WO2023239265A1 - Гибридный ген для получения рекомбинантного rbd-антигена - Google Patents
Гибридный ген для получения рекомбинантного rbd-антигена Download PDFInfo
- Publication number
- WO2023239265A1 WO2023239265A1 PCT/RU2023/050144 RU2023050144W WO2023239265A1 WO 2023239265 A1 WO2023239265 A1 WO 2023239265A1 RU 2023050144 W RU2023050144 W RU 2023050144W WO 2023239265 A1 WO2023239265 A1 WO 2023239265A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- rbd
- recombinant antigen
- protein
- vaccine
- producing
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 47
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 55
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 35
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 22
- JYDNKGUBLIKNAM-UHFFFAOYSA-N Oxyallobutulin Natural products C1CC(=O)C(C)(C)C2CCC3(C)C4(C)CCC5(CO)CCC(C(=C)C)C5C4CCC3C21C JYDNKGUBLIKNAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- FVWJYYTZTCVBKE-ROUWMTJPSA-N betulin Chemical compound C1C[C@H](O)C(C)(C)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(CO)CC[C@@H](C(=C)C)[C@@H]5[C@H]4CC[C@@H]3[C@]21C FVWJYYTZTCVBKE-ROUWMTJPSA-N 0.000 claims abstract description 16
- MVIRREHRVZLANQ-UHFFFAOYSA-N betulin Natural products CC(=O)OC1CCC2(C)C(CCC3(C)C2CC=C4C5C(CCC5(CO)CCC34C)C(=C)C)C1(C)C MVIRREHRVZLANQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 6
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 4
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000005352 clarification Methods 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 9
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 abstract description 7
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 abstract description 4
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 abstract description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 51
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 10
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 10
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 9
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 9
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000012516 mab select resin Substances 0.000 description 3
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 2
- 239000007970 homogeneous dispersion Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000053723 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 1
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001091385 Homo sapiens Kallikrein-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 1
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100034866 Kallikrein-6 Human genes 0.000 description 1
- 125000000010 L-asparaginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 1
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241001644525 Nastus productus Species 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 229940022005 RNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000044437 S1 domains Human genes 0.000 description 1
- 108700036684 S1 domains Proteins 0.000 description 1
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010046861 Vaccination complication Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 229940008201 allegra Drugs 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000012914 anti-clumping agent Substances 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 1
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- RWTNPBWLLIMQHL-UHFFFAOYSA-N fexofenadine Chemical compound C1=CC(C(C)(C(O)=O)C)=CC=C1C(O)CCCN1CCC(C(O)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1 RWTNPBWLLIMQHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000002443 hepatoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 230000000936 membranestabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000029219 regulation of pH Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 150000003648 triterpenes Chemical class 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
Definitions
- the invention relates to biotechnology, immunology, virology and concerns the creation of a vaccine against coronavirus infection, a method for its preparation, a hybrid gene design and a construct for expressing the recombinant antigen RBD/S21/S14-Fc, which is a section of the S-protein of SARS-CoV-2, including RBD, part of SD1 and S2 fused with the Fc fragment of IgGl, a cell line producing a recombinant antigen, a method for producing a recombinant antigen, which, in combination with a betulin-based corpuscular adjuvant, is capable of inducing long-term humoral and cellular immunity against coronavirus in animals and humans.
- RBD/S21/S14-Fc which is a section of the S-protein of SARS-CoV-2, including RBD, part of SD1 and S2 fused with the Fc fragment of IgGl
- a cell line producing a recombinant antigen
- Vaccination is considered in modern conditions as one of the most effective means of combating infection.
- many countries and pharmaceutical companies have become involved in the development of vaccines and drugs against SARS-CoV-2, a new RNA virus belonging to the Coronaviridae family of the Beta-CoV lineage.
- the technology for producing vaccines based on virus subunits proven in recent years, has certain advantages, such as safety and the possibility of booster administration of the vaccine.
- individual viral subunits have low immunogenicity, which requires the use of adjuvants.
- Nucleic acid vaccines are based on the principle of introducing genetic information into cells, which produces pathogen proteins that cause an immune response. If viral vectors are used for delivery, there is a danger of integration of foreign DNA into the genome of the vaccinee’s cell, and the possible development of autoimmune reactions against cells expressing viral antigen, or a reaction to foreign DNA. In addition to these disadvantages, there are difficulties with the delivery of such drugs. It is worth noting that RNA and DNA vaccines, as well as vaccines based on adenoviral vectors, cause some caution in use, since the long-term consequences of their use are unknown. Subunit vaccines are represented primarily by recombinant drugs based on purified proteins. An important part of creating these types of vaccines is finding new effective adjuvants.
- the S1 domain consists of the NTD subdomain (N-terminal domain), the RBD (residues 319–527), and the SD1 and SD2 subdomains, which are closest to the S2 domain.
- NTD subdomain N-terminal domain
- RBD Residues 319–527
- SD1 and SD2 subdomains which are closest to the S2 domain.
- the most important task of vaccination is not just the production of antibodies to the S protein, but rather neutralizing antibodies to the RBD.
- simple use of RBD as a vaccine antigen is not possible, since the mass of the protein is quite small (less than 40 kDa), and it is also quickly excreted from the body, so RBD, part of SD1 and S2, conjugated to the Fc fragment, became candidate antigens IgGl.
- Adding an adjuvant will reduce the amount of protein per dose, reduce the cost of the vaccine, and also increase the immune response to the antigen.
- mineral aluminum hydroxide or phosphate
- plant saponins - QuilA, QS21
- microbial killed bacteria, lipopolysaccharide, and its derivatives, CpG DNA motifs
- other types of adjuvants Due to toxicity or Due to the insufficient effectiveness of most adjuvants, only aluminum salts and water-oil emulsions MF-59, AS03, QS 21, VLP (virus-like particles) and ISKOMs (Immuno Stimulating COMplex) are allowed for general use.
- Such adjuvants include betulin adjuvants based on triterpenoids from birch bark extract (patent RU 2545714).
- Betulin particles in addition to a pronounced spectrum of biological activity (antimicrobial, antifungal, antiviral, hepatoprotective, anti-inflammatory, anticancer, antiallergic, membrane-stabilizing, immunomodulatory, antioxidant), also have adjuvant properties.
- RBD/S21/S14-Fc hybrid gene Design of the RBD/S21/S14-Fc hybrid gene.
- the RBD-based recombinant antigen sequence with additional epitopes was fused to the C-terminal portion of the RBD, wild-type FcIgGl (unmodified), to generate RBD/S21/S14-Fc. Modifications to the RBD were aimed at increasing the immunogenicity of the antigen. Two peptide epitopes were added.
- reaction product is purified using a DNA spin column purification protocol.
- the P-Pharma-Zeo vector is linearized using Hindll and Xbal restriction enzymes, the product is purified by agarose gel electrophoresis, and isolated from the gel using a spin column DNA purification protocol.
- the ends of the vector are blunt-ended using DNA polymerase, which has 3'-5' exonuclease activity, and the vector is then purified using a spin column DNA purification protocol.
- the ligation reaction is carried out using T4-DNA polymerase at an insert/vector ratio of 1/10 using 5% PEG-4000 in the ligation reaction.
- the resulting plasmid DNA is purified using a spin column DNA purification protocol.
- the ligase mixture is transformed into chemically competent E.
- the sediment was dried under a laminar flow of sterile air for 10 minutes and dissolved in 20 ⁇ l of sterile DNase- and RNase-free water. 1 ⁇ l was taken to assess the DNA concentration, as well as determine the sequence of the RBD/S21/S14-Fc gene.
- primers SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 were used for sequencing of the introduced gene using the Sanger method.
- Figures 2-7 show electropherograms of sequencing reactions. The final results of sequencing using primers covering the entire sequence of the RBD/S21/S14-Fc gene confirmed the identity of the sequence of the hybrid RBD/S21/S14-Fc gene with the reference sequence.
- transfect CHO cells 8.6 mg/ml of pure (“transfection grade”) plasmid DNA P-Pharma-Zeo-RBD/S21/S14-Fc was obtained.
- P-Pharma-Zeo-RBD/S21/S14-Fc one pool of cells was obtained, in which the viability of the cell culture 48 hours after transfection was 92%.
- Control transfection with a vector containing the GFP fluorescent green protein gene demonstrated a transfection efficiency of 50 ⁇ 20%.
- selection of transfectants began by culturing with the addition of 400 ⁇ g/ml zeocin and 500 nM MTX.
- the inoculum was increased in the required amount for initial seeding into the reactor with a cell density of 0.5 x 10 b cells/ml, i.e., in an amount of at least 400 x 10 b cells in flasks with stirring, the cell culture was reseeded with increasing volume of the flasks.
- the cell culture was transplanted into a 125 ml flask with 20 ml of medium and cultivated for 4 days in a shaker-CO3 incubator at a platform rotation speed of 120 ⁇ 5 rpm, temperature 37 ⁇ 1 °C, CO3 content 5 ⁇ 1% and relative humidity 70 ⁇ 5%.
