BRPI0017437B1 - composição farmacêutica estabilizada contendo polipeptídeo il-2, método para aumentar estabilidade de interleucina-2 em uma composição farmacêutica, e uma forma seca da composição - Google Patents

Description

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA ESTABILIZADA CONTENDO POLIPEPTÍDEO IL-2, MÉTODO PARA AUMENTAR ESTABILIDADE DE INTERLEUCINA-2 EM UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E UMA FORMA SECA DA COMPOSIÇÃO "Dividido do PI 0014486-0, depositado em 03/10/2000" Campo da Invenção A presente invenção está relacionada de forma geral a composições farmacêuticas, mais particularmente, a composições farmacêuticas compreendendo polipeptideos que são tipicamente instáveis em formulações farmacêuticas líquidas.

Fundamento da Invenção Avanços recentes no desenvolvimento de tecnologia de engenharia genética têm fornecido uma ampla variedade de polipeptideos biologicamente ativos em quantidades suficientemente grandes para uso como drogas. Os polipeptideos, no entanto, podem perder atividade biológica como um resultado de instabilidades físicas, incluindo desnaturação e formação de agregados solúveis e insolúveis, e uma variedade de instabilidades químicas, tais como hidrólise, oxidação e desamidação. A estabilidade de polipeptideos em formulações farmacêuticas líquidas pode ser afetada, por exemplo, por fatores tais como pH, força iônica, temperatura, ciclos repetidos de congelamento-descongelamento, e exposição a forças de deformação mecânicas tal como ocorre durante o processamento. A formação de agregados e perda da atividade biológica pode também ocorrer como um resultado de agitação física e interações de moléculas de polipeptídio em solução e nas interfaces líquido-ar dentro de frascos de estocagem. Além disso, podem ocorrer mudanças de conformação em polipeptideos adsorvidos a interfaces ar-líquido e sólido-líquido durante compressão-extensão das interfaces resultante de agitação durante transporte ou semelhante. Tal agitação pode levar a proteína embaraçar, agregar, formar partículas, e finalmente precipitar com outras proteínas adsorvidas. Para uma revisão geral de estabilidade de fármacos protéicos, veja, por exemplo, Manning e cols. (1989) Pharm. Res. 6:903-918, e Wang e Hanson (1988) J. Parenteral Sei. Tech. 42:S14. A instabilidade de formulações farmacêuticas líquidas contendo polipeptídio estimulou o acondicíonamento dessas formulações na forma liofilizada junto com um meio líquido adequado para a reconstituição. Embora a liofilização melhore a estabilidade de estocagem da composição, vários polipeptídeos exibem atividade diminuída, tanto durante estocagem no estado seco (Pikal (1990) Biopharm. 27:26-30) ou como um resultado de formação de agregado ou perda de atividade catalítica sob reconstituição como uma formulação líquida (veja, por exemplo, Carpenter e cols., (1991) Develop. Biol. Standard 74:225-239; Broadhead e cols. (1992) Drug Devei. Ind. Pharm. 18:1169-1206; Mumenthaler e cols. (1994) Phajrm. Res. 11:12-20; Carpenter e Crowe (1988) Cryohiology 25:459-470; e Roser (1991) Biopharm. 4:47-53). Enquanto o uso de aditivos melhorou a estabilidade de proteínas secas, várias formulações reidratadas continuam a ter quantidades inaceitáveis ou indesejáveis de proteína inativa agregada (veja, por exemplo, Townsend e DeLuca (1983) J. Pharm. Sei. 80:63-66; Hora e cols. (1992) Pharm. Res. 9:33-36; Yoshiaka e cols. (1993) Pharm. Res. 10:687-691). Também, a necessidade por reconstituição é uma inconveniência e introduz a possibilidade de dosagem incorreta.

Enquanto uma variedade de composições farmacêuticas líquidas têm sido formulada para estabilizar a atividade biológica dos polipeptídeos contidos nessas, a degradação dos polipeptídeos em formulações líquidas continua a criar problemas para os profissionais médicos. Consequentemente, há uma necessidade por composições farmacêuticas adicionais que compreendem estabilizantes fisiologicamente compatíveis que promovem estabilidade de componentes de polipeptídio, dessa forma mantendo sua eficácia terapêutica.

Sumário da Invenção São fornecidas composições que compreendem um polipeptídeo como um componente terapeuticamente ativo e métodos úteis na sua preparação. As composições são composições farmacêuticas líquidas estabilizadas que incluem um polipeptídeo cuja eficácia como um componente terapeuticamente ativo é normalmente comprometida durante a estocagem em formulações líquidas como um resultado de agregação do polipeptídeo. As composições farmacêuticas líquidas estabilizadas da invenção compreendem, em adição a um polipeptídeo que exibe formação de agregado durante estocagem em uma formulação líquida, uma quantidade de base de aminoácido suficiente para diminuir a formação de agregado do polipeptídeo durante estocagem, onde a base de aminoácido ê um aminoácido ou uma combinação de aminoácidos, onde qualquer aminoácido dado está presente tanto na sua forma de base livre como na sua forma de sal. As composições também compreendem um agente de tamponamento para manter o pH da composição líquida dentro de uma faixa aceitável para estabilidade do polipeptídeo, onde o agente de tamponamento é um ácido substancialmente livre de sua forma de sal, um ácido em sua forma de sal, ou uma mistura de um ácido e sua forma de sal. A base de aminoácido serve para estabilizar o polipeptideo contra a formação de agregado durante estocagem da composição farmacêutica liquida, enquanto o uso de um ácido substancialmente livre de sua forma de sal, um ácido em sua forma de sal, ou uma mistura de um ácido e sua forma de sal como o agente de tamponamento resulta em uma composição líquida tendo uma osmolaridade que é próxima da isotônica. A composição farmacêutica liquida pode adicionalmente incorporar outros agentes estabilizantes, mais particularmente metionina, um tensoativo não iônico tal como polissorbato 80, e EDTA, para também aumentar a estabilidade do polipeptideo. Tais composições farmacêuticas líquidas são consideradas como estabilizadas, já que a adição de base de aminoácido em combinação com um ácido substancialmente livre de sua forma de sal, um ácido em sal forma de sal, ou uma mistura de um ácido e sua forma de sal, resulta nas composições tendo estabilidade de estocagem aumentada em relação a composições farmacêuticas líquidas formuladas na ausência da combinação desses dois componentes. Métodos para aumentar a estabilidade de um polipeptideo em uma composição farmacêutica líquida e para aumentar a estabilidade de estocagem de tal composição farmacêutica são também fornecidos. Os métodos compreendem a incorporação na composição farmacêutica líquida de uma quantidade de uma base de aminoácido suficiente para diminuir a formação de agregado do polipeptideo durante estocagem da composição, e um agente de tamponamento, onde o agente de tamponamento é um ácido substancialmente livre de sua forma de sal, um ácido em sua forma de sal, ou uma mistura de um ácido e sua forma de sal. Os métodos encontram uso na preparação das. composições farmacêuticas liquidas da invenção.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra a percentagem remanescente de IL-2 solúvel em amostras estabilizadas estocadas a 40°C, como analisado por RP-HPLC. As formulações continham 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio em pH =6, e 270 mM de sorbitol ou sacarose ou manitol. A Figura 2 mostra a percentagem remanescente de IL-2 solúvel em amostras estabilizadas estocadas a 50°C, como analisado por RP-HPLC. As formulações continham 0,1 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio em pH =6, e 150 mM de vários aminoácidos como indicado na figura. A Figura 3 mostra a percentagem remanescente de IL-2 solúvel em amostras estabilizadas estocadas a 40°C, como analisado por RP-HPLC. As formulações continham 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio em pH = 6, e 50, 100 ou 270 mM de sorbitol. A Figura 4 mostra a percentagem remanescente de IL-2 solúvel em amostras estabilizadas estocadas a 50°C, como analisado por RP-HPLC. As formulações continham 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio em pH =6, e 150 mM de arginina. A Figura 5 mostra a meia-vida (ti/2, em dias) de IL-2 solúvel remanescente analisado por RP-HPLC como uma função de pH a 50 °C. As formulações continham 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de tampão (glicina, acetato de sódio, citrato de sódio, succinato de sódio, fosfato de sódio, borato de sódio) , e 150 mM de NaCl, 270 mM de sorbitol ou 150 mM de arginina. A Figura 6 mostra o gráfico Ln-Ln de meia vida (ti/2) versus a concentração inicial de proteína para amostras de estabilidade estocadas a 50°C. As formulações continham 0,1, 0,2, ou 0,5 mg/ml de IL-2 em 10 mM de succinato de sódio em pH = 6 e 150 mM de L-arginina. A Figura 7 mostra a percentagem remanescente de IL-2 solúvel, como analisado por RP-HPLC, em amostras tratadas com 1, 3, e 5 ciclos de congelamento-descongelamento de -70 °C à temperatura ambiente. As formulações continham 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio em pH = 6, 150 mM de arginina, e 0 a 0,1% de polissorbato 80. A Figura 8 mostra a percentagem remanescente de IL-2 solúvel, como analisado por RP-HPLC, em amostras tratadas com remessas de Emryville, Califórnia, para St. Louis, Missouri, e de St. Louis de volta a Emeryville em gelo. Duas formulações contendo várias quantidades de polissorbato 80 foram usadas: uma formulação de arginina, contendo 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio em pH = 6, 150 mM de arginina; e uma formulação de NaCl, contendo 0,2 mg/ml de IL-2 em 10 mM de citrato de sódio em pH = 6,5 e 200 mM de NaCl. A Figura 9 mostra a meia-vida (ti/2, em dias) de TFPI solúvel remanescente em quatro formulações analisado por IEX-HPLC como uma função da concentração de arginina a 50°C. Todas as formulações continham 0,15 mg/ml de TFPI e tanto base de L-arginina como L-arginina HCl, tamponados a pH = 5,5 com ácido cítrico ou com 10 mM de ácido cítrico e citrato de sódio. As formulações específicas de TFPI continham: (a) 20-150 mM de L-arginina HC1, 10 mM de ácido cítrico e citrato de sódio como tampão; (b) 20-150 mM de base de L-arginina, titulados com ácido cítrico; (c) 100-3 00 mM de L-arginina HCl, 10 mM de ácido cítrico e citrato de sódio como tampão; (d) 100-300 mM de base de L-arginina, titulados com ácido cítrico. A Figura 10 mostra a meia-vida (ti/2, em dias) de TFPI solúvel remanescente em quatro formulações analisado por IEX-HPLC como uma função da concentração de arginina a 50°C. Todas as formulações continham 0,15 mg/ml de TFPI e tanto base de L-arginina como L-arginina HCl, tamponados a pH = 5,5 com ácido succínico ou com 10 mM de ácido succínico e succinato de sódio. As formulações específicas de TFPI continham: (a) 20-150 mM de L-arginina HCl, 10 mM de ácido succínico e succinato de sódio como tampão; (b) 20-150 mM de base de L-arginina, titulados com ácido succínico; (c) 100-300 mM de L-arginina HCl, 10 mM de ácido succínico e succinato de sódio como tampão; (d) 100-300 mM de base de L-arginina, titulados com ácido succínico. A Figura 11 mostra a meia-vida (ti/2, em dias) de TFPI solúvel remanescente em quatro formulações analisado por IEX-HPLC como uma função da concentração de arginina a 50°C. Todas as formulações continham 0,15 mg/ml de TFPI e base de L-arginina, titulada a pH =5,5 com ácido succínico ou com ácido cítrico. As formulações específicas de TFPI continham: (a) 20-150 mM de base de L-arginina titulados com ácido cítrico; (b) 20-150 mM de base de L-arginina, titulados com ácido succínico; (c) 100-300 mM de base de L-arginina titulados com ácido cítrico; (d) 100-300 mM de base de L-arginina, titulados com ácido succínico.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção está direcionada a composições farmacêuticas líquidas que compreendem um polipeptídeo como um componente terapeuticamente ativo e a métodos úteis na sua preparação. Para os objetivos da presente invenção, o termo "líquida" com relação a composições ou formulações farmacêuticas pretendem incluir o termo "aquoso". O termo "polipeptídeo" como usado nessa engloba polipeptídeos e proteínas de ocorrência natural (nativos), sintéticos, e recombinantes, e variantes biologicamente ativas desses, como qualificado em outra parte nessa invenção. Por "componente terapeuticamente ativo" entende-se que o polipeptídeo é especificamente incorporado na composição para ocasionar uma resposta terapêutica desejada em relação ao tratamento, prevenção, ou diagnóstico de uma doença ou condição em um indivíduo quando a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo.

Mais particularmente, as composições da invenção são composições farmacêuticas líquidas estabilizadas cujos componentes terapeuticamente ativos incluem um polipeptídeo que normalmente exibe formação de agregado durante estocagem em formulações farmacêuticas líquidas. Por "formação de agregado" entende-se uma interação física entre as moléculas de polipeptídeo que resulta na formação de oligômeros, que podem permanecer solúveis, ou agregados grandes visíveis que se precipitam da solução. Por "durante a estocagem" entende-se uma composição ou formulação farmacêutica líquida que, uma vez preparada, não é imediatamente administrada a um indivíduo. Ao invés disso, seguindo-se à preparação, ela é empacotada para estocagem, tanto na forma líquida, em um estado congelado, como na forma seca para reconstituição posterior em uma forma líquida ou outra forma adequada para administração a um indivíduo. Por "forma seca" entende-se que a composição ou formulação farmacêutica líquida é seca por secagem a frio (quer dizer, liofilização; veja, por exemplo, Williams e Polli (1984) J. Parenteral Sei. Technol. 38:48-59), por secagem a spray (veja, Masters (1991) em Spray-Drying Handbook (5a edição; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead e cols. (1992) Drug Devei. Ind. Pharm. 18:1169-1206; e Mumenthaler e cols. (1994) Pharm. Res. 11:12-20), ou por secagem a ar (Carpenter e Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; e Roser (1991) Biopharm. 4:47-53). A formação de agregado por um polipeptídeo durante estocagem de uma composição farmacêutica líquida pode afetar a atividade biológica, de forma adversa, daquele polipeptídeo, resultando na perda de eficácia terapêutica da composição farmacêutica. Além disso, a formação de agregado pode causar outros problemas tais como entupimentos de tubos, membranas, ou bombas quando a composição farmacêutica contendo o polipeptídeo é administrada usando-se um sistema de infusão.

As composições farmacêuticas líquidas estabilizadas da invenção também compreendem uma quantidade de uma base de aminoácido suficiente para diminuir a formação de agregado pelo polipeptídeo durante estocagem da composição. Por "base de aminoácido" entende-se um aminoácido ou uma combinação de aminoácidos, onde qualquer aminoácido dado está presente ou na suas formas de bases livres ou na sua forma de sal. Onde uma combinação de aminoácidos é usada, todos os aminoácidos podem estar presentes em suas formas de base livre, todos podem estar presentes em suas formas de sal, ou alguns podem estar presentes em suas formas de base livre enquanto outros estão presentes em suas formas de sal . Aminoácidos de preferência para uso na preparação das composições da invenção são aqueles que carregam uma cadeia lateral com carga, tais como arginina, lisina, ácido aspártico, e ácido glutâmico. Quaisquer estereoisômeros (quer dizer, isômero L, D, ou DL) de um aminoácido particular, ou combinações desses estereoisômeros, podem estar presentes nas composições farmacêuticas da invenção desde que o aminoácido particular esteja presente na sua forma de base livre ou na sua forma de sal . Preferivelmente, o estereoisômero-L é usado. As composições da invenção podem também ser formuladas com análogos desses aminoácidos de preferência. Por "análogo de aminoácido" entende-se um derivado do aminoácido de ocorrência natural que ocasiona o efeito desejado de diminuição da formação de agregado pelo polipeptídeo durante estocagem das composições farmacêuticas liquidas da invenção. Análogos de arginina adequados incluem, por exemplo, aminoguanidina e N-monoetil-arginina. Assim como com os aminoácidos de preferência, os análogos de aminoácidos são incorporados nas composições na sua forma de base livre ou na sua forma de sal.

Em combinação com a base de aminoácido como aqui definido, as composições farmacêuticas liquidas estabilizadas da invenção também compreendem um ácido substancialmente livre de sal forma de sal, um ácido em sua forma de sal, ou uma mistura de um ácido e sua forma de sal para manter o pH da solução. Preferivelmente, o pH é mantido pelo uso da base de aminoácido em combinação com um ácido substancialmente livre de sua forma de sal . Tal combinação fornece uma osmolaridade mais baixa para a solução do que se um ácido e sua· forma de sal forem usados como agente de tamponamento em combinação com uma base de aminoácido para formular a composição farmacêutica estabilizada. A vantagem de tal combinação é que alguém pode incorporar uma concentração mais alta de estabilizante, a base de aminoácido, na composição farmacêutica sem exceder a isotonicidade da solução. Por "um ácido substancialmente livre de usa forma de sal" entende-se que o ácido que funciona como o agente de tamponamento na composição farmacêutica líquida está presente na ausência de quaisquer de suas formas de sal. Tipicamente, quando um tampão que compreende um ácido é usado em uma composição farmacêutica líquida, ele é preparado usando uma forma de sal do ácido ou uma combinação do ácido e uma forma de sal do ácido. Assim, por exemplo, o tampão é preparado usando o ácido com seu "counterion", tal como sódio, potássio, amônio, cálcio, ou magnésio. Portanto, um tampão de succinato geralmente consiste em um sal de ácido succínico, tal como succinato de sódio, ou uma mistura de ácido succínico e succinato de sódio. Embora o ácido usado como agente de tamponamento nas composições farmacêuticas líquidas estabilizadas da invenção possam ser a forma de sal do ácido ou uma mistura da forma de ácido e sua forma de sal, preferivelmente o ácido que serve como um agente de tamponamento está unicamente na sua forma de ácido. Ácidos adequados para uso na formulação de composições líquidas estabilizadas contendo polipeptídeo da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fosfórico, ácido glutâmico, ácido maleico, ácido málico, ácido acético, ácido tartárico, e ácido aspártico, mais preferivelmente ácido succínico e ácido cítrico, e o mais preferível é o ácido succínico.

