JP5998222B2 - ヒトb細胞で生産されたインフルエンザaウイルス中和活性を持つ結合分子 - Google Patents

ヒトb細胞で生産されたインフルエンザaウイルス中和活性を持つ結合分子 Download PDF

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Description

本発明は、インフルエンザAウイルスに感染された後で回復した患者の血液から選別されたヒトB細胞が生産する、インフルエンザAウイルスに対して中和活性を持つヒト単一クローン抗体に関する。
インフルエンザは、インフルエンザウイルス(Influenza virus)に呼吸器が感染されて現われる病気であり、冬に多く現われ、感染性が非常に高くて全年令層を対象として容易に伝播されるが、特に老弱者層が脆弱であると知られている(Treanor J,2004,N Engl J Med.350(3):218-20)。オルトミクソウイルス(Orthomyxoviridae)に属するエンベロープウイルス(enveloped virus)であり、8個の分節からなるマイナスセンス1本鎖(Negative-sense、single-strand)のRNA(ribonucleic acid)を遺伝体として持つインフルエンザウイルスは、A、B、Cグループに分類され、インフルエンザAウイルス(influenza A virus)の場合、主要表面タンパク質であるHA(hemaggutinin)とNA(neuraminidase)とによって再びいろいろなサブタイプ(subtype)に分けられる。現在まで16種のHA及び9種のNAが知られている(Cheung TK and Poon LL 2007,Ann NY Acad Sci.1102:1-25)。インフルエンザウイルスは、種類によって鳥類、豚及び人に感染されるという特性と、RNA分節になっている遺伝体とによって、多様な遺伝子の組み合わせ及び突然変異で変種ウイルスが発生し続ける(Treanor J,2004.N Engl J Med.350(3):218-20)。このような持続的な変異によって永久的な免疫力を得難いため、現在最も効果的にあると思われる予防法は、毎年流行すると予測されるインフルエンザウイルスに対するワクチンを接種し、特定タイプに合う免疫力を毎年形成させることである。
インフルエンザウイルスに対するワクチンは、一般的に卵を用いて生産されるが、これは長時間がかかる非効率的方法である。したがって、だいたい毎年短時間に十分量のワクチンを生産するのに問題点がある。このような問題を解決するために、細胞培養(cell culture)を用いたワクチン生産方法がいろいろな製薬会社(GSK,Baxter)で活発に進んでいる実情である。また、インフルエンザウイルスの流行性感染(pandemic infection)が引き起こされる場合、これに対する迅速なワクチンの開発は、時間のため極めて困難な実情である。抗ウイルス剤(antiviral drug)も、突然変異で抵抗性を持つウイルスの出現問題のため100%信頼できない。
このような問題点を解決するために、インフルエンザウイルスに対する抗体の使用及び開発が行われ、最近に活発に進んでいる(Throsby et al.,2008,PloS One 3(e3942);Sui et al.,2009,Nature structural&molecular biology.16(265-273);Simmons et al.,2007,PloS Medicine 4(e178);Wrammert et al.,2011,J Exp Med.208(181-193);Corti et al.,2011,Science 333(850-856))。
回復した患者の血液生産物は、多様なウイルスに感染された患者の治療に用いられ、流感感染(pandemic flu infection)の治療にも使われてきた。例えば、スペイン・インフルエンザ・ウイルス(Spanish influenza virus)に感染された患者が肺炎症状を伴う場合、前記インフルエンザに感染された後で回復した患者から採取した血液生産物(blood product)を治療に使った(Luke et al.,2006.Annals of internal medicine.145:599)。このようにハイパー免疫グロブリン(Hyper immune globulin:IgIv)は、ヒト血漿で精製されて多様なウイルスに感染された患者の治療に用いられるが、前記のように製造された生産物は暫定的感染源に対して安全ではなく、量産に非効率的である。
ヒトB細胞は、特異的ヒト単一クローン抗体の選別に用いられる。しかし、エプスタイン・バーウイルス(Epstein-Barr virus)によるヒトB細胞の不死化(immortalization)は、不死化の効率が低くて長時間がかかるなど非効率的にある。これを補うために新たな技術が開発及び用いられている。それらのうち一つは、RT−PCR方法を用いてB細胞で直接抗体の遺伝子情報を獲得することである。例ば、特定抗原に応じる抗体を発現するB細胞を染色した後、FACS分析機(FACS-sorter)を用いて分離し、これら単一B細胞から抗体の遺伝情報をRT−PCR方法によって獲得して発現ベクターに挿入した後、再び動物細胞で形質感染して量産する方法がある。これをさらに容易かつ迅速に進めるために、下記のような技術を用いられる。新技術であるISAAC(immunospot Array Assay on a Chip)は、特異的単一クローン抗体を分泌する単一B細胞を数週以内にスクリーニングして抗体遺伝子を獲得する(Jin et al.,2009 Nat Med.15,1088-1092)。このように獲得された抗体は自然的なヒト抗体であり、免疫源性問題でさらに効果的にある。
本発明の目的は、インフルエンザAウイルスに対して中和活性を持つ結合分子を提供することである。
また本発明の他の目的は、前記結合分子を暗号化する、単離された核酸分子を提供することである。
また本発明の他の目的は、前記単離された核酸分子が挿入された発現ベクターを提供することである。
また本発明の他の目的は、前記発現ベクターが形質感染された結合分子生産細胞株を提供することである。
また本発明の他の目的は、結合分子の選別方法を提供することである。
また本発明の他の目的は、前記結合分子を含む組成物を提供することである。
また本発明の他の目的は、前記結合分子を用いたインフルエンザAウイルス来由の疾患治療方法を提供することである。
また本発明の他の目的は、前記ヒト結合分子を用いたインフルエンザAウイルス来由の疾患予防方法を提供することである。
また本発明の他の目的は、前記ヒト結合分子を用いたインフルエンザAウイルス感染有無の診断方法を提供することである。
さらに本発明の他の目的は、前記ヒト結合分子を含むインフルエンザAウイルス診断用キットを提供することである。
前記課題を解決するために、本発明は、インフルエンザAウイルスに対して中和活性を持つ結合分子を提供する。
また、本発明は、前記結合分子を暗号化する、単離された核酸分子を提供する。
また、本発明は、前記単離された核酸分子が挿入された発現ベクターを提供する。
また、本発明は、前記発現ベクターが形質感染された結合分子生産細胞株を提供する。
また、本発明は、結合分子の選別方法を提供する。
また、本発明は、前記結合分子を含む組成物を提供する。
また、本発明は、前記結合分子を含むインフルエンザAウイルス来由の疾患の予防及び治療用組成物を提供する。
また、本発明は、前記結合分子を含むインフルエンザAウイルス診断用組成物を提供する。
また、本発明は、前記結合分子を用いたインフルエンザAウイルス来由の疾患治療方法を提供する。
また、本発明は前記結合分子を用いたインフルエンザAウイルス来由の疾患予防方法を提供する。
また、本発明は、前記結合分子を用いたインフルエンザAウイルス感染有無の診断方法を提供する。
さらに本発明は、前記結合分子を含むインフルエンザAウイルス診断用キットを提供する。
本発明の結合分子は、インフルエンザAウイルスに対して結合及び中和活性を持つので、前記インフルエンザAウイルスによる疾患の予防及び治療に有用であり、インフルエンザAウイルスの感染有無の診断方法にも有用である。
H3ヘマグルチニン(Hemaglutinin;以下、“HA”と称する)に対して結合することで一次選別された結合分子の結合力を、ELISA方法で検証したグラフである。 pCT145(A)及びpCT147(B)のベクター地図であり、A:pCT145ベクター、B;pCT147ベクター、pac:Puromycin N-acetyl-tranferaseをコードする遺伝子(PAC)、DS:dyad symmetry sequence(EBNA1はoriP内のdyad symmetry(DS)エレメントと結合する)である。 本発明の結合分子を発現する発現ベクター地図である。 本発明の結合分子を用いたマウス動物実験結果である。 本発明の結合分子を用いたフェレット動物実験中で、H3N2(A/Hong Kong/68)インフルエンザウイルス接種後の鼻腔洗浄液及び肺組織でのウイルス力価変化結果である。 本発明の結合分子を用いたフェレット動物実験中で、H5N1(A/Vietnam/1203/04)インフルエンザウイルス接種後の鼻腔洗浄液及び肺組織でのウイルス力価変化の結果である。
以下、本発明の単語を、次のように定義する。
本発明で使われる“インフルエンザAウイルス(influenza A virus)”は、オルトミクソウイルス(Orthomyxoviridae)に属するエンベロープウイルス(enveloped virus)であり、8個の分節からなるマイナスセンス1本鎖(Negative-sense、single-strand)のRNA(ribonucleic acid)を遺伝体として持ち、A、B及びCグループに分類され、主要表面タンパク質であるHA(hemaggutinin)及びNA(neuraminidase)によって再び様々なサブタイプ(subtype)に分けられる。現在まで16種のHA及び9種のNAが知られている。
本発明で使われる“H3サブタイプのウイルス”と表記されたものは、H3サブタイプのHAを持っているウイルスを称するので、H3N1、H3N2、H3N3、H3N4、H3N5、H3N6、H3N7、H3N8及びH3N9ウイルスが含まれる。
本発明で使われる“ヘマグルチニン(hemaggutinin、以下“HA”と称する)”は、インフルエンザウイルスの外被(envelope)糖蛋白質を示す。HAは、インフルエンザウイルスが宿主細胞に吸着して貫通することを媒介する。現在まで16種のサブタイプが報告されている。
