CZ305123B6

CZ305123B6 - Způsob výroby kapalného farmaceutického prostředku

Info

Publication number: CZ305123B6
Application number: CZ2004-1041A
Authority: CZ
Inventors: Bao-Lu Chen; Maninder Hora
Original assignee: Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc.
Priority date: 1999-10-04
Filing date: 2000-10-03
Publication date: 2015-05-13
Also published as: HU227347B1; WO2001024814A1; HU0401975D0; DE60031999D1; DE60031999T2; CN1636592A; CA2477857C; HUP0401975A3; AU7847500A; IL188230A0; ATE464062T1; NO20021567D0; EP1491208B1; HUP0203133A2; NZ535205A; JP2003510368A; CN100389821C; JP2005068158A; BR0014486A; NO20021567L

Abstract

Je popsán způsob výroby kapalného farmaceutického prostředku, jenž obsahuje polypeptid nebo jeho biologicky aktivní variantu, který spočívá v tom, že obsahuje kombinování uvedeného polypeptidu nebo jeho varianty s alespoň jednou aminokyselinovou bázi a pufrovacím přípravkem, kterým je ve formě kyseliny důkladně zbavené své soli, přičemž uvedená aminokyselinová báze obsahuje alespoň jednu aminokyselinu vybranou ze souboru zahrnujícího arginin, lyzin, kyselinu asparagovou a kyselinu glutamovou, kde jakákoli aminokyselina je ve formě volné báze nebo ve formě soli, přičemž prostředek má pH v rozmezí od 4,0 do 9,0, polypeptidem je interleukin 2 (IL-2), a jeho uvedená varianta má identitu sekvence alespoň 70 % s polypeptidem, přičemž pH se upravuje před přidáním polypeptidu. Prostředek je téměř izotonický a má zvýšenou skladovací stabilitu.

Description

Oblast techniky

Tento vynález se obecně týká způsobu výroby kapalných farmaceutických prostředků, obzvláště farmaceutických prostředků obsahujících polypeptid, kterým je interleukin 2 (IL-2), které jsou obvykle nestabilní v kapalných farmaceutických formulacích.

Dosavadní stav techniky

Nedávné pokroky ve vývoji technologie genetického inženýrství poskytly značné množství biologicky aktivních polypeptidů v dostatečně velkých množstvích pro použití jako léčiva. Polypeptidy však mohou ztratit svou biologickou aktivitu v důsledku fyzikálních nestabilit zahrnujících denaturaci a tvorbu rozpustných a nerozpustných agregátů a varietu chemických nestabilit, jako je hydrolýza, oxidace a deaminace. Stabilita polypeptidů v kapalných farmaceutických prostředcích může být ovlivněna například faktory, jako jsou pH, iontová síla, teplota, opakované cykly zmrazování a rozmrazování a expozice mechanickým střižným silám, ke kterým dochází v průběhu zpracovávání. Tvorba agregátů a ztráta biologické aktivity může být rovněž důsledkem fyzikálního promíchávání, interakcí polypeptidových molekul v roztoku a na rozhraní kapalinavzduch ve skladovacích nádobách. K dalším konformačním změnám může dojít v polypeptidech adsorbovaných na rozhraní vzduch-kapalina a pevná látka-kapalina v průběhu komprese a extenze povrchů v důsledku míšení během transportu a podobně. Takovéto promíchávání může zapříčinit, že se protein svine, agreguje, vytváří jednotlivé partikulace a nakonec precipituje s ostatními adsorbovanými proteiny. Všeobecný přehled stability proteinových farmaceutických prostředků je uveden například v publikacích Manning a kol., Pharm. Res., 6, 903 až 918 (1989) a Wang a Hanson, J. Parenteral. Sci. Tech., 42, 814 (1988).

Nestabilita kapalných farmaceutických prostředků obsahujících polypeptidy vyústila v balení těchto prostředků v lyofilizovaných formách společně s vhodným kapalným médiem pro rekonstituci. Ačkoliv lyofilizace zlepšuje skladovací stabilitu příslušného prostředku, mnoho polypeptidů vykazuje sníženou aktivitu, buď během skladování v suchém stavu (Pikal, Bipharm., 27, 26 až 30 (1990)), nebo jako důsledek tvorby agregátů nebo ztráty katalytické aktivity při rekonstituci do kapalné formulace (viz například Carpenter a kol., Develop. Biol. Standard 74, 225 až 239 (1991), Broadhead a kol., Drug. Devel. Ind. Pharm., 18, 1169 až 1206 (1992), Mumenthaler a kol., Pharm. Res., 11, 12 až 20 (1994), Carpenter a Crowe, Cryobiology, 25, 459 až 470, (1988) a Roser, Biopharm., 4, 47 až 53 (1991)). Zatímco použití přídatných přípravků zlepšilo stabilitu vysušených proteinů, mnoho rehydratovaných formulací stále má nepřijatelné nebo nežádoucí množství inaktivních, agregovaných proteinů (viz například Twosend a DeLuca, J. Pharm. Sci., 80, 63 až 66 (1983), Hora a kol., Pharm. Res., 9, 33 až 36 (1992), Yoshiaka a kol., Pharm. Res., 10, 687 až 691 (1993)). Rovněž potřeba rekonstituce je nepohodlná a vnáší možnost nesprávného dávkování.

Zatímco mnoho kapalných farmaceutických prostředků bylo formulováno tak, aby stabilizovalo biologickou aktivitu obsažených polypeptidů, degradace polypeptidů v kapalných formulacích stále představuje pro lékaře problémy. Z toho vyplývá, že je potřeba vyvinout další farmaceutické prostředky obsahující fyziologicky přijatelné stabilizační přípravky, které indukují stabilitu polypeptidových složek, čímž udržují jejich léčebnou účinnost.

Podstata vynálezu

Přítomný vynález je vyjádřen prostřednictvím podstaty vynálezu a je definován pomocí připojených patentových nároků.

-1 CZ 305123 B6

Podstatou tohoto vynálezu je způsob výroby kapalného farmaceutického prostředku, jenž obsahuje polypeptid nebo jeho biologicky aktivní variantu, který spočívá v tom, že obsahuje kombinování uvedeného polypeptidu nebo jeho varianty s alespoň jednou aminokyselinovou bází a pufrovacím přípravkem, kterým je ve formě kyseliny důkladně zbavené své soli, přičemž uvedená aminokyselinová báze obsahuje alespoň jednu aminokyselinu vybranou ze souboru zahrnujícího arginin, lyzin, kyselinu asparagovou a kyselinu glutamovou, kde jakákoli aminokyselina je ve formě volné báze nebo ve formě soli, přičemž prostředek má pH v rozmezí od 4,0 do 9,0, polypeptidem je interleukin 2 (IL—2), a jeho uvedená varianta má identitu sekvence alespoň 70 % s polypeptidem, přičemž pH se upravuje před přidáním polypeptidu.

Výhodné provedení podstaty vynálezu spočívá ve svrchu uvedeném způsobu, jenž je založen na tom, že aminokyselinou je alespoň jedna z aminokyselin, kterými je arginin ve formě své volné báze a lyzin ve formě své volné báze, účelně kyselina je vybrána ze souboru obsahujícího kyselinu octovou, kyselinu asparagovou, kyselinu jantarovou, kyselinu citrónovou, kyselinu fosforečnou a kyselinu glutamovou, s výhodou kyselinou je kyselina jantarová a aminokyselinou je arginin ve formě své volné báze.

S výhodou provedení podstaty vynálezu spočívá ve svrchu uvedeném způsobu, jenž je založen na tom, že 100 až 400 mM argininu ve formě své volné báze a 80 až 10 190 mM kyseliny jantarové se kombinuje s polypeptidem nebo jeho variantou, účelně 100 až 350 mM argininu ve formě své volné báze se kombinuje s IL-2 nebo jeho variantou a kyselinou jantarovou.

Zvláště výhodné provedení popsané podstaty vynálezu spočívá ve svrchu uvedeném způsobu, jenž je založen na tom, že arginin ve formě své volné báze o koncentraci 230 mM a kyselina jantarová o koncentraci 128 mM se kombinují s IL-2 nebo jeho variantou. Účelné je, pokud při způsob prostředek má pH v rozmezí od 5,0 do 6,5 a osmolaritu od 250 do 330 mmol/kg.

Jak je uvedeno svrchu, při výhodném provedení způsobu kyselinou je kyselina citrónová. Zvláště výhodné provedení podstaty vynálezu spočívá ve svrchu uvedeném způsobu, jenž je založen na tom, že 175 až 400 mM argininu ve formě své volné báze a 40 až 200 mM kyseliny citrónové se kombinují s polypeptidem nebo jeho variantou.

Jiné výhodné provedení podstaty vynálezu spočívá ve způsobu, jenž je založen na tom, že prostředek dále obsahuje methionin v množství dostačujícím pro inhibici oxidace alespoň jednoho methioninového zbytku v polypeptidu nebo jeho variantě během skladování prostředku.

Ještě jiné výhodné provedení podstaty vynálezu spočívá ve způsobu, jenž je založen na tom, že prostředek dále obsahuje neionický surfaktant v množství dostatečném pro inhibici agregace zmíněného polypeptidu nebo jeho varianty jako odpovědi na zmrazení a rozmražení nebo působení mechanické střižné síly v průběhu skladování prostředku.

Zvláště výhodné provedení podstaty vynálezu spočívá ve způsobu, jenž je založen na tom, že neionickým surfaktantem je polysorbát 80.

Ještě jiné výhodné provedení podstaty vynálezu spočívá ve způsobu, jenž je založen na tom, že aminokyselinovou bází je arginin ve formě své volné báze o koncentraci 150 až 350 mM a kyselinou je kyselina jantarová o koncentraci 80 až 190 mM.

Zvláště výhodné provedení této podstaty vynálezu spočívá ve způsobu, jenž je založen na tom, že 230 mM argininu ve formě své volné báze a 128 mM kyseliny jantarové se kombinuje s IL-2 nebo jeho variantou, přičemž prostředek má pH v rozmezí od 5,0 do 6,5 a osmolaritu od 250 do 330 mmol/kg.

Ještě jiné zvláště výhodné provedení této podstaty vynálezu spočívá ve způsobu, jenž je založen na tom, že prostředek má životnost alespoň 18 měsíců, pokud se skladuje při teplotě od 2 do

-2CZ 305123 B6 °C, účelně prostředek má životnost alespoň 20 měsíců, pokud se skladuje při teplotě od 2 do 8 °C.

Zvláště výhodné provedení podstaty vynálezu spočívá ve způsobu, jenž je založen na tom, že prostředek obsahuje dále methionin, který je přítomen v prostředku v koncentraci od 0,5 do 10 mM, polysorbát 80, který je přítomen v prostředku v koncentraci od 0,001 do 0,2 % a 0,1 až 5,0 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) nebo dvojsodné soli EDTA. Přitom výhodné provedení podstaty vynálezu spočívá ve způsobu, jenž je založen v tom, že IL-2 nebo jeho varianta je přítomen v prostředku v koncentraci od 0,01 do 2,0 mg/ml.

Zvláště výhodné provedení této podstaty vynálezu spočívá ve způsobu, jenž je založen na tom, že uvedeným IL-2 je rekombinantní humánní IL-2 (rhIL-2) nebo jeho biologicky aktivní varianta, s identitou sekvence alespoň 70 % s humánním IL-2, účelně uvedená varianta má identitu sekvence alespoň 80 % s humánním IL-2, jako jeho uvedená varianta má identitu sekvence alespoň 90 % s humánním IL-2, s výhodou jeho uvedená varianta má identitu sekvence alespoň 95 % s humánním IL-2.

S výhodou provedení podstaty vynálezu spočívá ve svrchu uvedeném způsobu, jenž je založen na tom, že variantou je des-alanyl-1, serin-125 humánní interleukin-2.

S výhodou provedení podstaty vynálezu spočívá v jakémkoli ze svrchu uvedených způsobů, jež jsou založeny na tom, že dále zahrnuje přípravu uvedeného prostředku ve vysušené formě, která je vybrána ze souboru obsahujícího vysoušení za mrazu a vysoušení rozprašováním.

Dále se uvádí podrobnější údaje vztahující se k podstatě vynálezu, popsané svrchu. Pro plnou informovanost se uvádí také údaje, které ilustrují nalezený vynález v celé jeho šíři a údaje srovnávací.

Vynález poskytuje prostředky obsahující polypeptid jako terapeuticky aktivní složku a způsoby používané v jejich přípravě. Těmito prostředky jsou stabilizované kapalné farmaceutické prostředky, které obsahují polypeptid, jehož účinnost jako terapeuticky aktivní složky se obvykle snižuje v průběhu skladování v kapalných formulacích jako důsledek agregace polypeptidu. Stabilizované kapalné farmaceutické prostředky zahrnují, kromě polypeptidu, který vykazuje tvorbu agregátu během skladování v kapalné formulaci, množství aminokyselinové báze dostatečné pro snížení tvorby agregátu polypeptidu v průběhu skladování, a aminokyselinovou bází je aminokyselina nebo kombinace aminokyselin, kde jakákoli aminokyselina je přítomna buď ve formě její volné báze, nebo ve formě soli. Prostředky dále obsahují pufrovací přípravek pro uchování pH kapalného prostředku v rozmezí přijatelném pro stabilitu polypeptidu, kde pufrovacím přípravkem je kyselina důkladně zbavená své soli, kyselina ve formě své soli nebo směs kyselina ajejí soli.

Aminokyselinová báze stabilizuje polypeptid a zabraňuje formaci jeho agregátů v průběhu skladování kapalného farmaceutického prostředku, zatímco použití ve formě její soli nebo směsi kyseliny ajejí soli jako pufrovacího přípravku vede ktomu, že kapalný prostředek má osmolaritou takovou, že je téměř izotonický. Kapalný farmaceutický prostředek může dále obsahovat jiné stabilizační přípravky, konkrétněji methionin, neionický surfaktant, jako je polysorbát 80 a EDTA, pro další zvýšení stability polypeptidu. Takovéto kapalné farmaceutické prostředky jsou považovány za stabilizované, jelikož přidání aminokyselinové báze v kombinaci s kyselinou důkladně zbavenou své soli, kyselinou ve formě své soli nebo se směsí kyseliny ajejí soli, má za následek vznik prostředků, které mají zvýšenou skladovací stabilitu vzhledem ke kapalným farmaceutickým prostředkům formulovaných za nepřítomnosti kombinace těchto dvou složek.

Dále jsou poskytnuty způsoby zvyšování stability polypeptidu v kapalném farmaceutickém prostředku a způsoby zvyšování skladovací stability tohoto farmaceutického prostředku. Zmíněné způsoby zahrnují včlenění určitého množství aminokyselinové báze dostatečného k potlačení

-3CZ 305123 B6 tvorby agregátu polypeptidu v průběhu skladování prostředku a pufrovacího přípravku, kde pufrovacím přípravkem je kyselina důkladně zbavená soli, kyselina ve formě soli nebo směs kyselin a jejich soli do kapalného farmaceutického prostředku. Tyto způsoby nalézají využití při přípravě kapalných farmaceutických prostředků přítomného vynálezu.

Objasnění výkresů

Obr. 1 znázorňuje procento zbývajícího rozpustného IL-2 ve vzorcích stability skladovaných při teplotě 40 °C, při analýze RP-HPLC. Formulace obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinátu sodného při pH 6 a 270 mmol sorbitolu, sacharózy nebo mannitolu.

Obr. 2 znázorňuje procento zbývajícího rozpustného IL-2 ve vzorcích stability skladovaných při teplotě 50 °C, při analýze pomocí RP-HPLC. Prostředky obsahují 0,1 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinátu sodného o pH 6 a 150 mmol různých aminokyselin jak jsou uvedeny na obrázku.

Obr. 3 znázorňuje procento zbývajícího rozpustného IL-2 ve vzorcích stability skladovaných při teplotě 40 °C, při analýze pomocí RP-HPLC. Prostředky obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinátu sodného o pH 6; a 50, 100 nebo 270 mmol sorbitolu.

Obr. 4 znázorňuje procento zbývajícího rozpustného IL-2 ve vzorcích stability skladovaných při teplotě 50 °C, při analýze pomocí RP-HPLC. Prostředky obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinátu sodného o pH 6; a 50, 100 nebo 150 mmol různých argininu.

Obr. 5 znázorňuje poločas (t]/₂ ve dnech) zbývajícího rozpustného IL-2 analyzované pomocí RPHPLC jako funkce pH při teplotě 50 °C. Prostředky obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol pufru (glycin, octan sodný, citrát sodný, sukcinát sodný, fosfát sodný, borát sodný) a 150 mmol NaCl, 270 mmol sorbitolu nebo 150 mmol argininu.

Obr. 6 znázorňuje Ln-Ln křivku poločasu (ti/₂) oproti počáteční koncentraci proteinů ve vzorcích stability skladovaných při 50 °C. Prostředky obsahují 0,1; 0,2 nebo 0,5 mg/ml IL-2 v 10 mmol sukcinátu sodného o pH 6 a 150 mmol L-argininu.

Obr. 7 znázorňuje procento zbývajícího rozpustného IL-2, analyzované pomocí RP-HPLC, ve vzorcích zpracovaných jedním, třemi a pěti cykly zmrazení/rozmrazení při teplotách od -70 °C do teploty místnosti. Prostředky obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinátu sodného o pH 6, 150 mmol argininu a od 0 do 0,1 % polysorbátu 80.

Obr. 8 znázorňuje procento zbývajícího rozpustného IL-2, analyzované pomocí RP-HPLC, ve vzorcích, které byly zaslány na ledu z Emeryville v Kalifornii do St. Louis v Missouri a ze St. Louis zpět do Emeryville. Byly použity dvě formulace obsahující různá množství polysorbátu 80: argininová formulace, obsahující 0,2 mg/ml IL-2 v 10 mmol sukcinátu sodného při pH 6 a 150 mmol argininu; a formulace s NaCl obsahující 0,2 mg/ml IL-2 v 10 mmol citrátu sodného o pH 6,5 a 200 mmol NaCl.

Obr. 9 znázorňuje poločas (ti/₂ ve dnech) zbývajícího rozpustného TFPI ve čtyřech formulacích analyzovaných pomocí IEX-HPLC jako funkce koncentrace argininu při 50 °C. Všechny formulace obsahují 0,15 mg/ml TFPI a buď L-argininovou bázi, nebo hydrochlorid L-argininu, pufrované na pH 5,5 buď kyselinou citrónovou, nebo s 10 mmol kyseliny citrónové a citrátu sodného. Specifické TFPI formulace obsahovaly:

a) 20 až 150 mmol hydrochlorídu L-argininu, 10 mmol kyseliny citrónové a citátu sodného jako pufru;

b) 20 až 150 mmol L-argininové báze titrované kyselinou citrónovou;

-4CZ 305123 B6

c) 100 až 300 mmol hydrochloridu L-argininu, 10 mmol kyseliny citrónové a citrátu sodného jako pufru nebo

d) 100 až 300 mmol L-argininové báze titrované kyselinou citrónovou.

Obr. 10 znázorňuje poločas (ti/₂, ve dnech) zbývajícího rozpustného TFP1 ve čtyřech formulacích analyzovaných pomocí IEX-HPLC jako funkce koncentrace argininu při 50 °C. Všechny formulace obsahují 0,15 mg/ml TFPI a buď L-argininovou bázi, nebo hydrochlorid L-argininu, pufrované na pH 5,5 buď kyselinou jantarovou, nebo 10 mmol kyseliny jantarové a sukcinátu sodného. Specifické formulace obsahující TFPI zahrnují:

a) 20 až 150 mmol hydrochloridu L-argininu, 10 mmol kyseliny jantarové a sukcinátu sodného jako pufru;

b) 20 až 150 mmol L-argininové báze titrované kyselinou jantarovou;

c) 100 až 300 mmol hydrochloridu L-argininu, 10 mmol kyseliny jantarové a sukcinátu sodného jako pufru; a

d) 100 až 300 mmol L-argininové báze titrované kyselinou jantarovou.

Obr. 11 znázorňuje poločas (tj/₂, ve dnech) zbývajícího rozpustného TFPI ve čtyřech formulacích analyzovaných pomocí IEX-HPLC jako funkce koncentrace argininu při teplotě 50 °C. Všechny formulace obsahují 0,15 mg/ml TFPI a buď L-argininovou bázi, nebo hydrochlorid L-argininu, pufrované na pH 5,5 buď kyselinou jantarovou, nebo s kyselinou citrónovou. Specifické TPFI formulace obsahují:

a) 20 až 150 mmol L-argininové báze titrované kyselinou citrónovou;

b) 20 až 150 mmol L-argininové báze titrované kyselinou jantarovou;

c) 100 až 300 mmol L-argininové báze titrované kyselinou citrónovou nebo

d) 100 až 300 mmol L-argininové báze titrované kyselinou jantarovou.

Podrobný popis vynálezu

Přítomný vynález je zaměřen na kapalné farmaceutické prostředky obsahující polypeptid jako terapeuticky aktivní složku a způsoby jejich přípravy. Pro účely přítomného vynálezu termín „kapalný“ týkající se farmaceutických prostředků nebo formulací zahrnuje také pojem „vodný“. Termín „polypeptid“, jak je zde dále užíván, zahrnuje přirozeně se vyskytující (nativní), syntetické a rekombinantní polypeptidy a proteiny ajejich biologicky aktivní varianty, jak jsou kvalifikovány dále. Pojem „terapeuticky aktivní složka“ znamená, že je polypeptid specificky začleněn do prostředku, aby navodil požadovanou léčebnou odpověď týkající se léčby, prevence nebo diagnózy onemocnění nebo chorobného stavu u subjektu, v případě, že je subjektu podán tento farmaceutický prostředek.

