する塩基の配合割合は重量比で２〜１００００倍、好ましくは５〜５０００倍、より好ましくは１０〜４５００倍であればよい。本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に酸を０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．２５〜１００ｍｇ、より好ましくは１〜５０ｍｇ添加すればよい。また、本発明組成物を固形剤として使用する場合、前記量よりも少なければ、溶液のｐＨが酸性となり、また多ければ、溶液のｐＨが塩基性となり、いずれの状態でもＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦを安定化できない恐れがある。
なお、塩基性アミノ酸であるアルギニン、リジン、塩酸リジン等は、構成成分の塩基であると同時にアミノ酸でもありうる。
本発明において、更に要すれば界面活性剤を添加することも可能である。界面活性剤としては、生理的に許容される界面活性剤であればよく、該界面活性剤の添加により、固形剤調製における乾燥前の組成物溶液調製時または固形剤を蒸留水に再溶解する時のＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの溶解性改善ならびに、組成物溶液の液媒体を乾燥した時におけるＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定性を向上（特に乾燥時におけるＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの容器壁面の吸着を防止して、組成物中のＩＬ−２含量の低下を抑制する）するなどの効果が得られる。界面活性剤として、組成物の溶液に溶解または懸濁でき、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定性を高めるものであればよいが、好ましくは非イオン性界面活性剤であり、具体的にはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等が挙げられる。ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油として具体的には、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油２０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０等がある。ポリエチレングリコールとして具体的には、マクロゴール２００、マクロゴール３００、マクロゴール４００、マクロゴール６００、マクロゴール１０００、マクロゴール１５００、マクロゴール１５４０、マクロゴール２０００、マクロゴール４０００、マクロゴール６０００、マクロゴール２００００等がある。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールとして具体的には、ポリオキシエチレン（１０５）ポリオキシプロピレン（５）グリコール、ポリオキシエチレン（１２０）ポリオキシプロピレン（４０）グリコール［プルロニックＦ８７］、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール［プルロニックＦ６８］、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール［プルロニックＰ１２３］、ポリオキシエチレン（５４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール［プルロニックＦ８５］、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール［プルロニックＦ１２７］、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（２０）グリコール［プルロニックＬ４４］等がある。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとして具体的には、ポリソルベート２０［Ｔｗｅｅｎ２０］、ポリソルベート４０［Ｔｗｅｅｎ４０］、ポリソルベート６０［Ｔｗｅｅｎ６０］、ポリソルベート６５［Ｔｗｅｅｎ６５］、ポリソルベート８０［Ｔｗｅｅｎ８０］等がある。より好ましくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、特に好ましくはポリソルベート８０［Ｔｗｅｅｎ８０］である。
界面活性剤の配合量は用いる界面活性剤の種類によっても異なるが、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦに対する界面活性剤の配合割合は重量比で１〜３００倍、好ましくは２．５〜２５０倍、より好ましくは５〜２００倍であればよい。本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ〜１５ｍｇ、好ましくは０．０７５ｍｇ〜７．５ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜４ｍｇを添加すればよい。また、本発明組成物を固形剤として使用する場合、前記添加量よりも少なければ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの溶解性が改善せず、またＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定性が低下する恐れがあり、逆に多ければ、調製の際、泡立ちにより組成物溶液の調製が困難となる可能性がある。
本発明では、固形剤調製における乾燥前の組成物溶液製造時または固形剤を蒸留水に再溶解する時のｐＨ変動を最小限にするために緩衝剤を用いることが好ましい。緩衝剤としては、生理的に許容される緩衝剤であればよく、例えば、リン酸系またはクエン酸系の緩衝剤が挙げられる。
緩衝剤の添加量は用いる緩衝剤の種類によっても異なるが、所望のｐＨ、すなわち、組成物の溶液のｐＨを６．１〜９に保持するのに必要な量を用いればよい。具体的には、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦに対する緩衝剤の配合割合は重量比で２０〜１００００倍、好ましくは５０〜８０００倍、より好ましくは１００〜６０００倍あればよい。本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に緩衝剤を１〜１００ｍｇ、好ましくは２．５〜７５ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇ添加すればよい。前記量よりも少なければ、組成物溶液製造時または固形剤を蒸留水に再溶解する時のｐＨ変動が大きくなる恐れがあり、多ければ、組成物全量に対するＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの含量が相対的に低下し、多量のＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの組成物を投与しなければ、薬効が生じない可能性がある。
本発明の製剤は、製剤の形態に応じ、製剤学上許容される添加物を含有しうる。例えば、注射剤の場合、フェノール、クレゾール等の保存剤、亜硫酸塩、ピロ亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸等の酸化防止剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール等の無痛化剤、塩化ナトリウム、グリセリン等の等張化剤を添加してもよい。
安定化剤として、温血動物由来の血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ブタ血清アルブミン等を配合した場合、前述した様に副作用を生じる可能性があるが、アルブミンであっても遺伝子組換えアルブミンであれば、上記副作用を生じる可能性が低く、組成物の添加剤として配合する場合もありうる。遺伝子組換えアルブミンの添加は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定性低下の防止に有用である。ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦに対する遺伝子組換えアルブミンの配合割合は、重量比で１〜４０００倍、好ましくは２．５〜２０００倍、より好ましくは５〜１０００倍であればよい。本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．２５ｍｇ〜５０ｍｇ、より好ましくは０．５ｍｇ〜２５ｍｇを添加すればよい。