- Cultivation of the cells of the producer strain is carried out in a BioFlo 320 bioreactor with a working volume of 1 liter (Eppendorf, Germany) in ActiPro medium (Hyclone, USA) containing 4 mM E-alanine- ⁇ -glutamine (Gibco, USA) and 0.4% reagent against cell aggregation (Lonza, Switzerland). Every day, from the third day of cultivation, a complex of additives is added: Cell Boost 7A (Cytiva, USA) 1.5-3.5% of the cultivation volume and a mixture of amino acids L-cysteine (152 mM), L-tryptophan (90 mM), L-tyrosine (250 mM) (AppliChem, USA).
- pH regulation is carried out by supplying CO3 and 0.5 M NaHCOs (Sigma-Aldrich, USA). Regulation of the dissolved oxygen concentration at the beginning of the process is carried out with nitrogen and air, then with air and oxygen as the concentration of viable cells and the rate of oxygen consumption increase.
- the mixture of gases is supplied through a macrobubbler at a rate of 0.2 to 1.5 l/min. Cultivation is carried out at a rotation speed of a marine propeller mixer from 60 to 100 rpm (cascade control) and a temperature of 37 °C, followed by a decrease to 35 °C in the exponential growth phase and to 33 °C on the next day of cultivation. Selection and clarification filtration of culture fluid.
- a daily sample of the culture liquid is taken to determine the number of viable cells in it, the concentration of glucose and lactate. Cultivation is stopped when viability drops below 90%.
- the culture liquid is clarified by centrifugation in two stages: 1000 g for 30 minutes and 3270 g for 15 minutes.
- a filter with a pore size of 0.22 microns is used to sterilize the culture liquid.
- the resulting volume of sterile culture fluid was 1.05 l.
- 375 mg of recombinant RBD/S21/S14-Fc antigen was obtained by purification according to the protocol described below.
- the intermediate product obtained from the first stage of purification is applied to the column in a 50% gradient of buffer 20 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, pH 7.0, contact time 5 min. After application is complete, the column is washed with 20 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, pH 7.0 buffer for 4 column volumes at a rate of 2 ml/min. After washing is completed, elution is carried out with a buffer of 20 mM sodium phosphate, 1 M sodium chloride, pH 7.0 for 4 column volumes at a rate of 1 ml/min. Adding NaCl to the intermediate product to a final content of 2 M.
- the column washed with buffer 20 mM sodium phosphate, 2 M sodium chloride, pH 6.0 for 5 column volumes at a speed of 2.5 ml/min. After washing is completed, elution is carried out in a gradient of 100% buffer 20 mM sodium phosphate, pH 6.0 over 3 column volumes at a rate of 2 ml/min.
- the fourth stage of purification is transfer to the GDF buffer using Sephadex G25 sorbent with a volume of 53 ml.
- Protein authentication Confirmation of the authenticity of the resulting recombinant RBD/S21/S14-Fc antigen is carried out using polyacrylamide gel electrophoresis followed by immunoblotting.
- electrophoresis use a gradient polyacrylamide gel 4-20% (Bio-Rad, cat No. 4561093). Analysis of samples by electrophoresis is carried out under reducing conditions. 100 ng of protein solution is added to the wells of the gel. Separation is carried out at a voltage of 200 V for 50 minutes. Transfer to PVDF membrane is carried out using the Trans Blot Turbo system (Biorad), according to the manufacturer's recommendations.
- the first stage of a phase 1 study is an open randomized study of the safety, tolerability (reactogenicity) and immunogenicity of the vaccine when administered twice intramuscularly in doses of 20 mcg + 5 mcg and 20 mcg + 20 mcg. Taking into account the estimated number of subjects found to be ineligible and/or compliant based on screening results criteria for non-inclusion, the study was conducted on 20 healthy volunteers in parallel groups aged 18 to 60 years.
- Group 3 (32 people) received the study drug according to the following scheme: the first injection of 20 mcg - 0.5 ml of suspension for intramuscular administration (40 mcg/ml), the second injection of 5 mcg - 0.5 ml of suspension for intramuscular administration (10 mcg /ml), intramuscularly, after 28 days;
- Group 4 (32 people) received the study drug according to the following scheme: first and second injections of 20 mcg - 0.5 ml of solution for intramuscular administration (40 mcg/ml), intramuscularly, after 28 days;
- Group 5 (32 people) received placebo according to the following scheme: first and second injections - 0.5 ml of sodium chloride, solution for injection 0.9%, intramuscularly, after 28 days.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии, а именно, к созданию вакцины против коронавирусной инфекции и способу ее получения, получения гибридного гена, кодирующего рекомбинантный антиген RBD/S21/S14-Fc, получения рекомбинантного антигена, способного вызвать индукцию специфического гуморального и клеточного иммунного ответа к необходимому эпитопу белка вирусной оболочки SARS-CoV-2. Техническим результатом раскрываемого изобретения является создание вакцинной композиции рекомбинантного антигена с бетулином в качестве адъюванта. Технический результат достигается за счет создания гена, генетической конструкции, клеточной линии (штамма-продуцента), продуцирующей целевой RBD/S21/S14-Fc рекомбинантный антиген SARS-CoV-2, слитый с Fc-фрагментом иммуноглобулина через линкер, способа очистки рекомбинантного белка, получения композиции вакцины, содержащей рекомбинантный антиген и корпускулярный адъювант, а также введения для получения иммунного ответа против коронавируса.
Description
Гибридный ген для получения рекомбинантного RBD-антигена
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии, вирусологии и касается создания вакцины против коронавирусной инфекции, способа ее получения, конструкции гибридного гена и конструкции для экспрессии рекомбинантного антигена RBD/S21/S14-Fc, представляющего собой участок S-белка SARS-CoV-2, включающего RBD, часть SD1 и S2, слитого с Fc-фрагментом IgGl, клеточной линии, продуцирующей рекомбинантный антиген, способа получения рекомбинантного антигена, который в сочетании с корпускулярным адъювантом на основе бетулина способен индуцировать у животных и человека длительный гуморальный и клеточный иммунитет против коронавируса.
Уровень техники
Вакцинация рассматривается в современных условиях как одно из наиболее эффективных средств борьбы с инфекцией. Таким образом, многие страны и фармацевтические компании включились в разработку вакцин и лекарственных препаратов против SARS-CoV-2, нового РНК- содержащего вируса, относящегося к семейству Coronaviridae линии Beta-CoV.
При традиционной технологии создания вакцин на основе использования полноразмерного патогена резко возрастает сложность производства, обусловленная опасностью работы и необходимостью строгого контроля за полнотой инактивации возбудителя, что делает данный вариант менее экономически выгодным. В связи с этим, проверенная в последние годы технология получения вакцин на основе субъединиц вируса имеет определенные преимущества, такие как безопасность и возможность бустерного введения вакцины. Однако, отдельные вирусные субъединицы имеют низкую иммуногенность, вследствие чего необходимо применение адъювантов.
Вакцины на основе целых инактивированных вирусов, в целом, широко используются для иммунизации, однако имеют серьезные недостатки - от технологических, связанных с трудностью получения больших количеств препарата в сжатые сроки, до проблем, касающихся их эффективности - нежелательные побочные эффекты и проблемы с таргетностью вырабатываемых антител на необходимый эпитоп белков вирусной оболочки, а также примесными белками, остающимися в вакцине после культивирования вируса.
Вакцины на основе нуклеиновых кислот основаны на принципе введения в клетки генетической информации, с которой продуцируются белки патогена, вызывающие иммунную реакцию. В случае использования для доставки вирусных векторов существует опасность интеграции чужеродной ДНК в геном клетки вакцинируемого, возможное развитие аутоиммунных реакций против клеток,
экспрессирующих вирусный антиген, или реакция на чужеродную ДНК. Помимо перечисленных недостатков, существуют трудности с доставкой таких препаратов. Стоит отметить, что РНК и ДНК вакцины, а также вакцины на основе аденовирусных векторов вызывают определенную осторожность в использовании, так как неизвестны долговременные последствия их применения. Субъединичные вакцины представлены, прежде всего, рекомбинантными препаратами, на основе очищенных белков. При создании таких типов вакцин важной частью является поиск новых эффективных адъювантов. Их использование позволяет уменьшить дозу антигена, снизить стоимость конечного препарата, повысить иммуногенность «слабых» или малых антигенов, на которые чрезвычайно сложно выработать иммунитет и получить вакцину к данному классу патогенов. Это позволяет предотвратить конкуренцию антигенов в комбинированных вакцинах, увеличить скорость развития и продолжительность иммунного ответа у привитых, индуцировать защитные свойства слизистых оболочек, а также увеличить силу иммунного ответа. В настоящее время признано невозможным создание эффективных и безопасных субъединичных или эпитопных вакцин без применения адъювантов. За функцию проникновения коронавируса в клетки организма хозяина отвечает RBD (рецептор-связывающий домен) S-белка, а также отдельные его эпитопы. В экспериментальных исследованиях установлено, что большинство антител, обладающих вируснейтрализующей активностью в отношении вида коронавирусов (например, MERS или SARS), специфически связываются с различными эпитопами RBD. RBD образует сайт связывания с рецептором АСЕ2, поэтому антитела, способные связываться с RBD доменом, могут блокировать контакт с рецептором и, как следствие, препятствовать проникновению вируса в клетки, что в случае SARS-CoV-2 установлено. На основании этого, в качестве последовательности для создания антигена была выбрана именно последовательность RBD. Стоит отметить, что выбор целого S-белка мог бы привести к выработке не только нейтрализующих антител, но и маскирующих, повышая развитие антитело-зависимого усиления инфекции.