Konkrétněji, prostředky přítomného vynálezu jsou stabilizované kapalné farmaceutické prostředky, jejichž terapeuticky aktivní složky zahrnují polypeptid, který obvykle vykazuje tvorbu agregátu v průběhu skladování v kapalných farmaceutických formulacích. Termín „tvorba agregátu“ znamená fyzikální interakci mezi polypeptidovými molekulami, při které dochází k tvorbě oligomerů, které mohou zůstat rozpustné, nebo větších viditelných agregátů, které se vysrážejí z roztoku. Termín „během skladování“ znamená, že kapalný farmaceutický prostředek nebo formulace, která je jednou připravena, není ihned podána subjektu. Namísto toho je po přípravě zabalena k skladování, buď v kapalné formě, ve zmrazeném stavu, nebo ve vysušené formě k pozdější rekonstituci do kapalné formy nebo jiné formy vhodné pro podání subjektu. Termín „sušená“ forma znamená, že kapalný farmaceutický prostředek nebo formulace je vysušen buď vysoušením za mrazu (tj. lyofilizací; viz například Williams a Polli, J. Parenteral Sci. Technl., 38, 48 až 59 (1984), vysoušením rozprašováním (viz Maters, Spray-Drying Handbook, pátá edice, Longman Scientific and Technical, Essex, Spojené království, 491 až 676 (1991)), Broadhead a kol., Drug Devel. Ind. Pharm. 18, 1169 až 1206 (1992) a Mumenthaler a kol., Pharm. Res., 11, 12

-5CZ 305123 B6 až 20 (1994), nebo vysoušením na vzduchu (Carpenter a Crowe, Cryobiology, 25, 459 až 470 (1988) a Roser, Biopharm, 4, 47 až 53 (1991). Tvorba agregátů polypeptidu v průběhu skladování kapalného farmaceutického prostředku může nepříznivě ovlivnit biologickou aktivitu zmíněného polypeptidu, s následkem ztráty léčebné účinnosti farmaceutického prostředku. Navíc, tvorba agregátů může zapříčinit další problémy, jako je blokáda kanyl, membrán nebo pump, pokud je farmaceutický prostředek obsahující polypeptid podán infuzním systémem.

Stabilizované kapalné farmaceutické prostředky podle přítomného vynálezu dále zahrnují takové množství aminokyselinové báze dostatečné ke snížení tvorby agregátu polypeptidu v průběhu skladování tohoto prostředku. Termín „aminokyselinová báze“ vyjadřuje aminokyselinu nebo kombinaci aminokyselin, kde jakákoliv daná aminokyselina je přítomna buď ve formě své volné báze, nebo ve formě své soli. V případě, kdy se použije kombinace aminokyselin, mohou být všechny tyto aminokyseliny přítomny jako volné báze, všechny aminokyseliny mohou být přítomny ve formě příslušné soli, nebo mohou být některé přítomny jako volná báze zatímco ostatní mohou být přítomny ve formě příslušné soli. Aminokyseliny výhodné pro použití pro přípravu prostředků přítomného vynálezu jsou takové, které nesou nabitý vedlejší řetězec, například arginin, lysin, kyselinu asparagovou a kyselinu glutamovou. Jakýkoliv stereoisomer (tj. L, D nebo DL ísomer) konkrétní aminokyseliny nebo kombinace stereoisomerů, mohou být přítomny ve farmaceutických prostředcích přítomného vynálezu, a to do té míry, dokud je příslušná aminokyselina přítomná buď ve jako volná báze, nebo ve formě příslušné soli. S výhodou se použije Lstereoisomer. Prostředky přítomného vynálezu mohou být také formulovány s analogy těchto výhodných aminokyselin. Termín „analogům aminokyseliny“ znamená derivát přirozeně se vyskytující aminokyseliny, který vyvolá požadovaný účinek poklesu tvorby agregátu polypeptidu v průběhu skladování kapalných farmaceutických prostředků podle přítomného vynálezu. Vhodná analoga argininu zahrnují, například, aminoguanidin aN-monoethyl—L-arginin. Stejně jako v případě příslušné aminokyseliny, se analoga aminokyselin inkorporují do prostředků, buď jako volné báze, nebo ve formě příslušné soli.

V případě kombinace s aminokyselinovou bází, jak je zde definováno, obsahují stabilizované kapalné farmaceutické prostředky podle přítomného vynálezu dále kyselinu důkladně zbavenou od své soli, kyselinu ve formě příslušné soli nebo směs kyseliny a její soli, a to za účelem udržení určitého pH roztoku. S výhodou je pH udržováno pomocí aminokyselinové báze v kombinaci s kyselinou důkladně zbavenou od její soli. Taková kombinace má nižší osmolaritu roztoku než v případě, kdy se použije jako pufrovací přípravek kyselina a její sůl v kombinaci s aminokyselinovou bází, toto vše za účelem formulace stabilizovaného farmaceutického prostředku. Výhodou této kombinace je, že lze do farmaceutického prostředku bez přílišného překročení izotonicity roztoku začlenit vyšší koncentraci stabilizátoru, tedy aminokyselinovou bázi, do. Termín „kyselina důkladně zbavená od své soli“ znamená, že kyselina fungující jako pufrovací přípravek je uvnitř kapalného farmaceutického prostředku přítomna v nepřítomnosti jakýchkoliv svých forem soli. Obvykle, pokud se ve farmaceutickém prostředku použije pufr zahrnující kyselinu, připraví se pomocí soli kyseliny nebo kombinací kyseliny a soli kyseliny. Například je tedy pufr připraven za použití kyseliny s jejím protějškem, jako je sodík, draslík, amoniak, vápník nebo hořčík. Proto se obvykle sukcinátový pufr skládá ze soli jantarové kyseliny, jako je sukcinát sodný, nebo směsi jantarové kyseliny a sukcinátu sodného. Ačkoliv kyselina použitá jako pufrovací přípravek ve stabilizovaných kapalných prostředcích podle přítomného vynálezu může být ve formě soli příslušné kyseliny nebo směsi kyseliny a její soli, kyselina je s výhodou fungující jako pufrovací přípravek pouze ve formě čisté kyseliny. Kyseliny vhodné k použití pro formulování stabilizovaných kapalných prostředků obsahujících polypeptid podle přítomného vynálezu zahrnují, avšak nejsou limitovány na, kyselinu jantarovou, kyselinu citrónovou, kyselinu fosforečnou, kyselinu glutamovou, kyselinu maleinovou, kyselinu jablečnou, kyselinu octovou, kyselinou vinnou a kyselinu asparagovou; výhodněji zahrnují kyselinu jantarovou a kyselinu citrónovou, nejvýhodněji zahrnují kyselinu jantarovou.

Kapalné farmaceutické prostředky obsahujících polypeptid podle přítomného vynálezu jsou „stabilizované“ prostředky. Termín „stabilizovaný“ znamená, že kapalné prostředky mají zvýšenou

-6CZ 305123 B6 skladovací stabilitu při porovnání s prostředky připravenými v nepřítomnosti kombinace aminokyselinové báze a pufrovacího přípravku, jak je zde popisováno. Tato zvýšená skladovací stabilita se pozoruje u kapalné formulace, ať skladované přímo v této formě pro pozdější použití, nebo ve zmrazeném stavu a rozmražené před použitím, nebo připravené ve vysušené formě, jako je lyofilizovaná, vzduchem vysušená nebo rozprašováním vysušená forma, pro pozdější rekonstituci na kapalnou nebo jinou formu těsně před použitím. Prostředky podle přítomného vynálezu se s výhodou skladují přímo v jejich kapalné formě, čímž se plně využije výhody zvýšené skladovací stability v kapalné formě, pohodlí při podávání bez rekonstituce a možnosti dodání formulace v předem naplněných, k okamžitému použití připravených stříkačkách nebo vícedávkových přípravcích, pokud je formulace kompatibilní s bakteriostatickými činidly.

V prostředcích podle přítomného vynálezu je využít objev, že přidání aminokyseliny argininu, lysinu, kyseliny asparagové nebo kyseliny glutamové jako volné báze nebo ve formě soli v kombinaci s kyselinou důkladně zbavenou její soli, kyselinou ve formě soli nebo směsi kyseliny a její soli, má za následek vznik kapalného farmaceutického prostředku obsahujícího polypeptid, který má zvýšenou skladovací stabilitu; ve srovnání s kapalným farmaceutickým prostředkem obsahujícím polypeptid připraveným bez kombinace těchto dvou složek. Zvýšená skladovací stabilita prostředku je dosažena pomocí vlivu aminokyseliny na stabilitu terapeuticky aktivního polypeptidu, zvláště jejího vlivu na agregaci polypeptidu v průběhu skladování v kapalných formulacích. Navíc, včlenění aminokyselinové báze, jak je zde definováno, a kyseliny důkladně zbavené její soli do kapalných polypeptid obsahujících formulací, vede ke vzniku kapalných farmaceutických prostředků, které jsou téměř izotonické, aniž by bylo nutné začlenění dalších izotonizujících činidel, jako je chlorid sodný. Termín „téměř izotonický“ znamená takový kapalný prostředek, který má osmolaritu přibližně od 240 mmol/kg do asi 360 mmol/kg, s výhodou přibližně od 240 mmol/kg do asi 340 mmol/kg, výhodněji přibližně od 250 mmol/kg do asi 330 mmol/kg, ještě výhodněji přibližně od 260 mmol/kg do asi 320 mmol/kg, a nejvýhodněji přibližně od 270 mmol/kg do asi 310 mmol/kg.

Aminokyselinová báze včleněná do stabilizovaných farmaceutických kapalných prostředků podle přítomného vynálezu ochraňuje terapeuticky aktivní polypeptid před agregací, čímž zvyšuje stabilitu polypeptidu během skladování prostředku. Termín „zvyšování stability“ znamená, že tvorba agregátu polypeptidu v průběhu skladování kapalného farmaceutického prostředkuje nižší než tvorba agregátu polypeptidu v průběhu skladování v nepřítomnosti tohoto jednotlivého stabilizujícího činidla. Ke snížené tvorbě agregátu pomocí přidání aminokyselinové báze dochází způsobem závislým na koncentraci. To znamená, že zvyšující se koncentrace aminokyselinové báze vede ke zvýšení stability polypeptidu v kapalném farmaceutickém prostředku, v případě, kdy tento polypeptid obvykle vykazuje tvorbu agregátu během skladování v kapalné formulaci za nepřítomnosti aminokyselinové báze. Stanovení množství každé jednotlivé aminokyselinové báze, které má být přidáno do kapalného farmaceutického prostředku za účelem snížení tvorby agregátu a tedy pro zvýšení stability polypeptidu, a tudíž zvýšení skladovací stability prostředku, může být snadno určeno pro každý jednotlivý polypeptid, aniž by bylo nutné provádět neobvyklé experimenty, za použití postupů, které jsou odborníkovi v oboru známé.

Proto například účinek konkrétní aminokyselinové báze na agregaci polypeptidu v průběhu skladování v kapalném prostředku, může být snadno stanoven měřením změny rozpustného polypeptidu v roztoku v čase. Množství rozpustného polypeptidu v roztoku může být kvantifikováno různými analytickými zkouškami adaptovanými na detekci příslušného polypeptidu. Takové zkoušky zahrnují například chromatografii s reverzní fází (RP)-HLPC, chromatografii metodou vylučování dle velikosti (SEC)-HLPC a absorbanci UV záření; jak jsou popsány níže uvedených příkladech. Pokud příslušný polypeptid vytváří v průběhu skladování v kapalných formulacích oba - jak rozpustné, tak nerozpustné agregáty, může být k rozlišení poměrné části rozpustného polypeptidu, který je přítomen jako rozpustné agregáty a poměrné části která je přítomna v neagregované, biologicky aktivní molekulární formě, jak je popsáno v příkladu 1, použita kombinace RP-HPLC a SEC-HPLC.

-7CZ 305123 B6

V případě agregace bude účinné množství aminokyselinové báze, které má být začleněno do kapalného farmaceutického prostředku obsahujícího polypeptid za účelem zisku stabilizovaného farmaceutického prostředku podle přítomného vynálezu, posuzováno jako takové množství, které vede ke snížení tvorby agregátu v čase, čímž navozuje vyšší retenci rozpustného polypeptidu v roztoku v jeho neagregované, biologicky aktivní molekulární formě. Z toho vyplývá, že například v případě, kdy je polypeptid monomemí protein, jako je například interleukin-2 (IL—2) nebo inhibitor působení tkáňového faktoru (TFPI) popsaný níže v příkladech, bude účinné množství stabilizujícího činidla pro použití v přípravě stabilizovaného prostředku podle přítomného vynálezu takové množství, které má za výsledek vyšší retenci IL-2 nebo TFPI ve své monomemí molekulární formě.

Zvýšená skladovací stabilita stabilizovaných kapalných prostředků obsahujících polypeptid podle přítomného vynálezu mohou též během skladování vykazovat inhibiční účinky aminokyselinové báze na deaminaci glutaminových a/nebo asparagových zbytků uvnitř terapeuticky aktivního polypeptidu. Účinek jednotlivé aminokyselinové báze na deaminaci příslušných zbytků v průběhu skladování v kapalném prostředku může být snadno určen monitorováním množství polypeptidu přítomného v jeho deaminované formě v čase. Postupy pro měření molekulárních vzorků, tj. nativního nebo deaminovaného, konkrétního polypeptidu přítomného v kapalné fázi, jsou všeobecně v oboru známy. Takovéto postupy zahrnují chromatografickou separaci molekulárních vzorků a identifikaci pomocí standardů molekulární hmotnosti, například prostřednictvím RP-HPFC, jak je popsáno v příkladech uvedených níže.

Použití nové kombinace aminokyselinové báze pufrované kyselinou důkladně zbavenou své soli pro zvýšení stability polypeptidu ve stabilizovaných kapalných farmaceutických prostředcích podle vynálezu poskytuje výhody oproti například použití aminokyseliny v pufrovacím systému kyseliny jantarové a sukcinátu sodného. Tato nová kombinace umožňuje přípravu téměř izotonických formulací, které mají vyšší koncentraci stabilizující aminokyseliny, než může být dosaženo použitím pufrovacího systému, který je směsí kyseliny a její soli. Vyšší koncentrace stabilizující aminokyseliny umožňuje dokonce větší zvýšení stability polypeptidu, a tím zvýšenou skladovací stabilitu formulace.

Pokud je například použita kyselina jantarová pro pufřování argininové báze přidané do kapalné formulace obsahující protein interleukin-2 (IL—2) a mající optimální pH pro tento protein (pH = 5,8), může být koncentrace argininu zvýšena na 230 mmol, zatímco je stále zachována izotonicita formulace. Tímto se dosáhne zdvojnásobení skladovací doby IL-2 při teplotě 50 °C, kteráje měřítkem proteinové stability.

Ačkoliv podobné skladovací doby IL-2 může být dosaženo prostřednictvím stejné koncentrace argininu a směsi kyseliny jantarové a sukcinátu sodného jako pufrovacího přípravku, musí být arginin, aby bylo dosaženo obdobného pH, přidán ve své kyselé formě, a výsledná formulace je hypertonická (viz příklad 1, tabulka 1).

Podobně, pokud se pro pufřování argininovou bází přidané ke kapalné formulaci obsahující inhibitor působení tkáňového faktoru (TFPI) a mající pH vhodné pro tento protein (pH 5,5) použije kyselina citrónová, může být koncentrace argininu zvýšena na 300 mmol, zatímco je stále udržována izotonicita formulace. Tímto se dosáhne téměř 50% vzestupu skladovací doby TFPI při 50 °C. Ačkoliv podobné skladovací doby TFPI může být dosaženo použitím stejné koncentrace argininu a směsi kyseliny citrónové kyseliny a citrátu sodného jako pufrovacího přípravku, musí být pro dosažení podobného pH arginin přidán ve své kyselé formě, a výsledná formulace je hypertonická (viz příklad 8, tabulka 18). Možnost použít vyšší koncentrace aminokyselin jako primárních stabilizujících činidel eliminuje potřebu tradičnějších stabilizátorů polypeptidů, jako je hovězí sérový albumin nebo lidský sérový albumin, které jsou méně žádoucími stabilizujícími činidly kvůli možné virové kontaminaci.

-8CZ 305123 B6

Izotonicita kapalných farmaceutických prostředků je navíc žádoucí, protože redukuje bolest během podávání a minimalizuje možné hemolytické účinky spojené s hypertonickými nebo hypotonickými prostředky. Z toho vyplývá, že stabilizované prostředky podle přítomného vynálezu nejenom že mají vyšší skladovací stabilitu, ale jsou též výhodné v tom smyslu, že podstatně snižují bolest v průběhu podávání při porovnání s formulacemi, které používají tradičnější pufrovací systémy sestávající z kyseliny a její soli. Například, v jednom provedení přítomného vynálezu, vykazuje stabilizovaný kapalný farmaceutický prostředek při injekčním podání nižší aplikační bolestivost spojenou s pálením a bodáním, ve srovnání s injekcí fyziologického roztoku (viz příklad 7).

Poté co byly identifikovány výhody přípravy kapalných polypeptidových prostředků podle přítomného vynálezu obsahující aminokyselinovou bázi jako primární stabilizační činidlo a kyselinu důkladně zbavenou její soli jako pufrující přípravek, je v možnostech oboru stanovit bez nevhodných pokusů, výhodné koncentrace každé z těchto složek pro začlenění do kapalného farmaceutického prostředku obsahujícího příslušný terapeuticky aktivní polypeptid, který vykazuje tvorbu agregátu, jak je zde popsáno, za účelem zvýšení stability polypeptidu v průběhu skladování tohoto prostředku. Při následování popsaných protokolů, například níže v příkladu 1, může kvalifikovaný odborník stanovit rozmezí vhodných koncentrací aminokyselinové báze a různých pufrovacích kyselin pro použití ve zde popisovaných kapalných farmaceutických prostředcích. Množství aminokyselinové báze začleněné do prostředku je s výhodou v rozmezí koncentrace přibližně od 100 do asi 400 mmol, výhodněji přibližně od 130 do asi 375 mmol, ještě výhodněji přibližně od 150 do asi 350 mmol, ještě výhodněji přibližně od 175 do asi 325 mmol, mnohem výhodněji přibližně od 180 do asi 300 mmol, ještě mnohem výhodnější přibližně od 190 do 280 mmol, a nej výhodněji přibližně od 200 do asi 260 mmol, v závislosti na proteinu přítomném v prostředku. Ačkoliv pufrovací přípravek může být kyselina ve formě soli nebo směs kyseliny a její soli, je pufrovací přípravek s výhodou kyselina důkladně zbavená její soli, a to z výhodných důvodů zde popsaných. Kyselina použitá jako pufrovací přípravek se s výhodou přidá v koncentračním rozmezí od přibližně 40 do asi 250 mmol, od přibližně 50 do asi 240 mmol, od přibližně 60 do asi 230 mmol, od přibližně 70 do asi 220 mmol, výhodněji od přibližně 80 do asi 210 mmol, nejvýhodněji od 90 do asi 200 mmol, v závislosti na kyselině použité jako pufrovací přípravek a optimálním pH pro polypeptid, který se stabilizuje proti tvorbě agregátu.

V jednom provedení je aminokyselinovou bází argininová báze přítomná v koncentraci přibližně 230 mmol a kyselinou použitou jako pufrovací přípravek je kyselina jantarová v koncentraci přibližně 128 mmol. Toto umožňuje přípravu kapalného polypeptid obsahujícího farmaceutického prostředku, který má osmolaritu téměř izotonickou a pH přibližně 5,8. V jiném provedení je aminokyselinovou bází argininová báze přítomná v koncentraci přibližně 300 mmol a kyselinou použitou jako pufrovací činidlo je kyselina citrónová v koncentraci přibližně 120 mmol. Toto umožňuje přípravu kapalného polypeptid obsahujícího farmaceutického prostředku, který má osmolaritu téměř izotonicitu a pH přibližně 5,5. V dalším provedení je aminokyselinovou bází argininová báze přítomná v koncentraci přibližně bází argininová báze přítomná v koncentraci přibližně 200 až asi 300 mmol a kyselinou použitou jako pufrovací přípravek je kyselina jantarová v koncentraci přibližně 120 až asi 180 mmol. Toto umožňuje přípravu kapalného polypeptid obsahujícího farmaceutického prostředku, který má osmolaritu od přibližně 256 až asi 363 mmol/kg a pH přibližně 5,5.

Proto v dalším provedení přítomného vynálezu obsahuje stabilizovaný kapalný farmaceutický prostředek IL-2 nebo jeho variantu jako polypeptid, argininovou bázi v koncentraci přibližně od 150 do přibližně 350 mmol a kyselinu jantarovou v koncentraci od přibližně 80 do asi 190 mmol. Ve výhodném provedení přítomného vynálezu, je argininová báze přítomna v kapalném farmaceutickém prostředku obsahujícím IL-2 v koncentraci přibližně 230 mmol a kyselina jantarová je přítomna v koncentraci přibližně 128 mmol. Tento výhodný prostředek obsahující IL—2 má pH přibližně 5,8 a osmolaritu od přibližně 250 do asi 330 mmol/kg. Koncentrace IL-2 nebo jeho varianty v těchto prostředcích je od přibližně 0,01 do asi 2,0 mg/ml, s výhodou od přibližně 0,02

-9CZ 305123 B6 do asi 1,0 mg/ml, výhodněji od přibližně 0,03 do asi 0,8 mg/ml, nejvýhodněji od přibližně 0,03 do asi 0,5 mg/ml.