本発明の組成物は、少なくともＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦのうちいずれか１種、糖および／または糖アルコール、アミノ酸、要すれば酸ならびに塩基、さらに要すれば界面活性剤、またｐＨの調節のために緩衝剤等の配合成分を含む。これら組成物の配合成分の好ましい組合せとして、ＩＬ−２の場合、１）ＩＬ−２、マルトース、アルギニン、クエン酸、ジエタノールアミン（場合によっては、ジエタノールアミンを配合しない場合もある）、要すればポリソルベート８０およびリン酸緩衝液、および２）ＩＬ−２、スクロース、アルギニン、クエン酸、ジエタノールアミン（場合によっては、ジエタノールアミンを配合しない場合もある）、要すればポリソルベート８０およびリン酸緩衝液の組合せの組成物である。これら好ましい組合せの配合成分の配合量について、ＩＬ−２は、固形剤全量に対し０．００１〜５ｗ／ｗ％、好ましくは０．００５〜２．５ｗ／ｗ％、より好ましくは０．０１〜１ｗ／ｗ％、ＩＬ−２に対するマルトースまたはスクロースの配合割合は重量比で１〜１００００倍、好ましくは５〜５０００倍、より好ましくは２０〜４０００倍、ＩＬ−２に対するアルギニンの配合割合は重量比で１〜５０００倍、好ましくは１０〜２５００倍、より好ましくは２０〜２０００倍、ＩＬ−２に対するクエン酸の配合割合は重量比で５〜２０００倍、好ましくは１０〜１０００倍、より好ましくは２５〜５００倍、ＩＬ−２に対するジエタノールアミンの配合割合は重量比で１０〜５０００倍、好ましくは２５〜２５００倍、より好ましくは５０〜２０００倍（場合によっては、ジエタノールアミンを配合しない場合もある）、ＩＬ−２に対するポリソルベート８０の配合割合は、重量比で１〜３００倍、好ましくは２．５〜２５０倍、より好ましくは５〜２００倍、リン酸緩衝液を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的にはＩＬ−２に対する緩衝剤の配合割合は、重量比で２０〜２０００倍、好ましくは５０〜１５００倍、より好ましくは１００〜１０００倍であればよい。本発明の組成物を溶液として使用する場合、ＩＬ−２は、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜５００μｇ、好ましくは０．５〜２５０μｇ、より好ましくは１〜１００μｇ、マルトースまたはスクロースは、組成物の溶液１ｍＬ中に５〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇ、より好ましくは２０〜２００ｍｇ、アルギニンは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜２５０ｍｇ、好ましくは０．５〜１２５ｍｇ、より好ましくは１〜１００ｍｇ、クエン酸は、組成物の溶液１ｍＬ中に０．２５〜５０ｍｇ、好ましくは、０．５〜２０ｍｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ、ジエタノールアミンは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．２５〜１００ｍｇ、より好ましくは１〜５０ｍｇ（場合によってはジエタノールアミンを配合しない場合もある）、ポリソルベート８０を添加するならば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ〜１５ｍｇ、好ましくは０．０７５ｍｇ〜７．５ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜４ｍｇ、リン酸緩衝液を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的には組成物の溶液１ｍＬ中に１〜１００ｍｇ、好ましくは２．５〜７５ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇ添加すればよい。本発明の組成物を固形剤として使用する場合、また、マルトースとアルギニン、およびスクロースとアルギニンとの含量の比率は、マルトースまたはスクロースに対し、重量比でアルギニンが０．０１〜４倍、好ましくは０．０５〜３倍、より好ましくは０．１〜２倍である。
ＩＦＮ−αの場合、組成物の配合成分の好ましい組合せとして、１）ＩＦＮ−α、マルトース、アルギニン、要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、さらに要すればポリソルベート８０、２）ＩＦＮ−α、スクロース、アルギニン、要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、さらに要すればポリソルベート８０の組合せの組成物である。これら好ましい組合せの配合成分の配合量について、ＩＦＮ−αは、固形剤全量に対し０．０００１〜５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０００５〜２．５ｗ／ｗ％、より好ましくは０．００１〜１ｗ／ｗ％、ＩＦＮ−αに対するマルトースまたはスクロースの配合割合は重量比で１〜２００００倍、好ましくは５〜１７５００倍、より好ましくは２０〜１３０００倍、ＩＦＮ−αに対するアルギニンの配合割合は重量比で１〜５０００倍、好ましくは１０〜４５００倍、より好ましくは２０〜４０００倍、要すればＩＦＮ−αに対する塩酸の配合割合は重量比で５〜６０００倍、好ましくは１０〜３０００倍、より好ましくは２５〜１５００倍、リン酸緩衝剤を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的にはＩＦＮ−αに対する緩衝液の配合割合は、重量比で２０〜１００００倍、好ましくは５０〜８０００倍、より好ましくは１００〜６０００倍である。さらにポリソルベート８０を要すれば、ＩＦＮ−αに対するポリソルベート８０の配合割合は、重量比で１〜３００倍、好ましくは２．５〜２５０倍、より好ましくは５〜２００倍であればよい。本発明の組成物を溶液として使用する場合、ＩＦＮ−αは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜５００μｇ、好ましくは０．５〜２５０μｇ、より好ましくは１〜１００μｇ、マルトースまたはスクロースは、組成物の溶液１ｍＬ中に５〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇ、より好ましくは２０〜２００ｍｇ、アルギニンは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜２５０ｍｇ、好ましくは０．５〜１２５ｍｇ、より好ましくは１〜１００ｍｇ、塩酸を添加するならば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．２５〜１００ｍｇ、好ましくは、０．５〜４０ｍｇ、より好ましくは１〜２０ｍｇ、リン酸緩衝液を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的には組成物の溶液１ｍＬ中に１〜１００ｍｇ、好ましくは２．５〜７５ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇ添加すればよい。さらにポリソルベート８０を要すれば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ〜１５ｍｇ、好ましくは０．０７５ｍｇ〜７．５ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜４ｍｇ添加すればよい。本発明の組成物を固形剤として使用する場合、また、マルトースとアルギニン、およびスクロースとアルギニンとの含量の比率は、マルトースまたはスクロースに対し、重量比でアルギニンが０．０１〜４倍、好ましくは０．０５〜３倍、より好ましくは０．１〜２倍である。