As composições farmacêuticas líquidas contendo polipeptídeo da invenção são composições "estabilizadas". Por "estabilizada" entende-se que as composições líquidas tendo estabilidade de estocagem aumentada em relação as composições preparadas na ausência da combinação de uma base de aminoácido e um agente de tamponamento como revelado nesta. A estabilidade de estocagem aumentada é observada na formulação líquida, se estocada diretamente naquela forma para uso posterior, se estocada em um estado congelado e descongelada antes do uso, ou se preparada em uma forma seca, tal como uma forma liofilizada, seca a ar, ou seca a spray, para posterior reconstituição na forma líquida ou outra forma antes do uso. Preferivelmente, as composições da invenção são estocadas diretamente em sua forma líquida para que se tenha vantagem absoluta da conveniência de ter uma estabilidade de estocagem aumentada na forma líquida, facilidade de administração sem reconstituição, e capacidade de suprir a formulação em seringas preenchidas prontas para uso ou como preparações de multidose se a formulação for compatível com agentes bacteriostáticos.

As composições da invenção estão relacionadas â descoberta de que a adição do aminoácido arginina, lisina, ácido aspártico, ou ácido glutâmico em sua forma de base livre ou em sua forma de sal em combinação com um ácido substancialmente livre de sua forma de sal, um ácido em sua forma de sal, ou uma mistura de um ácido e sal forma de sal, resulta em uma composição farmacêutica líquida contendo polipeptídeo que possui estabilidade de estocagem aumentada em relação a uma composição farmacêutica liquida contendo polipeptídeo preparada sem a combinação desses dois componentes. A estabilidade de estocagem aumentada da composição é alcançada através da influência do aminoácido sobre a estabilidade do polipeptídeo terapeuticamente ativo, mais particularmente sua influência sobre a agregação de polipeptídeo durante estocagem em formulações líquidas. Além disso, a incorporação de uma base de aminoácido como definido nesta e um ácido substancialmente livre de usa forma de sal nas formulações líquidas contendo polipeptídeo resulta em composições farmacêuticas líquidas que são próximas da isotonicidade sem ter que incluir agentes de isotonicidade adicionais, tal como cloreto de sódio. Por "próximo da isotonicidade" entende-se que a composição líquida possui uma osmolaridade de cerca de 240 mmol/kg a cerca de 360 mmol/kg, preferivelmente cerca de 240 a cerca de 340 mmol/kg, ainda mais preferivelmente cerca de 250 a cerca de 330 mmol/kg, e ainda mais preferivelmente cerca de 260 a cerca de 320 mmol/kg, mais preferivelmente cerca de 270 a cerca de 310 mmol/kg. A base de aminoácido incorporada nas composições farmacêuticas líquidas estabilizadas da invenção protege o polipeptídeo terapeuticamente ativo contra agregação, dessa forma, aumentando a estabilidade do polipeptídeo durante estocagem da composição. Por ^aumento da estabilidade" entende-se que a formação de agregado pelo polipeptídeo durante a estocagem da composição farmacêutica líquida é diminuída em relação à formação de agregado do polipeptídeo durante estocagem na ausência desse agente estabilizante particular. À formação de agregado diminuída sem adição de base de aminoácido ocorre em um modo dependente de concentração. Isto é, concentrações aumentadas de base de aminoácido levam à estabilidade aumentada de um polipeptídeo em uma composição farmacêutica líquida quando aquele polipeptídeo normalmente exibe formação de agregado durante estocagem em uma formulação líquida na ausência da base de aminoácido. A determinação da quantidade de uma base de aminoácido particular a ser adicionada a uma composição farmacêutica líquida para diminuir a formação de agregado, dessa forma aumentando a estabilidade de polipeptídeo, e assim aumentando a estabilidade de estocagem da composição, pode ser facilmente determinada por qualquer polipeptídeo particular de interesse sem experimentação indevida usando métodos geralmente conhecidos por aqueles experientes na técnica.

Assim, por exemplo, o efeito de uma base de aminoácido particular sobre a agregação de polipeptídeo durante estocagem em uma composição líquida pode ser facilmente determinado pela medição da mudariça em polipeptídeo solúvel em solução pelo tempo. A quantidade de polipeptídeo solúvel em solução pode ser quantificada por uma variedade de ensaios analíticos adaptados para detecção do polipeptídeo de interesse. Tais ensaios incluem, por exemplo, HPLC de fase reversa (RP) , HPLC de exclusão por tamanho (SEC) , e absorvência de UV, como descrito nos Exemplos abaixo. Quando um polipeptídeo de interesse forma tanto agregados solúveis como insolúveis durante estocagem em formulações líquidas, uma combinação de HPLC-RP e HPLC-SEC pode ser usada para distinguir entre aquela porção do polipeptídeo solúvel que está presente como agregados solúveis e aquela porção que está presente na forma molecular biologicamente ativa, de não-agregado, como descrito no Exemplo 1 abaixo.

No caso de agregação, uma quantidade eficaz de base de aminoácido para se incorporar em uma composição farmacêutica líquida contendo polipeptídeo para obter a composição farmacêutica estabilizada da invenção, seria vista como uma quantidade que resultaria em formação de agregado diminuída pelo tempo, e portanto, maior retenção de polipeptídeo solúvel em solução em sua forma molecular biologicamente ativa, não-agregada. Assim, por exemplo, quando o polipeptídeo é uma proteína monomérica, tal como interleucina-2 (IL-2) ou inibidor da via de fator tecidual (TFPI) descritos nos Exemplos abaixo, uma quantidade eficaz de agente estabilizante para uso na preparação de uma composição estabilizada da invenção seria uma quantidade que resultasse em uma maior retenção de IL-2 ou TFPI em sua forma molecular monomérica. A estabilidade de estocagem aumentada das composições líquidas estabilizadas contendo polipeptídeo da invenção pode estar também associada com os efeitos inibidores da base de aminoácido sobre a desamidação de resíduos de glutamina e/ou asparagina no polipeptídeo terapeuticamente ativo durante estocagem. O efeito de uma base de aminoácido particular sobre a desamidação desses resíduos durante estocagem em uma composição líquida pode ser facilmente determinada pela monitoração da quantidade de polipeptídeo presente em sua forma de desamidação pelo tempo. Métodos para medir espécies moleculares, quer dizer, nativas ou de desamidação, de uma polipeptídeo particular presente em fase de solução são geralmente conhecidos na técnica. Tais métodos incluem separação cromatográfica das espécies moleculares e identificação usando padrões de peso molecular de polipeptídeo, tal como com HPLC-RP como descrito nos Exemplos abaixo. O uso da nova combinação de uma base de aminoácido tamponada por um ácido substancialmente livre de sua forma de sal para aumentar a estabilidade do polipeptídeo nas composições farmacêuticas líquidas estabilizadas da invenção apresenta vantagens sobre, por exemplo, o uso de um aminoácido em um sistema de tampão ácido succínico/succinato de sódio. Essa nova combinação permite a preparação de formulações próximas da isotonicidade tendo maiores concentrações do aminoácido estabilizado que pode ser alcançada com o uso de um sistema de tampão que é uma mistura de uma ácido e sua forma de sal . A concentração mais alta do aminoácido estabilizado permite um aumento ainda maior na estabilidade do polipeptídeo, e assim estabilidade de estocagem aumentada da formulação.

Por exemplo, quando o ácido succínico é usado para tamponar base de arginina adicionada a uma formulação líquida que compreende a proteína interleucina-2 (IL-2) e tendo um pH ótimo para aquela proteína (pH = 5,8) , a concentração de arginina pode ser aumentada para 230 mM enquanto ainda se mantém a isotonicidade da formulação. Isso resulta em uma duplicação da data de validade de estocagem de IL-2 a 50°C, que é uma medida da estabilidade da proteína. Embora uma data de validade de estocagem de IL-2 similar possa ser atingida usando a mesma concentração de arginina e ácido succlnico/succinato de sódio como o agente de tamponamento, a arginina deve ser adicionada em sua forma ácida para atingir um pH similar, e a formulação resultante é hipertônica (veja Exemplo 1, Tabela 1).

De modo similar, quando o ácido cítrico é usado para tamponar base de arginina adicionada a uma formulação líquida que compreende o inibidor da via de fator tecidual (TFPI) e tendo um pH adequado para aquela proteína (pH = 5,5) , a concentração de arginina pode ser aumentada para 300 mM enquanto ainda se mantém a isotonicidade da formulação. Isso resulta em um aumento próximo de 50% na data de validade de estocagem de TFPI a 5 0 °C. Embora uma data de validade de estocagem de TFPI similar possa ser atingida usando a mesma concentração de arginina e ácido cítrico/citrato de sódio como o agente de tamponamento, a arginina deve ser novamente adicionada em sua forma ácida para atingir um pH similar, e a formulação resultante é hipertônica (veja Exemplo 8, Tabela 18) . A capacidade de usar concentrações maiores de um aminoácido como o agente estabilizante primário elimina a necessidade por estabilizantes de polipeptídeo tradicionais tais como albumina sérica bovina ou albumina sérica humana, que são agentes estabilizantes menos desejáveis devido à potencial contaminação viral.

Em adição, a isotonicidade de composições farmacêuticas líquidas é desejável à medida que ela resulta em dor reduzida após administração e minimiza efeitos hemolíticos potenciais associados com composições hipertônicas ou hipotônicas. Assim, as composições estabilizadas da invenção não têm apenas estabilidade de estocagem aumentada, mas também têm o benefício adicionado de reduzir substancialmente a dor após administração quando comparadas com formulações que usam outros sistemas de tampão tradicionais que consistem em um ácido e uma forma de sal do ácido. Por exemplo, em uma montagem da invenção, a composição farmacêutica líquida estabilizada quando injetada exibe reduzida dor associada com sensação de queimação e de ferroada em relação à injeção de solução salina normal (veja Exemplo 7).

Tendo identificado as vantagens da preparação de composições líquidas de polipeptídeo da invenção com uma base de aminoácido como o agente estabilizante primário e um ácido substancialmente livre de sua forma de sal como o agente de tamponamento, está dentro da experiência da técnica a determinação, sem experimentação indevida, de concentrações de preferência de cada um desses componentes a serem incorporados em uma composição farmacêutica líquida que compreende um polipeptídeo terapeuticamente ativo de interesse que exibe formação de agregado como descrito nessa para tingir uma estabilidade de polipeptídeo aumentada durante estocagem daquela composição. Seguindo os protocolos revelados, por exemplo, no Exemplo 1 abaixo, o praticante experiente pode avaliar uma faixa de concentrações desejadas da base de aminoácido e os vários ácidos de tamponamento para uso nas composições farmacêuticas líquidas descritas nessa. Preferivelmente a quantidade de base de aminoácido incorporada na composição está em uma faixa de concentração de cerca de 10 0 mM a cerca de 400 mM, preferivelmente cerca de 130 mM a cerca de 375 mM, mais preferivelmente cerca de 150 mM a cerca de 350 mM, ainda preferivelmente cerca de 175 mM a cerca de 325 mM, ainda preferivelmente cerca de 180 mM a cerca de 300 mM, ainda mais preferivelmente cerca de 190 mM a cerca de 280 mM, e o mais preferível é de cerca de 200 mM a cerca de 260 mM, dependendo da proteína presente na composição. Embora o agente de tamponamento possa ser o ácido na sua forma de sal, ou uma mistura do ácido e sua forma de sal, preferivelmente o agente de tamponamento é o ácido substancialmente livre de sua forma de sal, pelas razões vantajosas reveladas nessa. O ácido usado como o agente de tamponamento é adicionado preferivelmente em uma faixa de concentração de cerca de 40 mM a cerca de 250 mM, cerca de 50 mM a cerca de 240 mM, cerca de 60 mM a cerca de 230 mM, cerca de 70 mM a cerca de 220 mM, mais preferivelmente cerca de 80 mM a cerca de 210 mM, mais preferivelmente cerca de 90 mM a cerca de 200 mM, dependendo do ácido usado como o agente de tamponamento e do pH ótimo para o polipeptideo' que está sendo estabilizado contra a formação de agregado.

Em uma montagem, a base de aminoácido é base de arginina presente em uma concentração de cerca de 230 mM e o ácido usado como o agente de tamponamento é o ácido succínico em uma concentração de cerca de 128 mM. Isso permite a preparação de uma composição farmacêutica líquida contendo polipeptídeo tendo uma osmolaridade que é próxima de isotônica e um pH de cerca de 5,8. Em uma outra montagem, a base de aminoácido é base de arginina presente em uma concentração de cerca de 300 mM e o ácido usado como o agente de tamponamento é o ácido cítrico em uma concentração de cerca de 120 mM. Isso permite a preparação de uma composição farmacêutica liquida contendo polipeptídeo tendo uma osmolaridade que é próxima de isotônica e um pH de cerca de 5,5. Ainda em uma outra montagem, a base de aminoácido é base de arginina presente em uma concentração de cerca de 200 mM a cerca de 300 mM e o ácido usado como o agente de tamponamento é o ácido succínico em uma concentração de cerca de 120 mM a cerca de 180 mM. Isso permite a preparação de uma composição farmacêutica líquida contendo polipeptídeo tendo uma osmolaridade de cerca de 256 mmol/kg a cerca de 363 mmol/kg e um pH de cerca de 5,5.

Assim, em uma outra montagem da invenção, a composição farmacêutica líquida estabilizada compreende IL-2 ou variante dessa como o polipeptídeo, base de arginina em uma concentração de cerca de 150 mM a cerca de 350 mM, e ácido succínico em uma concentração de cerca de 80 mM a cerca de 190 mM. Em uma montagem de preferência, a base de arginina está presente na composição farmacêutica líquida de IL-2 em uma concentração de cerca de 230 mM e o ácido succínico em uma concentração de cerca de 128 mM. Essa composição de IL-2 preferida tem um pH de cerca de 5,8 e uma osmolaridade de cerca de 250 mmol/kg a cerca de 330 mmol/kg. A concentração de IL-2 ou variante dessa nessas composições é de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 2,0 mg/ml, preferivelmente cerca de 0,02 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml, mais preferivelmente cerca de 0,03 mg/ml a cerca de 0,8 mg/ml, mais preferivelmente cerca de 0,03 mg/ml a cerca de 0,5 mg/ml.

Ainda em uma outra montagem da invenção, a composição farmacêutica liquida estabilizada compreende TFPI ou variante desse como o polipeptídeo, base de arginina em uma concentração de cerca de 100 mM a cerca de 400 mM, e ácido succínico em uma concentração de cerca de 80 mM a cerca de 190 mM. Em uma montagem de preferência, a base de arginina está presente na composição farmacêutica líquida de TFPI em uma concentração de cerca de 2 00 mM a cerca de 3 00 mM e o ácido succínico está presente em uma concentração de cerca de 120 mM a cerca de 180 mM. Essa composição de TFPI preferida tem um pH de cerca de 5,5 e uma osmolaridade de cerca de 240 mmol/kg a cerca de 360 mmol/kg. A concentração de TFPI ou variante desse nessas composições é de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 5,0 mg/ml, preferivelmente cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 2,0 mg/ml, mais preferivelmente cerca de 0,10 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml, mais preferivelmente cerca de 0,10 mg/ml a cerca de 0,60 mg/ml.

Em uma outra montagem da invenção, a composição farmacêutica líquida estabilizada compreende TFPI ou variante desse como o polipeptídeo, base de arginina em uma concentração de cerca de 175 mM a cerca de 400 mM, e ácido cítrico em uma concentração de cerca de 4 0 mM a cerca de 200 mM. Em uma montagem de preferência, a base de arginina está presente na composição farmacêutica líquida de TFPI em uma concentração de cerca de 250 mM a cerca de 350 mM e o ácido cítrico está presente em uma concentração de cerca de 100 mM a cerca de 150 mM. Essa composição de TFPI preferida tem um pH de cerca de 5,0-6,5 e uma osmolaridade de cerca de 240 mmol/kg a cerca de 360 mmol/kg. Ainda em uma outra montagem, a base de arginina está presente na composição farmacêutica liquida de TFPI em uma concentração de cerca de 300 mM e o ácido cítrico está presente em uma concentração de cerca de 120 mM. Essa composição de TFPI preferida tem um pH de cerca de 5,5 e uma osmolaridade de cerca de 240 mmol/kg a cerca de 360 mmol/kg. A concentração de TFPI ou variante desse nessas composições é de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 5,0 mg/ml, preferivelmente cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 2,0 mg/ml, mais preferivelmente cerca de 0,10 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml, mais preferivelmente cerca de 0,10 mg/ml a cerca de 0,60 mg/ml.

Como mostrado nos exemplos abaixo, o pH de uma formulação farmacêutica liquida contendo polipeptídeo afeta a estabilidade do polipeptídeo contido nessa, primariamente através de seu efeito sobre a formação de agregado de polipeptídeo. Assim a quantidade de ácido de tamponamento presente nas composições farmacêuticas da invenção irá variar dependendo do pH ótimo para estabilidade de uma polipeptídeo particular de interesse. A determinação desse pH ótimo pode ser realizada usando métodos geralmente disponíveis na técnica, e também ilustrados nos Exemplos descritos nessa. As faixas de pH preferidas para as composições da invenção são de cerca de pH =4,0 a cerca de pH = 9,0, mais particularmente cerca de pH = 5,0 a cerca de 6,5, dependendo do polipeptídeo. Assim, em uma montagem, o pH é de cerca de 5,8, mais particularmente quando o polipeptídeo é IL-2 ou variante dessa. Em uma outra montagem, o pH é de cerca de 5,5, mais particularmente quando o polipeptídeo é TFPI ou variante desse.

As composições farmacêuticas estabilizadas que compreendem uma base de aminoácido tamponada com um ácido substancialmente livre de sua forma de sal, a forma de sal do ácido, ou uma mistura do ácido e sua forma de sal, podem também compreender agentes estabilizantes adicionais, que também aumentam a estabilidade de um polipeptídeo terapeuticamente ativo nessa. Os agentes estabilizantes de interesse particular para a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, metionina e EDTA, que protegem o polipeptídeo contra oxidação de metionina; e um tensoativo não-iônico, que protege o polipeptídeo contra agregação associada com congelamento-descongelamento ou cisalhamento mecânico.