V dalším provedení přítomného vynálezu, obsahuje stabilizovaný kapalný farmaceutický prostředek TFPI nebo jeho variantu jako polypeptid, argininovou bázi v koncentraci přibližně od 100 do přibližně 400 mmol a kyselinu jantarovou v koncentraci od přibližně 80 do asi 190 mmol. Ve výhodném provedení je argininová báze přítomna v kapalném farmaceutickém prostředku obsahujícím TFPI v koncentraci od přibližně 200 do asi 300 mmol a kyselina jantarová je přítomna v koncentraci od přibližně 120 do asi 180 mmol. Tento výhodný prostředek obsahující TFPI má pH přibližně 5,5 a osmolaritu od přibližně 240 do asi 360 mmol/kg. Koncentrace TFPI nebo jeho varianty v těchto prostředcích je od přibližně 0,01 do asi 5,0 mg/ml, s výhodou od přibližně 0,05 do asi 2,0 mg/ml, výhodněji od přibližně 0,10 do asi 1,0 mg/ml, nejvýhodněji od přibližně 0,10 do asi 0,60 mg/ml.

V dalším provedení přítomného vynálezu, obsahuje stabilizovaný kapalný farmaceutický prostředek TFPI nebo jeho variantu jako polypeptid, argininovou bázi, v koncentraci přibližně od 175 do přibližně 400 mmol a kyselinu citrónovou v koncentraci od přibližně 40 do asi 200 mmol. Ve výhodném provedení je argininová báze přítomna v kapalném farmaceutickém prostředku obsahujícím TFPI v koncentraci od přibližně 250 do asi 350 mmol a kyselina citrónová je přítomna v koncentraci od přibližně 100 do asi 150 mmol. Tento výhodný prostředek s TFPI má pH přibližně 5,0 až 6,5 a osmolaritu od přibližně 240 do asi 360 mmol/kg. V dalším provedení vynálezu je argininová báze přítomna v koncentraci přibližně 300 mmol a kyselina citrónová je přítomna v koncentraci přibližně 120 mmol. Tento prostředek obsahující TFPI má pH přibližně 5,5 a osmolaritu od přibližně 240 do asi 360 mmol/kg. Koncentrace TFPI nebo jeho varianty v těchto prostředcích je od přibližně 0,01 do asi 5,0 mg/ml, s výhodou od přibližně 0,05 do asi 2,0 mg/ml, výhodněji od přibližně 0,10 do asi 1,0 mg/ml, nejvýhodněji od přibližně 0,10 do asi 0,60 mg/ml.

Jak je ilustrováno v dále uvedených příkladech, ovlivňuje pH kapalného farmaceutického prostředku obsahujícího polypeptid stabilitu příslušného polypeptidu v něm obsaženého, a to primárně prostřednictvím účinku pH na tvorbu polypeptidového agregátu. Z toho vyplývá, že množství pufrující kyseliny přítomné ve farmaceutických prostředcích podle přítomného vynálezu se bude měnit v závislosti na pH optimálním pro stabilitu každého příslušného polypeptidu. Stanovení optimálního pH může být provedeno pomocí způsobů v oboru všeobecně známých, a je dále ilustrováno na příkladech uvedených níže. Výhodné rozmezí hodnot pH pro prostředky podle přítomného vynálezu je od přibližně 4,0 do asi 9,0, konkrétněji od přibližně 5,0 do asi 6,5, v závislosti na příslušném polypeptidu. Proto v jednom provedení je hodnota pH přibližně 5,8, konkrétněji v případě, kdy polypeptidem je IL-2 nebo jeho varianta. V jiném provedení, je hodnota pH přibližně 5,5, konkrétněji se jedná o případ, kdy je polypeptidem TFPI nebo jeho varianta.

Stabilizované farmaceutické prostředky obsahující aminokyselinovou bázi pufrovanou kyselinou důkladně zbavenou její soli, kyselinou ve formě příslušné soli nebo směsí kyseliny a její soli, mohou také obsahovat další stabilizující přípravky, které dále zvýší stabilitu terapeuticky aktivního polypeptidu obsaženého ve zmíněných prostředcích. Stabilizující přípravky v zájmu přítomného vynálezu zahrnují, avšak bez omezení na, methionin a EDTA, které ochraňují polypeptid před oxidací methioninu, a dále neionický surfaktant, který ochraňuje polypeptid před agregací spojenou se zmrazováním a rozmrazováním nebo mechanickými střižnými silami.

Tímto způsobem lze za účelem inhibice oxidace methioninových zbytků na methionin sulfoxid přidat aminokyselinu methionin, a to v případě, pokud je polypeptidem působícím jako terapeutický přípravek polypeptid obsahující nejméně jeden zbytek methioninu, který je citlivý k takové oxidaci. Termín „inhibovat“ znamená minimální akumulaci oxidovaných vzorků methioninu v čase. Inhibice oxidace methioninu má za důsledek vyšší retenci polypeptidu v jeho vlastní molekulární formě. Použit může být jakýkoliv stereoisomer methioninu (L, D nebo DL isomer) nebo jejich kombinace. Přidané množství by mělo být množství dostatečné pro inhibici oxidace me- 10CZ 305123 B6 thioninových zbytků tak, že množství methionin-sulfoxidu je přijatelné pro příslušné instituce. Toto obvykle znamená, že prostředek neobsahuje více než přibližně 10 až asi 30 % methioninsulfoxidu. Tohoto lze obecně dosáhnout přidáním methioninu takovým způsobem, že poměr methioninu přidaného k methioninovým zbytkům je v rozmezí od přibližně 1:1 do asi 1000:1, nejvýhodněji od přibližně 10:1 do asi 100:1.

Výhodné množství methioninu, které má být přidáno, může být snadno empiricky určeno přípravou prostředku obsahujícího příslušný polypeptid a různé koncentrace methioninu a stanovením relativního účinku na tvorbu oxidované sloučeniny polypeptidu pomocí například chromatografické separace molekulárních vzorků a identifikace použitím polypeptidových molekulárních hmotnostních standard, jako jsou pro RP-HLPC, jak je popsáno níže v příkladu 2. Taková koncentrace methioninu, která maximalizuje inhibici oxidace methioninových zbytků bez nepříznivých účinků na inhibici agregace polypeptidu vyvolanou aminokyselinou, representuje výhodné množství methioninu, která má být přidáno do prostředku, za účelem dalšího zlepšení stability polypeptidu.

Degradace polypeptidu následkem cyklu zmrazování a rozmrazování nebo mechanických střižných sil v průběhu zpracovávání kapalného prostředku podle přítomného vynálezu může být inhibována inkorporací surfaktantů do kapalných polypeptid obsahujících prostředků podle přítomného vynálezu, a to za účelem snížení povrchového napětí na rozhraní roztok-vzduch. Obvykle používané surfaktanty jsou neionické surfaktanty, včetně esterů polyoxyethylensorbitolu, jako je polysorbát 80 (Tween 80) a polysorbát 20 (Tween 20); esterů polyoxypropylen-polyoxyethylenu jako Pluronic F68; alkoholů polyoxyethylenu jako je Brij 35; simethikonu polyethylenglykolů jako je PEG400; lysofosfatidylcholinu a polyoxyethylen-para-íerc-oktylfenolu jako je Triton X-100. Klasickou stabilizaci farmaceutických prostředků surfaktanty nebo emulgátory popisuje například Levin a kol., J. Parenteral Sci. Technol., 45(3), 160 až 165 (1991), ve zde citované referenci. Výhodný surfaktant používaný v postupech podle přítomného vynálezu je polysorbát 80.

Vedle přípravků uvedených výše, mohou být přidány další stabilizační přípravky, jako je albumin, kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA) nebo některá z jejích solí jako je dinatriumEDTA, a to pro další zvýšení stability kapalných farmaceutických prostředků. Množství albuminu, které může být přidáno, se pohybuje v koncentracích přibližně 1,0 % hmotn./objem nebo méně. EDTA působí jako odklízeč kovových iontů, které jsou známy jako katalyzátory mnoha oxidačních reakcí, čímž působí jako další stabilizační přípravek.

V jednom provedení přítomného vynálezu, obsahuje stabilizovaný kapalný farmaceutický prostředek IL-2 nebo jeho variantu jako polypeptid, argininovou bázi v koncentraci od přibližně 150 do asi 350 mmol, kyselinu jantarovou v koncentraci od přibližně 80 do asi 190 mmol, methionin v koncentraci od přibližně 0,5 do asi 10 mmol, EDTA v koncentraci od přibližně 0,1 do asi 5,0 mmol a polysorbát 80 od přibližně 0,001 do asi 0,2 %. Ve výhodném provedení, je argininová báze přítomna v tomto kapalném farmaceutickém prostředku obsahujícím IL-2 v koncentraci přibližně 230 mmol a kyselina jantarová je přítomna v koncentraci přibližně 128 mmol. Tento výhodný prostředek obsahující IL-2 má pH přibližně 5,8 a osmolaritu od přibližně 250 do asi 300 mmol/kg. Koncentrace IL-2 nebo jeho varianty je v těchto prostředcích od přibližně 0,01 do asi 2,0 mg/ml, s výhodou od přibližně 0,02 do asi 1,0 mg/ml, výhodněji od přibližně 0,03 do asi 0,8 mg/ml, nejvýhodněji od přibližně 0,03 do asi 0,5 mg/ml.

Pokud je to žádoucí, mohou být do stabilizovaných kapalných farmaceutických prostředků obsahujících polypeptid podle přítomného vynálezu začleněny cukry nebo alkoholové cukry. Může být použit jakýkoliv cukr jako jsou mono-, di—, nebo polysacharidy nebo ve vodě rozpustné glukany, včetně například fruktózy, glukózy, mannózy, sorbózy, xylózy, maltózy, laktózy, sacharózy, dextranu, pullulanu, dextrinu, cyklodextrinu, rozpustného škrobu, hydroxyethylškrobu a natriumkarboxymethylcelulózy. Nejvýhodnějším cukrovým přídatným přípravkem je sacharóza. Alkoholový cukr je definován jako uhlovodík se 4 až 8 atomy uhlíku, který má skupinu -OH, a

- 11 CZ 305123 B6 zahrnuje například mannitol, sorbitol, inozitol, galacititol, dulcitol, xylitol a arabitol, přičemž nejvýhodnějším přídatným přípravkem ze skupiny alkoholových cukrů je mannitol. Cukry nebo alkoholové cukry zmíněné výše mohou být použity jednotlivě nebo v kombinaci. Pro množství, které má být použito, neexistuje žádný stálý limit, za předpokladu, že je cukr nebo alkoholový cukr rozpustný v kapalném prostředku a neovlivňuje nepříznivě stabilizační účinky dosažené metodami podle přítomného vynálezu. Koncentrace cukru nebo alkoholového cukru se s výhodou pohybuje v rozmezí přibližně od 1,0 do asi 15,0 hmotn./objem %, výhodněji v rozmezí přibližně od 2,0 do asi 10,0 hmotn./objem %.

Stabilizované kapalné farmaceutické prostředky podle přítomného vynálezu mohou obsahovat další sloučeniny, které zvyšují účinnost nebo podporují žádoucí kvality příslušného polypeptidu, který působí jako terapeuticky aktivní složka, pokud není primární stabilizační účinek dosažený aminokyselinovou bází nepříznivě ovlivněn. Prostředek musí být bezpečný pro podání zvolenou cestou, musí být sterilní a musí si uchovávat požadovanou léčebnou aktivitu.

Prostředky podle přítomného vynálezu se s výhodou připraví přípravným míšením stabilizačních a pufrovacích přípravků a jakýkoliv jiných excipientů, před inkorporací příslušného polypeptidu. Jakékoliv další přídatné excipienty, které mohou být přidány pro další stabilizaci prostředků podle přítomného vynálezu, nesmí nepříznivě ovlivňovat stabilizační účinky primárních stabilizačních přípravků, tj. aminokyselinové báze, v kombinaci s pufrovacím přípravkem, tedy kyselinou důkladně zbavenou své soli, ve formě příslušné soli nebo směsí kyseliny a její soli, jež jsou používány pro přípravu nových prostředků zde popisovaných. Po přidání výhodného množství aminokyselinové báze k dosažení snížené tvorby agregátu příslušného polypeptidu, upraví se pH kapalného prostředku pomocí pufrovacího přípravku, s výhodou v rozmezí pH zde uvedeném, výhodněji na optimální pH pro příslušný polypeptid. Ačkoliv může být pH upraveno až po přidání příslušného polypeptidu do prostředku, upraví se s výhodou ještě před přidáním tohoto polypeptidu, čímž se může snížit riziko denaturace polypeptidu. Poté jsou použita příslušná mechanická zařízení pro dosažení řádného promísení složek.

Zatímco specifická provedení přítomného vynálezu se týkají stabilizovaných prostředků obsahujících interleukin-2 (IL—2) nebo jeho variantu, nebo inhibitor působení tkáňového faktoru (TFPI) nebo jeho variantu, tedy příklady proteinů, které jsou obzvláště citlivé k degradaci cestou tvorby agregátu, použitelnost přítomného vynálezu všeobecně dosahuje k jakémukoliv farmaceutickému prostředku, který obsahuje polypeptid nebo jeho variantu vykazující tvorbu agregátu během skladování v kapalné formulaci. Proto polypeptidy vhodné pro použití v praxi podle přítomného vynálezu zahrnují například, interleukin (například IL-2), interferony včetně β-interferonu (IFN-β) ajeho muteiny jako je IFN-p_seri7 (jakje popsáno v evropském patentovém spisu EP 1 854 59B1 a v patentu US 4 588 585, jenž jsou zde zahrnuty do odkazů), inhibitor působení tkáňového faktoru (TFPI), lidský růstový hormon (hGH), insulin a jiné podobné polypeptidy, které vykazují tvorbu agregátů v kapalné formulaci, stejně jako jakékoliv jejich biologicky aktivní varianty.

Polypeptidy přítomné ve stabilizovaných kapalných farmaceutických prostředcích podle přítomného vynálezu mohou být nativní nebo získané rekombinantními technikami a mohou být za jakéhokoliv zdroje, včetně savčího zdroje, jako je například myš, krysa, králík, primát, prase a člověk, za předpokladu, že splňují zde uvedená kriteria, to znamená za předpokladu, že tvoří agregáty v průběhu skladování v kapalných formulacích. S výhodou jsou tyto polypeptidy získány z lidského zdroje a výhodněji se jedná o rekombinantní lidské proteiny získané z mikrobiálních hostitelů.

Biologicky aktivní varianty příslušného polypeptidu, který působí jako terapeuticky aktivní složka ve farmaceutických prostředcích přítomného vynálezu, jsou také obsaženy v pojmu „polypeptid“, jak je v tomto spisu užíváno. Takové varianty by si měly uchovávat požadovanou biologickou aktivitu nativního polypeptidu na takové úrovni, že farmaceutický prostředek obsahující variantu polypeptidu má stejný léčebný účinek jako farmaceutický prostředek obsahující nativní polypeptid, pokud je podán subjektu. To znamená, že varianta polypeptidu bude působit jako

- 12CZ 305123 B6 terapeuticky aktivní složka farmaceutického prostředku způsobem podobným tomu, který je pozorován u nativního polypeptidu. Pro stanovení, zda-li si varianta příslušného polypeptidu uchovává požadovanou biologickou aktivitu, a tak působí jako terapeuticky aktivní složka farmaceutického prostředku, jsou v oboru k dispozici různé způsoby. Biologická aktivita může být měřena pomocí analýz specificky navržených pro měření aktivity nativního polypeptidu nebo proteinu včetně analýz popsaných v přítomném vynálezu. Navíc je možné testovat protilátky vytvořené proti biologicky aktivnímu nativnímu polypeptidu na jejich schopnost navázat variantu polypeptidu, přičemž účinné navázání je indikátorem, že polypeptid má podrobnou konformaci jako nativní polypeptid.

Vhodné biologicky aktivní varianty nativního nebo přirozeně se vyskytujícího příslušného polypeptidu mohou být fragmenty, analoga a deriváty tohoto polypeptidu. Termín „fragment“ znamená polypeptid obsahující pouze část intaktní polypeptidové sekvence a struktury a může vzniknout delecí na C-konci nebo delecí na N-konci nativního polypeptidu. Termín „analogům“ vyjadřuje analogům buď nativního polypeptidu, nebo analogům fragmentu nativního polypeptidu, kdy analogům obsahuje nativní polypeptidovou sekvenci a strukturu s jednou nebo více substitucemi aminokyselin, insercemi nebo delecemi. Termín analogům zahrnuje též název „muteiny“, jak je zde popsáno, a peptidy obsahující jeden či více peptoidů (peptidových napodobenin), viz zveřejněná mezinárodní patentová přihláška WO 91/04 282. Termín „derivát“ znamená jakoukoliv vhodnou modifikaci příslušného nativního polypeptidu, nebo fragment nativního polypeptidu nebo jejich analog, jako jsou glykosylované, fosfoiylované nebo jiné další adiční skupiny, za předpokladu, že je zachována požadovaná biologická aktivita nativního polypeptidu. Postupy pro přípravu polypeptidových zlomků, analog a derivátů jsou v oboru všeobecně známé.

Například, varianty aminokyselinové sekvence polypeptidu mohou být připraveny mutacemi v sekvenci klonované DNA kódující nativní polypeptid našeho zájmu. Postupy mutageneze a alterace nukleotidové sekvence jsou v oboru dobře známy. Viz například, Walker and Gaastra, vyd., Techniques in Molecular Biology, MacMillan Publishing Company, New York, (1983); Kunkel, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82, 488 až 49 (1985); Kunkel a kol., Methods Enzymol., 154, 367 až 382 (1987), Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York) (1989); patent US 4 873 192 a reference citované tamtéž; jsou zde začleněny v odkazech. Návod pro příslušné aminokyselinové substituce, které neovlivňují biologickou aktivitu příslušného polypeptidu lze nalézt v modelu, který popisuje Dayhoff a kol., Atlas of Protein Sequence and Structure, Nati. Biomed. Res. Found. Washington, D. C., (1987), zde začleněný do obsahu. Konzervativní substituce, jako je výměna jedné aminokyseliny jinou mající podobné vlastnosti, může být výhodnější. Příklady konzervativních substitucí zahrnují GlyoAla, ValoIleoLeu, AspoGlu, LysoArg, AsnoGln a PheoTrpoTyr.

Při vytváření variant příslušného polypeptidu, jsou modifikace prováděny tak, že varianty stále mají požadovanou aktivitu. Samozřejmě, jakékoliv mutace vzniklé v DNA, která kóduje variantu polypeptidu, nesmí umístit sekvenci mimo čtecí rámec a s výhodou nevytváří komplementární oblasti, které by mohly vytvořit sekundární mRNA strukturu. Viz patentový spis EP 75 444.

Biologicky aktivní varianty příslušného polypeptidu mají všeobecně nejméně 70%, s výhodou nejméně 80%, výhodněji přibližně od 90 do asi 95% nebo více, a nejvýhodněji přibližně 98% a více, shodu v aminokyselinové sekvenci s aminokyselinovou sekvencí referenční polypeptidové molekuly, která slouží jako základ pro srovnání. Biologicky aktivní varianta příslušného nativního polypeptidu se může lišit od nativního polypeptidu v tak málo jako v 1 až 15 aminokyselinových zbytcích, v 1 až 10 aminokyselinových zbytcích, v 6 až 10 aminokyselinových zbytcích, v 5 aminokyselinových zbytcích, ve 4, 3, 2, nebo dokonce 1 aminokyselinovém zbytku. Termín „shoda v sekvenci“ znamená, že se vyskytují stejné aminokyselinové zbytky ve variantě polypeptidu a polypeptidové molekule, která slouží jako molekula referenční, pokud je specifický, přiléhající segment aminokyselinové sekvence varianty přiložen a porovnán s aminokyselinovou sekvencí referenční molekuly. Procentuální shoda v sekvenci mezi dvěma aminokyselinovými sekvencemi se vypočte určením počtu poloh, ve kterých se nacházejí identické aminokyselinové

- 13 CZ 305123 B6 zbytky v obou sekvencích, čímž se získá počet shodujících se poloh, dále vydělením počtu shodujících se poloh celkovým počtem poloh v segmentu, který je porovnáván s referenční molekulou, a vynásobením výsledku lOOx, čímž se získá procento identity v sekvenci.

Pro optimální seřazení dvou sekvencí, přiléhající segment aminokyselinové sekvence varianty polypeptidu může mít další aminokyselinové zbytky s ohledem na aminokyselinovou sekvenci referenční molekuly. Přiléhající segment použitý pro porovnání referenční aminokyselinové sekvence bude obsahovat nejméně dvacet (20) přiléhajících aminokyselinových zbytků a možná 30, 40, 50, 100 nebo více zbytků. Opravy zvýšené sekvenční identity spojené s včleněním mezer do aminokyselinové sekvence varianty mohou být provedeny přiřazením tzv. „gap penalties“ (mezerových penalt). Způsoby seřazení sekvence jsou v oboru dobře známé, jak pro aminokyselinové sekvence, tak pro sekvence nukleotidů kódujících aminokyselinové sekvence.

