CN105859877A - 一种hpv特异性抗体的制备方法及冻干制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种HPV特异性抗体的制备方法及冻干制剂。所述HPV特异性抗体的制备方法，包括制备抗原，用所述抗原免疫鸡得到抗体，再进行酶解纯化得到HPV特异性抗体。所述抗HPV感染抗体的冻干制剂包括如下重量份比的原料制备而成：聚乙二醇0.5‑8份；甘露糖5‑80份；海藻糖1‑70份；蔗糖0.1‑10份；甘氨酸0.1‑5份；精氨酸0.1‑5份；缓冲盐0.01‑1份；还包括：上述所得HPV特异性抗体0.01‑0.5mg/ml。本发明HPV特异性抗体与预防性HPV疫苗相比较，具有作用时间短、起效快、不受到年龄段的限制等优点。

Description

一种HPV特异性抗体的制备方法及冻干制剂
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种HPV特异性抗体的制备方法及冻干制剂。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)主要引起皮肤、粘膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系，HPV可分为高危型与低危型，其中高危型的HPV感染被证实是诱发包括女性宫颈癌在内的肛生殖器癌症主要原因；低危型则主要引起尖锐湿疣。预防与控制HPV感染的最有效方式是HPV疫苗，特别是能引起宫颈癌的高危型HPV疫苗。
目前，扩大疫苗的保护范围的主要方法是增加疫苗的价数，开发多价疫苗。然而，随着疫苗价数的增加，不但加大了制备的难度，从而使疫苗的成本急剧增加，而且给疫苗的安全性带来极大的挑战。此外，多价疫苗之间可能存在着相互间的免疫干扰，使得各价疫苗难以充分发挥其诱导免疫的功能。
现有技术中，通过HPV感染过程中入侵的关键蛋白，如HPV(致病亚性)L-1/L2(17-36短肽)、受体蛋白及协助蛋白酶作为抗原免疫蛋鸡(或其他禽类)获得特异性抗体，能够快速中和HPV及阻断HPV入侵的通道，起到防止高危型HPV的感染作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种HPV特异性抗体的制备方法及冻干制剂。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种HPV特异性抗体的制备方法，包括如下步骤：
1)特异性抗原制备，所述抗原为HPV-16/18亚型的L1和L2的17-36肽段受体蛋白(硫酸肝素类蛋白多糖)、协助蛋白酶(弗林蛋白酶)；
2)抗体制备：采用蛋鸡作为免疫动物使用步骤1)抗原进行免疫，得含有特异性抗体的鸡蛋卵黄；
3)步骤2)所得鸡蛋卵黄经过水稀释、PEG沉淀步骤得初级提取液；
4)将初级提取液用DEAE-Sepharose 5Pw弱阴离子交换树脂进行分离纯化得次级提取液，所述次级提取液的特异性抗体的纯度大于85％；
5)将分离得到目的蛋白进行浓缩，所述浓缩为PEG包埋、50％-80％甘油透析或超滤浓缩，得浓缩液，所述浓缩液蛋白含量为3-8mg/ml；
6)将步骤5)所得浓缩液用木瓜蛋白酶的酶液酶解，所述酶液总木瓜蛋白酶的浓度为0.005-0.1mg/ml，溶剂为EDTA-消化缓冲液，酶解时按照酶液：所述浓缩液＝1:50的比例混合，然后至于37℃的环境中，酶解2-3小时，用1Mol/L的磷酸氢二钠溶液调节pH至7.4；
7)将步骤6)所得酶解产物用sephadexG-25/75进行分离，sephadex在分离前应用PBS平衡5-10倍柱体积，并且通过紫外检测器观测到基线达到平稳后再上样，上样体积为1/30的柱体积；特异性抗体会在紫外检测器探测到的第三或四个峰时流出，为了避免酶解不彻底产生的信号干扰，应在第二个峰时开始收集馏分，最后通过SDS-PAGE检测各馏分中的蛋白组分，以确定目的片段，确定目的片段后，将馏分用超滤浓缩的方式进行浓缩使其浓度在2-5mg/ml之间，所得为特异性抗体。
优选的，上述的HPV特异性抗体的制备方法中，所述步骤2中的免疫具体为：在蛋鸡年龄在15周龄时进行首次免疫，此后每隔2周免疫一次共5次，最后一次免疫时剂量加倍。
