JPH05133956A - イムノクロマトグラフ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 クロマトグラフ媒体上において、移動相を構
成する検出用粒子が十分良好に展開移動することがで
き、しかも長期間保存することによっても性能が低下せ
ず、試料中の被検出物質の濃度が低いときにも十分に検
出することのできるイムノクロマトグラフ法を提供する
こと。 【構成】 試料中の被検出物質と結合可能な固定化試薬
を含む反応部位を有するクロマトグラフ媒体上におい
て、被検出物質と結合可能な検出試薬によって感作され
た検出用粒子をクロマトグラフ的に移動させると共に、
試料を反応部位に接触させ、反応部位において被検出物
質と固定化試薬と検出試薬とが結合することにより、検
出用粒子が凝集することを利用して被検出物質を検出す
るイムノクロマトグラフ法において、酸素原子含有極性
基を有するビニル系水溶性ポリマーの存在下で検出用粒
子をクロマトグラフ的に移動させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、動物、特にヒトの病気
の診断、妊娠の診断、便潜血の有無の判定、ＨＢｓ検査
などを目的として、血液、唾液、尿、糞便、汗などの動
物由来物質を検査対象としてこれに含有される被検出物
質を、抗原−抗体反応を利用して検出する免疫測定法の
一種であるイムノクロマトグラフ法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在において、抗原とこれに対する抗体
による特異的反応を利用して特定の抗原または抗体より
なる被検出物質を検出する免疫測定法としては、試料中
の被検出物質と、感作処理により検出用粒子に結合させ
た抗体または抗原とを免疫反応により結合させ、これに
よって生ずる検出用粒子の凝集状態を測定する凝集法が
簡便な方法であり、特に結果の目視判定が可能である点
で一般的に用いられている方法である。

【０００３】また、標識物質により標識した抗体、抗原
またはこれらによって感作された担体を免疫反応により
試料中の被検出物質に結合させ、この結合状態にある標
識物質を測定する方法も知られており、標識物質として
放射性同位元素を用いる放射免疫測定法、酵素を用いる
酵素免疫測定法、螢光物質を用いる螢光免疫測定法など
も採用されている。

【０００４】これらの免疫測定法では、競合型反応また
はサンドイッチ型反応が広く利用されているが、サンド
イッチ型反応による測定法の１つとしてイムノクロマト
グラフ法が知られており、その典型例においては、例え
ば試料中の抗原よりなる被検出物質を検出するために、
以下のような操作が行われる。

【０００５】（１）被検出物質である抗原に対する抗体
を固定化試薬とし、この固定化試薬により感作させたコ
ロイド粒子をクロマトグラフ媒体の所定の部位に所定の
形で塗布し、あるいは当該固定化試薬そのものを直接塗
布することにより、クロマトグラフ媒体の適宜の位置に
反応部位を形成させる。 （２）一方、被検出物質と特異的に結合可能な抗体を、
標識された検出用粒子または標識可能な検出用粒子（以
下これらを単に「標識粒子」と記す。）に感作させ、こ
の感作された標識粒子を展開用液体媒体中に分散させる
ことにより、移動相を構成する分散液を調製する。 （３）移動相である感作された標識粒子の分散液を、試
料と共に、クロマトグラフ媒体上をクロマトグラフ的に
移動させる。

【０００６】以上の操作により、クロマトグラフ媒体に
形成された反応部位において、被検出物質である抗原
が、反応部位に固定された固定化試薬である抗体と結合
することにより捕捉されると共に、この抗原と、標識粒
子に固定された検出試薬である抗体とによって抗原−抗
体反応が生ずる結果、当該反応部位においては固定化試
薬（抗体）−被検出物質（抗原）−検出試薬（抗体が結
合した標識粒子）の三者のサンドイッチ型結合体が生成
し、結局、試料中に被検出物質が存在するときに反応部
位に標識粒子が結合することによって所定のジグナル形
が現れ、これによって被検出物質の検出がなされる。