本発明で使われる“回復した患者または完治患者”は、インフルエンザAウイルスに感染されてインフルエンザAウイルスに陽性反応を示したが、治されて血液内でインフルエンザAウイルスが陰性反応を示す患者である。
本発明で使われる“結合分子”は、キメラ、ヒト化またはヒト単一クローン抗体のような単一クローン抗体を含む完全な(intact)免疫グロブリン(immunoglobulin)、または抗原に結合する免疫グロブリン、例えば、インフルエンザAウイルスの単量体HAまたは三量体HAとの結合のために、完全な免疫グロブリンと競争する免疫グロブリン断片を含む可変性ドメインを意味する。構造とは構わずに抗原−結合断片は、完全な免疫グロブリンによって認識された同じ抗原と結合される。抗原−結合断片は、結合分子のアミノ酸配列の2個以上の連続基、20個以上の連続アミノ酸残基、25個以上の連続アミノ酸残基、30個以上の連続アミノ酸残基、35個以上の連続アミノ酸残基、40個以上の連続アミノ酸残基、50個以上の連続アミノ酸残基、60個以上の連続アミノ酸残基、70個以上の連続アミノ酸残基、80個以上の連続アミノ酸残基、90個以上の連続アミノ酸残基、100個以上の連続アミノ酸残基、125個以上の連続アミノ酸残基、150個以上の連続アミノ酸残基、175個以上連続アミノ酸残基、200個以上の連続アミノ酸残基、または250個以上の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを含む。“抗原−結合断片”は、特にFab、F(ab’)、F(ab’)、Fv、dAb、Fd、相補性決定領域(CDR)断片、単鎖抗体(scFv)、2価の(bivalent)単鎖抗体、単鎖把持抗体、ディアボディ、トリアバデ−、テトラボディ、ポリペプチドへの特定抗原に結合するのに十分な免疫グロブリンの一つ以上の断片を含むポリペプチドなどを含む。前記断片は合成によって、または完全な免疫グロブリンの酵素的または化学的分解によって生成されるか、または、再組み合わせDNA技術によって遺伝工学的に生成される。生成方法は、当業界で周知のものである。
本発明で使われる“薬剤学的に許容可能な賦形剤”という用語は、容認可能な、または便利な投薬形態を製造するための薬物、製剤または結合分子のような活性分子で組み合わせられる不活性物質を意味する。薬剤学的に許容可能な賦形剤は、非毒性であるか、または、少なくとも毒性が使われた用量及び濃度において、収容者にその意図された用途のために許容される賦形剤であり、薬物、製剤または結合粉剤を含む剤形化の異なる成分と両立する。
本発明で使われる“治療学的に有効な量”という用語は、インフルエンザAウイルスの被曝前または被曝後の予防または治療に有効な本発明の結合分子の量を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の発明者らは、インフルエンザAウイルスに感染された後で回復した患者の採血された血液からPBMC(peripheral blood mononuclear cell)を分離し、前記分離されたPBMCを対象としてH1サブタイプのHAに対する単一クローン抗体を生産するB細胞を、ISAAC方法を用いて選別した。前記選別されたB細胞から、HAに対する単一クローン抗体を生産する遺伝子情報をRT−PCR方法によって収得し、これをpcDNAベクターに挿入してCHO細胞株に形質感染した後、抗体を生産して1次に82個の抗体を選別した。HAとの反応性をさらに綿密に測定するために、pcDNAベクターに挿入されたすべての抗体をヒト細胞であるF2N細胞に形質感染し、これより生産された抗体を、H3サブタイプの単量体HA一部及び三量体HAを抗原として用いたHA−ELISAを通じて比較分析を行い、三量体HAと高い割合で反応する6個(CT129、CT135、CT147、CT149、CT163及びCT166抗体)の抗体を2次選別した。前記2次選別された抗体でいろいろな種類のインフルエンザウイルスに対する中和活性を確認するために、マイクロ中和試験法(microneutralization test:以下、“MNテスト”と称する)及び血球凝集抑制試験法(hemagglutination inhibition test:以下、“HIテスト”と称する)を行った。様々な抗体が様々なインフルエンザウイルスに高い、または低い中和活性を示した、すべての抗体がHIテストで不応反応を示した。MNテストを通じて様々なウイルスに複合的な中和活性を示すCT149抗体を選別し、遺伝子を抗体発現効率の高いMarEx発現ベクターに挿入した後でF2N細胞に形質感染して生産された抗体により、さらに多様なインフルエンザウイルスについてのMNテストを施した。その結果、CT149抗体は、H1、H3サブタイプのウイルスだけではなくH5、H7、H9サブタイプのウイルスに対しても中和活性を持つということが分かった(表4を参照)。また、H3サブタイプのインフルエンザウイルスを用いた動物実験で、CT149抗体は、H3N2感染の予防及び治療に優れた効果を示した(図4を参照)。前記結果を通じて本発明者らは、インフルエンザAウイルス感染に対処する抗インフルエンザAウイルス単一クローン抗体の発明を完成した。
よって、本発明は、インフルエンザAウイルスに対して中和活性を持つ結合分子を提供する。
前記結合分子は、抗体であることを特徴とし、前記抗体は、Fab切片、Fv切片、ディアボディ、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることが望ましいが、これらに限定されるものではない。
本発明において、前記結合分子は、インフルエンザAウイルス表面のHAに結合することを特徴とする。また前記結合分子は、インフルエンザAウイルスH1N1サブタイプに感染された後で回復した患者の血液に存在するB細胞で生産されることを特徴とする。
特にCT149抗体は、Group1(H1,H5,H9)のみならずGroup2(H3,H7)インフルエンザウイルスに対しても中和活性を持っている。
本発明において、前記インフルエンザAウイルスは、H1N1サブタイプであることを特徴とし、前記インフルエンザAウイルスH1N1サブタイプは、A/Ohio/07/2009である。また、前記インフルエンザAウイルスは、H5N1サブタイプであることを特徴とし、前記インフルエンザAウイルスH5N1サブタイプは、A/Vietnam/1203/04×PR8である。合わせて、前記インフルエンザAウイルスは、H7N2サブタイプであることを特徴とし、前記インフルエンザAウイルスH7N2サブタイプは、A/turkey/Virginia/02×PR8である。前記インフルエンザAウイルスは、H9N2サブタイプであることを特徴とし、前記インフルエンザAウイルスH9N2サブタイプは、A/Green−winged teal/209/TX/2009及びA/ck/HK/G9/97×PR8からなる群から選択されるいずれか一つ以上である。また本発明において、前記インフルエンザAウイルスは、H3N2サブタイプであることを特徴とし、前記インフルエンザAウイルスH3N2サブタイプは、A/Brisbane/10/07、A/Wisconsin/67/05、A/Wyomin/3/03.rg、A/Beijing/353/89−X109、A/Beijing/32/92−R−H3、A/Johannesburg/33/94R−H3、A/Nanchang/933/95、A/Sydney/5/97、A/Panama/2007/99からなる群から選択されるいずれか一つ以上である。
本発明において、可変領域のCDRは、Kabatらによって考案されたシステムによって通常的な方法で定められた(文献[Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th),National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)]参照)。本発明に使われたCDRナンバリングはカバット方法(Kabat method)を使ったが、それ以外にIMGT方法、Chothia方法、AbM方法など他の方法によって定められたCDRを含む結合分子も本発明に含まれる。
また、本発明は、下記軽鎖ポリペプチド配列を含むインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子を提供する。カバット方法によって、配列番号1、配列番号7、配列番号13及び配列番号15で表されるポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのCDR1領域と、配列番号2、配列番号8及び配列番号16で表されるポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのCDR2領域と、配列番号3または配列番号9で表されるポリペプチド配列のうちいずれか一つのCDR3領域と、を含むことを特徴とする軽鎖。
また、本発明は、下記重鎖ポリペプチド配列を含むインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子を提供する。カバット方法によって、配列番号4または配列番号10で表されるポリペプチド配列のうちいずれか一つのCDR1領域と、配列番号5、配列番号11、配列番号14及び配列番号17で表されるポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのCDR2領域と、配列番号6または配列番号12で表されるポリペプチド配列のうちいずれか一つのCDR3領域と、を含むことを特徴とする重鎖。
また、本発明は、下記軽鎖及び重鎖ポリペプチド配列を含むインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子を提供する。カバット方法によって、配列番号1、配列番号7、配列番号13及び配列番号15で表されるポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのCDR1領域と、配列番号2、配列番号8及び配列番号16で表されるポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのCDR2領域と、配列番号3または配列番号9で表されるポリペプチド配列のうちいずれか一つのCDR3領域と、を含むことを特徴とする軽鎖、及びカバット方法によって、配列番号4または配列番号10で表されるポリペプチド配列のうちいずれか一つのCDR1領域と、配列番号5、配列番号11、配列番号14及び配列番号17で表されるポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのCDR2領域と、配列番号6または配列番号12で表されるポリペプチド配列のうちいずれか一つのCDR3領域と、を含むことを特徴とする重鎖。