ＩＦＮ−βの場合、組成物の配合成分の好ましい組合せとして、１）ＩＦＮ−β、マルトース、アルギニン、要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、さらに要すればポリソルベート８０、２）ＩＦＮ−β、スクロース、アルギニン、要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、さらに要すればポリソルベート８０の組合せの組成物である。これら好ましい組合せの配合成分の配合量について、ＩＦＮ−βは、固形剤全量に対し０．０００１〜５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０００５〜２．５ｗ／ｗ％、より好ましくは０．００１〜１ｗ／ｗ％、ＩＦＮ−βに対するマルトースまたはスクロースの配合割合は重量比で１〜２００００倍、好ましくは５〜１７５００倍、より好ましくは２０〜１００００倍、ＩＦＮ−βに対するアルギニンの配合割合は重量比で１〜５０００倍、好ましくは１０〜４５００倍、より好ましくは２０〜４０００倍、要すればＩＦＮ−βに対する塩酸の配合割合は重量比で５〜６０００倍、好ましくは１０〜３０００倍、より好ましくは２５〜１５００倍、リン酸緩衝剤を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的にはＩＦＮ−βに対する緩衝液の配合割合は、重量比で２０〜１００００倍、好ましくは５０〜８０００倍、より好ましくは１００〜６０００倍であればよい。さらにポリソルベート８０を要すれば、ＩＦＮ−βに対するポリソルベート８０の配合割合は、重量比で１〜３００倍、好ましくは２．５〜２５０倍、より好ましくは５〜２００倍であればよい。本発明の組成物を溶液として使用する場合、ＩＦＮ−βは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜５００μｇ、好ましくは０．５〜２５０μｇ、より好ましくは１〜１００μｇ、マルトースまたはスクロースは、組成物の溶液１ｍＬ中に５〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇ、より好ましくは２０〜２００ｍｇ、アルギニンは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜２５０ｍｇ、好ましくは０．５〜１２５ｍｇ、より好ましくは１〜１００ｍｇ、塩酸を添加するならば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．２５〜１００ｍｇ、好ましくは、０．５〜４０ｍｇ、より好ましくは１〜２０ｍｇ、リン酸緩衝液を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的には組成物の溶液１ｍＬ中に１〜１００ｍｇ、好ましくは２．５〜７５ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇ添加すればよい。さらにポリソルベート８０を要すれば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ〜１５ｍｇ、好ましくは０．０７５ｍｇ〜７．５ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜４ｍｇ添加すればよい。本発明の組成物を固形剤として使用する場合、また、マルトースとアルギニン、およびスクロースとアルギニンとの含量の比率は、マルトースまたはスクロースに対し、重量比でアルギニンが０．０１〜４倍、好ましくは０．０５〜３倍、より好ましくは０．１〜２倍である。
ＩＦＮ−γの場合、組成物の配合成分の好ましい組合せとして、１）ＩＦＮ−γ、マルトース、アルギニン、Ｌ−システイン、要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、さらに要すればポリソルベート８０、２）ＩＦＮ−γ、スクロース、アルギニン、Ｌ−システイン、要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、さらに要すればポリソルベート８０の組合せの組成物である。これら好ましい組合せの配合成分の配合量について、ＩＦＮ−γは、固形剤全量に対し０．００１〜５ｗ／ｗ％、好ましくは０．００５〜２．５ｗ／ｗ％、より好ましくは０．０１〜１ｗ／ｗ％、ＩＦＮ−γに対するマルトースまたはスクロースの配合割合は重量比で１〜５０００倍、好ましくは５〜２５００倍、より好ましくは２０〜１０００倍、ＩＦＮ−γに対するアルギニンの配合割合は重量比で１〜２５００倍、好ましくは１０〜１０００倍、より好ましくは２０〜５００倍、ＩＦＮ−γに対するＬ−システインの配合割合は重量比で０．１〜５倍、好ましくは０．２〜４倍、より好ましくは０．３〜３倍、要すればＩＦＮ−γに対する塩酸の配合割合は重量比で５〜２０００倍、好ましくは１０〜１０００倍、より好ましくは２５〜５００倍、ＩＦＮ−γに対するポリソルベート８０の配合割合は、重量比で１〜３００倍、好ましくは２．５〜２５０倍、より好ましくは５〜２００倍、リン酸緩衝液を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的にはＩＦＮ−γに対する緩衝液の配合割合は、重量比で１０〜２０００倍、好ましくは２０〜１５００倍、より好ましくは４０〜１０００倍であればよい。さらにポリソルベート８０を要すれば、ＩＦＮ−γに対するポリソルベート８０の配合割合は、重量比で１〜３００倍、好ましくは２．５〜２５０倍、より好ましくは５〜２００倍であればよい。本発明の組成物を溶液として使用する場合、ＩＦＮ−γは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜１０００μｇ、好ましくは０．５〜７５０μｇ、より好ましくは１〜５００μｇ、マルトースまたはスクロースは、組成物の溶液１ｍＬ中に５〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇ、より好ましくは２０〜２００ｍｇ、アルギニンは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜２５０ｍｇ、好ましくは０．５〜１２５ｍｇ、より好ましくは１〜１００ｍｇ、Ｌ−システインは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０１〜５ｍｇ、好ましくは０．０５〜３ｍｇ、より好ましくは０．１〜２．５ｍｇ、塩酸を添加するならば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．２５〜１００ｍｇ、好ましくは、０．５〜４０ｍｇ、より好ましくは１〜２０ｍｇ、ポリソルベート８０を添加するならば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ〜１５ｍｇ、好ましくは０．０７５ｍｇ〜７．５ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜４ｍｇ、リン酸緩衝液を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的には組成物の溶液１ｍＬ中に１〜１００ｍｇ、好ましくは２．５〜７５ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇ添加すればよい。さらにポリソルベート８０を要すれば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ〜１５ｍｇ、好ましくは０．０７５ｍｇ〜７．５ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜４ｍｇ添加すればよい。本発明の組成物を固形剤として使用する場合、また、マルトースとアルギニン、およびスクロースとアルギニンとの含量の比率は、マルトースまたはスクロースに対し、重量比でアルギニンが０．０１〜４倍、好ましくは０．０５〜３倍、より好ましくは０．１〜２倍である。
ＥＧＦの場合、組成物の配合成分の好ましい組合せとして、１）ＥＧＦ、マルトース、アルギニン、要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、さらに要すればポリソルベート８０、２）ＥＧＦ、スクロース、アルギニン、要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、さらに要すればポリソルベート８０の組合せの組成物である。これら好ましい組合せの配合成分の配合量について、ＥＧＦは、固形剤全量に対し０．００１〜５ｗ／ｗ％、好ましくは０．００５〜２．５ｗ／ｗ％、より好ましくは０．００７５〜１ｗ／ｗ％、ＥＧＦに対するマルトースまたはスクロースの配合割合は重量比で１０〜５０００倍、好ましくは５０〜４５００倍、より好ましくは１００〜４０００倍、ＥＧＦに対するアルギニンの配合割合は重量比で１〜２５００倍、好ましくは１０〜２０００倍、より好ましくは２０〜１７５０倍、要すればＥＧＦに対する塩酸の配合割合は重量比で５〜２０００倍、好ましくは１０〜１０００倍、より好ましくは２５〜５００倍、リン酸緩衝液を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的にはＥＧＦに対する緩衝液の配合割合は、重量比で１０〜３０００倍、好ましくは２０〜２５００倍、より好ましくは４０〜２０００倍であればよい。さらにポリソルベート８０を要すれば、ＥＧＦに対するポリソルベート８０の配合割合は、重量比で１〜３００倍、好ましくは２．５〜２５０倍、より好ましくは５〜２００倍であればよい。本発明の組成物を溶液として使用する場合、ＥＧＦは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜１０００μｇ、好ましくは０．５〜５００μｇ、より好ましくは１〜１００μｇ、マルトースまたはスクロースは、組成物の溶液１ｍＬ中に５〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇ、より好ましくは２０〜２００ｍｇ、アルギニンは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜２５０ｍｇ、好ましくは０．５〜１２５ｍｇ、より好ましくは１〜１００ｍｇ、塩酸を添加するならば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．２５〜１００ｍｇ、好ましくは、０．５〜４０ｍｇ、より好ましくは１〜２０ｍｇ、リン酸緩衝液を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的には組成物の溶液１ｍＬ中に１〜１００ｍｇ、好ましくは２．５〜７５ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇ添加すればよい。さらにポリソルベート８０を添加するならば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ〜１５ｍｇ、好ましくは０．０７５ｍｇ〜７．５ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜４ｍｇ添加すればよい。本発明の組成物を固形剤として使用する場合、また、マルトースとアルギニン、およびスクロースとアルギニンとの含量の比率は、マルトースまたはスクロースに対し、重量比でアルギニンが０．０１〜４倍、好ましくは０．０５〜３倍、より好ましくは０．１〜２倍である。