Desse modo, o aminoácido metionina pode ser adicionado para inibir oxidação de resíduos de metionina para sulfóxido de metionina quando o polipeptídeo que age como o agente terapêutico é um polipeptídeo que compreende pelo menos um resíduo de metionina suscetível a tal oxidação. Por "inibir" entende-se a acumulação mínima de espécies oxidadas de metionina pelo tempo. A inibição de oxidação de metionina resulta em uma maior retenção do polipeptídeo em sua forma molecular adequada. Qualquer estereoisômero de metionina (isômero L, D, ou DL) ou combinações desses podem ser usados. A quantidade a ser adicionada deve ser uma quantidade suficiente para inibir a oxidação dos resíduos de metionina de forma que a quantidade de sulfóxido de metionina seja aceitável para agências reguladoras. Tipicamente, isso significa que a composição contém não mais que cerca de 10% a cerca de 30% de sulfóxido de metionina. Geralmente, isso pode ser atingido pela adição de metionina de forma que a proporção de metionina adicionada aos resíduos de metionina varie de cerca de 1:1 a cerca de 1000:1, mais preferivelmente 10:1 a cerca de 100:1. A quantidade preferida de metionina a ser adicionada pode ser facilmente determinada empiricamente pela preparação da composição que compreende o polipeptídeo de interesse com diferentes concentrações de metionina e pela determinação do efeito relativo sobre a formação de espécies oxidativas do polipeptídeo usando, por exemplo, separação cromatográfica das espécies moleculares e identificação usando padrões de peso molecular de polipeptídeo, tal como com HPLC-RP, como descrito abaixo no Exemplo 2. Aquela concentração de metionina que maximiza a inibição de oxidação de resíduos de metionina, sem ter efeitos adversos sobre a inibição de agregação de polipeptídeo relacionada a aminoácido, deve representar uma quantidade preferida de metionina a ser adicionada à composição para também melhorar a estabilidade de polipeptídeo. A degradação de polipeptídeo devido ao congelamento e descongelamento ou cisalhamento mecânico durante o processamento da composição líquida da presente invenção pode ser inibida pela incorporação de tensoativos nas composições líquidas contendo polipeptídeo da invenção a fim de diminuir a tensão de superfície na interface solução-ar. Tensoativos típicos empregados são tensoativos não-iônicos, incluindo ésteres de polioxietileno sorbitol tais como polissorbato 80 (Tween 80) e polissorbato 20 (Tween 20) ; ésteres de polioxipropileno-polioxietileno tal como Pluronic F68; álcoois de polioxietileno tal como Brij 35; simeticone; polietileno glic.ol tal como PEG400; lisofosfatidilcolina; e polioxietileno-p-t-octilfenol tal como Triton X-100. a estabilização clássica de fármacos por tensoativos ou emulsificantes é descrita, por exemplo, em Levine e cols. (1991) J. Parentera.1 Sei. Technol. 45(3):160-165, aqui incorporado por referência. Um tensoativo de preferência empregado na prática da presente invenção é o polissorbato 80.

Em adição àqueles agentes revelados acima, outros agentes estabilizantes, tais como albumina, ácido et ilenodiaminotetracét ico (EDTA) ou um de seus sais tal como EDTA dissódico, podem ser adicionados para também melhorar a estabilidade das composições farmacêuticas líquidas. A'quantidade de albumina pode ser adicionada em concentrações de cerca de 1,0% peso/volume ou menos. O EDTA age como um limpador de íons de metal conhecido por catalisar várias reações de oxidação, assim fornecendo um agente estabilizante adicional.

Em uma montagem da invenção, a composição farmacêutica liquida estabilizada compreende IL-2 ou variante dessa como o polipeptídeo, base de arginina em uma concentração de cerca de 150 mM a cerca de 350 mM, ácido succínico em uma concentração de cerca de 80 mM a cerca de 190 mM, metionina em uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 10 mM, EDTA em cerca de 0,1 a cerca de 5,0 mM, e polissorbato 80 a cerca de 0,001% a cerca de 0,2%. Em uma montagem de preferência, a base de arginina está presente nessa composição farmacêutica líquida de IL-2 em uma concentração de cerca de 230 mM e o ácido succinico em uma concentração de cerca de 128 mM. Essa composição de IL-2 preferida tem um pH de cerca de 5,8 e uma osmolaridade de cerca de 250 mmol/kg a cerca de 330 mmol/kg. Ά concentração de IL-2 ou variante dessa nessas composições é de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 2,0 mg/ml, preferivelmente cerca de 0,02 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml, mais preferivelmente cerca de 0,03 mg/ml a cerca de 0,8 mg/ml, mais preferivelmente cerca de 0,03 mg/ml a cerca de 0,5 mg/ml.

Quando desejado, açúcares ou álcoois de açúcar podem também ser incluídos nas composições farmacêuticas líquidas estabilizadas contendo polipeptídeo da presente invenção. Quaisquer açúcares, como mono-, di-, ou polissacarídeos, ou glicanos solúveis em água, incluindo, por exemplo, frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sacarose, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, amido solúvel, hidroxietil amido e carboximetilcelulose-Na podem ser usados. A sacarose é o aditivo de açúcar de maior preferência. Álcool de açúcar é definido como um hidrocarbono C4-C8 tendo um grupo -OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol, galacititol, dulcitol, xilitol, e arabitol, com o manitol sendo o aditivo de álcool de açúcar mais preferido. Os açúcares ou álcoois de açúcar mencionados acima podem ser usados individualmente ou em combinação. Não há limite fixo para a quantidade usada, já que o açúcar ou álcool de açúcar é solúvel na preparação líquida e não afeta de forma adversa os efeitos de estabilização alcançados com o uso dos métodos da invenção. Preferivelmente, a concentração de açúcar ou de álcool de açúcar está entre cerca de 1,0 % de peso/volume e cerca de 15,0 % de peso/volume, mais preferivelmente entre cerca de 2,0 % de peso/volume e cerca de 10,0 % de peso/volume.

As composições farmacêuticas líquidas estabilizadas da invenção podem conter outros compostos que aumentam a eficácia ou promovem as qualidades desejáveis do polipeptideo. de interesse que serve como um componente terapeuticamente ativo já que o efeito estabilizante primário alcançado com a base de aminoácido não é afetado de modo adverso. A composição deve ser segura para administração pela via que é escolhida, ela deve ser estéril, e deve reter sua atividade terapêutica desejada.

As composições da presente invenção são preparadas preferivelmente por pré-mistura dos agentes estabilizantes e de tamponamento, e quaisquer outros excipientes antes da incorporação do polipeptídeo de interesse. Quaisquer excipientes adicionais que podem ser adicionados para estabilizar adicionalmente as composições da presente invenção não devem afetar de modo adverso os efeitos estabilizantes do agente estabilizante primário, quer dizer, a base de aminoácido, em combinação com o agente de tamponamento, quer dizer, um ácido substancialmente livre de sua forma de sal, a forma de sal do ácido, ou uma mistura do ácido e de sua forma de sal, como usado para obter as novas composições reveladas nessa. Seguindo-se à adição de uma quantidade preferida da base de aminoácido para alcançar uma formação de agregado diminuída de um polipeptídeo de interesse, o pH da composição líquida é ajustado usando o agente de tamponamento, preferivelmente numa faixa revelada nessa, mais preferivelmente até o pH ótimo para o polipeptídeo de interesse. Embora o pH possa ser ajustado seguindo a adição do polipeptídeo de interesse na composição, preferivelmente ele é ajustado antes da adição desse polipeptídeo, já que isso pode reduzir o risco de desnaturação do polipeptídeo. Dispositivos mecânicos adequados são então usados para tingir uma mistura adequada dos constituintes.

Enquanto montagens específicas da invenção são direcionadas para estabilizar composições que compreendem interleucina-2 (IL-2) ou variantes dessa, ou inibidor da via de fator tecidual (TFPI) ou variantes desse, exemplos de proteínas que são particularmente suscetíveis à degradação por meio de formação de agregado, a utilidade da invenção se estende geralmente a qualquer composição farmacêutica contendo um polipeptídeo ou variante desse que exiba formação de agregado durante estocagem em uma formulação líquida. Assim, os polipeptídeos adequados para uso na prática da presente invenção incluem, por exemplo, interleucinas (por exemplo, IL-2), interferons incluindo interferon-β {IFN-β) e suas muteínas tal como IFN^seri7 (como descrito na aplicação de Patente Européia 185459B1 e Patente U.S. 4.588.585, aqui incorporadas por referência), inibidor da via de fator tecidual (TFPI), hormônio do crescimento humano (hGH), insulina, e outros polipeptídeos semelhantes que exibem formação de agregado em uma formulação líquida, assim como quaisquer variantes biologicamente ativas desses.

Os polipeptídeos presentes nas composições farmacêuticas líquidas estabilizadas da invenção podem ser nativos ou obtidos por técnicas recombinantes, e podem ser de qualquer fonte, incluindo fontes mamíferas tais como, por exemplo, camundongo, rato, coelho, primatas, porco e humanos, desde que estejam de acordo com os critérios especificados nessa, que são, desde que eles formem agregados durante estocagem em formulações líquidas. Preferivelmente, tais polipeptideos são derivados de uma fonte humana, e mais preferivelmente são proteínas humanas, recombinantes de hospedeiros microbianos.

Variantes biologicamente ativas de um polipeptídeo de interesse que servem como o componente terapeuticamente ativo nas composições farmacêuticas da invenção são também englobados pelo termo "polipeptídeo" como usado nesta. Tais variantes devem reter a atividade biológica desejada do polipeptídeo nativo de forma que a composição farmacêutica que compreende o polipeptídeo variante tenha o mesmo efeito terapêutico que a composição farmacêutica que compreende o polipeptídeo nativo quando administrada a um indivíduo. Isto é, o polipeptídeo variante servirá como um componente terapeuticamente ativo na composição farmacêutica em um modo similar àquele observado para o polipeptídeo nativo. São disponíveis métodos na técnica para determinar se um polipeptídeo variante retém a atividade biológica desejada, e portanto serve como um componente terapeuticamente ativo na composição farmacêutica. A atividade biológica pode ser medida usando ensaios especificamente projetados para medir a atividade do polipeptídeo nativo ou proteína nativa, incluindo ensaios descritos na presente invenção. Adicionalmente, anticorpos que surgiram contra o polipeptídeo nativo biologicamente ativo podem ser testados para sua capacidade de se ligar ao polipeptídeo variante, onde a ligação eficaz é indicativa de um polipeptídeo tendo uma conformação similar àquela do polipeptídeo nativo.

Variantes biologicamente ativas adequadas de um polipeptídeo' nativo ou de ocorrência natural de interesse podem ser fragmentos, análogos, e derivados daquele polipeptídeo. Por "fragmento" entende-se um polipeptídeo que consiste em apenas uma parte da seqüência e estrutura de polipeptídeos intacta, e pode ser um apagamento de terminal-C ou de terminal-N do polipeptídeo nativo. Por "análogo" entende-se um análogo tanto do polipeptídeo nativo como de um fragmento do polipeptídeo nativo, onde o análogo compreende uma seqüência e estrutura de polipeptídeos nativos tendo uma ou mais substituições, inserções ou apagamentos de aminoácido. "Muteínas", tais como aquelas descritas nessa, e peptídeos tendo um ou mais peptóides (imitadores de peptídeos) são também englobados pelo análogo de termo (veja, Publicação Internacional WO 91/04282). Por "derivado" entende-se qualquer modificação adequada do polipeptídeo nativo de interesse, ou um fragmento do polipeptídeo nativo, ou de seus análogos respectivos, tais como glicosilação, fosforilação, ou outra adição de porções estranhas, desde que a atividade biológica desejada do polipeptídeo nativo seja mantida. Métodos para produzir fragmentos, análogos e derivados de polipeptídeos são geralmente disponíveis na técnica.

Por exemplo, variantes de seqüência de aminoácido do polipeptídeo podem ser preparadas por mutações na seqüência de DNA clonado que codifica o polipeptídeo nativo de interesse. Métodos para mutagênese e alterações de seqüência de nucleotídeos são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Walker e Gaastra, eds. (1983) Technlques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Corapany, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel e cols. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382;

Sambrook e cols. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); Patente U.S. 4.873.192; e as referências citadas nessa; aqui incorporadas por referência. Instruções para substituições adequadas de aminoácido que não afetem a atividade biológica do polipeptídeo de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff e cols. (1978) em Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., (Washington, D.C.), aqui incorporada por referência. Substituições conservadoras, tal como a troca de um aminoácido por outro tendo propriedades similares, podem ser preferidas. Exemplos de substituições conservadoras incluem, mas não estão limitadas a, Gly<=>Ala, Val<=>Ile<=>Leu, Asp<=>Glu, Lys<P>Arg, Asn<=>Gln, e Phe<=>Trp<=>Tyr.

Na construção de variantes do polipeptídeo de interesse, são feitas modificações de forma que as variantes continuem a possuir a atividade desejada. Obviamente, quaisquer mutações feitas no DNA que codifica o polipeptídeo variante não devem colocar a seqüência fora da estrutura de leitura e preferivelmente não criará regiões complementares que poderíam produzir estrutura secundária de mRNA. Veja Publicação de Aplicação de Patente EP 75.444.

Variantes biologicamente ativas de um polipeptídeo de interesse terão geralmente pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente cerca de 90% a 95% ou mais, e ainda mais preferivelmente cerca de 98% ou mais de identidade de seqüência de aminoácido à sequência de aminoácido da molécula de polipeptideo de referência, que serve como a base para comparação. Uma variante biologicamente ativa de um polipeptideo nativo de interesse pode diferir do polipeptideo nativo por apenas 1-15 residuos de aminoácidos, apenas 1-10, tal como 6-10, apenas 5, apenas 4, 3, 2, ou mesmo 1 resíduo de aminoácido. Por "identidade de seqüência" entende-se que os mesmos resíduos de aminoácido são encontrados no polipeptideo variante e na molécula de polipeptideo que serve como uma referência quando um segmento contíguo especificado da seqüência de aminoácido da variante é alinhado e comparado à seqüência de aminoácido da molécula de referência. A percentagem de identidade ' de seqüência entre duas seqüências de aminoácidos é calculada pela determinação do número de posições nas quais o resíduo de aminoácido idêntico ocorre em ambas seqüências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições no segmento que está sendo comprado com a molécula de referência, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a percentagem de identidade de seqüência.

Para propósitos de um alinhamento ótimo das duas seqüências, o segmento contíguo da seqüência de aminoácidos da variante pode ter resíduos de aminoácidos adicionais ou resíduos de aminoácidos apagados em relação à seqüência de aminoácido da molécula de referência. O segmento contíguo usado para .comparação com a seqüência de aminoácido de referência irá compreender pelo menos vinte (20) resíduos de aminoácido contíguos, e pode ter 30, 40, 50, 100, ou mais resíduos. Correções para identidade de seqüência aumentada associada com inclusão de intervalos na seqüência de aminoácidos da variante podem ser feitas pela adoção de penalidades de intervalo. Métodos de alinhamento de seqüência são bem conhecidos na técnica tanto para seqüências de aminoácidos como para seqüências de nucleotídeos que codificam seqüências de aminoácidos.

Assim, a determinação de -percentual de identidade entre quaisquer duas seqüências pode ser realizada usando-se um algoritmo matemático. Um exemplo não-limitante de preferência de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de seqüências é o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABÍOS 4:11-17. Tal algoritmo é utilizado no programa ALIGN (versão 2.0) , que é uma parte do pacote de software de alinhamento de seqüência GCG. Uma tabela de peso de resíduo PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4 podem ser usados com o programa ALIGN quando da comparação de seqüências de aminoácidos. Um outro exemplo não-1imitante de preferência de um algoritmo matemático para uso na comparação de duas seqüências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul e cols. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Pesquisas de nucleotídeo de BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter seqüências de nucleotídeo homólogas a uma seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de interesse. Pesquisas de nucleotídeo de BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter seqüências de aminoácidos homólogas ao polipeptídeo de interesse. Para obter alinhamentos de intervalo para objetivos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul e cols. (1997) Nucleic Acid Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAst pode ser usado para realizar uma pesquisa reiterada que detecta relações distantes entre moléculas. Veja Altschul e cols. (1997) supra. Quando da utilização de programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-BLast, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, X-BLAST e NBLAST) podem ser usados. Veja htpp://www.ncbi.nlm.nih.gov. Veja também o programa ALIGN (Dayhoff(1978) em Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.) e programas em Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 (disponível por Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), por exemplo, o programa GAP, onde parâmetros padrão dos programas são utilizados.

Quando da consideração da percentagem de identidade de seqüência de aminoácidos, algumas posições de resíduo de aminoácido podem diferir como um resultado de substituições conservadoras de aminoácidos, que não afetam as propriedades de função de proteína. Nesses casos, a percentagem de identidade de seqüência pode ser ajustada para cima para levar em conta a similaridade em aminoácido de substituídos de forma conservadora. Tais ajustes são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Myers e Miller (1988) Computer Applic. Biol. Sei. 4:11-17. A estrutura química precisa, de um polipeptídeo depende de uma variedade de fatores. Já que grupos amino e carboxil ionizáveis estão presentes na molécula, um polipeptídeo particular pode ser obtido como um sal ácido ou básico, ou na forma neutra. Todas essas tais preparações que retêm sua atividade biológica quando colocadas em condições ambientais adequadas estão incluídas na definição de polipeptídeos como usado nesta. Além disso, a seqüência de aminoácidos primária pode ser aumentada por derivação usando porções de açúcar (glicosilação) ou por outras moléculas suplementares tais como lipídeos, fosfato, grupos acetil, e semelhantes. Ela também pode ser aumentada por conjugação com sacarídeos. Certos aspectos de tais aumentos são realizados através de sistemas de processamento pós-tradução do' hospedeiro de produção; outras modificações podem ser introduzidas in vitro. Em qualquer evento, tais modificações são incluídas na definição de polipeptídeo usada nesta desde que a atividade do polipeptídeo não seja destruída. É esperado que tais modificações possam afetar quantitativa e qualitativamente a atividade, pelo aumento ou pela diminuição da atividade do polipeptídeo, nos vários ensaios. Além disso, resíduos de aminoácido individuais na cadeia podem ser modificados por oxidação, redução, ou outra derivação, e o polipeptídeo pode ser quebrado para obter fragmentos que retenham a atividade. Tais alterações que não destróem a atividade, não removem a seqüência de polipeptídeo da definição de polipeptídeo de interesse usada nesta. A técnica fornece orientação substancial em relação à preparação e ao uso de variantes de polipeptídeos. Na preparação de variantes de polipeptídeos, uma pessoa experiente na técnica pode determinar facilmente que modificações ao nucleotídeo de proteína nativa ou â seqüência de aminoácidos resultarão em uma variante que seja adequada para uso como um componente terapeuticamente ativo de uma composição farmacêutica da presente invenção e cuja formação de agregado seja diminuída pela presença de uma base de aminoácido e um ácido substancialmente livre de sua forma de sal, a forma de sal do ácido, ou uma mistura do ácido e sua forma de sal, como descrito nesta.