また、本発明は、下記ポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのポリペプチド配列で構成されることを特徴とするインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子を提供する。カバット方法によって、配列番号1で表されるCDR1領域、配列番号2で表されるCDR2領域及び配列番号3で表されるCDR3領域を含む軽鎖、及び配列番号4で表されるCDR1領域、配列番号5で表されるCDR2領域及び配列番号6で表されるCDR3領域を含む重鎖で構成される結合分子、及びカバット方法によって、配列番号7で表されるCDR1領域、配列番号8で表されるCDR2領域及び配列番号9で表されるCDR3領域を含む軽鎖、及び配列番号10で表されるCDR1領域、配列番号11で表されるCDR2領域及び配列番号12で表されるCDR3領域を含む重鎖で構成される結合分子、及びカバット方法によって、配列番号13で表されるCDR1領域、配列番号8で表されるCDR2領域、及び配列番号9で表されるCDR3領域を含む軽鎖、及び配列番号10で表されるCDR1領域、配列番号14で表されるCDR2領域、及び配列番号6で表されるCDR3領域を含む重鎖で構成される結合分子と、カバッ方法によって、配列番号15で表されるCDR1領域、配列番号16で表されるCDR2領域、及び配列番号9で表されるCDR3領域を含む軽鎖、及び配列番号10で表されるCDR1領域、配列番号17で表されるCDR2領域、及び配列番号12で表されるCDR3領域を含む重鎖で構成される結合分子。
本発明において、前記結合分子は、配列番号37で表されるポリペプチド配列を含む軽鎖、及び配列番号38で表されるポリペプチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする。
また、前記結合分子は、配列番号39で表されるポリペプチド配列を含む軽鎖、及び配列番号40で表されるポリペプチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする。
また、前記結合分子は、配列番号41で表されるポリペプチド配列を含む軽鎖、及び配列番号42で表されるポリペプチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする。
同時に、前記結合分子は、配列番号43で表されるポリペプチド配列を含む軽鎖、及び配列番号44で表されるポリペプチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする。
前記結合分子は、インフルエンザAウイルスH1、H3、H5、H7及びH9サブタイプからなる群から選択されたいずれか一つの中和活性を持つことを特徴とする。また前記インフルエンザAウイルスH3サブタイプは、H3N2であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
また、本発明は、下記軽鎖ポリヌクレオチド配列を含むインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子を提供する。カバット方法によって、配列番号18、配列番号24、配列番号30及び配列番号34で表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのCDR1領域と、配列番号19、配列番号25及び配列番号35で表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのCDR2領域と、配列番号20または配列番号26で表されるポリヌクレオチド配列のうちいずれか一つのCDR3領域と、を含むことを特徴とする軽鎖。
また、本発明は、下記重鎖ポリヌクレオチド配列を含むインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子を提供する。カバット方法によって、配列番号21、配列番号27及び配列番号31で表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのCDR1領域と、配列番号22、配列番号28、配列番号32及び配列番号36で表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのCDR2領域と、配列番号23、配列番号29及び配列番号33で記載したポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのCDR3領域と、を含むことを特徴とする重鎖。
また、本発明は、下記軽鎖及び重鎖ポリヌクレオチド配列を含むインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子を提供する。カバット方法によって、配列番号18、配列番号24、配列番号30及び配列番号34で表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのCDR1領域と、配列番号19、配列番号25及び配列番号35で表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのCDR2領域と、配列番号20または配列番号26で表されるポリヌクレオチド配列のうちいずれか一つのCDR3領域と、を含むことを特徴とする軽鎖、及びカバット方法によって、配列番号21、配列番号27及び配列番号31で表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのCDR1領域と、配列番号22、配列番号28、配列番号32及び配列番号36で表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのCDR2領域と、配列番号23、配列番号29及び配列番号33で記載したポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのCDR3領域と、を含むことを特徴とする重鎖。
また、本発明は、下記ポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とするインフルエンザAウイルスに対する中和活性を持つ結合分子を提供する。カバット方法によって、配列番号18で表されるCDR1領域、配列番号19で表されるCDR2領域及び配列番号20で表されるCDR3領域を含む軽鎖及び配列番号21で表されるCDR1領域、配列番号22で表されるCDR2領域及び配列番号23で表されるCDR3領域を含む重鎖で構成される結合分子、及びカバット方法によって、配列番号24で表されるCDR1領域、配列番号25で表されるCDR2領域及び配列番号26で表されるCDR3領域を含む軽鎖及び配列番号27で表されるCDR1領域、配列番号28で表されるCDR2領域及び配列番号29で表されるCDR3領域を含む重鎖で構成される結合分子、及びカバット方法によって、配列番号30で表されるCDR1領域、配列番号25で表されるCDR2領域及び配列番号26で表されるCDR3領域を含む軽鎖及び配列番号31で表されるCDR1領域、配列番号32で表されるCDR2領域及び配列番号33で表されるCDR3領域を含む重鎖で構成される結合分子、及びカバット方法によって、配列番号34で表されるCDR1領域、配列番号35で表されるCDR2領域及び配列番号26で表されるCDR3領域を含む軽鎖及び配列番号31で表されるCDR1領域、配列番号36で表されるCDR2領域及び配列番号29で表されるCDR3領域を含む重鎖で構成される結合分子。
本発明において、前記結合分子は、配列番号45で表されるポリヌクレオチド配列を含む軽鎖及び配列番号46で表されるポリヌクレオチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする。
また、前記結合分子は、配列番号47で表されるポリヌクレオチド配列を含む軽鎖及び配列番号48で表されるポリヌクレオチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする。
また、前記結合分子は、配列番号49で表されるポリヌクレオチド配列を含む軽鎖及び配列番号50で表されるポリヌクレオチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする。
さらに、前記結合分子は、配列番号51で表されるポリヌクレオチド配列を含む軽鎖及び配列番号52で表されるポリヌクレオチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする。
前記結合分子は、インフルエンザAウイルスH1、H3、H5、H7及びH9サブタイプからなる群から選択されたいずれか一つに対して中和活性を持つことを特徴とする。また、前記インフルエンザAウイルスは、H3サブタイプはH3N2であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
本発明の結合分子は、抗体であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。前記抗体は、Fab切片、Fv切片、ディアボディ、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることが望ましく、抗体の一部分としてインフルエンザAウイルスHAに結合する能力を持ち、本発明の結合分子と競争的にHAに結合する全ての断片を含む。さらに、本発明は、前記結合分子の機能的変異体を含む。変異体がインフルエンザAウイルスH3サブタイプまたはその断片に特異的に結合するために、本発明の結合分子と競争できるならば、本発明の結合分子の機能的変異体と見なされる。詳細には、機能的変異体がインフルエンザAウイルスHAまたはその断片に結合でき、これに対して中和活性を持つならば、本発明の機能的変異体として見なされる。機能的変異体は、1次構造的配列が実質的に類似した誘導体を含むが、これに制限されるものではなく、例えば、生体外(in vitro)または生体内(in vivo)変形、化学薬品及び/または生化学薬品を含み、これらは、本院発明の親結合分子では見つけられない。このような変形としては、例えば、アセチル化、アシル化、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、地質または地質誘導体の共有結合、架橋、二硫化結合形成、グリコシル化、水酸化、メチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解及び燐酸化などが含まれる。機能的変異体は、選択的に、親結合分子のアミノ酸配列と比べて一つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失またはそれらの組み合わせを含むアミノ酸配列を含む結合分子である。さらに機能的変異体は、アミノ末端またはカルボキシ末端のうち一つまたは全てにおいてアミノ酸配列の切断体(truncated form)を含む。