Proto stanovení procentuální identity mezi jakýmikoliv dvěma sekvencemi může být provedeno použitím matematického algoritmu. Jedním z výhodných, neomezujících příkladů matematického algoritmu používaného pro srovnání sekvencí je algoritmus dle publikace Meyers a Miller, CABIOS 4, 11 až 17 (1988). Tento algoritmus se použije v programu ALIGN (verze 2.0), který je součástí softwarového systému pro řazení sekvencí GCG. Tabulka hmotnostních zbytků APAM 120, délka mezerové penalty 12, a mezerová penalta 4 mohou být použity společně s programem ALIGN pro porovnání aminokyselinových sekvencí. Jiným výhodným neomezujícím příkladem matematického algoritmu pro použití při porovnávání dvou sekvencí je algoritmus popsaný v publikaci Karlin a Altschul, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87, 2264 (1990), modifikováno podle Karlina a Altschule, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90, 5873 až 5877 (1993). Tento algoritmus je včleněn do programů NBLAST a XBLAST, které zavádí Altschul a kol., J. Mol. Biol., 215, 403 (1990). Nukleotidové vyhledávání BLAST může být provedeno programem NBLAST, skóre = 100, délka slova = 12, za účelem zisku nukleotidových sekvencí homologních k nukleotidové sekvenci kódující polypeptid našeho zájmu. Vyhledávání proteinů systémem BLAST může být provedeno za použití programu XBLAST, skóre = 50, délka slova = 3, za účelem získání aminokyselinových sekvencí homologních s příslušným polypeptidem. K přeložení mezerových penalt pro účely srovnání, může být použit Gapped BLAST, jak popsal Altschul a kol., Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997). Alternativně může být použit PSI-Blast k provedení opakovaného vyhledání, který detekuje vzdálené vztahy mezi molekulami. Viz Altschul a kol., reference uvedená výše (1997). Pokud jsou použity programy BLAST, Gapped BLAST a PSI-Blast, lze použít parametry prodlení příslušných programů (například XBLAST a NBLAST). Viz http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Viz také program ALIGN (Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure 5: dodatek 3, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., (1978)) a programy uvedené ve Wisconsin Sequence Analysis Package, verze 8 (dostupné od Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), například program GAP, kde jsou použity parametry prodlení uvedených programů.

Pokud uvážíme procento identity v aminokyselinové sekvenci, některé polohy aminokyselinových zbytků se mohou lišit následkem konzervativních aminokyselinových substitucí, které neovlivňují vlastnosti proteinové funkce. V těchto případech může být procentuální sekvenční identita upravena na vyšší hodnoty, aby byla započítána podobnost v konzervativně substituovaných aminokyselinách. Takové úpravy jsou v oboru dobře známy. Viz například Myers a Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4, 11 až 17 (1988).

Přesná chemická struktura polypeptidu závisí na mnoha faktorech. Jelikož jsou v molekule přítomny ionizovatelné aminoskupiny a karboxylové skupiny, může být daný polypeptid získán jako kyselá nebo bazická sůl nebo v neutrální formě. Všechny takovéto preparáty uchovávající si svou biologickou aktivitu za určitých podmínek okolního prostředí jsou zahrnuty do definice polypeptidů podle přítomného vynálezu, která je zde užívána. Navíc primární aminokyselinová sekvence polypeptidu může být posílena derivatizací pomocí cukrových částí (glykosylace) nebo jinými suplementámími molekulami jako jsou lipidy, fosfát, acetylové skupiny a podobné. Může být také posílena konjugací se sacharidy. Určité aspekty takového rozšíření jsou provedeny post- 14CZ 305123 B6 trans lační systémy zpracování produkujícího hostitele; další takovéto modifikace mohou být zavedeny in vitro. V každém případě jsou takovéto modifikace zahrnuty do definice polypeptidů podle přítomného vynálezu, která je zde užívána, za předpokladu, že aktivita polypeptidu není alterována. Očekává se, že takové modifikace mohou kvantitativně nebo kvalitativně ovlivnit aktivitu, buď zvýšením, nebo snížením aktivity polypeptidu, v různých zkouškách. Navíc mohou být jednotlivé aminokyselinové zbytky v řetězci modifikovány oxidací, redukcí nebo jinou derivatizací a polypeptid může být štěpen pro zisk fragmentů, které si uchovávají aktivitu. Tyto změny, které nealterují aktivitu polypeptidových sekvencí, není nutno exkludovat z definice polypeptidu, která je zde užívána.

Dosavadní stav techniky poskytuje dostatečný dohled, co se týká přípravy a použití polypeptidových variant. Při přípravě polypeptidových variant může odborník v oboru snadno určit, které modifikace nativního proteinového nukleotidu nebo aminokyselinové sekvence budou mít za následek vznik varianty, která je vhodná pro použití jako terapeuticky aktivní složka farmaceutického prostředku podle přítomného vynálezu, a u které se tvorba agregátu sníží přítomností aminokyselinové báze a kyseliny důkladně zbavené její soli, přítomností soli kyseliny nebo směsí kyseliny a její soli, jak je zde popsáno.

V jednom provedení přítomného vynálezu, polypeptidem přítomným jako terapeuticky aktivní složka v kapalném farmaceutickém prostředku podle přítomného vynálezu je interleukin-2 (IL— 2) nebo jeho varianta, s výhodou rekombinantní IL-2. Interleukin-2 je lymfokin, který je produkován normálními periferními krevními lymfocyty a je v těle přítomen v malých koncentracích. Indukuje proliferaci T-buněk stimulovaných antigenem nebo mitogenem po expozici rostlinným lektinům, antigenům nebo jiným stimulům. IL-2 poprvé popsal Morgan a kol., Science, 193, 1007 až 1008 (1976) a původně byl nazýván růstovým faktorem T-buněk díky své schopnosti vyvolat proliferaci stimulovaných T-lymfocytů. Jedná se o protein s uváděnou molekulární hmotností v rozmezí od 13 000 do 17 000 (Gillis a Watson, J. Exp. Med. 159, 1709 (1980)), který má izoelektrický bod v rozmezí 6 až 8,5. Nyní bylo zjištěno, že kromě vlastností růstového faktoru také moduluje různé funkce imunitního systému in vitro a in vivo. IL-2 je jeden z několika lymfocyty produkovaných molekul fungující jako „messengers“ (poslové), které zprostředkovávají buněčné interakce a funkce. Bylo prokázáno, že tento přirozeně se vyskytující lymfokin má antitumorosní aktivitu proti různým malignitám buď jako takový, nebo v kombinaci s LAK buňkami (lymphokine-activated killer, lymfokiny aktivované zabíječské buňky) nebo tumor infiltrujícími lymfocyty viz, například Rosenberg a kol., N. Engl. J. Med., 316, 889 až 897 (1987), Rosenberg, Ann. Surg. 208, 121 až 135 (1988), Topalian a kol., J. Clin. Oncol., 6, 839 až 853 (1988), Rosenberg a kol., N. Engl. J. Med., 319, 1676 až 1680 (1988) a Weber a kol., J. Clin. Oncol., 10, 33 až 40 (1992). Ačkoliv anti-tumorosní aktivita IL-2 byla popsána u pacientů s metastatickým melanomem a renálním karcinomem, zdá se, že také jiné chorobné stavy, především lymfom, též odpovídají na léčbu IL-2.

Pojem „rekombinantní IL-2“ znamená interleukin-2, který má srovnatelnou biologickou aktivitu s IL-2 s nativní sekvencí, a který byl připraven metodami s rekombinantní DNA, jak popisuje například Taniguchi a kol., Nátuře, 302, 305 až 310 (1983) a Devos, Nucleic Acids Research, 11, 4307 až 4323 (1983), nebo s mutačně alterovaným IL-2, jak popisuje Wang a kol., Science 224, 1431 až 1433 (1984). Obvykle se nakloňuje gen kódující IL-2 a poté je exprimován transformovanými organismy, s výhodou mikroorganismem a nejvýhodněji E.coli, jak je zde popsáno. Hostitelský organismus exprimuje cizí gen, a tak produkuje IL-2 při expresních podmínkách. Syntetický rekombinantní IL-2 může být také vytvářen eukaryontní organismy, jako jsou kvasinkové nebo lidské buňky. Způsoby pěstování, sběru, disrupci nebo extrakci IL-2 z buněk jsou důkladně popsány například v US patentech US 4 604 377, US 4 738 927, US 4 656 132, US 4 569 790, US 4 748 234, US 4 530 787, US 4 572 298 a US 4 931 543, které jsou zde v celém znění začleněny do odkazů.

Příklady variant IL-2 proteinů jsou uvedeny v evropském patentovém spisu EP 136 489, evropské patentové přihlášce 83101035.0 podané 3. února 1983 (publikované 19. října 1983 pod publi- 15CZ 305123 B6 kačním č. 91 539); evropské patentové přihlášce 82307036.2, podané 22. prosince 1982 (publikované 14. září 1983 pod č. 88 195), příklady rekombinantních muteinů IL-2 jsou popsány v evropské patentové přihlášce EP 83306221.9, podané 13. října 1983 (publikované 30. května 1984 pod č. 109 748), která je ekvivalentem belgického patentu 893 016, obecně uznaným patentem US 4 518 584; muteiny popsané v patentu US 4 752 585 a dokumentu WO 99/60 128; a IL-2 mutein používaný zde v příkladech popsané v patentu US 4 931 543; veškeré příklady jsou zde začleněny do odkazů. Navíc, IL-2 lze modifikovat polyethylenglykolem pro zvýšení rozpustnosti a odlišný farmakokinetický profil (viz patent US 4 766 106, který je zde jako celek začleněn odkazem).

V jiném provedení přítomného vynálezu, je polypeptid přítomen jako terapeuticky aktivní složka v kapalném farmaceutickém prostředku podle přítomného vynálezu interferon, konkrétněji fibroepiteliální β-interferon (IFN-β) nebo jeho varianta, s výhodou se jedná o rekombinantní IFN-β připravený metodami s rekombinantní DNA, které již byly v oboru popsány. Interferony jsou produkovány savčími buňkami jako odpověď na expozici mnoha indukčním signálům, jako jsou mitogeny, polypeptidy, viry a jim podobné. Tyto relativně malé druhově specifické polypeptidy s jednoduchým řetězcem vykazují imunoregulační, antivirové a antiproliferativní vlastnosti. Interferony jsou ve středu zájmu jako léčebné prostředky pro léčbu virových onemocnění a kontrolu rakoviny.

DNA sekvence kódující lidské geny pro IFN-β jsou v oboru již popsány (viz Goeddel a kol., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980) a Taniguchi a kol., Proč. Japan acad. Sci., 855, 464 (1979)) a příslušné geny byly exprimovány E. coli (Taniguchi a kol., Gene, 10, 11 až 15 (1980)) a ovariálními buňkami čínských křečků (viz například patenty US 4 966 843 a US 5 376 567) . Varianty IFN-β jsou popsány v evropské patentové přihlášce EP 185459B1; patenty US 4 518 584, US 4 588 585 a US 4 737 462 popisují muteiny jako je IFN^_serl7 exprimované E. coli, všechny jsou zde zahrnuty do odkazů.

Ještě v dalším provedení je polypeptid přítomný jako terapeuticky aktivní složka v kapalném farmaceutickém prostředku vynálezu inhibitor působení tkáňového faktoru (TFPI) nebo jeho varianta, s výhodou rekombinantní TFPI. Tento polypeptid, který je inhibitorem koagulační kaskády je také znám jako inhibitor koagulace spojené s lipoproteiny (LÁCI), inhibitor tkáňového faktoru (TFI) a inhibitor extrinsické cesty (EPI). TFPI byl poprvé purifikován z buněk lidského hepatomu, Hep G2 (Brože a Miletich, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 1886 až 1890 (1987)) a následně z lidské plazmy (Novotný a kol., J. Biol. Chem., 264, 18832 až 18837 (1989)); a jaterních buněk typu Chang a buněk SK hepatomu (Wun a kol., J. Biol. Chem., 265, 16096 až 16101 (1990)). TFPI cDNA byla izolována z placentámích a endoteliálních bank cDNA (Wun a kol., J. Biol. Chem., 263, 6001 až 6004 (1988); Girard a kol., Thromb. Res., 55, 37 až 50 (1989). Pro reakce viz Rapaport, Blood, 73, 359 až 365 (1989); Brože a kol., Biochemistry, 29, 7539 až 7546 (1990)). Klonování TFPI cDNA, která kóduje 276 aminokyselinových zbytků proteinu TFPI, je dále popsáno v patentu US 4 966 852; viz také patenty US 5 773 251 a US 5 849 875; všechny jsou zde začleněny do referencí.

Varianty TFPI jsou v oboru známé. Viz například patent US 5 212 091, kde je popsána produkce neglykosylované formy rekombinantního TFPI a izolována z E. coli; patent US 5 106 833 popisuje analoga a fragmenty a patent US 5 378 614, kde je popsána produkce analog TFPI u kvasinek; přičemž všechny výše uvedené publikace jsou zde začleněny referencí.

Subjektu se podá farmaceuticky účinné množství stabilizovaného kapalného farmaceutického prostředku obsahujícího polypeptid podle přítomného vynálezu. Pojem „farmaceuticky účinné množství“ znamená množství, které je účinné v léčbě, prevenci nebo pro diagnózu onemocnění nebo chorobného stavu. Typické cesty podání zahrnují, avšak nejsou omezeny na, perorální podání a parenterální podání, včetně intravenózní, intramuskulámí, subkutánní, intraarteriální a intraperitoneální injekci nebo infuzi. V jednom provedení přítomného vynálezu, je podání prove-16CZ 305123 B6 děno injekcí, s výhodou subkutánní injekcí. Injekční formy prostředků podle vynálezu zahrnují, bez omezení na, roztoky, suspenze a emulze.

Stabilizovaný kapalný farmaceutický prostředek obsahující příslušný polypeptid by měly být formulovány v jednotkové dávce a pokud možno v injekční nebo infuzní formě, jako je roztok, suspenze nebo emulze. Dále, mohou být skladovány zmrazené nebo připraveny ve vysušené formě, jako je lyofilizovaný pudr, který může být rekonstituován na kapalný roztok, suspenzi nebo emulzi před podáním jakoukoliv cestou včetně perorální nebo parenterální cesty podání. S výhodou je zmíněný prostředek skladován ve formě kapalné formulace, čímž se využije výhody zvýšené skladovací stability získané v souladu se způsoby podle přítomného vynálezu, jež jsou vysvětleny níže. Stabilizovaný farmaceutický prostředek se s výhodou sterilizuje membránou filtrací a je skladován v jednodávkových nebo vícedávkových nádobách, jako jsou uzavřené nádoby nebo ampule. Dále mohou být použity další postupy formulování farmaceutického prostředku v oboru všeobecně známé, za účelem dalšího zvýšení skladovací stability kapalných farmaceutických prostředků zde uvedených, za předpokladu že tyto postupy nepříznivě neovlivní prospěšné účinky výhodných stabilizačních a pufrovacích přípravků popsaných ve způsobech podle přítomného vynálezu. Důkladná diskuse týkají se formulace a výběru farmaceuticky přijatelných nosičů, stabilizátorů atd. lze najít publikaci v Remingtonů Pharmaceutical Sciences (18. vydání, Mack Pub. Co., Eaton, Pensylvánie) (1980), která je zde zahrnuta do odkazů.

Pojem „subjekt“ zahrnuje jakékoliv zvíře. S výhodou je subjekt savec, nej výhodněji je subjektem člověk. Savci obzvláště důležití zahrnují, kromě člověka, psy, kočky, krávy, koně, ovce a prasata, avšak bez omezení na uvedené.

Pokud je podání učiněno za účelem léčby, může mít profylaktický nebo léčebný cíl. Pokud je poskytnuto profylaktický, látka je poskytnuta před výskytem jakéhokoliv příznaku. Profylaktické podání látky slouží k prevenci nebo oslabení příznaku, který by se mohl objevit. Pokud se jedná o léčebné podání, je látka poskytnuta při nástupu (nebo krátce po nástupu) příznaku. Léčebné podání látky slouží k oslabení jakéhokoliv aktuálního příznaku.

Tudíž, například, prostředky obsahující účinné množství farmaceutického prostředku podle přítomného vynálezu zahrnujícího nativní sekvenci IL-2 nebo její variantu mohou být použity k léčení, prevenci a ke stanovení diagnózy v mnoha klinických indikacích, které reagují na léčbu tímto polypeptidem. Biologicky aktivní varianty nativní sekvence IL-2, jako jsou muteiny IL-2, které si uchovaly aktivitu IL-2, obzvláště mutein IL-2. sub. serl25 a jiné muteiny, ve kterých je cystein v poloze 125 nahrazen jinou aminokyselinou, mohou být formulovány a použity stejným způsobem jako nativní sekvence IL-2. Následně, formulace podle přítomného vynálezu zahrnující nativní sekvenci IL-2 nebo její variantu jsou užitečné pro diagnózu, prevenci a terapii (lokální nebo systémovou) bakteriálních, virových, parazitárních, protozoámích a mykotických infekcí; pro augmentaci cytotoxicity zprostředkované buňkami; pro stimulaci aktivity lymfokiny aktivovaných zabíječských buněk (LAK - lymphokine activated killer cell); pro zprostředkování obnovení imunitní funkce lymfocytů; pro zvýšení odpovědi na alloantigen (cizorodý antigen); pro povzbuzení obnovení imunitní funkce u stavů získané imunodeficience; pro rekonstituci normální imunitní funkce u starších lidí a zvířat; pro vývoj diagnostických testů, například těch, které zahrnují amplifikaci enzymu, radioaktivní označení, radioaktivní zobrazení a jiné postupy známé v oboru pro monitorování hladin IL-2 u chorobných stavů; pro podporu proliferace T-buněk in vitro pro terapeutické a diagnostické účely; pro blokování receptorových míst pro lymfokiny; a pro různé jiné léčebné, diagnostické nebo výzkumné aplikace. Různé léčebné a diagnostické možnosti použití lidského IL-2 nebo jeho variant, jako jsou muteiny IL-2, byly zkoumány a uveřejněny v publikacích Rosenberg a kol., N. Engl. J. Med., 316, 889 až 897 (1987); Rosenberg, Ann. Surg., 208, 121 až 135 (1988); Topalian a kol., J. Clin. Oncol., 6, 839 až 853 (1988); Rosenberg a kol., N. Engl. J. Med., 319, 1676 až 1680 (1988); Weber a kol., J. Clin. Oncol., 10, 33 až 40 (1992); Grimmol a kol., Cell. Immulunol, 70(2), 248 až 259 (1982); Mazumder, Cancer J. Sci. Am., 3 (dodatek 1), 37 až 42 (1997); Mazumder a Rosenbeg, J. Exp. Med., 159(2), 495 až 507 (1984) a Mazumder a kol., Cancer Immunol. Immolunother., 15(1), 1 až 10 (1983). Formu- 17CZ 305123 B6 láce podle přítomného vynálezu obsahující IL—2 nebo jeho variantu mohou být použity jako jediný terapeutický přípravek nebo mohou být použity v kombinaci s dalšími imunologicky relevantními B- či T-buňkami nebo v kombinaci s jinými terapeutickými přípravky. Příklady odpovídajících buněk jsou B-buňky či T-buňky, přirozené zabíječské buňky, LAK buňky a jim podobné, a příklady terapeutických činidel, která lze použít v kombinaci s IL-2 nebo jeho variantou, jsou rozličné interferony, obzvláště interferon gamma, růstový faktor B-buněk, IL—1 a protilátky, například anti-HER2 nebo anti-CD20 protilátky. Prostředky podle přítomného vynálezu obsahující IL-2 nebo jeho variantu mohou být podány člověku či zvířeti perorálně, intraperitoneálně, intramuskulámě, subkutánně, intravenózně, intranazálně nebo do plic, jak je vyžadováno indikujícím lékařem. Podané množství IL-2 (buď v nativní sekvenci, nebo jako varianta nativní sekvence se Zachovalou biologickou účinností IL-2, jako jsou například muteiny popsané v tomto spisu) se může pohybovat v rozmezí přibližně 0,1 do přibližně 15 mIU/m². V indikacích, jako je karcinom ledviny nebo metastatický melanom, může být IL-2 nebo jeho biologicky účinná varianta podána jako intravenózní bolus ve vysoké dávce 300 000 až 800 000 IU/kg na 8 hodin.

Formulace obsahující účinné množství farmaceutických prostředků podle přítomného vynálezu, které obsahují nativní sekvenci inhibitoru působení tkáňového faktoru (TPFI) nebo jeho varianty, jsou vhodné pro diagnózu, prevenci a terapii (místní nebo systémovou) klinických stavů, které odpovídají na terapii tímto polypeptidem. Tyto klinické stavy zahrnují například onemocnění související se zvýšenou syntézou a uvolňováním neutrofilové elastázy, jako jsou zánětlivá onemocnění včetně těžké akutní pankreatitidy, emfyzému, revmatoidní artritidy, mnohočetného orgánového selhání, cystické fibrózy, syndromu dechové tísně dospělých (ARDS) a sepse; a pro diagnózu a terapii chorob souvisejících se zvýšenou syntézou a uvolňováním IL-8, které zahrnují zánětlivá onemocnění jako ARDS, reperfiizní trauma (včetně pulmonámího reperfuzního traumatu), sepsi a artritidu. Podrobněji viz dokument WO 96/40 224, který je v tomto spisu zahrnut v odkazech. Podání IFN-β nebo jeho muteinů člověku či zvířeti může být provedeno cestou perorální, intraperitoneální, intramuskulámí, intranazální, subkutánní, intravenózní, intranazální nebo intrapulmonální dle úmyslu indikujícího lékaře.