【０００７】このようなイムノクロマトグラフ法におい
ては、移動相として標識粒子の分散液が使用されるが、
この分散液中の標識粒子は、凝集することなしにクロマ
トグラフ媒体上を確実に展開移動して反応部位に到達す
ることが必要不可欠である。このため、イムノクロマト
グラフ法における移動相の分散液については、検出用粒
子の周りに保護層を形成して当該検出用粒子の分散状態
を安定化する適宜の分散安定剤が当該分散液に含有せし
められている。

【０００８】従来、このような検出用粒子の分散液のた
めの分散安定剤としては、例えば蛋白質、多糖類、界面
活性剤などが用いられており、具体的には、例えばゼラ
チン、カゼイン、牛血清アルブミン、アラビアゴム、デ
キストラン、でんぷん、メチルセルロース、ポリリジ
ン、ポリプロリン、ポリエチレングリコールなどが知ら
れている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな分散安定剤が分散液に添加されると、通常、分散液
の粘度が増大し、その結果、クロマトグラフ媒体上にお
いて、移動相である標識粒子が十分に展開移動しなくな
るという問題点がある。

【００１０】例えば、染色することによって自由に色調
構成を選ぶことができる点で好ましい合成高分子からな
る検出用粒子による標識粒子の分散液にゼラチンなどの
蛋白質よりなる分散安定剤を添加すると、当該標識粒子
の展開移動性が著しく阻害されてしまい、イムノクロマ
トグラフ法を実施することができない。

【００１１】また、分散安定剤として多糖類や界面活性
剤を用いた場合には、標識粒子の展開が不可能ではない
にしてもきわめて不十分であり、また界面活性剤によっ
ては、特に長期間保存すると感作に用いた抗体の脱着ま
たは失活が生じ易く、例えば試料中の被検出物質の濃度
が低い場合にはその検出が困難となる、という問題があ
る。

【００１２】本発明は、以上の事情に基づいてなされた
ものであって、その目的は、クロマトグラフ媒体上にお
いて移動相を構成する検出用粒子が十分良好に展開移動
することができ、しかも長期間保存することによっても
性能が低下せず、従って試料中の被検出物質の濃度が低
いときにも十分にこれを検出することのできるイムノク
ロマトグラフ法を提供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明のイムノクロマト
グラフ法は、試料中の検出すべき被検出物質と結合可能
な固定化試薬を含む少なくとも１つの反応部位を有する
クロマトグラフ媒体を固定相として用い、このクロマト
グラフ媒体上において、前記被検出物質と結合可能な検
出試薬によって感作された、検出用粒子が分散されてな
る分散液を移動相として当該検出用粒子をクロマトグラ
フ的に移動させると共に、前記試料を前記反応部位に接
触させ、これにより、前記反応部位において、前記試料
中に存在する被検出物質が前記固定化試薬に結合すると
共にこの被検出物質に前記検出試薬が結合することによ
り、前記移動相を構成する検出用粒子が特異的に結合し
て捕捉されることを利用して前記被検出物質を検出する
イムノクロマトグラフ法において、前記移動相を構成す
る検出用粒子を、酸素原子含有極性基を有するビニル系
水溶性ポリマーの存在下においてクロマトグラフ媒体上
をクロマトグラフ的に移動させることを特徴とする。

【００１４】

【作用】本発明の方法によれば、移動相を構成する標識
粒子のクロマトグラフ媒体上における展開移動を、酸素
原子含有極性基を有するビニル系水溶性ポリマーの存在
下において行わせることにより、当該標識粒子を確実に
かつ速やかに展開移動させることができ、しかも当該標
識粒子は検出試薬によって感作されたものであるが、そ
の感作による効果が長期間にわたって損なわれることが
なく、従ってクロマトグラフ媒体上の反応部位において
被検出物質との抗原−抗体反応が確実に生じ、その結
果、試料中の被検出物質の濃度が低い場合にも、短時間
のうちにかつ確実に当該被検出物質を検出することがで
きる。

【００１５】本発明において、酸素原子含有極性基を有
するビニル系水溶性ポリマーは、具体的には、検出試薬
が結合された標識粒子の分散液中に添加する手段によ
り、またはクロマトグラフ媒体における移動相の展開移
動経路上に存在させる手段により、適用される。これら
の２つの手段は、いずれも単独で有効であるが、両手段
を併用することもできる。