本発明溶液から固形剤を製造する際の溶液の乾燥法としては、組成物溶液の液媒体を乾燥しさえすればよいが、好ましくは凍結乾燥法、流動層乾燥法、噴霧乾燥法、より好ましくは凍結乾燥法がある。凍結乾燥法によって固形状にした凍結乾燥品は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦのようなタンパク成分を含む製剤の場合、熱等のストレスがかからず、安定なタンパク製剤を製造することができる。
組成物溶液のｐＨを約６以上に調節すれば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦは安定に保たれ、かつ液媒体の乾燥操作中及び固形状製剤の再溶解時の液状も透明に保たれうる。従って、本発明目的のためには、特にｐＨの上限はないが、好ましくは最終的なｐＨ調節は溶液状態でｐＨ６．１〜９である。本発明組成物を注射剤として用いる場合には、該組成物を生理的なｐＨ領域付近に調整することが好ましく、この場合には最終的なｐＨ領域をｐＨ６．１〜８、さらに好ましくはｐＨ６．５〜７．５にすればよい。前記下限のｐＨよりも酸性側では、再溶解時の液状を透明に保つことが困難である恐れがあり、上限のｐＨよりも塩基性側では、組成物の安定性および溶液の透明性は満足されても、皮膚や血管等への刺激性が増す可能性があり、必ずしも好ましいものではない。
本発明において、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定性が増大した理由は必ずしも明らかではないが、１）ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの分解、２）ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦ同士の凝集、３）ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの容器への吸着等を抑制したためと考えられる。特に、製剤中の薬物濃度が低い場合、容器壁への薬物吸着の影響が大きいが、本発明処方であれば、乾燥時における容器へのＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの吸着等を抑制することが可能である。また、組成物製造直後のＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの含量は経時保存後、例えば４０℃、３０日間程度保存してもほとんど低下しない。ＩＬ−２の容器への吸着をさらに抑制するためには、種々の方法が考えられるが、その一つの方法として内壁をシリコーンでコーティングされた容器にＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦを含む組成物を収容すればよい。
本発明ＩＬ−２組成物の製法は、特に限定されないが、好ましくは以下のような方法で製造する。糖および／または糖アルコールならびに安定化剤であるアミノ酸の必要量を蒸留水に溶解した溶液に、ＩＬ−２原液および要すれば更に界面活性剤の適当量を加える。次いで塩基の適当量（アミノ酸として、塩基性アミノ酸を添加した場合、塩基を添加しない場合がある）を添加してｐＨ約８〜１１、好ましくはｐＨ約９〜１１、さらに好ましくはｐＨ約９．５〜１０．５とし、緩衝液を加えた後、速やかに酸を加えてｐＨ約７〜７．５とする。残りの蒸留水を加えて液量を調節し、組成物の溶液を製造後、無菌濾過、容器へ分注、次いで凍結乾燥させる。また、別法として、糖および／または糖アルコールならびに安定化剤あるアミノ酸の必要量を蒸留水に溶解した溶液に、ＩＬ−２および要すれば更に界面活性剤の適当量を加える。次いで酸の適当量（アミノ酸として、酸性アミノ酸を添加した場合、酸を添加しない場合がある）を添加して、一旦ｐＨ約２〜６、好ましくはｐＨ約２〜４、さらに好ましくはｐＨ約２〜３とし、緩衝液を加えた後、速やかに塩基を加えてｐＨ約７〜７．５とし、以下上記と同様の方法で組成物を製造する。該製造法のうち、ＩＬ−２の安定性の面から、前者の製造方法が好ましい。凍結乾燥は、上記調製した組成物の溶液を約−６０℃〜約−１０℃、好ましくは約−５０℃〜約−４０℃で急速凍結した後、要すれば、昇華熱を供給しながら、好ましくは４８〜７２時間、０．００５〜１ｍｂに保って所定含水量になるまで水分を昇華、除去し、要すれば窒素など不活性気体または乾燥空気を充填して、密栓する。
上記製造法中、塩基または酸を添加して所要のｐＨとした後、「速やかに」酸または塩基を添加しｐＨを約７〜７．５とするが、この「速やかに」酸または塩基を添加しはじめ、ｐＨを約７〜７．５とするまでの時間は、組成物の製造量によっても異なるが、約６０分間、好ましくは約４５分間、より好ましくは約３０分間以内であればよい。
本発明ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦ組成物の製法は、特に限定されないが、好ましくは以下のような方法で製造する。糖および／または糖アルコールならびに安定化剤であるアミノ酸の必要量を蒸留水に溶解した溶液に、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの原液および要すれば更に界面活性剤の適当量を加える。ＩＦＮ−γについては、さらにＬ−システインを添加する。次いで要すれば塩基（アミノ酸として、塩基性アミノ酸を添加した場合、塩基を添加しない場合がある）および塩基を添加した場合、酸を添加して、緩衝液を加え、ｐＨ約７〜７．５とした後、残りの蒸留水を加えて液量を調節し、組成物の溶液を製造後、無菌濾過、容器へ分注、次いで凍結乾燥させる。また、別法として、糖および／または糖アルコールならびに安定化剤あるアミノ酸の必要量を蒸留水に溶解した溶液に、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦおよび要すれば更に界面活性剤の適当量を加える。次いで酸（アミノ酸として、酸性アミノ酸を添加した場合、酸を添加しない場合がある）および酸を添加した場合、塩基を添加して、緩衝液を加え、ｐＨ約７〜７．５とし、以下上記と同様の方法で組成物を製造する。該製造法のうち、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの安定性の面から、前者の製造方法が好ましい。凍結乾燥は、上記調製した組成物の溶液を約−６０℃〜約−１０℃、好ましくは約−５０℃〜約−４０℃で急速凍結した後、要すれば、昇華熱を供給しながら、好ましくは４８〜７２時間、０．００５〜１ｍｂに保って所定含水量になるまで水分を昇華、除去し、要すれば窒素など不活性気体または乾燥空気を充填して、密栓する。
本発明組成物は、温血動物由来の血清アルブミンおよびカルニチンを配合せず、かつ少なくともＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦのいずれか１種、糖および／または糖アルコール、アミノ酸、要すれば酸および塩基の成分を配合し、さらに要すれば界面活性剤や緩衝剤等を配合することによって、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦを長期間、例えば４０℃３０日間程度にわたっても安定に保存することが可能である。さらに、本発明製剤によって、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの容器壁面の吸着を抑制することが可能である。
本発明組成物の使用方法は特に限定されるものではないが、非経口的に用いることが好ましい。注射剤として用いる際には、凍結乾燥された該組成物を注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖液、適当な点滴用輸液等に用時溶解して静脈内、筋肉内、皮下または皮内に投与する。また、本組成物に適当な担体、賦形剤等を加えて口、鼻、耳腔内投与等の局所投与製剤としてもよい。投与量としては、例えばＩＬ−２として一日あたり、３５万〜１４０万ＪＲＵ（国内標準単位）である。