本発明の機能的変異体は、本発明の親結合分子と比べて同一または異なり、または、さらに高いまたは低い結合親和力を持つが、依然としてインフルエンザAウイルスのHAまたはその断片に結合する。例えば、本発明の機能的変異体は、本発明の親結合分子と比べてインフルエンザAウイルスHAまたはその断片に対して増加または減少した結合親和力を持つ。望ましくは、骨格構造、超可変(Hypervariable)領域、特に、CDR3領域を含むが、これらに限定されるものではなく、可変領域のアミノ酸配列が変形される。一般的に軽鎖または重鎖領域は、3個のCDR領域を含む3個の超可変領域及びさらに保存された領域、すなわち、骨格領域(FR)を含む。超可変領域は、CDRからのアミノ酸残基及び超可変ループからのアミノ酸残基を含む。本発明の範囲に属するための機能的変異体は、本明細書の親結合分子と少なくとも約50%〜99%、望ましくは、少なくとも約60%〜99%、さらに望ましくは、少なくとも約80%〜99%、さらに望ましくは、約90%〜99%、特に少なくとも約95%〜99%、及び特に少なくとも約97%〜99%アミノ酸配列同質性を持つ。比較されるアミノ酸配列を最適に配列し、類似または同じアミノ酸残基を定義するために、コンピュータアルゴリズムのうち当業者に周知のGapまたはBest fitを使える。機能的変異体は、親結合分子またはその一部をPCR方法、オリゴマーヌクレオチドを用いた突然変異生成及び部分突然変異生成を含む公知の一般分子生物学的方法によって変化させるか、または有機合成方法で得られるが、これらに制限されるものではない。
また、本発明は、前記結合分子を暗号化する、単離された核酸分子を提供する。
本発明の核酸分子は、本発明で提供する抗体のアミノ酸配列が、周知の如く、ポリヌクレオチド配列にて翻訳された核酸分子をいずれも含む。したがって、ORF(open reading frame)による多様なポリヌクレオチド配列が製造され、これもいずれも本発明の核酸分子に含まれる。
また、本発明は、前記単離された核酸分子が挿入された発現ベクターを提供する。前記発現ベクターとしては、セルトリオン固有の発現ベクターであるMarExベクター及び商業的に広く使われるpCDNAベクター、F、R1、RP1、Col、pBR322、ToL、Tiベクター;コスミド;ラムダ、ラムダ状(lambdoid)、M13、Mu、p1 P22、Qμ、T−even、T2、T3、T7などのファージ;植物ウイルスからなる群から選択されたいずれか一つから選択された発現ベクターを用いることが望ましいが、これらに限定されるものではなく、当業者に発現ベクターと知られた全ての発現ベクターは本発明に使用でき、発現ベクターを選択する時には目的とする宿主細胞の性質による。宿主細胞へのベクター導入時、燐酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、DEAE−デキストラン調節トランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクションまたは電気穿孔法によって行われるが、これらに限定されるものではなく、当業者ならば、使用する発現ベクター及び宿主細胞に好適な導入方法を選択して用いる。望ましくは、ベクターは一つ以上の選別マーカーを含むが、これに限定されず、選別マーカーを含まないベクターを用いて生産物生産如何によって選別できる。選別マーカーの選択は、目的とする宿主細胞によって選別され、これは公知の方法を用いるので、本発明はこれに制限されない。
本発明の核酸分子の精製を容易にするために、タグ配列を発現ベクター上に挿入して融合させる。前記タグは、ヘキサ−ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、mycタグまたはflagタグを含むが、これらに限定されるものではなく、当業者に周知の精製を容易にするタグならば、いずれも本発明で利用できる。
また、本発明は、前記発現ベクターが形質感染されたインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子生産細胞株を提供する。
本発明において、前記細胞株は、哺乳動物、植物、昆虫、菌類または細胞性起源の細胞を含むが、これらに限定されるものではない。前記哺乳動物細胞としては、CHO細胞、F2N細胞、CSO細胞、BHK細胞、ボウズ(Bowes)黒色腫細胞、HeLa細胞、911細胞、AT1080細胞、A549細胞、HEK293細胞及びHEK293T細胞からなる群から選択されたいずれか一つを宿主細胞として使用することが望ましいが、これらに限定されず、当業者に周知の哺乳動物宿主細胞として使用可能な細胞はいずれも利用できる。
また、本発明は、下記のような段階を含むインフルエンザAウイルスに感染された患者からの、抗インフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子の選別方法を提供する。1)インフルエンザAウイルスに感染された患者を対象として血液内インフルエンザAウイルス陰性患者を選別する段階と、2)前記段階1)で選別された患者から血液を採取して収集する段階と、3)前記段階2)で収集された患者の血液からB細胞を分離する段階と、4)前記段階3)でHAと結合する結合分子を生産するB細胞を選別する段階と、5)前記段階4)で選別されたB細胞からRNAを抽出する段階と、6)前記段階5)の抽出されたRNAを対象として結合分子遺伝子を増幅する段階と、7)前記段階6)で増幅された遺伝子を発現ベクターにクローニングする段階と、8)前記段階7)の発現ベクターを宿主細胞に形質感染させる段階と、9)前記段階8)で製作された形質感染された細胞で生産する結合分子から、HAと結合する結合分子を選別する段階と、10)選別された結合分子に対する細胞株を製作して培養する段階と、11)前記段階10)の宿主細胞の培養液で、インフルエンザAウイルスのHAに結合する結合分子を精製する段階と、12)前記段階11)で精製された結合分子を対象としてインフルエンザAウイルス中和活性を再確認する段階と、13)前記段階12)の中和活性実験で、インフルエンザAウイルス中和活性を持つ結合分子を再選別する段階。
前記選別方法の結合分子は、抗体であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。前記抗体は、Fab切片、Fv切片、ディアボディ、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることが望ましく、抗体の一部分として、インフルエンザAウイルスHAに結合する能力を持ち、かつ本発明の結合分子と競争的にHAに結合する断片をいずれも含む。
さらに、本発明は、前記結合分子の機能的変異体を含む。変異体がインフルエンザAウイルスまたはその断片に特異的に結合するために本発明の結合分子と競争できるならば、本発明の結合分子の機能的変異体と見なされる。詳細には、機能的変異体がインフルエンザAウイルスHAまたはその断片に結合でき、これに対して中和活性を持つならば、本発明の結合分子の機能的変異体と見なされる。機能的変異体は、1次構造的配列が実質的に類似した誘導体を含むが、これに制限されるものではなく、例えば、生体外または生体内変形、化学薬品及び/または生化学薬品を含み、これらは本発明の親結合分子では見つけられない。このような変形は、例えば、アセチル化、アシル化、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、地質または地質誘導体の共有結合、架橋、二硫化結合形成、グリコシル化、水酸化、メチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解及び燐酸化などが含まれる。機能的変異体は、選択的に親結合分子のアミノ酸配列と比べて一つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失またはそれらの組み合わせを含むアミノ酸配列を含む結合分子である。
さらに、機能的変異体は、アミノ末端またはカルボキシ末端のうち一つまたは全てにおいて、アミノ酸配列の切断体を含む。本発明の機能的変異体は、本発明の親結合分子と比べて同一または異なり、または、さらに高いまたは低い結合親和力を持つが、依然としてインフルエンザAウイルスのHAまたはその断片に結合できる。例えば、本発明の機能的変異体は、本発明の親結合分子と比べてインフルエンザAウイルスHAまたはその断片に対して増加または減少した結合親和力を持つ。望ましくは、骨格構造、超可変領域、特にCDR3領域を含むが、これらに限定されるものではなく、可変領域のアミノ酸配列が変形される。一般的に軽鎖または重鎖領域は、3個のCDR領域を含む3個の超可変領域及びさらに保存された領域、すなわち、骨格領域(FR)を含む。超可変領域は、CDRからのアミノ酸残基及び超可変ループからのアミノ酸残基を含む。本発明の範囲に属するための機能的変異体は、本明細書の親結合分子と少なくとも約50%〜99%、望ましくは、少なくとも約60%〜99%、さらに望ましくは、少なくとも約80%〜99%、さらに望ましくは約90%〜99%、特に少なくとも約95%〜99%、及び特に少なくとも約97%〜99%アミノ酸配列同質性を持つ。比較されるアミノ酸配列を最適に配列し、類似または同じアミノ酸残基を定義するために、コンピュータアルゴリズムのうち当業者に周知のGapまたはBestfitを使える。機能的変異体は、親結合分子またはその一部を、PCR方法、オリゴマーヌクレオチドを用いた突然変異生成及び部分突然変異生成を含む公知の一般分子生物学的方法によって変化させるか、または有機合成方法で得られるが、これらに制限されるものではない。
また、本発明は、前記結合分子を含む組成物を提供する。