Домен S1 состоит из субдомена NTD (N-концевой домен), RBD (остатки 319-527), и субдоменов SD1 и SD2, которые наиболее близки к домену S2. Таким образом, важнейшей задачей вакцинации является не просто выработка антител к S-белку, а именно нейтрализующих антител к RBD. Однако, простое использование RBD в качестве антигена вакцины не представляется возможным, так как масса белка довольно мала (менее 40 кДа), а также он быстро выводится из организма, поэтому кандидатами в антиген стали RBD, часть SD1 и S2, конъюгированные с Fc- фрагментом IgGl.
Добавление адъюванта позволит снизить количество белка на дозу, себестоимость вакцины, а также увеличить иммунный ответ на антиген. В настоящее время в экспериментальных и клинических исследованиях применяют: минеральные (гидроксид или фосфат алюминия), растительные (сапонины - QuilA, QS21), микробные (убитые бактерии, липополисахарид, и его производные, CpG-мотивы ДНК) и другие виды адъювантов. Вследствие токсичности или
недостаточной эффективности большинства адъювантов для общего использования разрешены только соли алюминия и водно-масляные эмульсии MF-59, AS03, QS 21, VLP (virus-like particles) и ИСКОМы (Immuno Stimulating COMplex). Наиболее перспективными являются корпускулярные адъюванты - сферические аморфные наночастицы (САНЧ). Одна из причин использования - их эффективное поглощение антиген-представляющими клетками иммунной системы, что приводит к усилению иммунного ответа. К таким адъювантам можно отнести бетулиновые адъюванты на основе тритерпеноидов из экстракта бересты (патент RU 2545714). Бетулиновые частицы, кроме выраженного спектра биологической активности (противомикробное, противогрибковое, противовирусное действия, гепатопротективное, противовоспалительное, противораковое, противоаллергическое, мембраностабилизирующее, иммуномодулирующее, антиоксидантное), обладают и адъювантными свойствами.
Из патента RU 2749193 известны варианты использования антигенов, включающие RBD для индукции специфического иммунитета против вируса SARS-CoV-2 в качестве антигенного компонента, вместе с бетулиновыми сферическим аморфными наночастицами (САНЧ) размера 80- 160 нм в качестве адъюванта. Данный адъювант производится в промышленных масштабах в соответствии с требованиями опытно-промышленного регламента, а также был протестирован ранее в доклинических исследованиях гриппозных вакцин, которые показали, что наличие корпускулярного адъюванта в составе вакцины приводит к усилению иммунного ответа и не влияет на безопасность применения препарата.
Раскрытие сущности изобретения
Существенный недостаток известных вакцин против SARS-CoV-2 состоит в сложности их производства, недостаточной иммуногенной активности, нежелательных побочных явлениях и проблемах с таргетностью вырабатываемых антител к необходимому эпитопу белка вирусной оболочки. Техническая задача настоящего изобретения заключается в создании антигенной композиции, позволяющей вызвать индукцию специфического гуморального и клеточного иммунного ответа к необходимому эпитопу белка вирусной оболочки SARS-CoV-2. Техническим результатом раскрываемого изобретения является создание антигенной композиции с корпускулярным бетулином в качестве адъюванта и рекомбинантным белком в качестве активного компонента. Технический результат достигается за счет создания гибридного гена RBD/S21/S 14-Fc, кодирующего рекомбинантный антиген SARS-CoV-2, слитый с Fc-фрагментом иммуноглобулина через линкер; клеточной линии, экспрессирующей рекомбинантный антиген в культуральную жидкость; выделения и очистки рекомбинантного антигена RBD/S21/S 14-Fc; формулирования вакцины с использованием корпускулярного адъюванта на основе природного бетулина; применения вакцины для иммунизации животных и человека с целью получения иммунного ответа против коронавируса.
Краткое описание рисунков
Рис. 1. Карта вектора P-Pharma-Zeo -RBD/S21/S14-Fc.
Рис. 2. Электрофореграммы реакций секвенирования для праймера RBD-Rev 1.
Рис. 3. Электрофореграммы реакций секвенирования для праймера RBD-short. Рис. 4. Электрофореграммы реакций секвенирования для праймера RBD-short (продолжение).
Рис. 5. Электрофореграммы реакций секвенирования для праймера SolR.
Рис. 6. Электрофореграммы реакций секвенирования для праймера SolR (продолжение).
Рис. 7. Электрофореграммы реакций секвенирования для праймера RBD-Fwd3.
Рис. 8. Результаты оценки экспрессии и секреции белка RBD/S21/S14-Fc с помощью Вестерн Блоттинга, (на рисунке: 1 - лизат клеток; 2 - культуральная жидкость. Столбец слева - стандарт молекулярных масс).
Рис. 9. Покрытие триптическими пептидами последовательности RBD/S21/S14-Fc.
Рис. 10. Результаты гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex 200 Increase в Na- фосфатном буфере pH 7.4. Осуществление изобретения
Дизайн гибридного гена RBD/S21/S14-Fc. На первом этапе работы был разработан дизайн гибридного гена RBD/S21/S14-Fc для экспрессии и получения антигена - рекомбинантного белка вируса SARS-CoV-2. Последовательность рекомбинантного антигена на основе RBD с дополнительными эпитопами была слита с С-концевой частью RBD, FcIgGl дикого типа (без модификации), для получения RBD/S21/S14-Fc. Модификации RBD были направлены на увеличение иммуногенности антигена. Было добавлено два пептидных эпитопа. Эпитоп S14P5 находится в области за RBD в SD1 субдомене, по всей видимости, антитела к этому участку стерически препятствуют связыванию с рецептором. Эпитоп S21P2 находится в области S2, перекрывается с фьюжн пептидом (FP), причем антитела к этому участку препятствуют слиянию вируса с таргетной клеткой. Порядок эпитопов был изменен для повышения стабильности белка. Его аминокислотная последовательность представлена SEQ ID NO: 1. Расчетный молекулярный вес 107,2 кДа (димер) и 53,6 кДа (восстановленный мономер).
Получение экспрессионной конструкции и ее подготовка к трансфекции. На первом этапе получили оптимизированную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 2). Нуклеотидную последовательность гибридного гена оптимизировали для экспрессии в культуре клеток СНО-НР с помощью программы GeneArt GeneOptimizer. В данной последовательности первые 60 нуклеотидов являются лидерным пептидом IL-2 (SEQ ID NO: 3).
Карта плазмиды RBD/S21/S14-Fc представлена на рис. 1. В табл. 1 приведены основные характерные кодирующие последовательности плазмиды RBD/S21/S14-Fc. Полная нуклеотидная последовательность вектора представлена SEQ ID NO: 4.
RBD/S21/S14-Fc гибридный ген амплифицируют в реакции ПЦР с использованием праймеров
SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 и ДНК полимеразой, обладающей корректирующей 3’-5’
экзонуклеазной активностью. Продукт реакции очищается с использованием протокола очистки ДНК на спин колонках.
Вектор P-Pharma-Zeo линеаризуют с использованием рестриктаз Hindlll и Xbal, очищают продукт методом агарозного гель-электрофореза и выделяют из геля с использованием протокола очистки ДНК на спин колонках. Концы вектора затупляют с использованием ДНК полимеразы, обладающей 3’ -5’ экзонуклеазной активностью, далее вектор очищают с использованием протокола очистки ДНК на спин колонках. Реакцию лигирования осуществляют с использованием Т4-ДНК полимеразы в соотношении вставка/вектор=1/10 с использованием 5 % ПЭГ-4000 в реакции лигирования. Полученную плазмидную ДНК очищают с использованием протокола очистки ДНК на спин колонках. Осуществляют трансформации лигазной смеси в химически-компетентные клетки Е. Coli (штамм lObeta), после трансформации высеивают клетки в LB-arap на чашку Петри, содержащую 100 мкг/мл ампициллина. Клетки инкубируют при 37 °C в течение 18 часов до появления отдельных колоний (бактериальных клонов).