Em uma montagem da invenção, o polipeptídeo presente como um componente terapeuticamente ativo na composição farmacêutica líquida da invenção é interleucina-2 (IL-2) ou variante dessa, preferivelmente IL-2 recombinante. A interleucina-2 é uma linfocina que é produzida por linfócitos normais de sangue periférico e está presente no corpo em baixas concentrações. Ela induz a proliferação de células T estimuladas por antígeno ou mitógeno depois de exposição a lectinas de planta, antígenos, ou outros estímulos. A IL-2 foi primeiramente descrita por Morgan e cols. (1976) Science 193:1007-1008 e originalmente chamada fator de crescimento de célula-T devido a sua capacidade de induzir a proliferação de linfócitos T estimulados. Ela é uma proteína com um peso molecular relatado na faixa de 13.000 a 17.000 (Gillis e Watson (1980) J. Exp. Med. 159:1709) e tem um ponto isoelétrico na faixa de 6-8,5. É agora reconhecido que em adição a suas propriedades de fator de crescimento, ela modula várias funções do sistema imune in vitro e in vivo. A IL-2 é uma de várias moléculas reguladoras de mensageiro produzidas por linfócitos que mediam as interações e funções celulares. Essa linfocina de ocorrência natural mostrou ter atividade anti-tumor contra uma variedade de malignidades tanto sozinha como quando combinada com células exterminadoras ativadas por linfocina (LAK) ou linfócitos de infiltração em tumor (veja, por exemplo, Rosenberg e cols. (1987) N. Engl. J. Med. 316:889-897; Rosenberg (1988) Ann. Surg.. 208:121-135; Topalian e cols. 1988) iJ. Clin. Oncol. 6:839-853; Rosenberg e cols. (1988) N. Engl. J. Med. 319:1676-1680; e Weber e cols. (1992) J. Clin. Oncol. 10:33-40). Embora a atividade antitumor de IL-2 tenha sido descrita em pacientes com melanoma metastático e carcinoma de célula renal, outras doenças, notavelmente linfoma, também parecem responder ao tratamento com IL-2.

Por "IL-2 recombinante" entende-se interleucina-2 tendo atividade biológica comparável à IL-2 de seqüência nativa e que foi preparada por técnicas de DNA recombinante como descrito, por exemplo, por Taniguchi e cols. (1983) Nature 302:305-310 e Devos (1983) Nucleic Acids Research 11:4307-4323 ou IL-2 alterada por mutações como descrito por Wang e cols. (1984) Science 224:1431-1433. Em geral, o gene que codifica para IL-2 é clonado e então expresso em organismos transformados, preferivelmente um microorganismo, e mais preferivelmente E. coli, como descrito nesta. O organismo hospedeiro expressa o gene estranho para produzir IL-2 sob condições de expressão. O IL-2 recombinante sintética pode também ser feita em eucariontes, tal como levedo ou células humanas. Os processos para crescimento, coleta, rompimento, ou extração de IL-2 das células são descritos substancialmente, por exemplo, nas Patentes U.S. 4.604.377; 4.738.927; 4.656.132; 4.569.790; 4.748.234; 4.530.787; 4.572.298; e 4.931.543; aqui incorporadas em suas totalidades por referência.

Para exemplos de proteínas de IL-2 variantes, veja Aplicação de Patente Européia 136.489; Aplicação de Patente Européia 83101035.0 registrada em 3 de fevereiro de 1983 (publicada em 19 de outubro de 1983 sob Publicação 91539); Aplicação de Patente Européia 82307036.2, registrada em 22 de dezembro de 1982 (publicada em 14 de setembro de 1983 sob 88195) ; as muteínas de IL-2 recombinantes descritas na Aplicação de Patente Européia 83306221.9, registrada em 13 de outubro de 1983 (publicada em 3 0 de maio de 1984 sob 109748), que é equivalente à Patente Belga 893.016, de domínio público Patente U.S. 4.518.584; as muteínas descritas nas Patentes U.S. 4.752.585 e WO 99/60128; e a muteína IL-2 usada nos exemplos nesta e descrita na Patente U.S. 4.931.543; todas são aqui incorporadas por referência. Adicionalmente, IL-2 pode ser modificada com polietileno glicol para fornecer solubilidade melhorada e um perfil farmacocinético alterado (veja Patente U.S. 4.766.106, aqui incorporada em sua totalidade por referência).

Em uma outra montagem da invenção, o polipeptídeo presente como um componente terapeuticamente ativo na composição farmacêutica líquida da invenção é um interferon, mais particularmente o interferon-β fibroepitelial (IFN-β) ou variante desse, preferivelmente IFN-β recombinante preparado por técnicas de DNA recombinante descritas na técnica. Os interferons são produzidos por células de mamíferos em resposta à exposição a uma variedade de indutores, tais como mitógenos, polipeptídeos, vírus, e semelhantes. Esses polipeptídeos de cadeia única espécies-específicos, relativamente pequenos exibem propriedades imuno-reguladoras, anti-virais, e anti-proliferativas. Os interferons são de interesse como agentes terapêuticos para tratamento de doenças virais e controle de câncer.

Seqüências de DNA que codificam o gene de IFN-β humano são disponíveis na técnica (veja Goeddel e cols. (1980) Nucleic Acid Res. 8:4057 e Taniguchi e cols. (1979) Proc. Japan acad. Sei. 855:464) e o gene foi expresso em E. coli (Taniguchi e cols. (1980) Gene 10:11-15) e células de ovário de hamster da China (veja, por exemplo, Patentes U.S. 4.966.843 e 5.376.567). Variantes de IFN-β são descritas nà Aplicação de Patente Européia 185459B1, e Patentes U.S. 4.518.584., 4.588.585, e 4.737.462 descrevem muteínas tal como IFN^seri7 expressas em E. coli, todas estão aqui incorporadas por referência.

Ainda em uma outra montagem, o polipeptídeo presente como um componente terapeuticamente ativo na composição farmacêutica líquida da invenção é inibidor da via de fator tecidual (TFPI) ou variante desse, preferivelmente TFPI recombinante. Esse polipeptídeo que é um inibidor da cascata de coagulação, é também conhecido como inibidor de coagulação associado à lipoproteína (LACI), inibidor de fator tecidual (TFI), e inibidor de via extrínseca (EPI). O TFPI foi primeiramente purificado a partir de uma célula de hepatoma humana, Hep G2 (Broze e Miletich (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:1886-1890) e subseqüentemente de plasma humano (Novotny e cols. (1989) J. Biol. Chem. 264:18832-18837); e células de fígado de Chang e células de hepatoma SK (Wun e cols. (1990) J. Biol. Chem. 265:16096-16101) . O cDNA de TFPI foi isolado a partir de bibliotecas de cDNA endotelial e de placenta (Wun e cols. (1988) J. Biol. Chem. 263:6001-6004); Girard e cols. (1989) Thromb. Res. 55:37-50). Para revisões, veja Rapaport (1989) Blood 73:359-365(1989); Broze e cols. (1990) Biochemistry 29:7539-7546. A clonagem do cDNA de TFPI, que codifica a proteína de TFPI de 276 resíduos de aminoácidos, é também descrita na Patente U.S. 4.966.852; veja também Patentes U.S. 5.773.251 e 5.849.875; todas as quais aqui incorporadas por referência.

Variantes de TFPI são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Patente U.S. 5.212.091, onde uma forma não glicosilada de TFPI recombinante foi produzida e isolada, a partir de E. coli; Patente U.S. 5.106.833, onde análogos e fragmentos são revelados; e Patente U.S. 5.378.614, onde a produção de análogos de TFPI em levedo é descrita; todas as quais aqui incorporadas por referência.

Uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma composição farmacêutica líquida estabilizada contendo polipeptídeo da invenção é administrada a um indivíduo. Por "quantidade ' farmaceuticamente eficaz" entende-se uma quantidade que é útil no tratamento, prevenção ou diagnóstico de uma doença ou condição. Vias de administração típicas incluem, mas não estão limitadas a, administração oral e parenteral, incluindo intravenosa, intramuscular, subcutânea, intra-arterial, e injeção ou infusão intraperitonial. Em uma tal montagem, a administração é por injeção, preferivelmente injeção subcutânea. Formas injetáveis das composições da invenção incluem, mas. não estão limitadas a, soluções, suspensões, e emulsões. A composição farmacêutica líquida estabilizada que compreende o polipeptídeo de interesse deve ser formulada em uma dose unitária e deve estar numa forma injetável ou de infusão tal como uma solução, suspensão ou emulsão. Além disso, ela pode ser estocada congelada ou preparada na forma seca, tal como um pó liofilizado, que pode ser reconstituído na solução, suspensão ou emulsão líquida, antes da administração por qualquer um dos vários métodos incluindo vias orais ou parenterais de administração. Preferivelmente, ela é estocada na formulação líquida para tirar vantagem da estabilidade de estocagem aumentada atingida de acordo com os métodos da presente invenção como descrito abaixo. A composição farmacêutica estabilizada é preferivelmente esterilizada por filtração de membrana e é estocada em recipientes de dose unitária ou de multi-doses tais como frascos ou ampolas selados. Métodos adicionais para formulação de uma composição farmacêutica geralmente conhecidos na técnica podem ser usados para também aumentar a estabilidade de estocagem das composições farmacêuticas líquidas reveladas nesta desde que elas não afetem de forma adversa os efeitos benéficos dos agentes estabilizantes e de tamponamento, de preferência revelados nos métodos da invenção. Uma discussão completa de formulação e seleção de transportadores, estabilizantes, etc. farmaceuticamente aceitáveis pode ser encontrada em Remington's Pharma.ceutica.1 Sciences (1990) (18a. ed. Mack Pub. Co., Eaton, Pennsylvania), aqui incorporado por referência.

Por "indivíduo" entende-se qualquer animal.

Preferivelmente o indivíduo é um mamífero, preferivelmente o indivíduo é um humano. Mamíferos de particular importância outros que não humanos incluem, mas não estão limitados a, cães, gatos, vacas, cavalos, carneiros, e porcos.

Quando a administração é para objetivos de tratamento, a administração pode ser para objetivos terapêuticos ou profiláticos. Quando fornecida profilaticamente, a substância é fornecida em antecipação a qualquer sintoma. A administração profilática da substância serve para prevenir ou atenuar qualquer sintoma subseqüente. Quando fornecida terapeuticamente, a substância é fornecida no (ou logo depois) do surgimento de um sintoma. A administração terapêutica da substância serve para atenuar qualquer sintoma atual.

Assim, por exemplo, as formulações que compreendem uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da invenção que compreendem IL-2 de sequência nativa ou variante dessa podem ser usadas para o objetivo de tratamento, prevenção, e diagnóstico de uma variedade de indicações clínicas responsivas a terapia com esse polipeptideo. Variantes biologicamente ativos de IL-2 de seqüência nativa, tal como muteínas de IL-2 que retêm atividade de IL-2, em particular a muteína de IL-2.sub.serl25 e outras muteínas nas quais a cisteína na posição 125 foi substituída por outro aminoácido, podem ser formuladas e usadas do mesmo modo que a IL-2 de seqüência nativa. Consequentemente, as formulações da invenção que compreendem IL-2 de seqüência nativa ou variante dessa são úteis para o diagnóstico, prevenção, e tratamento (local ou sistêmico) de infecções bacterianas, virais, parasíticas, por protozoários e fúngicas; para aumentar a citotoxicidade mediada por célula; para estimular a atividade de célula exterminadora ativada por linfocina (LAK); para mediar a recuperação de função imune de linfócitos; para aumentar a resposta de alo-antígeno; para facilitar a recuperação de função imune em estados de deficiência imune adquirida; para reconstituição de função imune normal em humanos idosos e animais; no desenvolvimento de ensaios diagnósticos tais como aqueles que empregam amplificação, radio marcação, radio imagem de enzima e outros métodos conhecidos na técnica para monitorar níveis de IL-2 no estado de doença; para a promoção de crescimento de células-T in vitro para objetivos diagnósticos e terapêuticos; para bloqueio de sítios receptores de linfocinas; e em várias outras aplicações terapêuticas, diagnosticas e de pesquisa. As várias aplicações terapêuticas e diagnosticas de IL-2 humana ou variantes dessa, tais como muteínas de IL-2, têm sido investigadas e relatadas em Rosenberg e cols. (1987) N. Engl. J. Med. 316:889-897; Rosenberg (1988) Ann. Surg. 208:121-135;

Topaiian e cols. 1988) J. Clin. Oncol. 6:839-853; Rosenberg e cols. (1988) N. Engl. J. Med. 319:1676-1680; Weber e cols. (1992) J. Clin. Oncol. 10:33-40); Grimm e cols. (1982) Cell Immunol. 70 (2) :248-259,- Mazumder (1997) Câncer J. Sei. Am. 3(Suppl. 1) :S37-42; Mazumder e Rosenberg (1984) J. Exp. Med. 159(2) :495-507,- e Mazunder e cols. (1983) Câncer Immunol. Immunother. 15(1):1-10. As formulações da invenção que compreendem IL-2 ou variante dessa podem ser usadas como o único agente terapeuticamente ativo ou podem ser usadas em combinação com outras células T ou B imunologicamente relevantes ou outros agentes terapêuticos. Exemplos de células relevantes são celas T ou B, células exterminadoras naturais, células LAK, e semelhantes, e reagentes terapêuticos de exemplo que podem ser usados em combinação com IL-2 ou variantes dessa são os vários interferons, especialmente interferon gama, fator de crescimento de célula-B, IL-1, e anticorpos, por exemplo, anticorpos anti-HER2 ou anti-CD20. As formulações da invenção que compreendem IL-2 ou variantes dessa podem ser administradas a humanos ou animais por via oral, intraperitonial, intramuscular, subcutânea, intravenosa, intranasal, ou por liberação pulmonar como considerado adequado pelo médico. A quantidade de IL-2 (de seqüência nativa ou variante dessa que retém atividade biológica de IL-2, tais como muteinas reveladas nessa) administrada pode variar entre cerca de 0,1 a cerca de 15 mIU/m2. Para indicações tais como carcinoma de célula renal e melanoma metastático, a IL-2 ou variante biologicamente ativa dessa pode ser administrada como um bolo intravenoso de alta dose em 300.000 a 800.000 IU/kg/8 horas.

As formulações que compreendem uma quantidade eficaz das composições farmacêuticas da invenção que compreendem inibidor de via de fator tecidual de seqüência nativa (TFPI) ou variante desse são úteis para o diagnóstico, prevenção, e tratamento (local ou sistêmico) de indicações clínicas responsivas à terapia com esse polipeptideo. Tais indicações clínicas incluem, por exemplo, indicações associadas com síntese aumentada e liberação de elastase de neutrófilo, tais como doenças inflamatórias incluindo pancreatite aguda severa, enfisema, artrite reumatóide, falência múltipla de órgãos, fibrose cística, Síndrome de Stress Respiratório de Adulto (ARDS), e sepsis; e para o diagnóstico e tratamento de doenças associadas com síntese e liberação aumentadas de IL-8, incluindo doenças inflamatórias tal como ARDS, trauma de reperfusão (incluindo trauma de reperfusão pulmonar), sepsis, e artrite. Veja, WO 96/40224, aqui incorporada por referência. A administração de IFN-β ou de suas muteínas a humanos ou animais pode ser liberada por via oral, intraperitonial, intramuscular, subcutânea, intravenosa, intranasal, ou por liberação pulmonar como considerado adequado pelo médico.