本発明の組成物は、本発明のインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子以外に、薬剤学的に許容可能な賦形剤を含む。薬剤学的に許容可能な賦形剤は、公知のものである。
また、本発明は、前記結合分子を含むインフルエンザAウイルス来由の疾患予防及び治療用組成物を提供する。
本発明の組成物は、本発明のインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子以外に、薬剤学的に許容可能な賦形剤を含む。薬剤学的に許容可能な賦形剤は、公知のものである。
また本発明の予防及び治療用組成物は、少なくとも5個の異なる治療剤を含む。本発明の予防及び治療用組成物は、インフルエンザAウイルスHA及びその断片に結合する数種の単一クローン抗体を含み、これを通じて中和活性に相乗作用を示す。
さらに、本発明の予防及び治療用組成物は、少なくとも一つの他の治療剤または診断制を含む。前記治療剤としては、抗ウイルス薬剤を含むが、これに限定されるものではない。このような薬剤としては、抗体、小分子、有機または無機化合物、酵素、ポリヌクレオチド配列、抗ウイルス性ペプチドなどである。
本発明の予防及び治療用組成物は、製造及び保存条件下で無菌かつ安定しており、伝達時または伝達前に好適な薬剤学的に許容可能な賦形剤中に、再構成のために粉末状に存在する。殺菌性注射溶液の製造のための殺菌粉末の場合、望ましい製造方法は、活性構成成分の粉末及びそれより予め殺菌−ろ過された溶液から、さらなる所望の構成成分を生産する真空乾燥及び凍結乾燥である。本発明の組成物は溶液状態であり、好適な薬剤学的に許容可能な賦形剤が、単位投与量注射型を提供するために伝達される前または伝達する時に添加及び/または混合される。望ましくは、本発明で使われる薬剤学的に許容可能な賦形剤は、高薬物濃度に好適であり、適当なフロー性を保持し、必要に応じて吸収が遅延される。
本発明の予防及び治療用組成物投与の最適の経路選択は、組成物内の活性分子の物理−化学的特性、臨床的状況の緊急性及び所望の治療用効果に対する活性分子のプラズマ濃度の関係を含むいろいろな因子によって影響される。例えば、本発明の結合分子は、インプラント及びマイクロカプセル化伝達システムを含む、調節された放出剤形の迅速な放出を防止した担体と共に製造される。エチレンビニルアセテート、多価無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸のような生分解性、生体適合性ポリマーが本発明に使われる。また本発明の結合分子は、抗体の不活性化を防止した物質または化合物でコーティングされるか、または共に投与される。例えば、本発明の結合分子は、好適な担体−リポソームまたは希釈剤−と共に投与される。
本発明の予防及び治療用組成物の投与方法は、経口及び非経口に分けられ、望ましい投与経路は、静脈内皮下または鼻腔が望ましいが、これらに限定されるものではない。
前記経口形態は、錠剤、トローチ剤、薬用ドロップス剤、水性または油性懸濁液剤、酸剤または分散顆粒剤、エマルジョン剤、剛性カプセル剤、軟性ゼラチンカプセル剤、シロップ剤またはエリクサー剤、ピール剤、糖衣錠、液剤、ゲル剤またはスラリー剤として製剤化される。これら剤形は、不活性希釈剤、顆粒化または崩解剤、結合剤、光沢剤、保存剤、着色剤、風味剤または甘味剤、植物性油またはミネラル油、湿潤剤及び増粘剤を含む薬剤学的賦形剤を含むが、これらに限定されるものではない。
前記非経口形態は、水性または非水性の等張性殺菌非毒性注射または注入溶液または懸濁液の形態である。溶液または懸濁液は、適用された投与量及び濃度で、受容体に非毒性の1,3−ブタンジオール、リンガー溶液、ハンクス溶液、等張性塩化ナトリウム溶液のような薬剤、オイル、脂肪酸、局所痲酔剤、保存剤、緩衝液、粘度または溶解度増加剤、水溶性抗酸化剤、油溶性抗酸化剤及び金属キレート化剤を含む。
また、本発明は、インフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子に標識物質を接合したコンジュゲートを含むインフルエンザAウイルス診断用組成物を提供する。
本発明の診断用組成物は、検出可能なモイエティ/薬剤のような少なくとも一つの検出可能な標識物質を含む。本発明の標識物質は、本発明のインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子に非共有的に連結され、また共有結合で前記結合分子に直接的に連結される。選択的に一つ以上の連結化合物によって前記結合分子に連結されてもよい。このような技術は、公知のものである。このような標識物質は、検出可能なモイエティ/薬剤としては、酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属、毒素及び非放射性パラマグネチック金属イオンからなる群から選択されたいずれか一つであることが望ましいが、これらに限定されるものではない。
また、本発明は、下記のような段階を含むインフルエンザAウイルス来由の疾患治療方法を提供する。インフルエンザAウイルスによって発生する疾患を持つ対象に、本発明のインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子を治療学的に有効な量に投与する段階。
本発明の治療方法において、インフルエンザAウイルスは、H1、H3、H5、H7及びH9サブタイプからなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とし、前記インフルエンザAウイルスH3サブタイプは、H3N2であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
本発明の治療方法において、当業者に周知の治療剤を共に投与する。
本発明の治療方法において、インフルエンザAウイルス来由の疾患は、新種インフルエンザ、大流行性インフルエンザ及び季節性インフルエンザからなる群から選択されたいずれか一つであるが、これらに限定されるものではない。
本発明の治療方法において、インフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子投与量は、最適の反応を提供するように調節される。投与量の範囲は、例えば0.01〜200mg/kgであり、望ましくは0.1〜150mg/kgであり、さらに望ましくは1〜100mg/kgであるが、これらに限定されるものではない。投与回数は、様々な時間にかけて分けて投与され、投与量は、治療的状況の緊急事態によって示されるところによって比例的に減少または増加し、これは、本発明で限定するものではなく、担当医者の権限によって変化する。
本発明の治療方法において、インフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子投与方法は、経口及び非経口に分けられ、望ましい投与経路は静脈内であるが、これに限定されるものではない。
また、本発明は、下記のような段階を含むインフルエンザAウイルス来由の疾患予防方法を提供する。対象に、本発明のインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子を治療学的に有効な量に投与する段階。
本発明の予防方法において、当業者に周知の予防剤を共に投与する。
本発明の予防方法において、インフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子投与量は、最適の反応を提供するように調節される。投与量の範囲は、例えば0.01〜200mg/kgであり、望ましくは0.1〜150mg/kgであり、さらに望ましくは1〜100mg/kgであるが、これらに限定されるものではない。投与回数は、様々な時間にかけて分けて投与され、投与量は、治療的状況の緊急事態によって示されるところによって比例的に減少または増加し、これは、本発明で限定するものではなく、担当医者の権限によって変化する。
本発明の予防方法において、インフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子の投与方法は、経口及び非経口に分けられ、望ましい投与経路は静脈内であるが、これに限定されるものではない。
また、本発明は、下記のような段階を含む患者のインフルエンザAウイルス感染有無の診断方法を提供する。1)サンプルと、本発明のインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子とを接触させる段階と、2)前記結合分子とサンプルとの反応を検出する段階、または1)サンプルと本発明の診断用組成物とを接触させる段階と、2)前記診断用組成物とサンプルとの反応を検出する段階。
本発明の診断方法において、前記インフルエンザAウイルスは、H1、H3、H5、H7及びH9サブタイプからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とし、前記インフルエンザAウイルスH3サブタイプは、H3N2であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
本発明の診断方法において、本発明の結合分子は、診断検出のために必要に応じて標識物質を接合させ、これは公知のものである。
本発明の診断方法において、前記サンプルは、対象の痰、唾、血液、汗、肺細胞、肺組織の粘液、呼吸器組織及び唾液からなる群から選択されたいずれか一つであることが望ましいが、これらに限定されず、当業者に周知の通常的な方法でサンプル準備が可能である。
本発明の診断方法において、前記反応検出方法は、放射免疫測定法(RIA)、酵素結合免疫吸収分析法(ELISA)、免疫蛍光法、免疫細胞化学、FACS、BIACORE及びウエスタンブルロッ分析のような均質及び異種性結合免疫分析からなる群から選択されたいずれか一つであるが、これらに限定されず、当業者に周知の検出方法ならば、本発明に使用できる。
また、本発明は、1)本発明のインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ結合分子と、2)容器を含むインフルエンザAウイルス診断用キットとを提供する。
さらに本発明は、1)本発明のインフルエンザAウイルス診断用組成物と、2)容器を含むインフルエンザAウイルス診断用キットとを提供する。
本発明の診断キットにおいて、前記インフルエンザAウイルスは、H1、H3、H5、H7及びH9サブタイプからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とし、前記インフルエンザAウイルスH3サブタイプは、H3N2であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