Далее осуществляли проверку наличия вставки и ориентации с использованием праймеров SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 (для проверки наличия гена в плазмиде), а также SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 (для проверки правильной ориентации гена) в выбранных бактериальных клонах. Объемы реагентов для реакции ПЦР представлены в табл. 2.
После проведения реакции ПЦР продукт реакции анализируют методом агарозного гель- электрофореза (1 % агарозы). Бактериальные клоны, ПЦР продукты от которых имеют размер ПЦР продукта ~ 1700 и. и. и корректно ориентированный размер ПЦР продукта ~ 400 и. и., переносят в 50 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, культивируют при перемешивании в течение 24 ч. Полученную суспензию центрифугируют и удаляют супернатант, не затрагивая осадка клеток.
Из осадка клеток выделяют плазмидную ДНК с использованием протокола очистки на спин- колонках.
Плазмидную ДНК из выбранных колоний выделяли из бактериальной культуры с помощью набора Plasmid Midiprep 2.0 согласно рекомендациям производителя. 50 мл культуры центрифугировали при скорости 3000 g и температуре 4±2 °C в течение 20 минут. Супернатант полностью удаляли, к осадку вносили 5 мл ресуспендирующего раствора с РНКазой А. Смесь тщательно перемешивали на вибромешалке до полного ресуспендирования осадка и вносили 5 мл лизирующего раствора. Содержимое пробирки аккуратно переворачивали 10 раз. Затем вносили 5 мл нейтрализующего раствора, предварительно охлажденного до 4±2 °C, и перемешивали переворачиванием. Лизат осаждали при скорости 3000 g в течение 45 мин на центрифуге Allegra 25R. Перед нанесением лизата на мембрану спин-колонки наносили 1,0 мл раствора для удаления эндотоксинов, полностью смачивая всю поверхность сорбента. Инкубировали в течение 1 минуты и наносили на мембрану весь объем бактериального лизата. Центрифугировали спин-колонку при скорости 3000 g в течение 2 минут. Затем на мембрану наносили 1 мл раствора для удаления эндотоксинов и центрифугировали при 3000 g в течение 1 минуты. Вносили 15 мл промывочного раствора с этанолом и центрифугировали при 3000 g в течение 1 минуты, промывку повторяли с тем же объемом промывочного раствора. После второй промывки спин-колонку центрифугировали при скорости 3000 g в течение 5 минут для удаления остатков жидкости. Спин-колонку помещали в новую пробирку вместимостью 50 мл и оставляли открытой под ламинарным боксом на 5 минут для удаления остатков этанола. После на мембрану наносили 4 мл элюирующего раствора, предварительно подогретого на водяной бане TW-2 до 50±2 °C, и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 минут. Центрифугировали спин-колонку при скорости 3000 g в течение 2 минут. Элюат концентрировали с использованием ультрафильтрационных концентраторов VivaSpin6 (предел отсечения 10 кДа) до 500 мкл при скорости 3000 g. К 500 мкл раствора плазмидной ДНК прибавляли 50 мкл 3 М натрия ацетата. К смеси вносили 1400 мкл этанола, предварительно охлажденного до минус 20 °C, перемешивали и инкубировали при минус 20±2 °C в течение 20 минут. Полученный раствор центрифугировали при скорости 14000 g в течение 20 минут при температуре 4±2 °C, супернатант полностью удаляли, к осадку плазмидной ДНК аккуратно вносили 500 мкл 70 % этанола. Образец центрифугировали при скорости 14000 об/мин в течение 10 минут, удаляли супернатант. Осадок высушивали под ламинарным потоком стерильного воздуха в течение 10 минут и растворяли в 20 мкл стерильной воды, не содержащей ДНКаз и РНКаз.
1 мкл отбирали для оценки концентрации ДНК, а также определения последовательности гена RBD/S21/S14-Fc. Для секвенирования внедренного гена методом Сэнгера использовали праймеры SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14.
На рисунках 2-7 приведены электрофореграммы реакций секвенирования. Итоговые результаты секвенирования с использованием праймеров, покрывающих всю последовательность гена RBD/S21/S14-Fc, подтвердили идентичность последовательности гибридного гена RBD/S21/S14-Fc с референтной последовательностью.
Трансфекция и селекция трансфектантов. Создание штамма-продуцента.
Для трансфекции клеток СНО получили 8,6 мг/мл чистой (“transfection grade”) плазмидной ДНК P-Pharma-Zeo-RBD/S21/S14-Fc. В результате трансфекции экспрессионным вектором Р- Pharma-Zeo-RBD/S21/S14-Fc получили один пул клеток, в котором жизнеспособность культуры клеток через 48 ч после трансфекции составила 92 %. Контрольная трансфекция вектором, содержащим ген флуоресцентного зеленого белка GFP, продемонстрировала эффективность трансфекции на уровне 50±20 %. Через 72 ч начинали селекцию трансфектантов путем культивирования с добавлением 400 мкг/мл зеоцина и 500 нМ МТХ. В течение 10 суток под селективным давлением жизнеспособность достигала минимума - 55±5 %. Восстановление жизнеспособности культуры в пуле до 90±5 % произошло на 16-е сутки, после чего часть клеток пула замораживалась, и осуществлялись предельные разведения с плотностью 0,5 клеток на лунку. Общее количество планшетов равнялось 100 шт. Из 96-луночных планшетов со стадии клонирования методом предельных разведений было отобрано 105 клонов и перенесено в 24- луночные планшеты. Все клоны, выросшие в 24-луночных (77) планшетах были перенесены в 6- луночные планшеты с увеличенным до 1,4 % содержанием Anti Clumping Agent В для разрушения агрегатов клеток. После масштабирования для адаптации к культивированию при перемешивании в колбах выбрали 10 суб клонов, которые имели наилучшие характеристики по параметрам: удельная продуктивность (ped) > 20 пг/клетку, содержание жизнеспособных клеток > 0,9 млн/мл, содержание белка в культуральной жидкости > 30 мкг/мл. Пересев субклонов осуществляли в течение 2 пассажей (1 пассаж - 4 суток), после второго пассажа клетки замораживали с содержанием клеток 10±1,5 млн клеток/криопробирку. В табл. 3 приведены данные по продуктивности клонов на втором пассаже, считая от пересева из 96-луночных планшетов. На основе клеточной линии СНО-НР, трансфицированной вектором P-Pharma-Zeo- RBD/S21/S14-Fc, получены четыре первичные клона-продуцента гибридного белка RBD/S21/S14- Fc не менее 17±2 пг/(клетку*день). В качестве штамма-продуцента выбран клон наибольшей продуктивности (табл. 3, клон номер 10).
Таким образом, была создана клеточная линия СНО-НР, полученная из линии клеток СНО-К1 (вид Cricetulus griseus), путем адаптации к суспензионному культивированию, содержащая ген гибридного белка RBD/S21/S14 домена S-белка из SARS-CoV-2, соединенного с Fc-фрагментом IgGl человека в составе вектора P-Pharma-Zeo. Таким образом, была проведена сборка и апробация RBD/S21/S14-Fc и создан штамм-продуцент для наработки белка RBD/S21/S14-Fc.
Анализ секреции и подтверяедение подлинности белка. На рис. 8 приведены результаты оценки экспрессии RBD/S21/S14-Fc методом вестерн-блоттинга.
Для масс-спектрометрической идентификации белка после проведения SDS-PAGE электрофореза вырезали окрашенные кумасси полосы и проводили трипсинолиз в геле. Разделение триптических пептидов проводили на хроматографической системе Ultimate 3000 Nano LC System (Thermo Fisher Scientific), сопряженной с масс-спектрометром Q Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) посредством наноэлектроспрейного источника (Thermo Fisher Scientific). Анализ MS/MS- данных проводили при помощи компьютерной программы PEAKS Studio 8. Первичные структуры пептидов, генерируемые программой PEAKS Studio, анализировали против базы данных соответствующих белковых последовательностей. Анализ проводили со следующими настройками: окисление Met, дезамидирование Asn/Gln и карбомидометилирование Cys. На рис. 9 представлено покрытие триптическими пептидами последовательности RBD/S21/S14-Fc. На рис. 10 представлены результаты гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex 200 Increase в Na-фосфатном буфере pH 7.4.
Способ получения рекомбинантного антигена из клеток штамма-продуцента. Разработанный способ получения рекомбинантного антигена включает следующие этапы: 1) культивирование штамма-продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2; 2) отбор и осветляющая фильтрация культуральной жидкости; 3) хроматографическая очистка
рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2; 4) подтверждение подлинности полученного рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2.