【００１６】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明の一態様においては、イムノクロマトグラフ法にお
ける移動相を構成する標識粒子の分散液に、酸素原子含
有極性基を有するビニル系水溶性ポリマーを、濃度が例
えば０．００１〜２５重量％となる割合で添加する。こ
の分散液は、その pＨが４〜９、特に５〜８の範囲内に
あることが好ましい。

【００１７】〔酸素原子含有極性基を有するビニル系水
溶性ポリマー〕本発明においては、酸素原子含有極性基
を有するビニル系水溶性ポリマーが用いられる。この酸
素原子含有極性基を有するビニル系水溶性ポリマーとし
ては、ビニルピロリドン、ビニルアルコール、ビニルメ
チルエーテル、（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メ
タ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、ヒドロキシ
アルキル（メタ）アクリレートなどの酸素原子含有極性
基を有する水溶性ビニル系モノマー、好ましくは酸素原
子含有極性基を有する非イオン性水溶性ビニル系モノマ
ーの二重結合が開裂した構造単位を有するポリマーを挙
げることができ、特にビニルピロリドンの二重結合が開
裂した構造単位を有するポリマーが好ましい。

【００１８】これらのビニル系水溶性ポリマーは、本発
明の効果が損なわれない程度に、酢酸ビニル、アルキル
（メタ）アクリレートなどの他のビニル系モノマーが、
例えば５０モル％以下、好ましくは３０モル％以下、特
に好ましくは１５モル％以下の割合で共重合されたもの
であってもよい。

【００１９】これらのビニル系水溶性ポリマーの具体例
としては、ポリビニルピロリドン、ジメチルアクリルア
ミド／ビニルピロリドン共重合体（ジメチルアクリルア
ミドの共重合割合が５０モル％以下のもの）、ビニルア
ルコール／ビニルピロリドン共重合体（ビニルアルコー
ルの共重合割合が５０モル％以下のもの）、酢酸ビニル
／ビニルピロリドン共重合体（酢酸ビニルの共重合割合
が２０モル％以下のもの）などを挙げることができる。

【００２０】これらのビニル系水溶性ポリマーの分子量
は、通常１万〜８０万、特に３万〜５０万であることが
好ましい。また、分散液における当該ビニル系水溶性ポ
リマーの濃度は０．００１〜２５重量％、特に０．０１
〜２０重量％であることが好ましい。このビニル系水溶
性ポリマーが添加された分散液には、更に少量の分散安
定剤を添加することができる。この分散安定剤として
は、例えば牛血清アルブミンなどの蛋白質を好ましく用
いることができ、その添加量は、分散液における濃度が
例えば０．０１〜１．０重量％となる量とされる。

【００２１】〔標識粒子〕移動相を構成する標識粒子と
しては、金、銀、白金のようなコロイド状金属粒子、酸
化鉄のようなコロイド状金属酸化物粒子、硫黄などのコ
ロイド状非金属粒子および合成高分子よりなるラテック
ス粒子、その他を用いることができる。この標識粒子の
平均粒径は０．０５〜０．５μｍ、特に０．０５〜０．
３μｍの範囲内であることが好ましい。平均粒径が０．
５μｍより大きい標識粒子は当該粒子の１個が有するシ
グナル強度が大きい点では好ましいが、クロマトグラフ
媒体における展開移動速度が小さくなる。一方、平均粒
径が０．０５μｍより小さい標識粒子は、これが検出試
薬によって感作されたときに、その分散液において凝集
し易いものとなる傾向がある。

【００２２】コロイド状金属粒子およびコロイド状金属
酸化物粒子は、それ自体が粒径に応じた特定の自然色を
呈するものであり、その色彩を標識のために利用するこ
とができ、従って特別に標識のための処理を施すことな
しに、そのまま標識粒子として使用することができる利
点がある。