优选的，上述的HPV特异性抗体的制备方法中，所述步骤3中的水稀释法具体为：将鸡蛋卵黄与纯化水按照W/V＝1:9的比例混合，所述纯化水中预先加入PEG6000，使混合后PEG的质量终浓度为3％-10％，2-8℃静置8小时以上，最后取出清夜即得到初级提取液。
本发明的另一技术方案为提供一种抗HPV感染抗体的冻干制剂，包括如下重量份比的原料制备而成：聚乙二醇0.5-8份；甘露糖5-80份；海藻糖1-70份；蔗糖0.1-10份；甘氨酸0.1-5份；精氨酸0.1-5份；缓冲盐(PBS磷酸缓冲盐溶液)0.01-1份；还包括：上述所得HPV特异性抗体0.01-0.5mg/ml。
本发明的有益效果在于：本发明HPV特异性抗体Fab'片段酶解纯化后效价高，HPV特异性抗体Fab'片段经过与壳聚糖等其他大分子物质偶联获得在体内半衰期较长的活性抗体片段，而且具有较低的免疫原性，用于易感染HPV患者或宫颈癌患者的抗病毒感染的治疗或辅助治疗等；与预防性HPV疫苗相比较，具有作用时间短、起效快、不受到年龄段的限制等优点。在已感染HPV的人群中使用时具有防止交叉感染的作用，这一点是预防性HPV疫苗所不具备的。
附图说明
图1为本发明具体实施方式的HPV-16L1的竞争实验结果图；
图2为本发明具体实施方式的HPV-16L2的竞争实验结果图；
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：本发明HPV特异性抗体Fab'片段酶解纯化后效价高，HPV特异性抗体Fab'片段经过与壳聚糖等其他大分子物质偶联获得在体内半衰期较长的活性抗体片段，而且具有较低的免疫原性，用于易感染HPV患者或或宫颈癌患者的抗病毒感染的治疗或辅助治疗。
实施例1
一、一种抗HPV感染的特异性抗体(Fab'片段)的制备方法
1、基因克隆及蛋白的分离纯化
1.1通过NCBI/Genebank查询相关蛋白分子的基因序列，包括：HPV(低危型、高危型)L1、L2的全序列、硫酸肝素类蛋白多糖及弗林蛋白酶-furin，通过基因合成得到完整的基因序列。
其中：HPV type-16L1基因序列：(SEQ ID NO：1)。
HPV type-16L2基因序列：(SEQ ID NO：2)。
1.2将上述硫酸肝素类蛋白多糖、弗林蛋白酶-及HPV-16亚型的L1和L2通过基因合成后，再利用基因工程技术克隆到原核表达载体、真核表达载体(或具有SV40启动子和真核增强子，以及合适的报告基因如HRP、荧光蛋白等)上。基因工程步骤包括：根据基因序列设计PCR引物，引物两端加上适当的酶切位点，并且要求基因片段中不存在上述酶切位点，酶切位点位于表达载体上的MCS中；然后以cDNA母载体为模板进行PCR等相关操作，将目的基因通过基因克隆的手段连接到表达载体中，之后进行转化扩增和基因测序鉴定。
主要技术路线：cDNA制备——PCR——酶切连接——表达载体转化扩增——测序鉴定——表达载体大量制备——转化/储存(-80℃)。
1.3硫酸肝素类蛋白多糖受体、弗林蛋白酶及HPV-16衣壳蛋白的表达纯化
通过基因克隆技术将目的基因连接到原核或真核目的表达载体上，将目的表达载体转化到大肠杆菌、酵母菌或CHO细胞中，进行可溶性表达。然后通过亲和层析色谱技术对目的蛋白进行分离纯化，得到纯度在85％以上的目的蛋白，用于后续的免疫步骤。
2、HPV-16假病毒制备
2.1试剂耗材以及操作环境的准备
假病毒制备用的细胞株为239TT细胞，细胞培养过程中需要细胞培养基、培养皿、血清等试剂的购买；病毒衣壳蛋白基因和报告基因转入需要的试剂(脂质体转染相关试剂)；由于假病毒具有一定的感染性，所以需要在具有生物安全级别的实验室中完成病毒包装；以及后续收货病毒以及分离纯化的过程中需要用的超高速离心机；
2.2细胞培养与传代
在细胞获得后，首先将293TT进行传代以用于后续转染试验等，并且冻存一定量于液氮罐(-196℃)内长期储存。
2.3基因转染
首先将293TT细胞扩增培养，然后预先铺在24孔/12孔培养板中进行培养。待细胞的汇合率达到约40％时方可进行转染。转染用lipofectamine2000(invitrogen)相关试剂，按照说明书中的操作步骤完成转染。(可通过与荧光蛋白基因共转染，对转染效率进行预评估)。
2.4病毒收获