Культивирование. Пробирку из главного банка клеток, содержащую 107 клеток штамма- продуцента рекомбинантного антигена RBD/S21/S14-Fc, размораживали при 37 °C в водяной бане в течение 10 минут, добавляли 4 мл среды ActiPro (Hyclone, США), содержащей 4 мМ Е-аланин-L- глутамина (Gibco, США) и 0,4 % реагента против агрегации клеток, перемешивали и центрифугировали при 200 g в течение 5 минут, супернатант удаляли, осадок клеток ресуспендировали в 5 мл среды ActiPro (Hyclone, США), содержащей 4 мМ -аланин-Ь -глутамина (Gibco, США) и 0,4 % реагента против агрегации клеток, и инкубировали в течение суток в инкубаторе при 37 °C и влажности не менее 70 %. Для культивирования в биореакторе наращивали инокулят в необходимом количестве для начального засева в реактор с клеточной плотностью 0,5х10б кл/мл, т. е. в количестве не менее 400 х10б кл в колбах при перемешивании, культуру клеток пересевали с увеличением объема колб. Культуру клеток пересевали в колбу вместимостью 125 мл с 20 мл среды и культивировали в течение 4 суток в шейкере-СОз-инкубаторе при скорости вращения платформы 120±5 об/мин, температуре 37±1 °C, содержании СОз 5±1 % и относительной влажности 70±5 %. Весь объем культуры переносили в колбу вместимостью 500 мл со 125 мл среды и культивировали в течение 3 суток при тех же условиях. Необходимый объем клеток переносили в биореактор BioFlo 320 с рабочим объемом 1 литр (Eppendorf, Германия) до клеточной плотности 0,5х10б кл/мл с конечным объемом культуры 800 мл. Культивирование клеток штамма-продуцента проводят в биореакторе BioFlo 320 с рабочим объемом 1 литр (Eppendorf, Германия) на среде ActiPro (Hyclone, США), содержащей 4 мМ Е-аланин- -глутамина (Gibco, США) и 0,4 % реагент против агрегации клеток (Lonza, Швейцария). Ежедневно с третьих суток культивирования вносят комплекс добавок: Cell Boost 7А (Cytiva, США) 1,5-3, 5% от объема культивирования и смесь аминокислот L-цистеина (152 мМ), L-триптофана (90 мМ), L-тирозина (250 мМ) (AppliChem, США).
Количество смеси аминокислот используют в 10 раз меньше относительно объема Cell Boost 7А. В течение всего процесса ежедневно добавляют концентрированный раствор глюкозы 200 г/л (Рапгеас, США) для поддержания концентрации глюкозы в культуральной жидкости около 5 г/л. Все указанные добавки ежедневно вносят через насос контроллера биореактора таким образом, чтобы рассчитанный объем на сутки не влиял на резкое изменение pH и осмоляльности. В первый день культивирования подготовленную биомассу переносят в биореактор для получения начальной концентрации живых клеток 0,5±0, 1 * 10б клеток/мл. Культивирование осуществляют при pH 7,0±0,2 и концентрации растворенного кислорода 40±5 %. Регуляцию pH осуществляют подачей СОз и 0,5 М NaHCOs (Sigma-Aldrich, США). Регуляцию концентрации растворенного кислорода в начале процесса осуществляют азотом и воздухом, затем воздухом и кислородом по мере увеличения концентрации жизнеспособных клеток и скорости потребления кислорода. Смесь газов подают
через макробарботер со скоростью от 0,2 до 1,5 л/мин. Культивирование осуществляют при скорости вращения мешалки типа «морской винт» от 60 до 100 об/мин (каскадное регулирование) и температуре 37 °C с последующим понижением до 35 °C в экспоненциальной фазе роста и до 33 °C на следующие сутки культивирования. Отбор и осветляющая фильтрация культуральной жидкости. Начиная с третьих суток культивирования, осуществляют ежедневный отбор пробы культуральной жидкости для определения в ней количества жизнеспособных клеток, концентрации глюкозы и лактата. Культивирование останавливают при снижении жизнеспособности ниже 90 %. Культуральную жидкость осветляют методом центрифугирования в две стадии: 1000 g в течение 30 минут и 3270 g в течение 15 минут. Для стерилизации культуральной жидкости используют фильтр с размером пор 0,22 мкм. Полученный объем стерильной культуральной жидкости составлял 1,05 л. Из полученной культуральной жидкости путем очистки по описанному ниже протоколу было получено 375 мг рекомбинантного антигена RBD/S21/S14-Fc.
Хроматографическая очистка белка. Хроматографическая очистка белка из осветленной культуральной жидкости проводится на препаративном хроматографе. Первая стадия очистки - аффиный сорбент Mab Select Shure LX (Cytiva), а также MabSelect Prisma (Cytiva), Mab Select (Cytiva) объемом 4,7 мл. Уравновешивание буфером 20мМ фосфат натрия, 150мМ хлорид натрия, pH 7,0 в течение 10 колоночных объемов со скоростью 2,5 мл/мин. Нанесение культуральной жидкости на колонку, время контакта 1 мин. После окончания нанесения, колонку промывают буфером 20мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, pH 7,0 в течение 5 колоночных объемов со скоростью 5 мл/мин. После окончания промывки проводят элюцию буфером 20 мМ цитрат натрия, pH 3,0 в течение 4 колоночных объемов со скоростью 1 мл/мин. Доведение pH в полупродукте 1М раствором трис до значения 7,0. Вторая стадия очистки - сорбент смешанного действия НА Ultrogel (Sartorius), а также СНТ Ceramic Hydroxyapatite(Biorad), Ca++Pure-HA (Tosoh Biosciences) объемом 10мл. Уравновешивание буфером 20 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, pH 7,0 в течение 8 колоночных объемов со скоростью 2мл/мин. Нанесение полупродукта, полученного с первой стадии очистки, на колонку происходит в 50% градиенте буфера 20 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, pH 7,0, время контакта 5 мин. После окончания нанесения колонку промывают буфером 20 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, pH 7,0 в течение 4 колоночных объемов со скоростью 2 мл/мин. После окончания промывки проводят элюцию буфером 20мМ фосфат натрия, 1М хлорид натрия, pH 7,0 в течение 4 колоночных объемов со скоростью 1 мл/мин. Добавление в полупродукт NaCl до конечного содержания 2 М. Доведение pH в полупродукте 1М раствором фосфорной кислоты до значения 6,0. Третья стадия очистки - гидрофобный сорбент Butyl Sepharose HP (Cytiva), а также Capto Butyl ImpRes (Cytiva), Phenyl Sepharose HP (Cytiva), Capto Phenyl ImpRes (Cytiva) объемом 5мл. Уравновешивание буфером 20 мМ фосфат натрия, 2 М хлорид натрия, pH 6,0 в течение 10 колоночных объемов со скоростью 2,5мл/мин. Нанесение полупродукта, полученного со второй стадии очистки на колонку, время контакта 5 мин. После окончания нанесения колонку
промывают буфером 20 мМ фосфат натрия, 2 М хлорид натрия, pH 6,0 в течение 5 колоночных объемов со скоростью 2,5мл/мин. После окончания промывки проводят элюцию в градиенте 100% буфера 20 мМ фосфат натрия, pH 6,0 в течение 3 колоночных объемов со скоростью 2 мл/мин. Четвертая стадия очистки - перевод в буфер ГЛФ, используя сорбент Sephadex G25 объемом 53мл. Перед нанесением колонка уравновешена буфером 20 мМ фосфат натрия, pH 7,0, нанесение проходит со скоростью 1мл/мин, после окончания нанесения промывка колонки буфером 20 мМ фосфат натрия, pH 7,0 в течение 3 колоночных объемов на скорости Юмл/мин. Пятая стадия - нормирование концентрации белка. Концентрацию доводят буфером 20 мМ фосфат натрия, pH 5,0- 7,0 до значения 2мг/мл и стерильно фильтруют через фильтр насадку на флакон Steritop 0,22 mkm (Merck - Millipore, Германия). Получили 180 мл стерильного очищенного рекомбинантного антигена RBD/S21/S14-Fc. Рекомбинантный антиген хранят в холодильнике при температуре +4 С.
Подтверждение подлинности белка. Подтверждение подлинности полученного рекомбинантного антигена RBD/S21/S14-Fc проводят при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с последующим иммуноблоттингом. Для проведения электрофореза используют градиентный полиакриламидный гель 4-20 % (Bio-Rad, кат № 4561093). Анализ образцов методом электрофореза проводят в восстанавливающих условиях. В лунки геля вносят 100 нг раствора белка. Разделение проводят при напряжении 200 В в течение 50 мин. Перенос на PVDF мембрану осуществляют с использованием системы Trans Blot Turbo (Biorad), согласно рекомендациям производителя. После забивки мембраны 3 % раствором бычьего сывороточного альбумина, проводят конъюгирование с анти-IgGl антителом (Abeam, кат №аЬ6760), меченым щелочной фосфатазой. После отмывки мембраны проводят детектирование конъюгата с использованием раствора BCIP/NBT.
Получение гомогенной дисперсии корпускулярного адъюванта на основе бетулина (КА).