As formulações que compreendem uma quantidade eficaz das composições farmacêuticas da invenção que compreendem interferon-β (IFN-β) ou variante desse, tal como IFN^seri7, são úteis para o diagnóstico, prevenção, e tratamento (local ou sistêmico) de indicações clínicas responsivas à terapia com- esse polipeptídeo. Tais indicações clínicas incluem, por exemplo, distúrbios ou doenças do sistema nervoso central (SNC), cérebro, e/ou medula espinhal, incluindo doença de Alzheimer, doença de Parkinson, demência de corpo de Lewy, esclerose múltipla, epilepsia, ataxia cerebelar, paralisia supranuclear progressiva, esclerose lateral amiotrópica, distúrbios afetivos, distúrbios de ansiedade, distúrbios compulsivos obsessivos, distúrbios de personalidade, distúrbios de déficit de atenção, distúrbios de hiperatividade de déficit de atenção, Síndrome de Tourette, Tay-Sachs, Nieman Pick, e esquizofrenia; dano ao nervo de distúrbios cerebrovasculares tal como acidente vascular no cérebro ou na medula espinhal, de infecção do SNC incluindo meningite e HIV, de tumores do cérebro e medula espinhal, ou de uma doença por priônios; doenças- auto-imunes, incluindo deficiência imune adquirida, artrite reumatóide, psoríase, doença de Crohn, síndrome de Sjogren, esclerose lateral amiotrópica, e lupus; e cânceres, incluindo de mama, próstata, bexiga, rim e cólon. A administração de IFN-β ou de suas muteínas a humanos ou animais pode ser liberada por via oral, intraperitonial, intramuscular, subcutânea, intravenosa, intranasal, ou por liberação pulmonar como considerado adequado pelo médico. A presente invenção também fornece um método para aumentar a estabilidade de um polipeptídeo em uma composição farmacêutica líquida, onde o polipeptídeo, que serve como o componente terapeuticamente ativo, exibe formação de agregado durante estocagem em uma formulação líquida. O método compreende a incorporação na composição farmacêutica líquida de uma base de aminoácido em uma quantidade suficiente para diminuir a formação de agregado do polipeptídeo durante estocagem da composição farmacêutica líquida, e um ácido substancialmente livre de sua forma de sal, um ácido em sua forma de sal, ou uma mistura de um ácido e sua forma de sal, onde o ácido serve como um agente de tamponamento para manter o pH da composição líquida em uma faixa aceitável, como previamente descrito nesta. A estabilidade crescente de um polipeptídeo ou variante desse pela incorporação de uma base de aminoácido, ou uma base de aminoácido mais um ou mais agentes estabilizantes adicionais descritos nesta, em combinação com o agente de tamponamento aqui revelado, quer dizer, um ácido substancialmente livre de sua forma de sal, a forma de saldo ácido, ou uma mistura de um ácido e sua forma de sal, leva a um aumento na estabilidade da composição farmacêutica líquida contendo polipeptídeo durante a estocagem. Assim, a invenção também fornece um método para aumentar a estabilidade de estocagem de uma composição farmacêutica líquida quando aquela composição compreende um polipeptídeo que forma agregados durante estocagem em uma formulação líquida. Por "estabilidade de estocagem crescente" entende-se que a composição farmacêutica exibe uma maior retenção do polipeptídeo ou de sua variante em sua conformação própria, não-agregada, biologicamente ativa durante estocagem, e assim, um menor declínio na eficácia terapêutica, do que uma composição farmacêutica líquida preparada na ausência de uma base de aminoácido, ou uma base de aminoácido mais um ou mais dos agentes estabilizantes adicionais descritos nesta, em combinação com o agente de tamponamento aqui descrito. A estabilidade de estocagem de composições farmacêuticas contendo polipeptídeos feitas de acordo com os métodos da invenção pode ser avaliada usando procedimentos padrão conhecidos na técnica. Tipicamente a estabilidade de estocagem de tais composições é avaliada usando perfis de estabilidade de estocagem. Esses perfis são obtidos pela monitoração de mudanças na quantidade de polipeptídeo presente em sua forma molecular biologicamente ativa, não-agregada, e sua potência pelo tempo em resposta à variável de interesse, tal como concentração de pH, agente estabilizante, concentração de agente estabilizante, etc., como demonstrado nos Exemplos abaixo. Esses perfis de estabilidade podem ser gerados em várias temperaturas representativas de possíveis condições de estocagem, tal como temperatura de congelamento, temperatura refrigerada, temperatura ambiente, ou temperatura elevada, tal como 40-50 °C. A estabilidade de estocagem é então comparada entre perfis por determinação, por exemplo, de meia-vida da forma molecular biologicamente ativa, não-agregada do polipeptídeo de interesse. Por "meia-vida" entende-se o tempo necessário para uma diminuição de 50% na forma molecular biologicamente ativa, não-agregada do polipeptídeo de interesse. As composições que compreendem base de arginina e um ácido substancialmente livre de sua forma de sal preparadas de acordo com os métodos da presente invenção terão uma meia-vida que é de pelo menos duas vezes a cerca de dez vezes maior, preferivelmente pelo menos cerca de três vezes a pelo menos cerca de dez vezes maior, mais preferivelmente pelo menos cerca de quatro vezes a cerca de dez vezes maior, e mais preferivelmente pelo menos cerca de cinco vezes a cerca de dez vezes maior que a meia-vida de uma composição líquida preparada na ausência de uma base de aminoácido, ou uma base de aminoácido mais um ou mais dos agentes estabilizantes adicionais descritos nesta, em combinação com um ácido substancialmente livre de sua forma de sal, a forma de sal do ácido, ou uma mistura de um ácido e sua forma de sal. Para os objetivos da presente invenção, uma composição farmacêutica tendo estabilidade de estocagem aumentada como um resultado de estar prepara de acordo com a presente invenção é considerada uma composição farmacêutica "estabilizada". Tal composição estabilizada preferivelmente possui uma data de validade de pelo menos cerca de 18 meses, mais preferivelmente pelo menos 20 meses, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 22 meses, e o mais preferível é de pelo menos cerca de 24 meses quando estocada a 2-8°C.

Os seguintes exemplos são oferecidos por via de ilustração e não por via de limitação.

EXPERIMENTAL O IL-2 é um mitógeno potente que estimula a proliferação de células-T. ele tem uma ampla aplicação terapêutica como um tratamento para metástases cancerosas, como um adjuvante para terapia de câncer e como um agente em conjunção para doenças infecciosas.

Com o progresso de vários experimentos clínicos usando terapia com IL-2, foi percebido que o desenvolvimento de uma formulação líquida estável para essa proteína é altamente desejável. Tal formulação deve ser mais versátil que as formulações liofilizadas tradicionais, já que elas podem ser fornecidas em diferentes forças de acordo com os vários regimes de dosagem. Uma formulação líquida seria também mais conveniente para administrar, já que nenhuma reconstituição seria necessária. Tal formulação pode ser fornecida em seringas preenchidas prontas para uso, ou como preparações de multidose, se acreditar que são compatíveis com os agentes bacteriostáticos.

Foi relatado que a IL-2 em formulações líquidas se degrada por meio de pelo menos três caminhos durante a estocagem: agregação, oxidação de metionina, e desamidação (Kunitani e cols. (1986) J. Chromatography 359:391-401; Kenney e cols. (1986) Lymphokine Res. 5:523-527) . Em adição, o IL-2 é suscetível a dano agudo causado pelo congelamento e stress de cisalhamento mecânico. Dessa forma, o desenvolvimento de formulação de IL-2 necessita avaliar tanto o dano agudo como a degradação crônica.

Consequentemente, uma formulação de rhIL-2 monomérica, nova estável foi desenvolvida. Nessa formulação as moléculas de proteína estão presentes em solução na sua forma de monômero, não em uma forma agregada. Portanto oligômeros ou agregados covalentes ou hidrofóbicos de rhlL-2 não estão presentes. A formulação contém vários agentes estabilizantes, de forma mais importante arginina e metionina, para estabilizar a proteína contra danos físicos e químicos tal como agregação, oxidação de metionina, e desamidação durante estocagem de longo termo. Em adição, um tensoativo não-iônico, polissorbato 80, foi incluído na formulação para impedir a proteína de dano agudo causado pelo congelamento-descongelamento e stress de cisalhamento mecânico. Como mostrado nos exemplos a seguir, a adição de agentes estabilizantes da invenção â formulação de rhIL-2 aumenta sua estabilidade de estocagem. A molécula de IL-2 usada nesses exemplos é a muteína recombinante humana de IL-2, aldesleucina, com cisteína-125 substituída por serina (des-alanil-1, serina-125 interleucina-2 humana). Ela é expressa a partir de E. coli, e purificada subseqüentemente por diafiltração e cromatografia de troca catiônica como revelado na Patente U.S. 4.931.543. O volume purificado para uso de desenvolvimento foi de cerca de 3 mg/ml de IL-2 e foi formulado em 10 mM de citrato de sódio em pH 6,0, 200-250 mM de NaCl (o tampão de conjunto de CM) ou em um tampão contendo 10 mM de succinato de sódio em pH 6,0 e 150 mM de L-arginina.

Inibidor de via de fator tecidual (TFPI) é uma outra proteína que exibe degradação pela agregação durante estocagem em uma formulação farmacêutica (Chen e cols. (1999) J. Pharm. Sei. 88:881-888). O Exemplo 8 abaixo é direcionado a formulações líquidas que demonstram a eficácia do uso de um ácido em sua forma de base livre para diminuir a formação de agregado e um sistema de tampão fornecido por um ácido substancialmente livre de sua forma de sal.

Os seguintes protocolos foram usados nos exemplos para determinar o efeito de uma agente estabilizante particular sobre a degradação de IL-2 ou de TFPI, e portanto a estabilidade dessa proteína durante estocagem em formulações líquidas.

Medições de Absorvência de UV

A absorvência de UV de soluções de proteína foi medida usando um espectrômetro Hewlett Packard Diode Array (Modelo 8452). O instrumento foi apagado com o tampão de formulação adequado. Absorvência a 280 nm foi registrada usando um cadinho de quartzo de 1,0 cm de comprimento. O coeficiente de extinção de 0,70 (mg/ml) ^cm'1 foi usado para converter os dados de absorvência para concentração de IL-2 em mg/ml. HPLC-RP O HPLC-RP foi realizado em um sistema Waters 626 LC equipado com um autosampler 717 (Waters Corporation, Milford, Maine) usando uma coluna Vydac 214BTP54C4 e uma pré-coluna Vydac 214GCC54 (Separations Group, Hesparia, Califórnia). As colunas foram inicialmente equilibradas com uma fase A móvel (10% acetonitrila, 0,1% TFA) . Então 20 μ9 de uma amostra de IL-2 foram carregados, e a proteína foi eluída pela aplicação de uma fase B móvel (100% acetonitrila, 0,1% TFA) de 0 a 100% em 50 minutos em uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min. As espécies solúveis principais de IL-2 foram eluídas em aproximadamente 32 minutos e detectadas por UV de 214 nm usando um detector Waters 486. A aquisição de dados e processamento foram realizados em um sistema de Turbochrom Perkins-Elmer (PE Nelson, Cupertino, Califórnia).

Esse método de HPLC-RP detecta as espécies monoméricas principais de IL-2 como o pico B, uma espécie oxidativa de metionina (principalmente Met104 oxidada) como pico A, espécies desamidadas (provavelmente Asn88) como o pico B' , e outras espécies desconhecidas que são eluídas antes ou depois que esses picos.

HPLC-SEC O HPLC de exclusão de tamanho foi realizada em uma coluna TOSOHAAS G20 0 0SWxl e uma coluna TSK SWxl guard (TOSOHAAS, Montgomeryville, Pennsylvania). Uma fase móvel única contendo 10 mM de fosfato de sódio em pH 7 e 200 mM de sulfato de amônio foi aplicada em uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min. As espécies de monômero de IL-2 foram eluídas em aproximadamente 14 minutos e detectadas por UV de 214 nm usando um detector Waters 486. A aquisição de dados e processamento foram realizados em um sistema de Turbochrom Perkins-Elmex.

Usando um protocolo de HPLC-SEC nativo especialmente desenvolvido para monitorar IL-2, a rhIL-2 eluida principalmente como uma espécie única, provavelmente na forma monomérica já que a adição de agentes de dissociação de agregação, tais como SDS, uréia, e DTT, não afetaram a eluição dessa espécie.

HPLC-IEX HPLC de troca iônica HPLC-(IEX) foi realizada em uma coluna de vidro Pharmacia Mono-S. HR 5/5 usando um sistema de Waters 626 LC com um autosampler 717 aquecedpr/resfriador como descrito em Chen e cols. (1999) J. Pharm. Sei. 88:881-888. A coluna foi equilibrada com 80% de fase A móvel (70:30 v/v, 20 mM acetato de sódio: acetonitrila em pH = 5,4) e 20% fase B móvel (70:30 v/v, 2 0 mM acetato de sódio e 1 M cloreto de amônio:acetonitrila em pH = 5,4) . Depois da injeção, TFPI recombinante humano foi eluído pelo aumento de fase B móvel para 85% em 21 minutos em uma taxa de fluxo de 0,7 ml/minuto. O rhTFPI eluído em aproximadamente 16,5 minutos como um único pico e foi detectado pela absorvência de UV em 280 nm com um detector de absorvência Waters 486. A aquisição de dados e processamento foram realizados em um sistema de Turbochrom Perkin-Elmer. A concentração de proteína foi estimada pela integração da área de pico e comparação dela com uma curva padrão gerada de amostras de concentrações conhecidas.

SDS-PAGE O SDS-PAGE foi realizado de acordo com o protocolo de Laemmli. Cerca de 5 μg de IL-2 foram carregados em cada linha de um gel pré-moldado de Tris-glicina Norvex 18% e eletroforese foi realizada em 100 volts. Bandas de proteínas foram coradas pelo corante azul de Coomassie e foram analisadas por um densiômetro Molecular Dynamics equipado com o sistema Imagequan T (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Califórnia).

Proliferação de Célula HT-2 e Corante MTT para Bioatividade de IL-2 A potência de IL-2 foi determinada por um bioensaio in vitro usando proliferação de células HT-2 e corante MTT (Gillis e cols. (1978) J. Immunology. 120:2027-2032; Watson (1979) iJ. Exp. Med. 150(6) :1510) . De forma breve, 1 x 104 de células HT-2 de murídeo, que eram dependentes de IL-2 para crescimento, foram carregadas em uma cavidade de placa de cultura de tecido contendo padrões, controles ou amostras. Depois de 22 a 26 horas de incubação a 37°C, corante MTT foi adicionado nas cavidades e a incubação foi continuada a 37 °C por 3 a 4 horas. Então 20% de SDS foram adicionados para descoloração de um dia para o outro em temperatura ambiente. A absorvência das cavidades foi lida em 570 nm e convertida para a bioatividade de IL-2 baseada nos padrões internacionais WHO.

Medições de pH e de Osmolaridade O pH de solução das várias formulações foi medido por um contador de pH de Orion (Modelo 611, Orion Research Incorporated Laboratory Products Group, Boston, Massachusetts). O contador de pH foi calibrado pelo procedimento de calibração de dóis tampões sugeridos pelo fabricante usando um padrão de pH = 4 (Fisher Scientific, Cat. No. SB101-500) e um padrão de pH = 7 (Fisher Scientific, Cat. No. SB107-500). A osmolaridade de solução dessas formulações foi medida por um Vapor Pressure Osmometer de Wescor (Modelo 5500, Wescor Inc., Logan, Utah). O osmômetro foi calibrado por dois padrões fornecidos pelo fabricante: padrão 290 mmol/kg (Wescor, Reorder No. OA-OIO) e padrão 1.000 mmol/kg (Wescor, Reorder No. OA-029).

Esses protocolos foram usados para quantificar os efeitos de vários agentes estabilizantes sobre a degradação de rhIL-2 via agregação de proteína, oxidação de metionina e desamidação.

Exemplo 1: Efeitos de Vários Agentes solubilizantes sobre a Agregação de Proteína e Estabilidade de Estocagem de rh.IL-2 A agregação de proteína é a principal via de degradação para rhIL-2 em meio líquido variando em condições de pH de levemente ácido a alcalino. O rhIL-2 em soluções formuladas com essas condições de pH, quando estocadas em temperaturas elevadas, rapidamente resulta em agregação de proteína, que leva a uma precipitação visível. A proteína precipitada visível é removida por filtração através de um filtro de 0,2 μτη. A* proteína solúvel remanescente em solução pode ser quantificada por uma variedade de ensaios analíticos tais como HPLC-RP, HPLC-SEC, e absorvência de UV. A agregação também resulta em uma diminuição na bioatividade, que pode ser determinada pelo bioensaio in vitro descrito nessa.

Usando os procedimentos analíticos aqui descritos, a estabilidade de estocagem de rhIL-2 sob condições severas foi seguida por monitoração de mudanças na quantidade de rhIL-2 solúvel como uma função de tempo de incubação em temperatura elevada. IA. Efeitos de Açúcares e Aminoácidos O efeito de açúcares na estabilidade de estocagem de rhIL-2 foi examinado para sorbitol, sacarose, e manitol em formulações contendo 0,2 mg/ml de rhIL-2, 10 mM de succinato de sódio em pH = 6, e 270 mM de um desses açúcares. A quantidade de rhIL-2 solúvel remanescente em amostras estabilizadas foi colocada em gráfico contra tempo de incubação como mostrado na Figura 1. As curvas de sacarose e manitol sobrepostas uma sobre a outra indicam que seus efeitos sobre estabilidade de estocagem de IL-2 são similares. A curva para sorbitol é levemente mais alta que a dos dois outros açúcares, sugerindo que o sorbitol possui um efeito de estabilização levemente maior que dos outros dois açúcares. O efeito de aminoácidos na estabilidade de estocagem é mostrado na Figura 2. As formulações continham 0,1 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio em pH = 6, e 150 mM de uma dos nove aminoácidos escolhidos. Como mostrado na Figura 2, a classificação de estabilidade é Arg >Asp>Lys>Met>Asn>Leu=Ser=Pro=Gly. O efeito estabilizante de sorbitol e arginina foi confirmado em estudos adicionais, que mostraram que a estabilidade de estocagem de rhIL-2 foi afetada em um modo dependente de concentração. Assim, a estabilidade de estocagem de rhIL-2 é aumentada quando a concentração de sorbitol é aumentada de 50 mM para 150 mM, e finalmente para 270 mM (Figura 3) . De modo similar, a estabilidade de estocagem de rhIL-2 aumenta com concentrações crescentes de arginina na formulação (Figura 4) . l.B. Efeito de pH da Formulação Os perfis de PH de estabilidade de estocagem de rhIL-2 em formulações contendo NaCl, sorbitol, e arginina foram examinados. As meias-vidas para a IL-2 solúvel remanescente a 50°C são colocadas em gráfico contra o pH na figura 5. A meia-vida (ti/2) foi aqui definida como o tempo necessário para uma diminuição de 50% em proteína solúvel nas amostras de estabilidade. Meias-vidas maiores indicam maior estabilidade de estocagem.

Como mostrado na Figura 5, o pH ótimo para estabilizar rhIL-2 contra agregação de proteína depende do agente estabilizante presente na solução. Estabilidade de estocagem máxima de rhIL-2 em NaCl é alcançada em pH = 4, onde rhIL-2 tem uma meia-vida a 50°C de aproximadamente 23 dias. Formulações de rhIL-2 em sorbitol mostram estabilidade aumentada a medida que o pH diminui, com a estabilidade máxima ocorrendo em pH = 5, onde a meia-vida a 50 °C é de cerca de 26 dias. A maior estabilidade (quer dizer, meia-vida mais longa) deve ser alcançada com arginina como o agente estabilizante, em uma formulação tendo um ph de cerca de 6,0, onde a meia-vida da proteína a 50 °C foi de cerca de 32 dias. Esses resultados sugerem que a arginina é um agente estabilizante de preferência em relação ao sorbitol ou NaCl, já que o ph ótimo para a estabilização da proteína ocorre em um pH fisiologicamente mais aceitável. l.C. Efeito de Sistema Tampão É quase um costume usar um sistema de tampão de 10 mM em uma formulação para fornecer um pH adequado e para manter uma certa quantidade de capacidade de tamponamento. Por exemplo, um pH de formulação de 5,8 pode ser alcançado pelo uso de 10 mM de uma mistura de ácido succínico e sua forma de sal, tal como succinato de sódio. Se tal sistema de tampão é selecionado, 150 mM de HCL de arginina mas não 150 mM de base de arginina, podem ser usados como o agente estabilizante primário na formulação, já que 150 mM de base de arginina impediríam o pH de ser ajustado para baixo para 5,8 pelos 10 mM de tampão.