本発明の診断用キットにおいて、前記2)の容器には、固体担体が含まれる。本発明の結合分子は、固体担体に取り付けられ、このような固体担体は、多孔性または非多孔性、平面または非平面である。
<実施例>
<実施例1:インフルエンザ回復患者の血液からのPBMC分離準備>
回復患者群は、新種インフルエンザ確診後2〜4週となった患者であり、血液内に新種インフルエンザウイルス(H1N1)が存在していないと確認され、かつ新種インフルエンザウイルスに対する抗体を保有している志願者で構成され、これは、臨床試験審査委員会(IRB)の承認をもらって行われた。これら患者群の特徴は、次の通りである。(1)季節インフルエンザを対するワクチンを接種されていない。(2)他の伝染性ウイルス、すなわち、HBsAgに対して陰性反応を、anti−HCV抗体及びanti−HIV抗体に対して陰性反応を示す。(3)血漿(plasma)で、インフルエンザAウイルスH1N1サブタイプのRT−PCRに陰性反応を示す。(4)血清で、インフルエンザAウイルスH1N1サブタイプの単量体(monomeric)HA(H1N1)に対するELISAで1:160以上の力価(titer)を示す。志願者から約100mlの全血を収得し、lymphoprep(商標)(Axis-Shield,Norway,1114545)方法を使ってPBMC(peripheral blood mononuclear cell)を分離した。分離されたPBMCは、燐酸緩衝溶液で3回洗浄した後、KM banker II(Cosmobio,Japan,KOJ-16092010)冷凍培地(freezing medium)で2×10cells/ml濃度に合わせ、液体窒素タンク(Liquid Nitrogen Tank)に保管された。
<実施例2:単一クローン抗体の1次選別>
抗原特異抗体を分泌するB細胞の選別方法は、Jinら(Jin A.et al.,2009.Nat Med.15,1088-1092)によって説明された方法を用いた。簡略に、前記実施例1で分離されたPBMCを、用意されたマイクロアレイチップ上のそれぞれのウェルに1つずつ添加した。単一細胞から分泌された抗体は、予めコーティングされた抗ヒトIgG抗体によって確認された。これを通じて選別された抗体分泌細胞(antibody secreting cell)を対象として標識されたHA抗原を用いて、HAに結合する抗体の分泌有無を確認した。確認された個別抗体分泌細胞から、逆転写重合酵素連鎖反応(RT−PCR)方法を用いて、抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子の全体配列を確保した。確保された重鎖及び軽鎖DNAをpcDNA3.1(+)発現ベクター(in vitrogen,USA,V790-20)に挿入し、抗体の軽鎖及び重鎖をそれぞれ生産する発現ベクターを製造した後、前記製造された軽鎖及び重鎖生産発現ベクターをCHO細胞に形質感染させた。次いで、形質感染されたCHO細胞で生産された抗体を用いて、下記の実施例3に記載のHA−ELISA方法を通じてHAに結合される抗体82個を1次的に選別した。この時には、抗体サンプルを連続して希釈せず、HAとの反応を示すすべての抗体を1次的に選別した。
<実施例3:単一クローン抗体のHA結合能の検証>
1次的に選別された82個の抗体から、H3N2インフルエンザウイルスのHAへの結合力が高い単一クローン抗体を2次的に選別するために、単量体HAのサブユニット(HA1)及び三量体HAを確保してHA−ELISAを進めた。インフルエンザAウイルスの再組み合わせHA1サブユニット(11056−V08H1)は、Sino Biological Inc.(China)から購入した。購入されたHA1サブユニットは、C−末端にヒスチジン(polyhistidine)残基を含むHAのN−末端分節(Met1−Arg345)で構成されており、形質感染されたヒト細胞から生産された。再組み合わせ三量体HA(FR−61)は、IRR(Influenza Reagent Resource,USA)から提供した。前記三量体HAは、C−末端ペプチドにトロンビン切断部位、三量体形成誘導ドメイン(trimerizing domain;foldon)及び6個のヒスチジン残基を含む構造であり、バキュロウイルスシステムを用いて生産された。
抗体の抗原(HA)との反応性は、抗原(HA)及び抗体を用いた酵素結合免疫吸収分析法(ELISA)によって測定された。詳細な方法は、下記の通りである。先ず、50ulの三量体HA抗原(250ng/ml)を、それぞれ96−ウェルマイクロタイタープレート(Nunc,Denmark,449824)のウェルに吸着させた。前記プレートを、1%ウシ血清アルブミン(bovine serum albumin,BSA)が含有された燐酸緩衝溶液(Teknova,USA,D5120)で処理してブロッキングした後、3倍ずつ連続して希釈した抗体サンプル(starting concentration:1ug/ml)をプレートの各ウェルに加えた。次いで、室温で1時間反応(incubation)させた後、過酸化酵素の標識された塩素の抗ヒトガンマ抗体(Zymed,USA,62.8420)で感知した。室温で1時間反応後、テトラメチルベンジジン(TMB,Sigma-Aldrich,USA,T0440)と反応させ、本反応を1N HClで中止させた。プレートリーダ(Spectramax plus 384,Molecular Device)を使って450/570nmで吸光度を測定し、グラフパッドプリズムプログラム(GraphPad Software Inc.USA)を用いて、抗原−抗体間反応性をグラフで示した。
大多数の抗体がH3N2のHAに対して結合していないが、図1に示されたようにCT129、CT135、CT147、CT149、CT164及びCT166抗体は高い反応性を示した。特にこれらは、三量体HAにはよく結合したが、HA1サブユニットには結合していない。これは、選別された抗体が、既知のHA1部分にあるエピトープではなく、HA1とHA2分節の境界面やHA2に結合する可能性と、正常組織(conformation)とを持っているHAのみに結合する可能性を示唆している。
これに前記図1の結果に基づいて、1次的に選別された82個の抗体のうち、H3N2インフルエンザウイルスの三量体HAに高い反応性を示す抗体6個(CT129、CT135、CT147、CT149、CT164及びCT166抗体)を2次的に選別し、これら抗体の発現量を高めるためにこれら抗体遺伝子を、pcDNAベクターからセルトリオン固有の発現ベクターであるMarEx発現ベクターに、次のように再クローニングを進めた。再クローニング後、これら抗体遺伝子を含むMarEx発現ベクターを用いて、マイクロ中和試験法(Microneutralization test;MN test)及び血球凝集抑制試験(Hemagglutination inhibition test:HI test)に必要な抗体を生産した。
2次的に選定された6個抗体の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子をそれぞれ含むオリジナルのpcDNAベクターに、制限酵素Nhe I及びPme Iを処理して重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を確保した後、確保された重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を、それぞれ同じ制限酵素で処理されたpCT145ベクター及びpCT147ベクターに挿入した。pCT145及びpCT147ベクターは、それぞれ抗体の重鎖及び軽鎖をクローニングするために製作されたセルトリオン固有のベクターである(図2)。次いで、重鎖転写単位(プロモータ−重鎖遺伝子−ポリエー)と軽鎖転写単位(プロモータ−軽鎖遺伝子−ポリエー)とを共に含む発現ベクターを製作するために、重鎖遺伝子を含むpCT145ベクターに制限酵素Pac I及びAsc Iを処理して重鎖転写単位を確保した後、軽鎖遺伝子を含むpCT147ベクターに同じ制限酵素を処理して重鎖転写単位を挿入した。次いで、制限酵素を用いて、重鎖転写単位と軽鎖転写単位とを同時に含むベクターを選別した(図3)。選別されたベクターは、Endofree plasmid maxi kit(QIAGEN,Germany,12362)を用いて抽出され、抽出されたDNAのうち一部を用いて塩基配列分析を行い、最終的に抗体の塩基配列を確認した。
次いで、抽出された抗体のDNAを用いて、浮遊培養中のセルトリオンで製作したF2N細胞株に形質感染して単一クローン抗体を生産する一時的細胞株を製造し、方法は下記の通りである。細胞内の一時的形質感染のために陽イオン性ポリマー(cationic polymer)であるFreeStyle(商標)Max(In vitrogen,USA,16447-100)を使い、製造社の使用マニュアルによって形質感染を行った。形質感染の前日、EX−CELL 293 Serum free media(SAFC,LIK,14571C,以下“EX−CELL 293培地”と称する)で培養されたF2N細胞を遠心分離し、Modified EX−CELL 293培地(SAFC,LIK,65237,オーダーメイド)を用いて、ml当り1×10個の細胞濃度で250mlの三角フラスコに80ml、または1lの三角フラスコに200mlを接種した。形質感染の当日に80ml接種した場合、単一クローン抗体をコーディングするDNA 100μg及びFreeStyle(商標) Max試薬100μlを、それぞれOptiPRO SFM II(In vitrogen,USA,12309)培地を用いて1.6mlのvolumeに希釈した後、軽く混合した。200mlを接種した場合、DNA 250μg及びFreeStyle(商標) Max試薬250μlを、それぞれOptiPRO SFM II培地を用いて4mlの容積に希釈した後、軽く混合した。それぞれ混合した直後、希釈されたFreeStyle(商標) Max試薬溶液をDNAが希釈されている溶液と混合した後、常温で19分反応させた。常温で19分反応させる間に、前日接種されたF2N細胞を、新鮮なModified EX−CELL 293培地を用いて0.8×10個の細胞濃度に希釈し、19分反応後、DNAとFreeStyle(商標) Max試薬との混合溶液をF2N細胞に処理することで形質感染を進めた。形質感染の翌日、同量のEX−CELL 293培地を形質感染された細胞に添加して7〜8日間培養することで、単一クローン抗体を生産した。