Formulace obsahující účinné množství farmaceutických prostředků podle přítomného vynálezu, které obsahují interferon-β (IFN-β) nebo jeho variantu, například ΙΡΝ-β_56Γΐ7, jsou vhodné pro diagnózu, prevenci a terapii (místní nebo systémovou) klinických stavů, které odpovídají na terapii tímto polypeptidem. Tyto klinické stavy zahrnují například onemocnění centrálního nervového systému (CNS), mozku a/nebo páteře včetně Alzheimerovy nemoci, Parkinsonovy nemoci, demence s Lewyho tělísky, roztroušené sklerózy, epilepsie, cerebellámí ataxie, progresivní supranukleámí obrny, amyotrofické laterální sklerózy, afektivních poruch, anxiozních poruch, obsedantně kompulzivních poruch, poruchy osobnosti, poruchy s deficitem pozornosti, poruchy s deficitem pozornosti a hyperaktivitou, Tourettova syndromu, Tay-Sachsovy choroby, Niemann-Pickovy choroby a schizofrenie; dále zahrnují poškození nervu v důsledku cerebrovaskulámích příhod, jako je mozková či míšní mrtvice, poškození nervu v důsledku infekcí CNS zahrnující meningitidu a HIV, poškození nervu zapříčiněného tumory mozku a míchy, nebo poškození nervu v důsledku prionových infekcí; dále zahrnují autoimunní choroby včetně získané imunodeficience, revmatoidní artritidy, psoriázy, Crohnovy choroby, Sjorgenova syndromu, amyotrofní laterální sklerózy a lupusu; a dále zahrnují maligní nádory včetně nádorů prsu, prostaty, močového měchýře, ledvin a tlustého střeva. Podání IFN-β nebo jeho muteinů člověku nebo zvířeti může být provedeno cestou perorální, intraperitoneální, intramuskulámí, subkutánní, intravenózní, intranazální nebo intrapulmonální dle potřeby indikujícího lékaře.

Přítomný vynález též poskytuje způsob zvyšování stability polypeptidu v kapalné farmaceutické formulaci, ve kterém polypeptid představující terapeuticky účinnou složku, vykazuje v průběhu skladování v kapalné formulaci tvorbu agregátů. Zmíněný způsob zahrnuje inkorporaci aminokyselinové báze do kapalného farmaceutického prostředku v množství dostatečném pro snížení tvorby agregátů polypeptidu v průběhu skladování kapalného farmaceutického prostředku, a dále inkorporaci kyseliny důkladně zbavené její soli, kyseliny ve formě příslušné soli, nebo směsi

-18CZ 305123 B6 kyseliny a její soli, přičemž kyselina funguje jako pufrovací přípravek udržující pH kapalného prostředku v přijatelném rozmezí, jak bylo popsáno výše.

Zvyšování stability polypeptidů nebo jeho varianty prostřednictvím inkorporace aminokyselinové báze nebo aminokyselinové báze s jedním či více přídatnými stabilizačními přípravky zde popsanými, v kombinaci s pufrovacím přípravkem zde popsaným, například s kyselinou důkladně zbavenou její soli, kyselinou ve formě příslušné soli, nebo se směsí kyseliny a její soli, vede ke zvýšení stability kapalného farmaceutického prostředku obsahujícího polypeptid v průběhu jeho skladování. Proto přítomný vynález také popisuje způsob zvyšování skladovací stability kapalného farmaceutického prostředku v takovém případě, kdy tento farmaceutický prostředek zahrnuje polypeptid, který vykazuje v průběhu skladování v kapalné formulaci tvorbu agregátů. Termín „zvyšování skladovací stability“ vyjadřuje, že farmaceutický prostředek vykazuje v průběhu skladování vyšší retenci polypeptidů či jeho varianty v příslušné neagregované biologicky aktivní konformaci, a tím také menší pokles terapeutické účinnosti, při porovnání s kapalným farmaceutickým prostředkem připraveným v nepřítomnosti aminokyselinové báze nebo aminokyselinové báze s jedním či více přídatnými stabilizačními přípravky zde popsanými, v kombinaci s pufrovacím přípravkem zde popsaným.

Skladovací stabilita farmaceutických prostředků obsahujících polypeptidy připravených v souladu s postupy podle přítomného vynálezu může být stanovena za použití standardních postupů v oboru známých. Skladovací stabilita takovýchto prostředků se obvykle stanoví použitím profilů skladovací stability. Tyto profily se získají monitorováním změn v množství polypeptidů přítomného v jeho neagregované biologicky aktivní molekulární formě a jeho potence v čase odpovídat na různé proměnné, například pH, koncentraci, přítomnost stabilizačního přípravku, koncentraci stabilizačního přípravku, atd., jak je například demonstrováno v příkladech uvedených dále. Tyto profily stability mohou být sestrojeny při několika teplotách, které jsou reprezentativní pro možné skladovací podmínky, například pro skladování za mrazu, v lednici, při teplotě místnosti či při zvýšené teplotě, například 40 až 50 °C. Skladovací stabilita se poté srovná s jednotlivými profily tím způsobem, že se například stanoví poločas neagregované biologicky účinné molekulární formy zkoumaného polypeptidů. Termínem „poločas“ se míní čas potřebný pro pokles množství neagregované biologicky účinné molekulární formy zkoumaného polypeptidů o 50 %. Prostředky podle přítomného vynálezu obsahující argininovou bázi a kyselinu důkladně zbavenou její soli připravené v souladu se způsoby podle přítomného vynálezu budou mít poločas, který je alespoň dvakrát až přibližně desetkrát vyšší, s výhodou alespoň třikrát až přibližně desetkrát vyšší, výhodněji alespoň čtyřikrát až přibližně desetkrát vyšší, nejvýhodněji alespoň pětkrát až přibližně desetkrát vyšší než je poločas kapalného prostředku připraveného v nepřítomnosti aminokyselinové báze, nebo aminokyselinové báze v kombinaci s jedním či více stabilizačními přípravky zde popsanými, v kombinaci s kyselinou důkladně zbavenou její soli, kyselinou ve formě příslušné soli, nebo jako směsi kyseliny a její soli. Pro účely přítomného vynálezu se farmaceutický prostředek mající zvýšenou skladovací stabilitu v důsledku přípravy v souladu s postupy podle přítomného vynálezu považuje za „stabilizovaný“ farmaceutický prostředek. Takovýto stabilizovaný prostředek má s výhodou skladovací životnost alespoň 18 měsíců, výhodněji alespoň 20 měsíců, ještě výhodněji alespoň 22 měsíců a nejvýhodněji alespoň 24 měsíců při skladování při teplotě 2 až 8 °C.

Následující příklady ilustrují přítomný vynález, avšak v žádném případě ho nevymezují.

Příklady uskutečnění vynálezu

Experimentální část

IL-2 je potentní mitogen, který stimuluje proliferací T-buněk. Má široké terapeutické využití, například při léčení metastáz maligních nádorů, jako adjuvantní přípravek při léčbě maligních nádorových onemocnění a jako přídatný přípravek při terapii infekčních onemocnění.

-19CZ 305123 B6

S postupem různých klinických experimentů využívajících terapii IL-2 bylo pozorováno, že příprava stabilní kapalné formulace takového proteinu je vysoce žádoucí. Takováto formulace by byla univerzálněji použitelná, nežli tradiční lyofilizované formulace, protože by mohla být dodána v různých koncentracích v závislosti na rozličných dávkovačích režimech. Kapalná formulace by též byla pohodlnější co se podávání týká a nebylo by třeba žádné rekonstituce. Takováto formulace může být dodána v předem naplněných stříkačkách připravených k přímému použití, nebo ve formě vícedávkových prostředků, pokud budou prohlášeny za kompatibilní s bakteriostatickými přípravky.

Bylo oznámeno, že IL-2 v kapalných formulacích v průběhu skladování degraduje alespoň třemi způsoby: agregací, oxidací methioninu a deaminaci (Kunitami a spol., J. Chromatography, 359, 391 až 401 (1986); Kenney a kol., Lymphokine Res., 5, 523 až 527 (1986)). Navíc IL-2 je susceptibilní k akutnímu poškození zapříčiněnému zmrazováním a rozmrazováním a mechanickým střihovým silám. Proto je nutné, aby formulace obsahující IL-2 odolávala jak akutnímu poškození, tak i chronické degradaci.

Následně byla vyvinuta nová stabilní formulace obsahující monomemí rhIL-2. V této formulaci jsou proteinové molekuly přítomné v roztoku v jejich monomemí formě, ne ve formě agregované. Takže nejsou přítomny kovalentní či hydrofobní oligomery nebo agregáty rhIL-2. Tato formulace obsahuje několik stabilizačních přípravků, zejména arginin a methionin, a to pro stabilizaci proteinu proti fyzikálním a chemickým poškozením, jako jsou například agregace, oxidace methioninu a deaminace, ke kterým dochází v průběhu dlouhodobého skladování. Navíc je do formulace zahrnut neionický surfaktant, polysorbát 80, za účelem ochránění proteinu před akutním poškozením zapříčiněným cykly zmrazování a tání a mechanickými střižnými silami. Jak je demonstrováno v následujících příkladech, přidání stabilizačních přípravků podle přítomného vynálezu k formulaci obsahující rhIL-2 zvyšuje její skladovací stabilitu.

Molekula IL-2 používaná v uvedených příkladech je rekombinantní humánní mutein IL-2, aldesleukin s cysteinem v poloze 125 nahrazeným serinem (des-alanyl-1, serin-125 humánní interleukin-2). Tato molekula je exprimována E. coli a následně je čištěna diafiltrací a kationtovou výměnnou chromatografii, jak je popsáno v patentu US 4 931 543. Očištěné množství pro použití v experimentuje přibližně 3 mg/ml interleukinu-2 aje formulováno buď v podobě 10 mmol citrátu sodného o pH = 6 ve 200 až 250 mmol NaCl (CM pufr), nebo v podobě pufru obsahujícího 10 mmol sukcinátu sodného o pH = 6 a 150 mmol L-argininu.

Inhibitor působení tkáňového faktoru (TFPI) je další protein, který vykazuje degradaci agregací v průběhu skladování při skladování kapalné farmaceutické formulace (Chen a kol., J. Pharm. Sci., 88, 881 až 888 (1999)). Příklad 8 uvedený níže se týká kapalných formulací, které vykazují účinnost použití kyseliny ve formě její volné báze za účelem snížení tvorby agregátů a pufrovacího systému obohaceného kyselinou důkladně očištěnou od její soli.

V příkladech se pro stanovení účinku konkrétního stabilizačního přípravku na degradaci IL-2 nebo TPL1, použijí následující protokoly, čímž se též stanoví stabilita tohoto proteinu v průběhu skladování ve formě kapalných formulací.

Měření absorbance UV záření

UV absorbance proteinových roztoků se měří za použití spektrometru Hewlett Packard Diodě Array Spectrometer (Model 8452). Přístroj se kalibruje pufrem příslušné formulace. Zaznamená se absorbance při 280 nm za použití 1,0 cm dlouhé křemenné kyvety. Pro konverzi údajů o absorbanci na koncentraci IL-2 v mg/ml se použije extinkční koeficient 0,70 (mg/ml)^-1 cm¹.

-20CZ 305123 B6

RP-HPLC

RP-HPLC se provede na Waters 626 LC systému vybaveném 717 automatickým děličem (Waters Corporation, Milford, Maine) za použití Vydac 214BTP54 C₄ sloupce a Vydac 214GCC54 C54 iniciálního sloupce (Separation Group, Hesparia, Califomia). Sloupce se nejdříve ekvilibrují mobilní fází A (10% acetonitril, 0,1% TFA). Poté se naloží 20 pg vzorku IL-2 a protein se poté eluuje aplikací mobilní fáze B (100% acetonitril, 0,1% TFA) od 0 do 100% v průběhu 50 minut při rychlosti průtoku 1,0 ml/min. Hlavní solubilní vzorek IL-2 se eluuje přibližně 32 minut a detekuje se prostřednictvím UV vln o vlnové délce 214 nm za použití detektoru Waters 486. Zisk údajů a jejich zpracování se provede Perkins-Elmer Turbochrom systémem (PE Nelson, Cupertino, Califomia).

Tento RP-HPLC způsob detekuje hlavní monomemí sloučeninu IL-2 jako pík B, methioninovou oxidativní sloučeninu (zejména oxidovaný methionin v poloze 104) jako pík A a deaminovanou sloučeninu (pravděpodobně Asn v poloze 88) jako pík B', a další neznámé sloučeniny, které eluují buď dříve, či později než uvedené píky.

SEC-HPLC

HPLC metodou vylučování dle velikosti (size exclusion HPLC) se provede na TOSOHAAS G2000WSxl sloupci a TSK SWxl ochranném sloupci (TOSOHAAS, Montgomeryville, Pensylvania). Jediná mobilní fáze obsahující 10 mmol fosfátu sodného o pH = 7 a 200 mmol síranu amonného se aplikuje rychlostí toku 1,0 ml/min. Monomer sloučeniny IL-2 se eluuje přibližně ve 14 minutě a je detekován UV o vlnové délce 214 nm prostřednictvím Waters 486 detektoru. Zisk údajů a jejich zpracování se provede za použití systému Perkin-Elmer Turbochrom.

Při použití nativního SEC-HPLC protokolu specielně vyvinutého pro monitoraci IL-2, eluuje rhIL-2 převážně jako samostatná sloučenina, pravděpodobněji jako monomemí forma, protože přidání agregačních disociačních přípravků, jako je například SDS, urea a DTT, neovlivní eluování této sloučeniny.

IEX-HPLC

HPLC metodou iontové výměny (Ion Exchange HPLC) se provede ve Pharmacia Mono-S HR 5/5 skleněném sloupci za použití Waters 626 LC systému s 717 automatickým vzorkovačem se zahřívačem/chladičem, jak je popsáno v publikaci Chen a kol., J. Pharm. Sci., 88, 881 až 888 (1999). Sloupec se ekvilibruje z 80 % mobilní fází A (70:30 objem/objem, 20 mmol směsi octanu sodného a acetonitrilu o pH = 5,4) a z 20% mobilní fází B (70:30 objem/objem, 20 mmol octanu sodného a 1 M směsi chloridu amonného a acetonitrilu o pH = 5,4). Po injekci se rekombinantní humánní (rh) TFPI eluuje zvyšováním podílu mobilní fáze B na 85 % v průběhu 21 minut rychlostí průtoku 0,7 ml za minutu. rhTFPI eluuje přibližně za 16,5 minuty jako jediný pík a je detekován při UV absorbanci 280 nm Waters 486 detektorem absorbance. Získávání údajů a jejich zpracování se provede Perkin-Elmer Turbochrom systémem. Koncentrace proteinu se stanoví integrací plochy píku a jejím porovnáním se stanoví integrací plochy píku a jejím porovnáním se standardní křivkou generovanou vzorky se známou koncentrací.

SDS-PAGE

SDS-PAGE se provede podle Laemmlliho protokolu. Přibližně 5 pg IL-2 se naloží do každé linie iniciálního sloupce z 18% Norvex-Tris-glycinového gelu a při napětí 100 Voltů se provede elektroforéza. Proteinové proužky se obarví Coomassie modří a analyzují se denzitometrem Molecular Dynamics vybaveným systémem Imagequan T (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Califomia).

Proliferace buněk HT-2 a jejich MTT barvení pro prokázání biologické aktivity IL-2

-21 CZ 305123 B6

Potence IL-2 se určí biologickou analýzou in vitro za použití proliferace HT-2 buněk a jejich barvení MTT (Gillis a kol., J. Immolunol., 120, 2027 až 2032 (1978), Watson, J. Exp. Med., 150(6), 1510 (1979). Pouze ve stručnosti, 1 x 10⁴ myších HT-2 buněk, které jsou růstově dependentní na IL-2 se naloží do jamek kultivační plotny, která obsahuje standardy, kontroly a vzorky. Po 22 až 26 hodinách inkubace při teplotě 37 °C se do jamek přidá MTT barvivo a v inkubaci se pokračuje při teplotě 37 °C po dobu 3 až 4 hodin. Potom se přidá 20% SDS pro odbarvení, které probíhá při teplotě místnosti přes noc. Absorbance jamek se odečítá při vlnové délce 570 nm a konvertuje se na biologickou aktivitu IL-2 podle WHO standardů.

Měření pH a osmolarity

Hodnoty pH různých formulací se měří pH-metrem od firmy Orion (model 611, Orion Research Incorporated Laboratory Products Group, Boston, Massachusetts). pH-metr se zkalibruje kalibračním způsobem využívající dva pufry, který je navržen výrobcem, a použije se standardu pH 4 (Fisher Scientific, Cat. No SB 101-500) a standardu pH 7 (Fisher Scientific, Cat. No SB 107— 500).

Osmolarita roztoků těchto formulací se změří osmometrem Vapor Pressure Osmometer od výrobce Wescor (model 5500, Wescor lne., Logan, Utah). Osmometr se zkalibruje prostřednictvím dvou standard dodaných výrobcem: standarda o osmolaritě 290 mmol/kg (Wescor, Reorder No. OA-010) a standarda o osmolaritě 1000 mmol/kg (Wescor, Reorder No. OA-029).

Tyto protokoly se použijí pro kvantifikaci účinků různých stabilizačních přípravků co se degradace rhIL-2 týká, a ta se určí prostřednictvím agregace proteinů, oxidace methioninu a deaminace.

Příklad 1: Účinky různých rozpouštěcích přípravků na agregaci proteinů a skladovací stabilitu IL-2

Agregace proteinů je hlavní cestou degradace rhIL-2 v kapalných médiích s hodnotami pH v rozmezí od slabě kyselých až po alkalické. V roztocích rhíL-2 formulovaných tak, aby měly zmíněné podmínky pH, dochází při skladování za zvýšených teplot rychle k agregaci proteinů, která vyústí k viditelné precipitaci. Viditelně precipitovaný protein je odstranitelný filtrací přes filtr s velikostí ok filtru 0,2 pm. Zbývající rozpustný protein v roztoku je možné kvantifikovat četnými analytickými stanoveními, jako jsou například RP-HPLC, SEC-HPLC a UV absorbance. Agregace též zapříčiňuje snížení biologické aktivity, které může být stanoveno in vitro biologickým stanovením, které je zde popsáno.

Za použití analytických postupů zde popsaných je stanovení skladovací stability rhIL—2 v různých podmínkách následováno monitorovací změn v množství rozpustného rhIL-2 jako funkce inkubačního času při zvýšených teplotách.

.A. Účinky cukrů a aminokyselin

Účinek cukrů na skladovací stabilitu rhIL-2 se stanoví pro sorbitol, sacharózu a mannitol, v roztocích obsahujících 0,2 mg/ml rhIL-2, 10 mmol sukcinátu sodného o pH = 6 a množství jednotlivého cukru 270 mmol. Množství rozpustného rhIL-2, které zůstane ve vzorcích pro určování stability se vynese oproti inkubačnímu času, jak je znázorněno na obr. 1. Křivky sacharózy a mannitolu vynesené nad sebou značí jejich účinky na skladovací stabilitu IL-2 a jsou si navzájem podobné. Křivka pro sorbitol je o něco vyšší než křivky pro ostatní zkoumané cukry a značí, že sorbitol má mírně vyšší stabilizační účinek než mají ostatní cukry.

Účinek aminokyselin na skladovací stabilitu je znázorněn na obr. 2. Formulace obsahují 0,1 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinátu sodného o pH = 6 a 150 mmol jedné z devíti vybraných

-22CZ 305123 B6 aminokyselin. Jak ukazuje obr. 2, rozsah stability je následující: Arg > Asp > Lys > Met > Asn > Leu = Ser = Pro = Gly.

Stabilizační účinek sorbitolu a argininu byl potvrzen dalšími studiemi, které ukázaly, že skladovací stabilita rhIL-2 je ovlivněna koncentrací. Z toho vyplývá, že skladovací stabilita rhIL-2 je vyšší, pokud se koncentrace sorbitolu zvýší z 50 mmol na 150 mmol a konečně na 270 mmol (obr. 3). Obdobně se skladovací stabilita rhIL-2 zvýší, pokud se zvýší koncentrace ve formulaci (obr. 4).

.B Účinky pH formulace

Zjišťují se profily skladovací stability pH formulací rhIL-2 obsahujících NaCl, sorbitol a arginin. Poločasy zbývajícího rozpustného IL-2 se při teplotě 50 °C oproti pH, jak je znázorněno na obr. 5. Poločas (t_1/2) se definuje jako čas potřebný pro 50% snížení množství rozpustného proteinu ve vzorcích pro určování stability. Vyšší poločas značí vyšší skladovací stabilitu.

Jak je znázorněno na obr. 5, optimální hodnoty pH pro stabilizaci roztoků rhIL-2 proti agregaci proteinů závisí na stabilizačním přípravku, který je v roztoku přítomen. Maximální skladovací stabilita rhIL-2 v NaCl se dosáhne při pH = 4, kdy rhIL-2 má poločas při teplotě 50 °C přibližně 23 dnů. Formulace rhIL-2 v sorbitolu vykazuje zvýšenou stabilitu se snižováním pH s maximální stabilitou okolo hodnot pH = 5, kdy poločas při teplotě 50 °C je přibližně 26 dnů. Nejvyšší stabilita (tedy nejdelší poločas) je dosažena v případě použití argininu jako stabilizačního přípravku ve formulaci o hodnotě pH přibližně 6,0, kdy poločas proteinu při teplotě 50 °C přibližně 32 dnů. Tyto výsledky naznačují, že arginin je s výhodnějším stabilizačním přípravkem než sorbitol a NaCl, protože optimální pH pro stabilizaci proteinu je při fyziologicky přijatelnější hodnotě pH.

.C Účinek pufrovacího systému

Použití 10 mmol pufrovacího systému ve formulaci je vcelku běžné, a to pro poskytnutí vhodného pH a pro uchování určitého vhodného stupně pufrovací kapacity. Například pH formulace 5,8 je možné dostat použitím 10 mmol směsi kyseliny jantarové a její soli, například sukcinátu sodného. Pokud je vybrán takovýto pufrovací systém, je možné jako primární stabilizační přípravek formulace použít 150 mmol hydrochloridu argininu, ale není možné použít 150 mmol argininové báze, jelikož 150 mmol argininové báze by neumožnilo upravení pH na hodnotu 5,8 použitím 10 mmol pufru.