No entanto, o HCl de arginina faz surgir uma maior osmolaridade do que a base de arginina. Assim, uma formulação contendo 150 mM de HCL de arginina ajustada ao pH = 5,8 com tampão de 10 mM de ácido succínico e succinato de sódio, está também próxima da isotonicidade, tendo uma osmolaridade de cerca de 253 mmol/kg, e uma meia-vida a 50 °C de cerca de 8 dias (Tabela 1) . Ainda uma maior concentração de arginina na formulação é desejável, já que a estabilidade de estocagem aumenta com o aumento nesse agente estabilizante. Quando a concentração de arginina é aumentada para 230 mM com adição de HCl de arginina e o pH é ajustado para 5,8 com 10 mM de tampão de ácido succínico e succinato de sódio, a meia-vida a 50°C é duplicada (cerca de 17 dias), a solução ainda é hipertônica, tendo uma osmolaridade de cerca de 372 mmol/kg.

Quando o ácido succínico serviu como o sistema de tamponamento para ajustar o pH da solução para 5,8 e a arginina estava presente como base de arginina, a concentração crescente de base de arginina para 230 mM resultou em uma duplicação similar da meia-vida a 50°C, aumentando ela para cerca de 16 dias. No entanto, esse aumento na estabilidade de estocagem foi atingido enquanto a solução é mantida próxima de isotônica, com a formulação tendo uma osmolaridade de cerca de 271 mmol/kg (veja Tabela 1) . Desse modo, 23 0 mM de base de arginina poderíam ser usados na formulação para aumentar a estabilidade de estocagem de rh.IL-2, sem exceder a isotonicidade da formulação.

Tabela 1: Osmolaridade de solução e estabilidade de estocagem de formulações de rhIL-2 » A estabilidade de estocagem é mostrada em meias-vidas (ti/2) para rhIL-2 solúvel remanescente medida por HPLC-RP depois de estocagem a 50°C. Formulações de HCl de arginina continham 0,5 mg/ml de rhIL-2, 1 mM EDTA, e 150 mM ou 23 0 mM HCl L-arginina e 10 mM de ácido succínico e succinato de sódio para ajustar o pH para 5,8. As formulações de base de arginina continham 0,5 mg/ml de rhIL-2, 1 mM EDTA, e 150 mM ou 230 mM de base de L-arginina e 81 mM ou 128 mM de ácido succínico para ajustar o pH para 5,8.

Formulação Osmolaridade ti/2 a 50°C (todas continham 1 mM EDTA (mmol/kg) (dia) em pH 5,8) 150 mM ArgHCl, 10 mM Succinato Na/ Ácido Succínico 253 8,0 150 mM ArgBase, 81 mM Ác. Succínico 253 9,9 230 mM ArgHCl, 10 mM Succinato/ Ácido Succínico 372 16,9 230 mM ArgBase, 128 mM Ác. succínico 271 16,0 Esses dois métodos de ajuste de pH foram examinados com outros sistemas de tampão (Tabela 2). Quando 150 mM de HCl de arginina foram usados na formulação e o pH foi ajustado para 5,8 por 10 mM de um ácido e seu sal de sódio, todas as formulações estavam abaixo da isotonicidade, que é aproximadamente de 290 mmol/kg. A meia-vida a 50 °C para a rhIL-2 nessas formulações variou de cerca de 15 a cerca de 20 dias. Quando 230 mM de base de arginina foram usados na formulação e o pH foi titulado para 5,8 usando um ácido substancialmente, livre de sua forma de sal como o sistema de tampão, as formulações tendo um pH ajustado com ácido cítrico ou ácido succínico mostraram osmolaridades de solução ainda abaixo da isotonicidade, enquanto outras formulações estavam levemente abaixo da isotonicidade, como no caso de ácido fosfórico, ou hipertônicas, como no caso do ácido glutâmico ou acético. No entanto a meia-vida a 50°C para todas as formulações foi aumentada para acima de 30 dias. Assim, pelo uso de ácido cítrico ou ácido succínico, ambos substancialmente livres de suas formas de sal, como o sistema de tampão, a concentração de arginina poderia aumentar a 230 mM usando base de arginina, resultando em estabilidade de estocagem aumentada de rhlL-2 .

Tabela 2: Osmolaridade de solução e estabilidade de estocagem de formulações de rhIL-2. A estabilidade de estocagem é mostrada em meias-vidas (ti/2) para rhIL-2 solúvel remanescente medida por HPLC-RP depois de estocagem a 50°C. Todas as formulações continham 0,2 mg/ml de rhIL-2, 5 mM de metionina, 1 mM de EDTA dissódico, 0,1% polissorbato 80 e 150 mM de HCl L-arginina, com pH ajustado para 5,8 por 10 mM de um ácido e seu de sal de sódio ou 230 mM de base de L-arginina com pH ajustado para 5,8 por titulagem com um ácido substancialmente livre de sua forma de sal.

Formulação Osmolaridade tx/2 (mmol/kg) (dia) 150 mM ArgHCl, 10 mM Citrato de 248 20,5 Sódio/Ac. Cítrico 230 mM ArgBase, 86 mM Ácido Cítrico 228 36,1 150 mM ArgHCl, 10 mM Succinato de 257 19,1 Sódio/Ac. Succínico 230 mM ArgBase, 128 mM Ácido Succínico 285 29,2 150 mM ArgHCl, 10 mM Fosfato de 260 15,6 Sódio/Ac. Fosfórico 230 mM ArgBase, 193 mM Ácido Fosfórico 329 29,9 150 mM ArgHCl, 10 mM Glutamato de 264 14,6 Sódio/Ac. Glutâmico 230 mM ArgBase, 225 mM Ácido Glutâmico 407 47,5 150 mM ArgHCl, 10 mM Acetato de 259 20,8 Sódio/Ac. Acético 230 mM ArgBase, 250 mM Ácido Acético 408 31,9 1.D. Efeito de Concentração de Proteína O efeito de concentração de proteína na estabilidade de estocagem foi examinado em uma formulação contendo 10 mM de succinato de sódio em pH = 6 e 150 mM de arginina. Como mostrado na Figura 6, na qual a meia-vida a 50°C para rhlL-2 solúvel foi colocada em gráfico contra a concentração inicial de proteína, a estabilidade de estocagem de rhIL-2 aumenta à medida que a concentração de proteína diminui. Esse achado está de acordo com a observação experimental de que a agregação é a principal via de degradação para rhIL-2 em formulações líquidas. l.E. Efeito de Tensoativo Não-Iônico Polissorbato 80 O efeito de polissorbato 80 (Tween 80m ou Tw 80) na estabilidade de estocagem de rhIL-2 foi testado em uma formulação contendo 0,5 mg/ml de IL-2, 230 mM de base de arginina, 128 mM de ácido succínico para ajustar o pH para 5,8, 1 mM de EDTA e 0,002, e 0,1% polissorbato 80. Como mostrado na Tabela 3, ambas as formulações contendo polissorbato 80 exibem uma redução na meia-vida de IL-2 solúvel a 50°C, de 16 dias para cerca de 9 dias como medido por HPLC-RP. Assim, a inclusão de polissorbato na formulação deve ser percebida como desfavorável baseado apenas em seu efeito sobre a agregação de proteína. No entanto, esse agente tem um efeito estabilizante contra dano agudo à proteína associado com congelamento-descongelamento e cisalhamento mecânico que é benéfico durante processamento de formulações líquidas contendo essa proteína, como revelado nos exemplos abaixo. A estabilidade de estocagem de duas formulações baseadas em sorbitol foi também examinada. Embora suas meias-vidas por HPLC-RP e bioatividade fossem comparáveis a das formulações de arginina, as meias-vidas estimadas por HPLC-SEC forma muito menores, sugerindo que uma maior porção da proteína de rhIL-2 nessas formulações está provavelmente presente em formas de agregados solúveis. Tabela 3 : Meias-vidas (ti/2) ou rhIL-2 solúvel restante (pico B) medidas por HPLC-RP, HPLC-SEC, e o bioensaio in vitro em formulações de rhIL-2 estocadas a 50°C.

Formulação tx/2 a 50°C (dia) (todas em pH = 5,8 e 1 mM EDTA) ______________________ RP SEC Bioatividade 230 mM ArgBase, 128 mM Ác. Succ., pH 5,8 16,0 21,3 25,6 230 mM ArgBase, 128 mM Ác. Succ., 0,02% Tw 80, pH 5,8 9,7 12,4 NA 230 mM ArgBase, 128 mM Ác. Succ., 0,1% Tw 80, pH 5,8 9,1 12,2 24,5 270 mM sorbitol, 10 mM NaSuc, 0,1% Tw 80, pH 4,5 31,7 3,6 NA 270 mM sorbitol, 10 mM NaSuc, 0,1% Tw 80, pH 5,0 14,4 2,4 21,3 Na Tabela 3, a meia-vida para uma formulação de rhIL-2 base de arginina-ácido succínico como determinada pelo método de . HPLC-RP foi levemente menor que aquela determinada pelo método HPLC-SEC, e é muito menor que aquela determinada pelo método de bioensaio in vitro. A eluição da principal espécie de rhIL-2 em HPLC-SEC foi avaliada para também examinar essas diferenças. Amostras com ou sem tratamento de SDS, uréia, e DTT mostraram nenhuma mudança no tempo de eluição para as principais espécies, indicando que a rhIL-2 nessas formulações estava presente como uma espécie monomérica. No entanto o protocolo de HPLC-SEC pode não ser capaz de distinguir outras espécies monoméricas, por exemplo, as espécies oxidativas de metionina de pico A, das principais espécies intactas monoméricas, as espécies de pico B. Dessa forma, uma pequena diferença na determinação da meia-vida seria esperada. O bioensaio in vitro usado para determinar a bioatividade nos dados apresentados na Tabela 3 foi realizado com 0,1% SDS no diluente de ensaio. Assim, antes da aplicação de amostras à placa de cultura de tecido para interagir com células HT-2 de murídeo, as amostras foram diluídas com diluente de ensaio contendo 0,1% SDS. É possível que aquela diluição com SDS tenha dissociado algum agregado de rhIL-2 nessas amostras de volta à forma monomérica, resultando em uma sobre-estimativa da bioatividade. de uma formulação dada. Dessa forma, amostras de estabilidade foram analisadas usando diluente de ensaio com ( + S) e sem (-S) a adição de SDS. As amostras foram também analisadas com (+F) e sem (-F) um tratamento de filtração de 0,2 μτη, já que a filtração é capaz de remover grandes agregados de proteína como avaliado por inspeção visual. Os valores de bioatividade medidos para amostras com esses tratamentos são mostrados na Tabela 4, junto com resultados de estabilidade de estocagem obtidos usando o protocolo de HPLC-RP para comparação. Os valores são apresentados como uma percentagem dos valores de bioatividade obtidos em amostras similares estocadas a -7 0 ° C .

Em geral, as formulações diluídas com SDS e não filtradas antes de contato com células HT-2 mostram valores de bioatividade maiores que aquelas formulações diluídas sem SDS no diluente de ensaio e filtradas antes da ocorrência do ensaio. Entre esses resultados de bioatividade, aqueles obtidos usando filtração e diluição com nenhum SDS são quase comparáveis com os resultados de HPLC-RP. Assim, esse método é recomendado para a verdadeira medição de bioatividade para rhIl-2 monomérica.

Tabela 4: Comparação de resultados entre análise de HPLC-RP para rhIL-2 solúvel e análise de bioensaio in vitro para amostras de estabilidade estocadas por 2 semanas a 40°C ou 5 0 ° C .

Todos os resultados são apresentados como percentagens daqueles obtidos para suas respectivas amostras de -70°C. As formulações continham 0,5 mg/ml de rhIL-2, 230 mM de base de arginina, 128 mM de ácido succínico em pH = 5,8 e 1 mM de EDTA, com (#1) e sem (#2) 0,1% de polissorbato 80. As amostras para o bioensaio foram tratadas com e sem uma filtração de 0,22 μπι antes da diluição usando diluentes com ou sem 0,1% de SDS.

Amostra % Bioatividade % RP HPLC (percentual para amostras -70°C) (percentual para amostras -70°C) -F+Sa +F + Sa -F- Sa +F-Sab #1 a 40 °C 106 100 104 100 101 #1 a 50 ° C 92 79 60 53 58 #2 a 40“C 101 69 106 112 98 #2 a 50 °C 60 38 62 47 42 a " - F" para não filtrada. U + F" para filtrada. "-S" para diluente sem SDS e "+S" para diluente com SDS. b Esse é o protocolo recomendado para IL-2 monomérica. l.F. Compatibilidade de Preservação A compatibilidade de preservação foi investigada na necessidade de se desenvolver uma formulação de multidose. O efeito de preservativos sobre a estabilidade de IL-2 foi avaliado em dois estudos acelerados. O Estudo 1 classificou benzil álcool, m-cresol, e fenol em uma formulação contendo 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio em pH = 6 e 160 mM de base de arginina. O Estudo 2 classificou cloreto de benzetônio, cloreto de benzalcônio, metil parageno/propil parabeno, e clorobutanol em uma formulação contendo 0,2 mg/ml de IL-2, 230 mM de base de arginina, 128 mM de ácido succínico em pH = 5,8, 1 mM de EDTA dissódico, 0,1% de polissorbato 80. As meias-vidas para rhIl-2 solúvel medidas por HPLC-RP para essas formulações estocadas a 40°C estão presentes na Tabela 5.

Todos os preservativos testados diminuíram a estabilidade de rhIL-2 na temperatura elevada. No estudo 1, a meia-vida para rhIl-2 solúvel era de cerca de 74 dias a 40°C sem qualquer um dos preservativos. A adição de benzil álcool ou m-cresol ou fenol reduziu a meia-vida significativamente em 5 a 10 vezes. No estudo 2, os efeitos dos preservativos foram muito menos intensos. A meia-vida para rhIl-2 solúvel diminuiu menos que a metade para o cloreto de benzetônio e diminuiu mais que 2 vezes para outros preservativos. No total, o cloreto de benzetônio tem a menor redução na estabilidade de rhIl-2 entre os preservativos testados.

Tabela 5: Meia-vida (ti/2) de rhIL-2 solúvel a 40°C para formulações contendo preservativos.

Estudo 1: as formulações continham 0,2 mg/ml de rhlL- 2, 10 mM de succinato de sódio em pH = 6, 150 mM de L- arginina e preservativos. Estudo 2: as formulações continham 0,2 mg/ml de rhIL-2, 230 mM de base de L-arginina, 128 mM de ácido succínico em pH = 5,8, 1 mM de EDTA dissódico, 0,1% de polissorbato 80, e preservativos.

Preservativo t,±/2 a 40°C (dia) Estudo 1 Sem preservativo 74,0 Benzil álcool 0,9% (p/v) 16,0 m-cresol 0,25% (p/v) 7,5 fenol 0,5% (p/v) 11,0 Estudo 2 Sem preservativo 261,0 Cloreto de benzetônio 0,01% (p/v) 185,0 Cloreto de benzalcônio 0,01% (p/v) 67,0 Metil parabeno 0,18% (p/v) e propil para- beno 0,02% (p/v) 113,0 Clorobutanol 0,5% (p/v) 84,0 Embora os preservativos tivessem um efeito desestabilizador pronunciado sobre rhIL-2 na temperatura elevada, seus efeitos sobre a estabilidade de estocagem de curto tempo de rhIL-2 a 4°C ou 25 °C foram também examinados. Um novo estudo foi realizado para examinar seis preservativos na mesma formulação contendo 0,2 mg/ml de rhIL-2, 230 mM de base de L-arginina, 128 mM de ácido succínico, 1 mM de EDTA, 5 mM de metionina, e 0,1% de polissorbato 80 em pH = 5,8. A Tabela 6 relata os resultados da quantidade de rhIL-2 solúvel retida depois de um ano de estocagem. Todas as formulações, quando comparadas à de controle, mostram nenhuma perda significativa no nível de rhIL-2 solúvel tanto por HPLC-RP como pelo bioensaio in vitro, com a exceção da formulação contendo 0,25% de m-cresol, que mostrou perda detectável. Tabela 6: Estabilidade de estocagem de um ano de formulação contendo preservativo a 4°C ou 25°C apresentada em percentagem de rhIL-2 solúvel restante total como determinado pelas áreas pico integrado de HPLC-RP e pela bioatividade in vitro. A formulação de controle continha 0,2 mg/ml de IL-2, 230 mM de base de L-arginina, 128 mM de ácido succínico, 1 mM de EDTA, 5 mM de metionina, e 0,1% de polissorbato 80 em pH = 5,8.

Preservativo % de IL-2 inicial Bioatividade In Vitro por RP-HPLPC (x 10° IU/ml) 4 ° C 2 5 °C t = 0 1 ano/4 °C 25°C/I ano Controle 102 93 3,8 3,3 2,5 Benzil álcool 0,9% 100 88 4,8 4,0 5,0 m-cresol 0,25% 98 60 5,8 2,6 2,5 fenol 0,5% 99 87 4,7 3,9 3,2 Cloreto de benzal- cônio 0,01% 102 93 5,5 3,9 4,4 Cloreto de benze- tônio 0,01% 98 89 5,4 3,2 4,7 Clorobutanol 0,5% 99 91 5,1 3,6 4,5 Exemplo 2 : Efeitos de Vários Fatores sobre Oxidação de Metionina e Estabilidade de Estocagem de rhIL-2. A oxidação de metionina em IL-2 foi caracterizada previamente (Kunitani e cols. (1986) J. Chromatography 359:391-402; Sasaoki e cols. (1989) Chem. Pharm. Bull. 37(8) :2160-2164) . A IL-2 tem quatro resíduos de metionina nas posições de resíduo 23, 39, 36 e 104 na cadeia polipeptídica. Entre esses, Mct104 está sobre a superfície de proteína e é mais oxidativo. Essas espécies oxidativas de metionina podem ser resolvidas como uma espécie de eluição precoce (pico A) para a espécie principal de IL-2 (pico B) do cromatograma de HPLC-RP. Met23 e Met39 são menos passíveis de oxidação, que ocorre apenas sob condições oxidativas extremas, provavelmente devido a sua existência no interior da molécula de proteína. Espécies oxidativas desses resíduos de Met podem eluir como espécies mais precoces do que a Met104 em HPLC-RP. A Met46 está enterrada profundamente no interior da molécula de proteína e não é facilmente oxidada a menos que a proteína se desdobre completamente. A. investigação de oxidação de metionina em IL-2 concentrada em oxidação de Met104, já que ele é o resíduo de metionina mais suscetível à oxidação, e a prevenção de sua oxidação irão também evitar a oxidação de outros resíduos de metionina.

2A. Efeito de pH A oxidação de metionina foi estudada em uma escala de pH de 3 a 9 em formulações contendo 0,2 mg/ml de IL-2, 150 mM de NaCl > e 10 mM de várias espécies de tampão. A oxidação de metionina nessas formulações foi examinada pela quantificação de percentagem da espécie de pico A (quer dizer, a espécie oxidada de Met104) em amostras de IL-2 em meses t=0 e t=3. Como relatado na Tabela 7, o efeito de pH não é percebido em t=0 exceto na amostra tamponada por citrato em pH = 6. Comparada com outras amostras, que têm 5% das espécies de pico A, a amostra de citrato mostrou um aumento no nível de pico A para 6%.

Nos meses t = 3, o nível de pico A está aumentado em condições de pH mais alto, sugerindo um mecanismo de base catalisada para oxidação de metionina de Met104. Em pH = 6, o succinato é um melhor tampão que o citrato na minimização de oxidação de metionina, já que valores mais baixos de pico A são observados na formulação de succinato.

Tabela 7: Análise de HPLC-RP de oxidação de metionina, expressa como uma percentagem da quantidade total de IL-2 solúvel (pico A + pico B) presente como a espécie de pico A de metionina oxidada (% de pico A de IL-2 solúvel total) para amostras de formulação de pH 3 a pH 9 em meses t = 0 e 3 .

As formulações continham 0,2 mg/ml de IL-2, 150 mM de NaCl, e pH ajustado por 10 mM de várias espécies de tampão. Tampão e pH % Pico A da IL-2 solúvel total t=0 t= 3 meses -70 °C 4 °C 25 °C 40 ° C

Glicina lOmM, pH 354 56 7 Acetato lOmM, pH 455 67 6 Acetato lOmM, pH 5 NA 7 89 9 Citrato 10mM, pH 6 6 6 8 12 14 Succinato 10mM, pH 656 74 9 Fosfato lOmM, pH 7 57 8 11 5 Borato lOmM, pH 9 5 11 15 14 NA 2.B. Efeito de EDTA, Polissorbato 20, Polissorbato 80, e MgCl2 Os efeitos de uma quelante de metal, dois tensoativos não-iônicos, e .um ion metálico divalente sobre a oxidação de metionina são relatados na Tabela 8. A presença de polissorbato 20 ou polissorbato 80 nas formulações aumentam o nível das espécies oxidativas de metionina em ambos meses t = 0 e t = l. Em contraste, EDTA e MgCl2 reduzem o nível de espécies oxidativas de metionina depois de 1 mês de estocagem a 40 e 50°C.

Tabela 8: Percentagem da quantidade total de IL-2 solúvel (pico A + pico B) presente como a espécie de pico A de metionina oxidada (% de pico A) em amostras de IL-2 em meses t=0 e t=l. A amostra de controle continha 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio em pH =6, e 150 mM de arginina.

Formulação % Pico A (oxidação de metionina) t = 0 t= 1 mês - 7 0 b C 4 ° C 4 0 ° C 5 0 ° C

Controle 2,8 3,5 5,1 19,7 36,3 EDTA lmM 2,5 3,5 5,0 9,5 14,0 Polissorbato 80 0,1% 5,8 4,3 6,9 21,5 41,4 EDTA 1 mM + Polissorbato 80 0,1% 5,9 4,2 6,9 12,1 19,2 Polissorbato 20 0,1% 4,1 5,4 9,6 25,3 42,8 MgCl2 5 mM 3,9 4,8 6,9 9,7 12,1 2.C. Efeito de Metionina A adição de metionina em formulações para prevenir a IL-2 de oxidação de metionina foi investigada. A Tabela 9 relata mudança no· pico A e a quantidade total de IL-2 solúvel {pico A + pico B) para formulações contendo quantidades variáveis de metionina depois de 2 semanas de estocagem a 50°C. O aumento da concentração de metionina nas formulações reduz o nível do pico A significativamente tanto na semana t=0 como na semana t=2, enquanto a quantidade de IL-2 solúvel retida depois de 2 semanas de estocagem não é afetada. Em 5 mM de metionina, é observado um declínio de 3 vezes no pico A em semana t = 2 . Assim, a adição de metionina resulta em uma redução significativa na oxidação de metionina da proteína e possui um pequeno efeito na agregação de IL-2.

Tabela 9 : Mudança no pico A e na proteína solúvel total em amostras de IL-2 em semanas t=0 e t-2 a 50°C.

As formulações continham 0,2 mg/ml de IL-2, 230 mM de arginina, 128 mM de ácido succínico em pH = 5,8, 1 mM de EDTA, 0,1% de polissorbato 80 e 0 a 10 mM de metionina.

Formulação % Pico A % IL-2 restante (oxidação de metionina) t = 0 t= 2 sem. a 50°C t= 2 sem. a 50°C Sem metionina 2,1 6,3 76 Metionina 1 mM 1,4 2,7 77 Metionina 5 mM 1,2 2,1 77 Metionina 10 mM 1,2 1,9 76 Era adição aos resultados de alta temperatura, o nível de oxidação de metionina a 4°C e 25°C depois de 3 meses de estocagem para formulações com e sem 5 mM de metionina também foi registrado. Como mostrado na Tabela 10, a presença de 5 mM de metionina na formulação resulta em uma diminuição de 3 vezes no nível de pico A tanto a 4°C como a 25 °C. Assim, a adição de 5 mM de metionina preveniu de forma eficaz a oxidação de Met104.

Tabela 10: Nível de oxidação de metionina, expresso como uma percentagem da quantidade total de IL-2 solúvel (pico A + pico B) presente como a espécie de pico A de metionina oxidada (% de pico A de IL-2 solúvel total) e percentagem de IL-2 solúvel restante em amostras estocadas por 3 meses tanto a 4°C como a 25°C.

As formulações continham 0,2 mg/ml de IL-2, 230 mM de arginina, 128 mM de ácido succínico em pH = 5,8, 1 mM de EDTA, 0,1% de polissorbato 80 e 0 a 5 mM de metionina. Formulação % Pico A % IL-2 restante da IL-2 solúvel total (pico principal) 4 °C 25 °C 4 °C 25 °C 0 mM 2,7 4,1 101 97 5 mM 0,8 1,4 101 100 2.D. Efeito de Remoção de Oxigênio por Depuração de Nitrogênio e Desgaseificação A remoção de oxigênio em frascos de amostras de IL-2 para minimizar a oxidação de metionina foi testada. O ar no espaço superior em um frasco de 3 cc com uma amostra de 1 ml de IL-2 foi purificado com nitrogênio. O oxigênio molecular dissolvido foi removido por desgaseificação a vácuo. A Tabela 11 mostra a mudança no pico A e a quantidade total de IL-2 solúvel (pico A + pico B) depois de 1 semana de estocagem a 50°C para esses amostras. A depuração de nitrogênio isolada diminui levemente a percentagem de espécies de metionina oxidativas de 6,7% para 6,2%. A combinação de desgaseificação de solução e depuração de nitrogênio do espaço superior também reduz o nível de pico A em cerca de um ponto percentual. Por outro lado, a percentagem da quantidade total de IL-2 solúvel permanece não modificada com depuração de nitrogênio ou com desgaseificação.

Tabela 11: Mudança na percentagem da quantidade total de IL-2 solúvel (pico A + pico B) presente como a espécie de pico A de metionina oxidada (% de pico A) e na percentagem da quantidade total de IL-2 solúvel restante em amostras retiradas em semana t=0 e t=l a 50°C.

As formulações continham 0,3 mg/ml de IL-2, 230 mM de arginina, 128 mM de ácido succínico, 1 mM de EDTA e 0,1% de polissorbato 80.

Formulação % Pico A % IL-2 restante (oxidação de metionina) t = 0 t = 1 sem. a 50°C t = l sem. a 50°C Controle 3,1 6,7 81 Depuração de nitrogênio 3,1 6,2 82 Desgaseificação/ Depuração de nitrogênio 3,0 5,8 81 2.E. Efeito de Preservativos O efeito de preservativos sobre a oxidação de metionina foi examinado. A Tabela 12 mostra mudança no pico A para amostras de formulação com e sem um dos seis preservativos depois de 6 e 12 meses de estocagem a 4°C e a 25°C. Todas as formulações contendo preservativos mostraram nível similar de pico A para o controle indicando que os preservativos não têm efeito detectável sobre a oxidação de metionina exceto na formulação contendo 0,25% de m-cresol, que mostrou um aumento significativo no nível de pico A. Tabela 12: Percentagem da quantidade total de IL-2 solúvel (pico A + pico B) presente como a espécie de pico A de metionina oxidada (% de pico A)______em várias formulações contendo preservativos estocadas por 6 meses e 12 meses a 4 ° C e 25 ° C. A formulação de controle continha 0,2 mg/ml de IL-2, 230 mM de base de L-arginina, 128 mM de ácido succínico, 1 mM de EDTA, 5 mM de metionina, 0,1% de polissorbato 80, em um pH de 5,8.

Preservativo % Pico A (oxidação de metionina) t=0 6 meses 12 meses 4 ° C 2 5 ° C 4 ° C 2 5 ° C

Controle 1,5 -1,6 1,9 1,8 2,6 Benzil álcool 0,9% 1,6 1,7 2,3 1,9 3,3 m-cresol 0,25% 1,6 1,8 6,7 2,1 3,5 fenol 0,5% 1,6 1,7 2,4 1,8 3,6 Cloreto de benzal- cônio 0,01% 1,5 1,6 2,0 1,0 3,0 Cloreto de benze- tônio 0,01% 1,5 1,7 2,0 1,8 2,8 Clorobutanol 0,5% 1,5 1,6 2,0 1,8 3,2 Exemplo 3: Efeito de Vários Fatores sobre a Desamidação de IL-2 A desamidação de IL-2 foi relatada previamente (Kunitani e cols. (1986) J. Chroma.togra.phy 359:391-402) , Foi descoberto que Asp 88 é o sítio primário para desamidação em IL-2 (Sasaoki e cols. (1992) Chem. Pharm. Bull.

40(4) :976-980) . Espécies que passaram por desamidação podem ser detectadas por HPLC-RP como um pico de arco posterior (Pico B' ) para as espécies principais (pico B) . A desamidação de IL-2 foi estudada em formulações contendo arginina, NaCl e sorbitol. A Tabela 13 mostra que as espécies que passaram por desamidação podem ser detectadas apenas em formulações contendo sorbitol e NaCl, mas não em formulações contendo arginina, depois de incubação em temperaturas elevadas por 2 semanas. Dessa forma, a arginina estabiliza IL-2 contra degradação por meio de desamidação.

Tabela 13: Desamidação detectada por HPLC-RP de espécies de pico B' em formulações contendo 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio em pH = 6, e 150 mM de arginina, 150 mM de NaCl, ou 270 mM de sorbitol.

Formulação % Pico B' (Desamidação) em t = 0 e 2 semanas . t = 0 - 70 °C 4 0 ° C 50 ° C

NaSuc lOmM, Arg 150mM, pH 6 0 000 NaSuc lOmM, NaCl 150mM, pH 6 0 0 0 3 NaSuc lOmM, Sorbitol 270mM, pH 60 0 2 2 Exemplo 4: Efeito de Congelamento-Descongelamento na Estabilidade de IL-2 Dano à proteína induzido por congelamento é usualmente causado por três mecanismos: (1) a proteína tem uma conformação instável em temperaturas frias (desnaturação de frio); (2) a proteína é suscetível â desnaturação em interface gelo-água; (3) a proteína é danificada por mudanças na concentração de sal ou troca de pH sob congelamento.

No caso de IL-2, perda de proteína durante conge1amento-de scongelamento é provavelmente causada por desnaturação e agregação na interface gelo-água já que o tensoativo não-iônico polissorbato 80 protegeu de forma eficaz a IL-2 de dano pelo congelamento-descongelamento. Como mostrado na Figura 7, a quantidade de IL-2 solúvel diminui sob cada ciclo de congelamento-descongelamento em uma formulação contendo 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio em pH = 6, e 150 mM de arginina. A adição de polissorbato 80 na formulação aumenta a estabilidade de IL-2 contra múltiplos congelamentos-descongelamentos. Quando a concentração de polissorbato 80 atinge 0,05% e acima, a IL-2 é completamente protegida de dano por congelamento-descongelamento.

Exemplo 5: Efeito de Cisalhamento Mecânico sobre a Estabilidade de IL-2 5.1. Efeito de Polissorbato 8Ò, EDTA, Concentração de Proteína e Volume de Preenchimento Foram realizados estudos para examinar a perda, induzida por stress de cisalhamento, de IL-2 solúvel. Dois tipos de estresses de cisalhamento foram avaliados: agitação em um agitador Orbital (VWR Scientific, Cat. No. 57018-754) e turbilhonamento em um turbilhonador (Fisher Scientific, modelo Genie 2, com a velocidade ajustada em 4). Várias formulações de 1 ml de IL-2 foram preenchidas em frascos de 3 cc. Esses frascos foram estocados em um refrigerador (amostras de controle), colocada sobre uma bancada de laboratório de um dia para o outro (amostras estáticas) , agitadas a 200 RPM de um dia para o outro (amostras agitadas), ou turbilhonadas por um minuto (amostras turbilhonadas). A Tabela 14 mostra os resultados da mudança na quantidade de IL-2 solúvel para essas amostras.

Comparadas com as amostras de controle refrigeradas, tanto as amostras estáticas como as amostras agitadas mostraram nenhuma perda em IL-2. Assim, IL-2 é estável em temperatura ambiente e é estável ao tratamento por agitação. Por outro lado, quando essas formulações foram submetidas a um minuto de turbilhonamento, várias quantidades de perdas foram detectadas. As formulações contendo 0,1 a 0,5 mg/ml de IL-2 ou 1 a 5 mM de EDTA ou baixas concentrações de polissorbato 80 (0,005 a 0,05%) todas mostraram perda de 25-50% de IL-2 solúvel. Portanto, um minuto no turbilhonamento foi mais prejudicial que a agitação das moléculas de IL-2 de um dia para o outro. A perda de IL-2 podería ser prevenida pelo aumento da concentração de polissorbato 80 na formulação para 0,1% ou mais. Em adição, frascos completamente cheios com nenhum ar deixado no espaço superior também mostraram perdas mínimas de IL-2 solúvel sob 1 minuto de turbilhonamento, indicando que a interface ar-líquido era o principal fator que causava o dano.

Tabela 14: Mudança na percentagem da quantidade de IL-2 solúvel para amostras estocada em temperatura ambiente de um dia para o outro (Estática) , agitadas a 200 RPM de um dia para o outro (Agitação) e turbilhonadas por 1 minuto (Turbilhonamento) quando comparada com aquelas estocadas a 4 ° C. A formulação de controle continha 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio em pH = 6, e 150 mM de arginina. A formulação de lml foi colocada em frascos de vidro de 3 cc exceto pela amostra completamente preenchida, que tinha a amostra de controle completamente preenchida até o topo dos frascos de 3 cc, não deixando ar no espaço superior. A IL-2 solúvel foi quantificada por HPLC-RP.

Amostra % Restante de IL-2 solúvel (lml colocado em frascos de 3' cc) De um dia De um dia turbilho- para o outro para o outro namento estática agitando 1 min IL-2 0,2 mg/ml (controle) 99,6 100,8 74,7 IL-2 0,1 mg/ml 100,3 102,7 72,0 IL-2 0,5 mg/ml 99,7 101,0 68,6 EDTA 1 mM 97,6 101,2 59,6 EDTA 5 mM 99,3 102,7 72,2 Polissorbato 80 0,005% 100,6 100,0 46,5 Polissorbato 80 0,01% 99,7 100,4 66,1 Polissorbato 80 0,05% 99,3 100,3 93,9 Polissorbato 80 0,1% 99,2 100,0 89,0 Polissorbato 80 0,2% 99,3 99,2 99,8 Polissorbato 80 0,5% 99,1 98,4 99,7 EDTA lmM, Polissorbato 80 0,1% 99,6 100,1 99,8 Frascos completos cheios 99,4 100,1 96,5 5.2 Efeito de Arginina O efeito de arginina sobre a estabilidade de IL-2 contra dano pelo turbilhonamento é relatado na Tabela 15 . Concentração crescente de arginina de 150 mM a 230 mM resulta em um aumento de 3% na quantidade de IL-2 solúvel de 65% a 6 9% depois de submetê-la a um minuto de turbilhonamento. Assim, a arginina tem um efeito menor sobre a IL-2 contra dano de cisalhamento embora ela tenha mostrado previamente um grande efeito de estabilização sobre IL-2 contra degradação devido à formação de agregado. O efeito de polissorbato 80 na formulação de 230 mM de arginina foi testado. A adição em uma baixa concentração de polissorbato 80 (0,02%) desestabiliza IL-2 e a adição em uma alta concentração de polissorbato 80 (0,1%) estabiliza IL-2 contra dano por turbilhonamento.

Tabela 15: Percentual restante de IL-2 solúvel em várias formulações sob 1 minuto de turbilhonamento como analisado por HPLC-RP.