<実施例4:ウイルスに対する生体外(in vitro)中和活性の調査>
HA−ELISAを進めた6個の抗体を用いて多様なインフルエンザウイルスに対する生体の外中和活性を確認するために、MN(microneutralization)分析を行った。
<実施例4−1:MDCK細胞株培養及びウイルス濃度の決定>
MDCK(Madin-Darby canine kidney)は、London line(MDCK−L)を使った。MDCK細胞株は、10%のFBS(Atlas Biologicals,USA,F0500A)、1Xペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco,USA,15140)、25mMのHEPES(Gibco,USA,15630)及び2mMLのグルタミン(Gibco,USA,25030)が含まれたDMEM(Gibco,USA,11965)培地を用いて、37℃の5%CO湿潤(humidified)細胞培養器で培養された。
ウイルス濃度は、細胞基盤ELISA方法で定量し、TCID50(Median tissue culture infective dose)を求めた。前記方法は、下記のように進められた。先ず、ウイルス保存液(Virus stock)を、ウイルス希釈剤(virus diluent)[DMEM(Gibco,USA)、3%のBSA(Gibco,USA,15260)、1Xペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco,USA)、25mMのHEPES(Gibco,USA)]で10倍ずつ連続希釈し、96ウェルプレートのウェルに100μlずつ添加した。陰性対照群(Negative control)としては、ウイルスが含まれていないウイルス希釈剤(virus diluent)を添加した。次いで、培養中のMDCK細胞株にトリプシンを処理して培養容器から分離した後、MDCK培養培地を処理してトリプシンを中和した。燐酸緩衝溶液を用いて2回洗浄した後、ウイルス希釈剤で細胞ペレットを希釈して5×10cells/ml濃度に合わせた。ウイルスが入っている96ウェルプレートに3〜4μg/ml TPCK−トリプシン(Sigma,USA)を入れた直後、前記MDCK細胞株100μlずつ添加して37℃の5% CO湿潤細胞培養器で20時間反応させた。反応させたプレートを燐酸緩衝溶液で1回洗浄した後で冷凍させたアセトン:燐酸緩衝溶液(PBS)(80:20)混合液を各ウェルに200μlずつ添加して8分間固定させた後、常温で20分間乾燥した。各プレートに燐酸緩衝溶液をウェル当り200μl添加して2回洗浄し、ビオチン化されたanti−NP(nuclear protein)単一クローン抗体(Milipore,USA,MAB8257B)を、1%のBSAが含まれた燐酸緩衝溶液(0.1% Tween−20)で2,000倍希釈してウェル当り100μlを添加し、常温で1時間反応させた。ウェル当り200μlの燐酸緩衝溶液で3回洗浄した後、1%のBSAが含まれた燐酸緩衝溶液に20,000倍希釈されたストレプトアビジン−HRP接合抗体をウェル当り100μlずつ添加し、常温で1時間反応させた。燐酸緩衝溶液で4回洗浄した後、OPD(Sigma,USA,P8287)溶液をウェル当り100μl添加して常温で10分間発色させ、3M HClをウェル当り50μl処理して反応を終了させた後、OD490を測定した。Reed&Muench(The American 1938)による方法を用いて測定されたOD490でTCID50を計算した。
<実施例4−2:MN分析法>
各抗体は、ウイルス希釈剤を用いて1次的に10μg/ml濃度で合わせた。この濃度を初期濃度とし、再びウイルス希釈剤を用いて連続して2倍ずつ希釈し、96ウェルプレートのウェル当り50μlずつ添加し、100 TCID50に該当する濃度のウイルスをウェル当り50μlずつ添加して、37℃の5% CO湿潤細胞培養器で1時間反応させた。次いで、3〜4μg/ml濃度のTPCK−トリプシン(Sigma,USA,T1426)を各ウェルに入れ、かつ100μlずつの処理されたMDCK細胞株を入れた後、37℃の5% CO湿潤細胞培養器で20時間反応させた。20時間反応させた後の過程は、実施例4−1に言及されたウイルス定量化に使われた方法と同じ方法でMN分析を進め、OD490数値を測定した。細胞のみ入れたウェルのOD490数値より高い数値を示すウェルは、ウイルスに感染されたと判断した。各抗体別にウイルス抗原が検出されていない様々なOD490数値のうち抗体の最も低い濃度(μg/ml)を表1に示し、この抗体の濃度が低ければ低いほど、ウイルスの中和活性が高いことを意味する。
H3サブタイプのインフルエンザウイルスに対する6個候補抗体のMN分析結果、CT129抗体は、HA−ELISA結果として高い結合力を示したが、実験に使った3種のウイルスに対して中和活性を示していない。CT135抗体は、2種のH3N2ウイルス(A/Hong Kong/68及びA/Brisbane/10/07)に対して中和活性を示し、CT147、CT149、CT164及びCT166抗体は、実験した3種のH3N2ウイルス(A/Wisconsin/67/05、A/Hong Kong/68及びA/Brisbane/10/07)に対して中和活性を示した。
前記抗体のうちCT149抗体を任意に選択して多様なインフルエンザウイルスに対する中和活性を、MN分析法を用いて検証した(表2)。
CT149抗体は、実験に使った多様なH1N1、H5N1、H7N2、H9N2、及びH3N2サブタイプのインフルエンザウイルスに対して中和活性を示した。
<実施例5:ウイルスによる赤血球凝集反応に対する抗体の抑制能力の調査>
v−bottom 96−ウェルプレート上で抗体を2倍ずつ連続して希釈し、4倍のHAユニットのウイルスを添加して混合させた。混合したプレートを常温で30分間反応させた後、それぞれのウェルに1% avian red blood cellを添加した。血球凝集抑制エンドポイント(end point)は、凝集反応が観察されない最も低い抗体濃度と定めた。
その結果、実験したすべての抗体が、試験に使ったH3N2サブタイプのウイルス(A/Brisbane/10/07)に対して、血球凝集を高濃度(>20μg/ml)でも抑制できなかった(表3)。
<実施例6:動物実験を通じた抗体のインフルエンザインフルエンザウイルスの予防及び治療効果の調査>
<実施例6−1:マウスを通じる抗体のインフルエンザインフルエンザウイルスの予防及び治療効果の調査>
CT149抗体がマウスにおいて、H3N2ウイルスの予防及び治療効果を持つかどうかを調べるために、次のように実験を進めた。5匹で構成されたマウスの各グループに、鼻腔を通じて10LD50のA/Hong Kong/68ウイルスを感染させた。CT149抗体は、kg当たり10または20mgの量をウイルス感染24時間前、またはウイルス感染後24時間や48時間後に腹腔内注射を通じてマウスに投与された。
実験結果、図4のように、陰性対照群の場合にウイルス感染11日目に全てのマウスが死亡したことに比べて、CT149抗体をウイルス感染24時間前に10mg/kgまたは20mg/kg注射する場合、全てのマウスが生存してCT149抗体がウイルス感染において予防効果があるということが分かった。CT149抗体の治療効果を確認するためにウイルス感染後に抗体を注射する場合、48時間後に10mg/kgの抗体を投与した時に20%のマウスが死亡したこと以外に、24時間後に10mg/kgや20mg/kg投与、または48時間後に20mg/kg投与した時には全てのマウスが生存して、CT149抗体がウイルス感染に対する治療効果があるということが分かった。
<実施例6−2:フェレットを通じる抗体のインフルエンザインフルエンザウイルスの治療効果の調査>
ヒトと類似した感受性及び症状を示してインフルエンザ研究に多く使われているフェレットを用いて、CT149抗体がH3N2及びH5N1ウイルスに対して治療効果を持つかどうかを調査するために、次のように実験を進めた。
各試験群は、9匹で構成され、H3N2(A/Hong Kong/68)インフルエンザウイルスの場合に1×10 EID50/mlを、H5N1(A/Vietnam/1203/04)インフルエンザウイルスの場合に1×10 EID50/mlを鼻腔及び機関に接種した。ウイルス接種1日後にインフルエンザと関係ない陰性対照群CT−P6抗体30mg/kgあるいはCT149抗体15mg/kgや30mg/kgを単回単独静脈注射するか、またはCT149抗体30mg/kgを毎日3日間単独静脈注射した。
ウイルス接種後1、3、5、7、9日目に各試験群から抗生剤を含むPBS溶液1mlを用いてフェレットの鼻腔洗浄液を採取し、3、5、9日目には鼻腔洗浄液を採取した後、各群当たり3匹ずつのフェレットを犠牲させて肺組織を確保し、ウイルス濃度を有精卵を用いて測定した。有精卵を用いたウイルス滴定試験のために鼻腔洗浄液は遠心分離し、肺組織は、抗生剤を含むPBS溶液1mlにフェレットの肺組織1gを入れて粉砕機を用いて破砕、遠心分離して上澄液を確保した後、抗生剤を含む溶液で10倍ずつ段階別に希釈した。希釈された上澄液を10〜13日齢の有精卵に接種及び48時間培養後、有精卵の尿膜液50μlを取って同量の0.5%ニワトリの赤血球と混合後、30分間反応させた後で血球凝集反応如何によってウイルスを滴定した。
H3N2(A/Hong Kong/68)インフルエンザウイルス接種24時間後に陰性対照群(CT−P6)と、CT149を投与した実験動物フェレットとのウイルス力価を測定した結果、陰性対照群の場合にウイルス接種1日後に約log4 EID50/ml以上のウイルス力価が観察され、接種5日後まで鼻腔洗浄液及び肺組織でウイルス力価が維持または増加したが、7日以後にはウイルスが検出されていない。CT149を投与した群では、ウイルス接種1日後に陰性対照群を投与した群と類似したウイルス力価を示したが、3日以後にはウイルスが減少していて9日にはウイルスが全く検出されず、ウイルスの除去が早く起きることが分かった。特に肺組織でウイルスの力価減少が、投与抗体量の増加によってさらに早く起きる傾向を示した(図5)。