С целью получения гомогенной дисперсии корпускулярного адъюванта (КА) на основе бетулина, к стерильной смеси 1 % раствора бетулина в тетрагидрофуране (ТГФ), которую пропускали через нейлоновую мембрану с диаметром пор 0,22 мкм, в соответствии с технологией, добавляли 25 объемов стерильного 0,01 М трис-буфера рН-9,0±0,1 с помощью перистальтического насоса при постоянном перемешивании в течение 15 минут магнитной мешалкой пропеллерного типа. После добавления буфера содержание ТГФ в растворе составляло 3,85 %. Далее полученную суспензию обрабатывали ультразвуком при 35 кГц в течение 10 минут. Для этого стеклянную емкость с полученной суспензией корпускулярного адъюванта помещали в ультразвуковую баню. И обрабатывали в вышеописанном режиме. В результате обработки получали белую равномерную суспензию без конгламератов и включений. За гомогенностью суспензии следили по светорассеянию, последовательно обрабатывая по 30 секунд до получения двух одинаковых спектров распределения частиц в диапазоне 100-150 нанометров. На следующем этапе производили очистку дисперсии КА от тетрагидрофурана. Применяли ультрафильтрацию на полых волокнах с номинальной отсекающей молекулярной массой 100 кДа в режиме фильтрации. Для
предотвращения сорбции использовали 2-3-хкратное разведение исходной дисперсии КА. При этом скорость ультрафильтрации составляла 1,0- 1,2 л/минуту, давление устанавливали в пределах 0,6- 0,8 атм. Для диафильтрации использовали 10-кратный объем (25 литров) 0,01 М трис-буфера. Затем дисперсию концентрировали до содержания бетулина 1, 0-2,0 мг/мл (4,5 л буфера). Концентрацию бетулина определяли методом ВЭЖХ. Ёмкость с корпускулярным адъювантом хранили в холодильной камере при температуре около +4 С.
Получение кандидатной вакцины для иммунизации животных и добровольцев. Полученный в соответствии с перечисленными этапами стерильный рекомбинантный антиген RBD/S21/S14-Fc, растворенный в Трис-HCl буферном растворе, объемом 100 мл добавляли в емкость с предварительно приготовленным стерильным адъювантом объемом 1 литр в 0,05М буферном растворе Трис-HCl с добавлением 0,15М NaCl (pH 7,5), тщательно перемешивали в течение двух часов при +4 °C. Полученный полуфабрикат, содержащий RBD/S21/S14-Fc, прошедший все контроли, доводят до концентрации белка 40 мкг/мл и концентрации адъюванта 400 мкг/мл в фосфатном буферном растворе pH 7,5. Компоненты тщательно перемешивали и помещали в шейкер в холодильник при температуре от 2 до 8 °C на 3 часа. Затем емкости с «балком» кандидатной вакцины разливали по 0,5 мл во флаконы и хранили в холодильнике при 2-8 °C. Содержание антигена и адъюванта в одной дозе (0,5 мл) составляло 20 мкг и 200 мкг, соответственно. По такой же схеме готовили образец кандидатной вакцины с содержанием антигена и адъюванта в дозе (0,5 мл): 5 мкг рекомбинантного антигена RBD/S21/S14-Fc и 200 мкг корпускулярного адъюванта.
Полученную вакцину применяли в качестве кандидатной вакцины для проведения доклинических и клинических исследований.
Определение содержания корпускулярного адъюванта (КА). Определение проводили методом обращено-фазовой ВЭЖХ. Исследование проводили с использованием жидкостного хроматографа Shimadzu LC-2010 (Япония) и аналитической колонки Kromasil 300-5С8 250 х 4.6 мм с размером частиц 5 мкм, AkzoNobel (Голландия) в изократическом режиме элюирования и детектировании при 210 нм. Результаты представлены в табл. 4.
Оценка специфической активности вакцины. Целью исследования являлось сравнительное изучение иммуногенности вакцины в опытах на животных. В ходе исследования сравнивали выработку антител у иммунизированных опытными вакцинами мышей линии Balb/c
массой 12 - 14 г обоего пола. Испытуемые препараты вводили двукратно (по схеме 0-14) внутрибрюшинно по 0,5 мл шприцем вместимостью 1 мл. Аналогично контрольным группам животных вводили натрия хлорид, раствор для инфузий 0,9 %. Забор крови осуществляли на 14 день после однократной иммунизации и на 14 день после двукратной иммунизации. Антитела определяли в сыворотках с помощью метода ИФА. Исследовали специфическую активность вакцины, содержащей только RBD (в двух дозировках: 5 и 20 мкг рекомбинантного белка в дозе (0,5 мл), вакцину N+RBD в дозировке 5 мкг антигена в дозе (0,5 мл), а также вакцину без адъюванта. Данные о числе животных, о вакцинах и их дозировке при иммунизации представлены в табл. 5.
Полученные из крови мышей сыворотки (индивидуально от каждого животного) контролировали на наличие антител к антигену SARS-CoV-2 методом иммуноферментного анализа с использованием экспериментальной тест-системы (ИФТС). При конструировании ПФТС использовались коммерческие реагенты: а/mouse IgG (H+L) Strong Zyme HRP Conjugate (фирмы «SDT», Германия); хромоген - 3,3,5,5-тетраметилбензидин (фирмы «Хема», Россия); блокатор - белково-солевой раствор, в качестве стоп-реагента применялся 5 % раствор серной кислоты. Иммуноферментную реакцию выполняли на полистироловых планшетах фирмы Greiner bio-one, Германия. На подложку наносили 1 мкг антигена SARS-CoV-2 и сорбировали в течение суток. Результаты иммуноферментного анализа регистрировали на спектрофотометре PR 2100 производства фирмы «Sanofi Diagnostiks Pasteur» (Франция) при двух длинах волн 450/620 нм, и они представлены в табл. 6.
Изучение иммунного ответа (титра антител) кандидатной вакцины на основе рекомбинантного белка RBD/S21/S14-FC и корпускулярного адъюванта на основе природного бетулина. В исследовании были использованы самки линии BALB/c (Филиал "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России). Животных содержали в стандартных условиях (18-22 °C и относительной влажности воздуха 50-70 %, МНз=0,001 мг/м3, СОг=0,1 %, 12 ч темноты/12 ч света), кормили гранулированным полнорационным экструдированным кормом для мышей, крыс, и хомяков (ООО «Лабораторкорм», Москва) ad libitum в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях и в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 2.2.1.3218-14 “Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)” (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29 августа 2014 г. № 51).
В табл. 7 приведены препараты кандидатной вакцины на основе рекомбинантного белка RBD/S21/S14-Fc с корпускулярным адъювантом для иммунизации животных и дизайн исследования. В качестве препарата плацебо использовали физиологический раствор (0,9 % NaCl).
Мышам линии BALB/c массой 18-20 г препараты вводили внутрибрюшинно по 0,5 мл шприцем вместимостью 1 мл, двукратно, на 1-й и 14-й день, согласно дизайну исследования. Перед каждым заполнением шприца препарат перемешивали 5-6 раз. Контрольной группе мышей той же партии вводили раствор 0,9 % натрия хлорида. Через 28 дней после первой иммунизации у мышей осуществляли забор крови из нижнечелюстной вены. Образцы крови отстаивали при комнатной температуре в течение 2-х часов, центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин и отбирали образовавшуюся цельную сыворотку. До момента использования сыворотки хранили при температуре -20 °C. Полученные из крови мышей сыворотки (индивидуально от каждого животного) контролировали на наличие антител методом иммуноферментного анализа (ИФА) и реакцией микронейтрализации (РМН). Статистический анализ первичных данных проводили в GraphPad Prism v9. Для представления данных использовали следующие статистические показатели: среднее геометрическое, стандартное отклонение, среднее арифметическое, ошибка среднего. Для определения значимости различий между групповыми средними использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, затем критерий Тьюки для апостериорных попарных сравнений групп между собой. Групповой уровень значимости принимали равным а = 0,05. Различия считали достоверными при р <а.