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、これは単に例示であって、本発明を制限するものではない。
なお、本発明において用いるＩＬ−２の力価は、ＩＬ−２に依存的に増殖するＮＫ細胞（マウス細胞由来）の増殖を定量化の指標とし、ＩＬ−２の単位を算出する方法を用いて、測定した。ＩＬ−２活性を有する物質の量に比例して、ＮＫ細胞の一種であるＮＫ−７細胞は増殖する。ＮＫ−７細胞にＭＴＴ〔臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム〕を与えると、ＭＴＴはＮＫ−７細胞に取り込まれ、ミトコンドリア内膜に存在する呼吸鎖に関連する２つの電子伝達体、チトクロームｂおよびチトクロームｃにより還元され、細胞の増殖能に比例した量の色素ホルマザンが生成する。このホルマザンの生成量と試料の希釈倍数の関係から、ＩＬ−２の力価を定量する。生成したホルマザンはイソプロパノールによりＮＫ−７細胞から溶出され、紫色に呈色した液を吸光度測定（波長５６０ｎｍ）することにより、ＩＬ−２の力価を測定した。また、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦについては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて測定をおこなった。
（実施例１）凍結乾燥を可能とするアミノ酸および糖の検討（ＩＬ−２を含まず）
以下に示す製造方法に準じて、表１に示す成分の組成物を製造し、組成物の外観を観察した。なお、本組成物には、主薬であるＩＬ−２を配合していない。
（実施例１製剤の製造方法）
糖または糖アルコールとしては、マルトース、マンニトール、ラクトース、スクロースを用いた。アミノ酸としては、アラニン、塩酸リジン、アルギニンを用いた。界面活性剤としてはポリソルベート８０、塩基としてはジエタノールアミン、酸としてはクエン酸、緩衝液としてはリン酸緩衝液を用いた。
１２０ｍｇ／ｍＬの糖または糖アルコール水溶液５ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０水溶液０．５ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬのアミノ酸水溶液２ｍＬを混合溶解した。該溶液に１００ｍｇ／ｍｌのジエタノールアミン水溶液約０．３ｍＬを加え、ｐＨ約９とした。なお、アルギニン添加処方では、ジエタノールアミンを添加しない。次いでリン酸緩衝液１４．６ｍｇおよびクエン酸約１．４８ｍｇを添加して、該溶液のｐＨを約７に調整し、注射用水で全量１０ｍＬとなるように調整した。その後、上記製造した組成物の溶液１ｍＬおよび上記製造した組成物の溶液１ｍＬと注射用蒸留水１ｍＬを混合した溶液２ｍＬをそれぞれ３ｍＬ容のガラスバイアルに分注し、凍結乾燥を行った。凍結乾燥は表２の条件で行った。
（試験方法）
凍結乾燥直後の凍結乾燥品および４０℃１０日間保存後の凍結乾燥品の外観を目視で観察した。以下の表３、４で外観上問題を認めないとは白色で均質な凍結乾燥品であり、融解などを認めないものであることを示し、また、ケーキとは、凍結乾燥品のマトリックスであり、このケーキが形成されていれば、凍結乾燥品としては安定である。
（試験結果）
凍結乾燥直後の凍結乾燥品および４０℃１０日間保存後の凍結乾燥品の外観を表３および４に示す。その結果、４０℃１０日間保存後において、糖または糖アルコールがマルトースの場合、アミノ酸がアラニン、塩酸リジン、アルギニンの組合せ、糖または糖アルコールがマンニトールの場合、アミノ酸がアラニン、塩酸リジン、アルギニンの組合せ、糖または糖アルコールがラクトースの場合、アミノ酸がアラニン、塩酸リジン、アルギニンの組合せ、糖または糖アルコールがスクロースの場合、アミノ酸がアルギニンの組合せの組成物における外観が特に良好であった。一方、グリシンを配合した製剤、ソルビトールを配合したほとんどの組成物、アラニンとスクロースを配合した組成物および塩酸リジンとスクロースを配合した組成物は、４０℃１０日間保存において、凍結乾燥品のケーキは形成しなかった。
（実施例２）凍結乾燥を可能とするアミノ酸および糖の検討（ＩＬ−２を含む）
実施例１において、凍結乾燥品の外観が良好であったアミノ酸と糖または糖アルコールの組合せの製剤を以下に示す製造方法に準じて、各組成物を製造し、製造直後、経時保存後のＩＬ−２含量および凍結乾燥品の外観を観察した。なお、本製剤には、主薬であるＩＬ−２を配合している。
（実施例２製剤の製造方法）
表５に本組成物の配合成分を示す。糖または糖アルコールとしては、マルトース、マンニトール、ラクトース、スクロースを用いた。アミノ酸としては、アラニン、塩酸リジン、アルギニンを用いた。界面活性剤としてはポリソルベート８０、塩基としてはジエタノールアミン、酸としてはクエン酸、緩衝液としてはリン酸緩衝液を用いた。
０．０４ｍｇ（７０万ＪＲＵ）のＩＬ−２を含んだ主薬原液０．６ｍＬに１２０ｍｇ／ｍＬの糖または糖アルコール水溶液５ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０水溶液０．５ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬのアミノ酸水溶液２ｍＬを混合溶解した。該溶液に１００ｍｇ／ｍＬのジエタノールアミン水溶液約０．３ｍＬ（アミノ酸としてアルギニンを添加する場合は、ジエタノールアミンを添加しない）を加え、ｐＨ約９とする。次いでリン酸緩衝液１４．６ｍｇおよびクエン酸を約１．４８ｍｇ添加して、該溶液のｐＨを約７に調整し、注射用水を用いて溶液全量を１０ｍＬに調整した。その後、上記製造した組成物の溶液１ｍＬおよび上記製造した組成物の溶液１ｍＬと注射用蒸留水１ｍＬを混合した溶液２ｍＬを３ｍＬ容ガラスバイアルに分注し、凍結乾燥した。凍結乾燥は実施例１の条件と同様である。
（試験方法）
凍結乾燥直後の凍結乾燥品および４０℃１４日間保存後における凍結乾燥品のＩＬ−２含量を測定するとともに、凍結乾燥晶の外観（４０℃１４日間保存後の凍結乾燥品のみ）を目視で観察した。ＩＬ−２凍結乾燥品中のＩＬ−２含量はＨＰＬＣ法にて測定した。凍結乾燥品を１ｍＬの注射用水で再溶解しＨＰＬＣ法の測定検体とした。カラムはＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−３００（１５０×４．６ｍｍ、カラム中樹脂の平均粒子径５μｍ、ナカライテスク社製）を、ＩＬ−２の検出には波長２２０ｎｍのＵＶを使用した。移動相はＡ）０．１％トリフルオロ酢酸含有水／アセトニトリル（９５／５）、Ｂ）０．０７％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリルであり、表６のような割合でＡ、Ｂ移動相溶液を流した（グラジエント法）。浸透圧は、日本薬局方第１４改正一般試験法「浸透圧測定法」に準じ測定した。
含量％＝（凍結乾燥直後または４０℃１４日保存後のＩＬ−２の濃度［ＪＲＵ］／調製直後のＩＬ−２の濃度［ＪＲＵ］）×１００
（試験結果）
表５処方の凍結乾燥直後の凍結乾燥品および４０℃１４日間保存後における凍結乾燥品のＩＬ−２含量、凍結乾燥品の外観（凍結乾燥品で４０℃１４日間保存後のみ）ならびに凍結乾燥品を水で溶解した場合（溶解した蒸留水の容量 １ｍＬ）の浸透圧、溶液状態のｐＨを表７に示す。
その結果、糖または糖アルコールがマルトース、スクロースであり、アミノ酸がアルギニンの組合せであれば、凍結乾燥直後および４０℃で１４日間保存後のＩＬ−２の含量はほぼ同じであり、ＩＬ−２は安定化していることが明らかとなった。また、上記組合せの組成物であれば、凍結乾燥品の着色等がないので、メイラード反応が生じていないことが推測された。さらに、上記組合せの場合、浸透圧はほぼ１で、またｐＨも約７付近と生理的ｐＨ付近に調整されており、注射剤として適用しても、肉体等に痛みは生じる恐れはないものと考えられる。なお、処方１〜８のいずれの凍結乾燥品も蒸留水等で再溶解した場合、液状は無色澄明であった。
（実施例３）ＩＬ−２組成物のバイオアッセイ
組成物中のＩＬ−２含量をバイオアッセイによって測定した。
（試験方法）
実施例２に示す凍結乾燥品のうち、経時保存後においてもＩＬ−２含量の低下が少なかった凍結乾燥品、すなわち糖または糖アルコールとしてマルトース、マンニトール、ラクトース、スクロース、アミノ酸としてアルギニンを含有した凍結乾燥品（実施例２の処方５〜８）中のＩＬ−２をバイオアッセイにて測定した。凍結乾燥品の配合成分のうち、ＩＬ−２を０．０２ｍｇ（３５万ＪＲＵ）とした以外は、実施例２の処方成分および製造法で製造した。供試した凍結乾燥品としては、凍結乾燥直後の凍結乾燥品および４０℃で３０日間保存後の凍結乾燥品を用いた。
