CN107337732B

CN107337732B - 抗h7n9全人源单克隆抗体2j17及其制法与应用

Info

Publication number: CN107337732B
Application number: CN201610288358.8A
Authority: CN
Inventors: 万晓春; 李俊鑫; 刘绿艳
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2016-05-03
Filing date: 2016-05-03
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2036-05-03
Also published as: CN107337732A

Abstract

本发明涉及抗H7N9全人源单克隆抗体2J17及其制法与应用，该抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；和/或该抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明所述抗体2J17可靶向结合H7N9病毒的血凝素HA；相比鼠源抗体，全人源抗体的基因完全来源于人的基因，没有其他种属的成分，在人体内不发生抗鼠抗抗体等毒副作用，具有更好的生物相容性，更适合和更有潜力成为治疗流感病毒的大分子药物。

Description

抗H7N9全人源单克隆抗体2J17及其制法与应用

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体地涉及抗H7N9全人源单克隆抗体2J17及其制法与应用。

背景技术

在2015年全球十大畅销药中，有6个是全人源或人源化单克隆抗体药物。排名第一的是艾伯维公司治疗关节炎的抗TNFa单克隆抗体Humira，这是一个全人源单克隆抗体，已经是连续3年销售额100亿以上的药王。从1986年第一个单克隆抗体药物上市开始，单抗药物经历了鼠源单抗药物(如Orthoclone OKT3)、嵌合单抗药物(Rituximab)、人源化单抗药物(Herceptin)和全人源单抗药物(Humira)等阶段。由于人体出现抗鼠抗体反应(HAMA)，鼠源单抗药物、嵌合单抗药物已经逐渐被淘汰，目前占据市场的单克隆抗体药物全都是人源化单克隆抗体药物。与国际先进的人源抗体生产技术相比，深圳乃至全中国都有很大差距，主要表现在人源抗体药物领域的创新能力薄弱，自主研发的品种少，目前还没有原创人源化单克隆抗体药物上市的报道，庞大的抗体药物市场被国外药企占领。我国要改变落后局面，争夺消费潜力巨大的国内外抗体药物市场，亟需攻克人源化单克隆抗体技术。

人源单克隆抗体在治疗炎症、癌症特别是流行性感冒方面具有高特异性的显著疗效。流行性感冒是由流感病毒引起的传染性疾病，严重威胁人类健康。全球每年约有10亿人受季节性流感病毒感染，其中有25-50万人死亡。H7N9病毒是一种流感病毒，对传统的抗病毒药amantadine和rimantadine有耐药性，目前尚没有有效治疗手段。H7N9病毒在入侵细胞时需要依赖病毒自身表达的特定分子与人细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。中和病毒的人源抗体是人B淋巴细胞产生的某些特异抗体，能够与病毒表面的抗原结合，从而阻止该病毒黏附靶细胞受体，防止病毒侵入细胞，能够高效防治H7N9流行性感冒。因此，提供一种抗H7N9全人源单克隆抗体及其制法是本领域亟待解决的技术问题之一。

发明内容

本发明的目的之一在于提供抗H7N9全人源单克隆抗体2J17或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段。

本发明的另一目的在于提供编码所述抗H7N9全人源单克隆抗体2J17或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段的基因及含该基因的载体或细胞。

本发明的另一目在于提供产生所述抗H7N9全人源单克隆抗体2J17的方法。

本发明的另一目在于提供包所述的抗H7N9全人源单克隆抗体2J17或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段的药物组合物。

本发明的另一目的在于提供本发明所述的抗H7N9全人源单克隆抗体2J17或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段或所述的药物组合物的应用。

本发明的另一目的在于提供一种检测H7N9病毒的试剂盒。

为实现上述目的，一方面，本发明提供抗H7N9全人源单克隆抗体2J17或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段，其中，该抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；和/或

该抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

在本发明的一具体实施方式中，该抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；和/或

该抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

经ELISA实验验证，本发明所述抗H7N9全人源单克隆抗体2J17可以靶向结合H7N9病毒的血凝素HA。本发明所述抗体为全人源性单克隆抗体，相比鼠源抗体，全人源抗体的基因完全来源于人的基因，没有其他种属的成分，在人体内不发生抗鼠抗抗体等毒副作用，具有更好的生物相容性，更适合和更有潜力成为治疗流感病毒的大分子药物。

另一方面，本发明提供编码本发明所述的抗H7N9全人源单克隆抗体2J17的基因。优选地，所述基因包含编码具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸的核苷酸序列，更优选地，该核苷酸序列的如SEQ ID NO:1所示；和/或

