CN106896231A - 一种利用两个反应线检测hcg浓度的hcg检测试纸 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用两个反应线检测HCG浓度的HCG检测试纸，通过利用两道检测线，可以实现特异性的定量检测HCG浓度；同时检测的灵敏度低于2000mIU/ml、检测高浓度HCG值(如5万mIU/ml以上)样本不出现阴性的HCG检测试纸，进而满足对高浓度样本的区间范围检测。本发明检测方法简单，用时较短，在几分钟之内即可实现定量检测，具有较好的推广应用前景。

Description

一种利用两个反应线检测HCG浓度的HCG检测试纸
技术领域
本发明属于医学检测领域，特别是涉及一种早早孕检测试纸及其检测方法。
背景技术
人绒毛膜促性腺激素是由人体胎盘的滋养层细胞分泌的一种蛋白，正常未孕女性尿液中基本没有或者含量极少，当受精卵在子宫内膜着床后，胎盘开始发育，绒毛膜滋养层细胞就开始分泌HCG，当妊娠1-2.5周时，血液或者尿液中的HCG水平即可迅速升高，第8孕周达到高峰，至孕期第4个月始降至中等水平，并一直维持到妊娠末期。HCG是维持正常妊娠生理过程的重要因素。因此判断正常育龄妇女是否怀孕，妊娠是否正常，可以通过检测血中或者尿液中的HCG浓度来进行诊断。
HCG检测试纸是采用胶体金标记技术，利用抗原抗体免疫反应，来实现对样本中的人绒毛膜促性腺激素(HCG)浓度水平进行检测。
HCG检测试纸是采用胶体金标记的一种HCG抗体作为指示试剂，如图1所示，将羊抗鼠多克隆抗体和另一种HCG抗体分别包被在硝酸纤维素膜上的质控区和检测区，加其他辅助成分制成。检测时，样本通过层析作用向上流动，阳性样本中的HCG会与金标垫上金标记抗-HCG特异性结合，并被检测线上的HCG单克隆抗体捕获，形成的[抗HCG]-[HCG-[金标记抗-HCG]复合物，从而在检测线(T)显现出一条红色条带。如是阴性样本，则将无检测线(T)显现。
CN102879576A公开了一种早孕检测试纸条，所述试纸条由样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，所述标记垫上涂覆有胶体金标记的鼠抗β-HCG单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜包括包被有鼠抗α-HCG单克隆抗体的检测区和包被有抗鼠IgG多克隆抗体的控制区，在所述检测区和控制区之间设置有包被有毒品抗原的对比区，所述标记垫上还涂覆有胶体金标记的所述毒品的抗体。该试纸条在现有的早孕检测试纸条的基础上，在检测区和控制区之间设置包被有毒品抗原的对比区，并在标记垫上涂覆了胶体金标记的所述毒品的抗体。利用双抗夹心法检测人体尿液中的HCG抗原，从而在检测区显色，采用竞争抑制法检测尿液标本，当标记的毒品抗体和对比区的毒品抗原结合反应时，在对比区显色，而对比区颜色是通过内控控制的，是固定不变，表示人怀孕6周的显色程度。比较对比区与检测区的颜色深浅，颜色较之深，则怀孕6周以上，较之浅则怀孕不足6周，从而实现预测怀孕时间的目的。同时，本发明试纸条在检测怀孕与否以及怀孕周期的同时，可以检测是否有滥用药物，进而可以提示是否适合妊娠，达到避免畸形胎儿的目的。虽然该试纸条具有检测毒品的功能，但是仍然无法准确的定量测定、以及高灵敏度的测定HCG。
CN103760368A公开了一种人绒毛膜促性腺激素胶体金定量检测试剂盒，包括盒座、盒盖和试剂条，所述试剂条固定于所述盒座中部且位于所述盒座与所述盒盖之间，所述盒盖上设有加样孔与观察口，其特征在干，所述试剂条包括底层与上层，所述底层为塑料薄片，所述上层依次头尾相接排列有滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记抗HCG单克隆抗体I，所述免疫硝酸纤维素膜上设有平行的两条检测线和一条质控线，所述检测线上包被有抗HCG单克隆抗体II，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG。在试剂盒的纤维膜上检测线(T\、Τ2线)包被有抗HCG单克隆抗体II，另一端包被有抗HCG单克隆抗体I胶体金复合物。检测时，被检样品首先与抗HCG单克隆抗I胶体金混合，并沿纤维膜向上层析依次通过T1线、T2线。如果样品中有HCG存在，HCG首先和抗HCG单克隆抗体I胶体金结合，形成“HCG-抗HCG单克隆抗体I胶体金复合物”，在层析至检测线时，会被另一抗HCG单克隆抗体II捕获，而在检测线处形成一条红色线条。检测线颜色的深浅与样品中HCG浓度成正比。如果样品中没有HCG，则不会在T线处形成线条。但是该方法，仍然不能够准确的定量检测高浓度的HCG，因此，仍然有改进的空间。