【００２３】一方、合成高分子よりなるラテックス粒子
は自然の状態で白色であるため、そのままでは標識粒子
として使用することはできないが、例えば油溶性染料に
よって、特に水系媒体中のラテックス粒子を、油溶性染
料の油性有機溶剤による溶液のエマルジョンによって染
色することにより、所望の色彩を所望の濃さで有するも
のとすることができる。このような染色ラテックスの色
彩は、コロイド状金属粒子などの自然色に比して相当に
鮮明なものである。従って、人の肉眼に鋭敏に映ずる色
彩に染色したラテックスを標識粒子として用いることに
より、実際のイムノクロマトグラフ法の実施において最
終的に得られるシグナル形の目視判定を非常に容易にか
つ確実に行うことが可能となる。しかも、このような染
色ラテックスによる標識粒子を用いる場合には、実際の
使用量が極微量でも十分であるから、試料中に存在する
被検出物質の濃度が低い場合にも、これを確実に検出を
することが可能となる。そして、以上の利点を有するこ
とから、染色されたラテックス粒子は、本発明の標識粒
子として好ましいものである。

【００２４】本発明における標識粒子として用いること
のできるラテックス粒子は、種々のモノマーを重合また
は共重合させることによって得ることができる。ここに
モノマーとしては、例えばスチレン、クロルスチレン、
α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、ビニルトルエ
ンなどの重合性不飽和芳香族類、例えば（メタ）アクリ
ル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマール酸などの重合
性不飽和カルボン酸類、例えば（メタ）アクリル酸メチ
ル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−
ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチ
ル、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコー
ル−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリ
ル酸トリブロモフェニルなどの重合性不飽和カルボン酸
エステル類、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アク
ロレイン、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール−
（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリ
ルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニ
ルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化
ビニリデン、臭化ビニルなどの不飽和カルボン酸アミド
類、重合性不飽和ニトリル類、ハロゲン化ビニル類、共
役ジエン類などを挙げることができる。これらのモノマ
ーは、標識粒子として要求される表面特性、比重などに
よって適宜選択され、１種を単独でまたは２種以上を混
合して使用することができる。

【００２５】本発明において、標識粒子として特に好ま
しいラテックスとしては、例えばスチレンとメタクリル
酸との共重合体、スチレンとイタコン酸との共重合体な
どを挙げることができる。このような共重合体を得るた
めの重合反応のための重合開始剤としては、過硫酸塩な
どを用いることができる。

【００２６】而して、検出試薬による感作処理が施され
る前のラテックス粒子は、その表面荷電量が０．０１〜
０．５ｍｅｑＣＯＯ^- ／ｇ、ｐＨ７．２の生理食塩水中
でのゼータ電位が−１００〜−１０ｍＶであるものが好
ましい。

【００２７】なお、本発明においては、移動相を構成す
る標識粒子が既に標識されたものであることは必須の条
件ではない。すなわち、展開処理が完了した後に、反応
部位に捕捉された標識粒子を、例えば染色などの適宜の
手段によって標識させることによっても、検出可能な状
態とすることができる。

【００２８】典型的な本発明のイムノクロマトグラフ法
の実施において、標識粒子は、被検出物質と結合可能な
検出試薬、例えば被検出物質の抗原に対する抗体によっ
て感作処理され、従って感作された標識粒子の分散液が
移動相とされる。

【００２９】〔クロマトグラフ媒体〕本発明において用
いるクロマトグラフ媒体は、毛細管現象を示す微細多孔
性物質からなる不活性のものであって、使用される検出
試薬、固定化試薬、被検出物質などと反応しないもので
あれば、特にその素材が限定されるものではない。実際
に用いるクロマトグラフ媒体のポアサイズは、移動相を
構成する標識粒子の粒径より大きいことが好ましく、こ
れにより、当該標識粒子の展開移動性が基本的に確保さ
れる。

【００３０】本発明において、クロマトグラフ媒体とし
ては、定性濾紙、定量濾紙、分液濾紙、ガラス繊維濾
紙、シリカ繊維濾紙、複合繊維濾紙よりなる濾紙などを
使用することができる。また、ニトロセルロースなどの
セルロースよりなる濾紙も使用することができる。

【００３１】本発明の実施に供されるクロマトグラフ媒
体の形態および大きさは特に制限されるものではなく、
実際の操作の点および反応結果の観察の点において適切
であればよい。操作をより簡便にするためには、反応部
位が表面に形成されているクロマトグラフ媒体の裏面
に、プラスチックなどよりなる支持体を設けることが好
ましい。なお、反応結果の測定は、必要に応じて１回の
測定によって被検出物質の定性的測定および定量的測定
を達成するために光学的に行うことができる。この場合
には、支持体は実質上透明であることが必要である。

【００３２】この支持体の性状は特に制限されるもので
はないが、目視判定によって結果の観察を行う場合に
は、支持体は、標識粒子の標識色素と類似しない色彩を
有するものであることが好ましく、通常、無色または白
色であることが好ましい。

【００３３】本発明の他の態様においては、固定相を構
成するクロマトグラフ媒体における移動相の展開移動経
路上、すなわちクロマトグラフ媒体の移動相が適用され
る端部と反応部位との間の領域に、酸素原子含有極性基
を有するビニル系水溶性ポリマーを、密度がクロマトグ
ラフ媒体の面積１ｍｍ² 当たり１〜１００ｍｇとなる割
合で存在させる。

【００３４】このようなクロマトグラフ媒体によれば、
移動相の展開移動経路上に酸素原子含有極性基を有する
ビニル系水溶性ポリマーが存在することにより、移動相
の分散液が当該ビニル系水溶性ポリマーを含有する場合
と同様に、移動相を構成する感作された標識粒子は当該
クロマトグラフ媒体上において確実にかつ速やかに展開
移動することができる。

【００３５】この場合においては、移動相を構成する感
作された標識粒子の分散液は、既述のように当該ビニル
系水溶性ポリマーを含有することは必要ではないが、当
該ビニル系水溶性ポリマーを含有するものであってもよ
い。このように、クロマトグラフ媒体における展開移動
経路上に当該ビニル系水溶性ポリマーが存在し、かつ移
動相を構成する分散液中にも当該ビニル系水溶性ポリマ
ーが含有されている場合には、所期の抗体−抗原反応以
外の非特異反応を殆ど完全に抑制することができる利点
がある。

【００３６】実際のイムノクロマトグラフ法の実施にお
いて、反応部位に対する試料の適用は、試料液をクロマ
トグラフ媒体上で展開させ、クロマトグラフ的に移動さ
せることによって行うことができる。この場合に、試料
液の展開は、移動相を構成する標識粒子の分散液の展開
と同時に行ってもよいし、あるいは試料液を先行して展
開し、その後に移動相を展開させてもよい。特に後者の
方法は、移動相を構成する標識粒子に感作された検出試
薬がポリクローナル抗体である場合に有効である。

【００３７】本発明の方法は、抗原−抗体反応を利用す
るものであるから、被検出物質が抗原および抗体のいず
れであっても適用することができる。すなわち、被検出
物質である抗原または抗体に対応する抗体または抗原を
固定化試薬および検出試薬として使用すればよい。

【００３８】

【実施例】以下、本発明の実施例について説明するが、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。な
お、ラテックス粒子の表面負荷電量は「ポテンショグラ
フＥ５３６」（メトラー社製）により、ゼータ電位は
「デルサー４４０」（コルター社製）により測定した。

【００３９】実施例１ Ａ．標識粒子の感作処理 （１）標識粒子用ラテックスの合成 スチレン９５重量部とメタクリル酸５重量部とを、過硫
酸カリウムを重合開始剤とするソープフリー重合によっ
て重合させることにより、平均粒径０．２７０μｍのラ
テックスを調製した。このラテックス粒子の表面負荷電
量は、０．１５ｍｅｑＣＯＯ^- ／ｇであった。

【００４０】（２）標識粒子の調製 上記のラテックス粒子を赤色の油溶性染料「ソルベント
レッド２７」を用いて染料エマルジョン法により染色し
て赤色のラテックス粒子を得た。このラテックス粒子の
ｐＨ７．２のリン酸緩衝液中でのゼータ電位は−４１ｍ
Ｖ、表面負荷電量は０．１５ｍｅｑＣＯＯ^- ／ｇであっ
た。