H5N1(A/Vietnam/1203/04)インフルエンザウイルス接種24時間後に陰性対照群(CT−P6)と、CT149を投与した実験動物フェレットとのウイルス力価を測定した結果、陰性対照群の場合にウイルス接種1日後に約log2.4EID50/ml以上のウイルス力価が観察され、接種5日後まで鼻腔洗浄液及び肺組織でウイルス力価が増加することが観察された。接種後5日目に対照群内の6匹のフェレットのうち1匹のみ生き残り、5日目に鼻腔洗浄液内のウイルス力価は一匹のみで測定され、9日目には既に全てのフェレットが死亡してウイルス力価を測定できなかった。CT149を投与した群では、3日目からウイルス力価が減少し始め、9日目にはウイルスが全く検出されず、ウイルスの除去が早く起きることが分かり、抗体の投与量によってさらに早く減少する傾向を示した。CT149投与群では15mg/kgの単回投与群で1匹のフェレットのみ接種7日目に死亡し、CT149がインフルエンザウイルスに対して治療効果があるということが分かった(図6)。

Claims (26)

  1. 下記ポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのポリペプチド配列を含むことを特徴とするインフルエンザAウイルスに対する中和活性を持つ抗体または抗体断片
    カバット方法によって、配列番号1で表されるCDR1領域、配列番号2で表されるCDR2領域及び配列番号3で表されるCDR3領域を含む軽鎖及び配列番号4で表されるCDR1領域、配列番号5で表されるCDR2領域及び配列番号6で表されるCDR3領域を含む重鎖で構成される抗体または抗体断片と、
    カバット方法によって、配列番号7で表されるCDR1領域、配列番号8で表されるCDR2領域及び配列番号9で表されるCDR3領域を含む軽鎖及び配列番号10で表されるCDR1領域、配列番号11で表されるCDR2領域及び配列番号12で表されるCDR3領域を含む重鎖で構成される抗体または抗体断片と、
    カバット方法によって、配列番号13で表されるCDR1領域、配列番号8で表されるCDR2領域及び配列番号9で表されるCDR3領域を含む軽鎖及び配列番号10で表されるCDR1領域、配列番号14で表されるCDR2領域及び配列番号6で表されるCDR3領域を含む重鎖で構成される抗体または抗体断片と、
    カバット方法によって、配列番号15で表されるCDR1領域、配列番号16で表されるCDR2領域、及び配列番号9で表されるCDR3領域を含む軽鎖及び配列番号10で表されるCDR1領域、配列番号17で表されるCDR2領域及び配列番号12で表されるCDR3領域を含む重鎖で構成される抗体または抗体断片
  2. 前記抗体または抗体断片は、配列番号37で表されるポリペプチド配列を含む軽鎖、及び配列番号38で表されるポリペプチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする、請求項1に記載の抗体または抗体断片
  3. 前記抗体または抗体断片は、配列番号39で表されるポリペプチド配列を含む軽鎖、及び配列番号40で表されるポリペプチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする、請求項1に記載の抗体または抗体断片
  4. 前記抗体または抗体断片は、配列番号41で表されるポリペプチド配列を含む軽鎖、及び配列番号42で表されるポリペプチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする、請求項1に記載の抗体または抗体断片
  5. 前記抗体または抗体断片は、配列番号43で表されるポリペプチド配列を含む軽鎖及び配列番号44で表されるポリペプチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする、請求項1に記載の抗体または抗体断片
  6. 前記抗体または抗体断片は、インフルエンザAウイルスH1、H3、H5、H7及びH9サブタイプからなる群から選択されたいずれか一つに対して中和活性を持つことを特徴とする、請求項1に記載の抗体または抗体断片
  7. 下記ポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含むことを特徴とするインフルエンザAウイルスに対する中和活性を持つ抗体または抗体断片
    カバット方法によって、配列番号18で表されるCDR1領域、配列番号19で表されるCDR2領域及び配列番号20で表されるCDR3領域を含む軽鎖及び配列番号21で表されるCDR1領域、配列番号22で表されるCDR2領域及び配列番号23で表されるCDR3領域を含む重鎖で構成される抗体または抗体断片と、
    カバット方法によって、配列番号24で表されるCDR1領域、配列番号25で表されるCDR2領域及び配列番号26で表されるCDR3領域を含む軽鎖及び配列番号27で表されるCDR1領域、配列番号28で表されるCDR2領域及び配列番号29で表されるCDR3領域を含む重鎖で構成される抗体または抗体断片と、
    カバット方法によって、配列番号30で表されるCDR1領域、配列番号25で表されるCDR2領域及び配列番号26で表されるCDR3領域を含む軽鎖及び配列番号31で表されるCDR1領域、配列番号32で表されるCDR2領域及び配列番号33で表されるCDR3領域を含む重鎖で構成される抗体または抗体断片と、
    カバット方法によって、配列番号34で表されるCDR1領域、配列番号35で表されるCDR2領域及び配列番号26で表されるCDR3領域を含む軽鎖及び配列番号31で表されるCDR1領域、配列番号36で表されるCDR2領域及び配列番号29で表されるCDR3領域を含む重鎖で構成される抗体または抗体断片
  8. 前記抗体または抗体断片は、配列番号45で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む軽鎖及び配列番号46で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む重鎖で構成されることを特徴とする、請求項7に記載の抗体または抗体断片
  9. 前記抗体または抗体断片は、配列番号47で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む軽鎖及び配列番号48で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む重鎖で構成されることを特徴とする、請求項7に記載の抗体または抗体断片
  10. 前記抗体または抗体断片は、配列番号49で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む軽鎖及び配列番号50で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む重鎖で構成されることを特徴とする、請求項7に記載の抗体または抗体断片
  11. 前記抗体または抗体断片は、配列番号51で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む軽鎖及び配列番号52で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む重鎖で構成されることを特徴とする、請求項7に記載の抗体または抗体断片
  12. 前記抗体または抗体断片は、インフルエンザAウイルスH1、H3、H5、H7及びH9サブタイプからなる群から選択されたいずれか一つに対して中和活性を持つことを特徴とする、請求項7に記載の抗体または抗体断片
  13. 前記抗体または抗体断片は、Fab切片、Fv切片、ディアボディ(diabody)、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする、請求項1または7に記載の抗体または抗体断片
  14. 請求項1または7に記載のインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ抗体または抗体断片コードする、単離された核酸分子。
  15. 請求項14に記載の単離された核酸分子が挿入された発現ベクター。
  16. 宿主細胞に、請求項15に記載の発現ベクターが形質感染されたインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ抗体または抗体断片生産細胞株。
  17. 宿主細胞は、CHO細胞、F2N細胞、BHK細胞、SP2/0細胞、NS0細胞及びHEK293細胞からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする請求項16に記載のインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ抗体または抗体断片生産細胞株。
  18. 請求項1または7に記載のインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ抗体または抗体断片を含む組成物。
  19. 請求項1または7に記載のインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ抗体または抗体断片を含むインフルエンザAウイルス由来の疾患の予防及び治療用組成物。
  20. 請求項1または7に記載のインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ抗体または抗体断片に標識物質を接合したコンジュゲートを含むインフルエンザAウイルス診断用組成物。
  21. 前記標識物質は、酵素、ルシフェラーゼ及び放射性同位元素、毒素からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項20に記載のインフルエンザAウイルス診断用組成物。
  22. 請求項1821のいずれか一項に記載の組成物の製造における、請求項1または7に記載のインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ抗体または抗体断片の使用。
  23. 前記インフルエンザAウイルスは、H1、H3、H5、H7及びH9サブタイプであることを特徴とする、請求項22に記載の使用。
  24. 1)請求項1または7に記載のインフルエンザAウイルスに中和活性を持つ抗体または抗体断片と、
    2)容器と、を含むインフルエンザAウイルス診断用キット。
  25. 1)請求項20に記載のインフルエンザAウイルス診断用組成物と、
    2)容器と、を含むインフルエンザAウイルス診断用キット。
  26. 前記インフルエンザAウイルスは、H1、H3、H5、H7及びH9サブタイプであることを特徴とする、請求項24または25に記載のインフルエンザAウイルス診断キット
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