Formulação % IL-2 (todas contêm 0,5 mg/ml IL-2, exceto onde restante observado de outro modo) Arginina 150 mM, NaSuc 10 mM, EDTA 1 inM, pH 5,8 65,5 Arginina 150 mM, NaSuc 81 mM, EDTA 1 mM, pH 5,8 65,3 Arginina 230' mM, NaSuc 10 mM, EDTA 1 mM, pH 5,8 69,0 Arginina 230 mM, NaSuc 128 mM, EDTA 1 mM, pH 5,8 68,9 Arginina 230 mM, NaSuc 128 mM, EDTA 1 mM, Tw 80 0,02%, pH 5,8 55,1 Arginina 230 mM, NaSuc 128 mM, EDTA 1 mM, Tw 80 0,1%, pH 5,8 99,5 5.3. Estudo de Remessa Dano de cisalhamento sobre IL-2 durante a remessa do produto foi investigado em um estudo de remessa real. IL-2 foi preparada em uma formulação de arginina em uma formulação de NaCl, ambas com quantidades variáveis de polissorbato 80. Essas amostras de IL-2 foram enviadas sobre gelo por ar de Emeryville, Califórnia, para St. Louis, Missouri, e de St. Louis de volta a Emeryville. A Figura 8 mostra análise de HPLC-RP da quantidade de IL-2 solúvel nessas amostras. Sem a presença de polissorbato 80 na formulação, uma perda de cerca de 10% de IL-2 foi observada em ambas amostras formuladas com arginina e NaCl.

As diferenças de estabilidade entre a formulação de arginina e a formulação de NaCl são desprezíveis, cerca de 1%. Com a presença de polissorbato 80 na formulação, a perda de IL-2 foi reduzida. A 0,1% de polissorbato 80, nenhuma perda foi observada, indicando que a IL-2 estava completamente protegida nessa concentração de tensoativo. Assim, 0,1% de polissorbato 80 é eficaz na formulação para prevenir IL-2 de dano cisalhamento agudo durante a remessa.

Em conclusão, a arginina serve como o agente estabilizante primário em formulações farmacêuticas líquidas de IL-2 durante estocagem de longo termo para diminuir a agregação e desamidação de IL-2. Para adicionalmente aumentar a concentração de arginina na formulação, e assim para atingir uma maior estabilidade de IL-2 mas ainda manter a isotonicidade da solução, o ácido succínico é usado preferivelmente para titular a base de arginina para o pH = 5,8. Em adição, a metionina e EDTA podem ser incluídos na formulação para prevenir a oxidação de metionina da proteína. Finalmente, um tensoativo não-iônico, tal como polissorbato 80, pode ser incluído na formulação para prevenir a IL-2 de dano por congelamento-descongelamento e cisalhamento mecânico.

Exemplo 6: Teste de Eficácia de Preservativo Várias formulações contendo preservativos antimicrobianos foram submetidas a um teste de eficácia de preservativos de United States Pharmacopoeia (USP). Os resultados são apresentados na Tabela 16. A amostra de controle sem preservativo falhou no teste enquanto todas as formulações contendo um preservativo passaram no teste. Tabela 16: Teste de eficácia de preservativo USP para formulações de rhIL-2. A formulação de controle continha 0,1 mg/ml de rhIL-2, 230 mM de base de L-arginina, 128 mM de ácido succínico, 1 mM de EDTA, 5 mM de metionina, 0,1% de polissorbato 80, em um pH de 5,8.

PRESERVATIVO TESTE USP

Controle falhou Benzil álcool 0,9% passou Benzil álcool 1,3% passou Benzil álcool 1,7% passou Clorobutanol 0,5% passou Fenol 0,5% passou Exemplo 7: Propriedade de Produção de Dor Um modelo de rato desenvolvido na Universidade da Flórida, College of Dentistry, OMSDS Divisão de Neurociência, foi usado para avaliar as propriedades de produção de dor, mais particularmente a queimação e sensação em ferroada produzidas pelas formulações. O modelo é baseado em um ensaio de corrente induzida nas células sensoriais que carregam mensagens de dor. Para conduzir o ensaio, células sensoriais (glia de raiz dorsal de rato) são isoladas em uma câmara de registro. Os registros são feitos a partir de células individuais que são pré-selecionadas baseadas em critérios nociceptivos (indutores de dor). Dor em queimação, dor em ferroada, e pontuações de dor padronizadas são computadas para a formulação testada. Uma pontuação de dor em queimação é definida pela resposta à formulação de teste em relação capsaicina (500 nM). A capsaicina é bem conhecida por sua capacidade de produzir intensa dor em queimação em humanos (Cooper e cols. (1986) Pain 24:93-116). Uma pontuação de dor em ferroada é computada como a proporção da corrente produzida pela formulação de teste em relação aquela produzida por uma solução tamponada a um pH = 5,0. A pontuação de dor padronizada classifica a formulação em relação à solução salina normal (NaCl a 0,9%, não tamponada), uma substância parenteral hospitalar comum que é bem conhecida por produzir uma sensação de ferroada.

Uma formulação de base de L-arginina-ácido succínico foi submetida â análise de dor por meio desse modelo. Os resultados dessas duas soluções de teste são mostrados na Tabela 17. Baseado em pontuações calculadas para pontuações de dor em queimação, dor em ferroada, e de dor padronizada, a formulação de L-arginina-ácido succínico exibiu excelentes propriedades em comparação com solução salina normal. Foi observado que a corrente de teste diminuiu durante a aplicação da formulação (diminuição dependente de tempo) enquanto ela não diminuía com a solução salina normal. Isso demonstra quer essa formulação é melhor tolerada do que a solução salina como avaliado por esse ensaio.

Tabela 17: Pontuações de dor em queimação, de ferroada e padronizada para a formulação líquida e NaCL a 0,9%. A formulação líquida continha 23 0 mM de base de L-arginina, 128 mM de ácido succínico, 1 mM de EDTA, 5 mM de metionina, 0,1% de polissorbato 80, em um pH de 5,8.

Formulação Dor em Dor em Pontuação queimação ferroada padronizada de dor NaCl 0,9% 0,084+0,006 2,44+0,62 1,73±0,73 Formulação líquida de RrhIL-2 0,044+0,019 0,65±0,23 0,16±0,05 Exemplo 8: Estudos de Estabilidade com TFPI.

Estudos de estabilidade e solubil idade de TFPI em várias formulações têm demonstrado que a L-arginina é um estabilizante (dados não mostrados) para TFPI e espécies de tampão com carga tal como íons de citrato têm um efeito solubilizante mais profundo. Nesse estudo, os efeitos da concentração de L-arginina e sistema de tamponamento sobre estabilidade de TFPI em várias formulações foram examinados. Em particular, a influência de sistema de tamponamento na forma de um ácido substancialmente livre de sua forma de sal versus uma mistura de um ácido e sua forma de sal foi testada como previamente observado para formulações de IL-2 nos exemplos antecedentes.

Materiais e Métodos Uma solução de TFPI foi formulada a 0,6 mg/ml em 20 mM de citrato de sódio e 300 mM de L-arginina em pH = 5,5. Essa solução teve o tampão trocado por meio de diálise a 4 ° C usando as membranas Spectral Por #7 (MWCO 3,500,ID# 132-110) para várias formulações de L-arginina tamponadas para pH = 6,5 por sistema de tamponamento de citrato ou de succinato. Seguindo-se à diálise, a concentração de TFPI de cada solução foi medida usando espectroscopia de UV/Vis. Cada solução foi então diluída para 0,15 mg/ml usando o tampão adequado. As soluções preparadas foram então divididas em alíquotas (de 1 ml cada) em frascos de 3cc para estocagem de estabilidade. Frascos suficientes foram reservados nesse ponto para o ponto de tempo t = 0 . O resto dos frascos foi colocado em um incubador a 50°C para um estudo de estabilidade acelerada. Os pontos de tempo foram então tomados em 3, 7, 14 e 30 dias. Para análise em cada ponto de tempo, os conteúdos de cada frasco foram transferidos, para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml e então centrifugados a 10K rpm por aproximadamente 2 minutos. O sobrenadante centrifugado das amostras foi retirado dos tubos para análise usando HPLC-IEX (descrição necessária) , que era conhecido por estudos prévios como sendo um ensaio de indicação de estabilidade.

Resultados e Discussão O TFPI foi formulado para uma concentração final de 0,15 mg/ml em várias formulações contendo base de L- arginina ou HC1 de L-arginina. As formulações de HC1 de L-arginina foram tamponadas ao pH = 5,5 por 10 mM de ácido cítrico ou ácido succínico em combinação com seus respectivos sais de sódio conjugados. As formulações de base de L-arginina foram tituladas para pH = 5,5 por ácido cítrico ou ácido succínico. Um total de oito estudos foi realizado como listado abaixo: 1) 20-150 mM de HCl de L-arginina tamponados ao pH = 5.5 por 10 mM de ácido cítrico e citrato de sódio; 2) 20-150 mM de base de L-arginina titulada ao pH = 5.5 por ácido cítrico; 3) 100-300 mM de HCl de L-arginina tamponados ao pH = 5.5 por 10 mM de ácido cítrico e citrato de sódio; 4) 100-300 mM de base de L-arginina titulada ao pH = 5.5 por ácido cítrico; 5) 20-15 0 mM de HCl de L-arginina tamponados ao pH = 5.5 por 10 mM de ácido succinico e succinato de sódio; 6) 20-150 mM de base de L-arginina titulada ao pH = 5.5 por ácido succinico; 7) 100-300 mM de HCl de L-arginina tamponados ao pH = 5.5 por 10 mM de ácido succinico e succinato de sódio; 8) 100-300 mM de base de L-arginina titulada ao pH = 5.5 por ácido succinico. A principal via de degradação para TFPI foi previamente determinada como sendo a agregação/precipitação de proteína (Chen e cols. (1999) J. Pharm. Sei. 88:881- 888). A degradação de TFPI pode ser seguida por monitoração da proteína solúvel restante em amostras de estabilidade. As soluções de TFPI formuladas em diferentes concentrações de L-arginina foram estocadas a 50°C para um estudo de estabilidade acelerada. Amostras foram retiradas em intervalos de tempo pré-determinados. A proteína solúvel nas amostras foi separada da proteína agregada/precipitada através de centrifugação em um tubo de microcentrífuga. A quantidade de proteína solúvel foi determinada pelo método de HPLC-IEX (Chen e cols. (1999) J. Pharm. Sei. 88:881- 888). Os dados foram então ajustados como uma função do tempo de estocagem por uma equação de cinética exponencial única (Y=YoEXP(-klt) para calcular a meia-vida para a proteína solúvel restante usando o programa de computador gráfico KaleidaGraph (Synergy software, Reading Pennsylvania).

Os valores de meia-vida (ti/2) para TFPI solúvel restante para as formulações tamponadas por adição de citrato ou citrato de sódio são mostrados na Tabela 18. Aqueles para as formulações tamponadas por ácido succínico ou succinato de sódio são mostrados na Tabela 19. Esses dados demonstram que o valor de meia-vida aumenta com aumento na concentração de L-arginina nessas formulações. Esses dados são também colocados em gráfico nas Figuras 9 e 10 para sistemas de tamponamento de citrato e succinato, respectivamente. O valor de meia-vida é apresentado como uma curva parabólica e aumenta como uma função de concentração de arginina. Isso estabelece que a L-arginina é um estabilizante para TFPI.

Entre os dois sistemas de tamponamento, a diferença na estabilidade de TFPI parece desprezível. Embora o sistema de tamponamento de citrato tenha mostrado mais variabilidade (Figura 9), as duas meias-vidas vs. curvas de concentração de arginina para o sistema de tamponamento de succinato estavam essencialmente sobrepostas (Figura 10). O TFPI atingiu estabilidade similar em concentração de L-arginina similar a despeito de qual dos sistemas de tamponamento foi usado para ajuste de pH. A Figura 11 também compara a meia-vida vs. curvas de concentração de arginina entre o sistema de tamponamento de ácido succínico e o sistema de tamponamento de ácido cítrico. Essa figura mostra que não há maior diferença na estabilidade de TFPI desde que a concentração de arginina permaneça a mesma na formulação. Esses dados demonstram que o efeito estabilizante foi principalmente contribuído pela arginina.

No entanto, a titulação de ácido com ácido succínico ou com ácido cítrico, permite uma maior concentração de arginina na formulação (e portanto estabilidade aumentada) enquanto mantém a isotonicidade. Assim, por exemplo, ambas as formulações 3-3 e 4-3 na Tabela 18, têm 300 mM de L-arginina nas formulações e seus valores de meia-vida são similares. No entanto, a formulação 3-3 usou 10 mM de ácido cítrico e citrato de sódio para tamponar 300 mM de HC1 de L-arginina ao pH = 5,5 e tinha uma osmolaridade de solução de 4 97 mOsm/kg. Essa é uma formulação hipertônica e não é preferida como uma formulação injetável. Por outro lado, a formulação 4-3 usou 121 mM de ácido cítrico em combinação com 300 mM de base de L-arginina para ajustar o pH para 5,5 e tinha uma osmolaridade de solução de 295 mOsm/kg. Essa formulação é muito próxima de uma solução isotônica (290 mmol/kg), e assim é uma formulação injetável de preferência. Se um meio convencional de ajuste de pH foi usado, por exemplo, com 10 mM de ácido cítrico e citrato de sódio, só poderíam ser adicionados pouco mais que 150 mM de L-arginina à formulação sem exceder a isotonicidade. A meia-vida da formulação de 150 mM de L-arginina (Código 1-6) é de 16 dias em comparação com 23 dias para a formulação de 300 mM de L-arginina (Código 4-3) . Dessa forma, a formulação de TFPI com uma base ácida (quer dizer, base de arginina) como um estabilizante e um tampão que compreende um ácido substancialmente livre de sua forma de sal (quer dizer, ácido succínico) fornece meios para adição de mais estabilizante (quer dizer, arginina) para maximizar o efeito estabilizante sobre TFPI.

Conclusão Esse exemplo demonstra que a L-arginina estabiliza TFPI por estender sua data de validade de estocagem. Pelo uso de titulação ácida, pode ser adicionada mais arginina à formulação para maximizar o efeito estabilizante sem exceder a isotònicidade, que é preferível para formulações injetáveis.

Tabela 18: Dados de estabilidade para formulações de arginina-citrato de TFPI de pH = 5,5. A meia-vida (t!/2) foi obtida por ajuste dos dados de estabilidade a 50°C usando uma equação cinética exponencial única.

Tabela 19: Dados de estabilidade para formulações de arginina-succinato de TFPI de pH - 5,5. A meia-vida (ti/2) foi obtida por ajuste- dos dados de estabilidade a 50°C usando uma equação cinética exponencial única.

Todas as publicações e aplicações de patentes mencionadas na especificação são indicativas do nível daqueles experientes na técnica à qual essa invenção diz respeito. Todas as publicações e aplicações de patentes estão aqui incorporadas por referência à mesma proporção se cada publicação e aplicação de patente individual fosse especificamente e individualmente indicada a ser incorporada por referência.

Embora a invenção antecedente tenha sido descrita em algum detalhe por via de ilustração e exemplo para o objetivo de clareza de entendimento, estará óbvio que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações em apêndice.

Claims (19)

1. Composição farmacêutica liquida estabilizada, caracterizada pelo fato de compreender: interleucina-2 (IL-2) ou variante dessa que retém atividade biológica IL-2 como um componente terapeuticamente ativo; de 100 mM a 400mM de uma base de aminoácido, em que a referida base de aminoácido compreende um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em arginina, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico; e um agente de taraponamento, em que o referido agente de tamponamento é um ácido substancialmente livre de sua forma de sal.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato da referida composição possuir uma osmolaridade de 240 mmol/kg a 360 mmol/kg.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato da referida composição possuir um pH em uma faixa de pH 4,0 a pH 9,0.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do referido agente de tamponamento ser selecionado a partir do grupo que consiste em ácido acético, ácido succinico, ácido cítrico, ácido fosfórico e ácido glutâmico.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracteri zada pelo fato de que o referido agente de tamponamento é ácido succinico.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato da referida base de aminoácido ser arginina em sua forma de base livre presente numa concentração de 100 mM a 400 mM e em que o referido ácido succinico está presente na referida composição em uma faixa de concentração de 8 0 mM a 190 mM.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato da referida arginina em sua forma de base livre estar presente em uma concentração de 150 mM a 350 mM.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a referida arginina em sua forma de base livre está presente em uma concentração de 230 mM e em que o referido ácido succinico está presente em uma concentração de 128 mM.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato da referida IL-2 ser IL-2 recombinante humana (rhIL-2) ou variante dessa.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato da referida composição possuir um pH de 5,0 a 5,5 e uma osmolaridade de 250 mmol/kg a 330 mmol/kg.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender ainda metionina para inibir oxidação de um referido resíduo de metionina na referida IL-2 ou variante dessa durante estocagem da referida composição.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender ainda um tensoativo não-iônico para inibir agregação da referida IL-2 ou variante dessa em resposta ao congelamento-descongelamento ou cisalhamento mecânico durante estocagem da referida composição.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato do referido tensoativo não-iônico ser polissorbato 80.

14. Método para aumentar estabilidade de interleucina-2 (IL-2) ou variante dessa que retém atividade biológica de IL-2 em uma composição farmacêutica liquida, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende incorporar na referida composição uma base de aminoácido e um agente de tamponamento, em que o dito agente de tamponamento é um ácido substancialmente livre de sua forma de sal, e em que a referida base de aminoácido compreende um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em arginina, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico, em que a referida composição farmacêutica possui um pH de 4,0 a 9,0 que é ajustado antes da adição de IL-2 ou variante dessa.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato da referida composição possuir uma osmolaridade de 240 mmol/kg a 360 mmol/kg.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o referido agente de tamponamento é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido acético, ácido succinico, ácido citrico, ácido fosfórico e ácido glutâmico.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracteri zado pelo fato de que o referido agente de tamponamento é ácido succinico.

18. Forma seca da composição conforme definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato da referida forma seca ser uma forma liofilizada e uma forma seca a spray.

19. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato da composição farmacêutica ser em uma formulação para o diagnóstico, prevenção, ou tratamento de doenças que respondem à terapia com interleucina-2 (IL-2).