バイオアッセイは、以下の方法で行った。本方法は、ＩＬ−２に依存的に増殖するＮＫ−７細胞（マウス由来）を用い、その増殖能から力価を測定する。ＩＬ−２活性を有する物質の量に比例して、ＮＫ−７細胞は増殖する。ＮＫ−７細胞にＭＴＴ〔臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム〕を与えると、ＭＴＴはＮＫ−７細胞に取り込まれ、ミトコンドリア内膜に存在する呼吸鎖に関連する２つの電子伝達体、チトクロームｂおよびチトクロームｃにより還元され、細胞の増殖能に比例した量の色素ホルマザンが生成する。このホルマザンの生成量と試料の希釈倍数との関係から、ＩＬ−２の力価を定量する。生成したホルマザンはイソプロパノールによりＮＫ−７細胞から溶出され、紫色に呈色した液を吸光度測定（波長５６０ｎｍ）することにより、定量した。
（試験結果）
４０℃、３０日間保存後の凍結乾燥品の外観およびバイオアッセイの結果を凍結乾燥直後のＩＬ−２活性と４０℃３０日間経時保存後のＩＬ−２活性の比として表８に示す。その結果、いずれの処方でもＩＬ−２の活性の比はほぼ１であり、経時保存してもＩＬ−２活性はほとんど変化しないことが明らかとなった。
（実施例４）組成物の収容容器を変更した場合のＩＬ−２の含量測定
組成物を収容した容器をガラスバイアルから容器の内壁面がシリコーンでコーティングされたバイアルに変更し、ＩＬ−２の含量を測定した。
（試験方法）
実施例２に示す凍結乾燥品のうち、経時保存後においてもＩＬ−２の含量の低下が少なかった凍結乾燥品、すなわち糖または糖アルコールとしてマルトース、マンニトール、ラクトース、スクロース、アミノ酸としてアルギニンを含有した凍結乾燥品（実施例２の処方５〜８）中のＩＬ−２含量を測定した。凍結乾燥品の配合成分のうち、ＩＬ−２を０．０２ｍｇ（３５万ＪＲＵ）とした以外は、実施例２の配合成分および製造法で製造した。該配合成分を含む溶液１ｍＬを３ｍＬ容のシリコーンコーティングされたバイアルおよび３ｍＬ容のガラスバイアルにそれぞれ分注し、凍結乾燥を行った。１回凍結乾燥後、２回凍結乾燥後（１回目の凍結乾燥後に注射用蒸留水１ｍＬで再溶解して凍結乾燥したものである）における凍結乾燥品中のＩＬ−２含量を測定した。含量測定法は、実施例２に示す通りである。
（試験結果）
ＩＬ−２の含量を１ｍＬあたりのＪＲＵ単位で表９に示した。その結果、いずれの凍結乾燥品においても、ガラスバイアルにくらべ、シリコーンコーティングされたバイアルに収容した凍結乾燥品のＩＬ−２含量はわずかに高く、シリコーンコーティングされた容器に組成物を収容することによって、ＩＬ−２の含量低下をわずかに抑制することが明らかとなった。
（実施例５）ＩＬ−２の容器壁面吸着性試験
ガラス製バイアルの壁面に、組成物中のＩＬ−２がどれほど吸着するのかを調べるために、凍結乾燥する前の調製液を用いて、ＩＬ−２の残存率を調べた。なお、対照例として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を配合した組成物を用いた。
（実施例５製剤の製造方法）
表１０に本組成物の配合成分を示す。糖または糖アルコールとしてはマルトースを、アミノ酸としてはアルギニンを、酸としては塩酸を、緩衝液としてはリン酸緩衝液を用いた。なお、安定化剤の影響をみるために、あえて界面活性剤は配合しなかった。
０．０４ｍｇ（７０万ＪＲＵ）のＩＬ−２を含んだ主薬原液０．６ｍＬに１２０ｍｇ／ｍＬの糖または糖アルコール水溶液５ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬのアルギニン水溶液２ｍＬを混合溶解し、ｐＨ約９とする。次いでリン酸緩衝液１４．６ｍｇおよびクエン酸を約１．４８ｍｇ添加して、該溶液のｐＨを約７に調整し、注射用水を用いて溶液全量を２０ｍＬに調整した。
（試験方法）
３ｍＬ容ガラスバイアルに表１０の組成物の調製液２ｍＬを移し替えた後、水溶液中のＩＬ−２濃度を測定した。最初のＩＬ−２組成物溶液の含量に対するバイアルを移し替えた後のＩＬ−２残存率を調べた。ＩＬ−２の測定条件は、実施例２と同様である。
ＩＬ−２の残存率は以下の式で算出した。
残存率％＝（液を移し替えた後のＩＬ−２の濃度［ＪＲＵ］／液調製直後のＩＬ−２の濃度［ＪＲＵ］）×１００
（試験結果）
処方９および比較処方１のＩＬ−２の残存率（％）を表１１に示す。ＩＬ−２の残存率は、ＨＳＡを配合した比較処方１にくらべ、マルトースとアルギニンを配合した処方９において、ほとんど変わらなかった。したがって、アミノ酸および糖を添加することによって、容器壁面への吸着を抑制することが可能であった。
（実施例６）ＩＬ−２以外のタンパク成分を用いた容器壁面吸着性試験
薬物として、ＩＬ−２以外のタンパク成分を用いた場合、容器にどれほど薬物が吸着するのかを調べるために、ガラスバイアルに凍結乾燥する前の調製液を加え、薬物の残存率を調べた。
（実施例６製剤の製造方法）
表１０に本組成物の配合成分を示す。糖または糖アルコールとしては、マルトースを、アミノ酸としては、アルギニンを、酸としてはクエン酸、緩衝液としてはリン酸緩衝液を用いた。なお、薬物としては、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γを用いた。なお、安定化剤の影響をみるために、あえて界面活性剤は配合しなかった。以下、ＩＦＮ−αの組成物の製法を示す。
０．０１３ｍｇのＩＦＮ−αを溶解したリン酸緩衝液０．４ｍＬに１３１．５ｍｇ／ｍＬの糖または糖アルコール水溶液０．４ｍＬ、そして水０．２ｍＬまたは２５ｍｇ／ｍＬ ＨＳＡ水溶液０．２ｍＬまたは適当量の塩酸を加えてｐＨを約７．０に調整した１００ｍｇ／ｍＬのアルギニン水溶液０．２ｍＬを添加して、試験用の溶液を調製した。
（試験方法）
上記で調製した溶液をガラスバイアルに５回連続で移し替えた後、水溶液中の薬物含量を測定した。最初の薬物の含量に対するバイアルを移し替えた後の薬物残存率を調べた。
なお、ＩＦＮ−αおよびγの含量測定は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、以下の条件で測定した。
・カラム：コスモジル５Ｃ１８−３００ ４．６φ×１５０ｍｍ
・移動相流量：１．０ｍＬ／分
・検出波長：ＩＦＮ−α：２４０ｎｍ、ＩＦＮ−β：２２０ｎｍ
・移動相：Ａ）０．１％ＴＦＡ−水／アセトニトリル（９５／５）
Ｂ）０．０７％ＴＦＡ−アセトニトリル
移動相のグラジエントプログラムは、表１３に示す。
なお、ＩＦＮ−γとＨＳＡを組み合わせた製剤は、ＨＰＬＣでＩＦＮ−γを測定することはできなかった。
各薬物の残存率は、以下の式で算出した。
残存率％＝（液を５回移し替えた後の各タンパク成分濃度／液調製直後の各タンパク濃度）×１００
（試験結果）
各タンパク成分の残存率を表１４に示す。ＩＦＮ−αの残存率は、ＨＳＡおよびアルギニンを添加した場合においてもほぼ同じであった。また、ＩＦＮ−γについて、アルギニンを添加した場合において、残存率は８０％以上であった。したがって、ＩＦＮ−α、γのようなタンパク成分においても、アルギニンおよび糖の組合せにおいて、容器への吸着を抑制することができた。
（実施例７）ＩＬ−２以外のタンパク成分を含有した凍結乾燥品の安定性試験
（試験方法）
表１５に示すＩＦＮ−α、β、γおよびＥＧＦを含む組成物溶液を凍結乾燥し、凍結乾燥直後の凍結乾燥品および４０℃１４日間保存後における凍結乾燥品のＩＦＮ−α、β、γおよびＥＧＦの含量を測定した。凍結乾燥品を１ｍＬの注射用水で再溶解し測定検体とした。
なお、それぞれの薬物含量は、実施例６と同様にＨＰＬＣで測定したが、ＩＦＮ−αの場合のみ、測定波長を２４０ｎｍとした。また、実施例６と同様、ＩＦＮ−γとＨＳＡを組み合わせた製剤は、ＨＰＬＣでＩＦＮ−γを測定することはできなかった。
各タンパク成分の含量％は以下の式で算出した。
含量％＝（４０℃１４日保存後の各タンパク成分濃度／製剤調製直後の各タンパク成分濃度）×１００
（試験結果）
各タンパク成分の含量を表１５に示す。ＩＦＮ−αおよびβの含量は、ＨＳＡよりもアルギニンを添加すると増大した。また、ＩＦＮ−γの含量は、アルギニンを添加した場合、ほぼ１００％であった。さらに、ＥＧＦの含量は、ＨＳＡおよびアルギニンを添加した場合でもほぼ同じであった。
したがって、ＩＬ−２以外のタンパク成分でも、糖およびアルギニンの組合せによって、安定化できることが明らかとなった。
産業上の利用性
本発明は、上記のごとく調製して得られたＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦ含有溶液、得られた溶液を凍結乾燥して得た凍結乾燥製剤、ならびに該凍結乾燥製剤に注射用蒸留水等の適当な復元剤を添加して所要の濃度とした溶液製剤等、種々の形態のＩＬ−２組成物を提供する。これらの本発明組成物は、温血動物由来の血清アルブミンや甲状腺阻害剤であるカルニチンを含有しなくても製造工程および保存中におけるＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの実質的な損失は少ない。さらに、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの凍結乾燥製剤においては、再溶解時の液状が透明であり、容器壁への吸着が少ない等の優れた特徴を有する。しかも、本発明組成物は生理的ｐＨ付近に調整され得るので、注射時疼痛、注射部位の炎症等の好ましくない局所作用も回避し得る。