细胞转然后进行过夜培养，病毒衣壳蛋白L1或L1/L2在细胞内完成组装，从细胞内释放。然后通过裂解剂的加入使病毒子彻底释放，并经过处理使得假病毒子成熟。
2.5Optiprep梯度密度超高速离心分离纯化病毒子
初步裂解得到假病毒子后，制备optiprep的密度梯度(27％、33％、39％)，再加入适量病毒子，在234000x g、16℃的条件下离心3.5-4小时。然后用26号注射器吸出目的分离组分，并将假病毒子放入硅化试管内，用于检测/存于-80℃(病毒子感染效力下降10％/冻融一次)。
2.6HPV-16病毒子的感染能力的测定
该步骤测定包装后HPV-16假病毒子的感染效力，通过将含有的碱性磷酸酶基因的假病毒子梯度稀释转染293TT细胞，然后被转染的293TT细胞会表达碱性磷酸酶基因，再加入该酶的底物进行显色，依据吸光值计算病毒子的转染效力。
3、HPV type16与弗林蛋白酶的预处理
该步骤中使用弗林蛋白酶与一定滴度及纯度的HPV type16假病毒颗粒按照一定比例的进行混合。使其充分消化L2N端氨基酸，暴露出17-36的短肽。
为了制备HPV type16N端17-36短肽的抗原，还可以通过多肽合成技术获得。HPV type16N端17-36短肽为：QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV。
①多肽合成、纯化
通过固相合成法，进行合成，参照多肽合成相关标准protocol，再通过质谱仪、HPLC进行多肽纯度鉴定。
②多肽抗原的联合
由于小分子量肽段是不能激发机体免疫应答，所以需要将该肽段与相应不会引起免疫物种免疫反应的大分子蛋白质进行联合(鸡卵白蛋白、BSA等)。然后用联合后的分子作为免疫原。
3.1预处理
将纯化得到的弗林蛋白酶-furin，与一定滴度和纯度的HPV type16进行孵育，为了确保弗林蛋白酶的最合适的消化体系，需要对孵育时间进行确定。
3.2将反应后的混合液通过动物体内是感染试验。阴性组和实验组的实验动物均用弗林蛋白酶抑制剂处理(使未经弗林蛋白酶消化处理的病毒不能感染阴道黏膜层)，阴性对照为HPV-16PsV，实验组为HPV-16PsV&弗林蛋白酶混合液(实验组内根据不同的比例分为不同的实验小组)；阳性组的动物未经任何处理的小鼠，用HPV-16PsV进行感染。通过免疫组化对实验组和对照组进行检测，确定实验组中荧光强度最弱的的一组即为酶反应比例最适组。参考：Rhonda C.Kines,Cynthia D.Thompson,Douglas R.Lowy,John T.Schiller,and Patricia M.Day1The initial steps leading to papillomavirus infectionoccur on the basementmembrane prior to cell surface binding。
3.3确定最佳酶反应时间后，制备一定量的“HPV type16&弗林蛋白酶”反应物。将反应底物直接作为抗原免疫蛋鸡，产生具有对弗林蛋白酶、L2N端(17-36)短肽、L1的特异性抗性的多克隆抗体。
所用的抗原为HPV-16/18亚型的L1和L2(17-36肽段)。抗原制备可通过原核表达或假病毒制备获得假病毒制备参考https://home.ccr.cancer.gov/lco/pseudovirusproduction.htm。
4、抗体制备采用蛋鸡(海兰鸡)作为免疫动物。蛋鸡年龄在15周龄(一般蛋鸡19-21周时开始产蛋)时进行首次免疫，此后每隔2周免疫一次共5次，最后一次免疫时剂量加倍，当抗体的效价在加强免疫后第三次产蛋时达到最高，一般维持40天左右，所以在第一次加强免疫后每隔40-50天进行一次加强免疫。而免疫获得特异性的抗体会在鸡蛋卵黄中富集，产量可达200mg/蛋。
5、特异性抗体经过水稀释、PEG沉淀步骤，可去除大部分不可溶蛋白、卵磷脂等。其中水稀释法及将鸡蛋卵黄与纯化水按照W/V＝1:9的比例混合，其中纯化水中预先加入PEG6000，使混合后PEG的终浓度3％-10％。2-8℃静置8小时以上，最后取出清夜即得到特异性抗体放入初级提取液(纯度一般在25％-45％之间)。