Иммуноферментный анализ. Наличие специфических иммуноглобулинов класса G (IgG) определяли в образцах сывороток мышей после двукратной иммунизации. Сорбцию антигена, разведенного в стерильном DPBS до концентрации 1,0 мкг/мл, проводили в течение ночи при +4 °C в 96-луночных планшетах Maxisorp (Nunc) (по 100 мкл/лунку). Затем планшеты дважды отмывали раствором 0,1 % TWEEN20 (Serva) в PBS с использованием автоматического промывателя ELx50 (BioTek) по 500 мкл/лунку. После отмывки планшеты инкубировали с блокирующим буфером (PBS- Т, содержащий 5 % сухое молоко, «ТФ Дитол») в течение 2-х часов при комнатной температуре и повторно отмывали. После чего на планшет вносили серии двукратных разведений сывороток,
начиная с разведения 1:400 для групп животных, получивших вакцинные препараты и с разведения 1:50 для группы плацебо. Планшеты с мышиными сыворотками инкубировали 1 ч при комнатной температуре, затем три раза отмывали. В качестве вторичных антител использовали меченые пероксидазой хрена Goat anti mouse IgG (H+L) HRP (Abeam) в разведении 1:7500 по 100 мкл/лунку. После инкубации со вторичными антителами планшеты четыре раза отмывали. В качестве цветного субстрата использовали раствор ТМВ (ООО «Имтек», Россия) по 100 мкл/лунку в течение 10 мин при комнатной температуре, затем реакцию останавливали добавлением IN H2SO4 («Вектон», Россия). Оптическую плотность (ОП) при длине волны 450 нм измеряли на мультипланшетном ридере с LVF монохроматорами CLARIOstar (BMG LABTECH). Для вакцинных препаратов после двукратной иммунизации в дозе 5 мкг и 20 мкг было проведено определение уровня специфических антител IgG к белку RBD/S21/S14-Fc в сыворотках иммунизированных животных с помощью непрямого варианта ИФА с использованием экспериментальной тест-системы. Результаты определения уровня специфических антител представлены в таблице. Статистический анализ был выполнен при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим попарным сравнением групп при помощи критерия Тьюки. В ходе исследования показано формирование выраженного уровня сывороточных антител, специфических к белку RBD/S21/S14- Fc после двукратной иммунизации вакцинными препаратами в обоих использованных дозах. Результаты представлены в табл. 8.
Реакция микронейтрализации (РМН). Для проведения реакции нейтрализации сыворотки мышей разводили стерильным DPBS в соотношении 1:4 и прогревали 30 мин при 56 °C. Затем готовили разведения сывороток на среде МЕМ+2 % FBS в объеме 50 мкл, начиная с 1: 10 (в пересчете на цельную сыворотку). К разведениям сывороток добавляли эквивалентный объем вируса SARS-CoV-2 (заражающая доза 25 ТЦИД50) и инкубировали 1 час при 37 °C. Затем разведения переносили на клетки Vero в 96-луночных планшетах. Планшеты инкубировали в течение 4 суток при 37 °C, после чего проверяли на наличие ЦПД (цитопатического действия).
Нейтрализующим титром считали наибольшее разведение сыворотки, при котором наблюдается отсутствие ЦПД. Все исследования с инфекционным коронавирусом проводили в лаборатории иммунологии и профилактики вирусных инфекций ФГБНУ «ПЭМ» (Санитарно- эпидемиологическое заключение Роспотребнадзора по Санкт-Петербургу № 77.ПЧ.01.000. М.000053.08.20 от 05.08.2020 для проведения работ е ПБА II-IV группы патогенности).
Результаты определения уровня нейтрализующих антител против коронавируса SARS-CoV-2 в сыворотках крови мышей после двукратной иммунизации показали, что вирус-нейтрализующие антитела в количестве, достоверно отличающимся от группы плацебо, формируются в группе животных, получивших кандидатную вакцину, содержащую рекомбинантный белок как в дозе 5 мкг, так и в дозе 20 мкг. Уровень вируснейтрализующих антител достоверно не отличался от такового в обеих группах. Статистический анализ был выполнен при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим попарным сравнением групп при помощи
критерия Тьюки. Результаты представлены в табл. 8. В ходе исследования показано, что двукратная иммунизация приводила к формированию вируснейтрализующих антител в количестве, достоверно отличающимся от группы плацебо, только в группе животных, привитых кандидатной вакциной, содержащей рекомбинантный белок в дозе 5 или 20 мкг. Таким образом, установлено, что вакцина, содержащая корпускулярный адъювант на основе природного бетулина, обладает высокой антигенной активностью.
Изучение иммуногенных свойств (оценки клеточного иммунного ответа) кандидатной вакцины на основе рекомбинантного белка RBD/S21/S14-FC и корпускулярного адъюванта на основе природного бетулина. Для оценки Т-клеточного иммунного ответа мышам линии C57/black SPF (п=5 на группу) препарат вводили внутрибрюшинно по 5 или 20 мкг, двукратно, 1 -й и 22-й день.
Селезенки были собраны через 28 дней после второй иммунизации. Невакцинированная группа (п=3) служила контролем. Дизайн исследования представлен в табл. 9.
Примечание: И - иммунизация, С - забор образцов селезенки
Гомогенаты селезенки фильтровали (поры 70 мкм), промывали DPBS, содержащим 2,5% FCS (Gibco), лишали красных кровяных телец буфером для лизиса RBC (BioLegend), промывали DPBS (2,5% FCS). Клетки селезенки высевали на 96-луночные планшеты с плоским дном при плотности 2х10& клеток и стимулировали пулом пептида S-белка SARS-CoV-2 (PepTivator® SARS-CoV-2 Prot
S) в течение 6 часов в присутствии анти-СВ28 (BioLegend) и Брефельдина A (BD Biosciences). Фенотип клеток изучали с помощью проточной цитометрии и CD8-PE/Cy7, CD4-PerCP/Cy5.5, CD44-BV510, CD62L-APC/Cy7, IFNy-BV780, TNFa-BV421, IL2-PE (BioLegend). Мертвые клетки обнаруживали с помощью Zombie Red (BioLegend). True Stain, содержащий анти-CD 16/CD32 (Bio- Legend), использовали для блокирования неспецифического связывания. Окрашивание клеток проводили с помощью Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями. Определяли относительное соотношение CD8 + и CD4+ Т-лимфоцитов с фенотипом эффекторных клеток памяти (CD44+ CD62L-). Значительное увеличение S-белок-специфических CD4+ и CD8+ Тет клеток было измерено после двух иммунизаций по 20 мкг, тогда как иммунизация в количестве 5 мкг антигена привела к статистически значимому увеличению только CD4+ Теш (р <0,05).
Наблюдалась тенденция к дозозависимому росту клеток, продуцирующих Th 1 -цитокин (IFNy, IL-2, TNFa), среди обеих популяций Теш. Эффект достиг значимости для Теш, продуцирующих IL-2 (IFNy-IL-2 + TNFa-), и для многофункциональных CD8+ Т-клеток (IFNy + IL-2 + TNFa +) в обеих группах дозирования. В группе с высокими дозами рост IL-2, продуцируемого CD8+ Теш, также был значительным.
Изучение иммуногенных свойств (оценки клеточного иммунного ответа) кандидатной вакцины на основе рекомбинантного белка RBD/S21/S14-FC и корпускулярного адъюванта на основе природного бетулина на добровольцах.
Для строгого контроля за возникновением нежелательных явлений и любых поствакцинальных осложнений для добровольцев была предусмотрена двукратная госпитализация в стационар на 3-е полных суток (4 дня) для проведения каждого из двух введений вакцины / плацебо. Добровольцы были госпитализированы в стационар за один день до введения вакцины. Через двое суток после первой и второй инъекции вакцины / плацебо, при отсутствии нежелательных явлений (НЯ) и серьезных нежелательных явлений (СНЯ), добровольцев выписали из стационара. Дальнейшее наблюдение осуществлялось амбулаторно. Исследование проводили в два этапа.
Первый этап исследования первой фазы. Первый этап клинического исследования представляет собой открытое рандомизированное исследование безопасности, переносимости (реактогенности) и иммуногенности вакцины при двукратном внутримышечном введении в дозах 20 мкг + 5 мкг и 20 мкг + 20 мкг. С учетом предполагаемого количества испытуемых, признанных по результатам скрининга не соответствующими критериям включения и/или соответствующими
критериям невключения, исследование проведено у 20 здоровых добровольцев в параллельных группах в возрасте от 18 до 60 лет. Группа 1 (10 человек) - получала исследуемый вакцинный препарат по следующей схеме: первая инъекция 20 мкг - 0,5 мл суспензии для внутримышечного введения (40 мкг/мл), вторая инъекция 5 мкг - 0,5 мл суспензии для внутримышечного введения (10 мкг/мл), через 28 дней (далее - «двукратная иммунизация по схеме 20 мкг + 5 мкг»). Группа 2 (10 человек) - получала исследуемый препарат по следующей схеме: первая и вторая инъекции по 20 мкг - по 0,5 мл раствора для внутримышечного введения (40 мкг/мл), через 28 дней (далее - «двукратная иммунизация по схеме 20 мкг + 20 мкг»). Добровольцы были госпитализированы в стационар за один день до каждого из двух введений вакцины. Длительность пребывания в стационаре составила два периода по 4 дня (4 Визита).