なお、本発明において用いるＩＬ−２の力価は、ＩＬ−２に依存的に増殖するＮＫ細胞（マウス細胞由来）の増殖を定量化の指標とし、ＩＬ−２の単位を算出する方法を用いて、測定した。ＩＬ−２活性を有する物質の量に比例して、ＮＫ細胞の一種であるＮＫ−７細胞は増殖する。ＮＫ−７細胞にＭＴＴ〔臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム〕を与えると、ＭＴＴはＮＫ−７細胞に取り込まれ、ミトコンドリア内膜に存在する呼吸鎖に関連する２つの電子伝達体、チトクロームｂおよびチトクロームｃにより還元され、細胞の増殖能に比例した量の色素ホルマザンが生成する。このホルマザンの生成量と試料の希釈倍数の関係から、ＩＬ−２の力価を定量する。生成したホルマザンはイソプロパノールによりＮＫ−７細胞から溶出され、紫色に呈色した液を吸光度測定（波長５６０ｎｍ）することにより、ＩＬ−２の力価を測定した。また、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦについては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて測定をおこなった。
（実施例１）凍結乾燥を可能とするアミノ酸および糖の検討（ＩＬ−２を含まず）
以下に示す製造方法に準じて、表１に示す成分の組成物を製造し、組成物の外観を観察した。なお、本組成物には、主薬であるＩＬ−２を配合していない。
（実施例１製剤の製造方法）
糖または糖アルコールとしては、マルトース、マンニトール、ラクトース、スクロースを用いた。アミノ酸としては、アラニン、塩酸リジン、アルギニンを用いた。界面活性剤としてはポリソルベート８０、塩基としてはジエタノールアミン、酸としてはクエン酸、緩衝液としてはリン酸緩衝液を用いた。
１２０ｍｇ／ｍＬの糖または糖アルコール水溶液５ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０水溶液０．５ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬのアミノ酸水溶液２ｍＬを混合溶解した。該溶液に１００ｍｇ／ｍｌのジエタノールアミン水溶液約０．３ｍＬを加え、ｐＨ約９とした。なお、アルギニン添加処方では、ジエタノールアミンを添加しない。次いでリン酸緩衝液１４．６ｍｇおよびクエン酸約１．４８ｍｇを添加して、該溶液のｐＨを約７に調整し、注射用水で全量１０ｍＬとなるように調整した。その後、上記製造した組成物の溶液１ｍＬおよび上記製造した組成物の溶液１ｍＬと注射用蒸留水１ｍＬを混合した溶液２ｍＬをそれぞれ３ｍＬ容のガラスバイアルに分注し、凍結乾燥を行った。凍結乾燥は表２の条件で行った。
凍結乾燥直後の凍結乾燥品および４０℃１０日間保存後の凍結乾燥品の外観を目視で観察した。以下の表３、４で外観上問題を認めないとは白色で均質な凍結乾燥品であり、融解などを認めないものであることを示し、また、ケーキとは、凍結乾燥品のマトリックスであり、このケーキが形成されていれば、凍結乾燥品としては安定である。
（試験結果）
凍結乾燥直後の凍結乾燥品および４０℃１０日間保存後の凍結乾燥品の外観を表３および４に示す。その結果、４０℃１０日間保存後において、糖または糖アルコールがマルトースの場合、アミノ酸がアラニン、塩酸リジン、アルギニンの組合せ、糖または糖アルコールがマンニトールの場合、アミノ酸がアラニン、塩酸リジン、アルギニンの組合せ、糖または糖アルコールがラクトースの場合、アミノ酸がアラニン、塩酸リジン、アルギニンの組合せ、糖または糖アルコールがスクロースの場合、アミノ酸がアルギニンの組合せの組成物における外観が特に良好であった。一方、グリシンを配合した製剤、ソルビトールを配合したほとんどの組成物、アラニンとスクロースを配合した組成物および塩酸リジンとスクロースを配合した組成物は、４０℃１０日間保存において、凍結乾燥品のケーキは形成しなかった。
実施例１において、凍結乾燥品の外観が良好であったアミノ酸と糖または糖アルコールの組合せの製剤を以下に示す製造方法に準じて、各組成物を製造し、製造直後、経時保存後のＩＬ−２含量および凍結乾燥品の外観を観察した。なお、本製剤には、主薬であるＩＬ−２を配合している。
（実施例２製剤の製造方法）
表５に本組成物の配合成分を示す。糖または糖アルコールとしては、マルトース、マンニトール、ラクトース、スクロースを用いた。アミノ酸としては、アラニン、塩酸リジン、アルギニンを用いた。界面活性剤としてはポリソルベート８０、塩基としてはジエタノールアミン、酸としてはクエン酸、緩衝液としてはリン酸緩衝液を用いた。
０．０４ｍｇ（７０万ＪＲＵ）のＩＬ−２を含んだ主薬原液０．６ｍＬに１２０ｍｇ／ｍＬの糖または糖アルコール水溶液５ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０水溶液０．５ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬのアミノ酸水溶液２ｍＬを混合溶解した。該溶液に１００ｍｇ／ｍＬのジエタノールアミン水溶液約０．３ｍＬ（アミノ酸としてアルギニンを添加する場合は、ジエタノールアミンを添加しない）を加え、ｐＨ約９とする。次いでリン酸緩衝液１４．６ｍｇおよびクエン酸を約１．４８ｍｇ添加して、該溶液のｐＨを約７に調整し、注射用水を用いて溶液全量を１０ｍＬに調整した。その後、上記製造した組成物の溶液１ｍＬおよび上記製造した組成物の溶液１ｍＬと注射用蒸留水１ｍＬを混合した溶液２ｍＬを３ｍＬ容ガラスバイアルに分注し、凍結乾燥した。凍結乾燥は実施例１の条件と同様である。
凍結乾燥直後の凍結乾燥品および４０℃１４日間保存後における凍結乾燥品のＩＬ−２含量を測定するとともに、凍結乾燥晶の外観（４０℃１４日間保存後の凍結乾燥品のみ）を目視で観察した。ＩＬ−２凍結乾燥品中のＩＬ−２含量はＨＰＬＣ法にて測定した。凍結乾燥品を１ｍＬの注射用水で再溶解しＨＰＬＣ法の測定検体とした。カラムはＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−３００（１５０×４．６ｍｍ、カラム中樹脂の平均粒子径５μｍ、ナカライテスク社製）を、ＩＬ−２の検出には波長２２０ｎｍのＵＶを使用した。移動相はＡ）０．１％トリフルオロ酢酸含有水／アセトニトリル（９５／５）、Ｂ）０．０７％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリルであり、表６のような割合でＡ、Ｂ移動相溶液を流した（グラジエント法）。浸透圧は、日本薬局方第１４改正一般試験法「浸透圧測定法」に準じ測定した。
（試験結果）
表５処方の凍結乾燥直後の凍結乾燥品および４０℃１４日間保存後における凍結乾燥品のＩＬ−２含量、凍結乾燥品の外観（凍結乾燥品で４０℃１４日間保存後のみ）ならびに凍結乾燥品を水で溶解した場合（溶解した蒸留水の容量 １ｍＬ）の浸透圧、溶液状態のｐＨを表７に示す。
その結果、糖または糖アルコールがマルトース、スクロースであり、アミノ酸がアルギニンの組合せであれば、凍結乾燥直後および４０℃で１４日間保存後のＩＬ−２の含量はほぼ同じであり、ＩＬ−２は安定化していることが明らかとなった。また、上記組合せの組成物であれば、凍結乾燥品の着色等がないので、メイラード反応が生じていないことが推測された。さらに、上記組合せの場合、浸透圧はほぼ１で、またｐＨも約７付近と生理的ｐＨ付近に調整されており、注射剤として適用しても、肉体等に痛みは生じる恐れはないものと考えられる。なお、処方１〜８のいずれの凍結乾燥品も蒸留水等で再溶解した場合、液状は無色澄明であった。
組成物中のＩＬ−２含量をバイオアッセイによって測定した。
（試験方法）
実施例２に示す凍結乾燥品のうち、経時保存後においてもＩＬ−２含量の低下が少なかった凍結乾燥品、すなわち糖または糖アルコールとしてマルトース、マンニトール、ラクトース、スクロース、アミノ酸としてアルギニンを含有した凍結乾燥品（実施例２の処方５〜８）中のＩＬ−２をバイオアッセイにて測定した。凍結乾燥品の配合成分のうち、ＩＬ−２を０．０２ｍｇ（３５万ＪＲＵ）とした以外は、実施例２の処方成分および製造法で製造した。供試した凍結乾燥品としては、凍結乾燥直後の凍結乾燥品および４０℃で３０日間保存後の凍結乾燥品を用いた。
バイオアッセイは、以下の方法で行った。本方法は、ＩＬ−２に依存的に増殖するＮＫ−７細胞（マウス由来）を用い、その増殖能から力価を測定する。ＩＬ−２活性を有する物質の量に比例して、ＮＫ−７細胞は増殖する。ＮＫ−７細胞にＭＴＴ〔臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム〕を与えると、ＭＴＴはＮＫ−７細胞に取り込まれ、ミトコンドリア内膜に存在する呼吸鎖に関連する２つの電子伝達体、チトクロームｂおよびチトクロームｃにより還元され、細胞の増殖能に比例した量の色素ホルマザンが生成する。このホルマザンの生成量と試料の希釈倍数との関係から、ＩＬ−２の力価を定量する。生成したホルマザンはイソプロパノールによりＮＫ−７細胞から溶出され、紫色に呈色した液を吸光度測定（波長５６０ｎｍ）することにより、定量した。