【００４１】（３）標識粒子の感作処理 この染色ラテックス粒子よりなる標識粒子に対して、検
出試薬による感作処理を行った。すなわち、当該ラテッ
クス粒子の懸濁液をｐＨ６．０のクエン酸緩衝液により
固形分濃度が１重量％となるように希釈したラテツクス
粒子分散液の１容量分と、ヒト絨毛性ゴナドトロピン
（以下「ＨＣＧ」と記す。）に対するモノクローナル抗
体（検出試薬）をクエン酸緩衝液で希釈して得られる濃
度５０μｇ／ミリリットルの抗体希釈液１容量分とを、
エッペンドルフ遠沈管に入れ、室温で０．５時間振盪す
ることにより、ラテツクス粒子に対しモノクローナル抗
体による感作処理を行った。ここに得られたラテツクス
粒子からなる感作された標識粒子のゼータ電位は−１０
ｍＶであった。

【００４２】（４）標識粒子分散液の調製 上記の感作された標識粒子の分散液の媒体部分を、濃度
０．２重量％の牛血清アルブミン（シグマ社製）を含有
するｐＨ７．０のグリシン緩衝液に置換し、温度４℃で
１夜静置した。次いで濃度０．１重量％の牛血清アルブ
ミンを含有するグリシン緩衝液を用いて３回遠心沈降処
理によって洗浄し、ガラス繊維濾紙「ＧＳ２５」（東洋
濾紙社製）を用いて濾過し、最終的に固形分が０．１重
量％の分散液を調製し、これにポリビニルピロリドン
「ＰＶＰ３６０」（シグマ社製）を０．２重量％の濃度
となるように添加し、もってＨＣＧ抗体により感作され
た標識粒子の分散液を調製した。

【００４３】Ｂ．クロマトグラフ媒体の調製 （１）反応部位形成剤の調製 スチレン９９．９重量部とメタクリル酸０．１重量部と
を、過硫酸カリウムを重合開始剤とするソープフリー重
合によって重合させることにより、平均粒径が０．５μ
ｍのラテックスを調製した。このラテックス粒子のゼー
タ電位は−５０ｍＶであった。このラテックスを固形分
濃度が２重量％となるよう生理食塩水によって希釈し、
その１ミリリットルと、ＨＣＧに対するウサギ抗体（固
定化試薬）を濃度が１ｍｇ／ミリリットルとなるよう生
理食塩水により希釈して得られたウサギ抗体希釈液１ミ
リリットルとをエッペンドルフ遠沈管に採り、室温にお
いて０．５時間振盪してラテツクス粒子にウサギ抗体を
感作させ、次いで遠心処理による沈澱部を濃度０．２重
量％の牛血清アルブミンの生理食塩水に分散して温度４
℃で１夜静置した。この分散液を、濃度０．１重量％の
牛血清アルブミンを含有する生理食塩水を用いて３回遠
心沈降処理によって洗浄し、最終的に２ミリリットルと
なるよう再懸濁させることにより、反応部位形成用のラ
テックス粒子分散液を調製した。

【００４４】（２）反応部位の形成 幅１００ｍｍ、長さ１００ｍｍのガラス繊維製濾紙「Ｇ
Ｓ２５」（東洋濾紙社製）の一端から１５ｍｍの位置
に、上記反応部位形成用ラテックス粒子分散液の２０マ
イクロリットルを筆により塗布し、風乾させた。この濾
紙を幅８ｍｍとなるよう切断し、もって反応部位を有す
るクロマトグラフ媒体を調製した。

【００４５】Ｃ．イムノクロマトグラフ操作 （１）試料液の調製 上記Ａで得られた感作された標識粒子の分散液の８マイ
クロリットルと、ｐＨ８．０のトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン塩酸塩緩衝液の３２マイクロリットル
と、表１に示すように分子量が異なる各種のポリビニル
ピロリドンとを、最終的に表１に示す種々の濃度となる
ように生理食塩水で希釈して移動相とされる分散液を調
製し、その後温度４℃で１ケ月間保存し、この分散液に
被検出物質であるＨＣＧ（ＵＣＢ社製）を添加すること
により、ＨＣＧが１ミリリットル当たり２５ｍＩＵで含
有される試料液を調製した。また、ＨＣＧを添加しない
ほかは同様の分散液（ＨＣＧ濃度０ｍＩＵ）をそのまま
対照用試料液とした。