CN204359798U中一种人绒毛膜促性腺激素双重确定试剂盒，包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上中间位置处依次设有检测线一、检测线二和质控线，所述硝酸纤维素膜上靠近检测线一的一端设有样品垫，所述硝酸纤维素膜上靠近质控线的一端设有吸水装置，所述样品垫和检测线一之间设有胶体金结合物垫。进一步的，所述胶体金结合物垫标记有鼠抗HCG-β单克隆抗体和鼠抗f-β-HCG单克隆抗体A。所述检测线一包被有鼠抗f-β-HCG单克隆抗体B。所述检测线二包被有鼠抗HCG-α单克隆抗体。所述质控线包被有包被有羊抗鼠IgG单克隆抗体。在现有的试纸的检测原理上，再加入一条检测线，该检测线可捕获人体尿液中的人游离β绒毛膜促性腺激素(f-β-HCG)，f-β-HCG是人体妊娠的特异性标志物，f-β-HCG可更可靠的指示检测者妊娠与否。该方法仍然存在着检测精确度不高，不能检测高浓度的以及不能一次即可定量HCG的效果。
目前市场上的早早孕检测试纸(人绒毛膜促性腺激素检测试纸，也可俗称HCG检测试纸)是定性或者半定量或者定量检测样本中HCG的浓度，现有技术都是一条反应线(也称检测线，下同)，检测时，是通过这条反应线的显色情况来进行结果判断的。现有的技术如果生产低灵敏度的试纸，比如灵敏度为600mIU/ml以下在检测5万mIU/ml以上浓度的样本就会出线HOOK效应，检测值为阴性。现有技术也没有办法生产出灵敏度低于2000mIU/ml检测试纸。
发明内容
本发明的目的就是解决上述缺点，可以生产出灵敏度低、检测高浓度HCG值(如5万mIU/ml以上)样本不出现阴性的HCG检测试纸，以满足对高浓度样本的区间范围检测。也可以通过组合不同灵敏度的HCG检测试纸，对检测样本进行半定量检测。
本发明一方面，提供一种改进的增强型的利用两个反应线检测HCG浓度的HCG检测试纸，其包括样品垫(1)、胶体金结合垫(4)、层析膜(2)、PVC胶板(3)、吸水材料(8)、质控线C(7)，其特征在于：沿样品流动方向，依次为增强检测线T1(5)和检测线T2(6)。具体结构如图2所示。
本发明另外一方面，增强线T1(5)用的抗体是yuHCG-β1(即HCG-β1)，胶体金上用的是胶体金用的是yuHCG-α抗体(即HCG-α)，检测线T2(6)用的是yuHCG-β2抗体(即HCG-β2)，质控线C(7)用的是羊抗鼠类IgG。
本发明的另外一方面，增强的检测线T1(5)消费者看不见，被专用的MAX胶盖住。
本发明的另外一方面，提供一种快速定量检测试纸盒，它是由五条不同灵敏度(分别是25mIU/ml、100mIU/ml、600mIU/ml、2000mIU/ml、10000mIU/ml)的前述HCG检测试纸联合在一起，进行半定量检测的。具体结构如图3所示。其中，(9)是隐藏的增强的检测线(T1)；(10)是加样孔，可以用联排移液枪，同时加入等量的样品。检测结果如下表述：
如：1号条阳性，其它条阴性。表明被检测样品中HCG的浓度大于25mIU/ml小于100mIU/ml。
本试纸半定量的浓度分区是：
小于25mIU/ml，为所有条均为阴性；
大于25mIU/ml小于100mIU/ml，1号条阳性，其它为阴性；
大于100mIU/ml小于600mIU/ml，1、2号条为阳性，其它条为阴性；
大于600mIU/ml小于2000mIU/ml，1、2、3号条为阳性，其它条为阴性；
大于2000mIU/ml小于10000mIU/ml，1、2、3、4号条为阳性，5号条为阴性；
大于10000mIU/ml，1、2、3、4、5号条均为阳性
浓度增高显示阳性条数逐步增加或者显示阳性的条T线颜色加深；浓度降低显示阳性条数逐步减少或者显示阳性的条T线颜色变浅。
本发明另外一方面，所述检测线与质控线相距离0.5cm-1.0cm，检测线T2距离检测窗口下沿0.4-1.0cm之间。
本发明另外提供一种利用两个反应线检测HCG浓度的HCG检测试纸的制备方法，该方法包括：
(1)样品垫的制备；
(2)胶体金结合垫的制备；
(3)包被膜的制备；
(4)吸水材料的制备；
(5)金膜组合；
(6)分切；
(7)装袋和封口；
(8)外包等步骤。具体的工艺流程图可以参加图4所示。
本发明的有益效果
本发明的利用两个反应线检测HCG浓度的HCG检测试纸，通过利用两道检测线，可以实现特异性的定量检测HCG浓度；这个检测是一种间接的方法，抗原先与金垫上的HCG-α抗体结合，再与T1线上的HCG-β1结合，才能与检测线上的HCG-β2抗体结合完成整个反应。没有T1线是没有办法完成反应的。这是这个检测反应的基本原理。同时本发明的检测的灵敏度低于2000mIU/ml、检测高浓度HCG值(如5万mIU/ml以上)样本不出现阴性的HCG检测试纸，进而满足对高浓度样本的区间范围检测。本发明检测方法简单，用时较短，在几分钟之内即可实现定量检测，具有较好的推广应用前景。
附图说明
图1为现有技术的试纸条的结构示意图
图2位本发明的试纸条结构示意图；附图标记分别为：1、样品垫；4、胶体金结合垫；2、层析膜；3、PVC胶板；8、吸水材料；7、质控线C；5、增强检测线T1；6、检测线T2。
图3为本发明定量检测试纸盒的结构示意图，其中9表示检测线T1，这条线消费者看不见，被专用的MAX胶盖住；10表示加样孔。
图4位本发明试纸条的生产工艺流程图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1一种利用两个反应线检测HCG浓度的HCG检测试纸
如图2所示，为本发明的利用两个反应线检测HCG浓度的HCG检测试纸的结构示意图。其包括样品垫(1)、胶体金结合垫(4)、层析膜(2)、PVC胶板(3)、吸水材料(8)、质控线C(7)，其特征在于：沿样品流动方向，依次为增强检测线T1(5)和检测线T2(6)。具体结构如图2所示。增强线T1(5)用的抗体是yuHCG-β1(即HCG-β1)，胶体金上用的是胶体金用的是yuHCG-α抗体(即HCG-α抗体)，检测线T2(6)用的是yuHCG-β2抗体(即HCG-β2)。其中增强的检测线T1(5)消费者看不见，被专用的MAX胶盖住，所述检测线与质控线相距离0.5cm，检测线T2距离检测窗口下沿0.5cm。在每1cm*30cm金结合垫上抗体的喷涂用量为0.15-0.3mg/条。
实施例2试纸条的制备方法
(1)样品垫的制备：将玻璃纤维素膜切成25*30cm，用样品垫处理液浸泡30分钟上，取出烘干，切成相应宽度的2.5*30cm样品垫条备用；
(2)胶体金结合垫的制备：用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金液冷却备用，调整PH值至适当值，加入要求量的yuHCG-α抗体，搅拌30分钟，加入适量的BSA，搅拌10分钟，离心去上清，加入适量的复溶液复溶至适量体积，振荡均匀，喷涂在聚酯膜上，37℃干燥4小时以上，沿着喷金复溶液的方向，在保证每条金的完整的情况下，裁成1*30cm胶体金结合垫备用。
(3)包被膜的制备：用抗体稀释液分别稀释yuHCG-β1抗体，yuHCG-β2和羊抗鼠多抗至一定的浓度，分别划线在NC膜上，分别形成T1、T2和C线，如上述产品图的位置，37℃干燥4小时以上，然后裁成30cm长备用。
(4)吸水材料的制备：将吸水板裁成3.3*30cm条形备用。
(5)金膜组合：将包被膜、吸水材料、胶体金结合垫、样品垫按照上图的顺序和层叠粘在PVC板上，形成成型板；如果做条型产品，用手柄胶带盖上吸水板部分，并压膜1mm，样品垫、金垫以及T1线部分膜用专用MAX胶带盖上，胶带盖T1级。
(6)分切：将上述成型板根据需要切成2.5-6mm的条；如果做板型和笔型，将相应尺寸的条装入板或者笔型里。
(7)装袋和封口：将上述条或者板或者笔，一个一个分别装入铝泊袋中，封口；备用；
(8)外包：将袋装产品装入外包装盒。
实施例3快速定量检测试纸盒的制备
取由采用实施例2方法制备的五条不同灵敏度(分别是25mIU/ml、100mIU/ml、600mIU/ml、2000mIU/ml、10000mIU/ml)的前述HCG检测试纸联合在一起，进行半定量检测的。具体结构如图3所示。其中，(9)是隐藏的增强的检测线(T1)；(10)是加样孔，可以用联排移液枪，同时加入等量的样品。产品保存待用。
实施例4利用实施例1和实施例3的试纸条和试纸盒进行HCG检测
(1)表1实施例1的试纸条灵敏度实验
“+”位阳性；“-”为阴性。
表1的结果表明，本发明实施例1的试纸条在现有试纸条的基础上，针对高浓度的HCG也具有较好的检测结果。
具体反应液测试