Nicméně hydrochlorid argininu zapříčiňuje vyšší vzestup osmolarify než argininové báze. Z toho vyplývá, že formulace obsahující 150 mmol hydrochloridu argininu, jejíž pH je upraveno na 5,8 prostřednictvím 10 mmol pufru sestávajícího z kyseliny jantarové a sukcinátu sodného, je téměř izotonická, neboť má osmolaritu přibližně 253 mmol/kg a poločas při teplotě 50 °C je přibližně 8 dnů (tabulka 1). Nicméně vyšší koncentrace argininu ve formulaci je žádoucí, jelikož skladovací stabilita vzrůstá se zvyšováním podílu tohoto stabilizačního přípravku. Pokud se koncentrace argininu zvýší na 230 mmol přidáním hydrochloridu argininu a pH se upraví na 5,8 prostřednictvím 10 mmol pufru sestávajícího z kyseliny jantarové a sukcinátu sodného, potom se poločas při teplotě 50 °C zdvojnásobí (přibližně na 17 dnů), nicméně roztok je hypertonický a jeho osmolarita je přibližně 372 mmol/kg.

V případě, kdy kyselina jantarová funguje jako pufrovací systém pro přizpůsobení pH roztoku na hodnotu 5,8 a arginin je přítomen ve formě své báze, potom zvyšování koncentrace argininové báze na 230 mmol vede k obdobnému zdvojnásobení poločasu při teplotě 50 °C na přibližně 16 dnů. Nicméně toto zvýšení skladovací stability se dosáhne, zatímco roztok zůstane téměř izotonický, s tím, že formulace má osmolaritu přibližně 271 mmol/kg (viz tabulka 1). Tímto způsobem lze ve formulaci použít 230 mmol argininové báze za účelem zvýšení skladovací stability rhIL—2, aniž by byla porušena izotonicita formulace.

-23 CZ 305123 B6

Tabulka 1

Osmolarita roztoku a skladovací stabilita formulací obsahujících rhIL-2

Skladovací stabilita je vyjádřena v poločasech (ti/₂) zbývajícího rozpustného rhIL-2 naměřených prostřednictvím RP-HPLC po skladování při teplotě 50 °C. Formulace obsahující hydrochlorid argininu obsahuje 0,5 mg/ml rhIL-2, 1 mmol EDTA a 150 mmol nebo 230 mmol hydrochloridu L-argininu a 10 mmol kyseliny jantarové a sukcinátu sodného pro upravení pH na 5,8. Formulace obsahující argininovou bázi obsahují 0,5 mg/ml rhIL-2, 1 mmol EDTA a 150 mmol nebo ío 230 mmol L-argininové báze a 81 mmol nebo 128 mmol kyseliny jantarové pro upravení pH na

5,8.

Formulace Osmolarita ti/₂ při (všechny obsahují (mmol/kg) teplotě 50 °C 1 mmol EDTA (den) a mají pH = 5,8)
150 mmol ArgHCl, 10 mmol sukcinátu sodného a kyseliny jantarové	253	8,0
150 mmol báze Arg, 81 mmol kyseliny jantarové	192	9,2
230 mmol ArgHCl, 10 mmol sukcinátu sodného a kyseliny jantarové	372	16, 9
230 mmol báze Arg, 128 mmol kyseliny jantarové	271	16, 0

Popsané dva způsoby úpravy pH byly prověřeny jinými pufrovacími systémy (tabulka 2). V případě, kdy se ve formulaci použije 150 mmol hydrochloridu argininu a pH se upraví na 5,8 přidáním 10 mmol kyseliny a její sodné soli, jsou všechny formulace méně než izotonické, tedy s osmolaritou menší než 290 mmol/kg. Poločas rhIL-2 pro tyto formulace při teplotě 50 °C se pohybuje v rozmezí přibližně 15 až 20 dnů. V případě, kdy se ve formulaci použije 230 mmol argininové báze a pH se upraví na 5,8 použitím pufru sestávajícího z kyseliny důkladně zbavené její soli, zůstává formulace s pH upraveným kyselinou citrónovou nebo kyselinou jantarovou stále nižší než izotonická, zatímco ostatní formulace jsou buď lehce hypertonické, jako v případě kyseliny fosforečné; nebo hypertonické, jak je tomu v případě kyseliny glutamové nebo kyseliny octové. Nicméně poločas při teplotě 50 % se pro všechny formulace zvyšuje na více než 30 dnů.

Proto při použití kyseliny citrónové nebo kyseliny jantarové, obě ve formě důkladně očištěné od soli, jako pufrovacího systému, může být koncentrace argininu zvýšena na 230 mmol, přičemž se použije argininové báze, a tím se docílí lepší skladovací stability rhIL-2.

-24CZ 305123 B6

Tabulka 2

Osmolarita roztoku a skladovací stabilita formulací obsahujících rhIL-2

Skladovací stabilita je vyjádřena v poločasech (ti/₂) zbývajícího rozpustného rhIL-2 naměřených prostřednictvím RP-HPLC po skladování při teplotě 50 °C. Všechny formulace obsahují 0,2 mg/ml rhIL-2, 5mmol methioninu, 1 mmol binatrium-EDTA, 0,1% polysorbátu 80 a 150 mmol hydrochloridu L-argininu s pH upraveným na 5,8 přidáním 10 mmol kyseliny a její sodné soli nebo 230 mg L-argininové báze s pH upraveným na 5,8 titrací kyselinou v její čisté ío formě.

Formulace Osmolarita ti/₂ (mmol/kg) (den)
150 mmol ArgHCl, 10 mmol citrátu sodného a kyseliny citrónové	248	20,5
230 mmol báze Arg, 86 mmol kyseliny citrónové	228	36,1
150 mmol ArgHCl, 10 mmol sukcinátu sodného a kyseliny j antarové	257	19,1
230 mmol báze Arg, 128 mmol kyseliny jantarové	285	29, 2
150 mmol ArgHCl, 10 mmol fosfátu sodného a kyseliny fosforečné	260	15, 6
230 mmol báze Arg, 193 mmol kyseliny fosforečné	329	29, 9
150 mmol ArgHCl, 10 mmol glutamátu sodného a kyseliny glutamové	264	14,6
230 mmol báze Arg, 225 mmol kyseliny glutamové	407	47,5
150 mmol ArgHCl, 10 mmol octanu sodného a kyseliny octové	259	20,8
230 mmol báze Arg, 250 mmol kyseliny octové	408	31, 9

l.D Účinek koncentrace proteinu

Účinek koncentrace proteinu na skladovací stabilitu se zjišťuje na formulaci obsahující 10 mmol 15 sukcinátu sodného o pH = 6 a 150 mmol argininu. Jak je ukázáno na obr. 6, kde se poločas rozpustného rhIL-2 při teplotě 50 °C vynese proti původní koncentraci proteinu, zvyšuje se skladovací stabilita rhIL-2 s poklesem koncentrace proteinu. Tento nález je v souladu s experimentálním poznatkem, že agregace je hlavní degradační cestou rhIL-2 v kapalných formulacích.

-25CZ 305123 B6 .E Účinek neionického surfaktantu polysorbátu 80

Účinek polysorbátu 80 (Tween 80 nebo Tw 80) na skladovací stabilitu rhIL-2 se testuje na formulaci obsahující 0,5 mg/ml IL-2, 230 mmol argininové báze, 128 mmol kyseliny jantarové pro upravení pH na 5,8, 1 mmol EDTA a 0%, 0,02% a 0,1% polysorbát 80. Jak je znázorněno v tabulce 3, obě formulace obsahující polysorbát 80 vykazují redukci poločasu rozpustného IL-2 při teplotě 50 °C, ze 16 dnů na 9 dnů, při měření RP-HPLC. Z toho vyplývá, že zahrnutí polysorbátu 80 do formulace by mohlo být pouze z hlediska jeho účinku na agregaci proteinu vnímáno jako nevýhodné. Nicméně tento přípravek má stabilizační efekt působící proti akutnímu poškození proteinových molekul, ke kterému dochází při zmrazení a tání a působení mechanických střižných sil, a je výhodný v průběhu výroby kapalných formulací obsahujících tento protein, jakje odhaleno v příkladech uvedených dále.

Dále se testuje skladovací stabilita dvou formulací obsahujících sorbitol. I když jejich poločasy stanovené RP-HPLC a biologická aktivita jsou srovnatelné s formulacemi obsahujícími arginin, poločasy stanovené SEC-HPLC jsou mnohem nižší, z čehož vyplývá, že větší část proteinu rhIL-2 v těchto formulacích je patrně přítomna v rozpustných agregovaných formách.

Tabulka 3

Poločasy (ti/₂) zbývajícího rozpustného rhIL-2 (pík B) naměřené prostřednictvím RP-HPLC, SEC-HPLC a in vitro biologické stanovení pro formulace obsahující rhIL-2 skladované při teplotě 50 °C.

Formulace (všechny s pH = 5,8 a obsahující 1 mmol EDTA)	ti/2 při teplotě 50 °C (den)
RP	SEC bio	1. aktivita
230 mmol báze Arg, 128 mmol kyseliny jantarové, pH = 5,8	16,0		21, 3	25, 6
230 mmol báze Arg, 128 mmol kyseliny jantarové, 0,02% Tw 80, pH = 5,8	9,7		12,4	NA
230 mmol báze Arg, 128 mmol kyseliny jantarové, 0,01% Tw 80, pH = 5,8	9,1		12,2	24,5
270 mmol sorbitolu, 10 mmol sukcinatu sodného, 0,01% Tw 80, pH = 4,5	31, 7		3,6	NA
270 mmol sorbitolu, 10 mmol sukcinatu sodného, 0,01% Tw 80, pH = 5,0	14,4		2,4	21,3

V tabulce 3 je poločas formulace obsahující rhIL-2 s argininovou bází a kyselinou jantarovou stanovený metodou RP-HPLC o něco kratší než poločas stanovený metodou SEC-HPLC, a o mnoho kratší než poločas stanovení in vitro biologickým stanovením. Pro další sledování rozdílností se stanoví eluování hlavní sloučeniny rhIL-2 metodou SEC-HPLC. Vzorky s a bez zpracování SDS, močovinou a DTT nevykazují žádnou změnu v elučních časech hlavní sloučeniny, což značí, že rhIL-2 je v těchto formulacích přítomen v monomemí formě. Nicméně SEC-HPLC protokol nemusí být schopen rozlišit další monomemí sloučeniny, například methioninovou oxi-26CZ 305123 B6 dovánou sloučeninu reprezentovanou pikem A od hlavní monomemí intaktní sloučeniny reprezentovanou pikem B. Proto se očekává malý rozdíl při určování poločasu.

Biologické stanovení in vitro pro určení biologické aktivity uvedené v údajích prezentovaných v tabulce 3 se provede za použití 0,1 % SDS obsaženého v ředidle experimentálního roztoku. Proto před aplikací vzorků na plotnu s tkáňovými kulturami pro zjištění interakce s myšími HT-2 buňkami se vzorky zředí ředidlem obsahujícím 0,1 % SDS. Je možné, že ředění SDS zapříčiní disociaci některých agregátů rhIL-2 v těchto vzorcích zpět na monomemí formu, čímž se falešně zvýší biologická aktivita dané formulace. Proto se vzorky testované na stabilitu analyzují za použití ředidla a (+S) a bez (-S) přidání SDS. Vzorky se též testují s (+F) a bez (-F) zpracování filtrací přes síto s velikostí ok 0,2 pm, a proto, že filtrací se odstraní velké agregáty proteinů, jak lze posoudit zrakem. Hodnoty biologické aktivity naměřené pro jednotlivé vzorky zpracované uvedeným způsobem jsou znázorněny v tabulce 4 společně s výsledky skladovací stability, které se dostanou použitím protokolu RP-HPLC pro porovnání. Hodnoty jsou uvedeny jako procento hodnot biologické aktivity získaných od obdobných vzorků skladovaných při teplotě -70 °C.

Obecně platí, že formulace ředěné SDS a nepřefiltrované před kontaktem s HT-2 buňkami vykazují vyšší hodnoty biologické aktivity než formulace ředěné bez SDS v experimentálním roztoku a přefiltrované před spuštěním stanovení. Mezi těmito výsledky biologické aktivity jsou ty, které byly získány při použití filtrace a ředěním bez SDS poměrně srovnatelné s výsledky RP-HPLC. Proto je tento způsob doporučen pro skutečné měření biologické aktivity monomemího rhIL-2.

Tabulka 4

Porovnání výsledků RP-HPLC analýzy pro rozpustný rhIL-2 a in vitro analýzy biologické aktivity vzorků testovaných na stabilitu skladovaných po dobu 2 týdnů při teplotě 40 °C a 50 °C.

Všechny výsledky jsou uvedeny jako procenta hodnot získaných pro analogické vzorky při teplotě -70 °C. Formulace obsahují 0,5 mg/ml rhIL-2, 230 mmol L-argininové báze, 128 mmol kyseliny jantarové o pH 5,8 a 1 mmol EDTA s (#1) a bez (#2) 0,1% polysorbátem 80. Vzorky pro biologické stanovení se buď přefiltrují, nebo se nepřefiltrují přes filtrační membránu s velikostí ok 0,22 pm a poté se zředí rozpouštědly, která buď obsahují, nebo neobsahují 0,1% SDS.

Vzorek HPLC	% biologické aktivity (procento aktivity vzorků při teplotě -70 °C)	%RP (% vzorků při -70 °C)
-F+S^a +F+S^a -F-S^a +F-S^ab
#1 při 40 °C	106	100	104	100	101
#1 při 50 °C	92	79	60	53	58
#2 při 40 °C	101	69	106	112	98
#2 při 50 °C	60	38	62	47	42

A „-F“ značí nepřefiltrovaný vzorek „+F“ značí přefiltrovaný vzorek „-S“ značí ředidlo bez obsahu SDS „+S“ značí ředidlo obsahující SDS b znamená, že se jedná o protokol doporučený pro monomemí IL-2 .F Kompatibilita konzervačního přípravku

Kompatibilita konzervačního přípravku se zjišťuje z důvodu potřeby vyvinout vícedávkovou (multidávkovou) formulaci. Účinky konzervačních přípravků na stabilitu IL-2 se stanoví prostřednictvím dvou urychlených (akcelerovaných) studií. Studie č. 1 testuje benzylalkohol, meta-27CZ 305123 B6 krezol a fenol ve formulaci obsahující 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinátu sodného s pH = 6 a 160 mmol argininu. Studie č. 2 testuje benzethonium-chlorid, benzalkonium-chlorid, směs methylparabenu a propylparabenu a chlorbutanol ve formulaci obsahující 0,2 mg/ml IL-2, 230 mmol L-argininové báze, 128 mmol kyseliny jantarové s pH = 5,8, 1 mmol dinatrium5 EDTA a 0,1 % polysorbát 80. Poločasy rozpustného IL-2 pro tyto formulace skladované při teplotě 40 °C naměřené prostřednictvím RP-HPLC jsou uvedeny v tabulce 5.

Všechny testované konzervační přípravky snižují stabilitu IL-2 při zvýšené teplotě. Ve studii č. 1 je poločas rozpustného IL-2 při teplotě 40 °C přibližně 74 dnů bez jakéhokoliv konzervačního io přípravku. Přidání benzylalkoholu nebo meta-krezolu nebo fenolu signifikantně redukuje poločas, a to pětkrát až desetkrát. Ve studií č. 2 jsou účinky konzervačního přípravku mnohem méně vyjádřené. Poločas rozpustného IL-2 se snižuje méně než dvakrát při použití benzethoniumchloridu a více než dvakrát pro ostatní uvedené konzervační přípravky. Z toho celkově vyplývá, že benzethonium-chlorid zapříčiňuje nejmenší redukci stability IL-2 ze všech testovaných kon15 zervačních přípravků.

Tabulka 5

Poločas (tj/₂) rozpustného IL-2 při teplotě 40 °C pro formulace obsahující konzervační přípravky

Studie č. 1: formulace obsahují 0,2 mg/ml rhIL-2, 10 mmol sukcinátu sodného s pH = 6 a 20 160 mmol argininu a konzervační přípravky.

Studie č. 2: formulace obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 230 mmol L-argininové báze, 128 mmol kyseliny jantarové s pH = 5,8, 1 mmol dinatrium-ETDA a 0,1 % polysorbát 80 a konzervační přípravky.

Konzervační přípravek	ti/2 při teplotě 40 °C
Studie č. 1
žádný konzervační přípravek	74,0
0,9 % (hmotnost/objem) benzylalkoholu	16, 0
0,25 % (hmotnost/objem) meta-krezolu	7,5
0,5 % (hmotnost/objem) fenolu	11, 0
Studie č. 2
žádný konzervační přípravek	261, 0
0,01 % (hmotnost/objem) benzethoniumchloridu	185,0
0,01 % (hmotnost/objem) benzalkoniumchloridu	67,0
0,18u% (hmotnost/objem) methylparabenu a propylparabenu	113, 0
0,5 % (hmotnost/objem) chlorbutanolu	84,0

-28CZ 305123 B6

Navzdory tomu, že konzervační přípravky mají výrazný destabilizační účinek na stabilitu IL-2 při zvýšené teplotě, testují se také jejich účinky na krátkodobou skladovací stabilitu IL-2 při teplotě 4 °C a 25 °C. Provede se další studie testující šest konzervačních přípravků ve stejné formulaci, která obsahuje 0,2 mg/ml IL-2, 230 mmol L-argininové báze, 128 mmol kyseliny jantarové,

1 mmol EDTA, 5 mmol methioninu s 0,1 % polysorbátu 80 při pH = 5,8. Tabulka 6 uvádí výsledné množství rozpustného rHIL-2, který zůstal ve formulaci po jednom roce skladování. Všechny formulace nevykázaly při porovnání s kontrolní studií signifikantní pokles množství rozpustného rhIL-2 při analýze jak RP-HPLC tak biologickým stanovením, s výjimkou formulace obsahující 0,25 % meta-krezolu, v jejímž případě množství rozpustného rhIL-2 signifikantně pokleslo.

io

Tabulka 6

Skladovací stabilita po 1 roce skladování formulace obsahující konzervační přípravek při teplotě

4 °C a 25 °C prezentovaná jako procento celkového rozpustného rhIL-2, který zůstal ve formulaci a je stanoven prostřednictvím RP-HPLC integrovaných ploch píků a biologickou aktivitou in vitro

Kontrolní formulace obsahuje 0,2 mg/ml IL-2, 230 mmol L-argininové báze, 128 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA, 5 mmol methioninu a 0,1 % polysorbátu 80 o pH = 5,8.

Konzervační přípravek	% počátečního IL-2 stanoveno RP-HPLC	biolog, aktivita in vitro
(x	10° IU/ml)
	4°C	25°C	t=0	lrok 4°C	lrok 25°C
Kontrola	102	93	3, 8	3,3	2,5
0,9 % benzylalkoholu	100	88	co	4,0	5,0
0,25 % meta-krezolu	98	60	5, 8	2,6	2,5
0,5 % fenolu	99	87	4,7	3,9	3,2
0,01 % benzalkonium- chloridu	102	93	5, 5	3,9	4,4
0,01 % benzethonium- chloridu	98	89	5,4	3,2	4,7
0,5 % chlorbultanolu	99	91	5,1	3, 6	4,5

-29CZ 305123 B6

Příklad 2

Účinky různých faktorů na oxidaci methioninu a skladovací stabilitu rhIL-2

Oxidace methioninových částí molekuly IL-2 byla popsána již dříve (Kunitani a kol., J. Chromatography, 359, 391 až 402 (1986); Sasaoki a kol., Chem. Pharm. Bull., 37(8), 2160 až 2164 (1989)). IL-2 obsahuje čtyři methioniové zbytky v polohách 23, 39, 36 a 104 polypeptidového řetězce. Mezi nimi je methionin v poloze 104 lokalizován na povrchu proteinu a vykazuje nejvyšší tendenci k oxidaci. Tuto oxidovanou variantu methioninu lze odlišit jako časně eluující sloučeninu (pík A) od hlavní sloučeniny IL-2 (pík B) na RP-HPLC chromatogramu. Methionin v poloze 23 a methionin v poloze 39 jsou méně náchylné k oxidaci, ke které dochází pouze za extrémně oxidativních podmínek, a to pravděpodobně v důsledku jejich výskytu uvnitř molekuly proteinu. Oxidovaná varianta těchto methioninových zbytků může při RP-HPLC eluovat časněji než methionin v poloze 104. Methionin v poloze 46 je ukryt hluboko uvnitř molekuly proteinu a k jeho oxidaci nedochází snadno, až na situaci, kdy se protein kompletně rozvine.

Zjišťování oxidace methioninu v molekule IL-2 je soustředěno na oxidaci methioninu v poloze 104, protože methionin v této poloze je nej náchylnější vůči oxidaci a zabránění jeho oxidace zabrání též oxidaci ostatních methioninových zbytků.

2.A

Účinek pH

Oxidace methioninu se zjišťuje při hodnotách pH v rozmezí od 3 do 9 ve formulacích obsahujících 0,2 mgPml IL-2, 150 mmol NaCl a 10 mmol různých pufrovacích sloučenin. Oxidace methioninu v těchto formulacích se stanoví kvantifikací procenta sloučeniny píku A (například oxidovaného methioninu v poloze 104) ve vzorcích IL-2 v čase t = 0 a t = 3 měsíce. Jak je uvedeno v tabulce 7, efekt pH není zaznamenán v čase t = 0, kromě vzorku pufrovaného citrátem o pH = 6. Při porovnání s ostatními vzorky, které obsahují 5 % sloučeniny píku A vykazuje vzorek obsahující citrát vzestup množství sloučeniny píku A na 6 %.

V čase t = 3 měsíce vzrůstá množství sloučeniny píku A za podmínek s vyšším pH, což značí, že mechanismus oxidace methioninu v poloze 104 je závislý na zásaditém prostředí. Při pH = 6 je sukcinát lepším pufrem než citrát co se minimalizace oxidace methininu týká, protože v případě formulace obsahující sukcinát jsou zaznamenány nižší hodnoty píku A.

Tabulka 7

RP-HPLC stanovení oxidace methioninu vyjádřené jako procento celkového množství rozpustného IL-2 (pík A + pík B) přítomné jako methionin-oxidovaná sloučenina reprezentovaná pikem A (% píku A z celkového rozpustného IL-2) ve vzorcích formulací s pH v rozmezí 3 až 9 v čase t = 0 a t = 3 měsíce

Formulace obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 150 mmol NaCl a jejich pH je upraveno použitím 10 mmol rozličných pufrovacích přípravků.

-30CZ 305123 B6

Pufr a pH	% sloučeniny píku A z celkového rozpustného IL-2 t = 0 t = 3 měsíce
		-70°C	4°C	25°C	40°C
10 mmol glycinu, pH 3	5	4	5	6	7
10 mmol acetátu, pH 4	5	5	6	7	6
10 mmol acetátu, pH 5	NA	7	8	9	9
10 mmol citrátu, pH 6	6	6	8	12	14
10 mmol sukcinátu, pH 6	5	6	7	4	9
10 mmol fosfátu, pH 7	5	7	8	11	5
10 mmol borátu, pH 9	5	11	15	14	NA

2.B.

Účinky EDTA, polysorbátu 20, polysorbátu 80 a MgCfi

Účinky kovového chelátu, dvou neionických surfaktantů a bivalentního kovového iontu na oxidaci methioninu jsou uvedeny v tabulce 8. Přítomnost polysorbátu 20 nebo polysorbátu 80 ve formulacích zvyšuje množství oxidované sloučeniny, jak v čase t = 0, tak v čase t = 1. Naproti tomu ío EDTA a MgCfi redukuje množství oxidované varianty methioninu po 1 měsíci skladování při teplotě 40 a 50 °C.

Tabulka 8

Procento z celkového množství rozpustného IL-2 (pík A + pík B) přítomného jako methioninoxidovaná sloučenina reprezentované pikem A (% píku A) ve vzorcích IL-2 v čase t = 0 a t = 1 měsíc

Kontrolní vzorek obsahuje 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinátu sodného o pH = 6 a 150 mmol argininu.

Formulace	% sloučeniny píku A (varianta s oxidovaným methioninem)
t = 0	t = 1 měsíc
		-70°C	4°C	40°C	50°C
Kontrola	2,8	3,5	5,1	19,7	36, 3
1 mmol EDTA	2,5	3,5	5, 0	9,5	14,0
0,1 % polysorbátu 80	5, 8	4,3	6,9	21,5	41, 4
1 mmol EDTA + 0,1 % polysorbátu 80	5,9	4,2	6,9	12,1	19,2
0,1 % polysorbátu 20	4,1	5,4	9,6	25,3	42,8
5 mmol MgCl₂	3,9	4,8	6,9	9,7	12,1

-31 CZ 305123 B6

2.C

Účinek methioninu

Testuje se účinek přidání methioninu do formulací s cílem zabránit oxidaci methioninu ve formulacích obsahujících IL-2. Tabulka 9 zaznamenává změny v píku A a celkovém množství rozpustného IL-2 (pík A a pík B) ve formulacích obsahujících variabilní množství methioninu po 2 týdnech při skladování při teplotě 50 °C. Zvyšování koncentrace methioninu ve formulacích signifikantně redukuje hodnotu píku A jak v čase t = 0 tak v čase t = 2 týdny, přičemž množství rozpustného IL-2 zůstává po týdnech neovlivněno. Při množství 5 mmol methioninu je zaznamenám trojnásobný pokles píku A v čase t = 2 týdny. Z toho vyplývá, že přidání methioninu vede k signifikantnímu snížení oxidace methioninu obsaženého v proteinu a má minimální efekt na agregaci IL-2.

Tabulka 9

Změna píku A a celkového rozpustného proteinu ve vzorcích IL-2 v čase t = 0 a t = 2 týdny při teplotě 50 °C

Lormulace obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 230 mmol argininu, 128 mmol kyseliny jantarové o pH = 5,8, 1 mmol EDTA, 0,1 % polysorbátu 80 a 0 až 10 mmol methioninu.

Formulace	% sloučeniny píku A % zbývajícího (varianta s oxidovaným IL-2 methioninem) t = 0 t = 2 týdny t = 2 týdny při 50 °C při 50 °C
Vzorek neobsahuj ící methionin	2,1	6, 3	76
1 mmol methioninu	1,4	2,7	77
5 mmol methioninu	1,2	2,1	77
10 mmol methioninu	1,2	1,9	76

Dodatečně k výsledkům pro vyšší teploty, byla též zaznamenávána úroveň oxidace methioninu při teplotě 4 °C a 25 °C po 3 měsících skladování pro formulace obsahující a neobsahující 5 mmol methioninu. Jak znázorňuje tabulka 10, přítomnost 5 mmol methioninu ve formulaci vede ke trojnásobnému poklesu úrovně píku A, a to jak při teplotě 4 °C, tak při teplotě 25 °C. Z toho vyplývá, že přidání 5 mmol methioninu efektivně zabraňuje oxidaci methioninu v poloze 104.

-32CZ 305123 B6

Tabulka 10

Úroveň oxidace methioninu vyjádřená jako procento z celkového množství rozpustného IL-2 (pík A + pík B) přítomného jako methionin-oxidovaná sloučenina reprezentovaná pikem A (% píku A z celkového rozpustného IL-2) a procento rozpustného IL-2, který zůstává ve vzorcích skladovaných po dobu 3 měsíců při teplotě buď 4 nebo 25 °C.

Formulace obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 230 mmol argininu, 128 mmol kyseliny jantarové o pH = 5,8, 1 mmol EDTA, 0,1 % polysorbátu 80 a 0 až 5 mol methioninu.

Formulace	Procento píku A z	IL-2	% zbývajícího IL-2 (hlavní pík)
Celkového	rozpustného
	4 °C	25 °C	4 °C	25 °C
0 mmol	2,7	4,1	101	97
5 mmol	0,8	1,4	101	100

2.D

Účinek odstranění kyslíku prostřednictvím proplachování dusíkem a odplyňováním

Testuje se účinek odstranění kyslíku z nádob obsahující vzorky IL-2 za účelem minimalizovat oxidaci methioninu. Vzduch nad kapalinou v nádobě o objemu 30 ml obsahující 1 ml vzorku IL2 se propláchne dusíkem. Rozpustný molekulární kyslík se odstraní způsobem vakuového odplyňování. Tabulka 11 znázorňuje změnu píku A a celkového množství rozpustného IL-2 (pík A + pík B) po 1 týdnu skladování těchto vzorků. Promývání dusíkem jako takové mírně snižuje procento methionin-oxidované sloučeniny ze 6,7 % na 6,2 %. Kombinace odplyňování roztoku a promývání vzduchu nad roztokem dusíkem dále snižuje úroveň píku A o další procento. Na druhou stranu procento celkového množství rozpustného IL-2 zůstává nezměněno, jak při promývání dusíkem, tak při odplyňování.

Tabulka 11

Účinek na procento z celkového množství rozpustného IL-2 (pík A + pík B), které je přítomné jako methionin-oxidovaná sloučenina reprezentovaná pikem A (% píku A) a na procento z celkového množství rozpustného IL—2, který ve vzorcích zůstane při odběru vzorků v čase t = 0 a t = 1 týden při teplotě 50 °C.

Formulace obsahují 0,3 mg/ml IL-2, 230 mmol argininu, 128 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA a 0,1 % polysorbátu 80.

Formulace	Procento píku A	% ninu)	zbývajícího IL-2
(oxidace	methio
	t = 0		t = 1 týden	t = 1 týden
			při 50 °C	při 50 °C
Kontrola	3,1	6,7	81
Promyto dusíkem	3,1	6,2	82
Odplyněno a	3, 0		5,8	81
promyto dusíkem

-33CZ 305123 B6

2.E

Účinek konzervačních přípravků

Zkoumá se účinek konzervačních přípravků na oxidaci methioninu. Tabulka 12 znázorňuje změnu v píku A pro vzorky formulací obsahující a neobsahující jeden ze šesti konzervačních přípravků po 6 a 12 měsících skladování při teplotě 4 a 25 °C. Všechny formulace obsahující konzervační přípravky vykazují obdobnou úroveň píku A jako kontrola, což značí, že konzervační přípravky nemají žádný detekovatelný účinek na oxidaci methioninu kromě formulace obsahující 0,25 % meta-krezolu, která vykazuje signifikantní vzestup úrovně píku A.

Tabulka 12

Procento celkového množství rozpustného IL-2 (pík A + pík B) přítomného jako methioninoxidovaná sloučenina reprezentovaná pikem A (% píku A) v různých formulacích obsahujících konzervační přípravky skladovaných po dobu 6 a 12 měsíců při teplotě 4 a 25 °C

Kontrolní formulace obsahuje 0,2 mg/ml IL-2, 230 mmol L-argininové báze, 128 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA, 5 mmol methioninu, 0,1% polysorbátu 80 s pH = 5,8.

Konzervační přípravek	% píku A t=0	(methionin-oxidovaná sloučenina)
6 měsíců	12 měsíců
		4°C	25°C	4°C	25°C
Kontrola	1,5	1,6	1,9	1,8	2,6
0,9% benzylalkoholu	1,6	1,7	2,3	1,9	3,3
0,25 % meta-krezolu	1,6	¹ oo	6,7	2,1	3,5
0,5 % fenolu	1,6	1,7	2,4	1,8	3,6
0,01 % benzalkonium- chloridu	1,5	1,6	2,0	1,0	3,0
0,01 % benzethonium- ohloridu	1,5	1,7	2,0	1,8	2,8
0, 5u% chlorbutanolu	1,5	1,6	2,0	1,8	3,2

Příklad 3

Účinek různých faktorů na deaminaci IL-2

Deaminace IL-2 byla popsána již dříve (Kunitani a kol., J. Chromatography, 359, 391 až 402 (1986)). Aspartát v poloze 88 byl zjištěn jako primární místo pro deaminaci v molekule IL-2 (Sasaoki a kol., Chem. Pharm. Bull., 40, 976 až 980 (1992)). Deaminovaná sloučenina může být detekována RP-HPLC jako vedlejší pík (pík B') píku hlavní sloučeniny (pík B). Deaminace IL-2 se studuje na formulacích obsahujících arginin, NaCl a sorbitol. Tabulka 13 znázorňuje, že de-34CZ 305123 B6 aminovaná sloučenina může být detekována pouze ve formulacích obsahujících sorbitol a NaCl, avšak ne ve formulacích obsahujících arginin, po inkubaci za zvýšených teplot po dobu 2 týdnů. Z toho vyplývá, že arginin stabilizuje IL-2 a zabraňuje degradaci cestou deaminace.

Tabulka 13

Deaminace detekovaná RP-HPLC jako sloučenina reprezentovaná pikem B' ve formulacích obsahujících 0,2 mg/ml IL—12, 10 mmol sukcinátu sodného o pH = 6 a 150 mmol argininu, 150 mmol NaCl nebo 270 mmol sorbitolu

Formulace	% píku B' (deaminace) vt=0at=2 týdny
	T=0	-70°C	40°C	50°C
10 mmol NaSuc, 150 mmol Arg, pH 6	0	0	0	0
10 mmol NaSuc, 150 mmol NaCl, pH 6	0	0	0	3
10 mmol NaSuc, 270 mmol sorbitol, pH 6	0	0	2	2

Příklad 4

Účinek zmrazování a rozmrazování na stabilitu IL-2

Zmrazením indukované poškození proteinu je obvykle zapříčiněno třemi mechanismy:

1) protein je konformačně nestálý při nízkých teplotách (denaturace chladem);

2) protein je susceptibilní k denaturaci na rozhraní s ledu s vodou;

3) protein je poškozen změnami v koncentraci solí nebo posunem pH při zmrazení.

V případě IL-2 je ztráta proteinu v průběhu zmrazování a rozmrazování pravděpodobně způsobena denaturaci a agregací na rozhraní s ledu s vodou, protože neionický surfaktant polysorbát 80 efektivně ochraňuje IL-2 od poškození zmrazováním a rozmrazováním. Jak je znázorněno na obr. 7, množství rozpustného IL-2 se snižuje v průběhu každého cyklu zmrazení a rozmražení formulace obsahující 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinátu sodného o pH = 6, a 150 mmol argininu. Přidání polysorbátu 80 do formulace zvyšuje stabilitu IL—2 a zabraňuje poškození opakovaným zmrazováním a rozmrazováním. V momentě, kdy koncentrace polysorbátu 80 dosáhne 0,05 % a vyšší, je IL-2 plně ochráněn před poškozením v průběhu zmrazování a rozmrazování.

Příklad 5

Účinek mechanických střižných sil na stabilitu IL-2

5.1. Účinek polysorbátu 80, EDTA, koncentrace proteinu a plnícího objemu

Provedou se studie analyzující ztráty rozpustného IL-2 indukované mechanickými střižnými silami. Prověřují se dva typy střižných sil: protřepávání na třepačce Orbital Shaker (VWR Scientific, Cat. No. 57 018 — 754) a víření v míchači (Fisher Scientific, model Genie 2, s rychlostí na-35 CZ 305123 B6 stavenou na stupeň 4). Různé formulace IL-2 se naplní v množství 1 ml do 3ml nádob. Tyto nádoby se skladují v lednici (kontrolní vzorky), umístí se na laboratorním stojanu přes noc (statické vzorky), protřepávají se rychlostí 200 cyklů za minutu přes noc (protřepávané vzorky) nebo se míchají ve víru po dobu 1 minuty (vířené vzorky). Tabulka 14 uvádí výsledky změny v množství rozpustného IL-2 v těchto vzorcích.

V porovnání s kontrolními vzorky uloženými v lednici, jak statické, tak protřepávané vzorky nevykazují žádnou ztrátu IL-2. Z toho vyplývá, že IL-2 je stabilní při teplotě místnosti a je stabilní vůči protřepávání. Na druhou stranu, pokud se tyto vzorky podrobí víření po dobu 1 minuty, jsou detekovány různé úrovně ztrát. Formulace obsahující 0,1 až 0,5 mg/ml IL-2 nebo 1 a 5 mmol EDTA nebo nižší koncentrace polysorbátu 80 (0,005 až 0,05 %) vykazují všechny 25 až 50% ztrátu rozpustného IL-2. Tedy jedna minuta víření má výraznější poškozující účinek na molekulu IL-2 než protřepávání přes noc. Ztrátě IL-2 může být zabráněno zvyšováním koncentrace polysorbátu 80 obsaženého ve formulaci do množství stejného či vyššího než 0,1 %. Navíc plně naplněné nádoby bez ponechaného vzduchu nad kapalinou vykazující minimální ztrátu rozpustného IL-2 v průběhu 1 minuty víření, což značí, že vzduchem vyplněné rozhraní je hlavním faktorem zapříčiňujícím poškození.

Tabulka 14

Změna v množství rozpustného IL-2 ve vzorcích skladovaných při teplotě místnosti přes noc (statické vzorky), ve vzorcích protřepávaných rychlostí 200 cyklů za minutu (protřepávané vzorky) a míchaných ve víru (vířivé vzorky) při porovnání se vzorky skladovanými při teplotě 4 °C.

Kontrolní formulace obsahuje 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinátu sodného o pH = 6 a 150 mmol argininu. Formulace se naplní v množství 1 ml do skleněných nádob o objemu 30 ml, s výjimkou kompletně naplněného vzorku, kdy je kontrolní vzorek naplněn až k okraji nádob o objemu 30 ml, přičemž v hlavě nádoby není ponechán žádný vzduch. Množství rozpustného IL-2 se kvantifikuje prostřednictvím RP-HPLC.

-36CZ 305123 B6

Vzorek (v množství 1 ml do nádoby 30 ml)	% zbývajícího rozpustného IL-2 statický protřepávaný vířený vzorek vzorek vzorek přes noc přes noc po 1 minutu
0,2 mg/ml IL-2 (kontrola)	99, 6	100, 8	74,7
0,1 mg/ml IL-2	100,3	102,7	72,0
0,5 mg/ml IL-2	99,7	101, 0	68,6
1 mmol EDTA	97,6	101,2	59, 6
5 mmol EDTA	99,3	102,7	72,2
0,005 % polysorbátu 80	100,6	100,0	46, 5
0,01 % polysorbátu 80	99, 7	100,4	66,1
0,05 % polysorbátu 80	99,3	100,3	93, 9
0,1 % polysorbátu 80	99,2	100, 0	89,0
0,2 % polysorbátu 80	99,3	99,2	99,8
0,5 % polysorbátu 80	99,1	98,4	99,7
1 mmol EDTA, 0, 1 % polysorbátu 80	99, 6	100,1	99,8
Kompletně naplněné nádoby	99,4	100,1	96, 5

5.2

Účinek argininu

Účinek argininu na stabilitu IL-2 a jeho ochranu před poškozením zapříčiněným vířivými silami je uveden v tabulce 15. Zvyšování koncentrace argininu ze 150 mmol na 230 mmol vede k3% vzestupu množství rozpustného IL-2 z 65 na 69 % po 1 minutě víření. Z toho vyplývá, že arginin má minoritní účinek na IL-2 co se týká ochrany IL-2 před střižnými silami, i když v dřívějších ío experimentech vykázal výrazný stabilizační účinek na IL-2, neboť zabraňuje degradaci zapříčiněnou formací agregátů.

Zjišťuje se účinek polysorbátu 80 na formulaci obsahující 230 mmol argininu. Přidání nízké koncentrace polysorbátu 80 (0,02 %) vede k destabilizaci IL-2 a přidání vysoké koncentrace poly15 sorbátu 80 (0,02 %) vede ke stabilizaci IL-2 a chrání ho před poškozením během víření.

Tabulka 15

Procento zbývajícího rozpustného IL-2 v různých formulacích po 1 minutě víření při analýze

RP-HPLC

-37CZ 305123 B6

Formulace (všechny formulace obsahují 0,5 mg/ml IL-2, pokud není uvedeno jinak)	% zbývajícího IL-2
150 mmol argininu, 10 mmol NaSuc, 1 mmol EDTA, pH = 5,8	65,5
150 mmol argininu, 81 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA, pH = 5,8	65,3
230 mmol argininu, 10 mmol NaSuc, 1 mmol EDTA, pH = 5,8	69, 0
230 mmol argininu, 128 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA, pH = 5,8	68,9
230 mmol argininu, 128 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA, 0,02 % Tw 80, pH = 5,8	55,1
230 mmol argininu, 128 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA, 0,1 % Tw 80, pH = 5,8	99, 5

5.3

Studie analyzující přepravu

Střižné síly působící na IL-2 v průběhu přepravy produktu se testují studií se skutečnou přepravou. IL-2 se připraví jako formulace obsahující arginin a formulace obsahující NaCl, přičemž obě obsahují různá množství polysorbátu 80. Tyto IL-2 vzorky se přepravují na ledu letadlem z Emeryville, Kalifornie, do Saint Louis, Missouri, a ze Saint Louis zpět do Emeryville. Obr. 8 ukazuje RP-HPLC analýzu množství rozpustného IL-2 v těchto vzorcích. Bez přítomnosti polysorbátu 80 ve formulacích je zaznamenána přibližně 10% ztráta IL-2, a to jak ve formulacích obsahujících arginin, tak ve formulacích obsahujících NaCl. Rozdíly ve stabilitě mezi formulací obsahující arginin a formulací obsahující NaCl jsou zanedbatelné, okolo 1 %. Za přítomnosti polysorbátu 80 ve formulacích je ztráta IL-2 redukována. Za přítomnosti 0,1 % polysorbátu 80 není zaznamenána žádná ztráta, což značí, že IL-2 je plně ochráněn při dané koncentraci surfaktantu. To znamená, že obsažení 0,1 % polysorbátu 80 ve formulaci je účinné pro zabránění akutního poškození IL-2 střižnými silami v průběhu přepravy.

Závěrem lze shrnout, že arginin může fungovat jako primární stabilizační přípravek v kapalných farmaceutických formulacích obsahujících IL-2 v průběhu dlouhodobého skladování, a to prostřednictvím snížení agregace a deamínace IL-2. Pro další zvýšení koncentrace argininu ve formulaci a pro dosažení vyšší stability IL-2 při zachování izotonicity roztoku, se pro titraci argininovou bází na pH = 5,8 s výhodou použije kyselina jantarová. Navíc lze do formulace zahrnout methionin a EDTA, a to za účelem prevence oxidace proteinu. Nakonec může být do formulace přidán neionický surfaktant, jako je polysorbát 80, a to pro zabránění poškození IL-2 v průběhu zmrazování a rozmrazování a poškození mechanickými střižnými silami.

Příklad 6

Testování účinnosti konzervačního přípravku

Několik formulací obsahujících antimikrobiální konzervační přípravky se podrobí testu účinnosti konzervačního přípravku dle postupu uvedeného v publikaci United States Pharmacopoeia (USP). Výsledky tohoto testu jsou uvedeny v tabulce 16. Kontrolní vzorek bez konzervačního přípravku požadavky USP nesplnil, zatímco všechny formulace obsahující konzervační přípravek požadavky splnily.