【００４６】（２）展開操作 上記の試料液の２５０マイクロリットルを用い、上記Ｂ
で得られたクロマトグラフ媒体の反応部位側の端を下に
して当該下端を５ｍｍだけ試料液中に浸漬し、当該試料
液を展開させた。そして、５分間が経過した後、クロマ
トグラフ媒体上の移動相の展開距離およびクロマトグラ
フ媒体上の展開移動経路における標識粒子の凝集状態を
調べ、またクロマトグラフ媒体の反応部位を観察して当
該反応部位における標識粒子による赤色シグナルの状態
を目視判定し、比較した。また、対照試料液について
も、同様の操作を行った。

【００４７】Ｄ．結果 以上の結果は各試料液の組成と共に表１に示すとおりで
ある。この結果は、移動相とされる分散液をその調製の
直後に使用した場合と同様の結果であった。表１におい
て、「ＰＶＰ」はポリビニルピロリドン（括弧内の数字
は、万を単位とする分子量の値である。）を表わす。

【００４８】評価の基準は次のとおりである。 濾紙上の凝集（反応部位以外での凝集） 「無」…凝集が認められないこと 「有」…若干の凝集
が認められること 「強」…著しい凝集が認められること 反応結果 「−」…シグナルが見えない状態 「±」…シグナルが
不明瞭な状態 「＋」…シグナルが明瞭な状態 「＋＋」…シグナル
が強い状態 「＋＋＋」…シグナルが非常に強い状態

【００４９】

【表１】

【００５０】比較例１ 実施例１において、ポリビニルピロリドンの代わりに、
分散安定剤である牛血清アルブミン、ゼラチン、カゼイ
ン、ポリリジン、アラビアガム、サッカロース、デキス
トラン、「ＰＥＧＡ」（分子量６千のポリエチレングリ
コール）、「ＰＥＧＢ」（分子量２万のポリエチレング
リコール）、「界面活性剤Ａ」（ポリオキシエチレン
（２０）ソルビタンモノラウレート）、「界面活性剤
Ｂ」（ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレ
エート）、「界面活性剤Ｃ」（ポリオキシエチレン（１
０）オクチルフェニルエーテル）の各々を分散液に添加
し、温度４℃で１ケ月間保存したほかは、実施例１と同
様にしてイムノクロマトグラフ操作を行った。その結果
を表２に示す。

【００５１】

【表２】

【００５２】この表２の結果から明らかなように、上記
の分散安定剤を使用した場合には、温度４℃で１ケ月間
保存すると移動相の標識粒子がクロマトグラフ媒体上に
おいて試料液の液面レベルで凝集してしまい、殆ど展開
されなかった。サッカロースおよび界面活性剤を使用し
た場合には、展開は認められたがその距離は非常に僅か
であってクロマトグラフ媒体上における凝集が相当に強
く、反応部位においては、ＨＣＧを含有する試料液を用
いた場合にも明確な変化は殆ど見られず、被検出物質の
検出は十分に達成されなかった。

【００５３】実施例２ ポリビニルピロリドンの種々の濃度の水溶液よりなる処
理液を調製し、この処理液中に、実施例１と同様にして
反応部位を形成したクロマトグラフ媒体、すなわち長さ
１０ｍｍ、幅８ｍｍの濾紙を５分間浸漬して風乾させ、
これにより、クロマトグラフ媒体にポリビニルピロリド
ンを付着させた。この処理液付着処理によってクロマト
グラフ媒体に吸収された処理液の量は約１５０マイクロ
リットルであった。また、ポリビニルピロリドンを添加
しないほかは実施例１と同様にして標識粒子の分散液を
調製し、温度４℃で１ケ月間保存した。

【００５４】そして、上記の標識粒子の分散液とクロマ
トグラフ媒体とを用いたほかは実施例１と同様にしてイ
ムノクロマトグラフ操作を行った。そして５分間が経過
した後に結果を調べたところ、表３に示すとおりであっ
た。