所述基因包含编码具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸的核苷酸序列，优选地，该核苷酸序列的如SEQ ID NO:3所示。

在本发明一具体实施方式中，所述基因包含编码具有SEQ ID NO:6的氨基酸的核苷酸序列，优选地，该核苷酸序列的如SEQ ID NO:5所示；和/或

所述基因包含编码具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸的核苷酸序列，优选地，该核苷酸序列的如SEQ ID NO:7所示。

另一方面，本发明提供含如上所述基因的载体。

再一方面，本发明提供含如上所述基因或如上所述载体的细胞。

再一方面，本发明提供一种产生本发明所述抗H7N9全人源单克隆抗体2J17或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段的方法，该方法是采用单个B细胞法制备所述抗H7N9全人源单克隆抗体2J17。

现有技术中存在采用噬菌体展示技术制备抗H7N9病毒人源单克隆抗体的方法，尽管该方法具有生产成本低、不经过免疫和细胞融合等繁琐工作的优点，但是其缺点也比较明显，从非免疫抗体库中获得的抗体往往亲和力不足、受外源基因转化率的限制、抗体库的库容量不足以涵盖动物的抗体多样性等。本发明采用单个B细胞PCR技术，从病人的血液中分离分泌功能抗体的B细胞，然后提取RNA和合成cDNA，从中克隆分泌目的抗体的基因，最后重组和表达全人源单克隆抗体。该技术操作简单快捷，生产的人源抗体具有高亲和力和特异性，此外，可进一步采用改进的从记忆B细胞中分离具有中和病毒功能或杀伤肿瘤功能的本发明所述单克隆抗体技术，更是大大减少了繁琐操作和成本。

另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明所述的抗H7N9全人源单克隆抗体2J17或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段。

另一方面，本发明提供本发明所述的抗H7N9全人源单克隆抗体2J17或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段或所述的药物组合物在制备用于治疗由H7N9病毒引起的疾病的药物中的应用。

另一方面，本发明提供一种检测H7N9病毒水平的试剂盒，其含有本发明所述的抗H7N9全人源单克隆抗体2J17或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段；优选所述的试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物，以及缓冲液；优选所述第二抗体为所述单克隆抗体2J17的抗抗体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明所述抗H7N9全人源单克隆抗体2J17可以靶向结合H7N9病毒的血凝素HA。

(2)相比鼠源抗体，全人源抗体的基因完全来源于人的基因，没有其他种属的成分，在人体内不发生抗鼠抗抗体等毒副作用，具有更好的生物相容性，更适合和更有潜力成为治疗流感病毒的大分子药物。

(3)相较于现有技术提供的噬菌体展示技术制备抗H7N9病毒人源单克隆抗体的方法，本发明采用的单个B细胞PCR技术具有操作简单快捷，生产的人源抗体具有高亲和力和特异性等优点。

附图说明

图1为实施例1NTH-3T3表达CD40L的流式检测结果图。

图2为实施例1流式细胞仪分选记忆B细胞结果图。

图3为实施例1ELISA实验结果图。

图4为实施例2琼脂糖凝胶电泳结果图。

图5为实施例2Western blot实验结果图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例1

(1)构建稳定表达CD40L的NTH-3T3细胞系

利用慢病毒建立3T3-CD40L饲养细胞。构建慢病毒表达载体pLVX-CD40L，转染293T细胞，转染第四天收集病毒上清液。活化NIH-3T3细胞，培养3代后用慢病毒感染，继续培养并传代3次。利用流式细胞仪进行分选FITC荧光强度在MFI附近的细胞，重新加入至培养瓶中，37℃，5％CO₂培养箱中培养和检测，检测结果如图1所示，其是将表达CD40L的3T3细胞和空载体pLVX(带有ZxGreen)转染的3T3细胞分别用带有APC的抗CD40L染色，然后上流式细胞仪分析。结果发现，所有3T3-CD40L饲养细胞都表达CD40L。当细胞长到80％～90％时，消化收集细胞，浓度为每毫升1×10⁷细胞。置于辐射仪中进行5000rads辐射，冻存液重悬细胞，浓度为每毫升3.5×10⁷细胞，分装1ml在冷冻小管，液氮冻存(可以保存2年)。

(2)记忆B细胞的分选和活化

用淋巴分离液分离和冻存曾经感染H7N9病毒的康复病人的PBMC，每管10～50×10⁶细胞，冻存在液氮罐中。配制PBMC流式染色液，其成分如下表1所示：

表1：PBMC流式染色液

抗体	体积(μL)
		CD19-PE-Cy7	0.5
IgM-PE	1.0
		IgA-APC	2.5
IgD-FITC	2.5
		PBS-1％(wt/vol)BSA	43.5

解冻PBMC，加入上述PBMC流式染色液并在流式细胞仪上分选，结果如图2所示，分选出CD19⁺IgM^–IgA^–IgD^–的记忆B细胞，细胞纯度需在90％以上，若低于90％，重复分选过程。配制激活B细胞的混合培养基，如下表2所示：

表2

将记忆B细胞加入到混合培养基中，混匀后有限稀释在384孔板，每孔1个细胞，体积为50ul，置于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养。13天后，取上清液进行ELISA，获得人源单克隆抗体2J17。

(3)人源单克隆抗体2J17结合H7N9病毒的血凝素HA实验

流感病毒血凝素HA是病毒包膜表面柱状抗原，能与人、鸡、豚鼠等多种红细胞受体结合引起红细胞凝集，具有免疫原性，抗血凝素抗体可以中和流感病毒。对上述获得的人源单克隆抗体2J17进行ELISA实验，具体地：

(1)将100ng/100ul的H7N9病毒的HA蛋白包被在96孔酶标板中，每孔100ul；

(2)放置4度冰箱过夜；

(3)用PBST溶液洗涤三遍，每孔加5％的脱脂奶粉溶液200ul，37度孵育1小时；

(4)用PBST溶液洗涤三遍，加100ul没有感染病毒的正常人血清(阴性对照)或加感染病毒的病人血清或抗H7N9全人源单克隆抗体，各三个重复；

(5)37度孵育1小时后用PBST溶液洗涤三遍；

(6)以1:5000稀释带HRP的抗人IgG抗体，加入酶标版中，每孔100ul；

(7)37度孵育1小时后用PBST溶液洗涤三遍；

(8)每孔加100ul TMB底物溶液，37度5分钟；

(9)每孔加终止溶液2M硫酸100ul，立刻在酶标仪中450nm波长检测吸光值。其结果如图3所示，ELISA实验表明本发明获得的人源单克隆抗体2J17可以靶向结合H7N9病毒的血凝素HA。

实施例2人源化单克隆抗体2J17基因的克隆、重组和表达

将实施例1获得的能够分泌结合H7N9病毒的抗体的B细胞进行裂解，取裂解液进行RNA的反转录，获得人源抗体基因的PCR模板cDNA。设计和合成克隆抗体基因的引物，以cDNA为模板克隆抗体的重链和轻链的基因，并且重组在真核细胞293F或HEK293中进行表达和纯化。具体地：

(1)将B细胞液转移至96孔板(Eppendorf，030133366)。

(2)反转录体系：150ng随机引物(invitrogen,48190-011),0.5ul 10mM dNTP(Invitrogen,18427-088),1μl 0.1M DTT(Invitrogen,18080-044),0.5％v/v Igepal CA-630(Sigma,I3021-50ML),4U RNAsin(Promega),6U Prime RNAse Inhibitor(Eppendorf)and 50U

III reverse transcriptase(Invitrogen,18080-044),补DEPC水至14ul/well。

(3)反转录反应程序：42℃，10min；25℃，10min；50℃，60min；94℃，5min。

(4)cDNA保存在-20℃。

(5)引物的设计和合成:

正向引物5′-3′序列(Forward Primer 5′-3′sequence)

重链可变区PCR引物:

5′VH1 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAG(SEQ ID NO:9)

5′VH1/5 CTGCAACCGGTGTACATTCCGAGGTGCAGCTGGTGCAG(SEQ ID NO:10)

5′VH3 CTGCAACCGGTGTACATTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAG(SEQ ID NO:11)

5′VH3-23 CTGCAACCGGTGTACATTCTGAGGTGCAGCTGTTGGAG(SEQ ID NO:12)

5′VH4 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAG(SEQ ID NO:13)

5′VH 4-34 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTG(SEQ ID NO:14)

5′VH 1-18 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTTCAGCTGGTGCAG(SEQ ID NO:15)

5′VH 1-24 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTCCAGCTGGTACAG(SEQ ID NO:16)

5′VH3-33 CTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAG(SEQ ID NO:17)

5′VH 3-9 CTGCAACCGGTGTACATTCTGAAGTGCAGCTGGTGGAG(SEQ ID NO:18)

5′VH4-39 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAG(SEQ ID NO:19)

5′VH 6-1 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTACAGCTGCAGCAG(SEQ ID NO:20)

3′SalI JH 1/2/4/5 TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG(SEQ ID NO:21)

3′SalI JH 3 TGCGAAGTCGACGCTGAAGAGACGGTGACCATTG(SEQ ID NO:22)

3′SalI JH 6 TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCGTG(SEQ ID NO:23)

κ轻链可变区PCR产物

5′Vκ1-5 CTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCCAGATGACCCAGTC(SEQ ID NO:24)

5′Vκ1-9 TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT(SEQ ID NO:25)

5′Vκ1D-43 CTGCAACCGGTGTACATTGTGCCATCCGGATGACCCAGTC(SEQ ID NO:26)

5′Vκ2-24 CTGCAACCGGTGTACATGGGGATATTGTGATGACCCAGAC(SEQ ID NO:27)

5′Vκ2-28 CTGCAACCGGTGTACATGGGGATATTGTGATGACTCAGTC(SEQ ID NO:28)

5′Vκ2-30 CTGCAACCGGTGTACATGGGGATGTTGTGATGACTCAGTC(SEQ ID NO:29)

5′Vκ3-11 TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC(SEQ ID NO:30)

5′Vκ3-15 CTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATAGTGATGACGCAGTC(SEQ ID NO:31)

5′Vκ3-20 TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT(SEQ ID NO:32)

5′Vκ4-1 CTGCAACCGGTGTACATTCGGACATCGTGATGACCCAGTC(SEQ ID NO:33)

3′Jκ1/4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC(SEQ ID NO:34)

3′Jκ2 GCCACCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTC(SEQ ID NO:35)

3′Jκ3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTC(SEQ ID NO:36)

3′Jκ5 GCCACCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTC(SEQ ID NO:37)

λ轻链可变区PCR产物

5′Vλ1 CTGCTACCGGTTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTGACKCAG(SEQ ID NO:38)

5′Vλ2 CTGCTACCGGTTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTGACTCAG(SEQ ID NO:39)

5′Vλ3 CTGCTACCGGTTCTGTGACCTCCTATGAGCTGACWCAG(SEQ ID NO:40)

5′Vλ4/5 CTGCTACCGGTTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTGACTCA(SEQ ID NO:41)

5′Vλ6 CTGCTACCGGTTCTTGGGCCAATTTTATGCTGACTCAG(SEQ ID NO:42)

5′Vλ7/8 CTGCTACCGGTTCCAATTCYCAGRCTGTGGTGACYCAG(SEQ ID NO:43)

3′CλCTCCTCACTCGAGGGYGGGAACAGAGTG(SEQ ID NO:44)

(6)用KOD-Plus-Neo(TOYOBO，KOD401)试剂盒PCR分别扩增抗体基因的重链和轻链，40μL体系：3.5μL cDNA，20nM混合引物，4μL缓冲液(buffer)，4μL 2mM dNTPs，2.4μLMgSO₄，1μL KOD。

(7)反应程序：94℃，2min；45个循环：[98℃,10s；58℃(IgH/Igκ)或60℃(Igλ),30s；68℃,28s(1^st PCR)或23s(2^nd PCR)]。

(8)对扩增产物进行琼脂糖凝胶，其结果如图4所示，结果显示，抗体轻链为κ，大小为339bp，重链大小是369bp。

(9)抗体基因重链可变区PCR产物测序结果如SEQ ID NO:1所示序列，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示序列。抗体基因轻链可变区PCR产物测序结果如SEQ ID NO:3所示序列，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示序列。抗体基因重链全长H基因(可委托Invitrogen公司合成)的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其带有BamH1/EcoR1双酶切位点，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。抗体基因轻链全长L基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示(可委托Invitrogen公司合成)，其带有Not1/Xho1双酶切位点，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

(10)将H基因和pcDNA3.1分别进行BamH1/EcoR1双酶切后相连，形成pcDNA3.1-H载体。

(11)将L基因和pcDNA3.1分别进行Not1/Xho1双酶切后相连，形成pcDNA3.1-L载体。

(12)培养293F细胞。

(13)20ug pcDNA3.1-L载体和10ug pcDNA3.1-H载体共转染293F细胞，培养96小时。

(14)取上清液进行ELISA(ABC是上清液，DEF是阳性对照，GH是阴性对照)和western blot；ELISA实验结果如下表3所示：

表3

数据	450	数据	450
				A	3.1025	E	1.0587
B	3.0215	F	1.1247
				C	2.9956	G	0.0655
D	1.2563	H	0.0741

上述结果显示上清液中含有能够结合H7N9病毒的抗体。

Western blot实验具体的过程为：

用上清液跑蛋白变性电泳，转膜后用5％的脱脂奶粉溶液封闭1小时，然后用带HRP的山羊抗人IgG抗体孵育1小时，最后加显示底物进行曝光。实验结果如图5所示，图5显示全人源抗体的重链和轻链，表明上清液中含有抗H7N9病毒全人源单克隆抗体。

最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。