6、将特异性抗体的初级提取液用DEAE-Sepharose 5Pw弱阴离子交换树脂进行分离纯化。经过一步加样，60％-80％的杂蛋白可以从直接从流穿中分离，特异性蛋白则被吸附到分离凝胶基质中，然后用含有0.1Mol/L-0.8Mol/L氯化钠的上样缓冲液(PBS)进行梯度洗脱，目的馏分会在5-10mins流出(d*h:10*7500mm规格的柱子，不同d*h，洗脱时间会有一定的差异。)。分离得到的特异性抗体的纯度在85％以上，可直接用于木瓜蛋白酶解步骤。
7、将分离得到目的蛋白进行浓缩，浓缩方法不限于：PEG包埋、50％-80％甘油透析、超滤浓缩等。是最终的浓缩液的蛋白含量在3-8mg/ml。
8、Fab’片段的酶解：木瓜蛋白酶使用浓度在0.005-0.1mg/ml之间，根据抗体的浓度徐泽合适的酶浓度，溶解于EDTA-消化缓冲液。消化时按照酶液：抗体液＝1:50的比例混合，然后至于37℃的环境中，2-3小时。完成消化后，用1Mol/L的磷酸氢二钠溶液调节pH至7.4左右。
9、将酶解产物用sephadexG-25/75进行分离，sephadex在分离前应用PBS平衡5-10倍柱体积，并且通过紫外检测器观测到基线达到平稳后再上样，上样体积为1/30的柱体积。
10、HPV特异性抗体的Fab'片段会在检测器探测到的第三或四个峰时流出，为了避免酶解不彻底产生的信号干扰，应在第二个峰时开始收集馏分，最后通过SDS-PAGE检测各馏分中的蛋白组分，以确定目的Fab'片段。确定目的Fab'后将馏分用超滤浓缩的方式进行浓缩使其浓度在2-5mg/ml之间，最为冻干制剂配料母液。
二、上述所得HPV特异性抗体(特异性Fab')效价测定
本发明采用竞争ELISA的方法来测定酶解后Fab'的中和效价，基本原理：将HPV-16/18的L1和L2(17-36短肽)分别铺板固定在聚苯乙烯板上(该检测体系中的L2 17-36短肽有氨基酸固相合成法获得，分离纯化后与BSA进行偶联)。
将分离得到的Fab'与未经酶解的鸡卵黄特异性抗体竞争结合聚苯乙烯板上的抗原，然后与联有HRP的鼠抗IgY(Fc)的二级抗体进行反应，然后同TMB显色，用OD450读取光度值。
根据竞争ELISA的原理，显色值越低说明Fab'的效价越高。实施步骤如下：
①铺板抗原：HPV-16L1蛋白通过原核表达获得，纯度在95％以上；HPV-16L2 17-36短肽有氨基端合成获得。
②铺板，用0.05Mol/L的碳酸盐缓冲液将分别将L1、L2抗原稀释只2ul/ml、10-50ul/ml，加入到酶标盘中，100ul/孔。37℃孵育2小时或4℃过夜(＞8小时)。
③洗板，拍干，备用，铺有L1和L2 17-36短肽的酶标板标记为V-1、V-2。
④准备已知抗L1或L2 17-36短肽效价在1:1000左右的未酶解的鸡卵黄抗体适量；
准备纯化后Fab'，用PBS调节浓度值0.5ug/ml。
⑤将未酶解的鸡卵黄抗体从起始50倍稀释开始以1/2为梯度做10个稀释度，每孔50ul分别加入V-1/2板中，其中阳性对照组加入100ul/孔。然后将调节好浓度的Fab'加入到实验组的检测槽中，50ul/孔。37℃孵育1小时。
⑥洗板，拍干。
⑦将二级抗体1:10000稀释(稀释液：PBS+0.25％tween-20+1％BSA)，然后100ul/孔加入到检测槽中。37℃孵育1小时。
⑧洗板，拍干。加入TMB显色，OD450读板，测定吸光值。
⑨结果用prism5.0处理如下：
如图1，HPV-16L1的竞争实验中：阳性组的EC50为1188，竞争实验组的EC50为249.9，可以看出酶解纯化后Fab'在0.1ug/ml时是未酶解鸡卵黄抗体(EC50为1186)的4.75倍。
如图2，HPV-16L2 17-36短肽的竞争实验中：阳性组的EC50为896.1，竞争实验组的EC50为177.4，可以看出酶解纯化后Fab'在0.1ug/ml时是未酶解鸡卵黄抗体(EC50为896.1)的5倍。
根据要求，可将Fab’与壳聚糖或聚乙二醇等大分子药用缓释载体进行偶联，延长在体内的半衰期。
实施例2
一种抗HPV感染抗体的冻干制剂的制备方法如下：将特异性Fab'与其他辅料混合灌装。按照下表1中的配比进行称量。
表1
原料名称 含量
特异性抗体Fab'片段 0.01-0.5mg/ml
聚乙二醇 0.5-8％
甘露糖 5-80％
海藻糖 1-70％
蔗糖 0.1-10％
甘氨酸 0.1-5％
精氨酸 0.1-5％
缓冲盐(PBS磷酸缓冲盐溶液) 0.01-1％
向配量罐内注入50％配料体积的纯化水，加入配方量的甘露糖、海藻糖、蔗糖。搅拌溶解后加入配料量的甘氨酸、精氨酸，再次搅拌溶解。称取配料量的磷酸盐在注入20％-30％与配料罐内溶解，待溶解完全后，一并注入到主配料罐内，混合均匀。然后加入配料量的特异性抗体Fab'片段。在加入抗体液前将配料罐体温度降至2-8℃，然后缓慢混匀。混匀后先用医用级活性炭过滤吸附溶液中的大颗粒杂质以及内毒素(热源)，再用0.2um的混合纤维素滤膜无菌过滤，最后在A级层流下灌装到安瓿瓶中。然后冷冻干燥，热封。
综上所述，本发明提供一种抗HPV感染的抗体(Fab')冻干制剂，该制剂为注射剂。制剂包括hpv特异性抗体的Fab'活性片段，偶联剂(壳聚糖、聚乙二醇)塑形剂(甘露糖、海藻糖和蔗糖)，稳定剂(精氨酸、甘氨酸等)及缓冲盐。该抗体(Fab')由多克隆抗体制备而来，可特异性与HPV-6/11/16/18/31/33的L1以及L2的17-36肽段有特异性的结合。能够阻断HPV在体内的感染进程，用于HPV感染患者治疗和宫颈癌患者的辅助治疗。与预防性HPV疫苗相比较，具有作用时间短、起效快、不受到年龄段的限制等优点。在已感染HPV的人群中使用时具有防止交叉感染的作用，这一点是预防性HPV疫苗所不具备的。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (4)

1.一种HPV特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)特异性抗原制备，所述抗原包括HPV-16/18亚型的L1和L2的17-36肽段、受体蛋白和协助蛋白酶；
2)抗体制备：采用蛋鸡作为免疫动物使用步骤1)抗原进行免疫，得含有特异性抗体的鸡蛋卵黄；
3)步骤2)所得鸡蛋卵黄经过水稀释、PEG沉淀步骤得初级提取液；
4)将初级提取液用DEAE-Sepharose 5Pw弱阴离子交换树脂进行分离纯化得次级提取液，所述次级提取液的特异性抗体的纯度大于85％；
5)将分离得到目的蛋白进行浓缩，所述浓缩为PEG包埋、50％-80％甘油透析或超滤浓缩，得浓缩液，所述浓缩液蛋白含量为3-8mg/ml；
6)将步骤5)所得浓缩液用木瓜蛋白酶的酶液酶解，所述酶液总木瓜蛋白酶的浓度为0.005-0.1mg/ml，溶剂为EDTA-消化缓冲液，酶解时按照酶液：所述浓缩液＝1:50的比例混合，然后至于37℃的环境中，酶解2-3小时，用1Mol/L的磷酸氢二钠溶液调节pH至7.4；
7)将步骤6)所得酶解产物用sephadexG-25/75进行分离，sephadex在分离前应用PBS平衡5-10倍柱体积，并且通过紫外检测器观测到基线达到平稳后再上样，上样体积为1/30的柱体积；特异性抗体会在紫外检测器探测到的第三或四个峰时流出，为了避免酶解不彻底产生的信号干扰，应在第二个峰时开始收集馏分，最后通过SDS-PAGE检测各馏分中的蛋白组分，以确定目的片段，确定目的片段后，将馏分用超滤浓缩的方式进行浓缩使其浓度在2-5mg/ml之间，所得为特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的HPV特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤2中免疫具体为：在蛋鸡年龄在15周龄时进行首次免疫，此后每隔2周免疫一次共5次，最后一次免疫时剂量加倍。
3.根据权利要求1所述的HPV特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的水稀释法具体为：将鸡蛋卵黄与纯化水按照W/V＝1:9的比例混合，所述纯化水中预先加入PEG6000，使混合后PEG的质量终浓度为3％-10％，2-8℃静置8小时以上，最后取出清夜即得到初级提取液。
4.一种HPV特异性抗体的冻干制剂，其特征在于，包括如下重量份比的原料制备而成：聚乙二醇0.5-8份；甘露糖5-80份；海藻糖1-70份；蔗糖0.1-10份；甘氨酸0.1-5份；精氨酸0.1-5份；磷酸缓冲盐溶液0.01-1份；还包括：权利要求1所得HPV特异性抗体0.01-0.5mg/ml。
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