-38CZ 305123 B6

Tabulka 16

USP test účinnosti konzervačního přípravku pro formulace obsahující rhIL-2

Kontrolní formulace obsahuje 0,1 mg/ml rhIL-2, 230 mmol L-argininové báze, 128 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA, 5 mmol methioninu, 0,1 % polysorbátu 80 s pH = 5,8.

Konzervační přípravek	USP test
Kontrola	nevyhovuj e
0,9 % benzylalkoholu	vyhovuje
1,3 % benzylalkoholu	vyhovuje
1,7 % benzylalkoholu	vyhovuje
0,5 % chlorbutanolu	vyhovuj e
0,5u% fenolu	vyhovuj e

Příklad 7

Schopnosti formulace produkovat bolest

Pro stanovení schopnosti produkovat bolest, konkrétněji pálivou a štípavou bolest navozenou formulacemi, se použije krysí model vyvinutý na Floridské univerzitě, fakultě stomatologie, OMSDS, oddělení neurověd (University of Florida, College of Dentistry, OMSDS, Division of Neuroscience). Model je založen na stanovení proudu, který je indukován senzorickými buňkami přenášejícími informace o bolesti. Pro stanovení se v zaznamenávací komoře izolují senzorické buňky (krysí gangliové buňky dorsálních míšních kořenů). Záznamy se učiní pro individuální buňky, které se předem selektují dle nociceptivních (tedy bolest - indukujících) kritérií. Pro danou formulaci se zaznamená indukce pálivé, štípavé bolesti a standardizovaná skóre pro bolest. Skóre pálivé bolesti se definuje prostřednictvím porovnání odpovědi testované formulace s odpovědí kapsaicinu (500 nmol). Kapsaicin je dobře znám pro svou schopnost produkovat u člověka intensivní pálivou bolest (Cooper a kol., Pain, 24, 93 až 116 (1986)). Pálivá bolest je zaznamenávána jako poměr celkové produkce proudu indukovaného testovanou formulací k proudu produkovanému roztokem pufrovaným na pH = 5. Standardizované skóre bolesti hodnotí formulaci vzhledem k fyziologickému roztoku (0,9 % NaCl, bez pufru) běžnému parenterálnímu roztoku dostupnému v nemocničních lékárnách, o kterém je známo, že indukuje štípavou bolest.

Kapalná formulace obsahující L-argininovou bázi a kyselinu jantarovou se podrobí analýze bolesti podle výše popsaného modelu. Výsledky pro dva testované roztoky jsou uvedeny v tabulce 17. Vycházeje ze skóre vypočítaných pro pálivou bolest, štípavou bolest a ze standardizovaných skóre bolesti, vykazuje formulace obsahující L-argininovou bázi a kyselinu jantarovou výborné vlastnosti v porovnání s běžným fyziologickým roztokem. Bylo také zaznamenáno, že testem indukovaný proud se zmenšuje v průběhu aplikace formulace (časově závislý pokles), zatímco pokles nebyl pozorován v případě běžného fyziologického roztoku. Poznatky vyplývající z provedení popsaného stanovení demonstrují, že zmíněná formulace je lépe tolerována než běžný fyziologický roztok.

Tabulka 17

Pálení, štípání a standardizovaná skóre bolesti pro kapalnou formulaci a 0,9 % NaCl

-39CZ 305123 B6

Kapalná formulace obsahuje 230 mmol L-argininové báze, 128 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA, 5 nmol methioninu, 0,1 % polysorbátu 80 o pH = 5,8.

Formulace	Pálivá bolest	Štípavá bolest	Standardizované skóre bolesti
0,9% NaCl	0,084 ± 0,0006	2,44 ± 0,62	1,73 ± 0,73
Kapalná formulace obsahující rhIL-2	0,044 + 0,019	0,65 ± 0,23	0,16 + 0,05

Příklad 8

Studie stability s TFPI

Studie stability a rozpustnosti TFPI obsaženého v různých formulacích demonstrují, že L-arginin funguje jako stabilizační přípravek (údaje nejsou uvedeny) na TFPI a pufrovací sloučeniny s nábojem, například reprezentované citrátovými ionty, mají hlubší solubilizační (rozpustnost zvyšující) účinek. V této studii se zkoumají účinky koncentrace L-argininu a pufrovacího systému na stabilitu TFPI v různých formulacích. Konkrétně se testuje vliv pufrovacího systému ve formě kyseliny důkladně zbavené své soli naproti pufrovacímu systému směsi kyseliny a její soli, jak bylo dříve zmíněno pro formulace obsahující IL-2 v předcházejících příkladech.

Materiály a způsoby

Roztok TFPI se formuluje jako 0,6 mg/ml ve 20 mmol citrátu sodného a 300 mmol L-argininu s pH = 5,5. Tento roztok se pufruje dialýzou při teplotě 4 °C za použití membrán Spectral Por #7 (MWCO, 3,500, ID# 132-110) do různých formulací obsahujících L-arginin pufrovaných na pH = 6,5, a to buď citrátovým, nebo sukcinátovým pufrovacím systémem. Po dialýze se koncentrace TFPI v každém roztoku měří UV/Vis spektroskopií. Každý roztok se poté zředí na 0,15 mg/ml použitím příslušného pufru. Připravené roztoky se poté rozdělí na alikvoty, každý o objemu 1 ml, do nádob o objemu 30 ml pro stabilní skladování. V tomto bodě se dostatečné množství nádob nechá stranou, a stanoví se výchozí časový moment T = 0. Zbytek nádob se umístí do inkubátoru s teplotou 50 °C pro akcelerovanou studii stability. Vzorky se analyzují v časových bodech 3, 7, 14 a 30 dnů. Pro analýzu v každém časovém momentu se obsah každé nádoby přenese do l,7ml mikrocentrifugační zkumavky a centrifuguje se při frekvenci 10 000 otáček za minutu po dobu přibližně 2 minut. Centrifugo váný supematant vzorků se ze zkumavky odebere a analyzuje se prostřednictvím IEX-HPLC (popis nutný), známé z předchozích studií jako stanovení vhodné k indikaci stability.

-40CZ 305123 B6

Výsledky a diskuse

TFPI je formulován v konečné koncentraci 0,15 mg/ml do různých formulací, které obsahují buď L-argininovou bázi, nebo hydrochlorid argininu. Formulace obsahující hydrochlorid argininu se pufrují na pH = 5,5 prostřednictvím lOmmol kyseliny citrónové nebo kyseliny jantarové v kombinaci s příslušnou konjugovanou sodnou solí. Formulace obsahující L-argininovou bázi se titrují na pH = 5,5 buď kyselinou citrónovou, nebo kyselinou jantarovou. Provede se celkem 8 studií dle následujícího výčtu:

1) 20 až 150 mmol hydrochloridu L-argininu pufrovaného na pH= 5,5 prostřednictvím 1 Ommol kyseliny citrónové a citrátu sodného;

2) 20 až 150 mmol L-argininové báze titrované na pH = 5,5 kyselinou citrónovou;

3) 100 až 300 mmol hydrochloridu L-argininu pufrovaného na pH = 5,5 prostřednictvím 1 Ommol kyseliny citrónové a citrátu sodného;

4) 100 až 300 mmol L-argininové báze titrované na pH = 5,5 kyselinou citrónovou;

5) 20 až 150 mmol hydrochloridu L-argininu pufrovaného na pH = 5,5 prostřednictvím 1 Ommol kyseliny jantarové a sukcinátu sodného;

6) 20 až 150 mmol L-argininové báze titrované na pH = 5,5 kyselinou jantarovou;

7) 100 až 300 mmol hydrochloridu L-argininu pufrovaného na pH = 5,5 prostřednictvím 1 Ommol kyseliny jantarové a sukcinátu sodného; a

8) 100 až 300 mmol L-argininové báze titrované na pH = 5,5 kyselinou jantarovou.

Hlavní cestou degradace TFPI byla již dříve určena agregace a precipitace proteinu (Chen a kol., J-Pharm. Sci., 88, 881 až 888 (1999)). Degradace TFPI může být sledována monitorováním zbylého rozpustného proteinu ve vzorcích pro testování stability. Roztoky TFPI formulované s různými koncentracemi L-argininu se skladují při teplotě 50 °C v případě akcelerované studie stability. Vzorky se odebírají v předem určených časových intervalech. Rozpustný protein ve vzorcích se oddělí od proteinu agregovaného/precipitovaného centrifugací v mikrocentrifiigační zkumavce. Množství rozpustného proteinu se stanoví metodou IEX-HPLC (Chen a kol., J. Pharm. Sci., 88, 881 až 888 (1999)). Údaje se poté vynesou jako funkce skladovacího času, přičemž se použije jednoduchá exponenciální kinetická rovnice

Y = Y(Y₀EXP(-klt) kterou se spočítá poločas zbývajícího rozpustného proteinu, s použitím KaleidaGraph grafického softwaru (Synergy Software, Reading Pennsylvania).

Hodnoty poločasů (ti_/2) pro zbývající rozpustný TFPI pro formulace pufrované kyselinou citrónovou či citrátem sodným jsou uvedeny v tabulce 18. Hodnoty pro formulace pufrované kyselinou jantarovou či sukcinátem sodným jsou uvedeny v tabulce 19. Tyto údaje demonstrují, že hodnota poločasu se zvyšuje se vzestupem koncentrace L-argininu v těchto formulacích. Tyto údaje jsou dále vyneseny na obr. 9 a 10 pro citrátové a sukcinátové pufrovací systémy. Křivky propojující hodnoty poločasů mají tvar paraboly a rostou s koncentrací argininu. Toto znamená, že L-arginin je stabilizátorem TFPI.

Rozdíl v TFPI stabilitě mezi dvěma zmíněnými pufrovacími systémy se zdá zanedbatelný. Ačkoliv citrátový pufrovací systém vykazuje větší variabilitu (obr. 9), jsou dvě křivky poločasu vynesené proti koncentraci argininu pro sukcinátový pufrovací systém prakticky superimponované (obr. 10). TFPI dosahuje obdobné stability při podobné koncentraci L-argininu, bez závislosti na tom, jaký pufrovací systém se použije pro úpravu pH. Obr. 11 také porovnává dvě křivky poločasu vynesené proti koncentraci argininu pro pufrovací systém obsahující kyselinu jantarovou a pufrovací systém obsahující kyselinu citrónovou. Tento obrázek také znázorňuje, že v TFPI stabilitě nedochází k žádným důležitým odchylkám, pokud zůstává koncentrace argininu ve formulaci stabilní. Tyto údaje demonstrují, že stabilizační účinek je zajištěn zejména argininem.

-41 CZ 305123 B6

Nicméně titrace kyseliny buď kyselinou jantarovou, nebo citrónovou umožňuje zvyšovat koncentraci argininu ve formulaci (a tím umožňuje zvyšovat stabilitu formulace), zatímco je zachována izotonicita. Proto například obě formulace, 3-3 a 4-3 v tabulce 18 obsahují 300 mmol Largininu, ajejich hodnoty poločasů jsou podobné. Formulace 3-3 však obsahuje 10 mmol kyseliny citrónové a citrátu sodného pro pufrování 300 mmol hydrochloridu L-argininu na pH = 5,5 a osmolarita roztoku je 497 mOsm/kg. Tato formulace je tedy hypertonická a není vhodná pro injekční cestu podání. Na druhou stranu, formulace 4-3 obsahuje 121 mmol kyseliny citrónové v kombinaci se 300 mmol L-argininové báze pro upravení pH na 5,5 a osmolarita tohoto roztoku je 295 mOsm/kg. Tato formulace je tedy osmolaritou velmi blízko izotonickému roztoku (290 mol/kg) a je vhodnější pro injekční formu podání. Pokud se použije běžný způsob úpravy pH, například přidání 10 mmol kyseliny citrónové a citrátu sodného, je možné do formulace přidat o něco málo více než 150 mmol L-argininu, aniž by byla porušena izotonicita. Poločas formulace obsahující 150 mmol L-argininu (kód 1-6) je 16 dnů v porovnání s 23 dny pro formulaci obsahující 300 mmol L-argininu (kód 4-3). Z toho vyplývá, že formulování TFPI s kyselinovou bází (například argininovou bází) jako stabilizátorem a s pufrem sestávajícím z kyseliny důkladně zbavené její soli (například kyseliny jantarové), poskytuje účinný způsob, jak přidat více stabilizátoru (například argininu) pro maximalizaci stabilizujícího účinku na TFPI.

Závěr

Tento příklad demonstruje, že L-arginin stabilizuje TFPI prostřednictvím prodlužování jeho skladovací doby. Při použití titrace kyselinou je možné pro maximalizaci stabilizačního účinku přidat do formulace více argininu, aniž by byla porušena izotonicita, která je výhodná v případě injikovatelných formulací.

Tabulka 18

Údaje o stabilitě formulací obsahujících TFPI a arginin-citrát, o pH = 5,5

Poločas (ti/₂) se získá proložením dat stability při teplotě 50 °C za použití jednoduché exponenciální kinetické rovnice.

Kód	Formulace	Osmolarita (iranol/kg)	tl/2 (dny)
1-1	20 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citratu sodného	66	9,4
1-2	40 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citratu sodného	81	12,6
1-3	60 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citratu sodného	91	10,7

-42CZ 305123 B6

1-4	80 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citrátu sodného	106	10, 9
1-5	100 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citrátu sodného	190	12,5
1-6	150 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citrátu sodného	276	16,0

2-1	20 mmol báze L-Arg titrované 8,9 mmol kyseliny citrónové	67	5,7
2-2	40 mmol báze L-Arg titrované 17,8 mmol kyseliny citrónové	84	15,0
2-3	60 mmol báze L-Arg titrované 26,6 mmol kyseliny citrónové	95	17,0
2-4	80 mmol báze L-Arg titrované 34,2 mmol kyseliny citrónové	109	14,6
2-5	100 mmol báze L-Arg titrované 42,6 mmol kyseliny citrónové	119	18,2
2-6	150 mmol báze L-Arg titrované 62,4 mmol kyseliny citrónové	147	20,4

3-1	100 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citrátu sodného	239	14,8
3-2	200 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citrátu sodného	358	19, 6
3-3	300 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citrátu sodného	497	21,7

4-1	100 mmol báze L-Arg titrované	155	16, 7
	42,2 mmol kyseliny citrónové
4-2	200 mmol báze L-Arg titrované 81,8 mmol kyseliny citrónové	224	22, 5
4-3	300 mmol báze L-Arg titrované 121 mmol kyseliny citrónové	295	23,3

-43CZ 305123 B6

Tabulka 19

Poločas (ti/₂) se získá proložením dat stability při teplotě 50 °C za použití jednoduché exponenciální rovnice.

3-1	100 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinátu sodného	207	16, 5
3-2	200 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinátu sodného	353	21,6
3-3	300 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinátu sodného	515	21,7

4-1	100 mmol báze L-Arg titrované 61,3 mmol kyseliny jantarové	127	17,0
4-2	200 mmol báze L-Arg titrované 122 mmol kyseliny jantarové	256	21,4
4-3	300 mmol báze L-Arg titrované 180 mmol kyseliny jantarové	363	22,5

io Všechny uvedené publikace a patentové přihlášky zmíněné v popise jsou odborníkovi v oboru, kterého se přítomný vynález týká, známé. Všechny publikace a patentové přihlášky jsou zahrnuty v tomto spisu do odkazů ve stejném rozsahu, ve kterém byla každá individuální publikace nebo patentová přihláška specificky a individuálně citována.

Ačkoliv přítomný vynález byl popsán vcelku detailně prostřednictvím obrázků a příkladů pro objasnění a porozumění, je jasné, že mohou být aplikovány určité změny a modifikace, a to ty, které jsou v rozsahu následujících patentových nároků.

-44CZ 305123 B6

Kód	Formulace	Osmolarita (mmol/kg)	tl/2 (dny)
1-1	20 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinátu sodného	66	9,9
1-2	40 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinatu sodného	97	11,5
1-3	60 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinatu sodného	129	15,3
1-4	80 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinatu sodného	163	16, 7
1-5	100 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinatu sodného	197	20, 5
1-6	150 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinatu sodného	282	21, 9

2-1	20 mmol báze L-Arg titrované 12,5 mmol kyseliny jantarové	40	δ,7
2-2	40 mmol báze L-Arg titrované 25,2 mmol kyseliny jantarové	62	12, 6
2-3	60 mmol báze L-Arg titrované 37,5 mmol kyseliny jantarové	85	16, 4
2-4	80 mmol báze L-Arg titrované 49,9 mmol kyseliny jantarové	107	19, 6
2-5	100 mmol báze L-Arg titrované 62,4 mmol kyseliny jantarové	129	20, 9
2-6	150 mmol báze L-Arg titrované 91,4 mmol kyseliny jantarové	192	23,1

Claims

1. Způsob výroby kapalného farmaceutického prostředku, který obsahuje polypeptid nebo jeho biologicky aktivní variantu, vyznačující se tím, že obsahuje kombinování uvedeného polypeptidu nebo jeho varianty s alespoň jednou aminokyselinovou bází a pufrovacím přípravkem, kterým je ve formě kyseliny důkladně zbavené své soli, přičemž uvedená aminokyselinová báze obsahuje alespoň jednu aminokyselinu vybranou ze souboru zahrnujícího arginin, lyzin, kyselinu asparagovou a kyselinu glutamovou, kde jakákoli aminokyselina je ve formě volné báze nebo ve formě soli, přičemž prostředek má pH v rozmezí od 4,0 do 9,0, polypeptidem je interleukin 2, IL-2, a jeho uvedená varianta má identitu sekvence alespoň 70 % s polypeptidem, přičemž pH se upravuje před přidáním polypeptidu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že aminokyselinou je alespoň jedna z aminokyselin, kterými je arginin ve formě své volné báze a lyzin ve formě své volné báze.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že kyselina je vybrána ze souboru obsahujícího kyselinu octovou, kyselinu asparagovou, kyselinu jantarovou, kyselinu citrónovou, kyselinu fosforečnou a kyselinu glutamovou.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že kyselinou je kyselina jantarová a aminokyselinou je arginin ve formě své volné báze.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že 100 až 400 mM argininu ve formě své volné báze a 80 až 10 190 mM kyseliny jantarové se kombinuje s polypeptidem nebo jeho variantou.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že 100 až 350 mM argininu ve formě své volné báze se kombinuje s IL-2 nebo jeho variantou a kyselinou jantarovou.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že arginin ve formě své volné báze o koncentraci 230 mM a kyselina jantarová o koncentraci 128 mM se kombinují s IL-2 nebo jeho variantou.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že prostředek má pH v rozmezí od 5,0 do 6,5 a osmolaritu od 250 do 330 mmol/kg.

9. Způsob podle nároku 3, vy z n a č uj í c í se t í m , že kyselinou je kyselina citrónová.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že 175 až 400 mM argininu ve formě své volné báze a 40 až 200 mM kyseliny citrónové se kombinují s polypeptidem nebo jeho variantou.

11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že prostředek dále obsahuje methionin v množství dostačujícím pro inhibici oxidace alespoň jednoho methioninového zbytku v polypeptidu nebo jeho variantě během skladování prostředku.

12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že prostředek dále obsahuje neionický surfaktant v množství dostatečném pro inhibici agregace zmíněného polypeptidu nebo jeho varianty jako odpovědi na zmrazení a rozmražení nebo působení mechanické střižné síly v průběhu skladování prostředku.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že neionickým surfaktantem je polysorbát 80.

-46CZ 305123 B6

14. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že aminokyselinovou bází je arginin ve formě své volné báze o koncentraci 150 až 350 mM a kyselinou je kyselina jantarová o koncentraci 80 až 190 mM.

15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že 230 mM argininu ve formě své volné báze a 128 mM kyseliny jantarové se kombinuje s IL-2 nebo jeho variantou, přičemž prostředek má pH v rozmezí od 5,0 do 6,5 a osmolaritu od 250 do 330 mmol/kg.

16. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že prostředek má životnost alespoň 18 měsíců, pokud se skladuje při teplotě od 2 do 8 °C.

17. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že prostředek má životnost alespoň 20 měsíců, pokud se skladuje při teplotě od 2 do 8 °C.

18. Způsob podle jakéhokoli z nároků 14 až 17, vyznačující se tím, že prostředek obsahuje dále methionin, který je přítomen v prostředku v koncentraci od 0,5 do lOmM, polysorbát 80, který je přítomen v prostředku v koncentraci od 0,001 do 0,2 % a 0,1 až 5,0 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) nebo dvojsodné soli EDTA.

19. Způsob podle jakéhokoli z nároků 14 až 18, vyznačující se tím, že IL-2 nebo jeho varianta je přítomen v prostředku v koncentraci od 0,01 do 2,0 mg/ml.

20. Způsob podle jakéhokoli z nároků 1, 6, 7 a 14 až 19, vyznačující se tím, že uvedeným IL-2 je rekombinantní humánní IL-2, rhIL-2, nebo jeho biologicky aktivní varianta, s identitou sekvence alespoň 70 % s humánním IL-2.

21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že jeho uvedená varianta má identitu sekvence alespoň 80 % s humánním IL-2.

22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že jeho uvedená varianta má identitu sekvence alespoň 90 % s humánním IL-2.

23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že jeho uvedená varianta má identitu sekvence alespoň 95 % s humánním IL-2.

24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že variantou je des-alanyl-1, serin-125 humánní interleukin-2.

25. Způsob podle jakéhokoli z nároků 1 až 24, vyznačující se tím, že dále zahrnuje přípravu uvedeného prostředku ve vysušené formě, která je vybrána ze souboru obsahujícího vysoušení za mrazu a vysoušení rozprašováním.