【００５５】

【表３】

【００５６】実施例３ 実施例１におけるＨＣＧ抗体の代わりに検出試薬として
抗ＨＢｓウマポリクローナル抗体を用い、実施例１にお
けるものと同様の赤色に染色されたラテックス粒子に対
して実施例１のＨＣＧの場合と同様の条件に従って感作
処理を行い、この分散液にポリビニルピロリドンを実施
例１と同様の濃度となるよう添加して、標識粒子を０．
００４重量％の濃度で含有する分散液を調製し、温度４
℃で１ケ月間保存した。また、実施例１と同様の方法に
より、上記と同様のＨＢｓ抗体を固定化試薬として用
い、これにより感作したラテックス粒子の分散液によ
り、クロマトグラフ媒体上に反応部位を形成した。

【００５７】そして、被検出物質であるＨＢｓ抗原を１
ミリリットル当たり２５ｎｇ含有する試料液および１ミ
リリットル当たり５０ｎｇ含有する試料液を調製し、こ
れらの試料液およびＨＢｓ抗原を含有しない対照試料液
の各々に上記クロマトグラフ媒体を実施例１と同様の条
件で浸漬して展開させ、３分間が経過した後にクロマト
グラフ媒体を取り出し、次にこれを上記の標識粒子の分
散液に浸漬させることにより展開させ、これにより、イ
ムノクロマトグラフ操作を行った。そして５分間が経過
した後に結果を調べたところ、表４に示すとおりであっ
た。

【００５８】比較例２ 実施例３において、ポリビニルピロリドンの代わりにカ
ゼインを分散液に添加し、温度４℃で１ケ月間保存した
ほかは実施例３と同様のイムノクロマトグラフ操作を行
った。結果は表４に示すとおりである。

【００５９】実施例４ 実施例３において、染色されたラテックス粒子の代わり
に平均粒径が０．０２μｍの金コロイド粒子を標識粒子
として用い、得られた分散液を温度４℃で１ケ月間保存
したほかは、実施例３と同様のイムノクロマトグラフ操
作を行った。結果は表４に示すとおりである。

【００６０】対照例 実施例４において、分散液にポリビニルピロリドンを添
加せず、温度４℃で１ケ月間保存したほかは実施例５と
同様のイムノクロマトグラフ操作を行った。結果は表４
に示すとおりである。

【００６１】

【表４】

【００６２】

【発明の効果】本発明の方法によれば、クロマトグラフ
媒体における移動相の展開移動経路上に特定のポリマー
が存在されるため、移動相を構成する標識粒子が確実に
かつ速やかにクロマトグラフ媒体上を展開移動し、しか
も長期間保存することによっても性能が低下せず、その
結果、所期の抗原−抗体反応によるイムノクロマトグラ
フ法により、被検出物質をその濃度が低い場合にも、確
実にかつ短時間のうちに検出することができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中の検出すべき被検出物質と結合可
   能な固定化試薬を含む少なくとも１つの反応部位を有す
   るクロマトグラフ媒体を固定相として用い、このクロマ
   トグラフ媒体上において、前記被検出物質と結合可能な
   検出試薬によって感作された、検出用粒子が分散されて
   なる分散液を移動相として当該検出用粒子をクロマトグ
   ラフ的に移動させると共に、前記試料を前記反応部位に
   接触させ、これにより、前記反応部位において、前記試
   料中に存在する被検出物質が前記固定化試薬に結合する
   と共にこの被検出物質に前記検出試薬が結合することに
   より、前記移動相を構成する検出用粒子が特異的に結合
   して捕捉されることを利用して前記被検出物質を検出す
   るイムノクロマトグラフ法において、 前記移動相を構成する検出用粒子を、酸素原子含有極性
   基を有するビニル系水溶性ポリマーの存在下においてク
   ロマトグラフ媒体上をクロマトグラフ的に移動させるこ
   とを特徴とするイムノクロマトグラフ法。
2. 【請求項２】 固定相を構成するクロマトグラフ媒体に
   おいて、移動相の展開移動経路上に、酸素原子含有極性
   基を有するビニル系水溶性ポリマーが存在することを特
   徴とする請求項１に記載のイムノクロマトグラフ法。