（試験結果）
４０℃、３０日間保存後の凍結乾燥品の外観およびバイオアッセイの結果を凍結乾燥直後のＩＬ−２活性と４０℃３０日間経時保存後のＩＬ−２活性の比として表８に示す。その結果、いずれの処方でもＩＬ−２の活性の比はほぼ１であり、経時保存してもＩＬ−２活性はほとんど変化しないことが明らかとなった。
組成物を収容した容器をガラスバイアルから容器の内壁面がシリコーンでコーティングされたバイアルに変更し、ＩＬ−２の含量を測定した。
（試験方法）
実施例２に示す凍結乾燥品のうち、経時保存後においてもＩＬ−２の含量の低下が少なかった凍結乾燥品、すなわち糖または糖アルコールとしてマルトース、マンニトール、ラクトース、スクロース、アミノ酸としてアルギニンを含有した凍結乾燥品（実施例２の処方５〜８）中のＩＬ−２含量を測定した。凍結乾燥品の配合成分のうち、ＩＬ−２を０．０２ｍｇ（３５万ＪＲＵ）とした以外は、実施例２の配合成分および製造法で製造した。該配合成分を含む溶液１ｍＬを３ｍＬ容のシリコーンコーティングされたバイアルおよび３ｍＬ容のガラスバイアルにそれぞれ分注し、凍結乾燥を行った。１回凍結乾燥後、２回凍結乾燥後（１回目の凍結乾燥後に注射用蒸留水１ｍＬで再溶解して凍結乾燥したものである）における凍結乾燥品中のＩＬ−２含量を測定した。含量測定法は、実施例２に示す通りである。
（試験結果）
ＩＬ−２の含量を１ｍＬあたりのＪＲＵ単位で表９に示した。その結果、いずれの凍結乾燥品においても、ガラスバイアルにくらべ、シリコーンコーティングされたバイアルに収容した凍結乾燥品のＩＬ−２含量はわずかに高く、シリコーンコーティングされた容器に組成物を収容することによって、ＩＬ−２の含量低下をわずかに抑制することが明らかとなった。
ガラス製バイアルの壁面に、組成物中のＩＬ−２がどれほど吸着するのかを調べるために、凍結乾燥する前の調製液を用いて、ＩＬ−２の残存率を調べた。なお、対照例として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を配合した組成物を用いた。
（実施例５製剤の製造方法）
表１０に本組成物の配合成分を示す。糖または糖アルコールとしてはマルトースを、アミノ酸としてはアルギニンを、酸としては塩酸を、緩衝液としてはリン酸緩衝液を用いた。なお、安定化剤の影響をみるために、あえて界面活性剤は配合しなかった。
０．０４ｍｇ（７０万ＪＲＵ）のＩＬ−２を含んだ主薬原液０．６ｍＬに１２０ｍｇ／ｍＬの糖または糖アルコール水溶液５ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬのアルギニン水溶液２ｍＬを混合溶解し、ｐＨ約９とする。次いでリン酸緩衝液１４．６ｍｇおよびクエン酸を約１．４８ｍｇ添加して、該溶液のｐＨを約７に調整し、注射用水を用いて溶液全量を２０ｍＬに調整した。
３ｍＬ容ガラスバイアルに表１０の組成物の調製液２ｍＬを移し替えた後、水溶液中のＩＬ−２濃度を測定した。最初のＩＬ−２組成物溶液の含量に対するバイアルを移し替えた後のＩＬ−２残存率を調べた。ＩＬ−２の測定条件は、実施例２と同様である。
ＩＬ−２の残存率は以下の式で算出した。
残存率％＝（液を移し替えた後のＩＬ−２の濃度［ＪＲＵ］／液調製直後のＩＬ−２の濃度［ＪＲＵ］）×１００
（試験結果）
処方９および比較処方１のＩＬ−２の残存率（％）を表１１に示す。ＩＬ−２の残存率は、ＨＳＡを配合した比較処方１にくらべ、マルトースとアルギニンを配合した処方９において、ほとんど変わらなかった。したがって、アミノ酸および糖を添加することによって、容器壁面への吸着を抑制することが可能であった。
薬物として、ＩＬ−２以外のタンパク成分を用いた場合、容器にどれほど薬物が吸着するのかを調べるために、ガラスバイアルに凍結乾燥する前の調製液を加え、薬物の残存率を調べた。
（実施例６製剤の製造方法）
表１０に本組成物の配合成分を示す。糖または糖アルコールとしては、マルトースを、アミノ酸としては、アルギニンを、酸としてはクエン酸、緩衝液としてはリン酸緩衝液を用いた。なお、薬物としては、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γを用いた。なお、安定化剤の影響をみるために、あえて界面活性剤は配合しなかった。以下、ＩＦＮ−αの組成物の製法を示す。
０．０１３ｍｇのＩＦＮ−αを溶解したリン酸緩衝液０．４ｍＬに１３１．５ｍｇ／ｍＬの糖または糖アルコール水溶液０．４ｍＬ、そして水０．２ｍＬまたは２５ｍｇ／ｍＬ ＨＳＡ水溶液０．２ｍＬまたは適当量の塩酸を加えてｐＨを約７．０に調整した１００ｍｇ／ｍＬのアルギニン水溶液０．２ｍＬを添加して、試験用の溶液を調製した。
（試験方法）
上記で調製した溶液をガラスバイアルに５回連続で移し替えた後、水溶液中の薬物含量を測定した。最初の薬物の含量に対するバイアルを移し替えた後の薬物残存率を調べた。
・カラム：コスモジル５Ｃ１８−３００ ４．６φ×１５０ｍｍ
・移動相流量：１．０ｍＬ／分
・検出波長：ＩＦＮ−α：２４０ｎｍ、ＩＦＮ−β：２２０ｎｍ
・移動相：Ａ）０．１％ＴＦＡ−水／アセトニトリル（９５／５）
Ｂ）０．０７％ＴＦＡ−アセトニトリル
移動相のグラジエントプログラムは、表１３に示す。
各薬物の残存率は、以下の式で算出した。
残存率％＝（液を５回移し替えた後の各タンパク成分濃度／液調製直後の各タンパク濃度）×１００
（試験結果）
各タンパク成分の残存率を表１４に示す。ＩＦＮ−αの残存率は、ＨＳＡおよびアルギニンを添加した場合においてもほぼ同じであった。また、ＩＦＮ−γについて、アルギニンを添加した場合において、残存率は８０％以上であった。したがって、ＩＦＮ−α、γのようなタンパク成分においても、アルギニンおよび糖の組合せにおいて、容器への吸着を抑制することができた。
（試験方法）
表１５に示すＩＦＮ−α、β、γおよびＥＧＦを含む組成物溶液を凍結乾燥し、凍結乾燥直後の凍結乾燥品および４０℃１４日間保存後における凍結乾燥品のＩＦＮ−α、β、γおよびＥＧＦの含量を測定した。凍結乾燥品を１ｍＬの注射用水で再溶解し測定検体とした。
なお、それぞれの薬物含量は、実施例６と同様にＨＰＬＣで測定したが、ＩＦＮ−αの場合のみ、測定波長を２４０ｎｍとした。また、実施例６と同様、ＩＦＮ−γとＨＳＡを組み合わせた製剤は、ＨＰＬＣでＩＦＮ−γを測定することはできなかった。
各タンパク成分の含量％は以下の式で算出した。
含量％＝（４０℃１４日保存後の各タンパク成分濃度／製剤調製直後の各タンパク成分濃度）×１００
各タンパク成分の含量を表１５に示す。ＩＦＮ−αおよびβの含量は、ＨＳＡよりもアルギニンを添加すると増大した。また、ＩＦＮ−γの含量は、アルギニンを添加した場合、ほぼ１００％であった。さらに、ＥＧＦの含量は、ＨＳＡおよびアルギニンを添加した場合でもほぼ同じであった。
したがって、ＩＬ−２以外のタンパク成分でも、糖およびアルギニンの組合せによって、安定化できることが明らかとなった。
本発明は、上記のごとく調製して得られたＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦ含有溶液、得られた溶液を凍結乾燥して得た凍結乾燥製剤、ならびに該凍結乾燥製剤に注射用蒸留水等の適当な復元剤を添加して所要の濃度とした溶液製剤等、種々の形態のＩＬ−２組成物を提供する。これらの本発明組成物は、温血動物由来の血清アルブミンや甲状腺阻害剤であるカルニチンを含有しなくても製造工程および保存中におけるＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの実質的な損失は少ない。さらに、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γ、ＥＧＦの凍結乾燥製剤においては、再溶解時の液状が透明であり、容器壁への吸着が少ない等の優れた特徴を有する。しかも、本発明組成物は生理的ｐＨ付近に調整され得るので、注射時疼痛、注射部位の炎症等の好ましくない局所作用も回避し得る。
Claims (3)
- 温血動物由来の血清アルブミンおよびカルニチンを配合せず、かつ少なくとも以下の成分
１）インターロイキン２、
２）マルトースまたはスクロース、ならびに
３）アルギニン
を含むことを特徴とする、タンパク組成物。 - 温血動物由来の血清アルブミンおよびカルニチンを配合せず、かつ少なくとも以下の成分
１）インターロイキン２、
２）スクロース、ならびに
３）アルギニン
を含むことを特徴とする、タンパク組成物。 - 更に界面活性剤を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
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