将HCG分别制备成为浓度为0、25mIU/ml、100mIU/ml、600mIU/ml、2000mIU/ml、1000mIU/ml的标准品，采用液相色谱进行标定。
取一定量的样品，其中HCG的浓度为2000mIU/ml分别加入如图3所示的检测试纸盒中，如图3的结果所示，其中1-4均为阳性，这说明检测的样本浓度达到了2000mIU/mL，这与液相色谱标定的结果也一致。而HCG浓度为0的试纸条没有相应条带产生。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种改进的利用两个反应线检测HCG浓度的HCG检测试纸，其包括样品垫(1)、胶体金结合垫(4)、层析膜(2)、PVC胶板(3)、吸水材料(8)、质控线C(7)，其特征在于：沿样品流动方向，依次为增强检测线T1和检测线T2。
2.根据权利要求1所述的HCG检测试纸，其特征在于：增强线T1用的抗体是yuHCG-β1，胶体金上用的是yuHCG-α抗体，检测线T2用的是yuHCG-β2抗体，质控线C用的是羊抗鼠IgG。
3.根据权利要求1或2所述的HCG检测试纸，其特征在于：所述检测线T1，检测线T2和质控线C二二相隔距离为0.5cm距离。
4.权利要求1或2所述的HCG检测试纸的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)样品垫的制备：将玻璃纤维素膜切成25*30cm，用样品垫处理液浸泡30分钟上，取出烘干，切成相应宽度的2.5*30cm样品垫条备用；
(2)胶体金结合垫的制备：用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金液冷却备用，调整PH值至适当值，加入要求量的yuHCG-α抗体，搅拌30分钟，加入适量的BSA，搅拌10分钟，离心去上清，加入适量的复溶液复溶至适量体积，振荡均匀，喷涂在聚酯膜上，37℃干燥4小时以上，沿着喷金复溶液的方向，在保证每条金的完整的情况下，裁成1*30cm胶体金结合垫备用；
(3)包被膜的制备：用抗体稀释液分别稀释yuHCG-β1抗体，yuHCG-β2和羊抗鼠多抗至一定的浓度，分别划线在NC膜上，分别形成T1、T2和C线，如上述产品图的位置，37℃干燥4小时以上，然后裁成30cm长备用；
(4)吸水材料的制备：将吸水板裁成3.3*30cm条形备用；
(5)金膜组合：将包被膜、吸水材料、胶体金结合垫、样品垫按照顺序和层叠粘在PVC板上，形成成型板；如果做条型产品，用手柄胶带盖上吸水板部分，并压膜1mm，样品垫、金垫以及T1线部分膜用专用MAX胶带盖上，胶带盖T1级；
(6)分切：将上述成型板根据需要切成2.5-6mm的条；如果做板型和笔型，将相应尺寸的条装入板或者笔型里；
(7)装袋和封口：将上述条或者板或者笔，一个一个分别装入铝泊袋中，封口；备用；
(8)外包：将袋装产品装入外包装盒。
5.一种快速定量检测试纸盒，它是由五条不同灵敏度，分别是25mIU/ml、100mIU/ml、600mIU/ml、2000mIU/ml、10000mIU/ml的权利要求1或2所述的HCG检测试纸组合在在一起同时进行检测。
6.根据权利要求5所述的检测试纸盒，其特征在于，检测试纸条也可以根据需要为4条或者3条或者2条。
7.根据权利要求5所述的试纸盒，其特征在于，检测结果如下表述：
如：1号条阳性，其它条阴性。表明被检测样品中HCG的浓度大于25mIU/ml小手100mIU/ml。
本试纸半定量的浓度分区是：
小于25mIU/ml，为所有条均为阴性；
大于25mIU/ml小手100mIU/ml，1号条阳性，其它为阴性；
大于100mIU/ml小手600mIU/ml，1、2号条为阳性，其它条为阴性；
大于600mIU/ml小手2000mIU/ml，1、2、3号条为阳性，其它条为阴性；
大于2000mIU/ml小手10000mIU/ml，1、2、3、4号条为阳性，5号条为阴性；
大于10000mIU/ml，1、2、3、4、5号条均为阳性
浓度增高显示阳性条数逐步增加或者显示阳性的条T线颜色加深；浓度降低显示阳性条数逐步减少或者显示阳性的条T线颜色变浅。
8.一种HCG的检测方法，其特征在于，使用权利要求1-3中任一所述的试纸或者权利要求5-7中任一所述的试纸盒进行检测。
9.权利要求1-3中任一所述的试纸在制备检测HCG的试剂盒中的用途，其特征在于可以根据需要做出不同灵敏度的试纸。
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