Второй этап исследования первой фазы. Второй этап клинического исследования представляет собой двойное слепое рандомизированное с параллельными группами клиническое исследование безопасности, переносимости и иммуногенности вакцины при двукратном внутримышечном введении в дозах 20 мкг + 5 мкг и 20 мкг + 20 мкг. С учетом предполагаемого количества испытуемых, признанных по результатам скрининга не соответствующими критериям включения и/или соответствующими критериям невключения, исследование проведено у 96 здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. Группа 3 (32 человека) - получала исследуемый препарат по следующей схеме: первая инъекция 20 мкг - 0,5 мл суспензии для внутримышечного введения (40 мкг/мл), вторая инъекция 5 мкг - 0,5 мл суспензии для внутримышечного введения (10 мкг/мл), внутримышечно, через 28 дней; Группа 4 (32 человека) - получала исследуемый препарат по следующей схеме: первая и вторая инъекции по 20 мкг - по 0,5 мл раствора для внутримышечного введения (40 мкг/мл), внутримышечно, через 28 дней; Группа 5 (32 человека) - получала плацебо по следующей схеме: первая и вторая инъекции - по 0,5 мл натрия хлорида, раствора для инъекций 0,9%, внутримышечно, через 28 дней. 96 добровольцев (Групп 3, 4 и 5) госпитализированы в стационар за 1 день до первого введения исследуемого препарата / плацебо. Длительность пребывания в стационаре составила 4 дня (3-е суток). Все добровольцы Групп 3, 4 и 5 наблюдались у врача-исследователя в течение 6-ти месяцев (180±5 дней) после первого введения исследуемого препарата / плацебо с целью выявления возможных поздних нежелательных реакций, оценки иммуногенности. Итоговая оценка безопасности и переносимости проводилась на Визите 20 (180±5 дней от момента первого введения исследуемого препарата / плацебо).
Анализ данных показал, что по всем изучаемым системам НЯ в анализируемых группах значимо не различались между собой. У одного добровольца с рандомизационным порядковым номером R004 (из Г1) на Визите 4 была зарегистрирована Коронавирусная инфекция COVID-19 на основании подтверждения наличия РНК вируса SARS-CoV-2 методом ПЦР и клинических проявлений (лихорадка, кашель), что являлось критерием исключения из исследования. Данное НЯ было легкой степени тяжести, продолжалось на момент проведения промежуточного анализа
данных. Оценка различий между Г1 и Г2 с применением Fisher exact test показала отсутствие статистической значимости (р=1.000) по критерию «Доля добровольцев с симптомами COVID-19 и подтвержденным методом ПЦР заражением SARS-CoV-2 инфекцией». Сравнительная характеристика первичных и вторичных критериев безопасности и переносимости показала отсутствие статистически значимых различий между исследуемыми группами.
Помимо безопасности кандидатной вакцины у добровольцев Группы 1-4 выявляли в крови специфические антитела к вирусу SARS-CoV-2. Результаты определения специфических антител у привитых добровольцев приведены в табл. 10.
Результаты определения специфических антител после иммунизации добровольцев двумя дозами вакцины Betuvax-CoV-2 показали, что при внутримышечном введении вакцины с интервалом 28 дней и использовании испытуемых схем введения (20мкг + 5мкг и 20мкг + 20 мкг) у большинства добровольцев наблюдается синтез специфических антител в высоком титре.
Claims
1. Гибридный ген, кодирующий рекомбинантный антиген, состоящий из рецептора RED поверхностного белка S коронавируса SARS-CoV-2, эпитопов S14P5 и S21P2, Fc-фрагмента иммуноглобулина IgGl, представленный в виде аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
2. Экспрессионная конструкция в составе вектора P-Pharma-Zeo, представленного SEQ ID NO: 4, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, состоящую из гибридного гена по п, 1 и последовательности SEQ ID NO: 3, кодирующей лидерный пептид IL2.
3. Линия клеток СНО-НР, трансфицированная экспрессионной конструкцией по и.2, способная продуцировать рекомбинантный антиген RBD/S21/S14-Fc.
4. Способ получения рекомбинантного антигена RBD/S21/S14-FC, предусматривающего культивирование линии клеток СНО-НР по п.З, в условиях подпитки 4 мМ Ь-алании- -глутамина и реагента против агрегации клеток с последующим отбором культуральной жидкости, ее осветлением, фильтрацией, хроматографической очисткой целевого рекомбинантного антигена, включающей аффинную хроматографию, хроматографию на НА сорбенте, гидрофобную и гель- проникающую хроматографию с последующей стерилизующей фильтрацией,
5. Рекомбинантный антиген RBD/S21/S14-FC, полученный способом по и. 4, стимулирующий иммунный ответ в организме на коронавирусную инфекцию.
6. Вакцинная композиция для профилактики короиавирусной инфекции, содержащая рекомбинантный антиген по п.5 и корпускулярный адъювант на основе природного бетулина в буферном растворе.
7. Способ профилактики короиавирусной инфекции, предусматривающий иммунизацию нуждающихся в защите от инфекции коронавирусов вакцинной композицией по п.6.
26
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2022115806 | 2022-06-10 | ||
| RU2022115806A RU2795160C1 (ru) | 2022-06-10 | Гибридный ген, состоящий из рецептора RBD поверхностного белка S коронавируса SARS-CoV-2, эпитопов S14P5 и S21P2, Fc-фрагмента, для получения рекомбинантного антигена и его применения в составе вакцинной композиции против коронавирусной инфекции |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2023239265A1 true WO2023239265A1 (ru) | 2023-12-14 |
Family
ID=89118633
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2023/050144 WO2023239265A1 (ru) | 2022-06-10 | 2023-06-09 | Гибридный ген для получения рекомбинантного rbd-антигена |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2023239265A1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2723008C1 (ru) * | 2020-05-19 | 2020-06-08 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение |
| CN111825762A (zh) * | 2020-06-17 | 2020-10-27 | 武汉华美生物工程有限公司 | 抗sars-cov-2病毒s蛋白rbd结构域的纳米抗体及其用途 |
| US20220001006A1 (en) * | 2020-07-01 | 2022-01-06 | Regents Of The University Of Minnesota | Virus like nanoparticle compositions and methods thereof |
-
2023
- 2023-06-09 WO PCT/RU2023/050144 patent/WO2023239265A1/ru unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2723008C1 (ru) * | 2020-05-19 | 2020-06-08 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение |
| CN111825762A (zh) * | 2020-06-17 | 2020-10-27 | 武汉华美生物工程有限公司 | 抗sars-cov-2病毒s蛋白rbd结构域的纳米抗体及其用途 |
| US20220001006A1 (en) * | 2020-07-01 | 2022-01-06 | Regents Of The University Of Minnesota | Virus like nanoparticle compositions and methods thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107875382B (zh) | 用于治疗巨细胞病毒的组合物和方法 | |
| US20100041875A1 (en) | Modified gp140 envelope polypeptides of hiv-1 isolates, compositions, stabilized trimeric coplexes, and uses thereof | |
| KR101989978B1 (ko) | 프라임 부스트 백신용 수포성 구내염 바이러스 | |
| US20230416309A1 (en) | Fusion protein and application thereof | |
| US7847085B2 (en) | Recombinant HIV-1 gp120 immunogen with three different V3 loops from viruses of different clades | |
| KR20020068040A (ko) | 키메라 면역원성 조성물 및 그들을 암호화하는 핵산 | |
| JP6407714B2 (ja) | 短縮型ｈｉｖエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）、前記に関連する方法及び組成物 | |
| WO2023051701A1 (zh) | 抗SARS-CoV-2感染的mRNA、蛋白以及抗SARS-CoV-2感染的疫苗 | |
| WO2015181142A1 (en) | Cytomegalovirus complexes and uses thereof | |
| US11136356B2 (en) | Recombinant HIV-1 envelope proteins and their use | |
| CN105555958B (zh) | 水疱性口炎病毒的改性基质蛋白 | |
| Bi et al. | An HIV-1 vaccine based on bacterium-like particles elicits Env-specific mucosal immune responses | |
| WO2023184861A1 (zh) | Hpv抗原表位及其鉴定方法、应用 | |
| CN113150085A (zh) | 抗SARS-CoV-2感染的组合物 | |
| WO2009143775A1 (zh) | 基于eiav减毒活疫苗的氨基酸突变而构建的抗hiv疫苗 | |
| WO2023184862A1 (zh) | Hpv抗原表位及其鉴定方法、应用 | |
| CN105859877A (zh) | 一种hpv特异性抗体的制备方法及冻干制剂 | |
| WO2023239265A1 (ru) | Гибридный ген для получения рекомбинантного rbd-антигена | |
| US20230190919A1 (en) | Coronavirus vaccine compositions and methods of use | |
| US8475799B2 (en) | HIV-1 GP41 neutralization domain and use thereof | |
| US20210340188A1 (en) | Recombinant gp120 protein with v1-loop deletion | |
| JP2023519837A (ja) | コロナウイルスを処置するためのワクチン組成物 | |
| JP2023519562A (ja) | サルモネラに基づく新規コロナウイルスワクチン | |
| WO2023128813A1 (ru) | Антигены для индукции иммунитета против вируса sars-cov-2 и генные конструкции для их экспрессии | |
| RU2781294C1 (ru) | Конъюгат белка рецепторсвязывающего домена (RBD) поверхностного гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 с полимером полиглюкин-спермидин (PGS) и вакцинный комплекс против коронавирусной инфекции COVID-19 на основе указанного конъюгата и плазмидной ДНК pVAX-RBD |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 23820179 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |