CN113896788B - 抗sar-cov-2（covid-19）全人源单克隆抗体及其制法与应用 - Google Patents

抗sar-cov-2（covid-19）全人源单克隆抗体及其制法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗SAR‑COV‑2抗体或其抗原结合片段及其应用，具体公开了，其具有SEQ ID No：1‑3所示的重链互补决定区，以及SEQ ID No：4‑6所示的轻链互补决定区。本发明的抗体为人源化抗体，其副作用低，亲和力和特异性高。

Description

抗SAR-COV-2(COVID-19)全人源单克隆抗体及其制法与应用
技术领域
本发明属于免疫学领域，具体地涉及抗SAR-COV-2(COVID-19)全人源单克隆抗体及其制法与应用。
背景技术
在2018年全球十大畅销药中，有8个是全人源或人源化单克隆抗体药物。排名第一的是艾伯维公司治疗关节炎的抗TNFa单克隆抗体Humira，这是一个全人源单克隆抗体，已经是连续6年销售额100亿以上的药王。从1986年第一个单克隆抗体药物上市开始，单抗药物经历了鼠源单抗药物(如Orthoclone OKT3)、嵌合单抗药物(Rituximab)、人源化单抗药物(Herceptin)和全人源单抗药物(Humira)等阶段。由于人体出现抗鼠抗体反应(HAMA)，鼠源单抗药物、嵌合单抗药物已经逐渐被淘汰，目前占据市场的单克隆抗体药物全都是人源化单克隆抗体药物。与国际先进的人源抗体生产技术相比，深圳乃至全中国都有很大差距，主要表现在人源抗体药物领域的创新能力薄弱，自主研发的品种少，目前还没有原创人源化单克隆抗体药物上市的报道，庞大的抗体药物市场被国外药企占领。我国要改变落后局面，争夺消费潜力巨大的国内外抗体药物市场，亟需攻克全人源单克隆抗体技术。
人源单克隆抗体在治疗炎症、癌症、流行性感冒特别是冠状病毒等方面具有高特异性的显著疗效。COVID-19是由一种SAR-COV-2冠状病毒引起的急性呼吸道传染病，至今仍然缺乏有效的药物和疫苗。新冠状病毒在入侵细胞时需要依赖病毒自身表达的特定分子与人细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。中和病毒的人源抗体是人B淋巴细胞产生的某些特异抗体，能够与病毒表面的抗原结合，从而阻止该病毒黏附靶细胞受体，防止病毒侵入细胞，能够高效防治SAR-COV-2流行性感冒。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种抗SAR-COV-2的抗体或其抗原结合片段，其特异性中和SAR-COV-2。
为解决上述问题，本发明提供一种抗SAR-COV-2的抗体或其抗原结合片段，其特异性中和SAR-COV-2。
本发明一方面提供一种分离的抗SAR-COV-2的抗体或其抗原结合片段；其具有如下任一组的三个重链可变区的互补决定区(HCDR)和三个轻链可变区的互补决定区(LCDR)：
HCDR1：GFTFNNYV SEQ ID No：1；
HCDR2：ISYDGSVK SEQ ID No：2；
HCDR3：AKPHVLFWLGEGKGPFDY SEQ ID No：3；
LCDR1：QGISSY SEQ ID No：4；
LCDR2：AAS SEQ ID No：5；
LCDR3：QQLNSYPLT SEQ ID No：6。
本发明另一个方面提供了一种分离的抗SAR-COV-2的抗体或其抗原结合片段，其具有如下所示的重链可变区和轻链可变区；
重链可变区：
QVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFNNYVMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSVKYYADSVKGRFTISRDHSKNTLYLHMNSLRPEDTAVYYCAKPHVLFWLGEGKGPFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID No：7
轻链可变区：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGPGTRVDIKR SEQ ID No：8。
在本发明的技术方案中，所述的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体，更优选为全人源化抗体。
在本发明的技术方案中，所述的抗体或其抗原结合片段特异性结合SAR-COV-2表面S蛋白。
在本发明的技术方案中，所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，优选为单克隆抗体。
在本发明的技术方案中，所述的抗体或其抗原结合片段特异性结合SAR-COV-2表面S蛋白。
本发明再一个方面提供了一种核苷酸序列，其编码如前述的抗体或其抗原结合片段。
本发明再一个方面提供了一种载体，包含前述的核苷酸序列。
本发明再一个方面提供了一种宿主细胞，包含前述载体或载体组，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。
本发明再一个方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含如前述的抗体或其抗原结合片段。
本发明再一个方面提供了一种检测试剂，所述检测试剂包含如前述的抗体或其抗原结合片段。
本发明再一个方面提供了上述抗体或其抗原结合片段作为检测试剂的用途，所述试剂用于以下用途的试剂：酶联免疫吸附检测(ELISA)、免疫印迹(Western Blot)、流式细胞术(FACS)、免疫组织化学(IHC)检测或者免疫PCR。
在上述在免疫学检测中，抗体或其抗原结合片段可单独或与通过化学键偶联，静电吸附或者亲疏水性吸附，而连接缀合物包括辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)，生物素(Biotin)，异硫氰酸荧光素(FITC)，Cy3、Cy5、磁珠和琼脂糖等缀合物连接。
在本发明的技术方案中，检测试剂可用于非诊断或治疗目的检测。
本发明再一个方面提供了一种药物组合物，其如前所述的分离的抗体或其抗原结合片段和药物上可接受辅料。
在本发明的技术方案中，其中所述抗体或其抗原结合片段阻断或降低SAR-COV-2的S蛋白与受试者的细胞表面受体结合，所述细胞表面受体优选为细胞血管紧张素转化酶相关性羧肽酶(ACE2)。
本发明再一个方面提供了一种抗SAR-COV-2的抗体或其抗原结合片段在制备预防、治疗或缓解SAR-COV-2感染的至少一种症状或适应症的药物中的用途。
在本发明的技术方案中，所述的药物为口服或注射制剂。
本发明再一个方面提供了一种预防、治疗或缓解SAR-COV-2感染的至少一种症状或适应症的方法，所述方法包括将前述任一项的抗体或其抗原结合片段或前述药物组合物施用于受试者。
在本发明的技术方案中，其中所述至少一种症状或适应症选自下组：肺部炎症、肺泡损伤、发热、咳嗽、呼吸困难、低血氧症、急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、凝血功能障碍、代谢性酸中毒、鼻塞、流涕、咽痛、腹泻、器官衰竭、败血性休克和死亡。
在本发明的技术方案中，其中所述药物组合物或所述抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂组合施用。其中所述第二治疗剂选自下组：抗炎症药物(如皮质类固醇和非甾体抗炎症药物)、抗病毒药物、针对SAR-COV-2的S蛋白的不同的抗体、对于SAR-COV-2的疫苗、抗生素、膳食补充剂如抗氧化剂和治疗SAR-COV-2感染的任何其他姑息疗法、缓解上述症状或适应症的药物。
在本发明的技术方案中，其中所述药物组合物或所述抗体或其抗原结合片段通过皮下、静脉内、皮内、腹膜内、口服、肌内或颅内施用。
有益效果
(1)本发明所述抗SAR-COV-2抗体可以靶向结合SAR-COV-2病毒的S蛋白，特异性高，能有效阻断SAR-COV-2病毒表面S蛋白与受试者细胞表面受体的结合。
(2)相比鼠源抗体，本发明全人源抗体的基因完全来源于人的基因，没有其他种属的成分，在人体内不发生抗鼠抗抗体等毒副作用，具有更好的生物相容性，更适合和更有潜力成为治疗流感病毒的大分子药物。
(3)相较于现有技术提供的噬菌体展示技术制备抗SAR-COV-2病毒人源单克隆抗体的方法，本发明采用的单个B细胞开发抗SAR-COV-2病毒的抗体具有操作简单快捷，生产的人源抗体具有高亲和力和特异性等优点。
附图说明
图1为实施例1NTH-3T3表达CD40L的流式检测结果图。
图2为实施例1流式细胞仪分选记忆B细胞结果图。
图3为实施例1ELISA实验结果图。
图4为重链可变区与轻链可变区的氨基酸和核苷酸序列示意图。
具体实施方式
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
如本文所用，术语“抗体”是指包含至少一个抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点免疫特异性地结合至特定的目标抗原靶标。因此，术语“抗体”包括但不限于全长抗体和/或其变体，其片段，肽体及其变体，单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两个完整的抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体和模拟抗体的结构和/或功能的抗体模拟物或其指定片段或部分，包括单链抗体及其片段。抗体与靶标的结合可引起多种作用，例如但不限于这种结合在体外、原位和/或体内调节、减少、增加、拮抗、激动、减轻、减缓、阻断、抑制、消除和/或干扰至少一种靶标活性或结合，或受体活性或结合。因此，本公开的抗体涵盖能够结合生物分子(例如抗原或受体)或其部分的抗体片段，包括但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、pFc'、Fd、单结构域抗体(sdAb)、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)或二硫化物连接的Fv(sdFv)；双功能抗体或二价双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指得自一群基本上同种的抗体的抗体，即除了可能存在少量可能天然发生的突变之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点还在于其可以未污染其它抗体而合成。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
如本文所用，术语HCDR与重链互补决定区含义相同，LCDR与轻链互补决定区含义相同。
如本文所用，单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链剩余的与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，且这些抗体的片段，表现出所需的生物活性。
如本文所用，术语“SAR-COV-2”也称作“新型冠状病毒”，指新发生的引起新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的病毒。
如本文所用，S蛋白指冠状病毒上的刺突蛋白(Spike protein)，SARS-CoV-2通过病毒表面的刺突蛋白识别人体内细胞表面的ACE2并侵染宿主细胞。通过阻断冠状病毒SARS-CoV-2表面的S蛋白可以有效抑制病毒黏附靶细胞受体，防止病毒侵入细胞。
如本文使用的术语"人源化抗体"包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人人源化抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如由随机或体外位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
如本文使用的术语抗"抗原结合片段"等包括任何天然存在的、酶学可获得的、合成的或基因工程的特异性结合抗原以形成复合物的多肽或糖蛋白。如本文使用的术语抗体的"抗原结合片段"与SAR-COV-2的S蛋白具有结合能力的一个或多个片段。
一方面，本发明提供抗SAR-COV-2全人源单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合SAR-COV-2的生物活性片段，其中，该抗体的重轻链CDR1、CDR2及CDR3区的氨基酸序列分别如下所示：
重链CDR1区：GFTFNNYV SEQ ID No：1；
重链CDR2区：ISYDGSVK SEQ ID No：2；
重链CDR3区：AKPHVLFWLGEGKGPFDY SEQ ID No：3；
轻链CDR1区：QGISSY SEQ ID No：4；
轻链CDR2区：AAS SEQ ID No：5；
轻链CDR3区：QQLNSYPLT SEQ ID No：6。
在一些实施方式中，该抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；
QVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFNNYVMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSVKYYADSVKGRFTISRDHSKNTLYLHMNSLRPEDTAVYYCAKPHVLFWLGEGKGPFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID No：7
和/或
该抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGPGTRVDIKR SEQ ID No：8。
在一些实施方式中，该抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；和/或
该抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
经ELISA实验验证，本发明所述抗SAR-COV-2全人源单克隆抗体可以靶向结合SAR-COV-2病毒的S蛋白。本发明所述抗体为全人源性单克隆抗体，相比鼠源抗体，全人源抗体的基因完全来源于人的基因，没有其他种属的成分，在人体内不发生抗鼠抗抗体等毒副作用，具有更好的生物相容性，更适合和更有潜力成为治疗流感病毒的大分子药物。
另一方面，本发明提供编码本发明所述的抗SAR-COV-2全人源单克隆抗体的基因。在一些实施方式中，所述基因包含编码具有上述所示的氨基酸的核苷酸序列。
在一些具体实施方式中，，该核苷酸序列如下所示(以下序列仅为示例性，本领域技术人员根据具体的氨基酸序列，可以设计其他可以翻译为所需氨基酸序列的核苷酸序列)：
编码重链可变区的核苷酸序列为：
CaggtgcagctgGtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggacgtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcaacaactatgtcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtgttaaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagaccattctaagaacacgctgtatctgcacatgaacagcctgagacctgaggacacggctgtttattactgtgcgaaaccacacgtattattttggctcggggaggggaaagggccctttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcg；SEQ ID No：9
编码轻链可变区的核苷酸序列为：
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggaGaCagagtcaccatcacttgccgggccagtcagggcattagcagttatttagcctggtatcagcaaaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccactttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacaacttaatagttacccccttactttcggccctgggaccagagtggatatcaaacga SEQ ID No：10
本发明抗体的重链可变区和轻链可变区序列示意图见图4，其中灰色框中的显示的是CDR区。
另一方面，本发明提供含如上所述基因的载体。
再一方面，本发明提供含如上所述基因或如上所述载体的细胞。
再一方面，本发明提供一种产生所述抗SAR-COV-2全人源单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合SAR-COV-2的生物活性片段的方法，该方法包括培养含编码抗SAR-COV-2全人源单克隆抗体的重轻链的上述基因或上述载体的基因工程细胞或直接培养上述细胞，收集，纯化得所述抗SAR-COV-2全人源单克隆抗体。
现有技术中存在采用噬菌体展示技术制备抗SAR-COV-2病毒人源单克隆抗体的方法，尽管该方法具有生产成本低、不经过免疫和细胞融合等繁琐工作的优点，但是其缺点也比较明显，从非免疫抗体库中获得的抗体往往亲和力不足、受外源基因转化率的限制、抗体库的库容量不足以涵盖动物的抗体多样性等。本发明从病人的血液中分离分泌功能抗体的B细胞，然后提取RNA和合成cDNA，从中克隆分泌目的抗体的基因，最后重组和表达全人源单克隆抗体。该技术操作简单快捷，生产的人源抗体具有高亲和力和特异性，此外，可进一步采用改进的从记忆B细胞中分离具有中和病毒功能或杀伤肿瘤功能的本发明所述单克隆抗体技术，更是大大减少了繁琐操作和成本。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明所述的抗SAR-COV-2全人源单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合SAR-COV-2的生物活性片段。
另一方面，本发明提供所述的抗SAR-COV-2全人源单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合SAR-COV-2的生物活性片段或所述的药物组合物在制备用于治疗由SAR-COV-2病毒引起的疾病的药物中的应用。
另一方面，本发明提供一种检测SAR-COV-2病毒水平的试剂盒，其含有本发明所述的抗SAR-COV-2全人源单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合SAR-COV-2的生物活性片段；在一些实施方式中，所述的试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物，以及缓冲液；所述第二抗体例如为抗本发明所述单克隆抗体的抗抗体。
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1
(1)构建稳定表达CD40L的NTH-3T3细胞系(3T3-CD40L)
利用慢病毒建立3T3-CD40L饲养细胞。构建慢病毒表达载体pLVX-CD40L，转染293T细胞，转染第四天收集病毒上清液。活化NIH-3T3细胞，培养3代后用慢病毒感染，继续培养并传代3次。利用流式细胞仪进行分选FITC荧光强度在MFI附近的细胞，重新加入至培养瓶中，37℃，5％CO2培养箱中培养和检测，检测结果如图1所示，其是将表达CD40L的3T3细胞和空载体pLVX(带有ZxGreen)转染的3T3细胞分别用带有APC的抗CD40L染色，然后上流式细胞仪分析。结果发现，所有3T3-CD40L饲养细胞都表达CD40L。当细胞长到80％～90％时，消化收集细胞，浓度为每毫升1×107细胞。置于辐射仪中进行5000rads辐射，冻存液重悬细胞，浓度为每毫升3.5×107细胞，分装1ml在冷冻小管，液氮冻存(可以保存2年)。
(2)记忆B细胞的分选和活化
用淋巴分离液分离和冻存曾经感染SAR-COV-2病毒的康复病人的PBMC，每管10～50×106细胞，冻存在液氮罐中。配制PBMC流式染色液，其成分如下表1所示
表1 PBMC流式染色液
抗体 体积(μL)
CD19-PE-Cy7 0.5
IgM-PE 1.0
IgA-APC 2.5
IgD-FITC 2.5
PBS-1％(wt/vol)BSA 43.5
解冻PBMC，加入上述PBMC流式染色液并在流式细胞仪上分选，结果如图2所示，分选出CD19+IgM–IgA–IgD–的记忆B细胞，细胞纯度需在90％以上，若低于90％，重复分选过程。配制激活B细胞的混合培养基，如下表2所示：
表2
Figure BDA0002550947970000081
Figure BDA0002550947970000091
将记忆B细胞加入到混合培养基中，混匀后有限稀释在384孔板，每孔1个细胞，体积为50μl，置于37℃，5％CO2培养箱中静置培养。13天后，取上清液进行ELISA，获得人源单克隆抗体。
(3)人源单克隆抗体结合SAR-COV-2病毒的表面抗原S蛋白实验
表面抗原S蛋白购自义翘神州公司，具有免疫原性，抗S蛋白抗体可以SAR-COV-2流感病毒。对上述获得的上清液人源单克隆抗体进行ELISA实验，具体地：
(1)将100ng/100μl的SAR-COV-2病毒的HA蛋白包被在96孔酶标板中，每孔100μl；
(2)放置4℃冰箱过夜；
(3)用PBST溶液洗涤三遍，每孔加5％的脱脂奶粉溶液200μl，37℃孵育1小时；
(4)用PBST溶液洗涤三遍，加100μl没有感染病毒的正常人血清(阴性对照)或上清液，各三个重复；
(5)37℃孵育1小时后用PBST溶液洗涤三遍；
(6)以1:5000稀释带HRP的抗人IgG抗体(abcam)，加入酶标版中，每孔100μl；
(7)37℃孵育1小时后用PBST溶液洗涤三遍；
(8)每孔加100μl TMB底物溶液(Thermo Scientific)，37℃5分钟；
(9)每孔加终止溶液2M硫酸100μl，立刻在酶标仪中450nm波长检测吸光值。其结果如图3所示，ELISA实验表明本发明获得的人源单克隆抗体可以靶向结合SAR-COV-2病毒的S蛋白。
实施例2人源化单克隆抗体基因的克隆
将实施例1获得的能够分泌结合SAR-COV-2病毒的抗体的B细胞进行裂解，取裂解液进行RNA的反转录，获得人源抗体基因的PCR模板cDNA。设计和合成克隆抗体基因的引物，以cDNA为模板克隆抗体的重链和轻链的基因，并且送金唯智公司测序。具体地：
(1)将裂解后的B细胞液转移至96孔板(Eppendorf，030133366)。
(2)反转录体系：150ng随机引物(invitrogen,48190-011),0.5μl 10mM dNTP(Invitrogen,18427-088),1μl 0.1M DTT(Invitrogen,18080-044),0.5％v/v Igepal CA-630(Sigma,I3021-50ML),4U RNAsin(Promega),6U Prime RNAse Inhibitor(Eppendorf)and 50U
Figure BDA0002550947970000092
III reverse transcriptase(Invitrogen,18080-044)，补DEPC水至14μl/well。
(3)反转录反应程序：42℃，10min；25℃，10min；50℃，60min；94℃，5min。
(4)cDNA保存在-20℃。
(5)引物的设计和合成:
正向引物5′-3′序列(Forward Primer 5′-3′sequence)
重链可变区PCR引物:
5′VH1 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAG(SEQ ID NO:11)
5′VH1/5 CTGCAACCGGTGTACATTCCGAGGTGCAGCTGGTGCAG(SEQ ID NO:12)
5′VH3 CTGCAACCGGTGTACATTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAG(SEQ ID NO:13)
5′VH3-23 CTGCAACCGGTGTACATTCTGAGGTGCAGCTGTTGGAG(SEQ ID NO:14)
5′VH4 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAG(SEQ ID NO:15)
5′VH 4-34CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTG(SEQ ID NO:16)
5′VH 1-18 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTTCAGCTGGTGCAG(SEQ ID NO:17)
5′VH 1-24 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTCCAGCTGGTACAG(SEQ ID NO:18)
5′VH3-33 CTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAG(SEQ ID NO:19)
5′VH 3-9 CTGCAACCGGTGTACATTCTGAAGTGCAGCTGGTGGAG(SEQ ID NO:20)
5′VH4-39 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAG(SEQ ID NO:21)
5′VH 6-1 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTACAGCTGCAGCAG(SEQ ID NO:22)
3′JH 1/2/4/5 TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG(SEQ ID NO:23)
3′JH 3 TGCGAAGTCGACGCTGAAGAGACGGTGACCATTG(SEQ ID NO:24)
3′JH 6 TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCGTG(SEQ ID NO:25)
κ轻链可变区PCR产物
5′Vκ1-5 CTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCCAGATGACCCAGTC(SEQ ID NO:26)
5′Vκ1-9 TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGACATCCAGTTGACCC AGTCT(SEQ ID NO:27)
5′Vκ1D-43 CTGCAACCGGTGTACATTGTGCCATCCGGATGACCCAGTC(SEQ ID NO:28)
5′Vκ2-24 CTGCAACCGGTGTACATGGGGATATTGTGATGACCCAGAC(SEQ ID NO:29)
5′Vκ2-28 CTGCAACCGGTGTACATGGGGATATTGTGATGACTCAGTC(SEQ ID NO:30)
5′Vκ2-30 CTGCAACCGGTGTACATGGGGATGTTGTGATGACTCAGTC(SEQ ID NO:31)
5′Vκ3-11 TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATTGTGTTGACAC AGTC(SEQ ID NO:32)
5′Vκ3-15 CTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATAGTGATGACGCAGTC(SEQ ID NO:33)
5′Vκ3-20 TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATTGTGTTGACG CAGTCT(SEQ ID NO:34)
5′Vκ4-1 CTGCAACCGGTGTACATTCGGACATCGTGATGACCCAGTC(SEQ ID NO:35)
3′Jκ1/4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC(SEQ ID NO:36)
3′Jκ2 GCCACCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTC(SEQ ID NO:37)
3′Jκ3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTC(SEQ ID NO:38)
3′Jκ5 GCCACCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTC(SEQ ID NO:39)
(6)用KOD-Plus-Neo(TOYOBO，KOD401)试剂盒PCR分别扩增抗体基因的重链和轻链，40μL体系：3.5μL cDNA，20nM混合引物，4μL缓冲液(buffer)，4μL 2mM dNTPs，2.4μLMgSO4，1μL KOD。
(7)反应程序：94℃，2min；45个循环：98℃,10s；58℃,30s；68℃,28s。
(8)对扩增产物进行琼脂糖凝胶，结果发现，抗体轻链为，大小为，重链大小是。
(9)抗体基因重链可变区PCR产物测序结果如SEQ ID No:9所示序列：
SEQ ID No:9
CaggtgcagctgGtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggacgtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcaacaactatgtcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtgttaaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagaccattctaagaacacgctgtatctgcacatgaacagcctgagacctgaggacacggctgtttattactgtgcgaaaccacacgtattattttggctcggggaggggaaagggccctttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcg
抗体基因重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No:7所示序列
SEQ ID No:7
QVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFNNYVMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSVKYYADSVKGRFTISRDHSKNTLYLHMNSLRPEDTAVYYCAKPHVLFWLGEGKGPFDYWGQGTLVTVSS
抗体基因轻链可变区PCR产物测序结果如SEQ ID No:10所示序列，
SEQ ID No:10
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggaGaCagagtcaccatcacttgccgggccagtcagggcattagcagttatttagcctggtatcagcaaaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccactttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacaacttaatagttacccccttactttcggccctgggaccagagtggatatcaaacga
抗体基因轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示序列；
SEQ ID No:8
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGPGTRVDIKR
对应地，其CDR区序列如下所示：
HCDR1：GFTFNNYV SEQ ID No：1；
HCDR2：ISYDGSVK SEQ ID No：2；
HCDR3：AKPHVLFWLGEGKGPFDY SEQ ID No：3；
LCDR1：QGISSY SEQ ID No：4；
LCDR:2：AAS SEQ ID No：5；
LCDR3：QQLNSYPLT SEQ ID No：6
上述结果显示上清液中含有能够结合SAR-COV-2病毒的抗体。
最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 抗SAR-COV-2（COVID-19）全人源单克隆抗体及其制法与应用
<130> CP120010400C
<160> 39
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 重链CDR1区
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Val
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 重链CDR2区
<400> 2
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Val Lys
1 5
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 重链CDR3区
<400> 3
Ala Lys Pro His Val Leu Phe Trp Leu Gly Glu Gly Lys Gly Pro Phe
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 轻链CDR1区
<400> 4
Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 轻链CDR2区
<400> 5
Ala Ala Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 轻链CDR3区
<400> 6
Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 125
<212> PRT
<213> 重链可变区氨基酸序列
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Val Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp His Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu His Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro His Val Leu Phe Trp Leu Gly Glu Gly Lys Gly Pro Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 轻链可变区氨基酸序列
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Val Asp Ile Lys Arg
100 105
<210> 9
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggacgtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcaac aactatgtca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtgt taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagacc attctaagaa cacgctgtat 240
ctgcacatga acagcctgag acctgaggac acggctgttt attactgtgc gaaaccacac 300
gtattatttt ggctcgggga ggggaaaggg ccctttgact actggggcca gggaaccctg 360
gtcaccgtct cctcg 375
<210> 10
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gggcattagc agttatttag cctggtatca gcaaaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacaa cttaatagtt acccccttac tttcggccct 300
gggaccagag tggatatcaa acga 324
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctgcaaccgg tgtacattcc caggtgcagc tggtgcag 38
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctgcaaccgg tgtacattcc gaggtgcagc tggtgcag 38
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctgcaaccgg tgtacattct gaggtgcagc tggtggag 38
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctgcaaccgg tgtacattct gaggtgcagc tgttggag 38
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ctgcaaccgg tgtacattcc caggtgcagc tgcaggag 38
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ctgcaaccgg tgtacattcc caggtgcagc tacagcagtg 40
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ctgcaaccgg tgtacattcc caggttcagc tggtgcag 38
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ctgcaaccgg tgtacattcc caggtccagc tggtacag 38
<210> 19
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ctgcaaccgg tgtacattct caggtgcagc tggtggag 38
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ctgcaaccgg tgtacattct gaagtgcagc tggtggag 38
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ctgcaaccgg tgtacattcc cagctgcagc tgcaggag 38
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ctgcaaccgg tgtacattcc caggtacagc tgcagcag 38
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tgcgaagtcg acgctgagga gacggtgacc ag 32
<210> 24
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tgcgaagtcg acgctgaaga gacggtgacc attg 34
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tgcgaagtcg acgctgagga gacggtgacc gtg 33
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ctgcaaccgg tgtacattct gacatccaga tgacccagtc 40
<210> 27
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ttgtgctgca accggtgtac attcagacat ccagttgacc c 41
<210> 28
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ttgtgctgca accggtgtac attcagacat ccagttgacc cagtct 46
<210> 29
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ctgcaaccgg tgtacatggg gatattgtga tgacccagac 40
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ctgcaaccgg tgtacatggg gatattgtga tgactcagtc 40
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ctgcaaccgg tgtacatggg gatgttgtga tgactcagtc 40
<210> 32
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ttgtgctgca accggtgtac attcagaaat tgtgttgaca cagtc 45
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ctgcaaccgg tgtacattca gaaatagtga tgacgcagtc 40
<210> 34
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ttgtgctgca accggtgtac attcagaaat tgtgttgacg cagtct 46
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
ctgcaaccgg tgtacattcg gacatcgtga tgacccagtc 40
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gccaccgtac gtttgatytc caccttggtc 30
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gccaccgtac gtttgatctc cagcttggtc 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gccaccgtac gtttgatatc cactttggtc 30
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gccaccgtac gtttaatctc cagtcgtgtc 30

Claims (13)

1.一种分离的抗SAR-COV-2的抗体或其抗原结合片段，其具有三个重链互补决定区(HCDR)和三个轻链互补决定区(LCDR)：
HCDR1：GFTFNNYV SEQ ID No：1；
HCDR2：ISYDGSVK SEQ ID No：2；
HCDR3：AKPHVLFWLGEGKGPFDY SEQ ID No：3；
LCDR1：QGISSY SEQ ID No：4；
LCDR2：AAS SEQ ID No：5；和
LCDR3：QQLNSYPLT SEQ ID No：6。
2.根据权利要求1所述的分离的抗SAR-COV-2的抗体或其抗原结合片段，其具有如下所示的重链可变区和轻链可变区；
重链可变区：
QVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFNNYVMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSVKY YADSVKGRFTISRDHSKNTLYLHMNSLRPEDTAVYYCAKPHVLFWLGEGKGPFDYWGQGT LVTVSS SEQ ID No：7
轻链可变区：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGPGTRVDIKR SEQ ID No：8。
3.根据权利要求1或权利要求2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述的抗体或其抗原结合片段为人源化的抗体或其抗原结合片段。
4.一种核苷酸，其特征在于：其编码如权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
5.一种载体，其特征在于：包含权利要求4所述的核苷酸序列。
6.一种宿主细胞，其特征在于：包含权利要求5所述载体。
7.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
8.一种检测试剂，所述检测试剂包含如权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
9.如权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备检测试剂的用途，所述试剂用于以下用途的试剂：酶联免疫吸附检测、免疫印迹、流式细胞术、免疫组织化学检测或者免疫PCR。
10.一种药物组合物，其如权利要求1-3任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段和药物上可接受辅料。
11.权利要求1-3任一项所述的抗SAR-COV-2的抗体或其抗原结合片段或权利要求10所述的药物组合物在制备预防、治疗或缓解SAR-COV-2感染的至少一种症状或适应症的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，所述至少一种症状或适应症选自下组：新型冠状病毒肺炎、肺泡损伤、发热、咳嗽、呼吸困难、低血氧症、急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、凝血功能障碍、代谢性酸中毒、鼻塞、流涕、咽痛、腹泻、器官衰竭、败血性休克。
13.根据权利要求11所述的用途，所述症状或适应症为肺部炎症。
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